ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
LÃ THỊ HƯƠNG HUYỀN
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG SINH
TỔNG HỢP RAPAMYCIN CỦA STREPTOMYCES RAPAMYCINICUS
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – Năm 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
LÃ THỊ HƯƠNG HUYỀN
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG SINH
TỔNG HỢP RAPAMYCIN CỦA STREPTOMYCES RAPAMYCINICUS
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 8420101.07
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HỒNG MINH
TS. PHẠM THẾ HẢI
Hà Nội – Năm 2020
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hồng Minh,
Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã trực tiếp hướng
dẫn em rất tận tình trong cả quá trình thực hiện đề tài và động viên, quan tâm, giúp
đỡ em vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt luận văn này.
Em xin cảm ơn tới TS. Phạm Thế Hải – Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh
học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã chỉ bảo, giúp đỡ để em có thể làm tốt
công việc và hoàn thành đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, trường Đại
Học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung cấp cho em
những kiến thức bổ ích trong suốt hai năm học vừa qua và giúp đỡ em rất nhiều trong
việc nắm bắt kiến thức cũng như động viên em rất lớn về mặt tinh thần.
Em cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo, các anh chị em Viện Vi sinh vật và Công
nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và tạo điều kiện
rất lớn trong suốt quá trình em thực hiện luận văn.
Em xin cảm ơn TS. Vittorio Venturi và Th.S Iris Bertani, Trung tâm Quốc tế
về Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học, Ý đã giúp đỡ em trong thực hiện thí
nghiệm lai Southern Blot.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và tất cả bạn bè, những
người đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện
luận văn.
Hà Nội, ngày 05 tháng 02 năm 2020
Học viên
Lã Thị Hương Huyền
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU........................................................................................ 3
Chương 1 - TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ............................................... 4
1.1. Xạ khuẩn ........................................................................................................ 4
1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn ...................................................................... 4
1.1.2. Ứng dụng của xạ khuẩn ............................................................................... 5
1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn trong sản xuất các chất trong y học ........................... 6
1.1.4. Streptomyces rapamycinicus........................................................................ 9
1.2. Rapamycin ................................................................................................... 10
1.2.1. Tính chất và cấu trúc hóa học .................................................................... 10
1.2.2. Vai trò của rapamycin trong đáp ứng miễn dịch ....................................... 10
1.2.3. Sinh tổng hợp rapamycin và cơ chế điều hòa ............................................ 11
1.3. Kỹ thuật di truyền ........................................................................................ 13
1.3.1. Giới thiệu chung ........................................................................................ 13
1.3.2. Một số phương pháp thường sử dụng trong kỹ thuật di truyền ................. 14
1.3.3. Ứng dụng ................................................................................................... 14
1.4. Tình hình nghiên cứu tăng hiệu suất tổng hợp rapamycin ........................... 15
1.4.1. Các nghiên cứu nhằm tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng xạ khuẩn ............. 15
1.4.2. Các nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến làm tăng lượng rapamycin . 18
Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 20
2.1. Vật liệu ......................................................................................................... 20
2.1.1. Chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy ................................................. 20
2.1.2. Vector và oligonucleotide .......................................................................... 21
2.1.3. Hóa chất và thiết bị .................................................................................... 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 22
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chung ................................................................ 22
2.2.2. Phương pháp tách ADN ............................................................................. 24
2.2.3. Phương pháp biến nạp ............................................................................... 25
2.2.4. Phương pháp tạo dòng vector pSET152/ rapG ......................................... 26
2.2.5. Phương pháp tiếp hợp ................................................................................ 27
2.2.5. Phương pháp sàng lọc chủng xạ khuẩn chuyển gen .................................. 28
2.2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính rapamycin .............................................. 30
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 33
3.1. Tạo dòng vector pSET 152/rapG .................................................................. 33
3.2. Tạo chủng Streptomyces rapamycinicus chuyển gen .................................... 37
3.2.1. Sàng lọc chủng xạ khuẩn chuyển gen trên môi trường chọn lọc ................ 37
3.2.2. Kiểm tra chủng xạ khuẩn chuyển gen bằng phương pháp lai Southern Blot 38
3.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh rapamycin ............................................................ 39
3.3.1. Ảnh hưởng của axit shikimic đến khả năng sinh rapamycin ...................... 42
3.3.2. Ảnh hưởng của glycerol đến khả năng sinh rapamycin ............................. 44
3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng axit shikimic đến khả năng sinh rapamycin ... 46
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 50
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 56
DANH MỤC HÌNH
Chương 1
Hình 1.1. Streptomyces rapamycinicus trên môi trường thạch ISP2 . ........................ 9
Hình 1.2. Cấu trúc rapamycin .................................................................................. 10
Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp rapamycin ........................................................ 12
Chương 2
Hình 2.1. Phương pháp tạo chủng đột biến ............................................................... 23
Hình 2.2. Phương pháp định lượng khả năng sinh rapamycin .................................. 23
Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế vector pSET152/rapG ........................................................ 26
Hình 2.4. Chuyển ADN biến tính lên màng .............................................................. 30
Chương 3
Hình 3.1. Sản phẩm PCR gen rapG trên agarose ...................................................... 33
Hình 3.2. Các khuẩn lạc xanh-trắng mang vector pGEM/rapG ............................... 34
Hình 3.3. Sản phẩm PCR bằng mồi M13F và M13R các khuẩn lạc trắng ............... 34
Hình 3.4. Sản phẩm cắt plasmid pGEM/rapG (A) và pSET152 (B) ........................ 35
Hình 3.5. (A) Ảnh chụp khuẩn lạc trắng mang vector pSET152/rapG và khuẩn lạc
xanh mang vector pSET 152 đóng vòng trên môi trường thạch LB/apramycin/X-gal.
(B) Sản phẩm PCR vùng liên gen của 04 khuẩn lạc trắng ........................................ 36
Hình 3.6. Sản phẩm cắt plasmid pSET152/rapG ...................................................... 37
Hình 3.7. Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn chuyển gen trên môi trường có kháng sinh ... 38
Hình 3.8. ADN tổng số trên bản gel sau khi điện di ................................................. 38
Hình 3.9. Kết quả lai Southern blot của các chủng xạ khuẩn chuyển gen ................ 39
Hình 3.10. Đường chuẩn rapamycin ......................................................................... 40
Hình 3.11. Vòng kháng nấm C. albicans của các chủng xạ khuẩn WT và WT/rapG
trong các môi trường nuôi cấy khác nhau ................................................................. 41
Hình 3.12. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường gốc ........ 41
Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường bổ sung
acid shikimic ............................................................................................................. 43
Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường bổ sung
Glycerol ..................................................................................................................... 45
Hình 3.15. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường bổ sung
lượng axit shikimic khác nhau .................................................................................. 47
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật ......................................................... 20
Bảng 2.2. Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu ........................... 21
Bảng 2. 3. Tỉ lệ hai pha dung môi qua cột HPLC ..................................................... 31
Bảng 3.1. Các giá trị dựng đường chuẩn rapamycin ................................................. 40
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADN : axit deoxyribonucleic
DHCHC : 4,5- dihydroxycyclohex- 1- ene carboxylic acid
HPLC: hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
IPTG : Isopropyl β- D- 1- thiogalactopyranoside
PCR: Phản ứng khuếch đại gen
X-gal : 5- bromo- 4- chloro- 3- indodyl- β- galactosidase
WT: chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus hoang dại
WT/rapG: chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus mang hai bản sao gen rapG
MỞ ĐẦU
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp nhiều chất chuyển hóa
thứ cấp khác nhau, đặc biệt là các chất có hoạt tính sinh học như chất kháng khuẩn,
kháng nấm, kháng virus, chống ung thư, ức chế miễn dịch hoặc enzyme. Đến nay, có
khoảng 23000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đã được tìm thấy và có
10000 hoạt chất thu được từ xạ khuẩn. Trong đó, các chất chuyển hóa thứ cấp từ các
loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces chiếm 68%, còn lại thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm-
non-Streptomyces. Streptomyces rapamycinicus là loài xạ khuẩn thuộc chi
Streptomyces, trước đây được định danh là Streptomyces hygroscopicus, được phân
lập từ mẫu đất trên đảo Phục Sinh, Chile. Đây là loài xạ khuẩn có khả năng sinh
rapamycin – hợp chất có khả năng kháng nấm và ức chế miễn dịch mạnh. Rapamycin
là một trong 31 macrolide trong tự nhiên có chứa vòng lacton lớn trong phân tử, được
chứng minh có hoạt tính chống nấm, chống u, bảo vệ thần kinh và đặc biệt hữu ích
trong ngăn chặn việc thải ghép thận [17]. Rapamycin ban đầu được nghiên cứu như
một hoạt chất chống nấm và chống u. Tuy nhiên, đặc tính giảm bạch cầu lymphô làm
cho rapamycin có vai trò như là một ức chế miễn dịch. Khả năng ức chế miễn dịch
của rapamycin đã được ứng dụng để sản xuất thuốc chống thải ghép dưới tên thương
mại là Sirolimus và thường được sử dụng điều trị cho các bệnh nhân ghép tạng. Đây
là một trong số ít kháng sinh được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ
(FDA, Food and Drug Administration) chấp nhận sử dụng (tháng 9/1999) trong bệnh
viện cho các trường hợp ghép tạng.
Rapamycin có nhiều ứng dụng trong y khoa nhưng hiệu quả sản sinh
rapamycin của các chủng hoang dại còn nhiều hạn chế. Do đó, nghiên cứu làm tăng
khả năng sinh rapamycin của các chủng này có tính thực tiễn, ứng dụng cao và trong
tương lai có thể áp dụng cho sản xuất rapamycin lượng lớn trong công nghiệp. Với
mục tiêu đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tăng
khả năng sinh tổng hợp rapamycin của Streptomyces rapamycinicus”. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng các kỹ thuật di truyền để chèn thêm một phiên
bản của gen điều hòa dương rapG vào hệ gen của chủng Streptomyces rapamycinicus
1
DSM 41530 hoang dại. Từ đó, chúng tôi đã nghiên cứu sâu hơn các điều kiện nuôi
cấy cũng như các yếu tố khác nhằm thu được lượng rapamycin lớn nhất từ chủng xạ
khuẩn chuyển gen.
2
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu nhằm thực hiện các mục tiêu cụ thể sau:
1. Tạo chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus đột biến có khả năng sinh
lượng rapamycin cao hơn chủng xạ khuẩn hoang dại.
2. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để thu lượng rapamycin lớn nhất.
3
Chương 1 - TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Xạ khuẩn
1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi sinh vật nhân sơ thuộc lớp
Actinobacteria, bộ Actinomycestales, thuộc nhóm Gram dương [13]. Thuật ngữ
“actinomyces” xuất phát từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là mang cả đặc điểm của vi khuẩn
và nấm [4]. Xạ khuẩn có khoảng 100 chi với hơn 1000 loài. Chúng là những vi sinh
vật đơn bào, rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân
nhánh tương tự như nấm mốc. Mạng lưới phân nhánh của hệ sợi thường phát triển ở
cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất
[23]. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, thô ráp, phát triển sâu vào bề mặt thạch,
kích thước khuẩn lạc khác nhau tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và điều kiện nuôi cấy.
Phần lớn xạ khuẩn sinh bào tử, bào tử được hình thành trên các nhánh phân hóa của
khuẩn ty khí sinh- gọi là cuống sinh bào tử, bào tử có dạng hình cầu, hình que hoặc
hình oval. Xạ khuẩn có khả năng tiết sắc tố vào môi trường nuôi với nhiều màu đa
dạng như đỏ, da cam, vàng, nâu, đen. Nhiệt độ để xạ khuẩn phát triển tốt nhất là 25-
35°C, tuy vậy nhiều loài xạ khuẩn đã được phân lập từ các môi trường khắc nghiệt;
ví dụ như Nocardiopsis alkaliphila được phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống
ở pH 9.5-10, tồn tại trong trầm tích biển sâu như rãnh Mariana hoặc Nam Cực [4, 19].
Xạ khuẩn nhạy cảm với độ axit (pH thấp), chúng phát triển tốt trong môi trường pH
trung tính (6.5-8.0).
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy
chủ yếu trong đất, phù sa và thảm thực vật mục nát, ước tính có 104-108 CFU trong 1
gram đất [4]. Xạ khuẩn đóng vai trò về mặt sinh thái quan trọng trong vòng tuần hoàn
tự nhiên. Chúng tham gia vào quá trình phân giải và sử dụng các chất hữu cơ khó
phân hủy như humic acid trong đất, cellulose, tinh bột. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả
năng hòa tan lignin và phân hủy các hợp chất liên quan đến lignin bằng cách sinh các
enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và các peroxidase ngoại bào [34]. Ngoài
4
ra, nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng kiểm soát bệnh cây
trồng.
Xạ khuẩn được chia thành 2 loại: Streptomyces và non-Streptomyces. Chi xạ
khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces với khoảng 500 loài đã được mô tả
[3]. Các loài xạ khuẩn thuộc chi này đóng góp hơn 70% trong số hơn 5000 chất kháng
sinh thu được từ vi khuẩn và nấm sợi.
1.1.2. Ứng dụng của xạ khuẩn
Xạ khuẩn được biết đến với nhiều ứng dụng liên quan tới nhiều lĩnh vực khác
nhau trong cuộc sống như sản xuất thuốc, sản xuất chế phẩm kháng bệnh, ứng dụng
bảo vệ thực vật.
Trong nông nghiệp, sử dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ xạ khuẩn
nhằm mục đích chống bệnh do nấm, do vi khuẩn gây ra trên rau quả và cây trồng,
kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
và Micromonospora sử dụng hợp chất giàu carbon và ni-tơ như cellulose,
hemicellulose, protein và lignin trong đất, phân hủy chúng thành mùn [4]. Một số
khác sản xuất enzyme ngoại bào như chitinase, gelatinase và catalase có khả năng
phân giải các chất hữu cơ phức tạp. Dịch lên men của các chủng xạ khuẩn còn được
dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt.
Một số loài xạ khuẩn như S. albviridis, S. griseoviridis có khả năng sinh chất kích
thích tăng trưởng thực vật – gibberellin, auxin và cytokinin, kích thích sự phát triển
của cây trồng [32].
Trong công nghiệp, xạ khuẩn có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme như
amylase, cellulase, protease, xylanase ứng dụng trong các ngành công nghiệp như
thực phẩm, dệt may, y sinh và sản xuất chất tẩy rửa. Cellulase phân giải cellulose
thành đường và vì vậy là enzyme công nghiệp quan trọng trong sản xuất nhiên liệu
sinh học. Các loài S. ruber, S. lividans, S. rutgersensis sinh cellulase có khả năng
chịu nhiệt cao và được ứng dụng làm chất bổ sung trong chất tẩy rửa, phụ gia, bột
giấy [37]. Protease được tìm thấy từ dịch nuôi các loài thuộc chi Streptomyces,
Nocardia, Nocardiopsis được sử dụng để xử lý các chất thải công nghiệp, làm chất
5
tẩy rửa và khử mùi [37]. Streptomyces spp. và Actinomadura keratinilytica có khả
năng sinh enzyme keratinase, phân hủy rác thải có nguồn gốc từ lông, móng, len [4].
Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu về tiềm năng vi sinh vật trong môi
trường khắc nghiệt để có thể sản xuất các enzyme mới, thân thiện với môi trường
theo xu hướng công nghệ sinh học xanh.
Ngoài ra, xạ khuẩn được ứng dụng để cung cấp phần lớn các loại kháng sinh,
chất kháng nấm, chất ức chế miễn dịch, chất chống ung thư mà con người đang sử
dụng hiện nay. Kháng sinh đầu tiên được biết đến là penicillin (1928) được phát hiện
bởi nhà khoa học A. Fleming, khi ông vô tình thấy rằng nấm Penicillin notatum tạo
vùng kháng khuẩn trên đĩa Staphylococcus [33].Từ đó, việc tìm kiếm các chất kháng
sinh từ vi sinh vật được chú ý đến nhiều hơn. Các chất có hoạt tính kháng nấm như
nystatin có nguồn gốc từ xạ khuẩn S. noursei, được phát hiện lần đầu vào năm 1950
và được sử dụng điều trị nhiễm nấm Candida trên da [44]. Amphotericin B, sản xuất
bởi S. nodosus phân lập từ mẫu đất Venezuela (1955) là một chất chống nấm mạnh,
được sử dụng để điều trị nhiều chứng nhiễm nấm nghiêm trọng [43]. Hiện nay, các
nhà khoa học đang hướng tới nghiên cứu nhiều loài xạ khuẩn khác, đặc biệt là nhóm
xạ khuẩn hiếm để tìm ra các chất có hoạt tính sinh học mới, có tính ứng dụng cao
trong y học.
1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn trong sản xuất các chất trong y học
Từ lâu, xạ khuẩn được biết đến nhiều với khả năng sản xuất các chất thứ cấp có
hoạt tính sinh học. Trong số 22500 hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật, số
chất thu từ xạ khuẩn chiếm 45%, 38% từ nấm sợi và 17% từ các loại vi sinh vật khác
[3]. Các chất thứ cấp có ứng dụng rất lớn trong sản xuất thuốc chống nấm (nystatin),
chống vi khuẩn (streptomycin, chloramphenicol, tetracycline), thuốc kháng virut
(tunicamycin), thuốc ức chế miễn dịch (rapamycin), thuộc hạ sốt (avermectin), thuốc
chống ung thư (actinomycin, mitomycin C, anthracyclines), enzyme ức chế (axit
clavulanic). Năm 1914-1939, Selman A. Waksman đã liên tục phân lập và sàng lọc
vi khuẩn và nấm sợi từ đất để tìm các loại kháng sinh mới. Trong những năm 1940,
Waksman cùng các cộng sự đã phát hiện ra hơn 15 loại kháng sinh như actinomycin,
6
clavacin, grisein. Đáng chú ý nhất là nhóm nghiên cứu của ông đã tìm ra streptomycin
từ loài Streptomyces griseus (1944). Đây là kháng sinh điều trị hiệu quả đầu tiên cho
bệnh lao và neomycin từ loài Streptomyces fradiae (1949) – kháng sinh điều trị nhiễm
trùng sau phẫu thuật đường ruột [47]. Sau đó, nhiều nghiên cứu khác đã phát hiện ra
nhiều hoạt chất mới được tách từ xạ khuẩn có ứng dụng lớn trong y học. Ví dụ,
nystatin từ Streptomyces noursei đã được chứng minh khả năng kháng nấm Candida
albicans, còn tetracyclin, được tách chiết từ một số chủng xạ khuẩn thuộc chi
Streptomyces (S. aureofaciens, S.rimosus, S. viridifaciens), là loại kháng sinh có phổ
rộng, chống lại được cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm [2].
Bên cạnh các chất kháng sinh, các chất có hoạt tính sinh học giữ vai trò quan
trọng trong việc điều trị bệnh và ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe và cuộc sống của
con người. Trong khi hầu hết các hoạt chất phức tạp như các hợp chất có nguồn gốc
từ vòng cacbon thơm hoặc các gốc ankyl khó có thể tổng hợp bằng con đường hóa
học, thu một hợp chất từ chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp chất đó được coi là
giải pháp hữu ích và hiệu quả. Xạ khuẩn là một trong những nguồn quan trọng nhất
để cung cấp lượng thuốc ra thị trường và khám phá ra các hợp chất sinh học mới.
Năm 2011, maklamicin – một polyketide mới được tìm thấy từ dịch tách chiết chủng
nội sinh Micromonospora sp. GMKU326 phân lập tại Thái Lan [21]. Maklamicin là
hợp chất đa vòng có khả năng kháng khuẩn mạnh, đặc biệt kháng mạnh các vi khuẩn
Gram dương như Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, kháng nấm C. alibicans và
có khả năng gây độc tế bào ung thư. Bên cạnh đó, nhiều hợp chất chống nấm, chống
virut đã được tìm thấy. Sceliphrolactam là chất chuyển hóa thứ cấp sản xuất từ xạ
khuẩn Streptomyces sp. sống liên kết với loài côn trùng cánh màng Sceliphron
caementarium. Sceliphrolactam đã được chứng minh hoạt tính kháng nấm mạnh đối
với chủng nấm C. alibicans kháng amphotericin [39]. 15-glycidylfilipin III là hợp
chất ức chế mạnh mẽ nấm C. albicans với giá trị MIC là 6,25 µg/mL, gấp 2 lần so
với giá trị MIC của nystatin là 3,13 µg/mL [50]. 15-glycidylfilipin III được tìm thấy
từ chủng xạ khuẩn đất S. lavenduligawnus. Sáu loại thuốc khử trùng mới –
enduspeptide A-F, được sản xuất từ chủng Streptomyces sp. phân lập từ mẫu đất lấy
7
từ mỏ than ở độ sâu 20 cm, Trung Quốc [9]. Trong đó, enduspeptide A và C có khả
năng kháng chủng C. glabrata ATCC 90030 mạnh nhất. Nghiên cứu về chủng xạ
khuẩn Streptomyces kaviengensis phân lập từ bờ biển New Ireland thuộc Papua New
Guinea đã xác định một chất chuyển hóa mới là antimycin A1a có hoạt tính chống
virut đáng kể [45]. Hợp chất antimycin A1a là dẫn xuất của antimycin A, có tiềm
năng chống lại virus viêm não ngựa miền Tây. Phân tích cơ chế hoạt động của
antimycin A1a cho thấy hợp chất làm gián đoạn vận chuyển điện tử của ty thể và quá
trình sinh tổng hợp pyrimidine. Hơn nữa, antimycin A đã được biết đến với khả năng
kháng ARN virut, hoạt động phổ rộng trên các họ Togaviridae, Flaviridae,
Bynyaviridae, Picornaviridae và Paramyxoviridae. Gần đây nhất vào năm 2018,
ahmpatinin iBu đã được chứng minh khả năng ức chế chống lại protease HIV-1, đây
là hợp chất được tìm thấy từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. CPCC 202950 nuôi
trên môi trường gạo ngâm vô trùng [6]. Nhìn chung, đa số các loài xạ khuẩn có khả
năng sinh các chất có hoạt tính sinh học mạnh và được ứng dụng nhiều trong thực tế.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất, phụ thuộc
vào cơ chế biểu hiện gen, ảnh hưởng của enzyme. Việc tìm kiếm các hợp chất mới
có hoạt tính sinh học mới có khả năng chống lại các vi khuẩn, virut gây bệnh kháng
thuốc đang là một lĩnh vực quan trọng của nghiên cứu hợp chất. Hiện nay, tình trạng
đa kháng thuốc là một trong những khó khăn trong việc điều trị các bệnh truyền nhiễm
cộng đồng, đặc biệt là ở bệnh viện. Hầu hết, các nghiên cứu nhiều năm gần đây tập
trung vào kháng các vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus MRSA, tuy
nhiên những kháng sinh có khả năng kháng khuẩn kháng thuốc là rất ít. Do đó, các
hoạt chất mới từ xạ khuẩn có khả năng trị bệnh hiệu quả cao, ít tác dụng phụ được
quan tâm nghiên cứu. Tháng 9/ 1999, chất chống nấm rapamycin (sản xuất bởi chủng
S. rapamycinicus) dưới tên thương mại là Sirolimus đã được Cục quản lý Thực phẩm
và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp nhận sử dụng để điều trị trong bệnh viện. Đây là
một trong những loại thuốc được dùng chống thải ghép cho các bệnh nhân ghép tạng
mà gây ra ít tác dụng phụ.
8
1.1.4. Streptomyces rapamycinicus
Streptomyces rapamycinicus thuộc chi Streptomyces, là vi khuẩn Gram dương,
sống hiếu khí. S. rapamycinicus được các nhà khoa học Brazil phân lập vào những
năm 1960 từ mẫu đất thu được ở vùng núi Rapa Nui, Đảo Phục Sinh, Chile [31]. Đây
là chủng xạ khuẩn có khả năng sinh hợp chất có hoạt tính sinh học rapamycin.
Trên môi trường ISP2, chủng Streptomyces rapamycinicus có màu vàng nhạt
đến trắng, khuẩn lạc tròn, bề mặt nhăn, thô, xù xì, đường kính khuẩn lạc từ 4-7 mm,
không sinh sắc tố (Hình 1.1). Hệ sợi cơ chất bám sâu vào bề mặt thạch, hệ sợi khí
sinh màu trắng. Sau 8-10 ngày nuôi, hệ sợi trắng chuyển màu xám dần và hình thành
bào tử màu đen. Nhiệt độ thích hợp để nuôi chủng xạ khuẩn là 25-30°C trong điều
kiện hiếu khí.
Hình 1.1. Streptomyces rapamycinicus trên môi trường thạch ISP2 [54].
9
1.2. Rapamycin
1.2.1. Tính chất và cấu trúc hóa học
Rapamycin (sirolimus, rapamune) có công thức phân tử là C51H79NO13, trọng
lượng phân tử 914,2 g/mol. Rapamycin là chất rắn màu trắng hoặc vàng nhạt, điểm
nóng chảy 183-185°C, hòa tan tốt trong DMSO (25 mg/ml), methanol (25 mg/ml),
chloroform (5 mg/ml) và một số dung môi khác như ethanol, ether, acetone, không
tan trong nước, tan rất ít trong hexan. Phổ hấp phụ UV tương ứng tại bước sóng 272
nm.
Rapamycin là kháng sinh thuộc nhóm macrolide, có nhiều vòng lactone trong
cấu trúc phân tử (Hình 1.2.). Cấu trúc rapamycin gồm 29 vòng chứa 4 liên kết đôi
dạng tran, ¾ liên kết này dạng liên hợp.
Hình 1.2. Cấu trúc rapamycin [42]
1.2.2. Vai trò của rapamycin trong đáp ứng miễn dịch
Rapamycin được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1975 từ loài Streptomyces
hygroscopicus và được biết đến như một kháng sinh có khả năng kháng nấm (chi
Candida – gây bệnh phổ biến ở người). Rapamycin có độ đặc hiệu và độc tính tương
đối thấp và hấp thu tốt ở chuột và chó [41]. Tuy nhiên, tính kháng nấm của rapamycin
không được ứng dụng nhiều vì những tác dụng phụ khi thử nghiệm lâm sàng trên
chuột và cơ chế kháng nấm chưa rõ ràng. Sau đó, rapamycin trở nên nổi bật hơn với
các nghiên cứu về khả năng kháng khối u, ức chế miễn dịch, bảo vệ thần kinh và
chống lão hóa [35]. Đặc biệt, khả năng ức chế miễn dịch của rapamycin đã được ứng
dụng để sản xuất thuốc chống thải ghép dưới tên thương mại là Sirolimus và thường
10
được sử dụng điều trị cho các bệnh nhân ghép tạng. Đây là một trong số ít kháng sinh
được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA, Food and Drug
Administration) chấp nhận sử dụng (T9/1999) trong bệnh viện cho các trường hợp
ghép tạng [31]. Trước đây, các bệnh viện thường sử dụng tacrolimus hoặc
mycophenolate mofetil để điều trị cho các bệnh nhân ghép thận. Tuy nhiên, bệnh
nhân sử dụng các loại thuốc này trong thời gian dài sẽ làm chức năng thận bị suy yếu,
thậm chí suy thận mãn tính. Sirolimus là loại thuốc thay thế có thể khắc phục những
tác dụng phụ đó. Một thử nghiệm lâm sàng khác sử dụng rapamycin cho bệnh nhân
ghép thận không gây ra bệnh tiểu đường ở những bệnh nhân này trong 3 năm theo
dõi. Đối với bệnh nhân ghép tạng đã bị tiểu đường từ trước và được điều trị thành
công bằng rapamycin, việc sử dụng rapamycin không làm bệnh tiểu đường của họ
nặng hơn [5]. Hiện nay, sirolimus có thể được sử dụng một mình hoặc sử dụng kết
hợp (tacrolimus) để điều trị cho bệnh nhân ghép tạng.
1.2.3. Sinh tổng hợp rapamycin và cơ chế điều hòa
Quá trình sinh tổng hợp polyketide - rapamycin bắt đầu với đơn vị khởi động là
4,5- dihydroxycyclohex- 1- ene carboxylic acid (DHCHC) [16]. Dưới tác động của
cụm enzyme đa chức năng gồm RapA, RapB và RapC (vùng PKS), DHCHC được
kéo dài qua 14 bước trùng ngưng tạo chuỗi polyketide. Cụm enzyme đa chức năng
gồm 14 cấu phần (modules), mỗi cấu phần đảm nhiệm một chức năng khác nhau [42].
RapA gồm modules 1-4, liên quan đến quá trình bắt đầu và kéo dài chuỗi polyketide,
RapB gồm modules 5-10 phụ trách kéo dài chuỗi đến C16 và RapC gồm modules 11-
14 chịu trách nhiệm kết thúc polyketide của vòng macrolactone. Ngoài vùng PKS, có
các gen khác liên quan tới quá trình sinh tổng hợp rapamycin như gen rapL mã hóa
cho enzyme lysine cyclodeaminase, xúc tác tổng hợp pipecolate từ lysine, pipecolate
là tiền chất tạo vòng trong cấu trúc phân tử rapamycin [20,30]. Gen rapP mã hóa cho
một protein chuyên biệt, enzyme này gắn với pipecolate, đưa phức hợp này vào khung
polyketide và xúc tác đóng vòng tạo tiền chất rapamycin [42]. Ngoài ra, quá trình
hình thành phân tử rapamycin từ tiền chất rapamycin phụ thuộc vào một số gen khác
như rapJ và rapN mã hóa cho enzyme cytochrome P450, xúc tác cho bước oxi hóa
11
tại C9 và C27 (Hình 1.3.). rapM, rapI, rapQ mã hóa cho enzyme methyltransferase
– xúc tác quá trình methyl hóa tại vị trí Cacbon tương ứng C16, C27 và C39 [24].
Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp rapamycin
Một số protein điều hòa và các yếu tố vật lý, yếu tố hóa học bao gồm các nguồn
dinh dưỡng có thể ảnh hưởng tới một loạt các quá trình sinh lý liên quan tới quá đến
quá trình sinh tổng hợp chất thứ cấp. Đối với rapamycin, cơ chế điều hòa đã được
chứng minh là chịu tác động của một số gen liên quan. rapR, rapS và rapY đã được
chứng minh có vai trò tiêu cực tới khả năng sinh tổng hợp rapamycin, khi xóa các
gen này lượng rapamycin thu được tăng từ 3-5 lần so với chủng hoang dại [52]. Bên
cạnh đó, gen rapH và rapG được chứng minh là gen điều hòa dương cho quá trình
sinh tổng hợp rapamycin. Cả hai gen này đều có vùng mã hóa cho codon leucine
TTA, đây là một trong những vùng cần thiết cho quá trình chuyển hóa chất thứ cấp ở
các loài thuộc chi Streptomyces. Đồng thời, giải trình tự gen rapG cho thấy độ tương
đồng về trình tự so với gen mã hóa protein điều hòa dương SoxS và Rob ở E. coli
[42]. Khi gây đột biến tăng cường biểu hiện gen rapG hoặc gen rapH với hệ thống
biểu hiện ActII-ORF4/PactI trong genome chủng xạ khuẩn hoang dại, lượng
rapamycin tăng đến 55% [29]. Khi xóa cả hai gen này, không thể định lượng
rapamycin. Do đó, việc tìm ra cơ chế điều hòa quá trình sinh tổng hợp rapamycin
thông qua sự biểu hiện các gen giúp chúng ta xác định được gen mục tiêu ảnh hưởng
như thế nào đến hiệu suất sinh tổng hợp rapamycin.
12
1.2.4. Cơ chế tác động của rapamycin
Cơ chế tác động của rapamycin lên tế bào liên quan đến quá trình ức chế một
loại protein kinase ở động vật có vú – mTOR. Protein mTOR có chức năng kiểm soát
sự phát triển, sự tăng sinh của tế bào. Rapamycin kết hợp với thụ thể nội bào - protein
liên kết FKBP12 thành một phức hợp, hoạt động như một chất ức chế mTOR, phức
hợp này gắn vào protein mTOR làm thay đổi cấu trúc protein dẫn tới mTOR bị ức
chế, không điều khiển sự tăng sinh của tế bào trong cơ thể [1]. Đối với tế bào lympho
T và tế bào B là hai thành phần quan trọng trong hệ thống miễn dịch, việc giảm tăng
sinh hai loại tế bào này sẽ làm suy giảm hệ thống miễn dịch của cơ thể. Trong trường
hợp bệnh nhân ghép tạng, việc làm giảm hệ thống miễn dịch sẽ làm giảm khả năng
đào thải các mô lạ, góp phần thành công cho các ca ghép tạng. Cùng với cơ chế ức
chế sự tăng sinh tế bào, rapamycin còn được ứng dụng để điều trị ung thư. Việc ức
chế quá trình tăng sinh của tế bào trong đó có các tế bào ung thư sẽ làm giảm sự phát
triển của khối u, gây apoptosis tế bào khối u và ngăn chặn sự hình thành khối u.
1.3. Kỹ thuật di truyền
1.3.1. Giới thiệu chung
Kỹ thuật di truyền là kỹ thuật sửa đổi cấu trúc di truyền của một sinh vật, các
thay đổi về cấu trúc có thể tạo ra bằng các phương pháp sinh học phân tử để tách
ADN từ một cơ thể sống và sau đó cắt, nối các gen trên ADN [38]. Bằng cách đó,
người ta có thể loại bỏ các gen không mong muốn và đưa vào các gen mới đặc hiệu
theo chủ ý lựa chọn, từ đó tạo ra những sinh vật mới mang những đặc điểm phù hợp
với mục đích sử dụng. Phương pháp này thường được áp dụng cho biến đổi gen ở
thực vật và vi sinh vật nhằm tạo giống mới như tạo các giống lúa chịu hạn, chịu mặn
hoặc tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất lượng lớn enzyme, protein. Trên thế
giới, kỹ thuật di truyền đã được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm ở các
lĩnh vực nghiên cứu khác nhau. Việc cải biến gen của các chủng sinh vật không còn
là vấn đề xa vời và bất khả thi. Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật di truyền chưa được
áp dụng phổ biến để tạo chủng đột biến, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở đột biến ngẫu
nhiên, đột biến chưa xác định gen mục tiêu. Do đó, các kết quả nghiên cứu còn hạn
13
chế, việc ứng dụng kỹ thuật di truyền trong cải biến chủng sẽ mang lại hiệu quả về
xác định mục tiêu đột biến và gây đột biến đúng điểm.
1.3.2. Một số phương pháp thường sử dụng trong kỹ thuật di truyền
Một trong những ứng dụng của kỹ thuật di truyền trong vi sinh vật là cải biến
tạo chủng mới. Đây là một hướng đi rất quan trọng trên thế giới để làm tăng khả năng
sinh các chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học và tạo ra được những chủng sản
xuất tốt có thể đưa vào ứng dụng thực tiễn. Có rất nhiều phương pháp cải biến di
truyền đã được phát triển, nhưng có thể coi thuộc hai nhóm phương pháp chủ yếu là
sử dụng đột biến ngẫu nhiên và đột biến gen mục tiêu.
Đột biến ngẫu nhiên là quá trình xảy ra đột ngột, riêng rẽ, không định hướng ở
cơ thể sống. Đột biến ngẫu nhiên được chia thành các dạng: đột biến gen gồm các
dạng như mất, thêm, thay thế nucleotide và đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể. Đột biến
gây ra chủ yếu bởi các tác nhân vật lý: tia UV, tia phóng xạ,...; tác nhân hóa học như
sử dụng các chất gây đột biến: 5-Bromuraxin (5BU), Etyl-Metyl-Sunfomat (EMS),
acridine,...; tác nhân sinh học (vi khuẩn, vi rút). Phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên
thường ít được sử dụng vì tốn nhiều thời gian, công sức, thậm chí nguy cơ gây hại
cho người thực hiện khi sử dụng các chất hóa học độc hại và không điều khiển được
hướng đột biến như mong muốn. Trong khi đó, phương pháp gây đột biến mục tiêu
sử dụng các kỹ thuật chỉnh sửa ADN đã và đang được nhiều phòng thí nghiệm trên
thế giới áp dụng bởi tính hiệu quả cao, điều khiển được hướng đột biến như mong
muốn. Các hướng đột biến thường hướng tới việc tăng cường biểu hiện gen điều hòa
dương, giảm số gen điều hòa âm hoặc chuyển toàn bộ cụm gen mã hóa vào chủng sản
xuất, tăng số lượng phiên bản gen cấu trúc [40]. Nhiều nghiên cứu sử dụng các
phương pháp đột biến này cũng đã thu được nhiều kết quả khả quan nhằm tăng lượng
chất chuyển hóa trong tế bào.
1.3.3. Ứng dụng
Kỹ thuật di truyền có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như phân
tích pháp y, chuẩn đoán bệnh trong y tế, lập bản đồ gen, giải trình tự hệ gen, đặc biệt
14
ứng dụng trong ngành công nghệ sinh học như tạo ra sinh vật biến đổi gen. Các lĩnh
vực sử dụng kỹ thuật di truyền được chia thành 4 nhóm chính:
Nghiên cứu về cấu trúc và chức năng gen: Gen là đơn vị cơ bản của di truyền ở
tất cả các sinh vật, có thể ảnh hưởng đến hình thái hoặc chức năng của một cơ thể.
Nghiên cứu về cấu trúc gen giúp chúng ta hiểu biết về chức năng, vai trò của gen.
Bên cạnh đó, phương pháp giải trình tự giúp ta nắm được thông tin trình tự gen và
xác định loài sinh vật (định danh).
Sản xuất protein bằng phương pháp mới: Năm 1976, công ty đầu tiên trong
ngành kỹ thuật sinh học được thành lâp. Năm 1978, công ty đã sản xuất insulin con
người và vi khuẩn có khả năng tự tạo ra insulin được thương mại hóa vào năm 1982.
Sau đó, ứng dụng kỹ thuật di truyền để sản xuất protein xuất hiện ngày càng nhiều,
điển hình là các sản phẩm protein đơn bào (protein single cell), các protein có hoạt
tính sinh học dùng để chữa bệnh như insulin, interferon, hormone tăng trưởng.
Sinh vật biến đổi gen (GMO) là sinh vật mà vật liệu di truyền của nó đã bị biến
đổi theo ý muốn chủ quan của con người. Mục tiêu của GMO là tạo ra những chủng
giống mới có những đặc điểm vượt trội so với giống cũ như ngô biến đổi gen cho
năng suất tăng nhiều lần so với giống cũ, lúa có khả năng chịu hạn, kháng nhiều sâu
bệnh, năng suất thu hoạch cao.
Chẩn đoán và điều trị y tế: Vận dụng kỹ thuật di truyền để có thể chẩn đoán các
bệnh do rối loạn di truyền và tiến tới điều trị bằng cách thay gen bệnh bằng gen lành.
Phân tích miễn dịch, định vị khối u, xác định sự có mặt của các loại vi khuẩn khác
nhau,...giúp bác sĩ xác định bệnh một cách nhanh chóng và chính xác. Ngoài ra, sản
xuất thuốc kháng sinh, vacxin, kháng thể đơn dòng.
1.4. Tình hình nghiên cứu tăng hiệu suất tổng hợp rapamycin
1.4.1. Các nghiên cứu nhằm tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng xạ khuẩn
Hiện nay, sản xuất rapamycin trong thương mại chủ yếu là thu từ quá trình lên
men tế bào chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus [8]. Do đó, có nhiều nghiên
cứu quan tâm về thành phần môi trường, thành phần lên men, điều kiện nuôi cấy
nhằm mục đích thu được lượng rapamycin lớn nhất. Trước đây, nhiều nghiên cứu về
15
con đường sinh tổng hợp rapamycin chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh
rapamycin gồm các tiền chất (acetate, propionate, shikimate, L-methionine, L-
Lysine), nguồn Cacbon và nguồn Nito [26, 41]. Khảo sát 35 nguồn Cacbon được lựa
chọn để xác định khả năng sinh rapamycin trong quá trình lên men bao gồm các
polysacarit, oligosacarit, monosacarit, các axit hữu cơ, lipid cho thấy: tám nguồn
Cacbon không làm tăng lượng rapamycin, 7 nguồn Cacbon ức chế quá trình sinh
rapamycin. Việc sử dụng kết hợp hai nguồn Cacbon là Fructose 2% và mannose 0,5%
cho thấy lượng rapamycin thu được lớn [26]. Acetate và propionate tham gia vào quá
trình đóng vòng lactone nhưng không ảnh hưởng tới quá trình sản xuất rapamycin.
Trong một nghiên cứu khác, sáu hợp chất nitơ vô cơ bao gồm ammonium sulfate,
ammonium nitrat, ammonium clorua, ammonium citrate, ure, kali nitrat, được bổ
sung vào môi trường nuôi S. hygroscopicus và sử dụng như nguồn nitơ cho quá trình
sinh tổng hợp rapamycin [36]. Trong đó, ammonium sulfate được bổ sung vào môi
trường lên men với nồng độ 40 nmM có ảnh hưởng tốt nhất đến quá trình sinh
rapamycin và hỗ trợ tăng sinh tế bào. Lượng rapamycin thu được tăng hơn 30% so
với môi trường đối chứng được bổ sung ba nguồn nitơ hữu cơ (aspartate, arginine,
histidine). Ba loại axit amin là lysine, torysin và glutamin được bổ sung vào môi
trường lên men ở giai đoạn đầu làm tăng lượng rapamycin lên tới 182% [49]. Nhóm
nghiên cứu của Demain đã chỉ ra tác dụng của phosphat, ammonium, muối magie và
muối sắt đến khả năng sinh tổng hợp rapamycin [10]. Nồng độ amoni (NH4Cl),
phosphate (KH2PO4), muối magie (MgSO4.7H2O) tối ưu cho quá trình tăng trưởng là
thích hợp nhất cho quá trình sinh rapamycin. Bổ sung muối sắt (FeSO4) với nồng độ
0,36 mM làm tăng khả năng sinh rapamycin. Bên cạnh các yếu tố dinh dưỡng, pH là
một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật
và khả năng sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp. Trong quá trình nuôi cấy
chủng S. hygroscopicus, sự thay đổi pH từ 6-8 trong hai giai đoạn khác nhau của quá
trình lên men đã cho thấy sự thay đổi pH dẫn tới thay đổi lượng rapamycin thu được.
Không điều chỉnh pH tại giai đoạn 1 và giữ pH 5,5 tại giai đoạn 2 thu được lượng
16
rapamycin 573± 23 mg/L cao hơn so với giữ pH 7,0 ( 45 ± 5 mg/L) và không điều
chỉnh pH (98 ± 5 mg/L) [51].
Axit shikimic đóng vai trò là tiền chất cho quá trình sinh tổng hợp DHCHC và
quá trình đóng vòng macrolacton từ 7 đơn vị acetate và 7 đơn vị propionate [42]. Một
nghiên cứu của Geng và cộng sự đã khảo sát ảnh hưởng của shikimate bổ sung từ bên
ngoài đối với các chủng xạ khuẩn đột biến ngẫu nhiên bằng tia UV và sàng lọc các
thể đột biến trên môi trường bổ sung axit shikimic ở các nồng độ khác nhau. Kết quả
cho thấy lượng rapamycin thu được tăng lên khi thêm axit shikimic trong quá trình
lên men sinh rapamycin của các chủng xạ khuẩn đột biến, cụ thể là tăng cường quá
trình biểu hiện gen rapK [15]. Khi bổ sung 57 mmol/L shikimate vào môi trường nuôi
cấy chủng xạ khuẩn đột biến ngẫu nhiên S. hygroscopicus C9 làm tăng lượng
rapamycin sinh ra gấp đôi so với nuôi trong môi trường đối chứng [14]. Theo một
nghiên cứu khác cho thấy nồng độ axit shikimic cao dẫn đến axit chorismic ở mức
cao. Axit chorismic là sản phẩm cuối cùng của con đường chuyển hóa axit shikimic
và là tiền chất của DHCHC, các axit amin thơm như phenyl alanine, tyrosine,
tryptophan [53]. Axit shikimic là một hợp chất có giá trị cao, được sử dụng làm
nguyên liệu khởi đầu chính cho quá trình tổng hợp oseltamivir phosphate. Oseltamivir
phosphate là một loại thuốc chống virut dưới tên Tamiflu [27]. Trước đây, axit
shikimic được tách chiết từ cây Illocium, hay còn gọi là đại hồi (Việt Nam) với hiệu
suất 6-8%. Trong quy mô phòng thí nghiệm, lượng axit shikimic thu từ đại hồi có thể
dùng cho các thí nghiệm nghiên cứu. Axit shikimic có khả năng tan tốt trong nước
(18 g/100mL, 23°C). Do đó, có thể tách chiết dễ dàng axit shikimic từ đại hồi với
nước nóng 120°C trở lên trong khoảng 5 phút [18].
Glycerol là thành phần trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật đóng vai trò như
nguồn Cacbon và nguồn năng lượng. Theo nghiên cứu của Chen (2012), quá trình lên
men chủng Streptomyces sp. M-Z18 sử dụng glucose /glycerol với tỷ lệ tối ưu 30/30
thu lượng ɛ-poly-L-Lysine là 35,14 g/L, cao hơn 1,43 lần so với lên men với glucose
và 1,17 lần so với glycerol [7]. Một nhóm nghiên cứu khác đã khảo sát các thành
phần môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn S. rapamycinicus bằng mô hình tối ưu
17
Plackett- Burman [48]. Mô hình đưa ra các thay đổi về lượng tinh bột, glycerol và
NaCl trong môi trường nuôi cấy, đồng thời đánh giá lượng rapamycin thu được trong
mỗi điều kiện. Kết quả cho thấy lượng rapamycin thu được trong môi trường không
có Glycerol thấp hơn so với môi trường có Glycerol, lượng rapamycin thu được cao
nhất là 0,734 mg/g trong môi trường có 80 g/L tinh bột, 74,89 g/L Glycerol và 4,5
g/L NaCl. Trong quá trình nuôi cấy chủng xạ khuẩn, glycerol thường được bổ sung
vào môi trường cùng với các loại đường khác như dextrin, glucose, maltose nhằm
tăng quá trình lên men, sinh tổng hợp các chất thứ cấp. Hiếm khi lựa chọn Glycerol
là nguồn cung cấp năng lượng duy nhất bởi nó là chất cung cấp nhiều năng lượng, tế
bào sẽ liên tục tăng sinh chất chuyển hóa bậc một nên các chất chuyển hóa bậc hai
sinh ra rất ít.
Tóm lại, có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới các chất chuyển hóa bậc hai. Trong
đường cong sinh trưởng của vi sinh vật, ban đầu các tế bào cần một nguồn năng lượng,
nguồn Cacbon ổn định để tổng hợp các chất sơ cấp cần thiết cho tế bào tăng sinh. Sau
đó, pha lên men cần các chất xúc tác gây ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chất
thứ cấp. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn hai thành phần môi trường là
Glycerol và bột Hồi (chứa axit shikimic) để khảo sát tới lượng rapamycin thu được.
1.4.2. Các nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến làm tăng lượng
rapamycin
Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu khoa học nhằm tạo các chủng xạ khuẩn
đột biến có khả năng sinh rapamycin cao. Một số nghiên cứu sử dụng đột biến ngẫu
nhiên để tạo chủng đột biến. Nhóm nghiên cứu của Dutta và Basak đã tạo chủng xạ
khuẩn đột biến NTG-30-27 từ chủng Streptomyces hygroscopicus MTCC 4003 bằng
tia cực tím (UV) và hóa chất gây đột biến N-methyl-N-nitro_N-nitrosoguanidin
(NTG) [12]. Lượng rapamycin thu được từ chủng NTG-30-27 cao hơn 67% so với
chủng đối chứng. Bào tử chủng xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253
được chiếu tia UV để tạo chủng xạ khuẩn đột biến có khả năng sinh rapamycin tăng
3,2 lần (23,6 mg/L) so với chủng hoang dại [22]. Các nghiên cứu sử dụng phương
pháp đột biến ngẫu nhiên cần có nhiều thời gian để sàng lọc, kiểm tra hoạt tính kháng
18
lớn nhất và định lượng rapamycin để tìm được chủng xạ khuẩn đột biến có khả năng
sinh rapamycin cao nhất.
Bên cạnh đó, các nghiên cứu về gen và cụm gen đã xác định chức năng của các
gen trong vùng điều hòa quá trình sinh tổng hợp rapamycin. Bằng phương pháp lai
phân tử, xác định vai trò của RapA, RapB, RapC, RapP là yếu tố mở đầu quá trình
tổng hợp chuỗi polyketide [46]. Ngoài ra, các gen ngoài vùng này cũng được quan
tâm nghiên cứu bởi ảnh hưởng tích cực và tiêu cực của nó đến quá trình sinh tổng
hợp rapamycin. Kuscer Enej và Coates Nigel (2007) đã chứng minh gen rapH và gen
rapG là gen điều hòa dương trong quá trình tổng hợp rapamycin bằng đột biến tăng
cường biểu hiện, mất đoạn gen [29]. Các chủng xạ khuẩn thêm bản copy gen rapG
hoặc rapH hoặc cả hai đều cho lượng rapamycin cao hơn từ 20% - 55% so với chủng
hoang dại, khi xóa cả hai gen rapG và gen rapH không thể định lượng rapamycin.
Tuy nhiên, cơ chế điều hòa quá trình sinh tổng hợp rapamycin của rapG và rapH còn
chưa được làm rõ. Một nghiên cứu khác của Yoo (2015) về các gen điều hòa quá trình
sinh tổng hợp rapamycin đã chứng minh gen rapS-R và rapY là gen điều hòa âm . Khi
lần lượt tạo đột biến mất đoạn gen rapS và rapY, hiệu suất rapamycin tăng thêm 4,6
lần (33,9 mg/L) và 3,7 lần (26,7 mg/L) so với chủng hoang dại.
Như vậy, việc cải biến di truyền tác động vào quá trình điều hòa sinh tổng hợp
rapamycin ở S. rapamycinicus hứa hẹn khả năng tạo ra các chủng có hiệu suất sinh
rapamycin tăng cao. Đó cũng là tiền đề cơ bản để chúng tôi thực hiện đề tài nghiên
cứu được trình bày trong luận văn này.
19
Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy
Chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus DSM41530 được cung cấp từ
Bảo tàng vi sinh vật và tế bào, Viện Leibniz, Đức.
Các chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5α và ET12567/pUZ8002 được cung
cấp bởi phòng Nghiên cứu và phát triển công nghệ, Viện Vi sinh vật và Công nghệ
sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Chủng nấm men Candida albicans VTCC 40674 do Bảo tàng giống chuẩn vi
sinh vật (VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học cung cấp.
Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1
Bảng 2.1. Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật
STT Ký hiệu môi trường Thành phần môi trường (g/L)
NaCl 10 Cao nấm men 5 1 LB pH 7,0 Peptone 10
Agar 16 Cao nấm men 2 2 YS Tinh bột 10
Cao Malt 3 Glucose 3
3 YM Peptone 5
Cao nấm men 3
NaCl 5 Dextrin 40
pH 5,0 L – Lysine HCl 2 4 MD1 Đậu tương 30
Na2HPO4 3
Glucose 20 KH2PO4 5 MD2 5 pH 6,0 Đậu tương 20
Glucose 6 K2HPO4 0,025 MD3 6 Đậu tương 10 Sorbitol 8
20
pH 6,5 (NH4)2SO4 0,2
Manitol 20
7 MS Đậu tương 20
MgCl2 10mM
Cao Malt 10
8 ISP2 Cao nấm men 4
Glucose 4
2.1.2. Vector và oligonucleotide
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector nhân dòng: pGEM-T Easy
Vector (Promega, Mỹ). Vector chuyển gen pSET152 được cung cấp bởi phòng
Nghiên cứu và Phát triển công nghệ cao, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học.
Các cặp oligonucleotide (Bảng 2.2.) được thiết kế để nhân các đoạn gen đích
dựa trên trình tự công bố trên Ngân hàng gen NCBI (X86780.1). Primer được tổng
hợp bởi Integrated DNA Technologies (Mỹ) và Primer Diagnosis Healthcare (Việt
Nam). Trình tự primer được thể hiện trong bảng 2.2.
Probe sử dụng trong lai Southern Blot chứa đoạn trình tự gen rapG có gắn đầu
dò phóng xạ P32 được tổng hợp bởi Merk, Đức.
Bảng 2.2. Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự Gen/Kích
thước
prapGF 5’- GGTCTAGAACCAACGGCGCTGGAGCGGA
G - 3’ rapG/ 1.0 kb prapGR 5’- GGTCTAGAGGTCAGCTGTCGGTCAGCCC
GGTTG-3’
Kích thước M13F(-29) 5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’
gen thêm M13R(-20) 5’-GCGGATAACAATTTCACACAGG-3’
vào
21
2.1.3. Hóa chất và thiết bị
Trong nghiên cứu này, các hóa chất sinh học phân tử như enzyme giới hạn
gồm XbaI, EcoRI, HindIII (Thermo Scientifics, Mỹ), enzyme DNA T4 Ligase, thang
chuẩn ADN (300 bp-10 kb) (Thermo Scientifics, Mỹ), Taq polymerase Go Taq
(Promega, Mỹ), Kit tinh sạch plasmid DNA-spin™ Plasmid DNA Purification Kit
(Intron, Hàn Quốc), kit E.N.Z.A Bacterial DNA kit (Omega, Mỹ), kit tinh sạch sản
phẩm PCR: AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc) được sử dụng,
đảm bảo tính chính xác của các thí nghiệm.
Các loại kháng sinh ampicillin (Wako, Nhật Bản), apramycin (Sigma, Mỹ)
được sử dụng trong các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật.
Các hóa chất pha môi trường, dung dịch đệm, dung dịch rửa cho các thí nghiệm
được cung cấp bởi Sigma (Mỹ).
Thiết bị máy móc gồm : Máy PCR Mastercycler proS của hãng Eppendorf
(Đức), hệ thống điện di của hãng Cleaver Scientific (Mỹ), bàn soi UV Benchtop
Variable Transilluminator (Mỹ), hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) của
hãng Agilent (Mỹ). Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy thông thường như tủ an toàn
sinh học cấp II Esco Labculture kiểu A2 (Mỹ), nồi hấp khử trùng HV Hirayama HV
(Nhật Bản), tủ lắc ổn nhiệt Gyromax 747R của hãng Amerex Instruments (Mỹ) và
một số thiết bị chuyên dụng khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chung
Để thực hiện mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành tạo chủng xạ khuẩn theo các
bước sau (Hình 2.1):
- Thiết kế vector gây đột biến
- Tạo chủng xạ khuẩn chuyển gen
- Kiểm tra chủng xạ khuẩn chuyển gen
22
Hình 2.1. Phương pháp tạo chủng đột biến
Sau khi có chủng xạ khuẩn chuyển gen, tiến hành nuôi các chủng xạ khuẩn
trong các môi trường nuôi cấy khác nhau nhằm định lượng khả năng sinh rapamycin
theo sơ đồ sau:
Hình 2.2. Phương pháp định lượng khả năng sinh rapamycin
23
2.2.2. Phương pháp tách ADN
2.2.2.1. Tách chiết plasmid
Plasmid được tách từ tế bào vi khuẩn bằng bộ kit DNA-spin™ Plasmid DNA
Purification Kit (Intron) theo các bước sau:
1. Tế bào vi khuẩn mang plasmid được nuôi trong 5 mL môi trường LB dịch
thể có bổ sung kháng sinh Apramycin 50 mg/L, nuôi lắc 160 rpm, qua đêm, 37°C. Ly
tâm với vận tốc 8000 rpm, 5 phút, nhiệt độ phòng, bỏ dịch và thu phần sinh khối tế
bào.
2. Bổ sung 250 µL dung dịch đệm 1 (Resuspension Buffer) đã thêm RNase
vào sinh khối, vortex để tế bào hòa lẫn vào dung dịch đệm. Thêm 250 µL dung dịch
2 (Lysis Buffer) vào hỗn hợp trên, đảo nhẹ ống và ủ trong 3 phút ở nhiệt độ phòng.
Sau đó, thêm 350 µL dung dịch 3 (Neutralization Buffer), đảo ống nhẹ nhàng và ủ
trên đá 5 phút.
4. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 rpm, 10 phút, 4°C để các mảnh vỡ tế bào
và protein biến tính lắng xuống đáy ống. Dịch nổi sau ly tâm được đưa lên cột tinh
sạch plasmid và ly tâm 13000 rpm, 1 phút. Plasmid được giữ trên lớp màng của cột
tinh sạch, bỏ phần dịch qua cột.
5. Rửa plasmid với 500 µL đệm rửa (Washing Buffer A) và ly tâm 13000 rpm
trong 1 phút, bỏ phần dịch qua cột. Tiếp tục rửa plasmid với 700 µL đệm rửa
(Washing Buffer B), 13000 rpm trong 1 phút, bỏ phần dịch qua cột. Có thể lặp lại
thêm một lần bước rửa plamid với Washing Buffer B để tăng độ sạch của mẫu. Ly
tâm cột 13000 rpm trong 1 phút để làm khô màng cột.
6. Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 mL mới. Bổ sung 50-100 µL dH2O vào
chính giữa màng cột, ủ cột trong bể ổn nhiệt 65°C trong 10 phút, ly tâm 10000 rpm,
1 phút. Mẫu plasmid tinh sạch được bảo quản ở -20°C.
2.2.2.2. Tách chiết ADN tổng số
Chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus DSM 41530 và các chủng xạ
khuẩn khác được nuôi trong môi trường ISP2 dịch thể để thu tế bào và tách ADN
tổng số bằng bộ kit E.N.Z.A Bacterial DNA kit (Omega) theo các bước sau:
24
1. Chủng xạ khuẩn được nuôi trong môi trường dịch thể ISP2, 3 ngày, 160
rpm, 30°C để tăng lượng sinh khối. Thu 3-5 mL dịch nuôi, ly tâm 8000 rpm, 5 phút
để thu sinh khối.
2. Thêm 100 µL đệm TE, vortex đến khi hòa đều sinh khối vào dung dịch đệm.
Bổ sung 10 µL Lysozyme 50 mg/mL và ủ trong bể ổn nhiệt 37°C, 2 giờ.
3. Thêm 100 µL dung dịch đệm TL và 20 µL Protein K, vortex mạnh, ủ 55°C
trong bể ổn nhiệt, 1 giờ, 20-30 phút đảo ống một lần. Thêm 5 µL RNase, đảo ống 10
lần và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm hỗn hợp trên 10000 rpm, 2 phút để
các mảnh tế bào lắng xuống đáy ống.
4. Chuyển toàn bộ phần nổi sang ống Eppendorf 1,5 mL mới, thêm 220 µL
dung dịch đệm BL, vortex mạnh và ủ trong 65°C, 10 phút. Sau đó, bổ sung 220 µL
ethanol 96%, vortex 20 giây.
5. Chuyển toàn bộ hỗn hợp lên cột, ly tâm 10000 rpm, 1 phút, bỏ phần dịch
qua cột. Thêm 500 µL dung dịch HBC và ly tâm 10000 rpm trong 1 phút, bỏ dịch qua
cột. Rửa cột với 700 µL DNA Wash Buffer, ly tâm 10000 rpm trong 1 phút, bỏ dịch.
Có thể lặp lại thêm một lần bước rửa cột với DNA Wash Buffer. Ly tâm cột 13000
rpm, 2 phút để làm khô cột.
6. Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 mL mới, bổ sung 50-100 µL dH2O vào
chính giữa màng cột, ủ cột trong bể ổn nhiệt 65°C, 10 phút. Ly tâm 10000 rpm, 1
phút. Mẫu ADN tổng số được bảo quản ở -20°C.
2.2.3. Phương pháp biến nạp
Phương pháp biến nạp được thực hiện để chuyển plasmid vào tế bào khả biến
– là những tế bào có khả năng nhận ADN lạ từ ngoài vào trong tế bào. Trong nghiên
cứu này, các sản phẩm nối được biến nạp vào các tế bào khả biến E. coli DH5α, vector
gây đột biến biến nạp vào tế bào khả biến E. coli ET12567/pUZ8002.
Tạo tế bào khả biến: Chủng E. coli DH5α được nuôi trong môi trường dịch
thể LB. Chủng E. coli ET12567/pUZ8002 được nuôi trong 5 mL dịch thể LB có bổ
sung chloramphenicol 25 mg/L, kanamycin 50mg/L, nuôi lắc 120 rpm qua đêm ở
37°C. Sau đó, 500 µL dịch nuôi được chuyển sang nuôi cấy trong 50 mL môi trường
25
LB, ở 37°C, 120 rpm đến khi đạt OD600 khoảng 0,3–0,4. Dịch nuôi được giữ ở 4°C
trong 5 phút và chuyển sang ống falcon 50 mL. Tế bào được thu bằng cách ly tâm
với tốc độ 5000 rpm trong 10 phút ở 4°C và bỏ dịch sau ly tâm. Bổ sung 50 mL dung
dịch CaCl2 0,05 M (đã giữ ở 4°C), trộn đều bằng pipet và ủ mẫu ở 4°C trong 30 phút.
Dịch được loại bỏ bằng ly tâm với tốc độ 5000 rpm trong 10 phút, 4°C. Thêm 10 mL
hỗn hợp CaCl2 (lạnh) 0.05 M pha trong glycerol 15%, trộn đều bằng pipet. Lấy 200
µL hỗn hợp cho vào ống eppendorf và làm lạnh nhanh trong nito lỏng. Bảo quản các
ống trong tủ lạnh sâu (- 80°C).
Phương pháp biến nạp: Plasmid tách bằng kit được trộn đều với 100 µL tế
bào khả biến bằng pipet và giữ trong đá lạnh 20 phút. Sau đó, cho hỗn hợp tế bào và
plasmid vào bể ổn nhiệt ở 42°C trong 45 giây. Lấy ống phản ứng cho vào đá lạnh 3
phút. Tế bào sau khi sốc nhiệt được nuôi trong 1 mL môi trường LB dịch thể, nuôi
lắc 160 rpm trong 2 giờ ở 30°C. Trải dịch lên đĩa thạch LB có bổ sung kháng sinh
hoặc chất chỉ thị chọn lọc thích hợp. Đĩa pepetri được ủ ở 37°C trong 24 giờ. Chọn
lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.
2.2.4. Phương pháp tạo dòng vector pSET152/ rapG
Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế vector pSET152/rapG
26
Đoạn gen rapG được khuếch đại bằng phương pháp PCR từ ADN của chủng xạ
khuẩn Streptomyces rapamycinicus DSM41530 và cặp mồi cho gen rapG (Bảng 2.2).
Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt: 95°C- 5 phút; (95°- 30 giây, 62°C-
15 giây, 72°C- 1 phút 30 giây) × 30 chu kỳ; 72°C- 7 phút. Sản phẩm PCR được điện
di kiểm tra trên agarose 1% với hiệu điện thế 100V trong 20 phút. Kích thước rapG
trên bản gel được kiểm tra dựa vào thang chuẩn ADN.
Sản phẩm PCR của gen rapG được tinh sạch bằng kit AccuPrep® PCR
Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc). Nồng độ và chất lượng ADN được kiểm tra
bằng nanodrop trước khi thực hiện phản ứng cắt với enzyme giới hạn XbaI. Hỗn hợp
cắt gồm 17 µL sản phẩm PCR của rapG sau tinh sạch, 2 µL Buffer, 1µL XbaI được
ủ ở 37°C trong 2 giờ. Trong một phản ứng độc lập, plasmid pSET152 sau khi được
kiểm tra chất lượng và nồng độ được cắt với XbaI. Sản phẩm cắt được kiểm tra bằng
điện di trên agarose 1%. Sản phẩm cắt đúng kích thước được tinh sạch sử dụng kit
AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc).
Phản ứng nối được thực hiện gồm: 7 µL H2O, 2 µL plasmid pSET152 đã cắt,
10 µL rapG đã cắt, T4 Buffer 2 µL, T4 Ligase 1 µL, hỗn hợp ủ ở 22°C qua đêm. Sản
phẩm nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và trải trên môi trường LB
bổ sung kháng sinh apramycin 50 mg/L, IPTG 1M, X-gal 20mg/L. Những khuẩn lạc
của tế bào mang plasmid pSET/rapG có màu trắng trên môi trường chọn lọc. Các
khuẩn lạc màu trắng được kiểm tra bằng cách PCR với mồi M13F và M13R. Khuẩn
lạc sau khi được kiểm tra sẽ chuyển sang nuôi trên môi trường dịch thể LB và giữ
chủng ở -80°C. Đồng thời, tách plasmid từ khuẩn lạc được chọn để lưu trữ plasmid
và chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.5. Phương pháp tiếp hợp
Plasmid pSET152/rapG được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng
ET12567/pUZ8002 và được sàng lọc trên môi trường LB thạch bổ sung apramycin
50 mg/L, chloramphenicol 25 mg/L, kanamycin 50 mg/L. Phương pháp tiếp hợp thực
hiện giữa vi khuẩn E. coli ET12567/pUZ8002 mang vector pSET152/rapG và bào tử
chủng xạ khuẩn S. rapamycinicus DSM 41530. Quy trình thực hiện như sau:
27
1. Xử lý tế bào vi khuẩn E. coli chủng ET12567/pUZ8002 mang vector
pSET152/rapG: Chủng vi khuẩn được nuôi lắc trong 5 mL LB dịch thể bổ sung kháng
sinh apramycin 50 mg/L, chloramphenicol 25 mg/L, kanamycin 50 mg/L, 37°C, 160
rpm nuôi qua đêm. Bổ sung 500 µL dịch nuôi vào 50 mL LB mới, nuôi lắc 3-4 giờ
để OD600 đạt 0,5. Ly tâm 3500 rpm, 5 phút, bỏ dịch nuôi thu sinh khối. Sau đó, rửa tế
bào với dịch lỏng LB hai lần. Hòa sinh khối với 500 µL LB và giữ trên đá.
2. Xử lý bào tử xạ khuẩn: Bào tử xạ khuẩn được thu từ đĩa thạch YS nuôi sau
8 ngày và cho qua màng lọc để giảm bớt các sợi xạ khuẩn, giữ bào tử xạ khuẩn với
dung dịch glycerol 15%. Ly tâm ống giữ bào tử 8000 rpm, 5 phút, bỏ phần dịch
glycerol. Bổ sung 500 µL môi trường 2YT, vortex. Ủ ống ở 45°C trong 15 phút, sau
đó chuyển ngay các ống bào tử vào khay đá lạnh.
3. Trộn 500 µL chủng E. coli ET12567/pUZ8002 mang pSET152/rapG đã
được xử lý với 500 µL bào tử xạ khuẩn đã xử lý, để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Ly tâm
5000 rpm, 5 phút, bỏ bớt dịch nổi. Trải hỗn hợp tế bào trên đĩa môi trường MS có bổ
sung MgCl2 10mM. Sau 14-16 giờ nuôi đĩa MS tại 30°C, bổ sung 1 mL hỗn hợp
kháng sinh apramycin có nồng độ 10 mg/L và nalidixic acid 50 mg/L lên các đĩa. Các
đĩa biến nạp được nuôi ở 28°C trong 5-8 ngày.
2.2.5. Phương pháp sàng lọc chủng xạ khuẩn chuyển gen
2.2.5.1. Phương pháp sàng lọc trên môi trường thạch
Sau 5-8 ngày, các khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn chuyển gen nhờ vector
pSET152/rapG được cấy chuyển sang đĩa môi trường MS bổ sung apramycin 10
mg/L, nhằm mục đích sàng lọc một lần nữa để loại bỏ các chủng xạ khuẩn không mọc
được trên môi trường này. Chọn chủng xạ khuẩn có khả năng mọc trên môi trường
MS có kháng sinh và nuôi trong môi trường YS lỏng, thu sinh khối. Tách ADN tổng
số chủng xạ khuẩn chuyển gen và chuẩn bị cho thí nghiệm tiếp theo.
2.2.5.2. Phương pháp lai Southern blot
Phương pháp lai Southern blot dùng để xác định vị trí một gen cụ thể trong hệ
gen. Trong nghiên cứu này, sử dụng lai Southern blot để xác định số lượng bản sao
của gen rapG trong chủng xạ khuẩn theo quy trình như sau:
28
1. Tách ADN tổng số của các chủng xạ khuẩn bằng kit và xử lý với RNase để
loại bỏ hết ARN.
2. Cắt ADN tổng số với enzyme giới hạn BamHI và KpnI: 25 µL ADN, 2 µL
enzyme giới hạn mỗi loại, 4 µL Buffer, 7 µL dH2O, 37°C, qua đêm.
3. Tra mẫu ADN sau cắt lên gel agarose và soi dưới đèn UV. Dùng một bản
giấy parafin đặt lên bản gel, đánh dấu vị trí các giếng, các băng sáng, thang marker.
4. Xử lý bản gel với dung dịch HCl 0.25M, 10 phút đến khi thuốc nhuộm (dye)
chuyển màu nhằm khử purine và cắt ADN thành các mảnh nhỏ hơn.
5. Biến tính ADN, tách sợi đôi thành sợi đơn: ngâm bản gel trong dung dịch
NaOH 0.5M, NaCl 1.5M, 30 phút, nhiệt độ phòng đến khi thuốc nhuộm (dye) chuyển
về màu xanh.
6. Chuyển ADN đã biến tính lên màng: Đặt giấy lọc Whatman 3MM phủ lên
bệ đỡ sao cho hai bên tờ giấy nhúng chìm trong đệm chuyển (SSC 10X). Làm ướt
giấy lọc bằng buffer SSC 10X và đặt 2 tờ giấy lọc lên chính giữa bệ đỡ. Đặt bản gel
lên trên giấy lọc, đặt màng nylon lên trên gel, thấm ướt màng nylon bằng dung dịch
đệm. Đặt thêm 2 tờ giấy lọc lên phía trên màng, xếp tiếp 3 lớp khăn giấy lên trên.
Dùng một miếng kính nhỏ phủ toàn bộ phía trên gel và đặt một vật tương đối nặng
lên phía trên cùng (đặt vật quá nặng sẽ làm nát bản gel bên dưới). Quá trình chuyển
ADN lên màng dựa trên nguyên lý mao dẫn: lực mao dẫn kéo dung dịch đệm lên, đi
qua gel và di chuyển tới màng, ADN sợi đơn sẽ gắn với màng. Sau 3 giờ, bỏ các lớp
giấy lọc, giấy thấm, rửa màng nylon với dung dịch đệm SSC 6X. Xử lý màng bằng
tia UV, hình thành liên kết với màng.
29
Hình 2.4. Chuyển ADN biến tính lên màng
7. Ủ màng trong dung dịch đệm tiền lai (SSC 6X, SDS 0,5%, ADN biến tính
(sợi đơn), formamide 50%) 42°C, 2-4 giờ. Vai trò của bước tiền lai là khóa các vị trí
không đặc hiệu, ngăn mẫu dò sợi đơn gắn với bất kỳ vị trí nào trên màng. Sau đó, bổ
sung đệm và probe mang trình tự gen rapG có gắn phóng xạ P32, ủ 42°C, qua đêm
để liên kết bổ sung giữa các sợi ADN hình thành. Probe sẽ liên kết với trình tự tương
ứng trên màng lai. Vì probe được thiết kế chứa trình tự gen rapG nên chỉ có thể bắt
cặp được với sợi đơn ADN trên màng lai.
8. Rửa màng ít nhất 3 lần bằng dung dịch SSC 2X, SDS 0,1%, 52°C, 30 phút
để loại bỏ các mẫu dò không tạo liên kết.
9. Đưa màng lên phim và chiếu qua tia X, đọc kết quả.
2.2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính rapamycin
2.2.6.1. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Rapamycin trong các mẫu được định tính bằng phương pháp thử hoạt tính
kháng nấm Candida albicans VTCC 40674 trên đĩa thạch. Chủng C. albicans VTCC
40674 được nuôi trong môi trường YM dịch thể ở 30°C, tốc độ lắc 160 rpm qua đêm.
Môi trường thạch YM khoảng 45°C được bổ sung dịch nuôi C. albicans để đạt được
OD600 = 0,01. 25 mL thạch lỏng chứa C. albicans được đổ vào đĩa peptri, làm nguội
ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các giếng với đường kính 5 mm được đục trên bề mặt đĩa
thạch. Nhỏ 40 µL mẫu - dịch sau tách chiết đã pha loãng 10 lần vào giếng, ủ đĩa ở
30
30°C, qua đêm. Lượng rapamycin được thể hiện bằng đường kính vòng vô khuẩn trên
đĩa C. albicans.
2.2.6.2. Phương pháp tách chiết rapamycin
Rapamycin được tách từ sinh khối của chủng xạ khuẩn: Xạ khuẩn nuôi trên
đĩa thạch môi trường YS trong 96 giờ, 30°C. 10 thỏi thạch với đường kính 5 mm chứa
hệ sợi xạ khuẩn được nuôi cấy trong môi trường dịch thể sinh rapamycin, tốc độ lắc
200 rpm, 28°C trong 72 giờ. Ly tâm tốc độ 4000 rpm trong 20 phút để thu toàn bộ
sinh khối, bổ sung 7.5 ml methanol vào sinh khối, vortex để sinh khối trộn đều trong
dung môi. Lắc hỗn hợp ở 160 rpm qua đêm ở nhiệt độ phòng. Ly tâm tốc độ 4000
rpm trong 20 phút và thu dịch trong. Dịch sau tách được hòa tan trong dịch nuôi cấy
tế bào. Sau đó, bổ sung ethylacetate với tỉ lệ thể tích 1:1, lắc hỗn hợp ở 160 rpm, 30°C
trong 2 giờ. Ly tâm thu phân lớp trên của ethylacetate. Dung môi chứa rapamycin sau
khi tách được cô quay đến khô và hòa tan bằng methanol. Mẫu được giữ ở -20°C.
2.2.6.3. Phương pháp định lượng rapamycin
Dịch chứa rapamycin sau khi tách được phân tích và thu hồi bằng hệ thống
HPLC sử dụng cột Eclipse XDB- C18 (4,6×150 mm, 5 µm), hai pha dung môi của hệ
thống gồm pha A là nước miliQ và pha B là dung môi acetonitrile 100%, tỉ lệ dung
môi và nước bơm qua cột Eclipse XDB- C18 được thể hiện trong bảng 2.3. Quá trình
phân tách chất trong 35 phút, tốc độ dòng 1,2 mL/phút, lượng mẫu phân tích là 40
µL. Rapamycin được phát hiện tại bước sóng hấp phụ là 272 nm.
Để đánh giá nồng độ rapamycin trong mẫu thử nghiệm, rapamycin được thu
hồi sau khi phân tách bằng hệ thống HPLC. Sau khi đông khô rapamycin thu được,
độ tinh sạch của rapamycin được đánh giá bằng HPLC. Lượng rapamycin tinh sạch
được sử dụng để xây dựng đường chuẩn làm cơ sở đánh giá nồng độ rapamycin của
các mẫu thử nghiệm.
Bảng 2. 3. Tỉ lệ hai pha dung môi qua cột HPLC
Dung môi
Thời gian ( phút )
0.00 A-H2O (%) 85 B – acetonitrile (%) 15
31
3.00 25.00 29.00 32.00 35.00 85 15 15 85 85 15 85 85 15 15
32
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo dòng vector pSET 152/rapG
Gen rapG được khuếch đại từ genome chủng xạ khuẩn S. rapamycinicus DSM
41530 và sản phẩm PCR gen rapG có kích thước khoảng 1,0 kb (Hình 3.1.). Sản
phẩm PCR của gen rapG sau khi tinh sạch đạt nồng độ 72.3 ng/µl với tỉ lệ A260/280
là 1,9; tỉ lệ A260/230 là 1,8. Do đó, mẫu rapG sau tinh sạch đủ về lượng và chất để
làm các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1. Sản phẩm PCR gen rapG trên agarose
Trên môi trường chọn lọc LB thạch bổ sung ampicillin 50 mg/L, IPTG 1M và
X-gal 20 mg/L, thấy xuất hiện các khuẩn lạc mang vector tạo dòng pGEM/rapG màu
trắng và các khuẩn lạc mang vector pGEM tự đóng vòng có màu xanh (Hình 3.2.).
Vector pGEM đóng vòng mang gen kháng kháng sinh ampicillin và gen lacZ mã hóa
cho enzyme β-galactosidase phân giải cơ chất X-gal thành màu xanh, do đó các khuẩn
lạc này mọc được trên môi trường có kháng sinh và có màu xanh. Vector pGEM/rapG
mang gen kháng kháng sinh ampicillin và vùng gen lacZ bị gián đoạn bởi đoạn gen
rapG được chèn thêm vào, do đó khuẩn lạc mang pGEM/rapG mọc được trên kháng
sinh và có màu trắng do không phân giải cơ chất X-gal (Hình 3.2).
33
Hình 3.2. Các khuẩn lạc xanh-trắng mang vector pGEM/rapG
và pGEM đóng vòng trên môi trường chọn lọc
Kết quả PCR khuẩn lạc với cặp mồi M13F và M13R của vùng liên gen trong
plasmid cho thấy trong số 9 khuẩn lạc trắng được chọn có 3 khuẩn lạc kí hiệu 1, 4 và
9 cho kết quả điện di băng sáng kích thước 1,0 kb (Hình 3.3). Sản phẩm PCR đối
chứng âm là khuẩn lạc xanh không cho băng sáng nào. Kích thước sản phẩm PCR
các khuẩn lạc này bằng với kích thước gen rapG đã công bố, do đó chúng tôi cho
rằng đã tạo được plasmid pGEM/rapG.
Hình 3.3. Sản phẩm PCR bằng mồi M13F và M13R các khuẩn lạc trắng
Sản phẩm cắt plasmid pGEM/rapG cho thấy hai băng sáng có kích thước 3,0
kb và 1,0 kb, tương ứng với kích thước plasmid pGEM và gen rapG (Hình 3.4 (A).
Đồng thời, sản phẩm cắt plasmid pSET 152 cho một băng sáng có kích thước 5,5 kb
(Hình 3.4 (B). Sau khi tinh sạch và kiểm tra nồng độ ADN của sản phẩm gen rapG
34
và plasmid pSET152 sau cắt, chúng tôi thấy rằng nồng độ của rapG sau cắt là 27
ng/µl và nồng độ plasmid pSET152 sau cắt là 112,7 ng/µl, các chỉ số A280/230 và
A260/230 nằm trong khoảng 1,8-2,0. Do đó, các mẫu rapG sau cắt và pSET 152 sau
cắt đủ điều kiện về lượng và chất để tham gia vào phản ứng nối tiếp theo.
Hình 3.4. Sản phẩm cắt plasmid pGEM/rapG (A) và pSET152 (B)
Khi biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả biến E. coli DH5α, chúng tôi thấy
xuất hiện 04 khuẩn lạc trắng và nhiều khuẩn lạc xanh mọc trên bề mặt môi trường
chọn lọc. Các khuẩn lạc trắng mang plasmid pSET152/rapG có gen kháng kháng sinh
apramycin và vùng gen lacZ bị gián đoạn bởi gen rapG chèn thêm vào nên các khuẩn
lạc này mọc được trên môi trường có bổ sung apramycin và có màu trắng. Các khuẩn
lạc xanh mang plasmid pSET152 tự đóng vòng có gen kháng kháng sinh apramycin
và gen lacZ, do đó các khuẩn lạc này mọc được trên môi trường có kháng sinh và
phân hủy được cơ chất X-gal tạo màu xanh. Kiểm tra 04 khuẩn lạc trắng với cặp mồi
M13F và M13R cho thấy: sản phẩm PCR khuẩn lạc số 01, 02, 03 cho băng sáng rõ
nét kích thước 1,0 kb bằng với kích thước gen rapG, khuẩn lạc số 04 cho một vệt
băng mờ có kích thước 3.0 kb. Do đó, khuẩn lạc số 01 được chọn để kiểm tra trong
các thí nghiệm tiếp theo.
35
B
Hình 3.5. (A) Ảnh chụp khuẩn lạc trắng mang vector pSET152/rapG và khuẩn lạc xanh mang vector pSET 152 đóng vòng trên môi trường thạch LB/apramycin/X-gal. (B) Sản phẩm PCR vùng liên gen của 04 khuẩn lạc trắng
Sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn XbaI của plasmid pSET152/rapG tách từ
khuẩn lạc trắng 01 xuất hiện hai băng với kích thước khoảng 5,5 kb và 1,0 kb tương
ứng với kích thước plasmid pSET152 đã cắt và gen rapG (Hình 3.6.). Giải trình tự
đoạn liên gen trong plasmid pSET/rapG cho thấy toàn bộ gen rapG (990 nucleotide)
đã được chèn vào vị trí gắn của pSET152 (Phụ lục 1). So sánh trình tự rapG trong
plasmid pSET/rapG với trình tự gen rapG đã công bố trên GenBank cho độ tương
đồng là 100%. Từ đó, chúng tôi kết luận rằng vector gây đột biến pSET152/rapG đã
được tạo thành công.
36
Hình 3.6. Sản phẩm cắt plasmid pSET152/rapG
3.2. Tạo chủng Streptomyces rapamycinicus chuyển gen
3.2.1. Sàng lọc chủng xạ khuẩn chuyển gen trên môi trường chọn lọc
Sau 5 ngày nuôi các đĩa petri mang thể đột biến, chúng tôi thấy xuất hiện các
khuẩn lạc xạ khuẩn màu trắng trên bề mặt môi trường MS có bổ sung kháng sinh, các
khuẩn lạc xạ khuẩn mọc được trên môi trường này gọi là khuẩn lạc dương tính (Hình
3.7). Quá trình chuyển gen rapG vào genome chủng xạ khuẩn hoang dại dựa vào
vector đột biến pSET152/rapG có nguồn gốc từ plasmid pSET 152. Plasmid
pSET152 mang vị trí attP là vị trí đích của gen tích hợp φC31, đồng thời trên genome
của chủng xạ khuẩn có vị trí attB có vai trò tương tự attP, do đó φC31 là gen trung
gian cho quá trình tái tổ hợp gen [28]. Trong quá trình tiếp hợp, vector gây đột biến
tiếp xúc với genome chủng xạ khuẩn làm vị trí của attP và attB tiếp xúc và trao đổi
chéo nhau làm tích hợp toàn bộ vector pSET152/rapG (bao gồm gen kháng kháng
sinh apramycin) vào genome chủng xạ khuẩn. Do đó, các khuẩn lạc xạ khuẩn chuyển
gen sẽ mang gen kháng kháng sinh apramycin và có thể mọc được trên môi trường
bổ sung kháng sinh apramycin.
37
Hình 3.7. Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn chuyển gen trên môi trường có kháng sinh
Các chủng xạ khuẩn dương tính ký hiệu I1, I7 và I18 được lựa chọn để kiểm
tra bằng Southern Blot. Tế bào được thu sau khi nuôi cấy trong môi trường ISP2 dịch
thể được sử dụng để tách ADN.
3.2.2. Kiểm tra chủng xạ khuẩn chuyển gen bằng phương pháp lai Southern Blot
Mẫu ADN sau khi xử lý với ARNase qua đêm cho thấy chất lượng tốt trên bản
gel sau điện di (Hình 3.8). Chất lượng ADN chuẩn bị cho thí nghiệm lai Southern
Blot được đánh giá bằng Nanodrop và giá trị A230/A260 thu được là 1,8 – 2,0, nồng
độ ADN của các mẫu I1, I7, I18 lần lượt là 65; 36,6 và 343 ng/µL. Mẫu ADN tổng
số của các chủng xạ khuẩn hoang dại và đột biến được cắt bằng cặp enzyme giới hạn
BamHI và KpnI.
Hình 3.8. ADN tổng số trên bản gel sau khi điện di
38
Kết quả lai Southern blot với đầu dò là sản phẩm PCR của gen rapG cho thấy
trong điện di đồ ứng với chủng xạ khuẩn hoang dại có một băng kích thước khoảng
5,5 kb lai được với đầu dò, trong khi điện di đồ ứng với chủng xạ khuẩn chuyển gen
I18 có hai băng kích thước khoảng 5,5 kb (giống chủng dại) và 4,0 kb lai được với
đầu dò (Hình 3.9). Điện di đồ ứng với các chủng xạ khuẩn I1 và I7 không xuất hiện
băng sáng nào, có thể do lượng ADN tổng số không đủ để phản ứng lai thành công
hoặc để quan sát được kết quả lai, hay do lỗi kỹ thuật trong quá trình lai. Tuy nhiên,
vì mục đích cuối cùng của chúng tôi là tìm được một chủng xạ khuẩn chuyển gen
mang thêm gen rapG và kết quả cho thấy chủng I18 đã đáp ứng yêu cầu này nên
chúng tôi không làm tiếp các thí nghiệm với I1 và I7. Chủng xạ khuẩn chuyển gen
I18 được đặt tên là chủng S. rapamycinicus WT/rapG.
Hình 3.9. Kết quả lai Southern blot của các chủng xạ khuẩn chuyển gen
(I1, I7, I18) và chủng hoang dại (WT)
3.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh rapamycin
Đường chuẩn rapamycin được xây dựng để định lượng nồng độ rapamycin
môi trường nuôi cấy và tách chiết. Các giá trị area (diện tích đỉnh hấp thụ) tại bước
sóng 272 nm được thể hiện trong bảng 3.1. Phương trình đường chuẩn rapamycin như
sau: y = 0,0241x – 0,5182, trong đó: x là giá trị area, y là giá trị rapamycin tương ứng
với x (mg/L).
39
Bảng 3.1. Các giá trị dựng đường chuẩn rapamycin
STT Lượng rapamycin (mg/L) Area
1 61,29 2537,3
2 30,40 1298,8
3 15,20 727,2
4 10,13 388,1
5 3,04 127,8
Hình 3.10. Đường chuẩn rapamycin
Các mẫu dịch sau tách chiết được thử hoạt tính kháng nấm C. albicans đều
cho vòng hoạt tính kháng lớn, các mẫu có đường kính kháng khuẩn lên tới 25 mm
(Hình 3.11.). Tuy nhiên, khi chạy phân tích mẫu bằng HPLC, lượng rapamycin thu
được ở các mẫu này có sự khác nhau rõ rệt. Do đó, định lượng rapamycin bằng phân
tích HPLC là cần thiết bên cạnh phương pháp đo đường kính kháng C. albicans ban
đầu. Trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi sẽ định lượng và phân tích lượng
rapamycin thu được bằng phân tích HPLC.
40
Hình 3.11. Vòng kháng nấm C. albicans của các chủng xạ khuẩn WT và WT/rapG trong các môi trường nuôi cấy khác nhau
Để xác định môi trường nuôi cấy thích hợp làm tăng khả năng sinh rapamycin
của các chủng xạ khuẩn WT và WT/rapG, chúng tôi tiến hành nuôi các chủng xạ
khuẩn này trong môi trường MD1, MD2 và MD3. Thành phần môi trường được thể
hiện chi tiết trong phần phương pháp. Nồng độ rapamycin trong các môi trường nuôi
cấy gốc của chủng WT và WT/rapG được thể hiện qua hình 3.12.
Hình 3.12. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường gốc
41
Khi nuôi hai chủng xạ khuẩn WT và WT/rapG trong môi trường MD1, lượng
rapamycin thu được của chủng WT (79,2 mg/L) tương đương với lượng rapamycin
của chủng WT/rapG (75,1 mg/L). Trong môi trường MD2, chủng WT/rapG cho
lượng rapamycin thu được (27,4 mg/L) cao hơn gấp 5 lần so với chủng WT (5 mg/L)
và trong môi trường MD3 không có sự khác biệt về lượng rapamycin thu được giữa
hai chủng. Trong ba môi trường MD1, MD2 và MD3, nguồn cung cấp năng lượng
ban đầu là các loại đường. Đối với môi trường MD1 sử dụng dextrin, lượng
rapamycin thu được cao hơn so với MD2 và MD3 sử dụng glucose. Dextrin đã được
chứng minh là yếu tố tích cực tới khả năng sinh rapamycin tốt hơn so với glucose
[26]. Hàm lượng glucose trong môi trường MD2 (20 g/L) cao hơn MD3 (6 g/L) và
lượng rapamycin thu được trong môi trường MD2 cao hơn MD3. Kết quả này chứng
tỏ rằng các nguồn cung cấp năng lượng khác nhau có ảnh hưởng tới lượng sản phẩm
rapamycin thu được. Do đó, giả thuyết chúng tôi đặt ra là quá trình sinh tổng hợp
rapamycin gồm hai giai đoạn: giai đoạn đầu, tế bào xạ khuẩn cần nguồn năng lượng
để tổng hợp các chất sơ cấp, chất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển;
giai đoạn hai là giai đoạn sinh tổng hợp rapamycin, các yếu tố ảnh hưởng đến lượng
rapamycin có thể ảnh hưởng tới giai đoạn một hoặc hai.
3.3.1. Ảnh hưởng của axit shikimic đến khả năng sinh rapamycin
Trong thí nghiệm này, chúng tôi bổ sung thêm 10 g/L bột hồi tương đương với
0,8 g/L axit shikimic vào môi trường nuôi cấy MD1, MD2, MD3. Lượng rapamycin
thu được trong các môi trường này được thể hiện qua hình 3.13.
42
Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường bổ sung acid shikimic
Kết quả cho thấy axit shikimic có ảnh hưởng tích cực tới quá trình sinh tổng
hợp rapamycin, cụ thể là lượng rapamycin thu được từ các chủng xạ khuẩn nuôi trong
môi trường bổ sung axit shikimic cao hơn so với các môi trường không bổ sung. Khi
bổ sung axit shikimic vào môi trường gốc MD1, lượng rapamycin thu được từ chủng
WT/rapG (148,4 mg/L) tăng hơn hai lần so với nuôi trong môi trường không bổ sung
(75,1 mg/L), trong khi đó chủng WT cho lượng rapamycin thu được (82,1 mg/L)
tương đương với môi trường gốc (72,9 mg/L) và không có sự chênh lệch lớn. Trong
môi trường MD2 bổ sung axit shikimic, lượng rapamycin thu được từ chủng WT là
35,1 mg/L và WT/rapG là 89,1 mg/L cao hơn so với trong môi trường MD2 từ 1-2
lần. Trong môi trường MD3 thêm axit shikimic, lượng rapamycin tăng nhẹ (WT –
7,6 mg/L và WT/rapG – 8,1 mg/L), không cao hơn nhiều so với môi trường MD3.
Lượng rapamycin thu được từ chủng xạ khuẩn WT/rapG trong môi trường MD1 cao
hơn so với lượng rapamycin thu được trong nghiên cứu của Fang A.và cộng sự (87
g/L) [14]. Fang bổ sung thêm 9,9 g/L acid shikimic vào môi trường nuôi là điều kiện
tối ưu nhất để thu được lượng rapamycin lớn nhất từ chủng xạ khuẩn đột biến ngẫu
nhiên S. hygroscopicus C9 [14]. Trong kết quả thí nghiệm của chúng tôi, khi bổ sung
43
0,8 g/L axit shikimic vào môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn chuyển gen WT/rapG
cho lượng rapamycin thu được là 148,4 mg/L, cao hơn hẳn so với thí nghiệm của
Fang [14].
Từ các bài báo trước đây, axit shikimic đã được chứng minh là yếu tố tham
gia vào quá trình tạo tiền chất rapamycin [42]. Do đó, bổ sung dịch chiết của bột đại
hồi chứa axit shikimic vào môi trường giúp tăng cường khả năng tổng hợp rapamycin
của hai chủng WT và WT/rapG so với môi trường gốc. Chủng xạ khuẩn WT/rapG là
chủng được tăng cường biểu hiện gen điều hòa dương rapG nên quá trình tổng hợp
rapamycin của chủng WT/rapG mạnh hơn chủng WT, do đó lượng rapamycin thu
được từ chủng WT/rapG cao hơn so với WT.
3.3.2. Ảnh hưởng của glycerol đến khả năng sinh rapamycin
Để đánh giá ảnh hưởng của glycerol tới khả năng sinh rapamycin của các
chủng xạ khuẩn, 15 g/L glycerol được bổ sung vào các môi trường gốc MD1, MD2,
MD3. Kết quả (Hình 3.12) cho thấy: trong cả ba môi trường bổ sung glycerol, chủng
WT/rapG cho lượng rapamycin cao hơn so với chủng WT. Trong môi trường MD1
thêm glycerol 15g/L, chủng WT/rapG cho lượng rapamycin thu được là cao nhất
(211,36 mg/L), gấp 6.5 lần chủng WT (32,7 mg/L). Trong môi trường MD2 thêm
glycerol, lượng rapamycin từ chủng xạ khuẩn WT/rapG là 11,29 mg/L cao hơn gấp
5 lần chủng WT (2,2 mg/L). Đối với môi trường MD3 thêm glycerol, lượng
rapamycin từ chủng xạ khuẩn WT/rapG là 44,9 mg/L cao hơn 1,3 lần so với chủng
WT (34,1 mg/L). Trong nghiên cứu của Kim và cộng sự (2014), khi bổ sung 36,2 g/L
glycerol vào môi trường lên men chủng xạ khuẩn đột biến bằng UV thu được lượng
rapamycin là lớn nhất (130,4 mg/L) [25]. Do đó, chúng tôi cho rằng glycerol có tác
động tích cực đến các chủng xạ khuẩn trong môi trường MD3, làm lượng rapamycin
tăng hơn 6 lần so với môi trường không bổ sung. Tuy nhiên, glycerol tác động tiêu
cực trong môi trường MD2 khi làm lượng rapamycin thu được thấp hơn so với môi
trường gốc. Trong môi trường MD1 bổ sung glycerol, lượng rapamycin từ chủng xạ
khuẩn WT/rapG cao hơn gấp 2,8 lần trong môi trường gốc, đối với chủng WT lượng
44
rapamycin giảm so với môi trường gốc. Ảnh hưởng khác nhau của glycerol có thể do
sự kết hợp của glycerol với các nguồn cacbon khác nhau trong môi trường như
glucose, dextrin. Các nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra rằng sự kết hợp của các
nguồn Cacbon khác nhau như glucose/glycerol, fructose/ mannose ảnh hưởng tới
lượng rapamycin thu được [7][26].
Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường bổ sung Glycerol
Glycerol là nguồn cung cấp nguyên liệu cho quá trình lên men và đã được
chứng minh là có ảnh hưởng tích cực tới lượng rapamycin thu được [25]. Chúng tôi
cho rằng glycerol được coi là chất xúc tác ở giai đoạn đầu, có vai trò cung cấp đầy đủ
năng lượng cho các quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp các chất sơ cấp, tạo tiền
chất rapamycin. Trong giai đoạn hai, ảnh hưởng của glycerol được thể hiện ít hơn và
gen rapG đóng vai trò hỗ trợ xúc tác quá trình sinh rapamycin là chủ yếu. Trong
nghiên cứu của Kuscer E. (2007), chủng xạ khuẩn được tăng cường biểu hiện gen
rapG cho lượng rapamycin cao hơn gấp 1,2 lần so với chủng hoang dại và khi xóa
gen rapG lượng rapamycin thu được giảm tới 6 lần so với chủng hoang dại [29]. Thí
nghiệm này cho thấy gen rapG có vai trò tích cực trong quá trình sinh tổng hợp
rapamycin. Do vậy, chủng xạ khuẩn WT/rapG được tăng cường biểu hiện gen rapG
45
nên quá trình chuyển hóa ở giai đoạn hai sẽ được đẩy mạnh hơn so với chủng WT,
lượng rapamycin thu được từ chủng WT/rapG sẽ cao hơn so với chủng WT. Lượng
rapamycin thu được từ chủng WT/rapG trong môi trường MD1 bổ sung glycerol thu
được cao gấp 6,5 lần so với chủng WT và cao hơn 1,5 lần so với nuôi chủng WT/rapG
trong môi trường bổ sung axit shikimic.
3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng axit shikimic đến khả năng sinh
rapamycin
Glycerol và axit shikimic có ảnh hưởng tích cực đến khả năng sinh rapamycin.
Khi bổ sung glycerol trong môi trường, lượng rapamycin thu được cao hơn so với bổ
sung axit shikimic do glycerol tác động đến giai đoạn đầu tổng hợp các chất sơ cấp
và các chất thứ cấp được tổng hợp sau. Do đó, chúng tôi nhận định rằng glycerol là
thành phần không thể thiếu trong môi trường để thu lượng rapamycin lớn, axit
shikimic là thành phần tác động giai đoạn sau và giá thành rẻ hơn rất nhiều so với
glycerol. Do đó, chúng tôi lựa chọn thay đổi lượng axit shikimic trong môi trường
MD1 bổ sung glycerol 15 g/L từ 5,0-10,0-15,0 g/L bột hồi chứa lượng axit shikimic
tương ứng là 0,4 – 0,8 – 1,2 g/L để đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng acid shikimic
tới khả năng sinh rapamycin [18]. Kết quả cho thấy, chủng xạ khuẩn WT/rapG trong
môi trường MD1 bổ sung glycerol 15 g/L và axit shikimic với hàm lượng khác nhau
đều thu được lượng rapamycin cực đại (± 200 mg/L). Kết quả này do gen điều hòa
dương rapG là một nhân tố giúp tăng cường chuyển hóa trong chu trình sinh tổng
hợp rapamycin đạt đến độ bão hòa. Do đó, sự có mặt của axit shikimic không thể giúp
tăng lượng rapamycin của chủng xạ khuẩn WT/rapG. Đối với chủng xạ khuẩn WT,
sự có mặt của glycerol và axit shikimic trong môi trường làm tăng lượng rapamycin
thu được so với môi trường gốc, môi trường chỉ bổ sung glycerol hoặc axit shikimic.
Tuy nhiên thay đổi lượng axit shikimic trong môi trường không làm ảnh hưởng nhiều
tới lượng rapamycin thu được.
46
Hình 3.15. Biểu đồ thể hiện lượng rapamycin thu được trong môi trường
bổ sung lượng axit shikimic khác nhau
Cuối cùng, chúng tôi kết luận rằng: hàm lượng axit shikimic trong môi trường
nuôi có ảnh hưởng tích cực đến quá trình sinh tổng hợp rapamycin của chủng xạ
khuẩn hoang dại và không tác động đến chủng xạ khuẩn chuyển gen WT/rapG.
Glycerol có tác động tích cực đến cả hai chủng xạ khuẩn. Trong môi trường MD1
không có axit shikimic và glycerol, các chủng xạ khuẩn cho lượng rapamycin thấp
hơn hẳn so với môi trường có bổ sung. Với lượng glycerol 15 g/L, bột hồi 15 g/L
(tương đương 1,2 g/L axit shikimic) trong môi trường MD1, chủng xạ khuẩn
WT/rapG cho lượng rapamycin cực đại. Do vậy, chúng tôi kết luận rằng đây là môi
trường tối ưu cho chủng xạ khuẩn WT/rapG.
47
KẾT LUẬN
1. Đã tạo được chủng xạ khuẩn chuyển gen Streptomyces rapamycinicus
WT/rapG mang hai bản sao của gen điều hòa dương rapG, có khả năng sinh tổng
hợp rapamycin cao gấp 6,5 lần chủng hoang dại trong môi trường MD1 bổ sung
glycerol 15 g/L.
2. Môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp rapamycin của hai chủng xạ khuẩn
Streptomyces rapamycinicus WT/rapG và WT là môi trường MD1 có bổ sung 15
g/L glycerol và 15 g/L bột hoa hồi (tương đương 1,2 g/L axit shikimic).
48
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu sản xuất rapamycin sử dụng chủng WT/rapG và môi
trường tối ưu MD1 bổ sung glycerol và axit shikimic trong quy mô công nghiệp.
2. Có thể áp dụng phương pháp chuyển gen trong các nghiên cứu tiếp theo với
đối tượng là chủng xạ khuẩn khác và gen điều hòa quá trình sinh tổng hợp chất khác.
49
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ballou L. M., Lin R. Z. (2008), "Rapamycin and mTOR kinase inhibitors",
Journal of Chemistry Biology, 1, pp. 27-36.
2. Basavaraj M. V., Shivayageeswar E. N. (2011), "Production and optimisation
of tetracycline by various strains of Streptomyces under solid state
fermentation using pineapple peel as a novel substrate", Recent Research in
Science and Technology, 3(2), pp. 01-08.
3. Bérdy J. (2005), "Bioactive microbial metabolites: a personal view", The
Journal of Antibiotics, 58, pp. 1-26.
4. Bhatti A. A., Haq S., Bhat R. A. (2017), "Actinomycetes benefaction role in
soil and plant health", Microbial Pathogenesis, 111, pp. 458-467.
5. Blagosklonny M. (2019), "Fasting and rapamycin: diabetes versus benevolent
glucose intolerance", Cell Death and Disease, 10(607), pp. 1-10.
6. Chen M., Chang S. (2018), "Ahmpatinin iBu, a new HIV-1 protease inhibitor
from Streptomyces sp. CPCC 202950", Royal Society of Chemistry, 8(10), pp.
5138-5144.
7. Chen X. S., Ren X. D. (2012), "Culture medium containing glucose and
glycerol as a mixed carbon source improves epsilon-poly-L-lysine production
by Streptomyces sp. M-Z18", Bioprocess and Biosystems Engineering, 35(3),
pp. 469-475.
8. Chen X., Wei P. (2009), "Generation of high-yield rapamycin-producing
strains through protoplasts-related techniques", Applied Microbiology and
Biotechnology, 83(3), pp. 507-12.
9. Chen Y., Liu R. (2017), "Enduspeptides A-F, six new cyclic depsipeptides
from a coal mine derived Streptomyces sp.", Tetrahedron, 73(5), pp. 527-531.
10. Cheng Y. R., Hauck L., Demain A. L. (1995), "Phosphate, ammonium,
magnesium and iron nutrion of Streptomyces hygroscopicus with respect to
rapamycin biosynthesis", Journal of Industrial Microbiology, 14(5), pp. 424-
427.
50
11. Dutta S., Basak B. (2014), "Kinetics of rapamycin production by Streptomyces
hygroscopicus MTCC 4003", 3 Biotech, 4(5), pp. 523-531.
12. Dutta S., Basak, B. (2017), "Approaches towards the enhanced production of
rapamycin by Streptomyces hygroscopicus MTCC 4003 through mutagenesis
and optimization of process parameters by Taguchi orthogonal array
methodology", World Journal of Microbiology Biotechnology, 33(5), pp. 1-
13.
13. Emerson R. P., Silva I. R. (2012), "Antibiotics produced by Streptomyces",
The Brazilian Journal of Infectious diseases, 16(5), pp. 466-471.
14. Fang A., Demain A. (1995), "Exogenous shikimic acid stimulates rapamycin
biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus ", Folia Microbiologica, 40(6),
pp. 607-610.
15. Geng H., Liu H., Liu J. (2017), "Insights into the metabolic mechanism of
rapamycin overproduction in the shikimate-resistant Streptomyces
hygroscopicus strain UV-II using comparative metabolomics", World Journal
of Microbiology and Biotechnology, 33(6), pp. 1-13.
16. Gregory M. A., Hong H. (2006), "Rapamycin biosynthesis: Elucidation of
gene product function", Organic and Biomolecular Chemistry, 4(19), pp.
3565-3568.
17. Harrison D. E. (2009), "Rapamycin fed late in life extends lifespan in
genetically heterogeneous mice", Nature, 460(7253), pp. 392-395.
18. Hiroki O., Naota T. (2009), "Rapid separation of shikimic acid from Chinese
star anise (Illicium verum Hook. f.) with hot water extraction", Separation and
Purification Technology, 69(1), pp. 102-108.
19. Hozzein W. N., Li W. J. (2004), "Nocardiopsis alkaliphila sp. nov., a novel
alkaliphilic actinomycete isolated from desert soil in Egypt", International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54(1), pp. 247-252.
51
20. J. Gatto G. (2006), "Biosynthesis of pipecolic acid by RapL, a lysine
cyclodeaminase encoded in the rapamycin gene cluster", Journal of the
American Chemical Society, 128(11), pp. 3838-3847.
21. Jakubiec K., Rajnisz A. (2018), "Secondary metabolites of Actinomycetes and
their antibacterial, antifungal and antiviral properties", Polish Journal of
Microbiology, 67(3), pp. 259-272.
22. Jung W. S., Yoo Y. J. (2011), "A combined approach of classical mutagenesis
and rational metabolic engineering improves rapamycin biosynthesis and
provides insights into methylmalonyl-CoA precursor supply pathway in
Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253", Applied Microbiology and
Biotechnology, 91(5), pp. 1389-1397.
23. Kar A. (2008), "Pharmaceutical Microbiology", New Age International, pp.
89 – 101.
24. Kim Wan S., Sean D. (2003), "Nutritional studies on the growth of the
rapamycin-producing Streptomyces hygroscopicus", Journal of Microbiology
and Biotechnology, 13(4), pp. 560-563.
25. Kim Y. H., Park B. S. (2014), "Production of rapamycin in Streptomyces
hygroscopicus from glycerol-based media optimized by systemic
methodology", Journal of Microbiology and Biotechnology, 24(10), pp. 1319-
1326.
26. Kojima I., Cheng Y. (1995), "Carbon source nutrition of rapamycin
biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus", Journal of Industrial
Microbiology, 14(6), pp. 436-439.
27. Kramer M., Bongaerts J. (2003), "Metabolic engineering for microbial
production of shikimic acid", Metabolic Engineering, 5(4), pp. 277-283.
28. Kurniawan Y. N., Kitani, S. (2016), "Regulation of production of the blue
pigment indigoidine by the pseudo gamma-butyrolactone receptor FarR2 in
Streptomyces lavendulae FRI-5", Journal of Bioscience and Bioengineering,
121(4), pp. 372-379.
52
29. Kuscer E., Coates N. (2007), "Roles of rapH and rapG in positive regulation
of rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus", Journal of
Bacteriology, 189(13), pp. 4756-4763.
30. Lake E., K. Gunter A. B., Su M. (1998), "Mutational biosynthesis of novel
rapamycins by a strain of Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 disrupted
in rapL encoding a putative lysine cyclodeaminase", Journal of Bacteriology,
180(4), pp. 809-814.
31. Li J. K., Blenis J. (2014), "Rapamycin: one drug, many effects", Cell
Metabolism, 19(3), pp. 373-379.
32. Mansour F. A., Aldesuquy H. S. (1994), "Studies on plant growth regulators
and enzyme production by some bacteria", Quatar University Science Journal,
14(2), pp. 281-288.
33. Mariya L., Giulia P. (2017), "Penicillin's discovery and antibiotic resistance:
Lessons for the future", Yale Journal of Biology and Medicine, 90, pp. 135-
145.
34. Mason M. G., Ball A. S. (2001), "Extracellular heme peroxidases in
actinomycetes: a case of mistaken identity", Applied and Environmental
Microbiology, 67(10), pp. 4512-4519.
35. Mitra P., Chakrabartty P. (2005), "An extracellular protease with depilation
activity from Streptomyces nogalator", Journal of Scientific & Industrial
Research, 64, pp. 978-983.
36. MS Lee, Kojima I., Demain A. (1997), "Effect of nitrogen source on
biosynthesis of rapamycin by Streptomyces hygroscopicus", Journal of
Industrial Microbiology & Biotechnology, 19, pp. 83-86.
37. Mukhta S., Zaheer A. (2017), "Actinomycetes: A source of industrially
important enzymes", Journal of Proteomics & Bioinformatics, 10(12), pp.
316-319.
38. Nicholl D. S. T. (2008), An Introduction to Genetic Engineering, Cambridge
University Press, UK.
53
39. Oh D., Poulsen M., Currie C., Clardy J. (2011), "Sceliphrolactam, a polyene
macrocyclic lactam from a wasp-associated Streptomyces sp.", Organic
Letters, 13(4), pp. 752-755.
40. Olano C., et al. (2008), "Improving production of bioactive secondary
metabolites in actinomycetes by metabolic engineering", Metabolic
Engineering, 10(5), pp. 281-292.
41. Paiva N. L., Demain A. L., Roberts M. F. (1991), "Incorporation of acetate,
propionate and methionine into rapamycin by Streptomyces hygroscopicus",
Journal of Natural Products, 54, pp. 167-177.
42. Park S. R., et al. (2010), "Biosynthesis of rapamycin and its regulation: past
achievements and recent progress", Journal of Antibiotic (Tokyo), 63(8), pp.
434-441.
43. Patrick C., Susan L. (2001), "Amphotericin biosynthesis in Streptomyces
nodosus : deductions from analysis of polyketide synthase and late genes",
Chemistry and Biology, 8(7), pp. 713-723.
44. Raja A., Prabakarana P. (2011), "Actinomycetes and drug - an overview",
American Journal of Drug Discovery and Development, 1(2), pp. 75-84.
45. Raveh A., Delekta, P. C. (2013), "Discovery of potent broad spectrum
antivirals derived from marine actinobacteria", PLoS One, 8(12).
46. Schwecke T., Aparicio J. F., Molnar I. (1995), "The biosynthetic gene cluster
for the polyketide immunosuppressant rapamycin", Biochemistry, 92(1), pp.
7839-7843.
47. Selman A., W. Albert S. (1945), "Streptomycin - origin, nature and
properties", Journal of the American Pharmaceutical Association, 34(11), pp.
273-291.
48. Umesh L., Nishtha K. S., Archana R. T. (2014), "Optimization of nutrient
components for rapamycin production by Streptomycetes hygroscopicus under
submerged fermentation using Plackett Burman design carried by response
54
surface methodology", International Journal Of Scientific Research And
Education, 2(8), pp. 1619-1631.
49. Xiang Z., Jin L. (2013), "Precursor engineering and cell physiological
regulation for high level rapamycin production by Streptomyces
hygroscopicus", Annals of Microbiology, 63(4), pp. 1371-1378.
50. Yang J., Yang Z., Yin Y. (2016), "Three novel polyene macrolides isolated
from cultures of Streptomyces lavenduligriseus", The Journal of Antibiotics,
69, pp. 62-65.
51. Yen H., Chen L. (2013), "The enhancement of rapamycin production using
Streptomyces hygroscopicus through a simple pH-shifted control", Journal of
the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 44(5), pp. 743-747.
52. Young J. Y., Jae-yeon H. (2015), "Characterization of negative regulatory genes
for the biosynthesis of rapamycin in Streptomyces rapamycinicus and its
application for improved production", Journal of Industrial Microbiology and
Biotechnology, 42(1), pp125-135.
53. Zhao S., et al. (2013), "Comparative metabolic profiling-based improvement
of rapamycin production by Streptomyces hygroscopicus", Applied
Microbiology and Biotechnology, 97(12), pp. 5329-5341.
54. dsmz.de
55
PHỤ LỤC 1. Trình tự gen rapG được gắn với plasmid pSET152, gen rapG bắt đầu từ đoạn
trình tự ACCAACGGCGCTGGA đến đoạn trình tự CTGACCGACAGCTGA
TGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGG CGCCATTGGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGC GGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAG GCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGAACCAACG GCGCTGGAGCGGAGGCCGACGGATCGCGCGGGGCGTTCTCCGTGGACTC CACCGTCCCGGGCGCGGCACCACAAGGATTCTTCCAGGCCTTCCAGCGC GGGTGGGACGCGGAGCTCGGCGACGGCTTGCCGCTGCGGAGCTTCAACC GGGATGTGACCGGTGACTTCCGGGTCAGGAGCCGCGCCGCCAAGGTCCG CGACCTGGCGTTCACCGATCTCCACAGCATGTCGGCCATCCGGACCGCA CACGCGCTGGGCGGTGTGGAGGACCGGGTACGGATGTACGTCGTGAAA CGCGGCGCATGGACGTTGGCAGGTTCGCGCGATCGGGACCGGCACACC GTGGCGGCCGGGCAGTTCCTCCTCCGGCACGTCGGGCAGCCGTGGCGCT TCGAGGCGGCGCCGCACACGACGGTGAAGATCCTTCTGCTGCCTCCCGG GCCGCTCACCCCACTGCTGGGAAACCGGGCCGTCACCGGGCCCGCGGAT TCGGCCGAGGTACGCCTGCTGGTGGCCCACGCGAATATGGTGTACGAGA CCATGACCGGCCTGGGCCCGGCCGGTGTGCAAGCCGCCCACAGCACCCT GCTCGAACTGGCCCAGTCGGTGGCGAGGCGTCGGTTCGACGATGTGGAG CCCCGGCTGGCGCCCGCGCTCGCCGGGGCCGCGAAGGACCTCGCGGAC AGCCACCTCACCGACCCCGAGCTCTCCCCCACGATGCTGGCGCGTGAAC TCAACGTCTCCTTACGCACCTTGCAGCGGGCGTTCACCGTGGCGGGAGA GTCGTTGATCGCCTACATCCGTCACCGGCGGCTGGAAGAGGCCCGCCGC GCTCTCATCGCCTCGGCCGGCAGGCTGAGCGTCTCGGAACTCGCCGCCC ACTGGCAGTTCGCCGACAGCAGCCACTTCATCCGGGTCTTCAAGAAGAC CTACGGCCAGACGCCCACCGAGTACGCCCGCTCAACCGGGCTGACCGAC AGCTGACCTCTAGAGGATCCGCGGCCGCGCGCGATATCGAATCGTAA
2. Sơ đồ vector pSET 152
![Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống ung thư của hợp chất lai chứa khung tetrahydro-β-carboline và imidazo[1,5-a]pyridine](https://cdn.tailieu.vn/images/document/thumbnail/2025/20250807/kimphuong1001/135x160/50321754536913.jpg)
