ụ ụ M c l c
1
Ề Ỹ Ậ Ể Ể Ệ A. KHÁI NI M V K THU T CHUY N GEN VÀ GEN CHUY N
ệ ể ậ ỹ
1. Khái ni m k thu t chuy n gen
ậ ư ể ậ ỹ ỹ ạ ử K thu t chuy n gen (ghép gen) là k thu t đ a 1 gen l ạ (1 đo n phan t ADN
ặ ế ủ ạ ồ ạ ở ế ho c RNA) vào t bào ch , làm cho gen l t n t i các plasmid trong t ủ ặ bào ch ho c
ộ ế ủ ồ ạ ớ ộ ả ế ạ ắ g n vào b gen t bào ch , t n t i và tái b n cùng v i b gen t ủ bào ch . Gen l trong
ạ ộ ủ ế ể ặ ặ ổ ợ ổ ệ gây bi n đ i các đ c đi m đã có ế t bào ch ho t đ ng t ng h p các protein đ c hi u,
2
ặ ơ ể ữ ủ ụ ệ ể ể ạ ấ ặ xu t hi n nh ng đ c đi m m i ho c làm ớ c a c th chuy n gen. M c đích t o ra
ậ ớ ố gi ng sinh v t m i.
ữ ể ậ ồ ướ ơ ả Kĩ thu t chuy n gen g m nh ng b c c b n sau:
ạ 1. T o ADN tái t ổ ợ h p
ư ổ ợ ế ậ 2. Đ a ADN tái t h p vào t bào nh n
ậ ủ ệ ủ ự ể ể 3. Ki m tra s sát nh p c a gen và bi u hi n c a gen
ớ ạ ủ ư ụ ể ậ ố Quy trình c a kĩ thu t chuy n gen gi ng v i t o dòng nh ng có m c đích khác nhau.
ể ậ ậ ằ ạ ố ớ Kĩ thu t chuy n gen nh m t o ra gi ng sinh v t m i.
ộ ố ượ ượ c khai thác, sau đó chúng đ c tháo tác ạ Nguyên lý: m t đo n gen mong mu n đ
ế ố ầ ế ể ủ ế ể ệ ể ậ các y u t c n thi t đ chuy n vào h gen nhân c a t bào nh n. Gen chuy n có kh ả
ề ổ ể ệ ị ở ế ệ ủ ệ năng bi u hi n và di truy n n đ nh th h sau, đó là nguyên lý c a công ngh này.
2. Gen chuy n ể
ể ạ ố ượ Gen chuy n là các gen mã hóa tính tr ng mong mu n đ c tách chi ế ừ t t các sinh
ự ậ ư ộ ố ượ ậ ạ ậ ậ v t khác nh đ ng v t, th c v t, vi sinh v t... chúng mã hóa các tính tr ng s l ng,
ấ ượ ư ả ượ ộ ố ữ ầ ổ ị ch t l ng (nh s n l ng s a, th t), hay mã hóa m t s thành ph n b sung.
ủ ể ấ ồ ự ự C u trúc c a gen chuy n bao g m 2 trình t chính: Trình t mã hóa cho phân t ử
ể ự ề protein (transgen – gen chuy n) và trình t đi u hòa (promoter và enchancer).
ể ể ệ ệ ứ ấ ả Đ bi u hi n protein trong mô chuyên bi t, c u trúc gen ph i ch a trình t ự ề đi u
ự ế ề ề ả ợ hòa thích h p, có kh năng phiên mã tr c ti p trong mô. Vùng đi u hòa có chi u dài
ả ớ ố ể ặ ế ợ kho ng 100bp, k t h p v i các nhân t cis ho c trans đ tham gia quá trình phiên mã
ở ộ ế (kh i đ ng hay k t thúc quá trình phiên mã.
3
ể ắ ắ ạ ộ ớ ọ ố Enhancer: m t đo n ADN ng n, có th g n v i protein (còn g i là nhân t ạ ho t
ứ ộ ụ ủ ộ đ ng trans), làm tăng m c đ phiên mã c a gen m c tiêu trong 1 nhóm gen, không ph ụ
ộ ị ướ ị thu c vào v trí đ nh h ủ ng c a gen.
ề ấ ầ ắ ể *Ngoài ra còn nhi u c u trúc khác c n g n vào gen chuy n
ọ ọ ể ế ượ ể ấ Các marker ch n l c: khi gen chuy n vào t bào, chúng đ c nuôi c y đ sau đó
ữ ọ ế ượ ặ ả ạ ế ồ ọ sàng l c, ch n ra nh ng t bào đã đ ạ c bi n n p ho c t i n p thành công. G m 2
lo i:ạ
ọ ọ ươ ọ ọ ả ẩ ượ ử ụ + Các marker ch n l c d ủ ng (s n ph m c a gen ch n l c) đ ệ c s d ng hi u
ọ ọ ữ ế ể ằ ả ầ ế ậ ượ qu trong h u h t các gen chuy n, nh m ch n l c nh ng t bào đã nh n đ ấ c c u
ể ở ạ ự ượ ậ ộ ế ủ trúc gen chuy n ( d ng t do hay đã đ c sát nh p vào b gen t bào ch ).
ọ ọ ườ ươ ử ụ + Các marker ch n l c âm th ng đ c s d ng: HSVtk, dt và hprt đ ch n l c t ể ọ ọ ế
ồ ạ ể bào không t n t i gen chuy n hay 1 gen nào đó bên trong.
ữ ễ ệ Gen báo cáo (reporter gen) là nh ng gen mã hóa cho các protein d phát hi n giúp
ạ ộ ủ ượ ườ ủ ể báo cáo vai trò ho t đ ng c a gen, đ c chèn vào “bên s ự n” c a gen chuy n. D a
ệ ủ ự ể ự ề ủ ể vào s bi u hi n c a gen báo cáo giúp đánh giá s đi u hòa c a gen chuy n trong t ế
bào hay mô.
Ở ố ể ượ ấ ổ ể ế Polylinker: cu i các c u trúc gen có th đ c bi n đ i đ hình thành các
ộ ố ị ệ ủ ứ ắ ớ ạ ậ polylinker ch a m t s v trí nh n di n c a các enzyme c t gi i h n. Polylinker cho
ữ ụ ể ằ ấ phép c u trúc gen chèn vào nh ng vector, nh m m c đích nhân dòng và ki m tra.
ể ượ ạ ằ ắ ớ ạ ADN gen chuy n đ ử ụ c t o ra b ng cách s d ng các enzyme c t gi i h n và
ừ ể ượ ế ợ ạ ữ ạ ệ ố ligase, gen t nh ng lo i khác nhau có th đ c k t h p l ể ạ i trong ng nghi m đ t o
ể ấ thành c u trúc gen chuy n.
4
ấ ể C u trúc gen chuy n
ắ ầ ị ATG: V trí b t đ u phiên mã
ự ấ SIG: Trình t ệ d u hi u
AAA: đuôi poly A
3. Các nguyên lý sinh h cọ
ề ệ ạ ưỡ ể ệ ế ứ
- T o các đi u ki n sinh lý sinh hóa, hoăc c
ng b c đ h t ấ ủ bào ch ch p
ế ố ạ ậ ự ả ể nh n y u t l ạ (gen chuy n), tránh s th i lo i
-
ả ượ ế ự ậ ả ợ ể Gen chuy n ph i vào đ c trong t ữ ễ bào nh n và ph i di n ra s dung h p gi a
ế gen t ể bào vào gen chuy n
ả ượ ể ể ế ủ
- Gen chuy n ph i đ
ệ c bi u hi n trong t bào ch
ố ượ ả ượ ể ể ậ ế ề ạ
- S l
ng cá th nh n gen chuy n ph i đ c khu ch đ i (di truy n cho th h ế ệ
ả ủ ể ể ề ệ con cái) đ di truy n hi u qu c a gen chuy n.
ổ ợ ả ượ ể ầ ị ế ồ ầ - T h p gen c n chuy n ph i đ c chèn chính xác vào v trí c n thi ờ t đ ng th i
ế ượ ố ự ủ ữ ộ kh ng ch đ ủ c nh ng tác đ ng tiêu c c c a mô ch .
5
ƯỚ Ể B. CÁC B C TRONG CHUY N GEN
ạ ổ ợ I. T o ADN tái t h p
ệ 1. Khái ni m chung
ổ ợ ượ ể ử ADN tái t h p (recombinant ADN) đ ỉ c dùng đ ch các phân t ADN đ ượ ạ c t o
ừ ấ ứ ừ ề ạ ồ ra t hai hay nhi u phân đo n ADN xu t x t ố các ngu n g c khác nhau.
6
ầ ủ ữ * Nh ng yêu c u c a ADN tái t ổ ợ h p
ổ ợ ả ạ ượ ữ ầ ầ ế ủ ộ ADN tái t h p ph i đ t đ c nh ng yêu c u c n thi ể t c a m t vector chuy n
gen.
ổ ợ ư ả ạ ế ADN tái t h p ph i có ho t tính khi đ a vào t ủ bào ch .
ổ ợ ữ ệ ễ ể ệ ấ ầ ẩ ả ADN tái t h p ph i có nh ng d u hi u d phát hi n trong qu n th vi khu n. Và
ự ạ ộ ệ ủ ể ổ ợ ễ d quan sát s ho t đ ng và bi u hi n c a gen tái t h p.
ư ế ự ệ 2. ADN tái t ổ ợ ượ h p đ c th c hi n nh th nào?
ướ ơ ả ự ệ ổ ợ Các b c c b n th c hi n ADN tái t h p
ọ ệ 2.1. Ch n nguyên li u
ượ ọ ươ ệ ậ ườ ADN đ c ch n làm ph ể ng ti n v n chuy n gen (vector) th ng là ADN
ượ ủ ế ừ ế ậ ậ ượ plasmid và ADN phage. Chúng đ c thu nh n ch y u t t bào vi sinh v t, đ c tách
ươ ế ạ và làm s ch theo ph ng pháp chi t tách ADN plasmid, ADN virus.
ứ ứ ạ ầ ượ ậ ừ ế ADN ch a gen c n nghiên c u (ADN l ) cũng đ c thu nh n t t ậ bào sinh v t
ượ ế ể ạ ươ ế đ c chi t tách và làm s ch và ki m tra theo ph ng pháp chi t tách ADN.
ớ ự ủ ể ể ạ ầ 2.2. Gia công đo n ADN c n chuy n v i s tham gia c a enzyme RE ki u II
ắ ở ữ ể ữ ị ị RE (Restriction Endonuclease) ki u II: là nh ng enzyme c t nh ng v trí xác đ nh
ộ ố ư ư ỉ ể ể ạ ắ ầ ộ ả chúng có m t s u đi m: H u nh ch có m t ki u ho t tính c t, enzyme khác đ m
ệ ả ắ ở ị ệ ỗ ộ ợ ị ướ ở nhi m vi c c i biên. M i m t enzyme c t v trí phù h p đ nh tr c ngay bên trong
ạ ự ậ ế ỉ ầ ầ ượ hay c nh trình t nh n bi t. Chúng ch c n ion Mg +2 và không c n năng l ng ATP.
ủ ặ ử ắ ỗ Các enzyme này g p chu i đích c a nó trên phân t ADN và c t ADN thành hai
ả ạ ầ ầ ằ m nh d ng đ u b ng hay đ u dính.
ả ắ ủ ệ ớ ạ ế ố ụ ề ộ ư Hi u qu c t c a enzyme gi i h n ph thu c vào nhi u y u t khác nhau nh hàm
ủ ệ ộ ạ ườ ệ ộ ượ l ng c a enzyme, nhi t đ , ion kim lo i, môi tr ng đ m, pH và đ tinh khi ế ủ t c a
ADN.
7
ặ ủ ớ ự ố 2.3. N i ADN vào vector v i s có m t c a enzyme ADN ligase
ướ ủ ế ề ể ạ ậ ố B c ti p theo c a kĩ thu t di truy n là n i các đo n ADN vào vector chuy n gen
ể ạ ổ ợ ạ ả ứ ố ượ ự ệ ờ đ t o vector tái t h p có mang ADN l . Ph n ng n i đ c th c hi n nh enzyme
ADN ligase.
ả ứ ả ằ ộ ố ạ ADN ligase là m t enzyme xúc tác các ph n ng n i hai m nh ADN b ng cách t o
ữ ủ ứ ầ ầ ố ạ ầ c u n i phosphodiester gi a đ u 5’(P) và đ u 3’(OH) c a hai nucleotide đ ng c nh
ọ ử ườ ư ộ ấ , ng i ta coi ADN ligase nh m t ch t keo nhau (Hình 62). Trong sinh h c phân t
ử ể ế ẫ ạ ớ phân t đ k t dính các m u ADN l i v i nhau.
ằ ố ầ 2.3.1. N i đ u b ng
ầ ằ ố ượ khi N i đ u b ng đ ả c x y ra
ạ ầ ằ ứ hai đo n ADN đ u b ng đ ng
ụ ủ ướ ạ c nh nhau. D i tác d ng c a
enzyme ligase, liên k tế
ữ ầ phosphodiester gi a đ u 5’(P) và
ượ hai ầ đ u 3’(OH) đ c hình thành và
ượ ố ạ ớ nucleotide đ c n i l i v i nhau.
ố ầ ệ 2.3.2. N i đ u l ch
ầ ả ầ Đ u tiên, hai m nh ADN đ u
ơ ổ ữ ệ l ch do có nh ng baz b sung
ầ ạ ế nên chúng ti n g n l i nhau đ ể
ữ ế ạ t o liên k t hydro gi a các baz ơ
ơ ổ nit b sung. Sau đó, hai
ủ ầ ố ạ nucleotide c a hai đ u n i t o
ế ữ liên k t este gi a OH (3’) và P
ướ ụ ủ (5’) d i tác d ng c a enzyme ADN ligase.
8
ờ ử ụ ắ ớ ạ ừ ữ => Nh s d ng các enzyme c t gi i h n và ligase, gen t nh ng loài khác nhau có
ể ượ ế ợ ạ ể ạ ệ ể ấ ố th đ c k t h p l i trong ng nghi m đ t o thành c u trúc gen chuy n.
ư ế II. Đ a ADN vào t bào nhân
ỹ ậ 1. K thu t Calcium phosphate ( calcium phosphate technique)
ứ ợ ả ẩ ủ Nguyên t c:ắ kh m bào c a ph c h p ADN – calcium phosphate.
ậ ỹ ượ ầ K thu t calcium phosphate (calcium phosphate technique) đ ể c phát tri n đ u tiên
ự ể ễ ị ủ đ xác đ nh s lây nhi m c a ADN virus (Graham,1973).
ệ ượ ử ụ ạ ủ ể ử ạ ộ ế ệ Hi n nay đ c s d ng rông rãi đ th nghi m ho t đ ng bi n n p c a ADN virus
ư ế cũng nh ADN tách chi ế ừ t t các t bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979;
Pellicer, 1980).
ầ ủ ậ ỹ ế ấ ồ ế ủ ậ ớ K thu t này yêu c u các t bào nh n v i các ch t đ ng k t t a ADN và calcium
ế ủ ế ẽ ấ ụ ế phosphate. K t t a này bám vào t bào và sau đó s h p th vào t bào qua quá trình
ẩ ế ử ạ m bào (Loyter, 1982). Trong t bào, các phân t ằ ADN ngo i lai n m trong không bào
ượ ạ ư ế ấ ấ ẩ ợ đ c t o thành do m bào và lysosome nh ng r t ít ADN đi đ n nhân và h p nh t vào
genome ch .ủ
9
ứ ợ Hình: Ph c h p ADNcalcium phosphate.
ị ố ớ ứ ể ậ ỹ ế K thu t này vô cùng có giá tr đ i v i các nghiên c u chuy n gen vào các t bào
ượ ử ụ ề ể ế ấ soma nuôi c y và đang đ ể c s d ng nhi u đ chuy n các dòng genome vào t bào
ạ ạ ế ế ế đích. Bên c nh đó, bi n n p ADN tách chi ế ừ t t các t ư bào ung th vào các t ậ bào nh n
ư ấ ươ ứ ự ể ấ ể không ung th đã cho th y đây là ph ng pháp duy nh t đ nghiên c u s ki m soát di
ề ủ ư truy n c a ung th .
ễ ự ố ế ệ ả ơ ố ế ế Ư ể đ n gi n, protocol d th c hi n, ít t n kém, s t ạ bào ch t sau bi n n p u đi m:
ể ự ể ặ ổ ệ ể ấ ọ ờ ị không đáng k , s bi u hi n gen có th là nh t th i ho c n đ nh và quan tr ng trong
ế ế ổ ợ ệ vi c thi t k vector virus tái t h p.
ượ ệ ủ ả ế ể ệ ạ ấ ứ ộ ể ể hi u qu bi n n p và m c đ bi u hi n c a gen chuy n th p. Nh c đi m:
ể 2. Chuy n gen qua liposome
ự ủ ợ ế ứ ợ ớ bào phía ngoài v i ph c h p liposome Nguyên t c: ắ s dung h p c a màng t
ADN.
ủ ấ ổ Hình 2.1: C u trúc t ng quát c a Lipid cation.
10
ủ ấ ổ Hình 2.2: C u trúc t ng quát c a DOPE (Ldiolecyl phosphatidyllethanolamine).
ứ ợ Hình 2.3: Ph c h p LiposomeADN.
11
ạ ộ ơ ồ ủ Hình 2.4: S đ Ho t đ ng c a vector liposome.
ượ ư ộ ớ ộ
Lipid cation đ
c tr n v i m t lipid trung tính nh Ldioleoyl phosphatidyl
ethanolamine (DOPE).
ủ ầ ử ế ợ ế ệ ả ớ
Ph n cation c a phân t
ứ lipid k t h p v i ADN tích đi n âm và k t qu là ch a
ứ ợ ầ đ y ADN trong ph c h p liposomeADN.
ờ ơ ế ứ ợ ệ ấ ậ
Nh c ch nh p bào, các ph c h p xu t hi n trong endosome và sau đó đi vào
ượ ủ ự ộ ợ nhân. DOPE đ c xem là m t lipid kích thích s dung h p và vai trò c a nó là phóng
ứ ợ ừ ợ ủ ự ư ế thích các ph c h p này t endosome cũng nh làm cho s dung h p c a màng t bào
ứ ợ ễ ả ớ phía ngoài v i ph c h p liposomeADN x y ra d dàng.
Ư ể ẽ ủ ệ ợ ấ ể gen chuy n s không h p nh t vào genome ch , có hi u qu t ả ố ố t đ i u đi m:
ể ượ ướ ấ ớ ớ ả ế v i c t bào in vitro và in vivo, có th mang đ c các ADN có kích th c r t l n, đ ộ
ế ể ử ụ ễ ớ ị ế ạ tinh khi t cao, không gây mi n d ch, có th s d ng v i các t ằ ế bào mà bi n n p b ng
ệ ậ ả ỹ k thu t calcium phosphat không có hi u qu .
ượ ệ ể ườ ế ở ấ ờ ự ể s bi u hi n gen chuy n th ự ứ ng nh t th i, s c ch b i các Nh ể c đi m:
ầ ủ ể ả ế thành ph n c a huy t thanh có th x y ra.
12
ươ 3. Ph ng pháp vi tiêm
ứ ạ ự ể ằ ầ ộ ươ S thành công đ u tiên trong nghiên c u t o chu t chuy n gen b ng ph ng pháp
ượ ố ề vi tiêm vào ti n nhân đã đ c công b vào năm 1980 (Gordon, 1980).
ứ ủ ụ ề ạ Hình 3.1: Vi tiêm gen ngo i lai vào ti n nhân c a tr ng th tinh.
ể ế ậ ậ ộ ỹ ươ Cho đ n nay, trong các k thu t chuy n gen vào đ ng v t thì ph ng pháp vi
ợ ử ị ươ ệ ả ấ ậ ộ tiêm dung d ch ADN vào h p t là ph ng pháp có hi u qu nh t trên đ ng v t có vú
ươ ủ ế ượ ử ụ ể ậ ệ và hi n là ph ng pháp ch y u đ ể c s d ng đ chuy n gen vào v t nuôi.
ố ớ ậ ươ ượ ử ụ ố ớ ế ự Ð i v i th c v t thì ph ng pháp này đ c s d ng đ i v i các t ề bào ti n
ủ ợ ử ặ ế ủ ạ ề ấ phôi c a h p t ho c các t bào ti n phôi c a h t ph n.
13
ộ ượ ượ ự ế ế ỏ ng nh ADN đ c tiêm tr c ti p vào t ầ bào phôi tr n Nguyên t c:ắ m t l
ặ ế ơ ọ ướ ẹ ộ ể ho c t bào nguyên v n m t cách c h c d i kính hi n vi.
ể ị Dung d ch gen chuy n
ể ượ ạ ộ Gen chuy n đ c xen vào trong m t vector plasmid và t o dòng trong E.coli.
ế ẩ ổ ợ ượ ệ ạ Các vi khu n bi n n p mang plasmid tái t h p đ c phát hi n trong môi
ườ ố ặ ệ ấ ố tr ng nuôi c y có thu c kháng sinh do plasmid mang các gen kháng thu c đ c hi u.
ố ượ ưở ườ ưỡ ẩ Các vi khu n s ng sót đ c sinh tr ng trong môi tr ng dinh d ng thích
ổ ợ ể ẽ ượ ỗ ế ợ h p và plasmid tái t h p mang gen chuy n s đ c sao chép m i khi t ẩ bào vi khu n
phân chia.
ủ ệ ổ ợ ể ượ ả Sau đó, hàng tri u b n sao c a plasmid tái t h p mang gen chuy n đ c tách
ế ể ượ ạ ẩ ừ chi ế ừ t t các t bào vi khu n này và các đo n gen chuy n đ c tách ra t plasmid tái t ổ
ờ ử ụ ạ ế ợ h p nh s d ng enzym h n ch .
ể ượ ể ạ ệ Ð tinh s ch, gen chuy n đ c đi n di trên gel agarose.
ư ư ệ ể ặ ị ị Hoà tan gen chuy n trong dung d ch đ m đ c tr ng (nh dung d ch Tris
ể ồ ộ ờ ị ị ổ ế EDTA; dung d ch TE...) và tính n ng đ dung d ch gen chuy n nh quang ph k .
ử ụ ộ ồ ị ườ N ng đ dung d ch ADN s d ng cho vi tiêm th ng là 15 µg/ml.
14
ướ ể ể ượ ự ể ể ệ Tr c khi chuy n vào phôi, gen chuy n đ c ki m tra s bi u hi n trong các
ự ể ễ ấ ằ ế t bào nuôi c y b ng s chuy n nhi m (transfection).
ướ ế Các b c ti n hành
ằ ạ ươ ầ N p gen vào kim tiêm b ng ph ng pháp capillar (ngâm đ u kim tiêm vào
ự ế ặ ơ ả ờ ị ị dung d ch gen kho ng 1012 gi ) ho c b m tr c ti p dung d ch gen vào.
ắ ữ ứ ề L p kim tiêm và kim gi ể vào máy vi thao tác, chuy n tr ng ti n nhân vào đĩa
ứ ườ ữ ứ ề ầ petri có ch a môi tr ng đ ượ ặ ướ c đ t d ể i kính hi n vi, gi tr ng ti n nhân vào đ u kim
ữ ằ ự ủ ề ể ể ỉ ị gi ề b ng l c hút c a syringe, đi u ch nh kính hi n vi đ xác đ nh đĩa phôi và đi u
ể ư ủ ứ ề ẩ ỉ ứ ị ch nh máy vi thao tác đ đ a kim tiêm vào v trí c a tr ng ti n nhân, đ y gen vào tr ng
ứ ề ẹ ề ấ ằ ặ ơ ồ ở ti n nhân b ng cách v n nh syringe. Khi th y tr ng ti n nhân h i ph ng to và tr nên
ừ ơ ạ sáng h n thì d ng l i và kéo nhanh kim tiêm ra.
ứ ề ượ ể ố ướ Tr ng ti n nhân sau khi tiêm đ ế c di chuy n xa đ n cu i đĩa petri tr c khi
ứ ề ế tiêm tr ng ti n nhân ti p theo.
ứ ỗ ộ ượ ể ộ ề M i m t nhóm tr ng ti n nhân đã hoàn thành đ c chuy n sang m t đĩa môi
ườ ể ấ ế ắ ộ tr ằ ng khác đ p và đánh giá b ng m t trong m t vài ti ng.
ấ ả ứ ề ượ ấ ượ Sau đó t t c các tr ng ti n nhân đ c nhìn th y rõ ràng và đ ể c chuy n vào
ố ứ ẫ ậ ủ ng d n tr ng c a con cái nh n.
ố ượ ố ượ Loài đ ngộ S l ng tr ng ứ đ cượ S l ng con sinh ra từ ố ượ S l ng
ể
v tậ Thỏ C uừ L nợ vi tiêm 1907 1032 2035 ứ tr ng vi tiêm 218 (11,4%) 73 (7,1%) 192 (9,4%) con chuy n gen 28 (1,5%) 1(0,1%) 20 (1%)
ả ủ ệ ở ộ ố ự ậ ộ ộ Hình 3.4: Hi u qu c a vi tiêm m t s loài đ ng v t (Hammer và c ng s , 1985).
Ư ể u đi m:
15
ố ở ừ ư ị ế ệ ớ Cho phép đ a gen vào đúng v trí mong mu n t ng t bào v i hi u qu ả
ươ t ố ng đ i cao.
ươ ể ệ ệ ả ấ ậ ộ Ph ng pháp chuy n gen có hi u qu nh t trên đ ng v t có vú và hi n là
ươ ủ ế ượ ử ụ ể ậ ph ng pháp ch y u đ ể c s d ng đ chuy n gen vào v t nuôi.
ố ớ ậ ươ ượ ử ụ ố ớ ế ự Ð i v i th c v t thì ph ng pháp này đ c s d ng đ i v i các t ề bào ti n
ủ ợ ử ặ ế ủ ạ ề ấ phôi c a h p t ho c các t bào ti n phôi c a h t ph n.
ượ Nh ể c đi m:
ự ỳ ế ố ượ ạ ả ỏ ỉ ỉ ế Đòi h i ph i tinh vi, t m và c c k chính xác nên h n ch s l ng t bào vi
ể ổ ươ ế ế ơ ọ tiêm và ngoài ra còn có th làm t n th ng đ n t bào phôi do tác nhân c h c gây ra
ệ ự khi th c hi n.
ậ ủ ự ể ế ủ ậ S xâm nh p c a gen chuy n vào ADN t ẫ ộ bào v t ch là m t quá trình ng u
ấ ể ủ ể ẽ ậ ể ị nhiên và xác su t đ gen chuy n xen vào v trí ADN v t ch mà s cho phép nó bi u
ệ ấ hi n là th p.
ế ạ 4. Bi n n p (Transformation)
ư ổ ợ ế ủ ượ ả h p vào t bào ch đ c ph i làm cho Nguyên t c:ắ Mu n ố đ a vector tái t
ấ ế ậ ổ ủ ớ màng sinh ch t t ị ế bào nh n b bi n đ i sau đó v i m t t l ộ ỉ ệ ữ vector tái t gi a ổ ợ h p
ử ớ ế v i t ủ bào ch đã x lý.
ệ ượ ế ề ằ Bi n n p ạ là hi n t ế ề ng truy n thông tin di truy n b ng ADN. Trong bi n
ượ ế n p,ạ ADN tr nầ t ừ ộ ế m t t bào vi khu n ể ẩ (th cho) này đ ề c truy n sang t ẩ bào vi khu n
ế ẩ ậ ạ ấ ạ ả ể khác (th nh n). ậ Bi n n p x y ra khi vi khu n nh n ADN ngo i lai và h p thu vào
ế ế ị ỡ ủ ẩ ị trong t bào. Khi t bào vi khu n b v do b tan (lysis), ADN vòng tròn c a chúng
ườ ẳ ả ạ ớ thoát ra môi tr ề ng thành các đo n th ng v i chi u dài khác nhau, có kh năng gây
ế ạ ế bi n n p cho các t ậ bào nh n khác.
ế ạ ượ ấ ở Bi n n p đ ứ c nghiên c u kĩ nh t các vi khu n ẩ Streptococcus pneumoniae,
ở ộ ố ẩ Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae và m t s nhóm vi khu n khác.
16
ả ủ ế ố ụ ệ ế ạ ộ Hi u qu c a bi n n p ph thu c vào 3 y u t :
ạ ủ ế ậ + Tính dung n p c a t bào nh n.
ướ ủ ạ ạ + Kích th c c a đo n ADN ngo i lai.
ồ ộ ủ + N ng đ c a ADN.
ử ơ ế 4.1. C ch phân t
ơ ồ ễ ế ủ ạ ở ấ ế ử Hình 4.1: S đ di n bi n c a quá trình bi n n p ộ c p đ phân t
a.
ắ ặ ậ ổ ợ ế ADN bám vào. b. Thâm nh p. c. B t c p và tái t h p. d. ế –T bào bi n
n pạ
17
ủ ế ồ ọ 4.2. Quá trình g m các giai đ an ch y u
ủ ự ế ế ủ ế ể ự bào cho: bào cho – S phân h y ADN t ADN t có th là c a t bào t nhiên b ị
ế ằ ủ ệ ặ ị ệ ộ phân h y ho c trong thí nghi m b gây ch b ng nhi t đ cao hay tác nhân phá v t ỡ ế
bào.
ề ặ ế bào: – ADN bám vào b m t t ắ Protein g n vào ADN.
ủ ủ ạ ẩ ợ ậ – Thâm nh p c a ADN: S i ADN m ch kép c a dòng vi khu n S sau khi chui
ế ủ ế ủ ạ ộ ạ qua màng t bào c a dòng R thì m t m ch S s b ẽ ịnucleaz c a t ắ bào c t, còn l ộ i m t
ạ m ch nguyên.
ắ ặ h p: – B t c p (Synapsis)và tái t ổ ợ Nh s h tr ờ ự ỗ ợ ủ protein RecA ADN c aủ c a
ẽ ế ạ ở ể ậ ờ ễ ắ ặ ể ạ ạ th nh n R s bi n tính tách r i 2 m ch ớ 1 đo n d b t c p v i đo n ADN th cho S
ừ v a chui vào.
ắ ặ ạ ạ ử ạ Sao chép: Sau khi b t c p t o đo n lai R S, phân t ợ ADN sao chép t o ra 2 s i,
ả ố ộ ợ ể ế ậ ạ ợ m t s i kép RR và s i kép khác có mang đo n ADN th nh n SS. K t qu cu i cùng
ủ ộ ọ ế ậ ộ ế là đ an gen c a SIII chèn vào b gen t bào nh n. Sau phân bào thì m t dòng t bào
ượ ạ ộ ế ượ ế ế ạ ượ ậ nh n đ c ADN ngo i lai vào b gen t bào đ c bi n n p. T bào đã đ ế c bi n
ả ạ ậ ớ ạ n p sinh s n t o dòng nh n RII m i.
ấ ị ế ổ ờ ế ạ 4.2.1. Làm cho màng sinh ch t b bi n đ i nh hóa bi n n p
ươ ể ế ứ ể ạ ế Ph ng th c kinh đi n đ bi n n p ADN plasmid vào t bào E.Coli.
2 đ tr
ế ủ ượ ủ ị ể ở ế + B1: Các t bào ch đ c trong dung d ch CaCl thành t bào kh ả
ế ậ ễ ế bi n giúp cho chúng d ti p nh n ADN plasmid.
ư ằ ệ + B2: ADN plasmid đ a vào b ng cách shock nhi t nhanh (4050giây)
ế ạ ượ ọ ọ ằ ươ + B3: Các t ế bào bi n n p đ c ch n l c b ng ph ng pháp ch n l c d ọ ọ ươ ng
ứ ườ ẩ ạ ớ ợ ỗ tính trên đĩa agar ch a môi tr ng LB v i kháng sinh thích h p. M i khu n l c trên đĩa
ể ế ệ ạ ạ ộ ơ kháng sinh đ i di n cho m t th bi n n p đ n
18
β ơ ấ ổ + B4: B sung thêm c ch t NST cho – galactosidase (X gal)
ế ứ ể ạ ằ ắ ị => Các t bào ch a plasmid mang ADN ngo i lai có th xác đ nh b ng m t
ấ ị ế ổ ệ ế ạ 4.2.2. Làm cho màng sinh ch t b bi n đ i nh đ ờ i n bi n n p
ấ ể ế ệ ạ ẩ ậ ả Đây là kĩ thu t hi u qu nh t đ bi n n p vi khu n.
ạ ế ố ọ ệ ầ ẩ ế Hai thông s quan tr ng là lo i t ầ ố bào vi khu n và t n s xung đi n c n thi t.
ể ạ ỗ ử ụ ế ụ ệ ộ ỏ nh trên Nguyên t c:ắ S d ng dòng đi n cao th c c b theo xung đ t o l
ọ ủ ế ệ ạ ế ấ ổ ợ màng sinh h c c a t ề bào, t o đi u ki n cho t ụ bào h p th ADN tái t h p d ễ
dàng.
8 109 th bi n n p/μg plasmid.
ệ ả ể ế ạ ấ Hi u su t kho ng 10
ươ ỏ ế ị ế ắ ề Ph ng pháp này đòi h i thi ạ t b bi n n p đ t ti n.
ế ạ ờ 4.2.3. Bi n n p gen nh polyetylen glycol (PEP)
ươ ổ ợ ế ượ ử Là ph ể ng pháp chuy n ADN tái t h p vào t ủ bào ch đã đ ằ c x lý b ng
polyetylen glycol (PEG).
ể ạ ế ườ ớ ộ Đ t o t ầ bào tr n ng i ta ủ ế t ồ bào v i PEG n ng đ 30 – 40%.
ươ ố ớ ế ệ ả ự ậ ằ ươ Đây là ph ng pháp hi u qu cao đ i v i t bào th c v t. B ng ph ng pháp
ườ ậ ượ ạ ổ ế ề ị này ng i ta đã nh n đ c các cây mang gen bi n n p n đ nh và di truy n qua
ề ế ệ nhi u th h .
Ư ầ ố ế ế ầ ạ ạ ồ ờ ỉ ị ể T n s bi n n p đ ng th i gen ch th và gen c n bi n n p cao. Có th ể u đi m:
ể ế ặ ệ chuy n gen vào t ủ ấ ỳ ạ bào protoplast c a b t k lo i cây nào. Đ c bi t loai cây có giá
ị ế ư ạ ạ tr kinh t cao nh : lúa, ngô, đ i m ch.
ượ ệ ấ ở ộ ố ể Vi c tái sinh cây protoplast còn r t khó khăn m t s loài cây. Nh c đi m:
19
ả ạ 5. T i n p (Transduction)
ả ạ ệ ượ ậ ệ ể ề ừ T i n p là hi n t ng chuy n v t li u di truy n qua vector là virus t ẩ vi khu n cho
ể ẩ ậ ổ ơ ở ẩ sang vi khu n nh n, trong đó quá trình chuy n gen và tái t h p gen vi khu n nh ờ
ự ể ẩ th c khu n th (Bacteriophage).
λ ứ ự ệ ượ ả ạ ở Th c nghi m đã ch ng minh đ i n p c t E.Coli qua phage , pha P1 và ở
ả ạ ệ ả ơ Bacillus subtilis qua phage SP10 thì t i n p cho hi u qu cao h n.
ể ẩ Tiêu chu n virus làm vector chuy n gen:
ủ ệ ả + H gen c a virus ph i là ADN.
ự ậ ể ạ + Không gây tác h i đáng k cho th c v t.
ắ ạ ả + Có kh năng t ả ượ i đ c đo n ADN g n vào.
ươ ượ ử ụ Tuy nhiên ph ng pháp này ít đ c s d ng
ơ ể ự ậ ễ ậ Ư ể Virus d xâm nh p và lây lan trong c th th c v t. u đi m:
ả ạ ồ ả ạ ả ạ ệ * T i n p g m: t i n p chung và t i n p chuyên bi t.
ả ạ 5.1. T i n p chung (Genral transduction)
ả ạ ả ấ ủ ể ẩ T i n p chung x y ra khi phage mang b t kì gen nào c a vi khu n A chuy n sang
ẩ vi khu n B.
ả ạ ể ặ T i n p chung (genralized transduction) có các đ c đi m:
ườ ể ự ệ Th ng do phage ki u P1 th c hi n.
ấ ủ B t kì gen nào ẩ c a vi khu n cũng đ u đ ề ượ ả ạ c t i n p.
ả ạ ượ ủ ế ủ ưở T i n p có đ c do gói nh mầ ADN c a t bào ch khi phage tr ng thành.
ể ổ ợ ượ ạ ơ h p đ n b i Các th tái t ộ đ c t o ra.
ả ạ ệ 5.2. T i n p chuyên bi t (Special transduction)
20
ả ạ ạ ườ T i n p chuyên bi t ệ hay h n ch ế (restricted transduction) là tr ợ ng h p ch ỉ
ấ ị ộ ể ặ mang m t vài gen nh t đ nh , nó có 4 đ c đi m:
ượ ắ Nh ngữ gen đ ể c chuy n n m ỗ ằ sát ch prophage g n vào.
ự ệ Chỉ prophage ki uể λ th c hi n.
ủ ắ ể ủ ế ắ ỏ ế Do k t qu s ả ự c t sai c a prophage ễ khi tách kh i nhi m s c th c a t bào
ch .ủ
ẩ ổ ợ ưỡ ầ ộ ộ ng b i m t ph n. Các vi khu n tái t h p có th ể l
ờ ể 6. Chuy n gen nh vector là virus
ượ ử ụ ể ễ ế ủ c s d ng đ lây nhi m vào t ạ ớ bào giai đo n s m c a phôi Nguyên t c:ắ Virus đ
ướ ượ ể tr c khi đ ẹ c chuy n ghép vào con m .
ề ố ượ ử ụ Nhi u nhóm trong s đó, các papovavirus, adenovirus, retrovirus...đ c s d ng vào
ụ ữ ệ ể ử ụ ủ ầ nh ng m c đích chuyên bi t. Ð s d ng làm vector, các ph n khác nhau c a genome
ượ ằ ấ ượ ử ụ ả virus đ c thay th ế b ng gen c u trúc quan tâm; các virus đ c s d ng ph i an toàn,
không gây b nh.ệ
ơ ể ể ở ạ ể ả ỉ Các c th chuy n gen sinh ra ể d ng kh m. Gen chuy n ch có th di truy n đ ề ượ c
ộ ố ế ấ ợ ụ ế n u retrovirus h p nh t vào m t s t bào sinh d c.
ể ấ ợ ế ụ ượ ể ọ Khi gen chuy n đã h p nh t trong các t bào sinh d c thì đ ả c g i là th kh m
ầ ượ ế ệ ế ả dòng m m và sau đó đ c lai cùng dòng kho ng 1020 th h cho đ n khi thu đ ượ c
ợ ử ậ ồ ộ ặ ở ể ể các đ ng v t chuy n gen đ ng h p t và gen chuy n có m t trong t ấ ả ọ ế t c m i t bào.
Ở ể ượ ể ạ ượ ả ả giai đo n này, phôi mang gen chuy n có th đ ạ c đông l nh và đ c b o qu n cho
ề ể ấ các quá trình c y chuy n v sau.
Ư ấ ỳ ạ ể ượ ử ụ ể ể B t k lo i virus nào cũng có th đ ể c s d ng làm vector đ chuy n u đi m:
ề ế ậ ệ v t li u di truy n vào trong t bào.
21
ượ ỉ ệ ố ủ ể ậ ấ ấ ộ ơ ể T l s ng c a các đ ng v t chuy n gen s sinh r t th p. Nh c đi m:
ể ở ờ ộ Hình 6.1 Chuy n gen chu t nh vector là virus.
ể ắ ằ 7. Chuy n gen b ng súng b n gen
ố ộ ử ụ ự ủ ể ạ Nguyên t c: ắ s d ng áp l c xung c a khí helium đ gia tăng t c đ các h t.
ườ ể ấ ả ỏ S d ng ử ụ các h tạ tungsten đ ạ ng kính r t nh ho ng 1 micromet ( có th là các h t
ư ặ ạ ượ ự ế ắ ọ ế kim loai n ng nh vàng, b c…) đ c bao b c ADN và b n tr c ti p vào t bào .
22
ổ ế ể ấ ố Dùng ph bi n nh t trong chuy n gen các loài ngũ c c.
ắ ạ ộ Hình 8.1: Nguyên lý ho t đ ng cúa súng b n gen.
ạ ế ể ể ề ễ Ư ể thao tác d dàng, có th chuy n gen vào nhi u lo i t bào và mô, các t ế u đi m:
ượ ỉ ệ ố ế ư ế ở ị bào đ ạ c bi n n p có t l s ng sót cao, cho phép đ a các gen vào t bào v trí mong
Ứ ụ ự ủ ể ậ ạ ạ ố ề mu n.... ng d ng đa d ng: t o th c v t chuy n gen, tiêm ch ng vaccine di truy n,
ệ ự ự ề ễ ị li u pháp gen t ế sát, s đi u bi n mi n d ch, …
ượ ả ấ ể ệ ỏ Cây chuy n gen khó tái sinh, hi u qu th p, đòi h i thi ế ị ắ t b đ t Nh ể c đi m:
ậ ư ắ ề ạ ti n, chi phí v t t đ t (h t vàng, volfram…).
ạ ề ấ ươ ư ẽ ộ => Tóm l i có r t nhi u ph ụ ng pháp nh ng s ph thu c vào nhi u y u t ề ế ố ể ọ đ ch n
ươ ấ ợ ươ ố ư ấ ra ph ng pháp phù h p nh t. Không có ph ng pháp nào là t i u nh t.
ệ ủ ậ ủ ự ể ể ể III. Ki m tra s sát nh p c a gen chuy n và bi u hi n c a gen
23
ậ ủ ự ể ể 1. Ki m tra s sát nh p c a gen chuy n
ứ ề ệ ố ồ ờ Công vi c này t n nhi u th i gian và công s c, bao g m t ừ ướ b ậ c thu nh n mô, tách
ế ệ ủ ự ệ ộ ố ể ộ ị ươ chi t ADN, xác đ nh s hi n di n c a gen chuy n trong b gen. M t s ph ng pháp
ườ ượ ử ụ th ng đ c s d ng là PCR, Southern blot, dot blot, sot blot.
ọ ơ ộ ử ụ ể ượ ể ể + S d ng PCR đ sàng l c s b hàng trăm, hàng ngàn cá th đ c chuy n gen, sau
ử ụ ươ ế ể ả ẳ ọ ị đó s d ng các ph ầ ng pháp Southern blot đ kh ng đ nh k t qu sàng l c ban đ u
ủ c a PCR.
ươ ể ị ượ ươ + 2 ph ng pháp Dot blot và slot blot cũng dùng song song đ đ nh l ng t ố ng đ i
ư ằ ạ ặ ộ ươ ử m t lo i ADN đ c tr ng nào đó cũng b ng ph ng pháp lai phân t ấ và đánh d u
phóng x .ạ
ệ ủ ự ể ể ị 2. Xác đ nh s bi u hi n c a gen chuy n
ự ể ủ ể ệ ướ ấ ố Ki m tra s bi u hi n c a gen là b ọ c cu i cùng và quan tr ng nh t. Có hai cách
ơ ể ậ ệ ủ ự ể ạ ủ đánh giá s bi u hi n c a gen ngo i lai trong c th v t ch :
ệ ự ể ệ ủ + Phát hi n s bi u hi n c a gen thông qua protein
ệ ự ể ệ ủ + Phát hi n s bi u hi n c a gen thông qua mARN
ộ ố ươ ệ ủ ự ể ể ị 2.2. M t s ph ng pháp xác đ nh s bi u hi n c a gen chuy n
ệ ự ể ệ ủ ủ ượ ị 2.2.1. Phát hi n s bi u hi n c a gen thông qua protein c a gen đ c d ch mã
ử ụ ườ ể ủ ể ẵ ợ S d ng trong tr ng h p kháng th c a protein gen chuy n có s n, phát hi n s ệ ự
ể ượ ệ ể ế ằ ươ bi u hi n protein có th đ c ti n hành b ng ph ng pháp Western blot, ELISA, RIA.
ậ 1. Thu nh n protein
ướ ệ 2. phân tích kích th ằ c protein b ng đi n di
ể ạ ớ ệ 3. Các v ch lai v i kháng th chuyên bi ử t (lai phân t )
24
ự ồ ạ ệ ủ ắ ặ ể ệ ả ặ => S t n t i các b t c p đ c hi u c a kháng th và protein trên b ng đi n di s ẽ
ượ ự ể ể ự d đoán đ ệ ủ c s bi u hi n c a gen chuy n.
ậ ỹ ễ ị 2.2.1.1. K thu t mi n d ch enzyme (ELISA)
ậ ủ ỹ Nguyên lý c a k thu t ELISA
ậ ộ ỹ ươ K thu t ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) là m t ph ng pháp sinh
ệ ự ệ ệ ủ ử ụ ủ ế ể ễ ộ ọ ị hoá s d ng ch y u trong mi n d ch h c đ phát hi n s hi n di n c a m t kháng
ể ẫ ặ ộ ượ ử ụ th ho c kháng nguyên trong m t m u; ELISA đ ụ ẩ ư ộ c s d ng nh m t công c ch n
ư ể ấ ượ ự ệ ậ ọ ọ đoán y h c và b nh lý h c th c v t, cũng nh ki m soát ch t l ng trong các ngành
ệ công nghi p khác nhau.
ự ủ ể ệ ặ Nguyên lý c a ELISA chính là d a vào tính đ c hi u kháng nguyên – kháng th và
ướ ơ ả ồ g m các b c c b n sau:
ư ế ượ ắ ộ ề ặ • Kháng nguyên – antigen (KN) ch a bi c g n trên m t b m t. t đ
ể ế ướ ượ ề ặ ử ể • Kháng th – antibody (KT) bi c đ t tr c “r a” qua b m t đó. Kháng th này
ượ ắ đ ế ớ c g n k t v i ezyme.
25
ẽ ế ổ ơ ộ ơ ấ ạ ấ • Thêm vào m t c ch t (substance), enzyme s bi n đ i c ch t này và t o tín
ệ ị ượ ể hi u có th xác đ nh đ c.
ươ a. Ph ự ế ng pháp ELISA tr c ti p
ắ ơ ấ ế ự ử ụ ể ế ẽ ộ ớ S d ng m t kháng th có g n c ch t enzyme s liên k t tr c ti p v i kháng nguyên
ề ặ ả ứ trên b m t đĩa ph n ng.
26
27
ươ b. Ph ế ng pháp ELISA gián ti p
ươ ể ứ ấ ẽ ượ ổ ắ ặ ặ ộ Trong ph ng pháp này, m t kháng th th c p s đ ệ c b sung và b t c p đ c hi u
ể ứ ấ ể ơ ấ ắ ặ ớ ắ ơ ấ ớ v i kháng th s c p đã b t c p v i kháng nguyên. Kháng th th c p có g n c ch t
ắ ặ ế ệ ả ạ ể ặ ả ứ ẽ s phát tín hi u khu ch đ i khi x y ra ph n ng b t c p kháng nguyên kháng th đ c
hi u.ệ
ướ ế ế Các b ậ c ti n hành kĩ thu t ELISA gián ti p
Ư ể u đi m:
ắ ơ ấ ệ ử ụ ể ứ ấ ạ • Linh ho t trong vi c s d ng các kháng th th c p có g n c ch t.
ể ơ ấ ệ ự ả ứ ễ ạ ọ • Linh ho t và d dàng trong vi c l a ch n kháng th s c p cho ph n ng.
ể ơ ấ ạ ộ ủ ễ ể ị ố • Ho t đ ng mi n d ch c a kháng th s c p có th phát huy t i đa vì không b ị
ả ưở ở ơ ấ ấ nh h ng b i c ch t đánh d u.
ạ ộ • Đ nh y cao.
28
ệ ử ụ ơ ấ ạ • Linh ho t trong vi c s d ng c ch t.
ượ Nh ể c đi m:
ể ứ ấ ệ ủ ả ứ ể ả ộ ặ ớ ả • Có th x y ra ph n ng chéo v i các kháng th th c p à đ đ c hi u c a ph n
ứ ưở ị ả ng b nh h ng.
ả ứ ự ờ ơ ệ • Th i gian th c hi n ph n ng lâu h n.
ươ c. Ph ng pháp ELISA “Sandwich”
ể ắ ẽ ượ ử ụ ể ơ ấ ể ắ ế ộ ớ M t kháng th g n s đ c s d ng đ g n v i kháng th s c p, ti p theo kháng
ể ứ ấ ắ ấ ơ ượ ể ắ ặ ớ ổ th th c p có g n c ch t enzyme đ ể ứ ấ c b sung đ b t c p v i kháng th th c p
ả ứ ế ệ ạ ượ ự ắ ặ trong ph n ng. Tín hi u khu ch đ i thu đ c khi có s b t c p kháng nguyên –
ệ ể ặ kháng th đ c hi u.
ễ ạ ậ ị 2.2.1.2. Kĩ thu t mi n d ch phóng x (RIA)
ươ ị ượ ự ễ ạ ị ủ c a ph ng pháp đ nh l ng mi n d ch phóng x là d a trên ắ Nguyên t c chung
ữ ạ ự ầ ị ượ ự ắ s g n c nh tranh gi a hormon t nhiên (hormon trong máu c n đ nh l ng) và
ứ ộ ắ ủ ạ ớ ệ ạ ấ ể ặ hormon đánh d u phóng x v i kháng th đ c hi u. M c đ g n c a hai lo i hormon
ể ỷ ệ ớ ứ ợ ầ ủ ớ ồ ậ ộ này v i kháng th t l thu n v i n ng đ ban đ u c a chúng: Đo ph c h p hormon
29
ạ ồ ự ể ằ ế ạ ồ ị ườ ắ g n đ ng v phóng x kháng th b ng máy đ m phóng x r i d a vào đ ng cong
ể ẩ ầ ị ị ượ chu n ta có th tính đ ượ ượ c l ng hormon có trong d ch c n đ nh l ng.
ấ ầ ả ứ ự ủ ễ ệ ặ ị ị D a trên tính đ c hi u cao c a ph n ng mi n d ch trong đó ch t c n đ nh l ượ ng
ấ ề ư ễ ớ ồ ị ượ đóng vai trò là KN cùng v i KN đ ng nh t v mi n d ch nh ng đ ằ ấ c đánh d u b ng
ế ớ ể ạ ứ ệ ạ ợ ị ặ ồ đ ng v phóng x (KN*) liên k t v i KT đ c hi u đ t o thành các ph c h p (KN*
ộ ượ ế ư ừ ộ ượ ạ KT) + (KNKT). N u có m t l ng d th a KN* và m t l ế ng h n ch KT, ta có:
KN* + KT + KN (KN*KT) + (KNKT) + KN* + KN
ự ạ ế ấ Có s c nh tranh KT. N u KN cao thì KN*KT th p.
ấ ế ủ ủ ế ợ ứ ể ầ ỏ KN*KT: ph n k t h p; có th tách ra kh i KN* vì tính ch t k t t a c a ph c KN
KT.
30
ạ ủ ứ ạ ớ ồ ầ ộ ị ị Ho t tính phóng x c a ph c B (KN*KT) t ỷ ệ l ngh ch v i n ng đ KN c n đ nh
ồ ị ự ẽ ẩ ị ượ ồ ị ượ ượ l ng. Xây d ng đ th chu n ta s xác đ nh đ ộ ấ ầ c n ng đ ch t c n đ nh l ằ ng b ng
ố ế ủ ủ ệ ẩ ẫ ẩ ớ ượ cách so sánh s đ m xung c a b nh ph m v i xung c a các m u chu n đ c làm
song song.
ể ả ả ộ ấ ả ử ệ ẫ ẩ ẫ ồ Đ đ m b o đ chính xác, t t c các m u th , bao g m các m u b nh ph m cũng
ả ượ ử ư ư ề ệ ẫ ẩ nh các m u chu n, đ u ph i đ c x lý và xét nghi m hoàn toàn nh nhau và trong
ề ờ ư ệ ề ủ ố ượ ệ ộ cùng các đi u ki n nh nhau v th i gian , kh i l ng, nhi ố ờ t đ , pH, th i gian và t c
ộ đ quay ly tâm...
ệ ự ệ ượ ệ ủ 2.2.2. Phát hi n s hi n di n c a gen thông qua mARN đ c phiên mã
ượ ử ụ ệ ề ả Cách này đ c s d ng khi cách phát hi n protein không kh thi (nhi u protein không
ể ẵ có s n các kháng th ).
ề ươ Có nhi u ph ư ng pháp nh :
31
+ RTPCR
+ Northern blot
+ ARN dot blot (lai phân t ử ố ượ đ i t ng là ARN)
+ RNase protection assay
ầ ả ậ ố ổ ươ Đ u tiên cũng ph i thu nh n ARN t ng s . Trong các ph ng pháp trên thì RTPCR là
ể ạ ấ ẫ nhanh và nh y nh t, Vì acid ribonucleic (ARN) không th đóng vai trò làm khuôn m u
ế ợ ự ế ầ ướ ượ tr c ti p cho PCR nên c n k t h p b c phiên mã ng c (reverse transcription – RT)
ể ượ ổ ợ ể ở ớ v i PCR đ ARN đ c chuy n thành ADN b tr (cADN) và tr ẫ thành khuôn m u
ỉ ầ ượ ợ ỏ ượ ạ thích h p cho PCR. Ch c n l ng nh ARN cho quá trình sao mã ng c t o thành
ằ ượ cADN b ng enzyme sao mã ng c (reverse transcriptase). Sau đó, các cADN mang đi
ớ ặ ể ể ế ạ ồ ệ PCR đ khu ch đ i gen chuy n v i c p m i chuyên bi t.
ươ ạ ỏ ượ ư ấ ớ ẫ Các ph ng pháp còn l i cũng chính xác nh ng đòi h i l ng m u ARN r t l n.
ử ở ồ ả ợ ạ ủ ệ ệ 3. Nuôi và tr ng th quy mô thí nghi m và theo dõi hi u qu l i và h i c a
gen chuy nể
Ứ ủ ụ ể ậ IV. ng d ng c a kĩ thu t chuy n gen
ế ổ ộ ậ 1. Đ ng v t bi n đ i gen
ề ứ ư ụ ấ Có r t nhi u ng d ng nh sau:
a. Y h cọ
Mô hình gen gây b nhệ
ậ ị ệ ạ ở ườ ể ệ ộ + T o mô hình đ ng v t b b nh ể ơ ế i đ tìm hi u c ch gây b nh ng
ậ ể ể ị ệ ệ ạ ớ + T o mô hình đông v t đ ki m tra các li u pháp tr b nh m i
ứ ứ ế ể ạ ậ ổ ộ T o đ ng v t bi n đ i gen đ nghiên c u ch c năng gen
ể ấ ộ Ki m tra ch t đ c
32
ơ ể ộ ạ ả ẩ ậ T o s n ph m trong c th đ ng v t
ấ C y ghép
b. Chăn nuôi
ưở ở ậ ẩ ự Thúc đ y s tăng tr ng v t nuôi
ế ớ ườ ườ ở ệ ợ Trên th gi i, ng ể i ta đã chuy n gen sinh tr ng bò vào l n, giúp cho hi u qu ả
ụ ứ ượ ỡ ườ ư ở tiêu th th c ăn cao hom, hàm l ơ ợ ng m ít h n l n bình th ng. (Nh ng ợ con l n
ạ ư ệ ề ạ ấ ấ ở ị trên l ể i xu t hi n các v n đ nh tím n to, hay b loét d dày, viêm da). Đã chuy n
ượ ữ ở ườ ế ữ đ ị c gen xác đ nh mùi s a ng i vào t ữ bào phôi bò cái làm cho s a bò có mùi s a
ề ể ẻ ờ ổ ngu i và d tiêu hoá dùng đ nuôi tr trong vòng 6 tháng tu i.
ấ ượ ấ ề ộ ữ ạ ị Tăng năng su t và ch t l ng v m t tính tr ng nào đó (th t, lông, s a…)
ệ Kháng b nh trong thú y
c. Môi tr ngườ
ễ ả Gi m ô nhi m phosphor – heo enviropig
ủ ả ồ d. Nuôi tr ng th y s n
ự ưở Kích thích s tăng tr ng
ể ả ị ượ ổ ợ ưở ố Tăng kh năng ch ng ch u: Đã chuy n đ c gen t ng h p hoocmôn sinh tr ng và
ị ạ ừ ự ắ ồ gen ch u l nh t cá B c C c vào cá h i và cá chép.
ự ậ 2. Th c v t
ệ ử ụ ự ậ ể ằ ậ ấ Nhìn chung vi c s d ng kĩ thu t chuy n gen trên th c v t nh m tăng năng su t cây
ả ả ẩ ồ ợ ệ ệ ậ ầ ả tr ng, gi m giá thành s n ph m, tăng l i nhu n nông nghi p và góp ph n b o v môi
ườ ấ ượ ứ ệ ệ ậ tr ng. Hi n nay, các nghiên c u đang t p trung vào vi c tăng ch t l ng dinh d ưỡ ng
ế ế ạ ả ế ụ ữ ự ẩ ố ị và kh năng ch bi n t ệ i nh ng qu c gia có hàng tri u dân b thi u h t th c ph m.
ướ ụ ứ ể ậ ữ * Nh ng h ự ậ ng chính trong ng d ng kĩ thu t chuy n gen vào th c v t
ể chuy n gen kháng sâu
33
ể ố chuy n gen kháng thu c di ệ ỏ t c
ể ệ ạ chuy n gen t o cây kháng virus gây b nh
ể ạ ấ ộ ậ ả chuy n gen t o cây s n xu t protein đ ng v t
ể ổ ượ ấ ượ ưỡ chuy n gen thay đ i hàm l ng và ch t l ấ ng ch t dinh d ng
ể ề ạ ố ắ chuy n gen t o gi ng hoa có nhi u màu s c
ề ệ ệ ể ượ Ở ệ Vi t Nam trong đi u ki n phòng thí nghi m đã chuy n đ ầ c gen kháng r y
ộ ố ạ ấ ệ ạ ổ ợ nâu, kháng sâu kháng b nh b c lá, kháng m t s lo i n m, gen t ng h p vitamin A,
ộ ố ư ớ ồ ả ắ kháng virut, gen chín s m… vào m t s cây tr ng nh lúa, ngô, khoai tây, c i b p,
ố ủ thu c lá, đu đ .
3. Vi sinh v tậ
ạ ậ ớ ủ a. T o ra các ch ng vi sinh v t m i
ượ ứ ể ạ ụ ủ ậ ả ớ ậ Kĩ thu t gen đ ả c ng d ng đ t o ra các ch ng vi sinh v t m i có kh năng s n
ạ ả ề ấ ẩ ọ xu t nhi u lo i s n ph m sinh h c (axit ami, prôtêin, vitamin, enziin, hoocmôn, kháng
ớ ố ượ ớ sinh…) v i s l ẻ ng l n và giá thành r .
ậ ế ổ ử ạ ườ b. T o vi sinh v t bi n đ i gen trong x lý môi tr ng
ọ ể ử ụ ủ ế ả ả ậ ố ự S d ng vi sinh v t bi n đ i gen có kh năng phân h y sinh h c đ làm gi m s ô
ễ ườ ườ ả ưở nhi m môi tr ng. chúng ta đã thành công trong tăng c ng kh năng sinh tr ng, phát
ạ ộ ể ử ủ ể ậ ầ ườ tri n và ho t đ ng c a vi sinh v t ban đ u đ x lý môi tr ng thêm vào đó là kh ả
ặ ạ ậ ả ả ậ ớ ủ năng làm gi m các vi sinh v t ho c t o ra các vi sinh v t m i có kh năng phân h y
ấ ộ ễ ấ ả ẩ ặ ọ ố các ch t đ c hóa h c ho c các ch t làm ô nhi m khác thành các s n ph m cu i cùng
ộ ạ ệ ẩ ả ừ ộ ơ ẻ ổ ợ không đ c h i. Hi n nay đã có s n ph m t ủ m t ch ng đ n l hay t ề ồ h p g m nhi u
ủ ễ ấ ả ủ ch ng có kh năng phân h y các ch t gây ô nhi m.
ế ế ủ ổ ợ AnAADN Chakrabarty đã thi t k ch ng Pseudomonas sp. t ng h p đ ượ ậ c t p
ủ ấ ả ợ ừ ộ ủ ợ h p kh năng phân h y các h p ch t hydrocacbon t ặ m t vài ch ng Pseudomonas, đ c
34
ệ ỏ ừ ề ủ ệ ả ầ ườ bi t là kh năng phân h y d u m , t đi u này, hi n nay ng ạ ế i ta đang ti n hành t o
ấ ữ ơ ề ủ ủ ữ ư ậ ả ọ ố ra ch ng vi sinh v t có kh năng phân h y các h c ch t h u c b n v ng nh thu c
ừ ấ ằ ợ tr sâu b ng clo, PCB’s, lignin và các h p ch t khác.
ậ ể ử ụ ễ ạ ượ ứ Các quá trình s d ng vi sinh v t đ làm s ch ô nhi m đã đ c ch ng minh qua
ầ ở ử ụ ệ ể ẩ th nghi m sau v tràn d u bãi bi n Exxon Valdez vào năm 1989. Các vi khu n có
ỏ ộ ỡ ấ ể ầ ự ằ ố ư ệ th phá v c u trúc d u m m t cách t nhiên, và b ng cách t ề i u các đi u ki n sinh
ưở ổ ầ ủ ế ể ể ả ậ tr ẩ ng, phát tri n c a vi sinh v t có th giúp bi n đ i d u khí thành các s n ph m
ộ ố ủ ể ậ ả ạ ộ ấ ộ không đ c h i. Thêm vào đó, m t s ch ng vi sinh v t có th làm gi m các ch t đ c
ư ủ ạ ặ ả ồ ạ h i khác, bao g m c các kim lo i n ng nh th y ngân.
ậ ế ổ ả ượ c. Vi sinh v t bi n đ i gen có kh năng làm tái sinh năng l ng
ể ấ ẩ ấ Vi khu n trong các bãi chôn l p rác có th cung c p khí metan, khí này có th đ ể ượ c
ệ ậ ể thu th p và chuy n thành đi n năng.
ượ ệ ế ệ ạ ộ ồ Etanol cũng đ c xem là m t ngu n nhiên li u thay th cho các nhiên li u hóa th ch.
ấ ế ả ự ế ấ ừ ự ậ ử ụ ầ Cách tr c ti p nh t đ s n xu t etanol t ứ th c v t là s d ng các thành ph n có ch a
ệ ử ụ ư ự ứ ề ặ ậ ộ ỳ ề ạ nhi u tinh b t nh ngô, lúa m ho c g o. Vi c s d ng th c v t có ch a nhi u
ể ạ ư ế ể ầ ỡ ể ạ cellulose đ t o, nh ng h u h t cá quá trình lên men không th phá v cellulose đ t o
ẩ ạ ả ẩ ể ượ ế ế ể ự ệ các s n ph m lên men. Tuy nhiên, vi khu n l i có th đ c thi ề t k đ th c hi n đi u
ạ ườ ế ổ ơ ượ đó, chúng bi n đ i cellulose thành các lo i đ ể ng đ n có th lên men đ c. Chính vì
ự ậ ử ụ ư ỏ ế ể ạ ậ ố th , vi sinh v t có th cho phép s d ng sinh kh i nh c và các lo i th c v t khác đ ể
ấ ả ưở ự ế ấ ẩ ồ ả s n xu t etanol mà không làm nh h ng đ n ngu n cung c p th c ph m.
35
Ể Ử Ụ C. VECTOR VÀ ENZYME S D NG TRONG CHUY N GEN
ể I. Vector chuy n gen
1. Khái ni mệ
ứ ệ ộ ị ở ề ậ ả ặ Vi c nghiên c u m t gen xác đ nh sinh v t eukaryote g p ph i nhi u khó khăn,
ỉ ự ỏ ằ ọ ướ ớ vì gen đó ch là trình t nh n m l ộ t trong toàn b gen có kích th c l n.
ể ế ế ế ậ ỉ ể Đ chuy n gen t ừ ế t bào A (t bào cho) sang t bào B (t bào nh n) ch có th ể
ộ ế ố ự ệ ể ầ ằ ượ th c hi n b ng cách đính các gen c n chuy n vào m t y u t trung gian đ ọ c g i là
ự ế ạ ấ ằ ứ ể ạ ộ ẫ đo n d n. Th c t cho th y r ng m t đo n ADN ch a gen không th làm gì trong t ế
ộ ộ ủ ủ ậ ả ườ ủ ế bào ch . Vì nó không ph i là m t b ph n c a genome bình th ng c a t bào, cho
ượ ế ượ ể ẽ nên nó s không đ ả c tái b n khi t bào phân chia, không đ ệ c bi u hi n và có kh ả
ỷ ị năng b phân hu khá nhanh.
ữ ạ ẫ ả ướ ẫ ậ ạ Nh ng đo n d n này có kh năng h ầ ể ng d n, v n chuy n các đo n gen c n
ế ể ẫ ậ ạ ứ nghiên c u vào t bào nh n. Đo n d n này chính là các vector chuy n gen.
ử ặ ạ ắ ạ ẳ ỏ => Vector là phân t ADN nh (ng n) d ng th ng ho c d ng vòng, trong đó, ng ườ i
ứ ẽ ầ ả ộ ta s cài m t m nh ADN (gen quý) c n nghiên c u.
ầ ủ ữ 2. Nh ng yêu c u c a vector
ậ ả ộ ế ố ớ ớ ạ Vector ph i có m t vùng nh n bi ộ t đ i v i m t enzyme gi ạ i h n lo i II. Vùng
ứ ẽ ầ ắ ộ ượ ử ở này s là vùng cài l p m t ADN (gen c n nghiên c u) đã đ c x lý b i cùng enzyme
ớ ạ ữ ậ ơ ế ườ ượ ữ ặ ỉ gi i h n. H n n a, các vùng nh n bi t này th ng đ c đ t vào gi a các gen ch th ị
ự ể ọ ọ ạ ộ ể ệ ủ ệ (gen báo cáo, marker ch n l c…) đ ti n theo dõi s bi u hi n ho t đ ng c a gen tái
ổ ợ t h p.
ả ồ ạ ế ế ệ ủ ề ộ Vector ph i t n t i trong t bào ch qua nhi u th h và ít gây xáo tr n trong t ế
bào ch .ủ
36
ướ ỏ ố ể ậ ượ ố Vector có kích th c càng nh càng t t đ thu nh n l ng ADN t i đa và d ễ
ế ế ạ bi n n p vào t ủ bào ch .
ả ả ự ự ế ủ ụ Vector ph i có kh năng t sao chép tích c c trong t ộ bào ch , không ph thu c
ủ ế ự ộ vào s sao chép b gen c a t ủ bào ch .
ề ữ ả ự ủ ề ả ộ ổ ợ Đ m b o s di truy n b n v ng c a m t ADN tái t h p.
ố ế ủ ể ế ả Chúng không có kh năng s ng sót ngoài t bào ch và không chuy n vào t bào
ủ ằ ườ ợ ch khác b ng con đ ế ng ti p h p.
ự ề ậ ợ ệ ạ ủ ệ Có trình t ề đi u hoà t o đi u ki n thu n l i cho vi c phiên mã c a gen đ ượ c
ư đ a vào.
ạ ớ ế ấ ả ả ố ế Kh năng bi n n p l n nghĩa là có kh năng th m t t vào t ủ ủ bào ch c a vector
ổ ợ mang gen tái t h p.
ệ ủ ự ể ễ ổ ợ ầ ầ ế D theo dõi s bi u hi n c a gen tái t h p, yêu c u này là c n thi ệ t cho vi c
ệ ầ phát hi n dòng c n tìm.
ế ễ ố ượ ớ ủ ắ ả ớ Tinh ch d dàng v i kh i l ng l n b n sao c a gen g n vào vector.
ệ ợ ệ ể ệ ử ụ => Ngày nay các vector chuy n gen ngày càng hoàn thi n và ti n l i cho vi c s d ng.
ự ự ự ể ầ ọ ố Không có vector nào toàn năng cho s chuy n gen mà c n có s l a ch n tùy đ i
ướ ể ầ ạ ượ ấ ạ ề ượ t ng và tùy kích th c đo n gen c n chuy n. Chúng đ ớ c c u t o v i nhi u tính
ấ ệ ể ượ ự ố ch t chuyên bi t đ mang đ c các trình t ư nucleotide nh mong mu n.
ạ 3. Các lo i vector
ự ố ồ ườ * D a vào ngu n g c ng i ta phân ra
ữ Các vector là nh ng plasmid.
Các vector là phage.
ư ạ Các vector lai nhân t o nh : cosmid, bluescript.
37
ể a) Vector chuy n gen là plasmid
ữ ắ ạ ẫ ỏ ợ ằ Các plasmid là nh ng m u ADN nh , ng n, d ng vòng (khép kín), s i đôi n m
ể ượ ễ ắ ấ ế ộ ố ẩ ngoài nhi m s c th , đ ầ c tìm th y đ u tiên trong t bào m t s vi khu n. Chúng sao
ượ ờ ộ ố ặ ế ụ ẩ chép đ c là nh m t s enzyme có m t trong t ộ bào vi khu n và không ph thu c
ự ễ ể ẩ ậ ắ ỉ vào s sao chép nhi m s c th vi khu n. Trong sinh v t eukaryote, plasmid ch có trong
ế t ấ bào n m men.
ứ ề ề ộ ỗ ỗ ự M i plasmid đ u có m t chu i mã di truy n (sequence) mang ch c năng t ả tái b n
ở ầ ể ự ế ị ậ ADN. N u không có v trí kh i đ u phiên mã (ori) này, ADN không th t tái l p trong
ấ ự ủ ể ể ả ộ ế t ớ bào ch . V i tính ch t t tái b n, plasmid là m t vector chuy n gen đ nhân dòng
ầ ế ADN c n thi t.
ướ ọ ọ ỏ ườ ặ Do kích th ỉ ứ ấ c nh nên plasmid ch ch a r t ít gen ch n l c, th ọ ng đ c tính ch n
ệ ườ ử ụ ọ l c là kháng kháng sinh. Trong phòng thí nghi m, ng i ta s d ng các plasmid nhân
ượ ạ ừ ự ộ ố ỗ ạ t o mà đ c t o ra t các plasmid t nhiên và cài thêm m t s chu i ADN.
ế ệ ứ ấ * Các plasmid th h th nh t
ế ệ ầ ấ ự Th h đ u tiên đó là các plasmid tìm th y trong t nhiên pSC101 (StalayCohen),
ColE1
ể b) Các vector chuy n gen là phage
ự ễ ể ẩ ẩ ả Phage (th c khu n th ) là virus xâm nhi m vi khu n làm phân gi ẩ i vi khu n.
ệ ử ụ ề ư ể ể ơ ớ Vi c s d ng phage làm vector chuy n gen có nhi u u đi m h n so v i vector là
plasmid
ễ ậ ẩ D xâm nh p vào vi khu n.
ả ế Kh năng nhân lên nhanh trong t ủ bào ch .
ế ả ậ ạ ạ ớ ơ Kh năng ti p nh n đo n ADN l l n h n plasmid.
ệ ử ụ ấ ợ ề ư Tuy nhiên, vi c s d ng phage có nhi u b t l i nh
38
ạ ứ ạ Thao tác ghép ADN l ph c t p,
ổ ợ ẩ ạ ư ạ ổ ợ ADN tái t h p không t o thành khu n l c nh ADN tái t h p là plasmid, mà
ả ủ ầ ệ ẩ ặ ấ thành đĩa phân gi ạ i xu t hi n trên m t th ch ph đ y vi khu n
ườ ủ ề ạ ượ ề ặ ằ Ng i ta tìm cách tăng chi u dài c a đo n đ ả c cài b ng cách gi m đi nhi u ho c ít
ữ ề ầ ầ ế ủ chi u dài nh ng ph n không c n thi t c a genom phage . λ
ữ ầ ầ ế ự Ph n trung tâm gi a gen J và N không c n thi ả ủ t cho s sinh s n c a phage có th ể
ượ ạ ề ầ ả ầ đ ằ c thay b ng ADN l . Các đ u m nh 5’ và 3’ đ u là đ u dính.
ộ ố ể c) M t s vector chuy n gen khác
* Các cosmid
ấ ạ ạ ừ ộ ữ ặ Đ c tính c u t o: Các cosmid là nh ng vector lai nhân t o t ớ m t plasmid v i
λ ự ủ ượ ử ụ ừ ự các trình t cos c a phage (đ c s d ng t năm 1978). Các trình t ề cos này đi u
ể ự ổ ợ khi n s đóng gói ADN tái t ầ ủ h p vào đ u c a phage.
ữ ớ ạ ạ ườ Cosmid là nh ng plasmid có các vùng gi i h n mà t i đây, ng ắ ể i ta có th cài l p
≈ ạ ố ộ ướ ADN l ị và m t gen ch ng ch u ampicilline. Kích th c cosmid 5kb do đó, nó có th ể
ậ ượ ể ớ ạ nh n đ c đo n cài 35÷45kb và có th t i 47kb.
39
ể ờ ổ ợ ượ ễ Vào th i đi m gây nhi m E. Coli, ADN tái t h p đ ẩ c phóng vào vi khu n.
ẽ ắ ặ ạ ẩ ầ ổ ợ ạ Trong vi khu n các đ u dính s b t c p t o ra cosmid tái t h p khép kín d ng vòng
ư ộ ả và tái b n nh m t plasmid.
Ư ể ủ ứ ụ * u đi m và ng d ng c a cosmid
ư ễ ả ế ẩ ớ Cũng nh phage, cosmid cho kh năng xâm nhi m t ậ bào vi khu n l n, nh n
ạ ướ ớ đo n cài có kích th c l n.
ế ự ư ả ườ ậ Trong t ủ bào ch , nó t nhân b n nh plasmid. Cho nên ng i ta nh n đ ượ c
ẩ ạ ữ ứ ả ả ậ ợ ặ nh ng khu n l c, ch không ph i đĩa phân gi ạ i trên m t th ch, thu n l ệ i cho vi c
quan sát.
ệ ợ ớ ườ ể ừ ữ ữ => V i nh ng ti n l i trên, ng i ta dùng cosmid đ tách dòng t ớ nh ng gen l n
ể ạ ữ ẩ ả ộ đ t o ngân hàng genom (b gen). Nh ng vi khu n mang vector này có kh năng
ớ ố ị ườ ch ng ch u v i môi tr ng có ampiciline.
40
ạ ủ ể ễ ấ ắ * Các nhi m s c th nhân t o c a n m men YAC (Yeart Artificial Chromosomes) –
ế ọ thi u hình minh h a
ầ ạ ữ ớ ự ớ Do nhu c u t o dòng v i nh ng trình t ứ ADN ngày càng l n, các nhà nghiên c u
ữ ể ớ ườ ạ tìm tòi phát tri n nh ng vector ngày càng m i. Ngày nay ng i ta đã t o ra YAC cho
ữ ạ ạ ớ ằ phép t o dòng v i nh ng đo n ADN dài 150÷1.000kb, trung bình là 350kb. B ng
ấ ở ấ ứ ể ễ ắ nghiên c u cho th y ố n m men (Saccharomyces Cerevisiae), nhi m s c th mu n
ố ầ ự nhân đôi và phân ly t t c n ba trình t :
ự ầ ố ủ đ u cu i c a NST 2 TEL (telomere): Trình t
ộ ự ả ự ủ ả Trình t trung tâm c a NST, đ m b o s chia CEN (centrmere tâm đ ng):
ự ủ ế ề đôi và đi v 2 c c c a t bào
ự ự ủ ươ sao chép t ch t ng t ự ARS (autonomously replicating sequence): Trình t
ở ư nh ori plasmid
ự ườ ấ ạ ủ ạ ự D a vào đó ng i ta đã c u t o NST nhân t o có đ ba trình t ớ ấ nói trên v i c u
ữ ồ ườ ể ạ ặ ộ ạ t o g m 2 cánh tay, gi a 2 cánh tay ng ầ i ta có th cài đ t m t đo n ADN c n
ể ướ ế ả ỗ ồ ớ chuy n v i kích th c kho ng 150 đ n 1.000kb. Trên m i cánh tay g m các gen đánh
ể ọ ọ ề ế ỗ ậ ứ ấ ấ d u di truy n đ ch n l c các t bào n m men có ch a YAC và các chu i t n cùng có
ố ủ ứ ả ạ ộ ộ ch c năng telomer đo n cu i c a NST. M t trong hai cánh tay mang m t m nh ADN
ư ộ ạ ộ ệ ả ộ ồ ạ ộ ho t đ ng nh m t tâm đ ng và m t ngu n tái b n ori. Vi c cài ADN l vào gen mã
ẩ ạ ế ấ ứ ể ế ế ẽ ắ ậ ổ hóa ch t c ch tRNA v n chuy n tyrosine s làm bi n đ i màu s c khu n l c t bào
ẩ ạ ừ ắ ặ ủ ỏ ạ ổ ố g c có mang gen h phách (khu n l c t tr ng sang đ ) khi có m t c a ADN l . Đây
ề ự ệ ệ ủ ệ ấ ổ ợ ế là d u hi u v s hi n di n c a YAC tái t h p trong t ấ bào n m men.
ễ ể ượ ư ế ủ ấ ượ ắ Các nhi m s c th này đ c đ a vào t bào ch (n m men), nó đ c nhân lên
ư ở ế ấ ượ ữ ố nh NST khác trong t bào n m men và ta có đ c nh ng gen mong mu n.
ạ ủ ộ ể ễ ậ ắ * Các nhi m s c th nhân t o c a đ ng v t có vú
41
ươ ự ư ồ ấ ạ C u t o: T ng t nh YAC và bao g m
ự Trình t TEL
ự Trình t CEN
ự Trình t ARS
ư ự ố ừ ồ ườ ớ Nh ng khác v i YAC là trình t TEL và CEN có ngu n g c t ng ề i. Đi u này
ế ộ cho phép MAC (Mammalian Artificiel Chromosomes) vào t ậ bào đ ng v t có vú và gi ữ
ượ ổ ị ế đ c n đ nh trong t bào.
ử ụ ủ ế ụ ứ ế ậ ử ụ Ch y u s d ng nghiên c u cho các t bào b c cao mà M c đích s d ng:
ử ụ ượ ớ ế ư ấ ế ủ chúng ta không s d ng đ c v i t bào n m men. Khi đ a NST vào t bào ch , nó
ồ ạ ượ ế cũng t n t i đ c và nhân lên trong t ủ bào ch .
ớ ạ II. Enzyme gi i h n (RE)
ệ ặ 1. Khái ni m và đ c tính
a) khái ni m ệ
ớ ạ ộ ị Enzyme gi i h n (restriction enzyme, RE) là m t enzyme endonuclease có v trí
ế ữ ữ ể ệ ạ ắ ắ ặ ậ nh n bi t đi m c t ADN đ c hi u thành nh ng đo n ng n. Nh ng enzyme này phân
ủ ộ ế ạ ổ ỷ ạ ế hu liên k t phosphodiester c a b khung ADN m ch đôi mà không gây t n h i đ n
ể ượ ế ắ ọ ị ở ạ ằ ố bases. Các liên k t hóa h c mà b enzyme này c t có th đ c n i tr l ạ i b ng lo i
ế ạ ớ ạ ả ứ ủ ả ẩ enzyme khác là các ligases, vì th các phân đo n gi ắ i h n (s n ph m c a ph n ng c t
ị ắ ừ ể ượ ễ ể ặ ắ RE) mà b c t t các nhi m s c th ho c gen khác nhau có th đ c ghép cùng nhau
ự ầ ề ậ ổ ớ ọ ỹ ử ế n u có trình t đ u dính b sung v i nhau. Nhi u k thu t sinh h c phân t và k ỹ
ề ự ề ậ ớ ạ thu t di truy n đ u d a vào các enzyme gi i h n.
ụ ắ ở ữ ặ ặ Ví d : Hae III c t ADN gi a 4 c p nucleotid: GG|CC ho c C|C GG
ữ ặ ặ ắ ằ Sma I c t ADN b ng gi a 6 c p nucleotid: CCC|CCC ho c GGG|GGG
ữ ệ ắ ặ EcoR I c t ADN l ch gi a 6 c p nucleotid: G|AATTC CTTAA|G
42
ớ ạ ạ 2. Phân lo i enzyme gi i h n
ự ậ ả ạ ế ắ ộ ự ị 3 lo i (d a vào kh năng nh n bi t và c t m t trình t xác đ nh trên phân t ử
ADN)
ớ ạ ạ ả ủ ế + Enzyme gi ứ i h n lo i II, ch c năng phân gi ứ i c a nó không liên quan đ n ch c
ả ắ ằ ị năng methyl hóa hay phân gi i nhóm methyl, và v trí c t cũng n m ngay bên trong hay
ậ ế ượ ử ụ ị ế ạ k c nh v trí nh n bi t. Nên hay đ c s d ng.
ể ị ắ * V trí đi m c t
ớ ạ ỉ ắ ự ặ ố ứ ề ọ Enzyme gi i h n ch c t các trình t l p đ i x ng khi đ c theo chi u 5´3´ trên
ạ ọ ự ế ả m ch ADN (palindrome) dài kho ng 46 nucleotide g i là trình t ậ nh n bi ị t. V trí
ắ ủ ể ớ ạ ể ằ ặ ự ế đi m c t c a enzyme gi i h n có th n m trong ho c ngoài trình t ậ nh n bi t này.
ộ ự Các RE khác nhau có cùng m t trình t ậ nh n bi ế ượ t đ ọ c g i là ố ớ isoschisomers. Đ i v i
ộ ố ự ế ệ ệ ố ộ ố m t s RE, trình t ậ nh n bi t không có tính chuyên bi t tuy t đ i, m t s nucleotid
ự ể ượ ế ở ủ c a trình t có th đ c thay th b i nucleotid khác.
43
D. BÀI BÁO
Ắ
Ể
CHUY N GEN TÍCH LŨY S T TRONG CÂY Đ U T
Ậ ƯƠ NG
Ờ
Ứ
Ẩ
SANG CÂY D A NH VI KHU N AGROBACTERIUM
44
ể 1. Chuy n gen ferritin vào Agrobacterium
ự ễ ả ế ự ậ ằ ể kh năng xâm nhi m t ộ bào th c v t b ng cách chuy n m t Nguyên t c:ắ d a trên
ủ ẩ ạ ế ậ đo n ADN c a t l p, s ử ủ Agrobacterium (1 chi c a vi khu n Gram âm do H.J. Conn thi
ể ể ố ở ự ậ ế ự ậ ụ d ng đ chuy n gene ngang gây ra các kh i u th c v t) vào t bào th c v t.
45
ự ể ằ ạ ươ ể ế ậ Hình 9.1: T o th c v t chuy n gen b ng ph ng pháp chuy n gen gián ti p nh ờ
ượ ứ c nghiên c u Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) là loài đ
ổ ế ấ ph bi n nh t trong chi này.
ơ ồ ấ ế Hình 9.2: S đ c u trúc t bào vi khu n ẩ Agrobacterium tumefaciens.
ư ể ể ộ Ð khai thác và s d ng ử ụ A. tumefaciens nh là m t vector chuy n gene các nhà
ạ ỏ ủ ọ ố khoa h c đã lo i b các gene gây kh i u và gene mã hoá opine c a T ADN và thay th ế
ọ ọ ủ ả ờ ờ ẫ vào đó là các marker ch n l c, trong khi v n duy trì các vùng b ph i và b trái c a T
ể ượ ờ ủ ữ ADN và các gen vir. Gene chuy n đ c xen vào gi a các vùng b c a TADN. Nó s ẽ
ượ ế ấ ớ ể ế ễ ắ ở ợ ự ậ đ ể c chuy n vào t bào và tr nên h p nh t v i nhi m s c th t bào th c v t.
ộ ế ứ ạ ị ủ ạ ả Hình thành m t v t đ t t i v trí vùng biên ph i RB c a đo n T ADN.
ượ ờ ự ỏ ộ ạ Đo n gen e này sau đó đ ạ c tách ra kh i plasmid nh s hình thành m t đo n
ạ ứ ứ ườ ố ớ ố ị ứ đ t th hai. Đo n đ t này th ng không c đ nh đ i v i các plasmid khác nhau.
ạ ố ượ ấ ầ Trong khi các axit nucleic tr ng t o ra trên plasmid đ c l p đ y theo nguyên
ủ ạ ổ ượ ượ ắ t c b sung c a các axit nucleic thì đo n T ADN đ c tách ra đ c bám b ởi m tộ
ứ ợ ợ ơ ạ ờ ớ protein bám s i đ n (SSBP). Nh ph c h p v i SSBP này mà đo n gen T ADN đ ượ c
ể ễ ắ chuy n vào nhi m s c th ể c a ủ cây ch .ủ
ấ ẩ ạ 2. Nuôi c y khu n l c Agrobacterium
ẩ ạ ộ ơ ượ Khu n l c Agrobacterium đ n đ c đ ỏ c nuôi qua đêm trong YENB l ng
ế ấ ướ ưỡ ừ ổ (0,75% chi t xu t men bia, 0,8% n c dùng dinh d ng) v a b sung 50 mg/l
ở ắ kanamycin 27 °C và l c 150 vòng / phút.
600nm x p x 0,1.
ụ ế ế ấ ỉ ấ Sau đó, ti n hành nuôi c y liên t c cho đ n khi OD
ế ụ ấ ờ ệ ươ ự ạ ượ ế Ti p t c nuôi c y 45 gi ề trong đi u ki n t ng t cho đ n khi đ t đ c 0,6
1,6,0 OD600nm.
46
ả ấ ẩ ượ ớ ồ ử ụ ể ặ ộ S n ph m nuôi c y đ c pha loãng t i n ng đ 0.1 ho c 0.2 s d ng đ lây
ễ ầ nhi m các m m lá.
ễ ầ ứ 3. Gây nhi m Agrobacterium vào m m lá d a
ứ ầ ấ ẫ Cách l y m u m m lá d a:
ắ ấ ầ ố + C t l y ph n g c lá (leaf base) 3 4 cm
ắ ầ ố ỏ + C t nh ph n g c lá 0.5 1cm.
ư ả ẩ ạ ứ ị ượ ể Đ a c dung d ch ch a khu n l c Agrobacterium đã đ ồ c chuy n gen n ng
ứ ầ ồ ườ ổ ủ ộ đ 0.10.2 và m m lá c a ch i lá d a vào môi tr ng MS có b sung ACS 100 μM đ ể
gây nhi m.ễ
47
ễ ẫ ượ ấ ỹ ờ ấ ượ Các m u sau khi gây nhi m đ c th m khô k trên các t gi y đã đ c ti ệ t
ượ ế ồ ườ ượ ủ trùng, và đ c tr ng ti p trong 3 ngày trên môi tr ng Pin1 đ ố ằ c c ng c b ng gerite
0,2%.
ầ ồ ượ ể ườ ặ ớ Sau khi đ ng canh tác m m lá đ c chuy n sang môi tr ng đ c (v i gerite
ổ 0,2%) Pin1 b sung cefotaxime (400 mg/l) và duy trì trong 3 ngày.
ế ụ ễ ủ ế ể ầ ạ ầ ấ Ti p t c nuôi c y cho đ n khi r c a m m phát tri n đ t 5 cm (sau 8 tu n).
ứ ể ượ ể ấ ố Cây chuy n gen đã c ng cáp đ ứ c chuy n vào nhà kính trong c c gi y ch a
ấ ượ ố ệ ọ ấ ồ đ t tr ng tr t có ch t l ng t t đã ti t trùng.
ế ừ ượ ể ễ 4. Tách chi t ADN t cây đã đ c gây nhi m Agrobacterium chuy n gen
ử ằ ẫ ở ờ ế M u x lý b ng RNAse (100 μg/ml) 37 °C trong 1 gi , sau đó chi ấ t xu t
ế ủ ồ ằ ADN b ng phenolchloroform và k t t a c n.
ướ ế B c 1: Phá màng t bào và màng nhân (TB eukaryote).
ụ M c đích: Phá màng TB và màng nhân.
ỡ ế ươ ậ ọ Phá v t ự ậ ằ bào th c v t b ng ph ng pháp v t lí hay hóa h c.
(cid:0) ́ ươ ấ ẩ ề ợ ộ Ph ỗ ng phap: nghi n TB trong m t h n h p ch t t y (SDS, sarkosyl) và
ỡ ả proteinase (proteinase K) phá v màng TB và màng nhân, gi i phóng ADN ra
ườ ế ớ ủ ồ ờ môi tr ng đ ng th i phân h y các protein liên k t v i ADN.
ấ ẩ ử ế
SDS (sodium dodecyl sulfate): Ch t t y r a, làm gãy các liên k t không
ị ộ c ng hóa tr .
Sarkosyl: Hòa tan các protein màng.
ắ
Proteinase K: Enzyme phân c t protein (protease).
48
ư ế ả ượ ự ậ ỏ ề L u ý: Do t bào th c v t có v cellulose, nên ph i đ c nghi n trong nit ơ
oC, giúp làm cho vách cellulose tr nên giòn h n, d v h n, đ ng ồ ở
ở ễ ỡ ơ ơ ỏ l ng 196
ờ ả ệ ừ ủ ở ị th i b o v ADN phóng thích t nhân không b tiêu h y b i các protease trong
ế t bào.
ướ ạ ỏ ủ ế ố ầ ẫ B c 2: Lo i b các thành ph n không mong mu n trong m u, ch y u là các
protein
ạ ỏ ụ ả ầ M c đích: Lo i b các thành ph n không ph i là ADN.
ế Dùng dd phenol: chloroform làm bi n tính protein.
(cid:0) ướ ế PhenolChloroform không tan trong n c và làm bi n tính protein.
ẽ ị ủ ặ Protein s b t a khi g p phenol.
ị ủ ở ẫ ướ
ADN thì không b t a b i phenol nên v n tan trong n
c.
ượ ầ ướ ệ ầ ố Sau li tâm, thu đ c ph n n ữ ứ c phía trên ng nghi m ch a ADN hòa tan, ph n gi a
ầ ướ ấ ẫ ệ ạ ố ế ủ là protein k t t a, ph n d i đáy ng nghi m là các t p ch t l n khác.
ướ ủ B c 3: T a nucleic acid
ụ M c đích:
(cid:0) ậ ướ ạ ặ Thu nh n nucleic acid d i d ng cô đ c.
(cid:0) ́ ́ ả ̉ ̣ ̉ ̉ ́ B o quan tranh tac dung cua cac enzyme phân huy nucleic acid.
ạ ồ ộ ố
(cid:0) Hòa tan nucleic acid l
i trong dd theo n ng đ mong mu n.
ủ
T a trong ethanol (ethylic alcohol)
ề ệ Đi u ki n:
ườ ự ồ ộ ố
(cid:0) Môi tr
ng có l c ion cao (n ng đ mu i cao).
ượ ư
(cid:0) Vethanol : V m uẫ = 2,5 : 1 L
ế ủ ng d ethanol làm k t t a hoàn toàn ADN.
49
ậ ợ ệ ề ạ ế ủ
(cid:0) Nhi
ệ ộ ấ T o đi u ki n thu n l t đ th p. ệ ạ i cho vi c t o k t t a.
ạ ủ ằ ượ Sau khi t o t a b ng ethanol, đem dd li tâm thu đ ặ c ADN cô đ c (pellet).
ử ủ ế ổ ả ứ ứ ỗ 5. Phân tích phân t ằ c a dòng d a bi n đ i gen b ng ph n ng chu i polymerase
ế ế ADN sau khi tách chi t ti n hành PCR.
ồ ượ ử ụ ả ứ ỗ + Các m i đ c s d ng cho ph n ng chu i polymerase (PCR) là:
′ ′ 1. 5 GGATCCAACAATGGCTCTTGCTCCATCCAAAGTT3
′ ′ 2. 5 GAGCTCGGCTATTCAAGATTAAGCAGCATC3
ẫ ổ ộ ố ượ ử ụ ể ể ớ M t m u 50ng trên t ng s ADN đ c s d ng đ phân tích PCR v i th tích
ả ứ ứ ệ ỗ ph n ng là 50 μl ch a 1 × Taq polymerase đ m, 100 μM m i dNTP, 1 μM m i l ỗ ượ ng
ồ ượ m i và 1 U l ng Taq polymerase.
Quy trình
ướ ẩ ị
B c 1. Chu n b
ậ ệ ệ ạ ạ ẩ ồ ị ặ Chu n b các v t li u: đo n ADN đ c hi u, đo n m i, polymerase, nucleotide
ệ ị ự t do, dung d ch đ m.
ậ ệ ặ ố ệ ệ ố
Cho các v t li u vào ng nghi m plastic, sau đó đ t ng nghi m vào máy luân
nhi t.ệ
ả ứ ướ
B c 2. Ph n ng PCR
ố ế ả ứ ề ồ ộ ộ ỗ
Là m t ph n ng theo nhi u chu i chu kì n i ti p nhau. M t chu kì bao g m 3
giai đo n:ạ
50
ả ạ ạ ể ế + Giai đo n bi n tính: nóng ch y t i 94 °C trong 5 phút đ tách ADN thành
ế ạ ồ ỳ ế ợ ơ s i đ n, ti p theo là 30 chu k khu ch đ i bao g m 94 °C trong 1 phút
ồ ượ ọ ớ ợ ợ ắ ặ ủ
+ Giai đ an lai ghép: ADN m i đ
c b t c p v i s i đ n c a ADN ban
ệ ở ầ ệ ộ ự đ u th c hi n nhi t đ 58 °C trong 1,5 phút, 72 °C trong 1 phút
ể ự ắ ạ ổ ề ế ợ
+ Giai đo n t ng h p ADN: Taq polymerase đi u khi n s g n ti p các nu
ồ ớ ế ầ ầ ạ ạ ố vào sau ADN m i v i m ch khuôn là ADN ban đ u, là ph n khu ch đ i cu i
ệ ở ệ ộ ự cùng th c hi n nhi t đ 72 °C trong 10 phút.
ộ ồ ướ ẽ ượ ặ ặ ạ ề ầ ỳ M t chu k bao g m 3 b c trên s đ c l p đi l p l ỗ i nhi u l n và m i
ấ ượ ủ ầ ẫ ướ ế ầ ạ l n l i làm tăng g p đôi l ng m u c a l n tr ạ ự c. Đây là s khu ch đ i
ấ ố ả ứ ủ ế ả ố ỳ ả theo c p s nhân, k t qu cu i cùng c a ph n ng PCR sau n chu k ph n
ứ ẽ ả ử ữ ạ ằ ng thì ta s có 2n b n sao các phân t ạ ADN m ch kép n m gi a 2 đo n
m i.ồ
ướ ậ
B c 3. Thu nh n ADN
ẩ ả ượ ử ụ ị ằ ể ệ ả Các s n ph m đ c hi n th b ng cách s d ng gel SYBR b o v ADN
ề (Invitrogen, USA) trên n n gel agarose 2%.
ế ả K t qu :
ỗ ấ ủ ứ ể ấ ấ Phân tích PCR c a sáu dòng d a chuy n gen có tính ch t cho m i c u trúc cho th y
ơ ươ ứ ế ạ ạ ặ ộ ướ ự ế ủ khu ch đ i m t đo n 780 c p baz t ớ ng ng v i kích th ậ c d ki n c a ferritin đ u
ế ặ ắ ổ ươ t ng, trong khi nó v ng m t trong các cây không bi n đ i gen (Hình 3a, b).
51
Hình 3.
ủ ể ể ế ạ ạ ị ặ a) Phân tích PCR c a cây chuy n gen pSF hi n th khu ch đ i băng đo n 780 c p
ơ ụ ể ố ớ ậ ươ baz c th đ i v i gen ferritin đ u t ng.
+ Làn 1 1 kb thang đo
ủ ự ươ ế + làn 2 c a c c d ổ ng, làn 3 cây không bi n đ i
ế ổ ẫ + làn 4–9 các m u bi n đ i gen.
ấ ự ạ ả ế ể ặ b) Phân tích PCR cây chuy n gen pEFESF cho th y s khu ch đ i d i băng 780 c p
ơ ụ ể ố ớ ậ ươ baz c th đ i v i gen ferritin đ u t ng.
+ Làn 1 1 kb thang đo
ủ ể ệ ể + làn 2 c a cây ki m soát bi u hi n
ế ổ + làn 3 cây không bi n đ i
ế ẫ ổ ẻ +làn 4–9 các m u bi n đ i gen riêng l .
52
ượ ể ả 6. Phân tích PCR phiên mã ng c tìm các dòng có kh năng chuy n gen thành
công
ượ ọ ượ Sáu dòng đ ế ụ c ch n sau khi PCR ti p t c phân tích phiên mã ng c (RT) –
ủ ể ệ ể ể ạ ị PCR đ xác đ nh bi u hi n tính tr ng c a gen chuy n.
ượ ể ờ ượ (Quá trình RTPCR: RNA đ c chuy n thành cADN nh enzyme phiên mã ng ồ c. M i
ể ồ ượ ủ ắ ặ ẫ ạ ử ụ s d ng trong giai đo n này có th là m i ng ớ c c a PCR, b t c p ng u nhiên v i
ộ ự ắ ượ ế ạ m t trình t ng n trên cADN, sau đó cADN đ ờ c khu ch đ i nh taq polymerase.)
ố ượ ậ ừ ủ ổ RNA t ng s đ c phân l p t ể ể lá c a các dòng chuy n gen và không chuy n
ự ậ ử ụ ộ gen, s d ng b RNeasy mini kit cho th c v t (Qiagen, USA)
ộ ượ ừ ổ ượ ử ụ ể ổ ợ M t l ng 1μg trích t ố t ng s RNA đ ằ c s d ng đ t ng h p cADN b ng
ệ ố ử ụ ủ ỳ cách s d ng h th ng cMaster RTPCR (Eppendorf, Hoa K ). 10 microlit c a cADN
ượ ồ ặ ậ ươ ủ ệ ẫ ớ này đ c dùng làm m u cho PCR v i m i đ c hi u c a ferritin đ u t ớ ng v i các
ư ề ệ ố ả ể ạ ượ đi u ki n cho phân tích PCR gi ng nh miêu t ệ trên. Bi u hi n tính tr ng đ c xác
ở ự ế ặ ạ ơ ạ ủ ị đ nh b i s khu ch đ i c a đo n 780 c p baz .
ế ả K t qu :
ượ ệ ủ ể ậ xác nh n bi u hi n c a gen chuy n c phiên mã (RT) PCR ộ ả ể . M t d i ferritin ả Đ o ng
ặ ơ ượ ủ ả ể ấ ụ ể c th là 780 c p baz đã đ ấ c quan sát th y trong các cây chuy n gen c a c hai c u
ặ ở ắ ế ạ ổ trúc, trong khi v ng m t các d ng cây không bi n đ i (Hình 4).
53
ượ ấ ự ể ả ứ ủ ệ ỗ c ph n ng chu i polymerase cho th y s bi u hi n c a gen Hình 4 Phiên mã ng
ơ ủ ể ế ặ ằ ạ ferritin b ng cách khu ch đ i 780 c p baz c a cADN trong cây chuy n gen.
+ Làn 1 1 kb thang đo
ể + làn 2 cây không chuy n gen
ế ổ ể + làn 3 cây ki m soát bi n đ i
ế ẫ ổ ẻ ủ + làn 4–5 các m u bi n đ i gen riêng l c a pSF
ể ẻ ủ ế + làn 6–7 bi n th riêng l c a pEFESF.
ủ ấ ươ 7. Phân tích đánh d u Southern c a PCR và các dòng RTPCRd ng tính
54
ươ ị ệ ằ Các ph ng pháp xác đ nh PCR và RTPCR phân tích h gen b ng lai ghép
ợ ổ ự ủ ắ ậ ị Southern xác nh n s tích h p n đ nh c a gen chuy n ể . G n nhãn DIG cho ferritin
ấ ự ả ắ ạ ặ cADN cho th y s lai t o trong c hai dòng pSF và pEFESF, trong khi chúng v ng m t
ượ ấ ự ổ ố ể ổ trong các cây không đ ể c chuy n đ i. Dòng pSF chuy n đ i s 4 cho th y s tích lũy
ả ượ ổ ừ ấ ự ủ c a ba b n sao và dòng 6 đã đ ể c chuy n đ i t ợ ủ PEFESF cho th y s tích h p c a
ủ ể ả ố b n b n sao c a gen chuy n (Hình 5).
ủ ể ệ ượ ắ c phân c t Hình 5: Phân tích gen Southern blot cây chuy n gen. ADN c a h gen đ
ớ ầ ậ ươ ắ ằ b ng HindIII và lai v i đ u dò g n nhãn DIG cho ferritin đ u t ng cADN.
+ Làn 1 1 kb thang đo,
ượ ể ể + làn 2 plasmid đ ệ c ki m soát bi u hi n
ể ượ ể ể + làn 3 cây không chuy n gen đ ệ c ki m soát bi u hi n
ể + làn 4 chuy n gen dòng pSF4
ủ ể + làn 5 chuy n gen dòng c a pEFESF6.
ượ ể ệ ể Sau khi PCR và RTPCR thu đ c hai dòng chuy n gen bi u hi n cao (pSF
dòng 4 và EFESF dòng 6)
55
ượ ể ằ Hai dòng này đ c nhân lên và phân tích b ng cách lai ghép Southern đ xác
ậ ự ổ ợ ủ ố ượ ể ị ị nh n s n đ nh tích h p c a gen ferritin và đ xác đ nh s l ả ng b n sao.
ứ ượ ử ụ ủ ể ậ ắ ỏ ẩ CTAB chu n giao th c đ c s d ng đ phân l p và c t nh ADN c a b ộ
ế gen. In v t ADN lên màng nylon (Hybond N +; AmershamPharmacia, USA) sau khi
ượ ự ướ ẫ ủ ả ấ tách gel đ ệ c th c hi n theo h ng d n c a nhà s n xu t.
ậ ừ ộ ậ ượ ắ ADN (10–20 μg) phân l p t ể các dòng chuy n gen đ c l p đ ỏ ớ c c t nh v i
ượ ắ ượ ệ ể Hind III. ADN đ c phân c t đ c đi n di trên gel agarose TAE 1% và chuy n sang
ử ụ ươ ố màng Hybond N + (Amersham Pharmacia Biotech, V ng qu c Anh) s d ng các công
ứ ẩ th c chu n.
ữ ạ ầ ẫ ớ ượ ắ Nh ng ADN này lai v i các đo n đ u dò ng u nhiên đ c g n DIG có 780
ượ ồ ượ ế ạ ằ ớ ề ậ ở ị ơ ặ c p baz thu đ c b ng PCR khu ch đ i pSF v i m i đ c đ c p trên. Xác đ nh
ạ ượ ệ ị ằ ể ế ọ ủ ấ d u hi u hóa h c c a phép lai t o đ ạ ả c hi n th b ng ph n chi u phóng x .
ố ượ ẽ ể ắ ằ 8. Ướ ượ c l ng s l ử ụ ng s t và k m trong các dòng chuy n gen b ng cách s d ng
ổ ấ ụ ử quang ph h p th nguyên t
ụ ượ ử ụ ổ ấ ụ ử ụ ủ D ng c th y tinh đ c s d ng cho quang ph h p th nguyên t đã đ ượ c
ấ ằ ử ụ ử ạ r a s ch và tráng b ng axit nitric pha loãng và s y khô trong 12 gi ờ ướ tr c khi s d ng.
ở ủ Đĩa th y tinh đ ượ ủ c trong lò không khí nóng 140 °C trong 12 gi ờ .
ậ ừ ệ 10 gram mô lá t ươ ượ i đ c thu th p t ố các cây trong ng nghi m và đ ượ c
ủ ể ế ạ chuy n đ n các đĩa petri th y tinh s ch.
ố ớ ẫ ỗ ượ ể ế Đ i v i m i m u, 0.250 g mô khô đ c chuy n đ n bình hình nón 250 ml và
ượ ắ ằ ậ ặ đ c phân c t b ng 30 ml axit nitric đ m đ c và axit percloric theo t ỷ ệ l 5: 1, t ươ ng
ứ ượ ữ ộ ượ ề ế ỉ ng. Các bình đ c gi trên m t đĩa nóng đ c đi u ch nh đ n 80 °C và đun trong 26
ờ ấ ượ ế ủ ắ gi cho đ n khi th y đ c khói tr ng c a axit perchloric.
56
ẫ ượ ể ộ ượ ọ ấ ọ ố Các m u đ c đ ngu i và đ c l c qua gi y l c Whatman (s 40) vào bình
ứ ạ ể ẫ ượ ề ằ ỉ ướ ị đ nh m c s ch 25 ml và th tích m u đã đ ế c đi u ch nh đ n 25 ml b ng n c MilliQ
vô trùng.
ị ượ ẫ ẩ ổ ấ ụ ằ Các m u chu n b đ c phân tích b ng máy quang ph h p th nguyên t ử
ứ ắ ẩ ị ẽ than chì PerkinElmer HGA 400. Dung d ch tiêu chu n ch a s t (1–5 μg/ml) và k m
ượ ử ụ ổ ấ ụ ẩ ị (0,2–1,5 μg/ml) đã đ c chu n b và s d ng cho quang ph h p th nguyên t ử ể ẽ đ v
ườ ẩ đ ng cong tiêu chu n.
ườ ượ ứ ẽ ế ắ ự ả: S tăng c ng tích lũy hàm l ổ ng s t và k m trong các dòng d a bi n đ i K t quế
ượ ổ ấ ụ ằ ử gen đ c quan sát khi phân tích b ng quang ph h p th nguyên t .
ề ệ ắ ượ ậ ở ộ Trong đi u ki n in vitro, 574 μg/g DW s t đã đ c ghi nh n m t trong
ữ ể ượ ể ệ ổ ớ nh ng dòng chuy n gen đ ể c chuy n đ i v i pSF bi u hi n cassette (expression
ệ ủ ể ả ượ ể ấ ắ cassette: kh năng bi u hi n c a gen đ c chuy n), ầ tăng g p 5,03 l n tích lũy s t so
ế ả ộ ồ ộ ổ (B ng 1). Cùng m t dòng cho th y ớ v i cây không bi n đ i ẽ ấ n ng đ tích lũy k m
ớ ể ế ấ ầ ự . S tích lũy đ n 192,01 μg/g DW tăng g p 2,44 l n so v i cây không chuy n gen
ầ ắ ẽ ầ ấ ấ ượ ớ tăng g p 3,65 l n s t và tăng g p 2,0 l n k m thu đ ể ể c trong cây chuy n gen v i bi u
ệ ả hi n pEFESF cassette (B ng 2).
ộ ồ ộ ồ S Số
N ng đ Fe (μg / g / dw) Trung bình tăng g p ấ N ng đ Zn (μg / g / dw) Trung bình tăng g p ấ
4.21 3.96 4.26 5.03 4.41 4.11 2.39 2.19 2.39 2.44 2.01 2.35
479.52±2.27 452.37±3.92 487.12±2.39 574.36±3.02 502.98±3.71 469.75±1.92 114.12±2.02 188.12±0.52 172.75±0.68 188.51±1.23 192.01±2.12 158.53±0.85 185.51±1.36 78.61±0.13
ổ SF1 SF2 SF3 SF4 SF5 SF6 Ứ Ố Đ I CH NG ế (cây không bi n đ i)
57
ả ượ ủ ẽ ể ắ B ng 1 Hàm l ủ ng s t và k m trong lá c a cây chuy n gen c a pSF
ồ ộ ộ ồ S Số
N ng đ Fe (μg / g / dw) Trung bình tăng g p ấ N ng đ Zn (μg / g / dw) Trung bình tăng g p ấ
2.21 1.91 2.94 2.91 3.25 3.65 1.52 1.56 1.57 1.56 1.84 2.05
Ố EFE SF1 EFE SF2 EFE SF3 EFE SF4 EFE SF5 EFE SF6 Ứ Đ I CH NG 251.62±2.33 218.74±3.39 336.06±2.68 331.83±4.06 371.25±2.74 410.22±2.16 114.12±2.02 119.81±3.07 122.95±0.15 124.01±2.18 123.17±1.56 145.02±2.39 161.23±3.25 78.61±0.13
ả ượ ủ ủ ẽ ể ắ B ng 2 Hàm l ng s t và k m trong lá c a cây chuy n gen c a pEFESF
ươ ự ứ ự ắ T ng t trong nghiên c u này thì s tích lũy 574,36 μg/g s t và 192,01 μg/g
ở ộ ượ ử ụ ử ụ ẽ k m khi vùng kh i đ ng ubiquitin đ ở ộ c s d ng, trong khi s d ng vùng kh i đ ng
ế ự ủ ứ ẽ ẫ ể ắ EFE d n đ n s tích lũy c a 410,22 μg/g s t và 161,23 μg/g k m trong cây d a chuy n
ứ ủ ọ ư ự ề ề ấ ệ gen. Nh đã đ xu t trong nghiên c u c a h và trong đi u tra này s khác bi t trong
ứ ộ ệ ủ ứ ẽ ể ể ắ ể m c đ tích lũy s t và k m trong cây chuy n gen có th là do s c bi u hi n c a vùng
ượ ử ụ ở ộ kh i đ ng đ c s d ng.
ấ ằ ứ ứ ề ầ ố ộ Tuy nhiên, nghiên c u và công trình g n đây v chu i cho th y r ng m c đ tích lũy
ậ ươ ứ ể ể ệ ằ ơ ằ có th cao h n b ng cách tăng m c bi u hi n gen ferritin đ u t ng b ng cách s ử
ứ ộ ở ộ ẽ ơ ữ ể ạ ơ ụ d ng vùng kh i đ ng m nh m h n trong cây chuy n gen. H n n a, m c đ tích lũy
ự ể ạ ượ ạ ầ ươ t ng t có th đ t đ ộ ấ c trong các lo i trái cây cung c p RDA theo yêu c u trong m t
ỗ ự ấ ượ ế ướ ể ầ ử ụ l n s d ng duy nh t. N l c đang đ c ti n hành theo h ứ ng nghiên c u này đ xác
ườ ứ ẽ ể ắ ự ị đ nh s tăng c ng tích lũy s t và k m trong quá trình chuy n gen cây d a.
ệ ả Tài li u tham kh o
Tài li uệ
ệ ọ ườ ậ ạ ạ ộ ọ 1. “Công ngh sinh h c trên ng i và đ ng v t”, Ph m Kim Ng c và Ph m Văn Phúc.
58
ươ ử ọ ỳ ị ồ 2. “Sinh h c phân t ”, H Hu nh th Thùy D ng.
Trang web:
Ứ ụ ế ậ ổ ử ườ 1. ng d ng vi sinh v t bi n đ i gen trong x lý môi tr ng:
http://iae.vn/NewDetails/ungdungvisinhvatbiendoigentrongxulymoitruong250
5
2. Top 13 Methods of Gene Transfer (With Diagram):
http://www.biotechnologynotes.com/genecloning/top13methodsofgenetransferwith
diagram/469
ự ế ẩ ổ 3. Th c ph m bi n đ i gen: https://www.slideshare.net/nambenho14/thcphmbdgen1
1
ứ ể ể ệ ằ ẩ ố 4. “Nghiên c u phát tri n h th ng chuy n gen b ng vi khu n agrobacterium
ấ ợ tumefaciens cho n m s i aspergillus oryzae”
http://repository.vnu.edu.vn/bitstream/VNU_123/17298/1/01050003177.pdf
ọ ọ ử ụ ệ ạ ế ượ ả ế 5. Marker ch n l c s d ng trong công ngh t o cây GM và chi n l c c i ti n
https://text.123doc.org/document/4278399markerchonlocsudungtrongcongnghe
taocaygmvacacchienluoccaitien.htm
