M c l cụ ụ
1
A. KHÁI NI M V K THU T CHUY N GEN VÀ GEN CHUY NỆ Ề Ỹ Ậ Ể Ể
1. Khái ni m k thu t chuy n gen ệ ỹ ậ ể
K thu t chuy n gen (ghép gen) là k thu t đa 1 gen l (1 đo n phan t ADNỹ ậ ể ỹ ậ ư ạ ạ ử
ho c RNA) vào t bào ch , làm cho gen l t n t i các plasmid trong t bào ch ho cặ ế ủ ạ ồ ạ ở ế ủ ặ
g n vào b gen t bào ch , t n t i và tái b n cùng v i b gen t bào ch . Gen l trongắ ộ ế ủ ồ ạ ả ớ ộ ế ủ ạ
t bào ch ho t đng t ng h p các protein đc hi u, ế ủ ạ ộ ổ ợ ặ ệ gây bi n đi các đc đi m đã cóế ổ ặ ể
2
ho c làm ặxu t hi n nh ng đc đi m m i ấ ệ ữ ặ ể ớ c a c th chuy n gen. M c đích t o raủ ơ ể ể ụ ạ
gi ng sinh v t m i.ố ậ ớ
- Kĩ thu t chuy n gen g m nh ng b c c b n sau:ậ ể ồ ữ ướ ơ ả
1. T o ADN tái t h pạ ổ ợ
2. Đa ADN tái t h p vào t bào nh nư ổ ợ ế ậ
3. Ki m tra s sát nh p c a gen và bi u hi n c a genể ự ậ ủ ể ệ ủ
Quy trình c a kĩ thu t chuy n gen gi ng v i t o dòng nh ng có m c đích khác nhau.ủ ậ ể ố ớ ạ ư ụ
Kĩ thu t chuy n gen nh m t o ra gi ng sinh v t m i.ậ ể ằ ạ ố ậ ớ
Nguyên lý: m t đo n gen mong mu n đc khai thác, sau đó chúng đc tháo tácộ ạ ố ượ ượ
các y u t c n thi t đ chuy n vào h gen nhân c a t bào nh n. Gen chuy n có khế ố ầ ế ể ể ệ ủ ế ậ ể ả
năng bi u hi n và di truy n n đnh th h sau, đó là nguyên lý c a công ngh này.ể ệ ề ổ ị ở ế ệ ủ ệ
2. Gen chuy n ể
Gen chuy n là các gen mã hóa tính tr ng mong mu n đc tách chi t t các sinhể ạ ố ượ ế ừ
v t khác nh đng v t, th c v t, vi sinh v t... chúng mã hóa các tính tr ng s l ng,ậ ư ộ ậ ự ậ ậ ạ ố ượ
ch t l ng (nh s n l ng s a, th t), hay mã hóa m t s thành ph n b sung.ấ ượ ư ả ượ ữ ị ộ ố ầ ổ
C u trúc c a gen chuy n bao g m 2 trình t chính: Trình t mã hóa cho phân tấ ủ ể ồ ự ự ử
protein (transgen – gen chuy n) và trình t đi u hòa (promoter và enchancer).ể ự ề
Đ bi u hi n protein trong mô chuyên bi t, c u trúc gen ph i ch a trình t đi uể ể ệ ệ ấ ả ứ ự ề
hòa thích h p, có kh năng phiên mã tr c ti p trong mô. Vùng đi u hòa có chi u dàiợ ả ự ế ề ề
kho ng 100bp, k t h p v i các nhân t cis ho c trans đ tham gia quá trình phiên mãả ế ợ ớ ố ặ ể
(kh i đng hay k t thúc quá trình phiên mã.ở ộ ế
3
Enhancer: m t đo n ADN ng n, có th g n v i protein (còn g i là nhân t ho tộ ạ ắ ể ắ ớ ọ ố ạ
đng trans), làm tăng m c đ phiên mã c a gen m c tiêu trong 1 nhóm gen, không phộ ứ ộ ủ ụ ụ
thu c vào v trí đnh h ng c a gen.ộ ị ị ướ ủ
*Ngoài ra còn nhi u c u trúc khác c n g n vào gen chuy nề ấ ầ ắ ể
- Các marker ch n l c: khi gen chuy n vào t bào, chúng đc nuôi c y đ sau đóọ ọ ể ế ượ ấ ể
sàng l c, ch n ra nh ng t bào đã đc bi n n p ho c t i n p thành công. G m 2ọ ọ ữ ế ượ ế ạ ặ ả ạ ồ
lo i:ạ
+ Các marker ch n l c d ng (s n ph m c a gen ch n l c) đc s d ng hi uọ ọ ươ ả ẩ ủ ọ ọ ượ ử ụ ệ
qu trong h u h t các gen chuy n, nh m ch n l c nh ng t bào đã nh n đc c uả ầ ế ể ằ ọ ọ ữ ế ậ ượ ấ
trúc gen chuy n ( d ng t do hay đã đc sát nh p vào b gen t bào ch ). ể ở ạ ự ượ ậ ộ ế ủ
+ Các marker ch n l c âm th ng đc s d ng: HSV-tk, dt và hprt đ ch n l c tọ ọ ườ ươ ử ụ ể ọ ọ ế
bào không t n t i gen chuy n hay 1 gen nào đó bên trong.ồ ạ ể
- Gen báo cáo (reporter gen) là nh ng gen mã hóa cho các protein d phát hi n giúpữ ễ ệ
báo cáo vai trò ho t đng c a gen, đc chèn vào “bên s n” c a gen chuy n. D aạ ộ ủ ượ ườ ủ ể ự
vào s bi u hi n c a gen báo cáo giúp đánh giá s đi u hòa c a gen chuy n trong tự ể ệ ủ ự ề ủ ể ế
bào hay mô.
- Polylinker: cu i các c u trúc gen có th đc bi n đi đ hình thành cácỞ ố ấ ể ượ ế ổ ể
polylinker ch a m t s v trí nh n di n c a các enzyme c t gi i h n. Polylinker choứ ộ ố ị ậ ệ ủ ắ ớ ạ
phép c u trúc gen chèn vào nh ng vector, nh m m c đích nhân dòng và ki m tra.ấ ữ ằ ụ ể
ADN gen chuy n đc t o ra b ng cách s d ng các enzyme c t gi i h n vàể ượ ạ ằ ử ụ ắ ớ ạ
ligase, gen t nh ng lo i khác nhau có th đc k t h p l i trong ng nghi m đ t oừ ữ ạ ể ượ ế ợ ạ ố ệ ể ạ
thành c u trúc gen chuy n. ấ ể
4
C u trúc gen chuy nấ ể
ATG: V trí b t đu phiên mãị ắ ầ
SIG: Trình t d u hi uự ấ ệ
AAA: đuôi poly A
3. Các nguyên lý sinh h cọ
-T o các đi u ki n sinh lý sinh hóa, hoăc c ng b c đ h t bào ch ch pạ ề ệ ưỡ ứ ể ệ ế ủ ấ
nh n y u t l (gen chuy n), tránh s th i lo iậ ế ố ạ ể ự ả ạ
- Gen chuy n ph i vào đc trong t bào nh n và ph i di n ra s dung h p gi aể ả ượ ế ậ ả ễ ự ợ ữ
gen t bào vào gen chuy nế ể
-Gen chuy n ph i đc bi u hi n trong t bào chể ả ượ ể ệ ế ủ
-S l ng cá th nh n gen chuy n ph i đc khu ch đi (di truy n cho th hố ượ ể ậ ể ả ượ ế ạ ề ế ệ
con cái) đ di truy n hi u qu c a gen chuy n.ể ề ệ ả ủ ể
-T h p gen c n chuy n ph i đc chèn chính xác vào v trí c n thi t đng th iổ ợ ầ ể ả ượ ị ầ ế ồ ờ
kh ng ch đc nh ng tác đng tiêu c c c a mô ch .ố ế ượ ữ ộ ự ủ ủ
5