Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô địa phương Việt Nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI TÀI NGUYÊN VÀ SINH VẬT

PHẠM THỊ HẰNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN ZmBZIP72 PHÂN LẬP TỪ GIỐNG NGÔ ĐỊA

PHƯƠNG VIỆT NAM VÀ THIẾT KẾ CẤU TRÚC MANG GEN PHỤC VỤ

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO CÂY TRỒNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TS. HUỲNH THỊ THU HUỆ

Hà Nội - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu

trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, Ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Phạm Thị Hằng

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Huỳnh Thị Thu

Huệ - Phó trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiên cứu hệ gen đã tận tình

hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.

Luận văn này được thực hiện tại phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiên cứu

hệ gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài cấp nhà nước: “Phân lập thiết kế gen chịu hạn phục

vụ công tác tạo giống ngô biến đổi gen” giai đoạn 2014-2018 do Bộ Nông nghiệp và Phát

triển Nông thôn quản lý.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và

Tài nguyên sinh vật và ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giảng dạy và tạo điều kiện

cho tôi học tập và thực hiện luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen,

Viện Nghiên cứu hệ gen đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và cho tôi những lời khuyên cũng như

những góp ý quý báu trong quá trình tôi thực hiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ

tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, Ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Phạm Thị Hằng

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ABA Abscisic acid

ABF ABRE binding factor

ABRE AB -responsive element

AP2/EREBP APETALA2/ethylene responsive element binding protein

AREB ABA responsive element binding protein

AS Acetosyringone

bZIP basic leucine zipper

CaMV Cauliflower mosaic virus

CBF CRT binding factor

CBU Crop Biotech Update

cDNA Complementary DNA

CDPK Calcium-dependent protein kinase

CDS Coding DNA sequence

CRT C-Repeat

CSP Cold shock protein

CUC2 Cupshaped cotyledon 2

CYP Cyclophilin

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DNA Deoxyribonucleic acid

DRE Dehydration responsive element

DREB Dehydration responsive element binding

iii

DST Drought and Salt Tolerance

EAR ERF-associated amphiphilic repression

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ERD1 Early responsive to dehydration

ERF Ethylene responsive e blement

EtBr Ethidium bromide

FAO Food and Agriculture Organization

FAS-USDA Foreign Agricultural Service-United States Department of Agriculture

HSP Heat Shock Protein

LB Lysogeny broth

LEA Late embryogenesis abundant

MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight

MCS Multiple cloning site

mRNA Messenger RNA

NAC NAM, ATAF1,2, CUC2

NACRS NAC recognition sequence

NAM No apical meristem

NF-Y Nuclear factor Y

PCR Polymerase Chain Reaction

PIS Phosphatidylinositol synthase

PKC Protein kinase C

PTMs Post translation modifications

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction

sHSP Small heat shock protein

TF Transcription factor

WFP World Food Programme

WMO World Meteorological Organization

ZAT Zinc transporter

ZFP Zinc ﬁnger protein

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

Bảng 1.1 Sản lượng ngô trên toàn thế giới qua các niên vụ 2011/2012 – 14

2016/2017

Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 21 - 22

Bảng 2.2 Thành phần các môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 22 - 23

Bảng 3.1 Kết quả biến nạp gen ZmbZIP72 57

Bảng 3.2 Danh sách mẫu cây chuyển gen ZmbIP72 thu được 58

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang

Hình 2.1 Sơ đồ vector biểu hiện mang gen ZmbZIP72 29

Hình 3.1 Sản phẩm tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô xử lý hạn 38

nhân tạo

Hình 3.2 Sản phẩm PCR nhân gen Actin từ các mẫu cDNA 39

Hình 3.3 Kết quả RT-PCR nhân gen ZmbZIP72 40

Hình 3.4 Tách chiết và chọn lọc plasmid mang gen ZmbZIP72 41

Hình 3.5 Kiểm tra plasmid pJET 1.2 mang đoạn gen ZmbZIP72 42

Hình 3.6 So sánh trình tự nucleotide giữa đoạn gen ZmbZIP72 từ giống Tẻ 43

vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham chiếu

Hình 3.7 So sánh trình tự acid amin suy diễn của đoạn CDS trên đoạn gen 44

ZmbZIP72 giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham

chiếu

Hình 3.8 Kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ZmbZIP72SacI F/R 45

Hình 3.9 Kết quả cắt enzyme giới hạn BglII trên các plasmid pJET 1.2 46

Hình 3.10 Tách chiết và chọn lọc plasmid pRTL2 mang gen ZmbZIP72 47

Hình 3.11 Sản cắt plasmid pRTL2_ZmbZIP72 bằng enzyme HindIII 47

Hình 3.12 Sản phẩm cắt plamsid pRTL2_ZmbZIP72 với enzyme BamHI 48 và HindIII

Hình 3.13 Chọn lọc plasmid pCAMBIA1300 mang gen ZmbZIP72 50

Hình 3.14 Sản phẩm cắt plasmid pCAM1300_ZmbZIP72 bằng enzyme 51 HindIII

Hình 3.15 Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 01 bằng enzyme SacI, HindIII 51

Hình 3.16 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen ZmbZIP72 từ 4 dòng plasmid 53

Hình 3.17 Minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh cây ngô chuyển gen 56

Hình 3.18 DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá cây chuyển gen ZmbZIP72 60 thế hệ T0

vii

Hình 3.19 Sản phẩm PCR nhân gen chỉ thị hygromycin ở các cây chuyển 61

gen T0

62 Hình 3.20 Sản phẩm PCR nhân gen đích ZmbZIP72 ở cây chuyển gen T0

viii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN................................................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. iii

DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................ vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................... vii

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3

1.1. Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán , ......................................... 3

1.1.1. Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật ...... 3

1.1.3.1. Các gen mã hoá protein chức năng .......................................................... 5

1.1.3.2. Các gen mã hoá protein truyền tín hiện .................................................. 6

1.1.3.3. Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã ........................................... 7

1.2. Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở thực vật ..................................................................................................................... 10

1.3. Cấu trúc và chức năng của gen ZmbZIP72 .................................................. 12

1.4. Cây ngô và vấn đề chịu hạn .......................................................................... 14

1.5. Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen ........................................................ 17

1.6. Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens19

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 21

2.1. Vật liệu và hoá chất nghiên cứu .................................................................... 21

2.1.1. Mẫu thực vật ............................................................................................ 21

2.1.2. Các vật liệu khác ...................................................................................... 21

2.1.3. Hoá chất .................................................................................................... 21

2.1.4. Thiết bị nghiên cứu .................................................................................. 23

2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 24

2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ thực vật ....................................................... 24

2.2.2. Tách chiết RNA tổng số từ thực vật ....................................................... 25

2.2.3. Sinh tổng hợp cDNA sợi thứ nhất .......................................................... 26

2.2.4. Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR.......................................... 26

Tinh sạch các đoạn DNA trên gel agarose ............................................. 27 2.2.5.

Tạo dòng gen và thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 . 28 2.2.6.

Biến nạp các vector tái hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β và A.

2.2.7. tumefaciens ................................................................................................................. 30

Tách chiết và tinh sạch plasmid.............................................................. 32 2.2.8.

Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn ............................. 33 2.2.9.

2.2.10. Điện di trên gel agarose ........................................................................... 33

2.2.11. Chuyển gen vào thực vật thông qua A. tumefaciens ............................. 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 37

3.1. PHÂN LẬP GEN ZmBZIP72 TỪ CÂY NGÔ ............................................. 37

Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô ............................................ 37 3.1.1.

Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất .................................................................. 38 3.1.2.

RT-PCR nhân gen ZmbZIP72 ................................................................. 39 3.1.3.

Tạo dòng gen ZmbZIP72 trong vector pJET1.2 .................................... 40 3.1.4.

Xác định và phân tích trình tự gen ZmbZIP72 ..................................... 42 3.1.5.

3.2. Thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 ................................... 44

PCR nhân gen ZmbZIP72 với cặp mồi treo vị trí enzyme SacI ........... 44 3.2.1.

Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72 .................................. 46 3.2.2.

Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72 ..................... 49 3.2.3.

3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 ......... 52

3.4. Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô ............................................................. 54

3.5. Đánh giá cây ngô T0 chuyển gen ZmbZIP72 ............................................... 58

Kết quả tách chiết DNA tổng số cây ngô chuyển gen ........................... 59 3.5.1.

Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị hygromycin ............ 60 3.5.2.

Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 61 3.5.3.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 64

1. Kết luận ........................................................................................................... 64

2. Kiến nghị ......................................................................................................... 64

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ........................................................................................................................................... 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 66

MỞ ĐẦU

Trong nhiều năm gần đây, biến đổi khí hậu đã và đang là vấn đề chính đối với nền

nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Sản lượng lương thực toàn cầu đang

bị thiệt hại nghiêm trọng bởi các yếu tố phi sinh học như hạn, ngập úng, mặn, dịch bệnh,

xói mòn đất và ô nhiễm môi trường (Nikos and Bruinsma, 2012). Trong đó, hạn hán đang

là một trong những nhân tố chính gây ảnh hưởng lớn tới nền sản xuất nông nghiệp của toàn

cầu và ngày càng trở nên nghiêm trọng ở nhiều khu vực. Các quốc gia thuộc khu vực Nam

và Đông Phi là những quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề nhất bởi hạn hán. Khu vực này đã

trải qua hai mùa mưa liên tiếp 2014-15 và 2015-16 với lượng mưa dưới mức trung bình

(WMO, 2016). Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên Hợp Quốc (FAO), sản

lượng ngũ cốc của khu vực này trong vụ mùa 2015-16 đã giảm 12% so với năm 2014-15.

Những khu vực khác bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi hạn hán trong những tháng đầu năm

2016 bao gồm phần lớn các khu vực ở phía Bắc Nam Mỹ, các vùng phía đông của Australia,

các hòn đảo thuộc phía Tây Thái Bình Dương và các nước Đông Nam Á thuộc lưu vực

sông Mekong đặc biệt là Việt Nam. Chương trình Lương thực thế giới (WFP) ước tính sẽ

có khoảng 17 triệu người cần được hỗ trợ vào đầu năm 2017 (WMO, 2016).

Cây ngô là một trong các loại cây ngũ cốc quan trọng đối với con người. Ở Việt

Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa và được trồng ở nhiều vùng khác

nhau. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, diện tích trồng ngô ở nước ta năm 2015 ước đạt

1164,8 nghìn ha, sản lượng ước đạt 5287,2 nghìn tấn và năng suất bình quân đạt 4,54 tấn/ha

(https://www.gso.gov.vn). Tuy nhiên, sản xuất ngô ở Việt Nam hiện vẫn chưa đáp ứng

được nhu cầu tiêu dùng trong nước, năm 2015 nước ta vẫn phải nhập khẩu khoảng 7,55

triệu tấn ngô (https://www.gso.gov.vn ). Một trong những nguyên nhân chính là do việc

canh tác ngô ở Việt Nam chủ yếu dựa vào nguồn nước mưa tự nhiên. Điều này ảnh hưởng

rất lớn đến khả năng tăng năng suất và sản lượng ngô hàng năm và đặc biệt là trong điều

kiện nắng hạn kéo dài. Do đó, việc nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn đang là chủ đề

nghiên cứu của nhiều tổ chức và các nhà khoa học. Trong nhiều năm gần đây, việc ứng

dụng công nghệ sinh học đặc biệt là công nghệ gen để cải thiện khả năng chịu hạn của cây

trồng đang được quan tâm. Tuy nhiên, ở nước ta, những thành tựu trong nghiên cứu tạo

giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn vẫn còn hạn chế. Nguyên nhân gồm cả khách

quan và chủ quan như nguồn gen chưa được tập trung khai thác/nghiên cứu nhiều, công

nghệ chuyển gen chưa được tiếp cận sớm, đồng thời cây ngô cũng là đối tượng khó để

chuyển gen vào hệ gen.

Ở thực vật, trong quá trình thích nghi với điều kiện hạn, sự biểu hiện và các cơ chế

điều hòa mức độ biểu hiện của các gen có vai trò quan trọng. Sự biểu hiện của gen liên

quan chặt chẽ với các yếu tố điều khiển phiên mã. Gen ZmbZIP72 là một trong những gen

mã hóa cho yếu tố điều khiển phiên mã của cây ngô đã được phân lập và mô tả bởi Sheng

và cộng sự (2012). Theo nhóm nghiên cứu, sự biểu hiện toàn thể của gen ZmbZIP72 dưới

sự điều khiển của promoter CaMV35S ở các dòng cây Arabidopsis chuyển gen đã làm tăng

đáng kể khả năng thích ứng với khô hạn, cho thấy vai trò tiềm năng của gen ZmbZIP72

trong việc tăng cường khả năng chịu hạn đối với cây chuyển gen. Trên cơ sở đó, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô

địa phương Việt Nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen

vào cây trồng” mục tiêu là phân lập gen và chuyển gen ZmbZIP72 vào cây dòng ngô K7

để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn. Các nội dung nghiên cứu

cụ thể như sau:

- Phân lập, tách dòng gen ZmbZIP72 từ giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) của

Việt Nam.

- Xác định và phân tích trình tự của gen ZmbZIP72

- Thiết kế các vector mang gen ZmbZIP72

- Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

- Kiểm tra sự có mặt của gen ZmbZIP72 trong cây chuyển gen T0 bằng kỹ thuật PCR.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán

1.1.1. Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật

Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm

của cây trồng. Khi môi trường hạn hán, cây bị mất nước dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm

trọng: (i) Gây nên hiện tượng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo. Sự co nguyên sinh

chất xảy ra khi tế bào bị stress nước làm cho nước trong tế bào bị thất thoát ra ngoài nên

khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp. Khi cây sống trong

môi trường thiếu nước kéo dài, tế bào mất nước dẫn đến các mô trở nên mềm yếu và sự

héo xảy ra. Mô thực vật bị héo tạm thời nhưng cũng có thể vĩnh viễn nếu sự thiếu nước xảy

ra nghiêm trọng và trong thời gian dài. (ii) Môi trường sống bị khô hạn cản trở sự vận

chuyển nước trong mạch gỗ. Trong điều kiện thiếu nước, sự cung cấp nước cho rễ không

đủ trong đêm để thủy hóa các mô đã bị thiếu nước ban ngày, dẫn đến các lông hút bị tổn

thương lớp ngoài, vùng vỏ bị phủ chất sáp (suberin) làm giảm áp suất rễ nên ảnh hưởng

đến đẩy cột nước lên cao trong mạch gỗ. Đặc biệt khi thiếu nước sẽ hình thành nhiều bọt

khí trong mạch gỗ dẫn đến phá vỡ tính liên tục của cột nước làm cho cột nước trong mạch

gỗ không được đẩy lên liên tục. (iii) Hạn hán làm dày lớp cutin trên bề mặt lá làm giảm sự

thoát hơi nước qua biểu bì. (iv) Sự thiếu nước làm giảm cường độ quang hợp. Khi hàm

lượng nước trong lá còn khoảng 40 -50%, quang hợp của lá bị đình trệ. (v) Đặc biệt, hạn

hán cản trở sự sinh trưởng của cây trồng. Thiếu nước ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý,

nhất là quang hợp nên làm giảm sinh trưởng và năng suất cây trồng nghiêm trọng (Abdullah

et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013).

Việc giảm năng suất do hạn hán đã được báo cáo ở nhiều loại cây trồng, mức độ

nghiêm trọng phụ thuộc vào thời gian xảy ra hạn. Ở lúa mạch (Hordeum vulgare), hạn hán

làm giảm năng suất do số lượng của chồi, cụm hoa, hạt trên mỗi cây và trọng lượng của

mỗi hạt bị giảm. Ở ngô, stress hạn làm giảm năng suất do trì hoãn việc phun râu, do đó làm

tăng thời gian chênh lệch trỗ cờ - phun râu. Đặc tính này liên quan chặt chẽ với năng suất

hạt, cụ thể là số bắp và số hạt trên mỗi cây bị ảnh hưởng (Cattivelli et al., 2008). Thâm hụt

nước trong suốt quá trình thụ phấn làm tăng tần số hạt không phát triển ở ngô. Ở cây đậu

triều (Cajanus cajan), hạn hán diễn ra trong giai đoạn nảy mầm làm sản lượng hạt bị giảm

đi 40 – 55% (Nam et al., 2001). Trong giai đoạn sinh sản, thiếu hụt nước làm giảm sản

lượng ở bông (Gossypium hirsutum) do việc giảm hình thành và sự phát triển không đầy

đủ của các quả nang. Hạn hán ở đậu tương cũng làm giảm tổng sản lượng hạt (Frederick et

al., 2001). Hạn hán ít có ảnh hưởng đến tỷ lệ hạt mẩy trên lúa mỳ nhưng thời gian hình

thành hạt ngắn hơn và trọng lượng khô bị giảm khi trưởng thành (Wardlaw and

Willenbrink, 2000).

1.1.2. Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật

Để chống lại khô hạn, thực vật có những biến đổi sinh lý, hóa sinh phù hợp. Có hai

cơ chế bảo vệ thực vật tồn tại trong môi trường thiếu nước: cơ chế tránh mất nước và cơ

chế chịu mất nước. Cơ chế tránh mất nước liên quan đến đặc điểm cấu trúc và hình thái

của bộ rễ (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998). Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài,

mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những nơi sâu, xa trong đất, hoặc lan rộng với

số lượng lớn để tăng diện tích tìm kiếm nước (Nguyễn Lan Điền, 2003). Cơ chế này phụ

thuộc vào khả năng thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi nhằm giảm mất

nước một cách tối đa (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998) (Đinh Thị Phòng, 2001). Trong

khi đó, cơ chế chịu mất nước liên quan đến những thay đổi hóa sinh diễn ra trong tế bào

nhằm sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước. Trong điều

kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu của dịch bào được điều chỉnh tăng lên, giúp cho tế bào thu

nhận được những phân tử nước ít ỏi còn lại trong đất. Nhờ vậy, thực vật có thể vượt qua

được tình trạng hạn cục bộ (Steponkus P.L. et al, 2003). Tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu

nội bào còn thông qua tích lũy các chất hòa tan, các protein, các axit amin ví dụ như: axit

amin prolin, mannitol, fructose, K+, các enzyme phân hủy gốc tự do… Sự điều chỉnh áp

suất thẩm thấu có hai chức năng: Giữ và lấy nước vào trong tế bào và ngăn chặn sự xâm

nhập của ion Na+; thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa, tương tác với lipid

hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng và các phức protein (Lê Trần Bình,

Lê Thị Muội, 1998).

1.1.3. Cơ chế phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật

Việc nắm được các cơ chế phân tử của phản ứng chịu hạn ở thực vật là vô cùng

quan trọng đối với việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng. Các nghiên cứu gần đây

đã phân lập được hàng trăm gen được cảm ứng hoặc ức chế khi cây gặp điều kiện khô hạn.

Tuy nhiên, chỉ một phần rất nhỏ các gen được kiểm chứng về vai trò của nó trong việc tăng

tính chịu hạn của cây. Những gen này có thể phân vào các nhóm dựa vào chức năng nội

bào như: các gen mã hoá protein chức năng, các gen mã hoá yếu tố truyền tín hiệu và các

gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã…

1.1.3.1. Các gen mã hoá protein chức năng

Các gen liên quan đến chức năng bảo vệ trực tiếp lên màng tế bào và protein như

LEA protein, heat shock protein (HSP), cold shock protein (CSP). LEA là một nhóm các

protein tự nhiên tích tụ trong hạt phấn hoa, hạt và các mô thực vật trong quá trình đáp ứng

lại các stress phi sinh học. Việc tích luỹ các protein LEA liên quan trực tiếp với khả năng

chịu khô hạn ở thực vật (Amara et al. 2012). Bên cạnh dữ liệu phong phú về cấu trúc và sự

biểu hiện của protein này, ngày càng có nhiều các công trình đề cập đến việc sử dụng các

gen LEA nhằm cải thiện tính chống chịu khô hạn ở thực vật (Grelet et al., 2005). Ví dụ,

gen HVA1 mã hoá nhóm protein LEA3 của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.). Người ta

đã chuyển nạp gen này thành công vào cây ngô để tăng cường khả năng chịu hạn và mặn

trong điều kiện nhà lưới (Nguyen et al., 2013). Gen OsLEA3-1 nhạy cảm với mặn đã thể

hiện tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng nhờ sự điều khiển của promoter

CaMV35S và promoter HVA1-like (Xiao et al. 2007).

Các protein sốc nhiệt (HSP) và sốc lạnh (CSP) là các chaperone ngăn ngừa sự biến

đổi và gấp nếp của các thành phần tế bào trong điều kiện stress. Các gen CspA và CspB từ

vi khuẩn đã được chuyển vào ngô để tăng cường khả năng chịu hạn, nóng, và lạnh bằng

cách bảo vệ quá trình quang hợp, sinh dưỡng và các giai đoạn sinh trưởng, sinh sản. Năng

suất tăng lên khoảng 11 – 12% đối với cây ngô chuyển gen CspA và CspB thông qua việc

đánh giá các thử nghiệm về năng suất trong nhiều năm, ở nhiều địa điểm (Yang et al.,

2010). sHSP17.2, sHSP17.4 và sHSP26 là 3 protein sốc nhiệt nhỏ đã được xác định bằng

cách sử dụng quang khối phổ MALDI-TOF ở lá ngô khi đáp ứng với stress hạn. Các phân

tích hệ phiên mã cho thấy mức biểu hiện của các sHSP này được điều chỉnh tăng lên khi

đáp ứng với stress nhiệt và hạn ở lá ngô. ABA chịu trách nhiệm điều hoà biểu hiện sau

phiên mã các sHSP này (Hu et al. 2010).

Protein Cyclophilin (CYP) liên quan đến nhiều chức năng như phân chia tế bào,

truyền tín hiệu tế bào, vận chuyển protein, điều hoà phiên mã, cắt nối tiền mRNA và khả

năng chịu stress (Trivedi et al. 2012). Các phân tích silico cho thấy rằng việc đáp ứng stress

của thực vật có liên quan với các protein cyclophilin. Các protein CYP ở lúa, ngô,

Arabidopsis, lúa mạch và brachypodium giống nhau đến trên 80% cho thấy tần số cao các

trình tự bảo thủ. CYP thường gặp ở lục lạp, cytosol, và ty thể (Trivedi et al. 2013). Đánh

giá so sánh chỉ ra rằng mRNA chịu trách nhiệm tổng hợp CYP được phát hiện với tần số

cao ở ngô sau 6 – 7 giờ xử lý stress hạn, ở đậu mất khoảng 48 giờ.

1.1.3.2. Các gen mã hoá protein truyền tín hiện

Nhiều hệ thống truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng với điều kiện bất lợi phi

sinh học, bao gồm kinase, enzyme chuyển hoá phospholipid, calcium sensing… Mặc dù

các quá trình truyền tín hiệu này khá phức tạp và chưa được hiểu rõ, một vài gen mã hoá

cho các yếu tố truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng chịu hạn đã được phân lập. Một

vào yếu tố gần đây đã được sử dụng trong tạo tính chịu hạn ở cây chuyển gen như: NPK

(Kovtun et al, 2000), SnRK2 (Umezawa et al., 2004), CBL (Cheong et al., 2003). Cũng

giống như các yếu tố điều khiển phiên mã, việc biến đổi một yếu tố truyền tín hiệu có thẻ

làm thay đổi một loạt các sự kiện sau đó, kết quả là tạo khả năng chống chịu ở nhiều mặt.

Ví dụ, NPK1 là một kinase của Nicotinana. NPK1 nằm ở giai đoạn đầu của con đường

truyền tín hiệu oxi hoá và dẫn đến khả năng chịu hạn, lạnh, nóng và muối ở cây ngô chuyển

gen (Shou et al., 2014). PIS (Phosphatidylinositol synthase) là một enzyme quan trọng

trong con đường tổng hợp phosphatidylinositol không những là một thành phần cấu trúc

màng tế bào mà còn là tiền chất của phần tử tín hiệu điều hoà đáp ứng của cây trước điều

kiện bất lợi. Khi biểu hiện quá mức gen ZmPIS trong cây ngô, cây tăng cường khả năng

chịu hạn đặc biệt là giai đoạn trước khi nở hoa (Liu et al., 2013).

1.1.3.3. Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã

Yếu tố điều kiển phiên mã (TF) là các protein có vai trò kiểm soát quá trình phiên

mã bằng cách bám vào các vùng trình tự đặc hiệu trên promoter của gen. Các yếu tố điều

khiển phiên mã hiện nay được các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu và khai thác do

tiềm năng sử dụng lớn trong công nghệ sinh học (Saibo et al., 2009; Century et al., 2008).

Hiện nay, những nghiên cứu sinh học phân tử đã chỉ ra rằng abscisic acid (ABA) đóng vai

trò quan trọng trong việc đáp ứng và thích nghi với các stress phi sinh học. Người ta nhận

thấy rằng, bên cạnh phần lớn các gen đáp ứng với stress được điều hòa bằng ABA, vẫn còn

một lượng các gen không chịu ảnh hưởng bởi ABA. Do đó, các yếu tố phiên mã cũng được

chia thành nhóm phụ thuộc hay độc lập với ABA. Các TF của hơn 50 họ khác nhau mã hoá

cho 1700 gen khác nhau đã được tìm thấy trong Arabidopsis (Yang et al., 2010). Các TF

được trình bày dưới đây đều là các TF đáp ứng với hạn và chịu hạn.

TF bZIP là một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã phụ thuộc ABA. ABA

responsive element binding factors (AREB/ABF) là một thành viên của nhóm TF bZIP liên

quan đến tín hiệu ABA trong điều kiện hạn hán và trưởng thành của hạt. AREB/ABF nhận

biết và bám vào ABA responsive element (ABRE) yếu tố hoạt động cis để điều khiển sự

hoạt động của các gen phía sau (Mundy et al., 1990). ABRE nằm trong vùng promoter của

các gen đáp ứng ABA (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2006). Việc đóng khí khổng

và giảm sự thoát hơi nước là kết quả của việc tăng hàm lượng ABA do sự biểu hiện quá

mức của AREB1/ABF2, ABF3 hoặc AREB2/ABF4 (Kang et al., 2002). Sự biểu hiện quá

mức của gen ABF3 ở cây lúa chuyển gen cho thấy khả năng chịu hạn thông qua việc tăng

cường độ phát huỳnh quang của diệp lục (Fv/Fm) và giảm sự héo và cuộn xoắn ở lá (Oh et

al., 2005). Các cây chuyển gen AREB1 được điều khiển bởi 35S promoter cho thấy khả

năng sống sót vượt trội (100%) so với cây đối chứng (40%) trong điều kiện hạn, không

những vậy cây chuyển gen còn có hiệu năng sử dụng nước cao hơn và có nhiều lá hơn so

với dòng đối chứng (Leite et al., 2014).

Một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã lớn khác là WRKY, TF này được

tìm thấy ở nhiều loài, đặc biệt là ở các loài thực vật bậc cao (Ulker and Somssich, 2004).

Gần đây, các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu vai trò của nhóm TF này trong đáp

ứng của cây với các điều kiện bất lợi phi sinh học, đặc biệt là hạn hán ở Arabidopsis, lúa

mạch (Luo et al., 2013; Xiong et al., 2010). Mới đây, các nhà khoa học đã phân lập được

gen ZmWRKY58 từ ngô và sự biểu hiện của gen này ở các dòng lúa chuyển gen làm tăng

khả năng chống chịu hạn và muối (Cai et al., 2014).

NAC (NAM, ATAF1-2, CUC2) là một họ TF đặc trưng cho thực vật, bao gồm các

vùng NAC bám DNA có tính bảo thủ cao (Guo et al., 2008). Có hơn 100 gen mã hóa cho

các protein NAC đã được xác định trên đối tượng Arabidopsis. Các protein NAC có nhiều

chức năng, không chỉ tham gia vào sự phát triển của cây mà còn tham gia vào phản ứng

chống chịu stress của thực vật (Nakashima et al., 2012). Có khoảng 40 TF NAC trong số

140 được tìm thấy chịu trách nhiệm đối khả năng chịu hạn và mặn ở lúa. NAC019, NAC055

và NAC072 là các thành viên của họ các yếu tố phiên mã NAC, chúng nhận biết và bám

vào yếu tố NACRS (CATGTG) nằm trong vùng promoter của các gen đáp ứng nhanh với

mất nước (ERD1) và tăng cường khả năng chống mất nước (Tran et al., 2004). Sự biểu

hiện của gen SNAC1 trong cây lúa biến đổi gen làm tăng độ thụ phấn của hoa lên 17 -22%

và khả năng hình thành hạt lên 22 -34% so với các cây đối chứng trong điều kiện hạn hán

vừa và nặng (Hu et al., 2006). Các cây lúa chuyển gen OsNAC6 tăng cường tính chịu hạn

và mặn, ngoài ra còn tăng cường tính kháng bệnh bạc lá so với cây đối chứng (Nakashima

et al., 2007). Cũng nằm trong nhóm NAC, các cây lúa chuyển gen OsNAC9 có tính chịu

hạn rất cao đồng thời, năng suất tốt hơn 13 – 32% so với các cây đối chứng trong điều kiện

bình thường và khô hạn (Redillas et al., 2012).

Một số TF đáp ứng mất nước nhưng không liên quan đến ABA, chúng được gọi là

các TF đáp ứng mất nước không phụ thuộc ABA. Phân tích vùng promoter của các gen

biểu hiện không phụ thuộc ABA trong phản ứng stress của thực vật cho thấy một yếu tố

hoạt động cis với trình tự A/GCCGAC là vị trí liên kết của các TF này, được biết đến như

yếu tố đáp ứng mất nước (DRE- dehydration responsive element). Họ TF đáp ứng mất

nước độc lập ABA điển hình là họ DREB. Các TF này đóng vai trò điều tiết trong điều

kiện stress hạn, lạnh và sự phát triển của lá, hoa, và hạt (Yang et al., 2010). Có 2 loại DREB

(DREB1 và DREB2) được tìm thấy đáp ứng cho những stress khác nhau. DREB1 đáp ứng

với stress lạnh trong khi DREB2 đáp ứng với stress hạn, nhiệt và mặn. Sự biểu hiện quá

mức của ZmDREB1A (DREB1A của Zea mays L.) và OsDREB1A (DREB1A của Oryza

sativa L.) ở Arabidopsis làm tăng cường sự hoạt động của các gen phía sau và tăng cường

khả năng chống chịu stress hạn hán, nhiệt và mặn (Qin et al. 2004; Yang et al., 2010).

Promoter ZmUbi (Zea mays L. Ubiquitin) có hiệu quả trong điều khiển các gen DREB1A,

DREB1B và DREB1C ở Arabidopsis để cải thiện khả năng chống chịu hạn hán (Yang et

al., 2010). Sự biểu hiện của DREB2A-CA đã cảm ứng biểu hiện một loạt các gen sốc nhiệt

và tăng cường khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen (Sakamura et al., 2006). Rất

nhiều cây trồng đã được chuyển gen thử nghiệm nhằm biểu hiện yếu tố phiên mã

DREB/CBF như đậu phộng (Arachis hypogaea) (Bhatnagar-Mathur et al., 2014), khoai tây

(Iwaki et al., 2013), đậu nành (de Paiva Rolla et al., 2014), lúa (Datta et al., 2012; Ito et

al., 2006), lúa mỳ (Saint Piere et al., 2012) đều cho kết quả cải thiện khả năng chịu hạn

một cách đáng kế ở các cây chuyển gen. HARDY là một thành viên khác của họ TF DREB

được biểu hiện trong mô sẹo. Sự biểu hiện quá mức của thành viên này có ảnh hưởng đa

tính trạng lên sự tăng trưởng của thực vật và hình thành rễ dày đặc và lá xanh dày. HARDY

cải thiện hiệu quả sử dụng nước thông qua cải thiện quang hợp và giảm sự thoát hơi nước

(Karaba et al., 2007).

Protein zinc finger (ZFP) là protein phổ biến nhất ở tế bào nhân thực, chức năng của

các protein này khá đa dạng, bao gồm bám DNA và RNA, hoạt hoá phiên mã, điều hoà quá

tình tự chết, điều hoà sự cuộn gấp và kết hợp protein. Nhiều protein ZFP được chứng minh

là có khả năng làm tăng khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi. Các TF này tham gia tự

động vào phản ứng stress thông qua hoạt động như chất hoạt hoá hoặc ức chế phiên mã

(Sakamoto et al. 2000, 2004). Các thành viên của họ ZFP như: OsZFP252 (Xu et al. 2008)

và ZAT10 (Xiao et al., 2009) tích cực tham gia vào việc điều hoà phản ứng mất nước. DST

là một chất điều hoà âm tính, cải thiện khả năng chịu hạn và mặn thông qua việc giảm biểu

hiện của gen (Huang et al., 2009). C2H2 ZFP, EAR và ZAT10 là thành viên của TF ZFP

cải thiện khả năng chịu hạn ở lúa (Yang et al., 2010).

Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu tập trung vào các yếu tồ điều khiển phiên mã liên

quan đến tính chịu hạn của thực vật cũng đang được các nhóm nghiên cứu quan tâm. Nhóm

nghiên cứu của Phạm Xuân Hội đã phân lập một số gen TF (OsNAC1, OsNAC6,

OsDREB1A, OsDREB2A, OsAREB1A và ZmDREB2A) từ các giống lúa, ngô Việt Nam và

chuyển gen vào cây mô hình lúa và Arabidopsis (Phạm Thu Hằng et al., 2014; Nguyễn

Duy Phương et al., 2014; Nguyễn Thị Phương Dung và Phạm Xuân Hội, 2010; Cao Lệ

Quyên et al., 2012; Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội, 2012 ). Một nhóm tác giả khác

cũng đã chuyển thành công các gen TF OsRAP2.4A, OsNLI-IF1 và cây lúa nhằm nghiên

cứu đặc tính của các yếu tố phiên mã này để tăng cường mức độ chịu hạn và mặn của cây

trồng (Nguyen Duy Phuong and Pham Xuan Hoi 2015, Nguyen Duy Phuong et al., 2014).

Cao Lệ Quyên và đồng tác giả (2009) đã phân lập được gen MtOsDREB2A từ thư viện

cDNA xử lý hạn của giống lúa Mộc tuyền. Đây là nguồn gen điều khiển chịu hạn từ chính

nguồn thực vật của Việt Nam, là cơ sở cho các nghiên cứu tính chịu hạn trên cây lúa. Nhóm

nghiên cứu của Nguyễn Văn Đồng cũng đã áp dụng thành công các gen yếu tố điều khiển

phiên mã NF-YB2, MYB trong việc chọn tạo giống ngô và đậu tương có khả năng chống

chịu với điều kiện khô hạn (Nguyễn Văn Đồng và Nguyễn Hữu Kiên, 2013; Nguyễn Văn

Đồng et al., 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2015). Gen DREB1A cũng được áp dụn g ở

đậu tương (Trần Thị Cúc Hoà, 2009; Trần Thị Cúc Hoà et al., 2015) để chọn tạo giống đậu

tương có khả năng chống chịu hạn.

1.2. Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở thực

vật

Basic leucine zipper (bZIP) là một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã lớn

nhất ở thực vật, chúng tham gia điều hòa nhiều chức năng tế bào, đặc biệt là quá trình điều

hòa trong đáp ứng stress và cảm ứng tín hiệu hormone (Kim, 2006). Tên của họ bZIP được

bắt nguồn từ việc protein này chứa một vùng cơ sở (basic region) và một motif leucine

zipper. Vùng cơ sở chứa 16 chuỗi bên amino acid được nhận biết bởi sự có mặt của một

motif bất biến N-x7-R/K-x9, trong khi đó Leu zipper bao gồm sự lặp lại 7 lần của amino

acid Leu hay các amino acid kị nước khác như Ile, Val, Phe, hay Met nằm chính xác ở vị

trí amino acid thứ 9 từ đầu C. Vùng cơ sở và vùng Leu zipper có chức năng riêng biệt.

Vùng cơ sở có nhiệm vụ là tín hiệu di chuyển vào nhân và bám đặc hiệu lên trình tự DNA,

vùng này vô cùng bảo thủ. Vùng Leu zipper là trình tự lưỡng cực ở dạng cuộn xoắn, đặc

trưng cho chức năng dimer hóa và kém bảo thủ hơn. Vùng trình tự Leu zipper này thực

hiện quá trình dimer hóa tương đồng (homo-) hoặc không tương đồng (hetero-) của các

protein bZIP. Các đơn phân bZIP ở dạng một chuỗi xoắn alpha dài, và khi bám với DNA

chứa trình tự lõi ACGT, thường là G-box (CACGTG), C-box (GACGTC) và A-box

(TACGTA), đầu N bám vào rãnh chính của sợi kép DNA, còn đầu C thì làm chức năng

dimer hóa để hình thành nên cấu trúc cuộn xoắn chồng gọi là Leu zipper (Nijhawan et al.,

2008).

Họ gen bZIP đã được phân lập và mô tả ở Arabidopsis (có 75 gen), lúa (89), đậu

tương (131), ngô (125) (Wei et al. 2012). Ở Arabidopsis, 75 gen khác nhau đã được xác

định và phân vào 10 nhóm dựa vào vùng bảo thủ của nó (Jakoby et al., 2002). Trong khi ở

lúa, 89 gen bZIP cũng được chia thành 11 nhóm (Nijhawa et al., 2008). Phần lớn các gen

bZIP liên kết với ABRE thuộc nhóm A, các gen trong nhóm này được cảm ứng mạnh mẽ

bởi ABA và stress phi sinh học khác (Jakoby et al., 2002, Lu et al., 2009).

Ở Arabidopsis, 75 gen mã hóa cho yếu tố phiên mã bZIP đã được phân lập nhưng

còn khoảng 50 gen chưa được miêu tả trong các dữ liệu. Trong số 7 gen thuộc nhóm A,

nhóm tham gia quá trình chống chịu stress và đáp ứng ABA thì chỉ có 3 gen tham gia vào

sự chịu hạn của cây. Đó là ABRE-binding protein 1 và 2 (AREB1 và AREB2) và ABRE

binding factor 3 (ABF3) (Jakoby et al., 2002). Một số nghiên cứu cho thấy ABA và stress

phi sinh học cảm ứng sự biểu hiện của ABF/AREB và ABA gây sự phosphoryl hóa của

AREB1/2. Sự photphoryl hóa này là cần thiết cho AREB1/2 cảm ứng gen sau nó và có thể

xảy ra ở vị trí phosphoryl hóa bằng casein kinase II nằm ở các domain bảo thủ. ABA và

stress hạn do đó có thể cảm ứng cả sự phiên mã và điều hòa sau dịch mã của nhiều gen

bZIP thuộc nhóm A.

Ở lúa, có gần 100 gen thuộc họ bZIP, trong đó 33 gen tham gia phản ứng với hạn

(Nijihawan et al., 2008). Trong số đó, 5 gen ABF3, OsbZIP23, OsbZIP46, OsbZIP 52 và

OsbZIP72 được cho là tạo nên khả năng thích ứng với hạn khi biểu hiện quá mức ở lúa.

Gen OsbZIP23 biểu hiện mạnh bởi stress phi sinh học, bao gồm muối, hạn, xử lí với ABA

và PEG. Gen OsbZIP23 khi biểu hiện quá mức ở thực vật cho thấy một sự điều hòa tăng

lên ở trên 800 gen tham gia trong các con đường chống chịu khác nhau. OsbZIP46 có thể

là yếu tố điều hòa dương tính của con đường tín hiệu ABA và chịu hạn ở lúa (Tang et al.,

2012). Một protein bZIP khác OsbZIP52 gần đây được cho là có khả năng tăng tính nhạy

cảm với hạn và lạnh (Liu et al., 2012). OsbZIP72 được công bố là có chức năng như một

chất điều hòa dương tính trong con đường truyền tín hiệu của ABA và hạt nảy mầm biểu

hiện quá mức OsbZIP72 cho thấy tăng khả năng chịu hạn.

1.3. Cấu trúc và chức năng của gen ZmbZIP72

Gen mã hóa ZmbZIP72 dài 2164bp, gồm 3 intron, giống với sự phân bố introns ở

hầu hết các gen bZIP nhóm A ở Arabidopsis và lúa. Vùng promoter của gen ZmbZIP72

(1670bp upstream) có nhiều các yếu tố hoạt động cis đáp ứng với stress và một vài đáp ứng

với ánh sáng cũng được tìm thấy. Điều đó gợi ý rằng ZmbZIP72 có thể tham gia nhiều đáp

ứng stress và điều khiển bởi một cơ chế điều hòa phức tạp. Tuy nhiên chưa có bằng chứng

cho thấy ZmbZIP72 tham gia đáp ứng lạnh.

Gen ZmbZIP72 chứa một khung đọc mở dài 894bp mã hóa cho một chuỗi

polypeptide dài 297 aa, 180bp ở vùng 5’ không dịch mã và 226bp ở vùng 3’ không dịch

mã. Trình tự amino acid suy diễn của ZmbZIP72 được tính toán tương ứng với protein có

khối lượng 32,4 kDa và chỉ số pI là 9,39. Protein suy diễn có trình tự amino acid tương

đồng cao với protein của lúa là OsbZIP72 (Sheng et al., 2012).

Protein ZmbZIP72 chứa một domain bám DNA bZIP điển hình ở đầu C và 4 trình

tự bảo thủ phân bố ở đầu N hoặc C. Một vài vị trí hoạt động đích của kinase, ví dụ

R/KXXS/T cho CDPK, S/TXK/R cho PKC, nằm trong các vùng bảo thủ. Amino acid vị trí

từ 23 đến 63 là cần thiết cho hoạt động hoạt hóa phiên mã của gen ZmbZIP72.

Sản phẩm phiên mã của gen ZmbZIP72 được tìm thấy ở tất cả các cơ quan, nhưng

nồng độ cao nhất là ở rễ của cây mới nảy mầm và trưởng thành và thấp nhất ở thân. Protein

ZmbZIP72 hoạt động ở nhân. Tín hiệu chuyển vào nhân được tìm thấy ở domain bảo thủ

bZIP của ZmbZIP72 giống với các nghiên cứu trước (Fujita et al., 2005, Xiang et al., 2008,

Zou et al., 2008, Lu et al., 2009). Để hoạt động thì bZIP cần được phosphoryl hóa phụ

thuộc ABA nhờ protein kinase. Một vài gốc serin ở vùng bảo thủ có thể là vị trí được

phosphoryl hóa. Đồng thời, chúng có thể cần được dimer hóa tương đồng (homo) hoặc

không tương đồng (hetero-) như ở Arabidopsis và lúa.

Khi chuyển cDNA ZmbZIP72 vào Arabidopsis dưới sự điều khiển của promoter

CaMV 35S, dòng chuyển gen thể hiện một số đặc điểm của sự thích ứng với hạn như: sự

nảy mầm của hạt bị ức chế mạnh hơn so với hạt đối chứng trong điều kiện xử lí với ABA

và stress thẩm thấu. Cây trồng trong đất không được tưới nước trong 2 tuần cho thấy lá

tươi và xanh hơn so với cây đối chứng, đồng thời nhanh phục hồi khi được tưới lại với tỉ

lệ sống sót cao hơn đối chứng. Những kết quả kiểu hình và thay đổi sinh lý này cho thấy

sự biểu hiện quá mức ZmbZIP72 ở Arabidopsis chuyển gen có thể làm tăng đáng kể khả

năng thích ứng với khô hạn. Không những thế, ZmbZIP72 có thể hoạt hóa sự biểu hiện của

một vài gen cảm ứng bởi ABA. ZmbZIP72 làm tăng sự biểu hiện của các gen như RD29B,

RAB18, HIS1-3, các gen được cảm ứng bởi các stress khác nhau qua con đường phụ thuộc

ABA, và các gen này biểu hiện càng cao thì tính chống chịu càng cao. Điều này chứng tỏ

ZmbZIP72 hoạt động như là yếu tố hoạt hóa phiên mã dương tính trung gian ABA (ABA-

mediating). Một vài nghiên cứu chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức liên tục của gen mã hóa

yếu tố phiên mã thường gây ra các kiểu hình không mong muốn, như là sự sinh trưởng

chậm của cây (Kasuga et al., 1999; Kim et al., 2004). Tuy nhiên, các dòng Arabidopsis

chuyển gen biểu hiện quá mức ZmbZIP72 không gây ra hậu quả bất lợi nào đến sự sinh

trưởng và phát triển của cây như chiều cao hay kiểu hình so với kiểu dại. Do đó protein

ZmbZIP72 có tiềm năng ứng dụng vào trồng trọt để tăng khả năng chống chịu stress, đặc

biệt là điều kiện khô hạn (Sheng et al., 2012).

1.4. Cây ngô và vấn đề chịu hạn

Ngô là cây lương thực quan trọng đối với nền kinh tế toàn cầu, có tiềm năng năng

suất cao và được trồng phổ biến ở nhiều nước. Trên thế giới, ngô chỉ đứng thứ ba về diện

tích sau lúa mì và lúa nước nhưng ngô lại dẫn đầu về năng suất và sản lượng. Bên cạnh đó,

ngô còn là cây điển hình được ứng dụng nhiều thành tựu khoa học về các lĩnh vực di truyền

học, chọn giống, công nghệ sinh học,… vào công tác nghiên cứu và sản xuất (Ngô Hữu

Tình, 2009). Theo USDA dự đoán, sản lượng ngô ước tính sẽ đạt 1,011 tỷ tấn trong niên

vụ 2016/2017, tăng 9,58% so với niên vụ 2015/2016 (968,85 triệu tấn) (USDA-FAS, 2017).

Bảng 1.1: Sản lượng ngô trên toàn thế giới qua các niên vụ 2011/2012 – 2016/2017

Niên vụ Sản lượng (tấn)

2016/2017 1,011,068,000

2015/2016 968,855,000

2014/2015 1,013,462,000

2013/2014 990,790,000

2012/2013 869,735,000

2011/2012 889,782,000

(Nguồn: FAS/USDA, 2017)

Quan sát sản lượng ngô trên thế giới qua các niên vụ (bảng 1.1), chúng ta có thể

nhận thấy rằng sản lượng ngô trên thế giới tăng qua các niên vụ từ 2011/2012 đến

2014/2015 và đến niên vụ 2014/2015 đã đạt hơn 1 tỷ tấn. Có được kết quả trên, trước

hết là nhờ ứng dụng rộng rãi giống ngô biến đổi gen và giống ngô lai, đồng thời

không ngừng cải thiện các biện pháp kỹ thuật canh tác. Tuy nhiên, trong năm

2015/2016, sản lượng ngô đã bị giảm đi 9.55%. Nguyên nhân chính được cho là do tình

trạng hạn hán diễn ra tại các nước sản xuất ngô.

Ở ngô, hạn hán gây ảnh hưởng đến toàn bộ chu trình sống. Tỷ lệ nảy mầm, tốc độ

nảy mầm, hình thành cây con và sức sống của cây con bị hạn chế do hạn hán ở giai đoạn

phát triển sớm. Khi bị thiếu nước, cây ngô biểu hiện một loạt các đặc điểm như toàn bộ

thân và lá sẽ chuyển từ màu xanh sang màu xanh xám, các lá có hiện tượng cuộn lại, khí

khổng đóng, quang hợp giảm, giảm cố định carbon qua đó sinh trưởng bị chậm lại. Giai

đoạn sinh sản của ngô cũng bị hạn chế do hạn hán. Sự phát triển của cờ và bắp, quá trình

thụ phấn, sự phát triển của phôi, sự phát triển của nội nhũ và hạt bị ảnh hưởng nặng nề bởi

stress hạn. Nếu cây gặp hạn trước khi ra hoa 7 – 10 ngày, sự phát triển của bắp sẽ chậm

hơn cờ, do đó quá trình phu râu sẽ chậm hơn sự tung phấn, điều này dẫn đến khả năng thụ

phấn thấp. Nếu hạn nặng ở giai đoạn ra hoa có thể dẫn đến việc mất hoàn toàn bắp và làm

mất năng suất (Chapman, Edmeades, 1999). Nếu hạn xảy ra trong thời gian tạo hạt, bắp

ngô sẽ ít hàng hạt, và các hàng không có nhiều hạt (Edmeades et al., 2000). Như vậy, hạn

hán dù ngắn hay dài, dù nặng hay nhẹ cũng đều ảnh hưởng không nhỏ đến sản lượng và

năng suất của ngô.

Các cơ chế chống chịu khác nhau đã được phát triển ở ngô giống như các cây trồng

khác, cho phép chúng tồn tại một cách hiệu quả trong điều kiện hạn hán. Thoát hạn, tránh

hạn và chịu hạn là các cơ chế khác nhau của thực vật làm việc trong điều kiện hạn hán. Các

giống ngô thoát hạn điều chỉnh đời sống của chúng hoàn thành trước khi bắt đầu hạn hán

và các giống ngô tránh hạn tránh không bị hạn bằng cách giảm tổn thất nước hoặc tăng

lượng nước hấp thụ. Các giống ngô chịu hạn duy trì sự tăng trưởng và phát triển của chúng

cùng với năng suất hạt trong điều kiện hán hán.

Do nhu cầu về ngô ngày càng tăng và tình trạng khan hiếm nước ngày càng trầm

trọng, cần phải nâng cao mức độ chịu hạn đối với cây ngô. Các nhà khoa học và người

nông dân có thể sử dụng nhiều phương thức khác nhau để làm tăng khả năng sống sót của

trồng trong điều kiện hạn hán. Các chiến lược khác nhau đã được sử dụng để cải thiện khả

năng chống lại stress hạn hán của ngô như: chiến lược quản lý và chiến lược sinh học. Các

chiến lược quản lý bao gồm việc sử dụng nguồn tài nguyên nước hợp lý và áp dụng các

biện pháp nông học tiết kiệm nước. Các chiến lược sinh học được ưa thích hơn các chiến

lược quản lý do hiệu quả kinh tế lâu dài. Cách tiếp cận sinh học được thực hiện dưới nhiều

hình thức khác nhau như phương pháp lai tạo giống truyền thống và phương pháp sử dụng

công nghệ gen. Các giống ngô lai chịu hạn được trồng thực tế ở nhiều nước châu Phi. Với

nghiên cứu chuyển gen chịu hạn cho ngô thì năm 2013, Monsanto đã công bố giống ngô

chuyển gen chịu hạn đầu tiên DroughtGard MON 87460, chứa gen shock lạnh (CspB) được

phân lập từ Bacillus subtillis. Ngoài ra, gen HVA1 và mtlD dưới sự điều khiển của promoter

Act1 ở cây ngô chuyển gen đã cho thấy sự cải thiện khả năng chịu hạn và chịu mặn (Nguyen

et al., 2013). Một số gen mã hóa cho các protein tham gia vào chuyển hóa đường và tổng

hợp các hợp chất phản ứng cũng đã được phân lập từ vi khuẩn như glutamate

dehydrogenase (gdhA); choline dehydrogenase (betA) từ E.coli, trehalose synthase (TPS)

của vi sinh vật cũng đã được chuyển vào hệ gen ngô nhằm nâng cao tính chịu hạn của cây

và đã thu được những kết quả khả quan (Chun-lin et al., 2011; Lightfoot et al., 2007; Quan

et al., 2004). Gần đây, nhóm nghiên cứu của Zou đã công bố một nghiên cứu chuyển gen

AtCBF4 – một yếu tố phiên mã không phụ thuộc ABA- nhằm nâng cao tính chịu hạn của

cây ngô và đã đạt được hiệu quả tích cực khi biểu hiện bằng promoter cảm ứng hạn RD29A

(Zou et al., 2014). Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dòng ngô chịu hạn đang được đầu tư

và tập trung nghiên cứu. Nhóm nghiên cứu của Bùi Mạnh Cường đã xác định được một số

chỉ thị SSR liên kết với các gen chịu hạn và một số chỉ thị liên quan đặc tính chịu hạn ở

ngô (Bùi Mạnh Cường, 2007). Theo báo cáo của Lương Văn Vàng (2012), đã lựa chọn

được một số dòng ngô chịu hạn tốt, thích ứng rộng, năng suất khá và ổn định: VS36, H119,

VS71 và CN11-2. Các giống ngô lai LVN61, LVN14 và VN8960 phát triển tốt trong điều

kiện hạn và có năng suất cao (Nguyễn Đức Thuận et al., 2008). Dựa trên đánh giá kiểu

hình và maker phân tử, nhóm nghiên cứu Phan Đức Thịnh đã chọn ra được 5 dòng TP17,

TP12, TP2, TP5 và TP4 ưu tú là những dòng phát triển từ giống ngô địa phương Việt Nam

có thể sử dụng để lai thử khả năng kết hợp chọn tạo giống ngô lai chịu hạn (Phan Đức

Thịnh et al., 2013).

1.5. Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen

Nhu cầu ngô nguyên liệu luôn gia tăng là động lực thúc đẩy các nhà khoa học nghiên

cứu lai tạo ra nhiều giống ngô đáp ứng với các điều kiện sống khác nhau. Những tiến bộ

vượt bậc trong công nghệ gen đã cho ra đời nhiều giống ngô biến đổi gen có khả năng

chống chịu thuốc diệt cỏ, kháng côn trùng, chịu hạn, đạt năng suất cao hoặc có các tính

chất theo ý muốn.

Diện tích trồng ngô biến đổi gen phát triển mạnh trên thế giới bắt đầu từ năm 1996,

tính đến năm 2016 đã đạt 60,6 triệu hecta, tăng 13% so với năm 2015. Diện tích tăng lên

là do giá cả thị trường thuận lợi, nhu cầu về năng lượng sinh học và thức ăn gia súc cũng

như sự gia tăng của sâu đục thân ngô ở châu Âu. Bên cạnh đó, việc chấp nhận các mặt tích

cực của ngô chịu hạn ở Mỹ và Châu Phi năm 2017 sẽ khiến cho việc chấp nhận ngô chuyển

gen tăng lên ở nhiều nước phải đối mặt với stress hạn hán do biến đổi khí hậu. Đồng thời,

ngô biến đổi gen cũng đã mang lại lợi ích về thu nhập cho nông dân trong suốt 20 năm từ

1996 đến 2015 là 57,1 tỷ đô la Mỹ (USD) và chỉ riêng trong năm 2015 là 6,25 tỷ USD

(Brookes and Barfoot, 2017). Trong 60,6 triệu hecta cây chuyển gen ngô thì có 6 triệu hecta

trồng cây chuyển gen kháng sâu, 7 triệu hecta trồng cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ

và 47.7% hecta trồng cây chuyển gen có cả hai đặc tính trên. Cây ngô chuyển gen được

trồng ở 16 quốc gia, năm quốc gia đứng đầu bao gồm: Mỹ (30 triệu hecta), tiếp sau đó là

Brazil (15.6 triệu hecta), Argentina (4.7 triệu hecta), Nam Phi (2.2 triệu hecta), và Canada

(1.5 triệu hecta). Các quốc gia trồng dưới 1 triệu hecta bao gồm Phillipines, Paraguay,

Spain, Colombia, Uruguay, Việt Nam, Honduras, Bồ Đào Nha, Chile, Slovakia và Cộng

hoà Séc. Trong số 185 triệu hecta trồng ngô trên toàn cầu (FAOSTAT, 2016), thì diện tích

trồng cây ngô chuyển gen chiếm 33%.

Ở Việt Nam, ngô biến đổi gen là cây trồng chuyển gen đầu tiên được thương mại

hoá với diện tích tối thiểu là 3500 heta vào năm 2015. Năm 2016, nông dân Việt Nam đã

chấp nhận công nghệ này khá nhanh với ước tính diện tích trồng ngô biến đổi gen tăng lên

10 lần khoảng 35000 hecta với các giống mang đồng thời hai đặc tính kháng sâu bệnh và

khác thuốc diệt cỏ. Vào năm 2015, có 14 sự kiện ngô chuyển gen được phê duyệt, đến năm

2016, có 3 sự kiện được phê duyệt làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bao gồm sự kiện

5370 và MIR604 kháng côn trùng và TC1507 kháng côn trùng và thuốc diệt cỏ. Có 4 sự

kiện được chấp nhận được trồng vào năm 2015 bao gồm: Bt11 x GA21, GA21, MON8904

và NK603. Các thử nghiệm trên đồng ruộng về các sự kiện ngô chuyển gen được tiến hành

tại các địa điểm khác nhau trong nước như là một điều kiện tiên quyết để các sự kiện này

được thương mại hoá. Một thử nghiệm trên đồng ruộng cho MON810 bắt đầu vào

17/03/2017 do Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam và Pioneer Hi-bred Vietnam thực

hiện ở huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên. Một thử nghiệm khác được thực hiện bởi Viện

Bảo vệ thực vật kết hợp với Công ty TNHH Syngenta Việt Nam về ngô biến đổi gen kháng

côn trùng MIR162 cũng như đặc tính kháng côn trùng và thuốc diệt cỏ Bt11 x IR162 x

GA21 ở Sơn La bắt đầu từ ngày 2/6/2016 (CBU, 2016)

Các nghiên cứu phân lập gen và tạo cây chuyển gen chịu hạn ở Việt Nam có thể

nói là đang khá mới mẻ và đang ở giai đoạn ban đầu nên các thành tựu đạt được chưa

nhiều. Nhóm nghiên cứu của Phạm Xuân Hội và cộng sự đã phân lập một số gen TF

(OsNAC1, OsNAC5, OsNAC6, OsNAC10, OsDREB1A , OsAREB1A và ZmDREB2A) từ

các giống lúa, ngô Việt Nam và chuyển gen vào cây mô hình lúa và Arabidopsis (Phạm

Thu Hằng et al., 2014; Nguyễn Duy Phương et al., 2014; Nguyễn Thị Phương Dung và

Phạm Xuân Hội, 2010; Cao Lệ Quyên et al., 2012; Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội,

2012 ). Các gen chịu hạn ZmNF-YB2 và IPT đã được chuyển thành công vào các giống ngô

chọn lọc cho kết quả chuyển nạp ổn định và đồng đều trên hai dòng ngô VH1 và C8H9

(Nguyễn Văn Đồng và Nguyễn Hữu Kiên, 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2013; Nguyễn

Văn Đồng et al., 2015). Huỳnh Thị Thu Huệ và cộng sự cũng đã chuyển thành công gen

modiCspB vào ba dòng ngô Việt Nam V152N, C436 và C7N (Huỳnh Thị Thu Huệ et al.,

2014).

1.6. Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Hiện nay, có nhiều phương pháp được các nhà khoa học sử dụng để chuyển gen vào

thực vật như: phương pháp gián tiếp sử dụng A. tumefaciens, phương pháp trực tiếp sử

dụng xung điện, vi tiêm, xử lý polyethylene glycol (PEG) và dùng súng bắn gen. Mỗi

phương pháp chuyển gen đều có những ưu, nhược điểm riêng tùy vào từng đối tượng

nghiên cứu khác nhau. Trong đó, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens

đem lại hiệu quả cao và ít tốn kém nhất. Ưu điểm lớn của phương pháp chuyển gen thực

vật thông qua A. tumefaciens là một lượng nhỏ bản sao (thường là 1 hoặc 2) kích thước

tương đối lớn (có thể lớn hơn 10kb) của T-DNA với các đầu xác định được ghép vào hệ

gen thực vật với sự tái sắp xếp tối thiểu, tạo ra cây chuyển gen chất lượng cao (Ishida et

al., 2007). Việc chuyển gen vào thực vật hai lá mầm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đã

được biết đến như là một cơ chế đưa DNA mong muốn vào thực vật với hiệu quả cao. Tuy

nhiên, trước đây, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefacines không được

xem là hiệu quả với cây một lá mầm (Raineri et al., 1990). Một trong những nguyên nhân

dẫn đến sự chậm trễ trong các nghiên cứu biến nạp gen vào cây một lá mầm thông qua A.

tumefaciens là do thiếu phản ứng gây tổn thương hoặc phản ứng gây tổn thương kém ở mô

tế bào của cây một lá mầm (Repellin et al., 2001). Phản ứng này là một trong các yếu tố

quan trọng trong quá trình chuyển gen. Khi tế bào bị tổn thương, chúng tiết ra các hợp chất

phenol: acetosyringone(AS), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và gắn kết vi

khuẩn với tế bào thực vật. Cơ chế nhận biết này được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A.

tumefaciens với cây hai lá mầm, ở cây một lá mầm chỉ có ở 1 ít loài. Vì vậy, khi tiến hành

chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua A. tumefaciens, người ta thường bổ sung AS.

Năm 1993, cây lúa là cây một lá mầm chuyển gen đầu tiên được thu nhận nhờ lây nhiễm

phôi non với A. tumefaciens (Chan et al., 1993); tiếp đó là nhiều thành công chuyển gen

vào các loại ngũ cốc quan trọng khác như ngô, lúa mì, lúa mạch và cao lương. Các yếu tố

quan trọng cho những thành công này gồm tối ưu hóa loại mô thực vật chuyển gen, lựa

chọn vector, lựa chọn chủng A. tumefaciens và tối ưu kĩ thuật nuôi cấy mô. Ngày nay,

chuyển gen thông qua A. tumefacien khuyến khích được sử dụng trên các giống ngô do đáp

ứng nuôi cấy mô tốt.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu và hoá chất nghiên cứu

2.1.1. Mẫu thực vật

Giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) là giống ngô địa phương của Việt Nam có

khả năng chịu hạn tốt do Viện Nghiên cứu Ngô sàng lọc và cung cấp. Hạt ngô được gieo

mầm và phát triển đến giai đoạn ba lá thì xử lý hạn nhân tạo theo phương pháp của Sheng

và cộng sự (2012). Mẫu tại các thời điểm: 3 giờ và 6 giờ được thu giữ trong Nitơ lỏng và

bảo quản ở -70oC.

2.1.2. Các vật liệu khác

Các vector và chủng vi khuẩn được sử dụng gồm: vector tách dòng pJET 1.2, vector

tách dòng trung gian pRTL2 mang promoter RD29A, vector biểu hiện thực vật

pCAMBIA1300, chủng vi khuẩn E. coli DH5α, E. coli DH10β, chủng vi khuẩn

A.tumefaciens EHA105. Các vật liệu này được được lưu giữ tại phòng Đa dạng sinh học

hệ gen - Viện Nghiên cứu hệ gen.

2.1.3. Hoá chất

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu được thiết kế dựa trên trình tự tham chiếu

trên ngân hàng gen. Trình tự mồi thể hiện ở bảng 2.1.

Bảng 2.1: Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự mồi

ZmbZIP72 F 5’ AAGGGTTTCGGCTCCGTGAAC 3’

ZmbZIP72 R 5’ TAGCAAGTGCAAGTCATGTGC 3’

ZmbZIP72 SacI F 5’ ATGAGAGCTCATGGACGAGCTG 3’

ZmbZIP72 SacI R 5’ TAATGAGCTCTCACCAGGGGGC 3’

HptF 5’ AAAGCCTGAACTCACCGC 3’

HptR 5’ GCTTTCCACTATCGGCGA 3’

TestRD29AR 5’ TGTCCCTTTATCTCTCTCAGTCTC 3’

ZmbZIP72SacIR 5’ TAATGAGCTCTCACCAGGGGGC 3’

Plant actinF 5’ AGCTAGCATACTCGAGGTCAT 3’

Plant actin R 5’ TATCCTCGGCGTCAGCCATC 3’

- Kit tổng hợp cDNA: First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real – Time PCR của

hãng Affymetrix.

- Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: DeamTaq polymerase của hãng Thermo

Scientific,…

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo

Scientific.

- Hóa chất sử dụng trong việc chọn dòng: Clone JET for cloning PCR Kit; LB; agar;

các dung dịch tách chiết plasmid: Sol I (50 mM glucose, 25 mM Tris-base, 10mM

EDTA pH 8,0), Sol II (0,2M NaOH, 1% SDS), Sol III (3M CH3COOK, 11,5%

Ch3COOH); Ampicillin; các enzyme giới hạn: BamHI, BglII, HindIII, SacI.

- Các hóa chất chloroform, isoamyl alcohol, Tris, acetic acid, EDTA, cồn tuyệt đối

và các hóa chất chuyên dụng khác: Hãng Merck (CHLB Đức).

- Các hoá chất sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Thành phần môi trường sử

dụng nuôi cấy mô thực vật được thể hiện ở bảng 2.2.

Bảng 2.2: Thành phần các môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

(Frame et al. 2015)

Môi trường Thành phần

Lây nhiễm MS + 2,4D 1,5mg/l + L-proline 0,7g/l + sucrose 68,4 g/l + glucose 36 g/l

lỏng + AS (100uM).

pH 5,5

Nuôi ủ - đồng MS + 2,4D 2mg/l + L-proline 0,7 g/l + sucrose 30 g/l + phytagel 2,4 g/l

nuôi cấy + AgNO3 0,85 mg/l + AS (100uM).

pH 5,8

Nuôi phục MS + 2,4D 2mg/l + L-proline 0,7 g/l + sucrose 30 g/l + MES 0,5 g/l +

hồi phytagel 2,4g/l + cefotaxim 100mg/l + vancomycin 100mg/l + AgNO3

0,85 mg/l

pH 5,8

Chọn lọc 1 MS + 2,4D 1,5mg/l + L-proline 0,7 g/l + MES 0,5 g/l + sucrose 30 g/l +

phytagel 2,4 g/l + cefotaxim 100mg/l + vancomycin 100mg/l + AgNO3

0,85 mg/l + hygromycin 1,5 mg/l.

pH 5,8

Chọn lọc 2 MS + 2,4D 1,5mg/l + L-proline 0,7 g/l + MES 0,5 g/l + sucrose 30 g/l +

phytagel 2,4 g/l + cefotaxim 100mg/l + vancomycin 100mg/l + AgNO3

0,85 mg/l + hygromycin 3 mg/l.

pH 5,8

Tái Sinh 1 MS + myo-inositol 100mg/l + sucrose 60 g/l + phytagel 2,4 g/l +

cefotaxim 100mg/l + vancomycin 100mg/l + hygromycin 3 mg/l.

pH 5,8

Tái Sinh 2 MS + myo-inositol 100mg/l + sucrose 30 g/l + casein 400mg/l + kinetin

1mg/l + nước dừa 150 ml/l + phytagel 2,4 g/l.

pH 5,8

Môi trường MS + myo-inositol 100mg/l + sucrose 30 g/l + casein 100mg/l NAA

ra rễ 1mg/l + IBA 0.1 mg/l + phytagel 2,4 g/l.

pH 5,8

2.1.4. Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị được sử dụng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam. Bao gồm: Tủ lạnh 20C (Sanyo, Nhật Bản), Cân phân tích

(Mettler Toledo, Thụy Sỹ), bể ổn nhiệt (Memmert, Đức), máy làm khô chân không

(Concentrator Plus) (Eppendorf, Đức), máy li tâm lạnh Eppendorf 5424R (Eppendorf,

CHLB Đức), máy li tâm lạnh đa năng 5810R (Eppendorf, Đức), máy chạy điện di

PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy PCR Master Cycler Pro S (Eppendorf, Đức), máy soi

gel M-26 UVP (Mỹ), máy chụp ảnh gel (GelDoc) UVP (Mỹ), máy ủ nhiệt Thermomixer C

(Eppendorf, Đức), máy giải trình tự ABI 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies, Nhật),

máy biến nạp xung điện Gene Pulser (Bio-Rad, Mỹ), box cấy vi sinh vật The Esco

Airstream® Class II Biological Safety Cabinet (Esco, Singapore). Phòng nuôi cấy mô vô

trùng, box cấy thực vật Esco laminar flow cabinets ( Esco, Singapore).

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ thực vật

DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Roger và đồng tác giả nhưng

có cải tiến cho phù hợp với mô lá ngô, bao gồm các bước sau:

1 Nghiền lá tươi thành bột mịn bằng cối chày sứ đã khử trùng trong nitơ lỏng. Cho

toàn bộ bột lá vào ống eppendorf 1.5ml.

2 Bổ sung đệm chiết (1ml cho 100g lá) vào ống. Đảo ống vài lần hoặc vortex nhẹ

để đệm chiết và bột lá trộn đều với nhau. Ủ hỗn hợp ở 65°C trong 60 phút.

4 Để hỗn hợp 15 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm mẫu ở 12.000 vòng/phút trong

10 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên chuyển sang ống mới.

5 Loại protein và tạp chất bằng hỗn hợp phenol/choloroform/isoamyl alcohol (v:v:v

= 25:24:1). Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên.

6 Bổ sung RNase, ủ dịch thu được ở 4˚C, 1 giờ. Dịch thu tiếp tục được tinh sạch

bằng hỗn hợp choloroform/isoamyl alcohol (v:v =24:1) . Ly tâm 12.000 vòng/phút

trong 20 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên.

7 Tủa DNA trong dịch thu được bằng 2 lần thể tích EtOH 100% , 0.3M CH3COONa

trong ít nhất 3 giờ ở -20˚C.

8 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4˚C, loại bỏ dịch, thu kết tủa.

9 Rửa kết tủa bằng cồn 70%. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4˚C, thu kết

tủa.

10 Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút. Hòa lại tủa trong nước không chứa

DNase. Bảo quản DNA ở -20⁰C.

2.2.2. Tách chiết RNA tổng số từ thực vật

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tách chiết RNA theo phương pháp sử dụng TRI

Reagent có cải tiến phù hợp với mẫu ngô. Quy trình thực hiện như sau:

1 Nghiền 2- 3 g mẫu thành bột mịn bằng cối chày sứ đã khử trùng trong nitơ lỏng.

2 Bổ sung ngay 700 µl Trizol, trộn đều, sau đó chuyển sang ống eppendorf 1.5ml,

để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

3 Ly tâm 12.000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC, thu dịch ở pha trên và chuyển sang

ống eppendorf mới.

4 Bổ sung 300 µl Chloroform vào mỗi ống. Lắc mạnh ống bằng tay hoặc vortex

trong 15 – 20 giây sau đó chuyển sang máy ly tâm, ly tâm 12.000 vòng/phút trong

15 phút ở 4oC.

5 Sau khi ly tâm xong, hút dịch ở pha trên một cách cẩn thận, chuyển sang ống

eppendorf 1.5 ml mới.

6 Bổ sung 300 µl 2-propanol lạnh vào mỗi ống. Ủ mẫu ở -20oC trong 1giờ để tủa

RNA tổng số.

7 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch, thu tủa RNA.

8 Rửa kết tủa bằn Ethanol 70%. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC và

loại bỏ dịch.

9 Làm khô tủa RNA tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút.

10 Hòa tan RNA tổng số trong 50µl nước đã được xử lý DEPC

11 Kiểm tra RNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và đo quang

phổ ở bước sóng 260nm. RNA tổng số được bảo quản ở -80oC.

2.2.3. Sinh tổng hợp cDNA sợi thứ nhất

Trong di truyền học, cDNA (complementary DNA) là đoạn DNA sợi đôi được tổng

hợp dựa trên khuôn mẫu mRNA xúc tác bởi enzyme phiên mã ngược (reverse

transcriptase). Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp sợi cDNA thứ nhất dựa trên khuôn

mẫu mRNA bằng kit tổng hợp cDNA của hãng Affymetrix: First-Strand cDNA Synthesis

Kit for Real – Time PCR. Thành phần phản ứng tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bao gồm: 2

µl primer mix 10pM, 1 µg RNA tổng số, 2 µl 10X RT Buffer, 2 µl dNTPs 10mM, 1 µl

RNase Inhibitor, 1 µl M-MLV RT, và H2O. Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt

PCR Master Cycler Pro S với chu trình nhiệt như sau: 44oC - 60 phút, 92oC - 10 phút. Các

cDNA sau khi được tổng hợp được kiểm tra bằng phản ứng PCR nhân gen Actin từ cặp

mồi Plant Actin F/R và được lưu giữ ở tủ -20oC.

2.2.4. Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR

PCR được tiến hành với thể tích là 25 µl. Bao gồm các thành phần: 2,5 µl 10X

DreamTaq Buffer, 1 µl dNTPs 10mM, 1 µl mồi xuôi 10pM, 1 µl mồi ngược 10pM, 1 µl

DNA khuôn (20 ng – 100ng), 0.2 µl DreamTaq DNA polymerase (5U/µl) và nước. Phản

ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Master Cycler Pro S với chu trình nhiệt như

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen Actin: 950C - 3 phút; 30 chu kỳ : 95oC

- 45 giây, 54oC - 45 giây, 72oC - 30 phút; 72oC - 10 phút; 4oC.

- Chu trình nhiệt với phản ứng RT-PCR phân lập gen ZmbZIP72: 950C - 3 phút; 30

chu kỳ: 95oC - 45 giây, 60oC - 45 giây, 72oC - 1 phút; 72oC -10 phút; 4oC.

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng CDS gen ZmbZIP72: 950C - 3 phút;

30 chu kỳ: 95oC - 30 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - 1 phút; 72oC - 10 phút; 4oC.

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen hygromycin: 950C-3 phút; 30 chu kỳ:

95oC - 30 giây, 54oC- 30 giây, 72oC - 50 giây; 72oC - 8 phút; 4oC.

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng từ cuối promoter RD29A đến cuối gen

ZmbZIP72: 950C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95oC - 30 giây, 54oC - 30 giây, 72oC - 1phút

15 giây; 72oC - 8 phút; 4oC.

2.2.5. Tinh sạch các đoạn DNA trên gel agarose

Chúng tôi sử dụng GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific để tinh

sạch sản phẩm PCR. Quy trình thực hiện:

1. Điện di sản phẩm PCR cần tinh sạch trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế: 100V

2. Sau khi điện di, nhuộm bản gel trong EtBr trong 10 phút, sau đó cắt đoạn gel có

chứa đoạn DNA cần tinh sạch chuyển sang ống eppendorf 1.5ml.

3. Bổ sung Binding Buffer vào ống eppendorf chứa gel (V:W = 1:1).

4. Ủ hỗn hợp gel + Binding Buffer ở 55oC trong 10 phút, cho tới khi miếng gel tan

hoàn toàn. Trong lúc ủ, cách 2 – 3 phút dảo ống một lần để đảm bảo gel tan đều.

Sau khi gel tan hoàn toàn, đem ống eppendorf đi vortex và spindown trước khi

chuyển lên cột tinh sạch.

5. Chuyển dung dịch gel đã tan ở bước 4 sang cột tinh sạch. Ly tâm 1 phút, 12000

vòng/phút ở 24oC. Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống.

6. Bổ sung 100 µl Binđing Buffer vào cột tinh sạch. Ly tâm 1 phút, 12000 vòng/phút

ở 24oC. Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống.

7. Bổ sung 700 µl Wash Buffer vào cột tinh sạch. Ly tâm 1 phút, 12000 vòng/phút ở

24oC. Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống.

8. Ly tâm cột tinh sạch không chứa gì trong 1 phút, 12000 vòng/phút ở 24oC để loại

bỏ hoàn toàn Wash Buffer.

9. Bỏ dịch, chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorf 1.5ml mới. Bổ sung 30 µl H2O.

10. Bỏ cột tinh sạch, DNA thu được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%và đo nồng

độ. Sản phẩm sau tinh sạch được lưu giữ ở tủ lạnh – 20oC.

2.2.6. Tạo dòng gen và thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72

2.2.6.1. Tạo dòng gen trong vector tách dòng pJET1.2

Chúng tôi sử dụng bộ kit: CloneJET PCR Cloning Kit để xử lý đầu bằng đoạn gen

và ghép nối đoạn gen với vector. Quy trình thực hiện như sau:

1. Xử lý đầu bằng đoạn gen. Thành phần phản ứng: 10 µl 2X reaction buffer, 1 µl sản

phẩm PCR, 1 µl DNA blunting enzyme, 18 µl H2O.

2. Ủ hỗn hợp ở 70oC trong 5 phút sau đó đặt ngay lên đá.

3. Bổ sung thêm các thành phần sau vào trong hỗn hợp ban đầu: 1 µl pJET 1.2/blunt

Cloning Vector, 1 µl T4 DNA Ligase.

4. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 22oC trong 5 phút. Sản phẩm sau ghép nối được sử dụng để

biến nạp ngay hoặc được giữ trong tủ lạnh – 20oC.

2.2.6.2. Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72

Vector trung gian pRTL2 RD29A mang promoter RD29A và terminator 35S được

cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn SacI. Đồng thời, plasmid tái tổ hợp pJET

1.2_ZmbZIP72 cũng được cắt bằng enzyme giới hạn SacI để thu đoạn gen ZmbZIP72. Phản

ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 16 giờ.

Các đoạn DNA này sau đó được tinh sạch bằng kit thôi gel GeneJET Gel Extraction

Kit của hãng Thermo Scientific. Đoạn ZmbZIP72 được ghép nối với vector pRTL2 đã mở

vòng nhờ sự xúc tác của enzyme T4 ligase ở 22oC trong 1 giờ. Sản phẩm ghép nối sau đó

được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β.

2.2.6.3. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72

Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72

Hình 2.1.: Sơ đồ vector biểu hiện mang gen ZmbZIP72

Để thiết kế vector biểu hiện gen ZmbZIP72, chúng tôi chuyển cấu trúc biểu hiện gen

ZmbZIP72 (promoter RD29A:: ZmbZIP72:: terminator 35S) thu được khi cắt vector trung

gian pRTL2 RD29A mang gen ZmbZIP72 bằng enzyme giới hạn HindIII vào vector biểu

hiện pCAMBIA 1300 được mở vòng bằng enzyme giới hạn HindIII. Phản ứng cắt được

thực hiện ở 37oC trong 16 giờ.

Sản phẩm cắt sau đó được điện di trên gel agarose 0.8%, tinh sạch các đoạn DNA

cần bằng kit thôi gel GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific. Phản ứng

ghép nối giữa vector đã mở vòng và cấu trúc biểu hiện gen thực hiện nhờ xúc tác của

enzyme T4 ligase. Phản ứng thực hiện ở 22oC trong 1 giờ. Sản phẩm ghép nối sau đó được

biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β.

2.2.7. Biến nạp các vector tái hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β và A.

tumefaciens

2.2.7.1. Biến nạp các vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β theo

phương pháp sốc nhiệt

 Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E. coli bằng CaCl2 lạnh dùng cho biến nạp

theo phương pháp sốc nhiệt

Quy trình thực hiện:

1. Chủng vi khuẩn được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 37oC

2. Cấy một khuẩn lạc đơn vào 3ml môi trường LB lỏng và lắc qua đêm ở 37oC, 200

vòng/phút.

3. Chuyển 0,5 ml dịch nuôi trên sang 50 ml môi trường LB lỏng, lắc tiếp khoảng 3h

đến khi OD600nm đạt 0,6 – 0,8 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã giữ

lạnh trên đá.

4. Ly tâm 6000 vòng/phút, 4oC, 10 phút để thu cặn tế bào.

5. Hòa tan cặn nhẹ nhàng trong 20 – 30 ml CaCl2 0.1M, giữ ống tế bào trong đá 20

phút, ly tâm ở 4200 vòng/phút, 4oC, 10 phút để thu cặn tế bào.

6. Lặp lại một lần bước 5 và hòa cặn nhẹ nhàng trong 0,7 – 1,5 ml CaCl2 0.1M.

7. Chia vào mỗi ống eppendorf 50 µl dịch tế bào, bổ sung 50 µl glycerol 60%, làm

đông lạnh nhanh bằng Nitơ lỏng và giữ ở - 70oC.

 Phương pháp biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến E. coli bằng phương pháp

sốc nhiệt

Quy trình thực hiện:

1. Ống tế bào khả biến được để trong đá 30 phút sau khi lấy ra từ tủ -70oC.

2. Hòa 7 µl sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào khả biến, sau đó

tiếp tục giữ trong đá 30 phút.

3. Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút sau đó chuyển ngay xuống 4oC và giữ trong 5 phút.

4. Bổ sung 0.3 ml môi trường LB lỏng và nuôi lắc ở 37oC trong 1 giờ.

5. Sau đó vi khuẩn được cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc chọn lọc có bổ sung

kháng sinh kháng sinh thích hợp 50µg/µl và nuôi qua đêm ở 37oC.

2.2.7.2. Biến nạp vector biểu hiện thực vật vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens

theo phương pháp xung điện

 Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến A. tumefaciens

Quy trình thực hiện:

1 Làm mới giống trên môi trường thạch YEP có bổ sung kháng sinh thích hợp.

2 Nuôi cấy lắc vi khuẩn trong 2 ml môi trường LB ở 280C, 6 giờ.

3 Lấy 100 l dịch vi khuẩn trên nuôi cấy tiếp ở 280C qua đêm trên 100 ml môi trường

LB lỏng + 0,1% glucose đến khi OD660nm đạt 1-1,5.

4 Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5000 v/p, 20 phút để thu cặn tế bào. Rửa

cặn 3 lần trong 10 ml 1 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-

ethanesulfonic acid) pH 7,0; 1 lần trong 10 ml 10% glycerol.

5 Hoà tủa tế bào trong 500-700 l 10% glycerol.

6 Chia 45 l dịch tế bào vào mỗi ống eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và giữ ở -

700C.

 Phương pháp biến nạp vào tế bào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện

Quy trình thực hiện:

1 Làm tan tế bào khả biến A. tumefaciens trong đá 5 phút.

2 Đối với mẫu thí nghiệm, thêm 3 l plasmid tái tổ hợp vào ống eppendorf chứa tế

bào khả biến, trộn đều và đặt trên đá.

3 Rửa cuvette bằng cồn 100%, rửa lại bằng nước deion khử trùng rồi thấm khô. Dùng

pipet chuyển hỗn hợp sang cuvette đã được làm lạnh từ trước; lau sạch bên ngoài

cuvette.

4 Xung điện ở 5 ms, 12,5 kV/cm; điện trở 400Ω.

5 Bổ sung ngay 1 ml môi trường SOC vào cuvette, đảo đều và chuyển sang ống

eppendorf vô trùng, lắc ở 280C trong 1 - 1,5 giờ, sau đó cấy trải trên môi trường

chọn lọc.

2.2.8. Tách chiết và tinh sạch plasmid

1. Nuôi vi khuẩn qua đêm trong ống nghiệm chứa 2 ml môi trường LB lỏng có kháng

sinh thích hợp ở nhiệt độ thích hợp, lắc 200 vòng/phút.

2. Thu tế bào vi khuẩn từ dịch nuôi bằng cách li tâm 6000 vòng/phút trong 6 phút.

3. Bỏ dịch, thu cặn tế bào.

4. Bổ sung 150 µl dung dịch I, vortex.

5. Bổ sung 150 µl dung dịch II, đảo nhẹ 3 – 5 lần.

6. Bổ sung 150 µl dung dịch III tiếp ngay sau đó, rồi để trên đá khoảng 5 phút.

7. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu dịch trong và chuyển sang ống

effpendorf mới.

8. Bổ sung 1ml cồn 100%, để tủ lạnh – 20oC trong 3 giờ để kết tủa DNA.

9. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Bỏ dịch, thu tủa DNA

10. Rửa tủa DNA bằng cách bổ sung 300µl cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 5

phút, bỏ dịch, thu DNA.

11. Làm khô tủa DNA bằng máy SpeedVac trong 5 phút.

12. Bổ sung 50 µl RNase 0.01 mg/ml, ủ ở 37oC trong 1 giờ.

13. Điện di kiểm tra, plasmid sau đó được bảo quản ở - 20oC cho đến khi sử dụng.

2.2.9. Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn

Để xác định rõ xem plasmid đã lựa chọn có mang đoạn DNA đích hay không thì có

thể sử dụng enzyme giới hạn để cắt kiểm tra.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các enzyme cắt đầu dính: SacI, HindIII,

BamHI. Enzyme SacI được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen ZmbZIP72, enzyme

HindIII và BamHI được sử dụng trong phản ứng cắt kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu

hiện gen trong vector. Phản ứng được thực hiện với tổng thể tích là 15 µl với các thành

phần: 1,5 µl 10X buffer, 3 µl plasmid DNA (1,5 µg), 0,2 µl enzyme giới hạn, và nước. Ủ

ở 37oC trong 3 giờ.

2.2.10. Điện di trên gel agarose

2.2.10.1. Điện di DNA trên gel agarose

Quy trình thực hiện:

1 Chuẩn bị gel: agarose 0,8% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50-60˚C,

đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn lược thích hợp. Sau 30 - 60 phút,

khi gel đã đông ổn định, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X

ngập cách mặt gel khoảng 2 mm.

2 Tra mẫu: Mẫu DNA được trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thể tích 2:1. Sau

đó, mẫu được tra vào các giếng trên bản gel.

3 Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng

điện 60 - 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để kết thúc

điện di vào thời gian phù hợp.

4 Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch

EtBr nồng độ 10 µg/ml trong thời gian 5- 10 phút. Bản gel sau đó rửa sạch bằng

nước cất.

5 Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng

254 nm. Khi đó, DNA đã nhuộm sẽ hiện lên dưới dạng các vạch sáng và được ghi

lại bằng máy GEL - DOC.

2.2.10.2. Điện di RNA trên gel agarose

RNA là một acid nucleic sợi đơn nhưng chúng có xu hướng hình thành cấu trúc thứ

cấp vì vậy trước khi điện di RNA tổng số cần làm biến tính RNA để chúng luôn duy trì ở

trạng thái sơi đơn.

Chuẩn bị MOPS buffer, RNA loading buffer, RNA sample buffer:

- 5X MOPS buffer: MOPS (pH 7.0) 0.2M, EDTA (pH 8.0) 0.005M, Sodium acetate

0.05M.

- RNA sample buffer: 10 ml Deionized formamide, 3.5 ml formaldehyde 37%, 2 ml

MOPS buffer.

- RNA loading buffer: glycerol 50%, EDTA 10mM, bromophenol blue 0.4%.

Quy trình thực hiện:

1 Chuẩn bị gel: agarose 1% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50-60˚C, đổ

dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn lược thích hợp. Sau 30 - 60 phút, khi

gel đã đông ổn định, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập

cách mặt gel khoảng 2 mm.

2 Tra mẫu: Mẫu RNA được trộn cùng với RNA sample buffer và RNA loading

buffer. Sau đó, mẫu được tra vào các giếng trên bản gel.

3 Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng

điện 60 - 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để kết thúc

điện di vào thời gian phù hợp.

4 Nhuộm RNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch

EtBr nồng độ 10 µg/ml trong thời gian 5- 10 phút. Bản gel sau đó rửa sạch bằng

nước cất.

5 Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng

254 nm. Khi đó, RNA đã nhuộm sẽ hiện lên dưới dạng các vạch sáng và được ghi

lại bằng máy GEL - DOC.

2.2.11. Chuyển gen vào thực vật thông qua A. tumefaciens

Quy trình thực hiện:

1 Tạo dịch huyền phù: Cấy khuẩn lạc vi khuẩn A. tumefaciens chứa plasmid quan

tâm trong môi trường LB đặc sang môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh

thích hợp và lắc ở 200 vòng/phút, 28oC, tiến hành nuôi qua đêm. Sau 8 - 12 giờ

lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy trên ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, ở

4°C trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn vi khuẩn bằng môi trường lây

nhiễm có bổ sung AS. Pha loãng dịch khuẩn cho tới khi đạt được OD600: 0.5-1.0.

Dịch huyền phù vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm với phôi non của ngô.

2 Lây nhiễm vi khuẩn với phôi: Bắp ngô non được thu từ các cây ngô mẹ trồng

ngoài đồng ruộng từ 10 đến 12 ngày. Ngay sau khi thu hái, phôi non được tách

trong điều kiện vô trùng và được lây nhiễm với dịch vi khuẩn có bổ sung AS nồng

độ 100 µM trong 20 phút.

3 Đồng nuôi cấy: Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường

đồng nuôi cấy, nuôi trong tối, ở nhiệt độ 21oC trong 3 ngày.

4 Nuôi phục hồi: Chuyển phôi đã biến nạp từ môi trường đồng nuôi cấy sang môi

trường phục hồi, nuôi trong tối ở 28oC, trong 7 ngày.

5 Chọn lọc mô sẹo: Mô sẹo tạo thành từ phôi non được cấy chuyển từ môi trường

phục hồi sang môi trường chọn lọc 1 có bổ sung kháng sinh hygromycin (1,5

mg/l), nuôi trong tối ở 28°C, trong 14 ngày. Sau đó, các mô sẹo tiếp tục được

chuyển sang môi trường chọn lọc 2 có nồng độ kháng sinh hygromycin (3mg/l),

nuôi tối 14 ngày/ 28oC.

6 Tạo chồi: Các mô sẹo phôi hoá tạo thành trên môi trường chọn lọc được cấy

chuyển sang môi trường tái sinh 1, không có chất kích thích sinh trưởng, nuôi

trong tối 7 ngày/ 25oC/. Các mô sẹo phôi hoá này tiếp đó được cấy chuyển sang

môi trường tái sinh 2 không bổ sung kháng sinh, nuôi ngoài sáng ở 25oC, liên tục

chuyển môi trường tái sinh 2 cho đến khi các mô sẹo phôi hoá này tạo thành các

chồi.

7 Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh: Chồi tái sinh trong môi trường tái sinh được

cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh ở điều kiện sáng 25oC, trong

khoảng 10 - 20 ngày.

8 Chuyển cây ra đất: Cây tái sinh trên môi trường tái sinh khi có khoảng 2 - 3 láđược

chuyển ra đất trồng.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. PHÂN LẬP GEN ZmBZIP72 TỪ CÂY NGÔ

3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô

Chúng tôi đã tiến hành xử lý hạn giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) giai đoạn

ba lá trong 3và 6 giờ theo quy trình của nhóm nghiên cứu trên, và tiến hành thu thập các

mẫu lá của các cây này để tách chiết RNA tổng số phục vụ thí nghiệm. Trong nghiên cứu,

chúng tôi thực hiện tách chiết RNA tổng số theo phương pháp sử dụng TRI Reagent với

quy trình như đã mô tả như ở phần phương pháp.

Phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme RNase. Hơn nữa, RNase

có mặt ở khắp nơi, có hoạt tính cao và rất bền vững với các tác nhân thường dùng để loại

bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt ở 90oC trong 1 giờ không làm mất hoạt tính RNase). Vì những

lý do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi sự thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các RNase

từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hóa chất đều được khử trùng

bằng nhiệt hay DEPC (Diethylpyrocarbonate), tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay

trần.

Các mẫu mô sau khi được nghiền mịn trong nitơ lỏng, cần được bổ sung ngay TRI

Reagent để hạn chế sự hoạt động của RNase. TRI Reagent có chứa hai chất biến tính protein

mạnh là phenol và guanidin isothiocyanate, khi được xử lý với hai hóa chất này, tế bào sẽ

bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein...

Sau khi phá vỡ được màng tế bào và màng nhân, việc tiếp theo là phải tiến hành loại

protein và phân tách riêng các phần không chứa RNA trong hỗn hợp dung dịch chiết. Ở

đây chúng tôi sử dụng chloroform để loại bỏ protein và tạp chất. Sau khi bổ sung

chloroform và ly tâm, hỗn hợp dung dịch chiết phân chia thành ba pha riêng biệt: trên cùng

là pha dịch chứa RNA; pha giữa chứa DNA; pha cuối là protein, cặn tế bào cùng các hợp

hợp chất khác. Giữa pha trên và pha dưới được ngăn cách nhau bởi một lớp màng.

Dịch thu được ở pha trên sẽ được tủa bằng việc bổ sung 2-propanol. RNA thu được

sau đó được làm sạch bằng cồn 70%. Sản phẩm RNA sau đó được kiểm tra trên gel agarose

1% (hình 3.1). Kết quả cho thấy RNA tổng số có độ sạch cao và khoảng smear đậm quanh

vùng 18S – 28S cho thấy thu được lượng mRNA khá nhiều.

Hình 3.1: Sản phẩm tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô xử lý hạn nhân tạo

M: maker 1kb, 1: RNA tổng số tách chiết từ mẫu lá ngô xử lý hạn 3 giờ, 2: RNA

tổng số tách chiết từ mẫu lá ngô xử lý hạn 6 giờ

3.1.2. Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất

RNA tổng số sau khi kiểm tra chất lượng được chúng tôi sử dụng làm khuôn mẫu

để tổng hợp cDNA sợi thứ nhất theo First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real - Time

PCR. Để tổng hợp cDNA sợi thứ nhất chúng tôi sử dụng mồi primer mix đi kèm theo bộ

Kit. Sau đó, chúng tôi kiểm tra chất lượng cDNA tổng hợp được bằng phản ứng PCR với

cặp mồi nhân gen Actin. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5% (Hình

3.2).

Hình 3.2: Sản phẩm PCR nhân gen Actin từ các mẫu cDNA

M: maker 1kb plus, 1: sản phẩm PCR từ cDNA của mẫu cây xử lý hạn 3 giờ, 2: sản

phẩm PCR từ cDNA của mẫu cây xử lý hạn 6 giờ

Qua ảnh điện di, chúng tôi thấy rằng trên đường chạy 1 và 2 xuất hiện băng đậm nét

với kích thước xấp xỉ 500bp đúng với kích thước dự đoán khi thiết kế cặp mồi nhân gen

Actin là 480bp. Điều đó chứng tỏ chúng tôi đã tổng hợp thành công cDNA. Mẫu cDNA

này sẽ được sử dụng làm DNA khuôn trong phản ứng nhân gen ZmbZIP72 sau đó.

3.1.3. RT-PCR nhân gen ZmbZIP72

Phản ứng PCR được thực hiện với khuôn mẫu là cDNA, sử dụng enzyme DreamTaq

polymerase với cặp mồi ZmbZIP72F/R nhiệt độ gắn mồi 60oC. Kết quả điện di sản phẩm

PCR trên gel agarose 0.8% (hình 3.3) cho thấy xuất hiện băng DNA kích thước xấp xỉ 1kb,

kích thước này đúng với dự đoán khi chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân gen

ZmbZIP72 dựa trên trình tự tham chiếu trên Ngân hàng gen NCBI (mã số: HQ328839)

(953bp). Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng kit PCR GeneJET Gel Extraction Kit

cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.3: Kết quả RT-PCR nhân gen ZmbZIP72

M: maker 1kb, 1: sản phẩm RT-PCR nhân gen ZmbZIP72 từ cDNA mẫu lá ngô Tẻ

vàng chắt dạo (Lai Châu) xử lý hạn 6 giờ

3.1.4. Tạo dòng gen ZmbZIP72 trong vector pJET1.2

Nhằm mục đích tạo dòng và xác định trình tự nucleotide đoạn gen, chúng tôi tiến

hành ghép nối sản phẩm PCR đã tinh sạch vào vector pJET 1.2 sử dụng bộ hóa chất

CloneJET PCR Cloning Kit. Vector pJET 1.2 có chứa điểm khởi đầu sao chép nên có khả

năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E. coli. Gen kháng kháng sinh Ampicilin

(Amp) có trên vector cho phép chọn lọc những tế bào có mang vector này trên môi trường

có bổ sung kháng sinh Ampicillin. Ngoài ra, vector này còn chứa gen eco47IRI mã hóa cho

nuclease phân hủy DNA gây chết tế bào vật chủ. Khi đoạn chèn được gắn vào vector thì

gen này bị bất hoạt. Vì vậy, quá trình chọn dòng khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp sẽ

hiệu quả hơn. Mặt khác, trên vùng MCS (Multiple cloning site) chứa các điểm nhận biết

của các enzyme giới hạn như: BglII, NotI, XhoI,… giúp dễ dàng kiểm tra đoạn DNA được

chèn vào. Sản phẩm của phản ứng ghép nối sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.

coli DH5α. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng

sinh Ampicillin (50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Quan sát kết quả trên đĩa cấy trải, chúng tôi

thu được nhiều khuẩn lạc đơn là các dòng tế bào vi khuẩn mang plasmid. Để xác định xem

các plasmid này có mang đoạn DNA cần tách dòng hay không, chúng tôi đã tiến hành tách

chiết plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra.

Chúng tôi chọn 22 khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch LB, sau đó nuôi cấy trong môi

trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin (50µg/ml ) ở 37oC qua đêm. Các plasmid

sau khi tách chiết được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.4).

Hình 3.4: Tách chiết và chọn lọc plasmid mang gen ZmbZIP72

1 – 22: 22 dòng plasmid tách chiết được từ 22 khuẩn lạc đơn

Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai sẽ có kích thước lớn hơn. Vì

vậy, khi so sánh độ cao thấp giữa các plasmid với nhau, chúng tôi lựa chọn ra được 3 dòng:

4, 12, 20 có khả năng mang đoạn chèn cao hơn so với các dòng khác. Ba dòng này được

cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn.

Khi phân tích vùng MSC của vector pJET 1.2, chúng tôi thấy rằng ở phía bên trái

và bên phải của vị trí ghép nối gen đều chứa điểm nhận biết enzyme BglII. Vì vậy, chúng

tôi sử dụng enzyme BglII để cắt kiểm tra ba dòng số 4, 12, 20. Sản phẩm sau khi xử lý bằng

enzyme giới hạn được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.5). Kết quả cho thấy,

dòng số 20 xuất hiện hai băng, một có kích thước xấp xỉ 3kb và một băng có kích thước

khoảng 1kb. Hai kích thước này tương ứng với kích thước của vector và đoạn gen

ZmbZIP72 (953 bp) cùng với một số nucleotide trong vùng MCS của vector pJET 1.2. Như

vậy, qua kết quả kiểm tra bằng enzyme giới hạn có thể dự đoán rằng đoạn chèn gắn vào là

đoạn gen đích. Dòng plasmid trên sau đó được xác định trình tự nucleotide theo phương

pháp Sanger.

Hình 3.5: Kiểm tra plasmid pJET 1.2 mang đoạn gen ZmbZIP72

M: maker 1kb, 1: dòng số 4, 2: dòng số 12, 3: dòng số 20

3.1.5. Xác định và phân tích trình tự gen ZmbZIP72

Trình tự đoạn gen ZmbZIP72 được xác định bằng máy giải trình ABI 3500, sử dụng

cặp mồi pJET1.2 F/R để xác định trình tự nucleotide trên plasmid tái tổ hợp theo cả hai

chiều. Kết hợp giữa kết quả giải trình tự mồi pJET1.2 F và mồi pJET1.2 R chúng tôi có

được trình tự đầy đủ của gen ZmbZIP72 có kích thước 953 bp. Kết quả xác định trình tự

nucleotide được xử lý bằng phần mềm BioEdit và so sánh trình tự này với trình tự tham

chiếu trên Ngân hàng gen (mã số: HQ328839), chúng tôi thấy rằng, hai đoạn gen có độ

tương đồng 99%, với 2 điểm thay đổi: vị trí 486 A>C và vị trí 493 C>T (hình 3.6).

Hình 3.6: So sánh trình tự nucleotide giữa đoạn gen ZmbZIP72 từ giống Tẻ vàng chắt

dạo (Lai Châu) với trình tự tham chiếu

ZmbZIP72: trình tự tham chiếu trên Ngân hàng gen mã số: HQ328839

bZIP72 clone: trình tự đoạn gen ZmbZIP72 phân lập từ giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai

Châu)

Sử dụng công cụ online http://insilico.ehu.es/translate/ để dịch mã đoạn gen thu

được từ giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) chúng tôi có được trình tự acid min suy diễn

của đoạn nucleotide dài 894bp với 297 aa, tương ứng với trình tự acid amin của protein

ZmbZIP72 trong CSDL của NCBI mã số ADO19904. Kết quả so sánh (hình 3.7) cho thấy,

hai vị trí nucleotide bị thay đổi trong vùng CDS dẫn đến sự thay đổi trình tự acid amin, với

thay đổi A>C dẫn tới mã bộ ba AAA>AAC và làm cho Lysine>Asparagine. Với thay đổi

C>T làm cho mã CCT > TCT dẫn tới Proline> Serine. Tuy nhiên, các thay đổi acid amin

này đều không thuộc vùng chức năng quan trọng của protein ZmbZIP72 như vùng lõi, vùng

gắn protein, những thay đổi này có thể là sự đa hình của gen ZmbZIP72 ở giống Tẻ vàng

chắt dạo (Lai Châu) so với giống CN165. Từ các kết quả thu được, chúng tôi có thể khẳng

định đã phân lập và tách dòng thành công gen ZmbZIP72 từ giống ngô Tẻ vàng chắt dạo

(Lai Châu) với độ dài 953bp bao gồm toàn bộ vùng CDS dài 894bp và 21bp thuộc vùng 5’

trước mã mở đầu và 38bp vùng 3’ sau mã kết thúc.

Hình 3.7: So sánh trình tự acid amin suy diễn của đoạn CDS trên đoạn gen ZmbZIP72

giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham chiếu

ZmbZIP72: Trình tự acid amin của protein ZmbZIP72 trong CSDL của NCBI:

ADO19904

ZmbZIP72clone: Trình tự acid amin suy diễn đoạn gen ZmbZIP72 phân lập từ giống Tẻ

vàng chắt dạo (Lai Châu)

3.2. Thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72

3.2.1. PCR nhân gen ZmbZIP72 với cặp mồi treo vị trí enzyme SacI

Sau khi đoạn gen ZmbZIP72 được phân lập và tạo dòng trong vector pJET1.2, chúng

tôi sử dụng plasmid tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp

mồi ZmbZIP72 SacIF/SacIR, đoạn gen được nhân lên với cặp mồi này sẽ có kích thước

894bp bao gồm toàn bộ vùng CDS của gen (hình 3.8).

Hình 3.8: Kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ZmbZIP72SacI F/R

M: maker 1kb, 1: sản phẩm PCR nhân vùng CDS gen ZmbZIP72

Quan sát kết quả điện di, chúng tôi thấy rằng trên đường chạy xuất hiện băng DNA

có kích thước ~1kb, kích thước này đúng với kích thước dự đoán khi chúng tôi thiết kế

mồi. Sau đó, chúng tôi thực hiện PCR lượng lớn để tinh sạch và tạo dòng trong vector tách

dòng pJET 1.2 theo quy trình của bộ kit CloneJET PCR Cloning Kit. Kết quả là chúng tôi

thu được 3 dòng plasmid tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72: 01, 05, 09 khi kiểm tra bằng

enzyme giới hạn SacI (hình 3.9). Dòng 01 được chúng tôi tiếp tục sử dụng cho các thí

nghiệm tiếp sau đó.

Hình 3.9: Kết quả cắt enzyme giới hạn BglII trên các plasmid pJET 1.2

M: maker 1kb, 1: dòng số 01, 2: dòng số 05, 3: dòng số 09

3.2.2. Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72

Để biểu hiện gen trong tế bào thực vật, gen ZmbZIP72 cần được đặt dưới sự điều

khiển của promoter và terminator thích hợp. Chúng tôi lựa chọn promoter RD29A và

terminator 35S để điều khiểu sự hoạt động của gen ZmbZIP72 trong thực vật. Chúng tôi

ghép nối đoạn gen ZmbZIP72 với vector tách dòng trung gian pRTL2 có kích thước 2.6kb

chứa đoạn trình tự cần thiết cho biểu hiện gen gồm promoter cảm ứng stress RD29A kích

thước 841bp và terminator 35S dài 246bp, gen đích được chèn vào giữa tại điểm nhận biết

của enzyme SacI. Nếu cấu trúc RD29A::ZmbZIP72::35S được gắn đúng sẽ có kích thước

1991bp. Đoạn gen ZmbZIP72 được tạo đầu dính tương ứng bằng enzyme SacI. Đồng thời,

vector pRTL2 cũng được xử lý bằng enzyme SacI để mở vòng và ghép nối với nhau sau

đó biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β theo phương pháp sốc nhiệt. Các tế bào này

sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc Ampicillin

(50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Quan sát kết quả trên đĩa cấy trải, chúng tôi thu được nhiều

khuẩn lạc đơn là các dòng tế bào vi khuẩn mang plasmid. Để xác định xem các plasmid

này có mang đoạn DNA đích hay không, chúng tôi chọn 36 khuẩn lạc đơn trên đĩa biến

nạp nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin (50µg/ml) ở

37oC qua đêm để tách chiết plasmid. Các plasmid từ các dòng vi khuẩn sau khi tách chiết

được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.10).

Hình 3.10: Tách chiết và chọn lọc plasmid pRTL2 mang gen ZmbZIP72

1 – 36: 36 dòng plasmid được tách chiết; (-): đối chứng âm là plasmid pRTL2 gốc

không mang đoạn chèn

Quan sát ảnh điện di, chúng tôi chọn được một dòng plasmid số 32 có khả năng mang

vector tái tổ hợp pRTL2-bZIP72. Plasmid này được xử lý với enzyme giới hạn HindIII để

kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện, kết quả điện di trên gel agarose 08% (hình 3.11)

thấy xuất hiện hai băng kích thước khoảng 2.6kb và 2k. Hai sản phẩm cắt này đúng với

kích thước dự đoán khi ghép nối đoạn gen ZmbZIP72 với vector pRTL2.

Hình 3.11: Sản cắt plasmid pRTL2_ZmbZIP72 bằng enzyme HindIII

M: maker 1kb, 1: Sản phẩm cắt vector gốc pRTL2 không mang đoạn chèn, 2: sản

phẩm cắt plasmid pRTL2_ZmbZIP72

Tuy nhiên, chúng tôi chỉ sử dụng một enzyme giới hạn là SacI khi thiết kế, nên khi

ghép nối đoạn gen với vector pRTL2 sẽ có hiện tượng có plasmid tái tổ hợp mang gen đúng

chiều và plasmid tái tổ hợp mang gen ngược chiều. Vì vậy, plasmid tái tổ hợp số 32 trên

cần được xác định chiều trước khi được sử dụng cho các thí nghiệm phía sau. Trình tự của

vector pRTL2 và trình tự gen ZmbZIP72 đều có vị trí nhận biết của enzyme giới hạn BamHI

(vị trí 834 trong vùng CDS của gen và vị trí 865 ở vùng linhker của vector), vì vậy khi sử

dụng đồng thời cả 2 enzyme HindIII và BamHI sẽ xác định được chiều của gen ZmbZIP72

trong plasmid tái tổ hợp. Nếu đúng chiều, khi điện di sản phẩm cắt thì trên bản gel sẽ xuất

hiện bốn băng có kích thước: 2.6kb, 1.7kb, 235bp, 76bp. Quan sát kết quả điện di kiểm tra

sản phẩm cắt trên gel agarose 0.8% (hình 3.12), chúng tôi thấy xuất hiện ba băng có kích

thước: xấp xỉ 1.7 k, 2.6 kb, và 270bp, không thấy băng có kích thước dự đoán 76bp xuất

hiện do kích thước của băng này nhỏ nên không quan sát thấy được trên bản gel agarose

0.8%. Ba đoạn DNA thể hiện trên đường chạy 1 hình 3.12 đúng kích thước dự đoán. Như

vậy, đoạn gen ZmbZIP72 được chèn vào trong vector pRTL2 đúng chiều.

Hình 3.12: Sản phẩm cắt plamsid pRTL2_ZmbZIP72 với enzyme BamHI và HindIII

M: maker 1kb; 1: sản phẩm cắt plasmid

3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72

Một trong những yếu tố quan trong quyết định sự thành công của thí nghiệm chuyển

gen vào thực vật đó là lựa chọn được hệ vector biểu hiện phù hợp. Trong nghiên cứu này,

chúng tôi lựa chọn hệ vector pCAMBIA. Hệ thống pCAMBIA có những ưu điểm như: (1)

Có số lượng bản sao lớn trong E. coli nên lượng DNA thu được lớn; (2) Vùng replicon

pVS1 cho mức độ ổn định cao trong Agrobacterium; (3) Kích thước nhỏ, 7-12 kb tùy thuộc

vào từng plasmid; (4) Các điểm cắt enzyme giới hạn cho phép dễ dàng lắp ráp/ chèn gen

quan tâm; (5) Chọn lọc vi khuẩn bằng chloramphenicol hoặc kanamycin; (6) Chọn lọc thực

vật bằng hygromycin B hoặc Kanamycin; (7) dễ dàng thiết kế các cấu trúc dung hợp biểu

hiện với gen chỉ thị gusA (http://www.cambia.org).

Để tạo hệ vector biểu hiện gen ZmbZIP72 điều khiển bởi promoter hoạt động cảm

ứng điều kiện stress RD29A, vector pRTL2_ZmbZIP72 và khung vector pCAMBIA1300

được xử lý bằng enzyme HindIII. Cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 và vector

pCAMBIA1300 mạch thẳng được tinh sạch bằng kit tinh sạch, sau đó được ghép nối với

nhau nhờ xúc tác của enzyme T4 ligase.

Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH10β khả

biến theo phương pháp sốc nhiệt. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB

đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc Kanamycine (50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Quan sát kết

quả trên đĩa cấy trải, chúng tôi thu được nhiều khuẩn lạc đơn là các dòng tế bào vi khuẩn

mang plasmid. DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc được tách chiết và điện di kiểm tra

trên gel agarose 0.8% (hình 3.13).

Hình 3.13: chọn lọc plasmid pCAMBIA1300 mang gen ZmbZIP72

1 – 20: 20 dòng plasmid được tách chiết; (-): đối chứng âm là plasmid

pCAMBIA1300 gốc không mang đoạn chèn

Qua ảnh điện di, khi so sánh độ cao thấp giữa các plasmid với đối chứng âm (vector

gốc không mang gen) thì thấy rằng tất cả các dòng plasmid tách chiết được đều cao hơn

đối chứng, vì vậy, chúng tôi lựa chọn ra được 03 dòng plasmid 01, 02, 03 để kiểm tra sự

có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 trong vector pCAMBIA1300, chúng tôi cắt

kiểm tra 3 dòng plasmid tái tổ hợp trên bằng enzyme BamHI. Trên vector pCAMBIA1300

có một vị trí của BamHI, đồng thời trong cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 cũng chứa hai

vị trí nhận biết của BamHI. Nên khi xử lí bằng enzyme giới hạn BamHI, nếu vector biểu

hiện có chứa đoạn chèn, khi điện di sẽ xuất hiện các băng có kích thước xấp xỉ 1.7kb và

1.8kb. Nếu vector không có đoạn chèn, sẽ thu được vector mở vòng (9kb). Kết quả điện di

kiểm tra (hình 3.14) cho thấy rằng mẫu 01 và 03 cho kết quả là một băng đậm kích thước

khoảng 1.7 – 1.8kb, mẫu 2 cho kết quả một băng khoảng 2kb.

Hình 3.14: Sản phẩm cắt plasmid pCAM1300_ZmbZIP72 bằng enzyme BamHI

M: maker 1kb, 1: dòng số 01, 2: dòng số 02, 3: dòng số 03

Vì vậy, để chắc chắn hơn, chúng tôi chọn mẫu plasmid tái tổ hợp 01 để phân tích

tiếp bằng enzyme giới hạn SacI và HindIII. Kết quả điện di cho thấy (hình 3.15), khi xử lý

plasmid tái tổ hợp 01 với enzyme giới hạn SacI, trên ảnh điện di xuất hiện 2 băng kích

thước ~9kb và ~0.9kb. Khi xử lý với HindIII, xuất hiện 2 băng kích thước ~9kb và ~2kb.

Các kích thước này đều đúng với kích thước dự đoán khi thiết kế cấu trúc biểu hiện gen

ZmbZIP72. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện thực vật

pCAMBIA1300 mang gen ZmbZIP72.

Hình 3.15: Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 01 bằng enzyme SacI, HindIII

M: maker 1kb, 1: Sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme SacI, 2: sản phẩm cắt

plasmid bằng enzyme HindIII, 3: plasmid tái tổ hợp 01 không được xử lý enzyme

giới hạn

3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72

Một đặc tính tự nhiên của vi khuẩn A. tumefaciens là khả năng chuyển một số gen

trên Ti-plasmid vào hệ gen tế bào thực vật. Nhờ có đặc điểm này nên vi khuẩn A.

tumefaciens được sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu chuyển gen thực vật. Trong nghiên

cứu này, nhằm phục vụ công việc nghiên cứu chức năng nhân tố phiên mã bZIP72 trong

cây mô hình, chúng tôi đã sử dụng phương pháp biến nạp gen vào tế bào thực vật thông

qua vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA105. Để thực hiện thí nghiệm chuyển gen vào cây

mô hình, các chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mang các cấu trúc biểu hiện gen

được tạo ra bằng phương pháp xung điện. Các thể biến nạp sau khi được sàng lọc bằng môi

trường nuôi cấy có bổ sung chất kháng sinh Kanamycin (100µg/ml) được tiếp tục tách

plasmid để kiểm tra sự có mặt của vector biểu hiện gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi

đặc hiệu ZmbZIP72SacI F/R.

Chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid từ 4 dòng khuẩn lạc đơn trên đĩa biến nạp.

Các plasmid này sau đó được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt

của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 với cặp mồi đặc hiện ZmbZIP72SacI F/R. Sản phẩm

PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.16). Quan sát kết quả điện di thì thấy

rằng, đối chứng dương xuất hiện một băng đậm, sáng rõ, điều này chứng tỏ phản ứng diễn

ra bình thường. Trong khi đó, đối chứng âm không xuất hiện băng DNA, chứng tỏ không

có sự tạp nhiễm trong quá trình thao tác thí nghiệm. Trong các mẫu thì chỉ có 1 dòng 01,

cho một băng DNA đậm, rõ nét, có kích thước khoảng 0.9kb bằng với kích thước của đối

chứng dương, tương ứng với kích thước đoạn gen đích. Kết quả này, có thể nói rằng chúng

tôi đã thu được thể biến nạp Agrobacterium có mang cấu trúc biểu hiện gen đích ZmbZIP72

điểu khiển bởi promoter RD29A. Đây là nguồn nguyên liệu sử dụng cho các thí nghiệm

nhằm chuyển gen ZmbZIP72 vào thực vật.

Các cây trồng chuyển gen nếu được tạo ra với một gen chức năng nằm dưới sự điều

khiển của promoter cơ định thường dẫn đến sự biểu hiện của các gen đích trong tất cả các

mô và cơ quan của thực vật ở tất cả các giai đoạn phát triển và đôi khi ảnh hưởng đến sự

tăng trưởng và phát triển của thực vật chuyển gen. Trong các nghiên cứu trước đây, việc

sử dụng promoter RD29A điều khiển gen là yếu tố phiên mã cho thấy nhiều lợi ích so với

promoter CaMV35S (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1993; Kasuga et al., 2004;

Pellegrineschi et al., 2004). RD29A chứa yếu tố đáp ứng mất nước (DRE) có thể cảm ứng

stress. Trong điều kiện bình thường, sự biểu hiện của các gen đích dưới sự điều khiển của

promoter RD29A chỉ ở mức độ thấp nhưng sự biểu hiện sẽ tăng nhanh khi bị mất nước.

(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1994). Trong nghiên cứu của Zhou và cộng sự

(2016), các cây thuốc lá chuyển gen TaFBA1 được điều khiển bởi promoter 35S có kiểu

hình rất khác so với các cây không chuyển gen trong điều kiện nước bình thường. Trong

khi đó, các cây chuyển gen TaFBA1 do promoter RD29A điều khiển thì sự sinh trưởng và

phát triển tương tự như các cây không chuyển gen trong điều kiện bình thường. Với nguồn

nguyên liệu về gen đã có trong nghiên cứu này, và việc lựa chọn promoter RD29A với các

ưu điểm trên để điều khiển sự biểu hiện của gen ZmbZIP72, chúng tôi hi vọng rằng các cây

chuyển gen tăng cường được khả năng chịu hạn, đồng thời, hạn chế được các ảnh hưởng

tiêu cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây.

Hình 3.16: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen ZmbZIP72 từ 4 dòng plasmid

M: maker 1kb, (+): đối chứng dương với khuôn là plasmid pCAM1300_ZmbZIP72

01; (-): đối chứng âm với khuôn là H2O; 1 – 4: sản phẩm PCR từ 4 dòng plasmid.

3.4. Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô

Để tạo thành công bất cứ loài thực vật chuyển gen nào, các gen ngoại lai phải được

đưa vào các tế bào chưa biệt hóa, phản biệt hóa là những tế bào phân chia tích cực hoặc có

khả năng phân chia tạo thành cây mới. Ở ngô, vật liệu được lựa chọn là phôi chưa trưởng

thành và toàn bộ phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen hoặc A. tumefaciens cho hiệu

quả tạo cây chuyển gen tốt đều sử dụng phôi chưa trưởng thành. Vì vậy, yếu tố tiên quyết

cho chuyển gen thành công là đáp ứng của phôi non trong nuôi cấy mô, loại tế bào tạo

thành từ phôi chưa trưởng thành và các đặc điểm tiếp theo trong sinh trưởng và tái tạo. Cây

ngô sau khi thụ phấn được 10 – 12 ngày, thì bắp non được sử dụng để tách phôi cho chuyển

gen. Vật liệu được khử trùng bằng nước Javel 1% trong box cấy phòng thí nghiệm, sau đó

dùng dao và phanh để tách lấy phôi từ trong hạt ngô. Các phôi được ngâm trong môi trường

lây nhiễm có bổ sung AS (100 µM). Chất lượng phôi non là một yếu tố quan trọng nhất

quyết định đến hiệu quả chuyển gen ngô, kích thước phôi là tiêu chí cho thấy sự phát triển

tốt ở phôi. Phôi non cần có kích thước từ 1- 1.2 mm là thích hợp nhất cho chuyển gen

(Ishida et al., 2007). Vì vậy trong khi tiến hành thí nghiệm, phôi được chọn lọc ngay ở

bước đầu, những phôi có kích thước quá bé hoặc quá lớn sẽ bị loại bỏ.

Các phôi sau đó được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens chủng

EHA105 để biến nạp gen. Sau đó nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy trong tối 3 ngày.

Thời gian lây nhiễm có ảnh hưởng rất lớn tới sự thành công của việc chuyển gen cũng đồng

thời ảnh hưởng đến việc tạo mô sẹo, tái sinh của cây. Theo nghiên cứu của Lê Đức Huấn,

để thuận lợi cho vi khuẩn lây nhiễm vào phôi đồng thời vẫn cho tỉ lệ hình thành mô sẹo

của phôi cao, thì thời gian lây nhiễm thích hợp nhất là 20 – 30 phút. Trong thí nghiệm này,

chúng tôi tiến hành ngâm phôi trong môi trường lây nhiễm ở 20 phút. Sau 3 ngày nuôi cấy

phôi, phôi có kích thước lớn hơn so với ban đầu nhưng không đáng kể (Hình 3.17 A).

Các phôi sống sót sau khi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy được chuyển sang môi

trường phục hồi có bổ sung kháng sinh vancomycin (100mg/l) và cefotaxim (100mg/l) để

loại bỏ tạp khuẩn và phục hồi phôi. Sau một tuần, kích thước của mô sẹo đã có sự thay đổi

và mô sẹo có màu vàng sáng, chứng tỏ các mô sẹo phát riển bình thường. Trên một số mô

sẹo vẫn còn rễ do chưa được cắt bỏ trong quá trình chuyển từ môi trường đồng nuôi cấy

sang (Hình 3.17 B).

Các mô sẹo sau đó được cấy chuyển sang các môi trường chọn lọc. Các vector chịu

hạn có chứa gen quan tâm cùng và gen chỉ thị chọn lọc hygromycin. Do đó, các tế bào thực

vật mang gen chuyển nạp mới phát triển được trên môi trường nuôi cấy có hygromycin.

Sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trường chọn lọc 1 với nồng độ chất chọn lọc 1,5 mg/l, chúng

tôi quan sát thấy rằng, các mô sẹo tiếp tục tăng kích thước, có màu vàng sáng. Một số mô

sẹo, không có sự thay đổi kích thước đồng thời có màu vàng nâu, có thể các mô sẹo này

không mang vector biến nạp dẫn đến không thể tiếp tục phát triển trên môi trường chọn lọc

(Hình 3.17 C), các mô sẹo này sau đó bị loại bỏ khi chuyển sang môi trường mới.

Các mô sẹo đạt tiêu chuẩn được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc 2 với nồng

độ chất chọn lọc tăng từ 1,5 mg/l lên 3 mg/l. Sau 2 tuần, mô sẹo hầu như không có sự thay

đổi về kích thước. Lúc này, chúng tôi quan sát thấy một số mô sẹo có màu vàng sáng, một

số mô sẹo có màu nâu nhạt (Hình 3.17 D). Cả 2 kiểu mô sẹo này đều được chúng tôi chuyển

sang môi trường tái sinh.

Các mô sẹo sau đó được cấy chuyển sang môi trường tái sinh 1 không bổ sung chất

kích thích sinh trưởng nhưng vẫn có chất chọn lọc. Môi trường tái sinh 1 được coi là môi

trường tiền tái sinh. Quan sát mô sẹo sau một tuần, các mô sẹo màu trắng sáng bắt đầu hình

thành phôi (Hình 3.17 E).

Các mô sẹo tạo phôi được cấy chuyển sang môi trường tái sinh hai có bổ sung chất

điều hoà sinh trưởng kinetin (1mg/l). Trong khi đó, nhiều mô sẹo có màu nâu không có

khả năng tạo phôi sau 1 tuần theo dõi, bị loại bỏ. Sau khoảng 1 tuần, các mô sẹo được nuôi

cấy trong môi trường tái sinh 2 dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ ngày, với chất điều hoà

sinh trưởng kinetin kích thích tạo chồi, một số phôi phát triển thành chồi, một số phôi chỉ

phát triển rễ, đồng thời có các mô sẹo không phát triển thêm nữa mà có xu hướng chuyển

sang màu nâu và chết dần (Hình 3.17 F).

Các phôi phát triển thành chồi sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ có bổ sung các

chất điều hoà sinh trưởng NAA (1 mg/l) và IBA (0,1 mg/l) để tạo cây hoàn chỉnh (Hình

3.17 G). Cây con tái sinh được nuôi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ ngày ở 25oC cho

đến khi đủ rễ để đưa ra ngoài giá thể (khoảng 1 tuần). Các cây con tái sinh sau đó được

chuyển sang giá thể trước khi chuyển ra trồng ngoài đồng ruộng (Hình 3.17H). Các cây

con sau khoảng 1 tuần, phát triển thêm lá mới sẽ được trồng ra đất trong nhà lưới để chăm

sóc và tiến hành sàng lọc (Hình 3.17 I).

Hình 3.17: Minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh cây ngô chuyển gen

A: Phôi non sau 3 ngày được nuôi cấy cộng sinh với vi khuẩn A. tumefacines trong

môi trường đồng nuôi cấy

B: Phôi sau một tuần nuôi cấy trên môi trường phục hồi có bổ sung kháng sinh

vancomycin (100mg/l) và cefotaxim (100mg/l)

C: Mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc 1 với chất chọn lọc

hygromycin (1,5 mg/l)

D: Mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc 2 có bổ sung kháng sinh

hygromycin (3mg/l)

E: Mô sẹo tạo phôi soma sau 1 tuần nuôi cấy trong môi trường tái sinh 1 (RM1) có

bổ sung kháng sinh hygromycin 3 mg/l)

F: Phôi soma tạo chồi trong môi trường tái sinh 2 có bổ sung chất điều hoà sinh

trưởng kinetin (1mg/l)

G: Cây con tái sinh trong môi trường ra rễ

H: cây con phát triển trên giá thể

I: cây được trồng trên đất trong nhà lưới.

Sau quá trình biến nạp, cấy chuyển chọn lọc, chúng tôi thu được kết quả thống kê

như sau (bảng 3.1):

Bảng 3.1: Kết quả biến nạp gen ZmbZIP72

Tỷ lệ Tỷ lệ tái Vector biến Số lượng mẫu trên các môi trường

tạo mô sinh tạo nạp Số Số Số số Số Số Số

sẹo (%) chồi/ phôi mô mô chồi chồi chồi cây

cây (%) non sẹo sẹo tạo trên trên

ngô rễ trên trên MT MT

MT MT tái tái

chọn chọn sinh sinh

lọc 1 lọc 2 1 2

PCAM1300_ 1651 1142 1050 597 155 111 111 36.15% 6.7%

bZIP72

Trong biến nạp gen thực vật, đặc biệt là biến nạp gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium thì khả năng sống sót và mức độ tái sinh cây hoàn chỉnh của mẫu biến nạp

sau khi trải qua các giai đoạn nuôi cấy chọn lọc là hết sức quan trọng, quyết định đến hiệu

quả quá trình biến nạp. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, số lượng phôi sống sót và hình thành

mô sẹo trên môi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều này cho thấy những cây tồn

tại và phát triển được có thể là các phôi mang tế bào đã được chuyển gen. Kết quả cho thấy

tỷ lệ tạo mô sẹo không quá cao: 36.15%. Tỷ lệ tái sinh tạo chồi tương đối thấp, khoảng

6.7%.

3.5. Đánh giá cây ngô T0 chuyển gen ZmbZIP72

Trong đợt chuyển gen này, chúng tôi thu được 111 cây con chuyển gen ZmbZIP72

trong bình nuôi cấy. Tuy nhiên, khi trồng các cây non này ra giá thể và ra đất trong nhà

lưới dưới tác động của môi trường, các cây non này bị chết dần và thu được 44 cây khoẻ

mạnh. Các cây sống sót được gắn thẻ theo dõi và thu mẫu lá (Bảng 3.2). để tiến hành kiểm

tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 bằng kỹ thuật PCR.

Bảng 3.2: Danh sách mẫu cây chuyển gen ZmbZIP72 thu được

STT Số thẻ trên STT Số thẻ STT Số thẻ trên STT Số thẻ

trên cây trên cây cây cây

1 174 34 200 117 12 128 23

2 175 35 201 118 13 129 24

3 176 36 202 119 14 130 25

4 177 37 203 120 15 131 26

5 178 38 204 121 16 167 27

6 190 39 205 122 17 168 28

7 191 40 211 123 18 169 29

8 192 41 212 124 19 170 30

9 193 42 213 125 20 171 31

10 194 43 214 126 21 172 32

11 195 44 215 127 22 173 33

3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số cây ngô chuyển gen

Tách chiết DNA tổng số là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu gen sinh vật.

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số rất hiệu quả từ mô thực vật đã

được nghiên cứu, cải biến và ứng dụng tùy thuộc vào đối tượng và điều kiện nghiên cứu.

Tách chiết DNA của thực vật thường gặp khó khăn bởi thành cellulose ảnh hưởng đến chất

lượng của việc phá vỡ tế bào do khó nghiền mẫu thành bột mịn. Việc sử dụng ni tơ lỏng

trong quá trình nghiền làm thành cellulose trở nên giòn hơn, dễ vỡ hơn, giúp phá vỡ mỗi

liên kết giữa các tế bào trong mô lá, đồng thời bảo vệ DNA không bị phá hủy bởi các

enzyme trong tế bào. Ở đây, chúng tôi sử dụng đệm chiết chứa CTAB 2%. CTAB là hóa

chất dùng trong tách chiết acid nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến

hiện nay. Dung dịch CTAB là một dung môi có khả năng hòa tan acid nuleic cao, do đó

mà CTAB được dùng là chất chính trong quá trình tách DNA. Để tăng hiệu quả hoạt động

của CTAB, đệm chiết được làm ấm ở 650C trước khi bổ sung vào bột lá, sau đó ủ mẫu ở

65oC. Nhiệt độ này còn có tác dụng là vỡ thêm màng tế bào và màng nhân để giải phóng

tối đa được DNA và biến tính một vài protein, đặc biệt là enzyme thủy phân DNA. Thay

vì sử dụng protease K, trong thí nghiệm này -mecapthoetanol được sử dụng như là một

một chất khử cực mạnh để loại bỏ tannin và các hợp chất polyphenol khác, giúp cho DNA

thu được sạch hơn.

DNA tổng số của các cây ngô chuyển gen pCAMBIA1300 _ZmbZIP72 sống sót

được pha loãng 10 lần và điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả trên hình 3.18 cho thấy,

DNA được tách chiết khá nguyên vẹn, thể hiện là một băng DNA tổng số rõ nét, phù hợp

cho các thí nghiệm sinh học phân tử sau đó.

Hình 3.18: DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá cây chuyển gen ZmbZIP72 thế hệ T0

3.5.2. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị hygromycin

Trước khi kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72, chúng tôi tiến

hành PCR kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị hygromycin trong các cây ngô chuyển gen

pCAMBIA1300_ZmbZIP72. Sự có mặt của gen chỉ thị Hygromycin giúp cây có thể sống

sót qua các giai đoạn chọn lọc trong nuôi cấy mô. Tuy nhiên, thực tế thì nhiều phôi vẫn có

thể tái sinh dù không có gen kháng hygromycin. Vì vậy việc kiểm tra sự có mặt của gen

chỉ thị bước đầu giúp chúng tôi xác định được quá trình chuyển gen có xảy ra hay không.

Cặp mồi được sử dụng trong thí nghiệm PCR này khuếch đại vùng mã hóa của gen chỉ thị

hygromycin với kích thước lý thuyết là 984bp. Quan sát kết quả điện di trên hình 3.19 có

thể nhận thấy ở đường chạy của đối chứng dương là sản phẩm PCR từ plasmid

pCAMBIA1300_ZmbZIP72, xuất hiện một băng khá đậm, sáng, có kích thước xấp xỉ 1kb,

điều này chứng tỏ phản ứng PCR xảy ra bình thường. Đối chứng âm chúng tôi sử dụng là

H2O và cây không chuyển gen đều không xuất hiện băng DNA nào, cho thấy không có sự

tạp nhiễm trong quá trình thực hiện thí nghiệm. Ở các đường chạy 11 và 33 xuất hiện một

băng sản phẩm đậm, sáng, kích thước bằng đối chứng dương. Như vậy, có thể nói rằng,

gen chỉ thị hygromycin đã được chuyển vào trong hệ gen của các cây con tái sinh này. Ở

các mẫu còn lại, sản phẩm PCR không xuất hiện băng DNA, như vậy, các cây này mang

kết quả âm tính với gen chỉ thị hygromycin.

Hình 3.19: Sản phẩm PCR nhân gen chỉ thị hygromycin ở các cây chuyển gen T0

M: maker 1kb, (+): sản phẩm PCR của đối chứng dương với khuôn là plasmid

pCAM1300_ZmbZIP72, (-): Sản phẩm PCR từ H2O, WT: sản phẩm PCR từ DNA

tổng số của cây ngô không chuyển gen, 1 – 44: Sản phẩm PCR của 44 mẫu DNA

cây chuyển gen

3.5.3. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72

Để kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện trong DNA tổng số cây chuyển gen,

chúng tôi sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi nhân đặc hiệu. Bởi vì gen ZmbZIP72 là gen

nội sinh ở ngô, do đó, chúng tôi sử dụng cặp mồi TestRD29A R và ZmbZIP72SacIR. Mồi

TestRD29A R có vị trí bám nằm ở vùng cuối của promoter RD29A, trong khi đó mồi

ZmbZIP72SacIR là mồi nằm ở vị trí cuối của gen ZmbZIP72. Việc sử dụng cặp mồi này

sẽ tránh được việc nhân gen nội sinh. Theo lí thuyết, sản phẩm PCR sử dụng hai mồi trên

có kích thước 1014bp.

Hình 3.20: Sản phẩm PCR nhân gen đích ZmbZIP72 ở cây chuyển gen T0

M: maker 1kb, (+): sản phẩm PCR của đối chứng dương với khuôn là plasmid

pCAM1300_ZmbZIP72, (-): Sản phẩm PCR từ H2O, WT: sản phẩm PCR từ DNA

tổng số của cây ngô không chuyển gen, 1 – 44: Sản phẩm PCR của 44 mẫu DNA

cây chuyển gen

Qua ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR (hình 3.20), có thể thấy rằng mẫu đối chứng

dương xuất hiện một băng khá đậm, rõ nét với kích thước xấp xỉ 1,1kb giống với kích thước

lý thuyết. Đối chứng âm không lên chứng tỏ phản ứng không bị tạp nhiễm. Đối với các

mẫu thí nghiệm, hầu hết các mẫu đều không xuất hiện băng DNA nào, chỉ có 2 đường chạy

11 và 33 xuất hiện một băng đậm và rõ nét có kích thước bằng với đối chứng dương. Khi

chuyển gen vào tế bào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, đoạn T-DNA

được chuyển vào nhờ bộ máy phân tử của vi khuẩn và tế bào thực vật. Đoạn T-DNA được

thiết kế bao gồm cả cấu trúc biểu hiện RD29A::ZmbZIP72::35S và gen chỉ thị thực vật

hygromycin. Do đó, theo lý thuyết, cả cấu trúc biểu hiện và gen chỉ thị cùng được chuyển

vào hệ gen của cây. Các cây số 127 và 195 đều cho thấy có mặt của cả hai trình tự của gen

Hyg và gen đích ZmbZIP72 khi đánh giá bằng phương pháp PCR. Tuy nhiên, PCR dương

tính chưa chắc chắn 100% với chuyển gen thành công vì có nhiều cách để giải thích sự có

mặt của DNA trong mẫu phân tích: (i): trong các nghiên cứu chuyển gen nhờ A.

tumefaciens, loài vi khuẩn này thường tồn tại lâu dài trong mô tế bào thực vật mặc dù đã

trải qua quá trình loại bỏ vi khuẩn và chọn lọc tế bào thực vật chuyển gen. Và với nhiều

loại đối tượng thì vi khuẩn A. tumefaciens mang gen chuyển còn tồn tại trong khối mô hay

trong gian bào của mẫu phân tích. Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu

tính tức đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này được loại trừ. (ii): gen chuyển tồn tại tự

do trong tế bào chất, có thể biến mất qua sinh sản hữu tính, (iii): gen chuyển tồn tại không

hoạt động, tức là không biểu hiện thành protein có chức năng sinh học. Chính vì những lý

do trên kết quả PCR có giá trị định hướng ban đầu. Vì vậy, chúng tôi sẽ tiếp tục tiến hành

các thí nghiệm đánh giá tiếp sau đó để khẳng định sự thành công của việc chuyển cấu trúc

biểu hiện gen ZmbZIP72 vào cây ngô ở các thế hệ sau.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

- Với kỹ thuật RT-PCR, đoạn gen mã hóa nhân tố phiên mã ZmbZIP72 đã được phân

lập thành công từ RNA tổng số tách ở lá ngô giai đoạn ba lá được xử lý hạn 6 giờ

của giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu). Gen ZmbZIP72 phân lập được có kích

thước 894bp vùng CDS với hai điểm thay đổi so với trình tự tham chiếu: ở vị trí 486

A>C và vị trí 493 C>T.

- Đoạn gen ZmbZIP72 đã được thiết kế thành công vào vector biểu hiện

pCAMBIA1300 dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng RD29A và tạo được

chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector tái tổ hợp này làm nguyên liệu phục vụ

chuyển gen thực vật.

- Đã tạo được 2 cây ngô chuyển gen T0 127 và 195 dương tính với PCR nhân gen đích

ZmbZIP72 và gen chỉ thị Hyg.

2. Kiến nghị

- Phân tích các dòng cây ngô chuyển gen qua các thế hệ T1, T2,… nhằm chọn được

dòng cây ổn định về gen chuyển và có khả năng chịu hạn.

-

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Phạm Thị Hằng, Hà Hồng Hạnh, Nguyễn Thùy Linh, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn

Hải, Huỳnh Thị Thu Huệ (2017). Thiết kế vector vào tạo chủng Agrobacteriums

mang gen ZmbZIP72 phân lập từ cây ngô. Tạp chí công nghệ sinh học 15 (2): 333-

340.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt

1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998). Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại

cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại Học Quốc Gia, Hà Nội

2. Bùi Mạnh Cường (2007). Ứng dụng công nghệ sinh học trong chon tạo giống ngô.

NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

3. Nguyễn Thị Phương Dung và Phạm Xuân Hội (2010). Phân lập và thiết kế vector

biểu hiện mang gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển chịu hạn OsNAC6. Tạp

chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 156 (10): 7-13.

4. Nguyễn Lam Điền (2003). Một số kết quả nghiên cứu về 2 giống cỏ ngọt D3 và

ST88 trồng tại Thái Nguyên. Kỉ yếu hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 2 tại Huế,

NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội 309 – 11.

5. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013).

Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả năng kháng hạn và thuốc trừ cỏ vào

giống đậu tương ĐT22. Tạp chí Khoa học và công nghệ 11: 3-9.

6. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Hữu Kiên (2013). Thiết kế vector biểu hiện gen chịu

hạn NTCB-ZmNF-YB2 ở ngô. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 7: 31-

7. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Phạm Thị Hương, Lê

Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Nguyễn Hữu Kiên, Trần Duy Hưng, Lê Huy Hàm

(2015). Nghiên cứu chuyển gen chịu hạn NF-YB2 vào một số dòng ngô Việt Nam.

Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 7: 3530

8. Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội (2010). Phân lập và thiết kế vector chuyển gen

mang gen điều khiển chịu hạn OsNAC1 ở lúa. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3):345-

352

9. Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phương và Phạm Xuân Hội (2014). Phân lập gen

OsNAC10 liên quan tới tính chống chịu hạn từ giống lúa Indica. Tạp chí công nghệ

sinh học 12(2): 319-326.

10. Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phương,Trần Lan Đài, Phan Tuấn Nghĩa và Phạm

Xuân Hội (2014). Thiết kế vector biểu hiện gen OsNAC1 được điều khiển bởi

promoter cảm ứng điều kiện bất lợi RD29A. Tạp chí Khoa học – Đại học Quốc gia

Hà Nội 30(4): 1-10.

11. Trần Thị Cúc Hòa (2009). Tạo dòng đậu tương biến đổi gen kháng sâu và chịu hạn.

Báo cáo khoa học ở Hội thảo khoa học đánh giá kết quả thực hiện đề tài, dự án công

nghệ sinh học nông nghiệp - thủy sản giai đoạn 20072008, Hà Nội 7/4/2009. Bộ

Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 26-28

12. Trần Thị Cúc Hòa, Phạm Trung Nghĩa, Trần Ngọc Thạch, Hồ Thị Huỳnh Như, Lã

Cao Thắng, Trần Thanh Hải, Nguyễn Trần Hải Bằng, Trang, V.T.K. (2015). Tạo

dòng đậu tương biến đổi gene kháng sâu và chịu hạn. Tạp chí Nông nghiệp và Phát

triển nông thôn 6: 19-25.

13. Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Văn Trường, Bùi Mạnh Minh, Đoàn Thị Bích THảo,

Nguyễn Xuân Thắng, Nông Văn Hải, Bùi Mạnh Cường (2014). Thiết kế vector biểu

hiện mang gen modiCspB và chuyển gen này vào cây ngô. Tạp chí công nghệ sinh

học 12(1): 125 – 132.

14. Đinh Thị Phòng (2001). Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa

bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật. Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh

học.

15. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Thị Vân, Phạm Xuân Hội (2012). Thiết kế

vector chuyển gen mang gen điều khiển OsDREB1A có tiềm năng tăng cường tính

chống chịu với điều kiện bất lợi môi trường ở lúa. Tạp chí Công nghệ Sinh học

10(2): 271-279

16. Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Xuân Hội (2009). Phân lập và chuyển gien

điều khiển chịu hạn MtOsDREB2A vào giống lúa Chành trụi thông qua

Agrobacterium Tạp chí sinh học 3(2).

17. Ngô Hữu Tình (2009). Chọn lọc và lai tạo giống ngô.

18. Phan Đức Thịnh, Hoàng Thị Thùy, Phạm Quang Tuân, Vũ Thị Bích Hạnh, Nguyễn

Thị Hân, Vũ Văn Liết (2013). Chọn lọc dòng ngô có khả năng chịu hạn dựa trên

kiểu hình vào maker phân tử. Tạp chí khoa học và Phát triển 11(2): 184-193.

19. Nguyễn Đức Thuận, Luân Thị Đẹp, Nguyễn Thị Thuý Hường (2008). Kết quả đánh

giá khả năng chịu hạn của một số giống ngô lai tại tỉnh Sơn La. Tạp chí Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn 6(6): 22-25

20. Lương Văn Vàng, Vũ Văn Dũng, Vũ Hoài Sơn (2013). Nghiên cứu tạo giống ngô

cho vùng khó khăn. Hội thảo quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 348 –

356.

Tài liệu tiếng Anh

21. Abdullah, A. Y., Obeidat, B. S., Muwalla, M. M., Matarneh, S. K., Ishmais, M. A.

A. (2011). Growth performance, carcass and meat characteristics of black goat kids

fed sesame hulls and Prosopis juliflora pods. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 24 (9): 1217-

1226

22. Belkheiri O, Mulas M (2013). The effects of salt stress on growth, water relations

and ion accumulation in two halophyte Atriplex species. Environmental and

Experimental Botany 86, 17–28.

23. Bhatnagar-Mathur P., Rao J. S., Vadez V., Dumbala S. R., Rathore A., Yamaguchi-

Shinozaki K., (2014). Transgenic peanut overexpressing the DREB1A transcription

factor has higher yields under drought stress. Mol. Breed. 33 327–340.

10.1007/s11032-013-9952-7

24. Brookes and Barfoot (2017). Farm income and production impacts of using GM

crop technology 1996–2015. GM Crops & Food 8(3): 156 – 193.

25. Cai X, Chen J, Xu H, Liu S, Jiang QX, Halfmann R, Chen ZJ (2014). Prion-like

polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and

inflammasome activation. Cell 156(6): 1207-22.

26. Cattivelli L., Rizza F., Badeck F.W., Mazzucotelli E., Mastrangelo A.M., Francia

E., Mare C., Tondelli A., Stanca A.M. (2008). Drought tolerance improvement in

crop plants: An integrative view from breeding to genomics. Field Crop. Res. 105:

1–14.

27. Century K, Reuber TL, and Ratcliffe OJ. (2008). Regulating the regulators: The

future prospects for transcription-factor-based agricultural biotechnology products.

Plant Physiol 147: 20–29

28. Chan, M.-T., Chang, H.-H., Ho, S.-L., Tong, W.-F. and Yu, S.-M. (1993)

Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric

α-amylase promoter/β-glucuronidase gene. Plant Mol. Biol. 22: 491-506

29. Chapman S. C., Edmeades G. O. (1999). Selection improves tolerance to mid/late

season drought in tropical maize populations. II. Direct and correlated responses

among secondary traits. Crop Sci. 39: 1315–1324

30. de Paiva Rolla A. A., de Fátima Corrêa Carvalho J., Fuganti-Pagliarini R., Engels

C., do Rio A., Marin S. R., (2014). Phenotyping soybean plants transformed with

rd29A:AtDREB1A for drought tolerance in the greenhouse and field. Transgenic

Res. 23: 75–87.

31. Dong Chun-lin, Zhang Ming-yi, Zhang Yan-qin, Yang Li-li, Liang Gai-mei, Sun

Jie, Lin Zhong-ping, Gou Jjian-fang (2011). Transformation of trehalose synthase

gene (TPS Gene) into corn inbred line and identification of drought tolerance.

Academic Journals 10(68): 15253-15258

32. Edmeades G. O., Bolaños J., Elings A., Ribaut J.-M., Bänziger M., Westgate M. E.

(2000). The role and regulation of the anthesis-silking interval in maize, in

Physiology and Modeling Kernel Set in Maize. Madison, WI: CSSA Special

Publication (29): 43–73

33. FAOSTAT, 2016

34. FAS/USDA, 2017.

35. Fujita Y, Fujita M, Satoh R, Maruyama K, Parvez MM, Seki M, Hiratsu K, Ohme-

Takagi M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2005). AREB1 is a transcription

activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress

tolerance in Arabidopsis. Plant cell 17:3470-3488

36. Grelet J, Benamar A, Teyssier E, Avelange-Macherel MH, Grunwald D, Macherel

D (2005). Identification in pea seed mitochondria of a late-embryogenesis abundant

protein able to protect enzymes from drying. Plant Physiol 137: 157–167

37. Guo Z, Qian L, Liu R, Dai H, Zhou M, Zheng L, Shen B (2008). Nucleolar

localization and dynamic roles of flap endonuclease 1 in ribosomal DNA replication

and damage repair. Mol Cell Biol 28(13): 4310-9

38. Hu H, Dai M, Yao J, Xiao B, Li X, Zhang Q, Xiong L (2006). Overexpressing a

NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and

salt tolerance in rice. Proc Natl Acad Sci USA 103:1 2987–12992

39. Hu X, Li Y, Li C, Yang H, Wang W, Lu M (2010). Characterization of small heat

shock proteins associated with maize tolerance to combined drought and heat stress.

J Plant Growth Regul 29 (4): 455–464

40. Huang XY, Chao DY, Gao JP, Zhu MZ, Shi M, Lin HX (2009). A previously

unknown zinc ﬁnger protein, DST, regulates drought and salt tolerance in rice via

stomatal aperture control. Genes Dev 23:1805–1817

41. Huawen Zou, Xiaohan Wang, Conglin Huang, Jinsong Chen, Xiuhai Zhang, Chang

Luo, RongYu, Zhongyi Wu (2014). Stress - inducible expression of a gene encoding

C - repeat binding factor 4 (CBF4) from Arabidopsis improved performance of

transgenic maize under drought condition. POJ 7(2): 94-101.

42. Iwaki T., Guo L., Ryals J. A., Yasuda S., Shimazaki T., Kikuchi A., (2013).

Metabolic profiling of transgenic potato tubers expressing Arabidopsis dehydration

response element-binding protein 1A (DREB1A). J. Agric. Food Chem 61: 893–

900

43. Jakoby, M, Weisshaar, B, Droge-Laser, W (2002). bZIP transcription factors in

Arabidopsis. Trends Plant Sci 7: 106–11.

44. Kang JY, Choi HI, Im MY, Kim SY (2002). Arabidopsis basic leucine zipper proteins

that mediate stress-responsive abscisic acid signaling. Plant Cell 14: 343-357

45. Karaba A, Dixit S, Greco R, Aharoni A, Trijatmiko KR, Marsch-Martinez N,

Krishnan A, Nataraja KN, Udayakumar M, Pereira A (2007). Improvement of water

use efficiency in rice by expression of HARDY, an Arabidopsis drought and salt

tolerance gene. Proc Natl Acad Sci. 104: 15270–15275

46. Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1999).

Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single

stress-inducible transcription factor. Nat Biotechnol 17:287–291

47. Kasuga M., Miura S., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2004). A

combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress inducible Rd29A

promoter improved drought- and low temperature stress tolerance in tobacco by

gene transfer. Plant Cell Physiol. 45: 346–350

48. Kim S, Kang J, Cho D, Park JH, Kim SY (2004). ABF2, an ABRE binding bZIP

factor, is an essential component of glucose signaling and its overexpression affects

multiple stress tolerance. Plant J 40: 75–87

49. Kim SY (2006) The role of ABF family bZIP class transcription factors in stress

response. Physiol Plant 126: 519–527

50. Kovtun Y, Chiu WL, Tena G, Sheen J (2000). Functional analysis of oxidative

stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants. Proc Natl Acad

Sci USA 97: 2940–2945

51. Lightfoot, Mungur, Ameziane, R., Nolte, S., Long, L., Bernhard, K., Colter, A.,

Jones, K., Iqbal, M. J., Varsa, E., & Yong, B ( 2007 ). Improved drought tolerance

of transgenic Zea mays plants that express the glutamate dehydrogenase gene

(gdhA) of E. coli . Euphytica 156: 103–116.

52. Liu J, Huang X, Withers BR, Blalock E, Liu K, Dickson RC (2013). Reducing

sphingolipid synthesis orchestrates global changes to extend yeast lifespan. Aging

Cell 12(5):833-41

53. Lu G, Gao C, Zhong X, Han B (2009). Identification of OsbZIP72 as a positive

regulator of ABA response and drought tolerance in rice. Planta 229: 605-615

54. Mundy J, Yamaguchi-Shinozaki K, Chua NH (1990). Nuclear proteins bind

conserved elements in the abscisic acid-responsive promoter of a rice rab gene. Proc

Natl Acad Sci USA 87: 1406–1410

55. Nakashima K, Ishida H, Nakatomi A, Yazawa M (2012). Specific conformation and

Ca(2+)-binding mode of yeast calmodulin: insight into evolutionary development.

J Biochem 152(1): 27-35

56. Nakashima K., Tran L.S., Van Nguyen D., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., Ito

Y. (2007). Functional analysis of a NAC‐type transcription factor OsNAC6

involved in abiotic and biotic stress‐responsive gene expression in rice. Plant J. 51,

617–630.

57. Nguyen Duy Phuong and Xuan Hoi Pham (2015). Isolation and characterization of

a OsRap2.4A transcription factor and its expression in Arabidopsis for enhancing

high salt and drought tolerance. Current Science 108(1): 51 – 62

58. Nguyen Duy Phuong, Tuteja Narendra, Tuan Nghia Phan and Xuan Hoi Pham

(2014). Identification and characterization of a stress inducible gene OsNLI-IF

enhancing drought tolerance in transgenic tobacco. Current Science 109(3): 541 –

551

59. Nijhawan A, Jain M, Tyagi AK, Khurana JP (2008). Genomic survey and gene

expression analysis of the basic leucine zipper transcription factor family in rice.

Plant physiology 146: 333-350

60. Nikos and Bruinsma (2012). World agriculture towards 2030/2050: the 2012

revision. Global Perspective Studies Team. FAO Agricultural Development

Economics Division

61. Oh SJ, Song SI, Kim YS, Jang HJ, Kim SY, Kim M, Kim YK, Nahm BH, Kim JK

(2005). Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic rice increased

tolerance to abiotic stress without stunting growth. Plant physiology 138: 341-351

62. Pellegrineschi A., Reynolds M., Pacheco M., Maria B. R., Almeraya R.,

Yamaguchi-Shinozaki K., et al. (2004). Stress-induced expression in wheat of the

Arabidopsis thaliana DREB1A gene delays water stress symptoms under

greenhouse conditions. Genome 47: 493–500

63. Qin F, Sakuma Y, Li J, Liu Q, Li YQ, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2004).

Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor

involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L. Plant Cell Physiol 45

1042–1052

64. Quan R, Shang M, Zhang H, Zhao Y, Zhang J. (2004). Improved chilling tolerance

by transformation with betA gene for the enhancement of glycinebetaine synthesis

in maize. Plant Science 166: 141–149.

65. Raineri DM, Bottino P, Gordon MP, Nester EW (1990). Agrobacterium mediated

transformation of rice (Oryza sativaL.). BioTechnology 8: 33–38.

66. Redillas M. C., Jeong J. S., Kim Y. S., Jung H., Bang S. W., Choi Y. D., et al.

(2012). The overexpression of OsNAC9 alters the root architecture of rice plants

enhancing drought resistance and grain yield under field conditions. Plant

Biotechnol. J. 10: 792–805

67. Repellin A, Baga M, Jauhar PP, Chibbar RN (2001). Genetic enrichment of cereal

crops via alien gene transfer: new challenges. Plant Cell, Tissue and Organ Culture

64: 159-183.

68. Saibo NJM, Lourenco T, Oliveira MM (2009). Transcription factors and regulation

of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses . Annals of

Botany 103: 609 -623.

69. Saint Pierre C., Crossa J. L., Bonnett D., Yamaguchi-Shinozaki K., Reynolds M. P.

(2012). Phenotyping transgenic wheat for drought resistance. J. Exp. Bot. 63: 1799–

1808

70. Sakamoto H, Araki T, Meshi T, Iwabuchi M (2000). Expression of a subset of the

Arabidopsis Cys(2)/His(2)-type zinc-finger protein gene family under water stress.

Gene 248: 23–32

71. Sakamoto, T., (2004). An overview of gibberellin metabolism enzyme genes and

their related mutants in rice. Plant Physiol. 134: 1642–1653.

72. Sheng Y, Zhang DF, Fu J, Shi YS, Song YC, Wang TY, Li Y (2012). Cloning and

characterization of a maize bZIP transcription factor, ZmbZIP72, confers drought

and salt tolerance in transgenic Arabidopsis. Planta 235: 253-266.

73. Shou, H., Eloyan, A., Nebel, M.B., Pekar, J.J., Mostofsky, S., Caﬀo, B., Lindquist,

M.A., Crainiceanu (2014). Shrinkage prediction of seed voxel brain connectivity

using resting-state fMRI. NeuroImage.

74. Tang N, Zhang H, Li X, Xiao J, Xiong L (2012). Constitutive activation of

transcription factor OsbZIP46 improves drought tolerance in rice. Plant Physiology

158(4): 1755-1768

75. Tran LS, Nakashima K, Sakuma Y, Simpson SD, Fujita Y, Maruyama K, Fujita M,

Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2004). Isolation and functional

analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a

drought responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1

promoter. Plant Cell 16:2481–2498

76. Trivedi DK, et al. (2012). Genome wide analysis of Cyclophilin gene family from

rice and Arabidopsis and its comparison with yeast. Plant Signal Behav 7(12): 1653-

77. Trivedi P., Anderson I. C., Singh B. K. (2013). Microbial modulators of soil carbon

storage: integrating genomic and metabolic knowledge for global prediction. Trends

Microbiol. 21: 641–651.

78. Ülker B, Somssich IE (2004) WRKY transcription factors: from DNA binding

towards biological function. Curr Opin Plant Biol 7: 491–498

79. Umezawa T., Yoshida R., Maruyama K., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K.

(2004). SRK2C, a SNF1 -related protein kinase 2, improves drought tolerance by

controlling stress -responsive gene expression in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 101: 17306–17311

80. Wardlaw I.F., Willenbrink J. (2000). Mobilization of fructan reserves and changes

in enzyme activities in wheat stems correlate with water stress during kernel ﬁlling.

New Phytol. 148: 413–422.

81. WMO, (2016) WMO provisional Statement on the Status of the Global Climate in

2016.

82. Xiang Y, Tang N, Du H, Ye H, Xiong L (2008). Characterization of OsbZIP23 as a

key player of the basic leucine zipper transcription factor family for conferring

abscisic acid sensitivity and salinity and drought tolerance in rice. Plant Physiol

148: 1938–1952

83. Xiangzhu Kong, Shumei Zhou, Suhong Yin, Zhongxian Zhao, Yangyang Han, and

Wei Wang (2016). Stress-Inducible Expression of an F-box Gene TaFBA1 from

Wheat Enhanced the Drought Tolerance in Transgenic Tobacco Plants without

Impacting Growth and Development. Front Plant Sci. 7: 1295.

84. Xiao B, Huang Y, Tang N, Xiong L (2007). Over-expression of a LEA gene in rice

improves drought resistance under the Weld conditions. Theoretical and Applied

Genetics. 115: 35 – 46.

85. Xiao BZ, Chen X, Xiang CB, Tang N, Zhang QF, Xiong LZ (2009). Evaluation of

seven function-known candidate genes for their effects on improving drought

resistance of transgenic rice under ﬁeld conditions. Mol Plant 2: 73–83

86. Xiong X, Wang X, Ewanek R, Bhat P, Diantonio A, Collins CA (2010). Protein

turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal

injury. J Cell Biol. 191: 211–223

87. Xu DQ, Huang J, Guo SQ, Yang X, Bao Y-M, Tang H-J, Zhang H-S (2008).

Overexpression of a TFIIIA-type zinc ﬁnger protein gene ZFP252 enhances drought

and salt tolerance in rice (Oryza sativa L.). FEBS Lett 582:1037–1043

88. Yamaguchi-Shinozaki K and Shinozaki K (2006). Transcriptional regulatory

networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses. Annu

Rev Plant Biol 57: 781–803

89. Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (1993). Arabidopsis DNA encoding two

desiccation responsive rd29 genes. Plant Physiol. 101: 1119–1120

90. Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (1994). A novel cis-acting element in an

Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low-temperature or high-

salt stress. Plant Cell 6: 251–264.

91. Yang S, Vanderbeld B, Wan J, Huang Y (2010). Narrowing down the targets:

towards successful genetic engineering of drought-tolerant crops. Mol Plant 3(3):

469–490.

92. Zou M, Guan Y, Ren H, Zhang F, Chen F (2008). A bZIP transcription factor,

OsABI5, is involved in rice fertility and stress tolerance. Plant Mol Biol 66: 675–

683

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô địa phương Việt Nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng

MỤC LỤC

hết là nhờ ứng dụng rộng rãi giống ngô biến đổi gen và giống ngô lai, đồng thời

không ngừng cải thiện các biện pháp kỹ thuật canh tác. Tuy nhiên, trong năm

 Phương pháp biến nạp vào tế bào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện

-

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn năm 2023 tại tỉnh Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xác định biến đổi gen ở một số bệnh nhân thông liên nhĩ bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích toàn bộ hệ gen ty thể và đa hình nucleotide đơn vùng không trao đổi chéo của nhiễm sắc thể Y người Việt Nam thuộc năm dân tộc Pa Kô, Cơ-Tu, Rơ-Măm, Kinh miền Trung và Kinh miền Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn có lợi sinh trưởng trong môi trường chứa tảo

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh rụng lá Pestalotiopsis hại cây cao su tại một số vùng trồng chính của Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng gene kháng thuốc, gene độc lực và hệ vi khuẩn đường ruột cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng giải trình tự metagenomics

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm gây hại trên hòm gỗ thu thập tại đồng nai và khảo sát hiệu quả ức chế nấm của một số chế phẩm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sử dụng thông tin di truyền trên vùng gen ITS DNA trong định loại các mẫu sâm (Panax L.) thu thập ở tỉnh Hà Giang

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok