Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái và mức độ phân tử tập đoàn các dòng lúa đột biến được tạo ra từ giống lúa ST19 và Q2

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THÁI DƯƠNG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ HÌNH THÁI VÀ MỨC ĐỘ PHÂN TỬ TẬP ĐOÀN CÁC DÒNG LÚA ĐỘT BIẾN ĐƯỢC TẠO RA TỪ GIỐNG LÚA ST19 VÀ Q2

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã ngành: 8420114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Khuất Hữu Trung

Đơn vị công tác: Viện Di Truyền Nông Nghiệp Việt Nam

Hà Nội – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này được thực hiện bởi bản thân tôi dưới

sự hướng dẫn của PGS.TS. Khuất Hữu Trung. Kết quả đề tài là một phần kết

quả của đề tài NCS. Hoàng Thị Loan: “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân

tử và đột biến thực nghiệm để nâng cao chất lượng lúa ST19 và Q2”. Các

số liệu và tài liệu trích dẫn nêu trong luận văn là trung thực. Kết quả nghiên

cứu trong luận văn này không trùng với bất kì công trình nào đã được công bố

trước đó.

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thái Dương

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Khuất Hữu Trung, người hướng

dẫn đề tài, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ, cung cấp

tài liệu, kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái – Viện Hàn

lâm khoa học Việt Nam, Ban Lãnh đạo Viện Di Truyền Nông Nghiệp, các

anh chị em bộ môn Kĩ Thuật Di Truyền – Viện Di Truyền Nông Nghiệp đã

tạo điều kiện và hỗ trợ cho quá trình học tập, nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn đề tài độc lập cấp nhà nước, mã số ĐT.ĐL-

G36.2012, cảm ơn NCS – Hoàng Thị Loan đã thiết kế, hướng dẫn và trực tiếp

bố trí các thí nghiệm cho tôi, động viên, giúp đỡ, cung cấp tài liệu, và tạo điều

kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài.

Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã

yêu thương, thông cảm, chia sẽ, an ủi, khích lệ tôi trong những lúc khó khăn

khi thực hiện luận văn, giúp tôi có thêm động lực để hoàn thành chương trình

học và thực hiện nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn

Nguyễn Thái Dương

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ ii

MỤC LỤC ............................................................................................................................ iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................ v

DANH SÁCH BẢNG .......................................................................................................... vii

DANH SÁCH HÌNH .......................................................................................................... viii

PHẦN I: MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

PHẦN II. NỘI DUNG ........................................................................................................... 4

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 4

1.1.Tổng quan về cây lúa ....................................................................................................... 4

1.1.1.Nguồn gốc và phân loại cây lúa .................................................................................... 4

1.1.2.Đặc tính nông học của các giống lúa ............................................................................ 5

1.2.Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái về năng suất, chất lượng ....................... 7

1.2.1.Một số các chỉ tiêu đánh giá của đặc tính nông học ảnh hưởng đến năng suất cây

lúa..................... ...................................................................................................................... 7

1.2.2.Phương pháp đánh giá đặc tính nông học ở lúa ............................................................ 9

1.3.Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử ............................................................... 10

1.3.1.Sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa ...................................................... 10

MỤC LỤC

1.3.2.Nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa ở mức độ phân tử trên thế giới ...................... 14

1.3.3.Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa mức độ phân tử của Việt Nam ........ 15

1.3.4.Một số thành tựu trong chọn tạo giống lúa chất lượng ............................................... 16

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 20

2.1.Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................................ 20

2.2.Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 20

2.3.Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 21

2.3.1.Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng ......................................................................... 21

2.3.1.1.Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử ..................................................... 30

2.3.2.phân tích số liệu .......................................................................................................... 33

2.4.Địa điểm và thời gian thực hiện ..................................................................................... 34

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 35

3.1.Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái ............................................................. 35

iii

3.1.1.Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của các dòng lúa đột biến và đối

chứng....................................................................................................................................41

3.2.Đa dạng di truyền của các dòng nghiên cứu và giống gốc dựa vào các đặc điểm hình

thái........................................................................................................................................47

3.3.Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử ............................................................... 52

3.3.1.Kết quả tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 52

3.3.2.Kết quả phân tích đa hình DNA bằng các chỉ thị phân tử SSR .................................. 53

3.5.3.Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của các dòng lúa nghiên cứu....60

3.5.3.1.Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của 20 dòng lúa đột biến và

giống gốc ST19 .................................................................................................................... 60

3.5.3.2. Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của 4 dòng lúa đột biến và

giống gốc Q2 ........................................................................................................................ 64

PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 65

1. Kết luận ............................................................................................................................ 65

2. Kiến nghị .......................................................................................................................... 66

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ..................................................................... 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 68

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Amylose Content of the Grain AMY

Alkali Digestion AlkD

Coding sequence CDS

Chỉ thị phân tử CTPT

Culm Strength CS

Deoxyribonucleic acid DNA

ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long

External Antisense Primer EAP

External Sense Primer ESP

Panicle Exsertion EXS

Plant Height HT

Tỷ lệ dị hợp tử H%

Internal Fragrant Antisense Primer IFAP

Internal Non-fragrant Sense Primer INSP

International Rice Research Institute IRRI

National Center for Biotechnology Information NBCI

Tỷ lệ số liệu khuyết thiếu M%

Nhiễm Sắc Thể NST

Nghiên cứu sinh NCS

Polymerase Chain Reaction PCR

Quantitative Trait Loci QTL

Random Amplified Polymorphic DNAs RAPD

Restriction Fragment Length Polymorphisms RFLP

Scent SCT

Leaf Senescence SEN

Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá cây lúa SES

SNP Single Nucleotide Polymorphism

SSR Simple Sequence Repeats

STS Sequence Tagged Sites

TGST Thời gian sinh trưởng

TLC Thin layer chromatography

USDA United States Department of Agriculture

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1: Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa ...... 5

Bảng 2.1. Tên và liều đột biến của các dòng đột biến và giống gốc được

nghiên cứu.. ..................................................................................................... 20

Bảng 2.2: Tên và vị trí các mồi trên nhiễm sắc thể ......................................... 26

Bảng 2.3. Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lượng amylose cho lúa (IRRI, 1988)

……………………………………………………………………………… 29

Bảng 2.4. Bảng phân cấp độ trở hồ (IRRI, 1979) ........................................... 29

Bảng 2.5. Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979) .................... 30

Bảng 2.6. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR...32

Bảng 2.7. Chương trình chạy của phản ứng PCR .......................................... 32

Bảng 2.8. Các tính trạng hình thái nông học và thang điểm ........................... 24

Bảng 3. 1. Kết quả đánh giá các chỉ tiêu đặc tính nông học của các dòng đột

biến và đối chứng được gieo trồng vào vụ mùa năm 2016 ............................. 37

Bảng 3. 2. Kết quả đánh giá mật độ chỉ tiêu đặc tính chất lượng của các dòng

đột biến và đối chứng được gieo trồng vào vụ mùa năm 2016 ....................... 41

Bảng 3. 3. Kết quả kiểm tra gen BAD2 của các dòng lúa nghiên cứu ........... 44

Bảng 3. 4. Số alen thể hiện và hệ số PIC của 20 cặp mồi SSR trên các dòng

đột biến từ giống ST19 .................................................................................... 56

Bảng 3 5. Số alen thể hiện và hệ số PIC của 20 cặp mồi SSR trên các dòng đột

biến từ giống Q2 .............................................................................................. 57

Bảng 3 6.Tỷ lệ dị hợp tử (H%) và tỷ lệ số liệu khuyết (M%) của các dòng lúa

đột biến từ giống ST19 .................................................................................... 59

Bảng 3 7.Tỷ lệ dị hợp tử (H%) và tỷ lệ số liệu khuyết (M%) của các dòng lúa

đột biến từ giống Q2........................................................................................ 60

vii

Bảng 3 8. Hệ số tương đồng di truyền giữa giống ST19 và 20 dòng đột biến 62

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với mồi

BADH2………………………………………………………………………43

Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với mồi

W-xy…………..………………………………………………………….….46

Hình 3.3. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền dựa vào các đặc điểm hình

thái của 20 dòng đột biến và giống ST19....................................................... .49

Hình 3.4. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền dựa vào các đặc điểm hình

thái của 4 dòng đột biến và giống Q2 ............................................................. 51

Hình 3.6. ảnh điện di sản phẩm PCR các mồi SSR với các dòng đột biến và

đối chứng.........................................................................................................54

Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với cặp mồi RM224…………………………………………………………………..56 Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với cặp

mồi RM234......................................................................................................58

Hình 3.9. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 21 dòng lúa nghiên

viii

cứu...................................................................................................................63

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng đứng thứ ba trên

thế giới sau ngô và lúa mì. Tuy nhiên, gạo lại là lương thực chính cho khoảng

3,7 tỷ người trên hành tinh vào thời điểm hiện tại. Do được con người thuần

hóa và phát triển từ hàng ngàn năm về trước nên lúa có sự phân bố rộng trên

trái đất. Có đến 114 quốc gia coi lúa và cây trồng quan trọng, phân bố ở tất cả

các châu lục trên thế giới. Việc sản xuất lúa gạo tập trung chủ yếu ở các nước

châu Á, nơi chiếm hơn 91% về diện tích gieo trồng cũng như về sản lượng,

khoảng 9% còn lại được phân bố ở Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Phi. Do đó, các

chương trình chọn tạo giống lúa luôn được chú trọng và phát triển nhằm tăng

năng suất và chất lượng lúa, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ đang tăng trên toàn cầu.

Từ buổi đầu của nền văn minh, cây lúa là cây trồng được gắn liền với quá

trình phát triển của loài người và đã trở thành cây lương thực chính của Châu

Á nói chung, người Việt Nam ta nói riêng. Diện tích trồng lúa trên thế giới

không ngừng tăng, theo số liệu từ FAO đến năm 2016 diện tích trồng lúa

khoảng gần 163,3 triệu ha. Tại Việt Nam từ năm 1945 đến nay, theo tổng cục

thống kê diện tích trồng lúa gạo không ngừng được mở rộng, năng suất ngày một

tăng đến năm 2016 đạt 7,79 triệu ha. Từ những năm đầu thực hiện công cuộc đổi

mới của đất nước (1986), chúng ta vẫn nằm trong danh sách các nước thiếu lương

thực trầm trọng, song với đường lối đổi mới của Đảng ngành nông nghiệp đã có

bước khởi sắc, chúng ta từ một nước nhập khẩu lương thực đã trở thành nước xuất

khẩu gạo đứng thứ 2 thế giới (Nguyễn Thị Anh Hạnh, 2008) [7].

Hiện nay do tác động của biến đổi khí hậu, tình hình sản xuất gặp rất nhiều

khó khăn như:

Mất diện tích đất nông nghiệp do mực nước biển dâng, xâm lấn những cánh

đồng thấp trũng ven biển.

- Mùa đông có những đợt rét kéo dài, mùa hè thì hạn hán, nắng nóng, thiếu

nước dẫn đến hoang mạc hóa, sa mạc hóa trên những vùng đất cát, đất trống,

đồi trọc ảnh hưởng sự sinh trưởng phát triển của cây trồng dẫn đến giảm năng

suất sản lượng cây trồng, hiệu quả kinh tế và đe dọa đến an ninh lương thực.

- Biến đổi khí hậu làm thay đổi điều kiện sinh sống của các loài sinh vật, dẫn

đến tình trạng biến mất của một số loài và ngược lại làm xuất hiện nguy cơ

gia tăng các loài “gây hại”.

- Biến đổi khí hậu có thể tác động đến thời vụ, làm thay đổi cấu trúc mùa

mang gây thất thu, mất mùa.

Nhiệm vụ của công tác chọn tạo giống cây trồng là phải làm thế nào

trong thời gian ngắn nhất tạo ra được những giống cây trồng mới có năng suất

cao, phẩm chất tốt ổn định, khả năng chống chịu tốt với điều kiện bất thuận,

đáp ứng được yêu cầu sản xuất nông nghiệp và của nền kinh tế quốc dân. Tiến

hành thí nghiệm chọn, tạo ra các giống mới đưa ra sản xuất để bổ sung vào cơ

cấu giống là nhiệm vụ rất quan trọng. Bên cạnh đó việc đánh giá về năng suất,

chất lượng cũng như khả năng chống chịu sâu bệnh, đặc điểm hình thái, các

đặc tính nông học và phân tử của các dòng giống lúa đang được tạo ra là điều

cần thiết để chọn lọc ra những giống lúa phù hợp với điều kiện về địa lý và

cho năng suất và chất lượng gạo cao nhất. Vì vậy chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái và mức độ phân

tử tập đoàn các dòng lúa đột biến được tạo ra từ giống lúa ST19 và Q2.”

nhằm tìm ra những dòng lúa triển vọng có năng suất cao, chất lượng tốt

kháng sâu bệnh khá thích ứng được với các điều kiện môi trường biến đổi

khí hậu phức tạp hiện nay và góp phần bảo đảm an ninh lượng thực trong

nước và trên thế giới.

2. Mục tiêu của nghiên cứu

Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái, các yếu tố cấu thành

năng suất, chất lượng và đa dạng di truyền ở mức độ phân tử để xác định mối

quan hệ di truyền của tập đoàn các dòng lúa được tạo ra từ đột biến của giống

ST19 và Q2.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: 20 dòng lúa được phát triển từ giống ST19 và 4

dòng lúa được phát triển từ giống Q2 qua xử lí đột biến phóng xạ và chọn lọc

đến thế hệ M6 và đối chứng lần lượt là giống gốc ST19 và Q2.

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 5/2016 đến tháng 8/2018.

- Địa điểm nghiên cứu: Thực hiện các thí nghiệm phân tử tại Bộ môn Kỹ

thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp.

Thí nghiệm đồng ruộng được thực hiện tại: Khu nhà lưới Trường Đại

học sư phạm kỹ thuật Hưng Yên.

Khu khảo nghiệm lúa Trường Cao đẳng nghề Kinh tế Kỹ thuật Tô Hiệu

Hưng Yên.

4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Cung cấp thêm nhiều dữ liệu thông tin về đa dạng di truyền ở mức độ

hình thái và phân tử của các dòng đột biến tạo từ giống ST19 và Q2.

Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài góp phần chọn lọc các dòng ưu tú về tiềm năng năng suất cũng

như chất lượng từ 20 dòng đột biến từ ST19 và 4 dòng đột biến từ Q2.

PHẦN II. NỘI DUNG

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây lúa

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa

Lúa trồng (Oryza sativa L.) là cây trồng có từ lâu đời và gắn liền với

quá trình phát triển của xã hội loài người, nhất là vùng châu Á. Theo Mai Thọ

Trung (1990) [15], lúa trồng hiện nay có nguồn gốc từ lúa dại (Oryza fatua,

Oryza off Cinalis, Oryza minuta) do quá trình chọn lọc tự nhiên và chọn lọc

nhân tạo lâu dài tạo nên.

Lúa trồng thuộc:

Giới : thực vật (Plantae),

Ngành : thực vật có hoa (Angios permes),

Lớp : một lá mầm (Mono Cotyledones),

Bộ : hoà thảo có hoa (Poales),

Họ : hoà thảo (Poaceae) trước đây gọi là họ Graminae,

Chi : Oryza,

Chi Oryza có 23 loài phân bố rộng khắp thế giới. Loài Orazy sativa L.

được trồng phổ biến ở khắp các nước trên thế giới và phần lớn tập trung ở

châu Á. Loài Oryza glaberrima S. được trồng). Loài Oryza sativa L. được

chia làm ba loài phụ:

- Loài phụ Japonica phân bố ở những nơi có vĩ độ cao (bắc Trung

Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên), có những đặc điểm như chịu rét cao nhưng ít

chịu sâu bệnh.

- Loài phụ Indica được trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới

(Việt Nam, Ấn Độ, Mianma, Philippin). Loài phụ Indica có đặc điểm: hạt dài,

thân cao, mềm, dễ đổ, chịu sâu bệnh khá, năng suất thấp, mẫn cảm với chu kỳ

ánh sáng.

- Loài phụ Javanica có hình thái trung gian giữa Indica và Japonica.

Hạt dài nhưng dày và rộng hơn hạt của Indica, chỉ được trồng ở một vài nơi

thuộc Indonesia.

Bảng 1.1: Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa

Đặc Japonica Indica Javanica tính

Thân - Thân cao - Thân cao trung bình - Thân thấp

Chồi - Nở bụi mạnh - Nở bụi thấp - Nở bụi trung bình

- Lá rộng, xanh - Lá rộng, cứng, xanh - Lá hẹp, xanh đậm Lá nhạt nhạt

- Hạt thon dài, dẹp - Hạt tròn, ngắn - Hạt to, dầy - Hạt hầu như - Hạt không đuôi tới - Hạt không có đuôi không có đuôi có đuôi dài hoặc có đuôi dài Hạt - Trấu ít lông và - Trấu có lông dài và - Trấu có lông dài lông ngắn dày - Ít rụng hạt - Hạt dễ rụng - Ít rụng hạt

Sinh - Tính quang cảm - Tính quang cảm rất - Tính quang cảm rất

học rất thay đổi yếu thay đổi

1.1.2. Đặc tính nông học của các giống lúa

Lúa là cây thân thảo sinh sống hàng năm. Thời gian sinh trưởng của các

giống dài ngắn khác nhau và trong khoảng 60 - 250 ngày tuỳ theo giống, vụ

lúa chiêm hay mùa, cấy sớm hay muộn. Chu kỳ sinh trưởng, phát triển của

cây lúa bắt đầu từ hạt và cây lúa cũng kết thúc một chu kỳ của nó khi tạo ra

hạt mới. Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa có thể được chia làm

hai giai đoạn: Giai đoạn sinh trưởng được tính từ thời kì mạ đến đẻ nhánh;

Giai đoạn sinh thực tính từ thời kì làm đốt đến hạt chín.

Các nhân tố sinh thái (nhiệt độ, ánh sáng, nước, đất…) thường xuyên ảnh

hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa, trong đó nhiệt độ có tác dụng

quyết định. Ở mỗi giai đoạn sinh trưởng, cây lúa yêu cầu nhiệt độ khác nhau,

nhiệt độ thích hợp nhất là 280C - 320C, ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ dưới

130C. Nhiệt độ tối thích cho nảy mầm là 200C - 350C, ra rễ là 250 C - 280 C,

vươn lá là 310C (Lê Trần Bình và cộng sự, 1995) [1]. Ánh sáng tác động tới

cây lúa thông qua cường độ chiếu sáng và thời gian chiếu sáng. Quang hợp

của lúa nước tiến hành thuận lợi ở điều kiện chiếu sáng 250 - 400

cal/cm2/ngày (Trần Kim Đồng và cộng sự, 1991) [5]. Cường độ ánh sáng

trong ngày ảnh hưởng đến quá trình ra hoa, kết quả ở lúa. Dựa vào phản ứng

quang chu kỳ người ta chia cây lúa làm 3 loại: loại phản ứng với ánh sáng

ngày dài, yêu cầu thời gian chiếu sáng trên 13 giờ/ngày; loại phản ứng với

ánh sáng ngày ngắn, yêu cầu thời gian chiếu sáng dưới 13 giờ/ngày; loại phản

ứng trung tính có thể ra hoa trong bất cứ điều kiện ngày ngắn hay ngày dài

(Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998) [2].

Lúa yêu cầu nhiều nước hơn các cây trồng khác, để tạo ra 1g chất khô

cây lúa cần 628g nước. Lượng nước cần thiết cho cây lúa trung bình 6 -

7mm/ngày trong mùa mưa, 8 - 9mm/ngày trong mùa khô. Đất trồng lúa tốt

nhất là đất thịt, trung tính đến sét, có hàm lượng N, P, K tổng số cao; pH = 4,5

- 7,0, độ mặn nhỏ hơn 0,5% tổng số muối tan [5, 4].

Đặc điểm hình thái dòng lúa ST19

Giống lúa ST19 là giống lúa thuộc loài phụ Indica, có thời gian sinh

trưởng 115-120 ngày vụ xuân, vỏ trấu có màu nâu. Hạt gạo trong, cơm mềm,

dẻo, hàm lượng amylose 18%- 21% có mùi thơm. Hạt gạo ST19 dài 7,5mm,

đang được trồng phổ biến ở các tỉnh phía Nam, nhất là các tỉnh Sóc Trăng và

Cà Mau. Giống có năng suất khá, đặc biệt là chất lượng cao, chịu phèn mặn

khá, có kiểu hình đẹp, lá hình lòng mo, chịu thâm canh, năng suất khá, chỉ

thích ứng ở phía Nam, khi giống mang ra trồng ở phía Bắc thì giống có 4

nhược điểm lớn cần khắc phục: Dài ngày, năng suất thấp; Bông thưa, tỷ lệ lép

cao; Nhiễm sâu bệnh nặng, nhất là bạc lá và rầy nâu; Chịu rét kém vào vụ

đông xuân.

Đặc điểm hình thái dòng lúa Q2

Giống Q2 có thời gian sinh trưởng 130-140 ngày vụ xuân, hàm lượng

amylose 25%, năng suất cao đạt 60-65 tạ/ha nhưng cơm cứng và dài ngày.

1.2. Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái về năng suất, chất

lượng

1.2.1. Một số các chỉ tiêu đánh giá của đặc tính nông học ảnh hưởng đến

năng suất cây lúa

Trong sản xuất lúa, năng suất là mục tiêu cuối cùng và là một chỉ tiêu

kinh tế quan trọng, có ý nghĩa quyết định đến sự tồn tại hay không tồn tại của

một giống lúa. Mặt khác năng suất là chỉ tiêu tổng hợp phản ánh kết quả của

một giống. Khả năng cho năng suất của các giống lúa được thể hiện qua các

yếu tố cấu thành năng suất như: Số bông/m2, số hạt chắc/bông, khối lượng

1000 hạt, các yếu tố này liên quan chặt chẽ với nhau. Số bông/m2 phụ thuộc

vào quá trình đẻ nhánh hữu hiệu và số cây trên đơn vị diện tích. Dựa vào điều

kiện đất đai, dinh dưỡng, khí hậu của địa phương và đặc điểm của từng giống

để quyết định mật độ cấy, tỷ lệ đẻ nhánh từ đó sẽ quyết định số bông, số hạt,

tỷ lệ hạt chắc và năng suất cuối cùng.

Khả năng đẻ nhánh: Đẻ nhánh là tập tính sinh học của cây lúa, nhanh

được hình thành từ các mắt trên thân. Các mầm này có thể phát triển thành

nhánh khi gặp điều kiện thuận lợi. Khả năng đẻ nhánh nhiều hay ít phụ thuộc

và đặc điểm của từng giống, tùy thuộc vào tuổi mạ, kỹ thuật cấy, điều kiện

dinh dưỡng, nước, điều kiện ngoại cảnh. Cây lúa càng nhiều nhánh, tỉ lệ

nhánh hữu hiệu cao thì cho năng suất càng cao.

Độ cứng cây: Ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất của lúa. Trong thời kì

hạt bắt đầu chín, độ cứng cây cần đạt yêu cầu để giữ cho cây lúa không bị đổ

gục trước những đợt gió hoặc mưa to. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ cứng cây

như bón phân, ánh sáng và chất lượng giống. Cây càng yếu thì khả năng nâng

đỡ bông lúa càng kém.

Chiều cao cây: Chiều cao cây là một chỉ tiêu quan trọng, ảnh hưởng tới

năng suất, những giống có chiều cao cây thấp, thân rạ cứng thường là những

giống chịu thâm canh cao, khả năng tích luỹ vật chất khô lớn, có tiềm năng

cho năng suất cao. Chiều cao cây là đặc trưng của từng giống. Chiều cao cây

phụ thuộc vào điều kiện canh tác, chăm sóc, thời vụ gieo trồng,... khác nhau

thì chiều cao cây cũng khác nhau, ngoài ra chiều cao cây còn phụ thuộc vào

chiều dài lóng và số lóng trên thân. Xu hướng chọn tạo hiện nay của Việt

Nam cũng như trên thế giới là chọn lọc ra nhiều giống lúa mới có năng suất

cao, phẩm chất tốt, cây thấp chịu thâm canh, có khả năng chống chịu tốt với

điều kiện ngoại cảnh và sâu bệnh hại.

Độ thoát cổ bông: Khả năng không trỗ thoát cổ bông nhìn chung được

coi là một nhược điểm di truyền, có ảnh hưởng đến năng suất lúa nếu giống

lúa có tỉ lệ thoát cổ bông thấp, nhiều hạt lúa không thoát ra khỏi bẹ lá đòng

dẫn tới hình thành hạt lép.

Thời gian sinh trưởng: Thời gian sinh trưởng của các giống lúa bắt đầu

từ khi gieo đến khi thu hoạch được chia làm nhiều giai đoạn khác nhau, các

giai đoạn sinh trưởng luôn biến động theo giống, mùa vụ tác động của con

người thông qua các biện pháp kỹ thuật trong quá trình sản xuất. Sinh trưởng,

phát triển là một chỉ tiêu quan trọng liên quan chặt chẽ với năng suất lúa. Quá

trình sinh trưởng, phát triển của lúa thể hiện trên đồng ruộng là kết quả của sự

phản ánh tính bền vững của giống về mặt di truyền, đồng thời cũng phản ánh

được khả năng phản ứng của giống với điều kiện ngoại cảnh. Hay nói cách

khác, các giống khác nhau thì đặc tính của từng giống là khác nhau.

- Năng suất hạt: Trên ruộng lúa số bông/m2 phụ thuộc rất nhiều vào khả

năng đẻ nhánh và sức đẻ nhánh hữu hiệu. Như vậy, muốn nâng cao số bông

trên đơn vị diện tích nhất thiết phải tác động, thúc đẩy hai yếu tố trên một

cách hài hoà nhất. Thực tế ta thấy rằng quần thể ruộng lúa có quy luật tự điều

tiết, không cho phép cấy dày hay thưa quá vì không phù hợp với những lợi ích

về kinh tế và kỹ thuật. Số hạt/bông nhiều hay ít tuỳ thuộc vào số gié, hoa phân

hoá cũng như số gié, hoa thoái hoá, các quá trình này nằm trong thời kỳ cây

lúa sinh trưởng sinh thực (làm đòng). Hạt chắc/bông là yếu tố ảnh hưởng rất

lớn đến năng suất. Thời kỳ quyết định hình thành số hạt chắc/bông bắt đầu từ

thời kỳ phân hoá đòng đến cuối thời kỳ vào chắc (từ trước trỗ 30 ngày đến sau

trỗ 15 ngày).

1.2.2. Phương pháp đánh giá đặc tính nông học ở lúa

Để đánh giá các các yếu tố về đặc tính nông học ảnh hưởng đến năng

suất và chất lượng lúa trên thế giới thường sử dụng hệ thống tiêu chuẩn đánh

giá cây lúa (SES) theo tiêu chuẩn IRRI (1996) [21]. Riêng tại Việt Nam còn

có thêm hệ thống đánh giá theo thang điểm của tiêu chuẩn ngành quy phạm

khảo nghiệm giống lúa 10 TCN 558 - 2002.

Phương pháp đánh giá theo IRRI (1996) [21] giúp các nhà nghiên cứu

lúa trên thế giới có một tiếng nói chung trong công tác đánh giá đặc tính của

cây lúa, tạo điều kiện thuận lợi cho việc thu thập, xử lý và phân tích các số

liệu trong những thí nghiệm đa môi trường, tăng cường phương pháp tiếp cận

đa lĩnh vực trong công tác cải thiện giống lúa, thang điểm SES đánh giá hàng

loạt các đặc tính di truyền nhằm phân nhóm xếp hạng các tập đoàn quỹ gen

cây lúa hoặc các dòng lai. Tuy nhiên, vẫn còn một số hạn chế trong cách đánh

giá này là phức tạp trong các phương pháp thang điểm và đánh giá sự giao

động giữa các tính trạng.

Với phương pháp khảo nghiệm DUS theo tiêu chuẩn ngành của Bộ nông

nghiệp và Phát triển nông thôn. Quy phạm này quy định nguyên tắc, nội dung

và phương pháp khảo nghiệm tính khác biệt (Distinctness), tính đồng nhất

(Uniformity), tính ổn định (Stability) - gọi tắt là khảo nghiệm DUS - của các

giống lúa mới, bao gồm giống thuần (true line varieties), các dòng bố mẹ lúa

lai và giống lai F1 (hybrid varieties), thuộc loài Oryza sativa Linn.

Hiện nay có nhiều vùng, địa phương tiến hành đánh giá chất lượng giống

lúa dựa trên năng suất và phẩm chất của giống lúa, đánh giá các đặc tính nông

học như chịu hạn, chịu mặn, thời gian sinh trưởng, khả năng chống chịu sâu

bệnh được cho là những ưu tiên khi đánh giá một giống lúa, xem nó có phù

hợp với địa lý và điều kiện ở địa phương, khu vực gieo trồng hay không.

Abifarin và cộng sự (1972) [16], nghiên cứu đặc điểm nông sinh học và

năng suất trong điều kiện nước trời và có tưới nước tiến hành theo dõi các đặc

điểm liên quan đến khả năng chịu hạn như độ cuốn lá, độ khô lá, độ tàn lá,

khả năng trỗ thoát, khả năng chịu hạn, khả năng phục hồi sau 7 ngày khi kết

thúc đợt hạn tự nhiên (khi có mưa trở lại) theo thang điểm của IRRI. Theo

Nguyễn Thanh Tuyền (2006) [14], kết quả nghiên cứu về một số đặc điểm

nông sinh học và chỉ tiêu chất lượng của các dòng giống lúa tẻ thơm ngắn

ngày năng suất cao. Thời gian sinh trưởng của các dòng giống lúa trong các

vụ xuân dao động từ 128 ngày (KD18) đến 142 ngày (D30, D23, DTT05) vụ

mùa từ 110 ngày (KD18) đến 119 ngày (D30, D23). Như vậy các dòng này

thuộc nhóm có thời gian sinh trưởng ngắn thích hợp với trà xuân muộn và

sớm. Các dòng lai đều có TGST dài hơn cả 2 bố mẹ (LT2, KD18).

1.3. Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử

1.3.1. Sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa

Chỉ thị phân tử (CTPT) là các chỉ thị chọn lọc trực tiếp dựa trên cấu trúc

phân tử DNA.

Các chỉ thị di truyền được phát hiện thông qua phương pháp đánh dấu

các đoạn oligonucleotit và đều có một số đặc điểm chung là không bị ảnh

hưởng bởi các yếu tố môi trường, thường liên kết với các tính trạng trội hoặc

siêu trội, mang tính ổn định và di truyền qua các thế hệ. Số lượng các chỉ thị

DNA là rất lớn, cây trồng có khoảng 108 - 1010 Nucleotit trong DNA tổng số

và vì thế nếu giữa 2 cá thể chỉ cần có sự sai khác nhỏ thì giữa chúng sẽ có một

số lượng khổng lồ các chỉ thị DNA để phân biệt sự sai khác đó. Theo lý

thuyết, một chỉ thị DNA lý tưởng phải đáp ứng đầy đủ các yêu cầu sau:

- Cho đa hình cao

- Di truyền đồng trội

- Xuất hiện nhiều trong bộ gen

- Tập tính chọn lọc trung tính

- Dễ tiếp cận

- Phân tích nhanh, dễ dàng

Tuy nhiên, việc tìm được một chỉ thị phân tử có thể thoả mãn được tất cả

các yêu cầu trên là điều rất khó khăn. Tuỳ thuộc vào từng nghiên cứu mà

người ta sử dụng hệ thống các chỉ thị phù hợp cho mục đích của mình. Các

chỉ thị phân tử được phân loại dựa trên phương pháp thực hiện với chúng bao

gồm: chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA (chỉ thị RFLP) và chỉ thị dựa trên cơ sở

nhân bản DNA (chỉ thị RADP, SSR,…)

 Chỉ thị RFLP

RFLP là một kỹ thuật áp dụng để phân biệt các sinh vật với nhau bằng

cách phân tích các kiểu dẫn xuất hình thành từ việc cắt nhỏ DNA của chúng.

Nếu hai sinh vật khác nhau về các khoảng cách giữa các vị trí phân cắt vốn

thực hiện bởi các enzymes cắt giới hạn giữa chuỗi đặc hiệu (particular

Restriction Endonucleases), chiều dài của các đoạn hình thành sẽ khác nhau

khi mà DNA bị phân giải bởi các enzyme cắt giới hạn đó. Sự giống nhau hay

không giữa các mẫu khảo sát dựa trên RFLP có thể được sử dụng để phân biệt

ra các loài (và thậm chí các dòng) trong số các sinh vật được nghiên cứu.

Bằng kỹ thuật RFLP thì sự khác nhau giữa các sinh vật có nguồn gốc từ sự

sắp xếp lại DNA xảy ra trong quá trình tiến hóa hoặc đột biến điểm xảy ra

trong trình tự DNA tại vị trí nhận dạng để hoạt động của Restriction

Endonuclease hoặc việc thêm, mất một hay nhiều nucleotides hay giao chéo

không cân bằng. Như thế, một đa hình có thể sử dụng để phân biệt các loài

thực vật, các kiểu gene hay trong vài trường hợp là giữa các cá thể cùng loài.

Trong phân tích RFLP, sản phẩm phân giải DNA bộ gene bằng enzyme cắt giới

hạn có thể được phân tách nhau theo kích thước bằng điện di trên gel và sau đó

được thấm lại vào một màng nitrocellulose. Các kiểu băng đặc trưng sẽ được

nhìn thấy bằng cách lai với DNA thăm dò có đánh dấu. Việc đánh dấu này có

thể được thực hiện với các đồng vị phóng xạ hay các chất nhuộm không phóng

xạ khác như digoxigenin hay fluoresein. Những DNA thăm dò này chủ yếu là

các DNA thăm dò đơn locus đặc trưng cho loài kích thước khoảng 0,5 – 3 kb

nhận được từ thư viện cDNA hay một thư viện bộ gene nào đó.

RFLP có thể ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng và phát sinh loài trên

dải đối tượng từ các cá thể đến quần thể, từ trong loài đến các loài có quan hệ

họ hàng gần. RFLP được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu lập bản đồ

gene bởi tính phong phú cao của chúng trên bộ gene, khả năng ứng dụng rộng

của các enzyme cắt giới hạn khác nhau và sự phân bố ngẫu nhiên suốt bộ

gene của các RFLP (Neale và Williams, 1991) [26]. RFLP cũng được sử dụng

trong nghiên cứu khảo sát mối quan hệ giữa các bậc phân loại gần, hoặc sử

dụng như một công cụ làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA (DNA

fingerprinting), trong nghiên cứu về đa dạng di truyền lai, chuyển gene quan

tâm vào sinh vật và bao gồm cả những nghiên cứu về dòng gene hay phân bố

gene giữa các cây trồng. Các marker RFLP cũng được sử dụng lần đầu trong

việc xây dựng bản đồ di truyền bởi Botstein và cộng sự năm 1980, từ đó một

bộ các marker RFLP phát hiện được đã tạo nhiều cơ hội cho việc phát triển

một bản đồ chi tiết ở rau diếp (Landry và cộng sự, 1987) [24].

 Chỉ thị RAPD

RAPD là một kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR. Phương pháp được dựa trên

cơ sở sự khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu hay ngẫu nhiên dưới tác động

của enzyme với các mồi tùy chọn, kỹ thuật này được Welsh và McClelland

phát triển năm 1991. Trong phản ứng RAPD, một chủng loại mồi đơn sẽ gắn

vào DNA bộ gene ở hai vị trí khác nhau trên hai mạch bổ sung của DNA

khuôn mẫu. Trung bình, mỗi mồi sẽ dẫn đến việc khuếch đại một vài locus

riêng rẽ trên bộ gene, đó là cơ sở cho sự hữu dụng của RAPD cho việc sàng

lọc một cách hiệu quả các đa hình trình tự nucleotide giữa các cá thể. Tuy

nhiên, vì tính ngẫu nhiên một cách tự nhiên trong việc khuếch đại DNA với

các mồi có trình tự ngẫu nhiên, điều quan trọng là phải tối ưu hóa và duy trì

điều kiện phản ứng cho việc nhân mạch đôi DNA. Các oligonucleotide trung

bình khoảng 10 nucleotide được sử dụng trong vai trò cả hai mồi xuôi và

ngược và được sử dụng để khuếch đại đồng thời các đoạn DNA từ 1- 10 vị trí

bắt mồi trên bộ gene. Sản phẩm khuếch đại (thường trong dải kích thước

khoảng 0,5 – 5kb) được phân tách nhau trên gel agarose với sự có mặt của

ethidium bromide hay các chất nhuộm khác để có thể được nhìn thấy dưới tia

cực tím. Qua đó, sự hiện diện hay thiếu vắng của các band sẽ được quan sát.

Những đa hình này được xem như là căn bản bởi sự biến động về vị trí bắt

mồi, nhưng chúng cũng có thể được hình thành bởi sự khác nhau về chiều dài

trình tự được khuếch đại nằm giữa các vị trí bắt mồi.

Việc ứng dụng các RAPD và các marker được cải biến liên quan trong

phân tích sự biến động và kiểu gene đặc trưng cá thể đã được thực hiện một

cách rộng rãi, nhưng kém thông dụng hóa bởi những vấn đề như khả năng tái

lặp kết quả thí nghiệm kém hoặc tạo các sản phẩm mơ hồ và khó để có được

các band rõ ràng để có thể đưa đến những kết luận một cách phù hợp. RAPD

đã được sử dụng với nhiều mục đích, từ nghiên cứu ở mức độ cá thể (như xác

định đa dạng di truyền) đến nghiên cứu liên quan đến những loài họ hàng gần

nhau. RAPD cũng đã và đang được ứng dụng vào việc nghiên cứu lập bản đồ

gene để lấp đầy những lỗ hổng mà các marker khác chưa thực hiện được

(Hadrys và cộng sự, 1992) [19].

 Chỉ thị SSR

Khái niệm microsatellite được Litt và Lutty đặt ra năm 1988 và cũng

được biết đến như là SSR - các phân đoạn ngắn DNA, bao gồm các đơn vị lặp

của nucleotide đơn, 2- , 3-, 4- hay 5- nucleotide lần lượt nối tiếp nhau xuất

hiện khắp bộ gene của phần lớn các loài nhân thật. Chỉ thị SSR, vốn được

phát triển từ các thư viện gene, có thể thuộc về vùng phiên mã hay không

phiên mã trên bộ gene và hiếm khi chúng mang thông tin có giá trị liên quan

đến chức năng. SSR đặc biệt thích hợp để phân biệt các kiểu gene có quan hệ

họ hàng gần, bởi mức độ biến động cao của chúng, vì thế chúng được ưa thích

khi sử dụng trong các nghiên cứu về quần thể và cho việc nhận dạng các

chủng giống nông nghiệp có quan hệ gần. SSR thể hiện một tính đa hình cao

nên chúng là những chỉ thị có thể được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về di

truyền quần thể cũng như các nghiên cứu quan hệ phát sinh từ mức độ cá thể

(như nhân dòng vô tính và xác định các dòng) đến mức độ những loài có quan

hệ họ hàng gần. Ngược lại, tỷ lệ đột biến cao của chúng làm cho chúng không

thích hợp trong nghiên cứu phân biệt các taxon có quan hệ phát sinh xa nhau.

SSR được xem là các mồi lý tưởng trong nghiên cứu lập bản đồ gene (Jarne

và Lagoda, 1996) [22].

Marker SSR đã được chứng minh tính hữu dụng cho việc đánh giá biến động

di truyền trong chọn lọc các sinh vật (Mohammadi và Prasanna, 2003) [27].

1.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa ở mức độ phân tử trên thế giới

Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học cùng với sự ra đời của

nhiều loại chỉ thị chỉ thị cũng như số lượng của mỗi loại chỉ thị đã làm tăng

hiệu quả trong quá trình đánh giá, bảo tồn, khai thác và sử dụng trong với

mục đích khác nhau. Chỉ thị DNA được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu

di truyền thực vật mà phân tích đa dạng di truyền, xác định các locus kiểm

soát các tính trạng, hay chọn giống phân tử là các lĩnh vực được triển khai

hiệu quả.

Tác giả Olufowote (1997) [28], nghiên cứu biến động di truyền trong

giống của 171 giống lúa bằng cả hai loại chỉ thị SSR và RFLP. Kết quả cho

thấy, các giống lúa địa phương có mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao

hơn các giống lúa cải tiến. Cả hai phương pháp đều cho thấy số lượng các

alen ở các giống lúa địa phương cao hơn hẳn các giống lúa cải tiến. Chỉ thị

SSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi, đồng thời

số lượng alen cao hơn chỉ thị RFLP.

Tác giả Yu và cộng sự (2003) [34] đã sử dụng 101 chỉ thị SSR để đánh

giá đa dạng 193 giống lúa từ 26 nước trên thế giới. Khoảng cách di truyền từ

0,13 - 0,88, trung bình là 0,68. Số alen/locus từ 2 - 11, trung bình 6,3/locus.

Kết quả phân tích nhóm đã phân tách 193 giống thành 3 nhóm chính và 9

phân nhóm. Nhóm I là các giống lúa Indica, nhóm II và III thuộc loài phụ

Japonica. Các locus thuộc nhiễm sắc thể 9, 12 phân biệt rõ nhất sự khác nhau

giữa Indica và Japonica.

Tác giả Lu H. và cộng sự (2005) [25] đã phân tích cấu trúc của quần thể

lúa ở Mỹ với 115 giống lúa trồng ở Mỹ và 30 giống lúa châu Á bằng 169 chỉ

thị SSR. Kết quả thu được 870 alen, trung bình 5,15 alen/locus. Tần số alen

hiếm rất cao, lên đến 50%, trong khi đó tần số alen phổ biến chỉ chiếm 24-

26% trong số 870 alen. Hệ số đa dạng PIC đạt khá cao: 0,80. Kết quả phân

nhóm cho thấy, 115 giống lúa đã phân thành ba nhóm: Japonica ôn đới với

đặc điểm hạt ngắn, Japonica nhiệt đới có đặc điểm hạt trung bình và Japonica

nhiệt đới hạt dài. Các giống lúa Indica đại diện cho các giống lúa truyền thống

thì phân chia thành các nhóm riêng.

1.3.3. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa mức độ phân tử

của Việt Nam

Việt Nam được coi là trung tâm khởi nguyên của cây lúa, tài nguyên di

truyền lúa của nước ta phong phú cả về số lượng và chất lượng. Nghiên cứu

đa dạng di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Nam còn

hạn chế. Tuy nhiên trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã quan tâm

ứng dụng chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng tài nguyên lúa nước ta.

Tác giả Trần Danh Sửu và cộng sự (2001) [9] sử dụng kỹ thuật RAPD để

nghiên cứu các giống lúa ở vùng Tây Bắc và Tây Nam nước ta cho thấy hầu

hết các giống lúa ở vùng Tây Bắc thuộc loài phụ Japonica, các giống lúa

nước ở Tây Nam nước ta thuộc loài phụ Indica. Bùi Chí Bửu đã sử dụng 20

mồi RAPD để đánh giá đa dạng di truyền của 72 giống lúa địa phương. Trong

20 mồi thử nghiệm thuộc nhóm OPA kit, có 10 mồi cho kết quả tốt với 59

băng. Kết quả có hai nhóm chính bao gồm các giống lúa mùa, lúa chiêm ở

đồng bằng sông Hồng, lúa nước sâu của đồng bằng sông Cửu Long, lúa nếp

của Tây Nguyên và lúa nước trời của Duyên Hải Trung bộ.

Trần Danh Sửu và cộng sự (2001) [9] sử dụng 48 chỉ thị SSR để đánh

giá đa dạng của 17 giống lúa Tám. Hệ số đa dạng gen thu được là 0,35. Số

alen thu được trung bình 3,37 alen/mồi. 17 giống lúa này còn được phân loại

Indica và Japonica dựa trên sự khác biệt của DNA lục lạp. Kết quả 17 giống

lúa Tám đều thuộc nhóm Japonica.

1.3.4. Một số thành tựu trong chọn tạo giống lúa chất lượng

 Trong chọn giống lúa thơm

Tác giả Sujatha (2004) [32] nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các giống

lúa Basmati bằng chỉ thị SSR. Nghiên cứu được tiến hành trên 30 giống lúa

thơm (bao gồm 22 giống lúa Basmati hạt ngắn và 8 giống Basmati hạt dài)

dựa trên 6 chỉ thị SSR. Kết quả cho thấy 20 trong số 22 giống lúa thơm hạt

ngắn nằm cùng một nhóm lớn, 2 giống lúa thơm hạt ngắn còn lại nằm cùng

nhau và tách riêng so với các nhóm khác, tám giống lúa Basmati hạt ngắn

nằm trong cùng một nhóm khác. Tác giả đã khẳng định chỉ thị phân tử cung

cấp ước lượng đa dạng di truyền chính xác so với các chỉ thị hình thái. Kết

quả nghiên cứu này cũng giúp cho việc phân biệt và chọn lọc các bố mẹ thích

hợp trong công tác lai tạo giống lúa chất lượng.

Trong nghiên cứu của mình, Weiwei Shi và cộng sự (2008) [33] đã phát

hiện alen badh2 và sự phát triển của các chỉ thị chức năng của locus badh2.

Tổng số 24 giống lúa thơm và 10 giống lúa không thơm đã được nghiên cứu

và giải trình tự locus badh2/badh2 của chúng. Nghiên cứu này đã phát hiện

được trong 12 giống lúa thơm nghiên cứu, tại alen badh2 có thiếu 8bp và

SNPs ở đoạn exon7, các giống khác có một alen mới không phải là badh2

(badh2- E2), alen này có trình tự giống hệt với alen badh2 ở đoạn exon7

nhưng thiếu 7bp ở đoạn exon2. Alen không thuộc badh2 này cũng quy định

tính trạng thơm của lúa. Dựa trên sự khác biệt về trình tự giữa hai alen,

Weiwei Shi & cs đã phát triển các chỉ thị phân tử này như một dạng marker

để có thể dễ dàng phân biệt các giống lúa thơm và các giống lúa không thơm,

cũng như để phân biệt giữa hai nhóm lúa thơm. Các chỉ thị chức năng này sẽ

mang lại hiệu quả cao trong chương trình chọn tạo các giống lúa thơm qua

phương pháp chọn lọc liên kết phân tử (MAS).

Dương Xuân Tú và cộng sự (2008) [12] đã nghiên cứu và sử dụng chỉ thị

phân tử DNA để xác định gen thơm điều khiển tính trạng mùi thơm trong lúa

gạo phục vụ công tác chọn tạo giống lúa thơm, công trình được tiến hành từ

năm 2007 đến 2008 tại Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm. Kết quả đã

lựa chọn được 2 chỉ thị là L05 và BADH2 gồm 4 mồi: EAP, ESP, IFAP,

INSP có thể sử dụng để phân biệt chính xác giữa các giống lúa có mùi thơm

do gen fgr điều khiển và giống lúa không thơm (không mang gen fgr). Sử

dụng chỉ thị BADH2 để phân biệt các dòng lúa thơm trong tổng số 420 dòng

lúa từ các thế hệ F4 đến F6 và các dòng đơn bội kép, kết quả đã chọn ra được

73 dòng lúa mang gen thơm fgr đồng hợp tử và 91 dòng lúa mang gen thơm

fgr dị hợp tử.

 Trong chọn giống lúa dẻo

Theo Hirano và cộng sự (1998) [20]. Tính trạng dẻo của gạo được quyết

định bởi hàm lượng amylose có trong nội nhũ hạt, amylose chiếm khoảng 16-

30% trong tinh bột gạo và nó là yếu tố quyết định của tính dẻo, dính và trắng

bóng của hạt gạo. Gạo có hàm lượng amylose cao thường cứng và khô cơm,

khi nấu hạt gạo rời nhau. Gạo có hàm lượng amylose thấp thường dẻo, dính

và bóng cơm. Sự tổng hợp của amylose là do sự thủy phân của enzym

granule-bound starch synthaza (GBSS), enzym này được mã hóa bởi gen Wx.

Các giống lúa phi sáp (không dẻo) có chứa 2 alen ở locus waxy được gọi là

Wxa và Wxb. Alen Wxa chủ yếu có mặt trong các giống lúa Indica trong khi đó

alen Wxb là trội trong giống lúa Japonica. Qua nghiên cứu của mình, Wang và

cộng sự đã chỉ ra rằng sự khác biệt về cơ sở phân tử của thành phần amylose

trong nội nhũ của hạt là do sự điều khiển sau phiên mã của alen Wx. Ở những

giống lúa có trình tự AGGTATA ở đầu nối 5’ của đoạn intron đầu tiên thuộc

gen Wx cho thấy sự phiên mã ở mức cao, do đó dẫn đến hàm lượng cao của

amylose trong nội nhũ hạt. Trong khi đó, các giống lúa có trình tự AGTTATA

ở đầu nối 5’ cho mức độ phiên mã của gen Wx thấp, dẫn đến hàm lượng

amylose trong nội nhũ thấp. Ở một nghiên cứu khác, Hirano và cộng sự đã chỉ

ra rằng trình tự AGGTATA ở đầu nối 5’ trùng với sự có mặt của alen Wxa,

trong khi đó trình tự AGTTATA trùng với sự có mặt của alen Wxb. Tuy nhiên,

chỉ với hai alen này không đủ để giải thích được sự khác nhau về hàm lượng

amylose của tất cả các giống lúa.

Hàm lượng amylose cao có tính trội không hoàn toàn so với hàm lượng

amylose thấp, do một gen điều khiển kèm theo một số modifiers (gen phụ có

tính chất cải tiến). Gen điều khiển sự co dãn hàm lượng amylose (amylose

extender) được xác định trên nhiễm thể số 2 (Kaushik và Khush 1991) [23].

Thành tựu có ý nghĩa trong nghiên cứu di truyền phân tử về chất lượng cơm

có thể được ghi nhận qua công trình bản đồ liên kết gen hệ enzyme III của

tinh bột trong hạt gạo trên nhiễm thể số 2, với hai chỉ thị kế cận CDO 718 và

RG 157. Amylose được đo lường bằng phương pháp hấp thu phổ sóng

“amylose - iodine complex”. Trên thế giới, mạng lưới chất lượng lúa gạo

(INQR - International Network for Quality Rice) đã điều tra số liệu biến thiên

giữa các phòng thí nghiệm khi phân tích amylose và xác định tại sao có sự sai

lệch này. Phương pháp phân tích amylose không hề đơn giản và đòi hỏi độ

chính xác với điều kiện chuẩn mực hơn. Phân tích QTL (phân tích di truyền

các gen điều khiển tính trạng số lượng) kiểm soát hàm lượng amylose cho

thấy, vùng giả định nằm trên nhiễm sắc thể số 5 và 6 với gen Wx và các alen

khác, giải thích biến thiên kiểu hình 91,1% trong quãng giữa hai marker

RG573-C624. Yanagisawa và các cộng sự đã dùng kỹ thuật SNP (single

nucleotide polymorphism) và dCAPS (derived cleaved amplified polymorphic

sequence) để tìm kiếm gen Wx-D1 trong lúa và lúa mì mã hóa protein Wx-D1

thông qua phân tích immunoblot.

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: 20 dòng lúa ở thế hệ M6

được chọn lọc từ quần thể gây đột biến giống lúa thơm Sóc Trăng 19 (ST19)

và 4 dòng lúa thế hệ M6 được chọn lọc từ các dòng đột biến của giống Q2 kế

thừa từ đề tài độc lập cấp nhà nước, mã số ĐT.ĐL-G36.2012. Do NCS –

Hoàng Thị Loan cung cấp (Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Các dòng đột biến và giống gốc được nghiên cứu

TT Tên dòng/giống Liều chiếu TT Tên dòng/giống Liều chiếu

ST19 ĐC 14 Dòng số 13 300 Gy 1

Dòng số 1 200 Gy 15 Dòng số 14 300 Gy 2

Dòng số 2 200 Gy 16 Dòng số 15 300 Gy 3

Dòng số 3 200 Gy 17 Dòng số 16 350 Gy 4

Dòng số 4 250 Gy 18 Dòng số 17 350 Gy 5

Dòng số 5 250 Gy 19 Dòng số 18 350 Gy 6

Dòng số 6 250 Gy 20 Dòng số 19 350 Gy 7

Dòng số 7 250 Gy 21 Dòng số 20 350 Gy 8

Dòng số 8 250 Gy 22 Q2 ĐC 9

Dòng số 9 250 Gy 23 Q2-1 350 Gy 10

Dòng số 10 250 Gy 24 Q2-2 350 Gy 11

Dòng số 11 250 Gy 25 Q2-3 350 Gy 12

Dòng số 12 300 Gy 26 Q2-4 350 Gy 13

2.2. Nội dung nghiên cứu

 Đánh giá một số đặc điểm hình thái nông học chính của 20 dòng lúa đột

biến được tạo ra từ giống ST19 và 4 dòng lúa đột biến từ giống Q2. So

sánh với giống gốc.

 Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR. Các dòng đột

biến so với giống gốc.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng

Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp tuần tự không lặp lại mỗi ô

thí nghiệm.

- Bố trí thí nghiệm đánh giá tập đoàn theo phương pháp tuần tự không

nhắc lại, diện tích ô 2,5m2 (1 x 2,5 m).

- Mật độ: 45 khóm/m2.

- Các khâu kỹ thuật trồng và chăm sóc theo đại trà sản xuất.

- Đánh giá và so sánh các dòng đột biến thu được ở M6 so với giống

đối chứng là ST19, các định dòng ưu việt theo mục tiêu nghiên cứu, các dòng

còn phân ly thì loại bỏ.

 Phương pháp đánh giá một số tính trạng nông Sinh học và yếu tố

cấu thành năng suất, chất lượng.

Các tính trạng theo dõi và đánh giá được thực hiện theo Hệ thống đánh

giá tiêu chuẩn cây Lúa của IRRI (1996).

Các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa được chia thành 9 giai đoạn như

Giai đoạn 1: Nảy mầm Giai đoạn 2: Mạ Giai đoạn 3: Đẻ nhánh

Giai đoạn 4: Vươn lóng Giai đoạn 5: Làm đòng Giai đoạn 6: Trỗ bông

Giai đoạn 7: Chín sữa Giai đoạn 8: Vào chắc Giai đoạn 9: Chín

Các tính trạng theo dõi và đánh giá gồm:

Các cá thể trong toàn ô thí nghiệm được thực hiện qua quan sát bằng

mắt, trên từng cây và bộ phận của cây và cho điểm. Các chỉ tiêu được đo đếm,

so sánh với đối chứng để đánh giá.

+ Đột biến về thời gian sinh trưởng:

Khóm chín sớm hoặc muộn hơn đối chứng từ 10 ngày trở lên là thể đột

biến chín cực ngắn ngày hoặc chín trung, dài ngày và khóm chín tương đương

với đối chứng gọi là thể đột biến ngắn ngày sau đó tính tần số đột biến.

+ Đột biến về hình thái:

Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá bằng phương pháp quan sát trong quần

thể phát hiện ra các cá thể có xuất hiện đột biến, thu lại và tiến hành đo đếm.

+ Chiều cao cây: Cây cao hơn hay thấp hơn cây cao nhất hoặc thấp nhất

của lô đối chứng từ >20cm là đột biến cao cây hoặc đột biến thấp cây.

+ Độ cứng cây: Được đánh giá lần đầu vào lúc trỗ xong bằng cách lay

nhẹ các dảnh, ngược xuôi trong vài lần. Lần quan sát cuối cùng tiến hành vào

lúc chín nhằm ghi lại thế đứng của cây.

Giai đoạn sinh trưởng 8 - 9. Thang điểm (số cây đổ): 1. Cứng ;3. Cứng trung

bình; 5. Trung bình ;7. Yếu; 9. Rất yếu.

+ Số nhánh đẻ nhiều nhánh: Khóm có số nhánh nhiều hơn khóm có nhiều

nhánh nhất của lô đối chứng từ >5 nhánh được coi là đột biến đẻ nhánh khỏe.

+ Số nhánh đẻ từ 1- 2 nhánh: Quan sát và đếm số cây có số nhánh đẻ từ

1- 2 nhánh là đột biến đẻ nhánh ít.

+ Đột biến về các yếu tố cấu thành năng suất: Các chỉ tiêu xác định

bằng phương pháp quan sát trong quần thể phát hiện ra các cá thể có xuất hiện

đột biến, thu lại và tiến hành đo đếm.

+ Số bông/khóm: Khóm có số bông hữu hiệu nhiều hơn khóm có nhiều

bông hữu hiệu nhất của lô đối chứng từ 3 bông trở lên gọi là thể đột biến tăng

số bông hữu hiệu nhiều còn số bông hữu hiệu dưới 3 bông gọi là thể đột biến

tăng số bông hữu hiệu ít.

+ Số hạt/bông: Bông chính có số hạt/bông nhiều hơn bông chính có số

hạt/bông nhiều nhất của lô đối chứng từ 30 hạt trở lên được coi là đột biến

tăng số hạt/bông. Bông chính có số hạt/bông ít hơn bông chính có số hạt/bông

ít nhất của lô đối chứng từ 30 hạt trở lên được coi là đột biến giảm số

hạt/bông.

+ Trọng lượng 1000 hạt: Cây có trọng lượng 1000 hạt lớn hơn trọng

lượng 1000 hạt của đối chứng từ 4gr trở lên được coi là đột biến tăng trọng

lượng 1000 hạt, Cây có trọng lượng 1000 hạt ít hơn trọng lượng 1000 hạt của

lô đối chứng từ 4gr trở lên được coi là đột biến giảm trọng lượng 1000 hạt

+ Độ thoát cổ bông: Giai đoạn sinh trưởng 7-9.

Thang điểm: 1. Thoát tốt; 3. Thoát trung bình; 5. Vừa đúng cổ bông; 7. Thoát

một phần; 9. Không thoát được.

+ Màu vỏ lúa: Giai đoạn sinh trưởng 9.

Thang điểm: 1. Trắng; 2. Hơi nâu; 3. Ánh nâu; 4. Nâu; 5. Đỏ; 6. Tím

thay đổi; 7. Tím.

Hương thơm: Giai đoạn sinh trưởng 9.

+ Thang điểm (Vào lúc trỗ hay kiểm tra khi nấu): 0. Không thơm; 1.

Hơi thơm; 2. Thơm.

+ Hàm lượng amylose: Sử dụng các phương pháp chuẩn trong phòng

thí nghiệm để phân tích hàm lượng amylose, lấy % làm đơn vị tính.

+ Độ phân hủy trong kiềm: Đặt hạt gạo xát vào 10 ml dung dịch 1,7%

KOH trong một đĩa chứa nông và sắp xếp làm sao cho các hạt không chạm

nhau.

Giai đoạn sinh trưởng 9 (sau khi xay xát).

Thang điểm: 1. Không ảnh hưởng như trở mầu bạc; 2. Trương lên; 3.

Trương lên nhưng cổ không hoàn toàn và hẹp; 4. Trương lên và cổ cũng

trương hoàn toàn và rộng; 5. Tỏa ra hoặc bị phân đoạn, cổ trương hết và rộng;

6. Tỏa lan và hòa đồng với cổ; 7. Tiêu tan hoàn toàn.

Bảng 2.8. : Các tính trạng nông sinh học và thang điểm

TT

Tính trạng

Thời gian sinh trưởng (ngày) tính từ khi gieo đến khi có 85% số hạt chín trên các

khóm.

Thời gian sinh trưởng (ngày) tính từ khi gieo đến khi có 50% số bông lúa trỗ cộng

với thời gian từ khi 50% số bông lúa trỗ đến khi lúa có 80% số hạt chín.

2 Chiều cao cây (cm). Đo từ mặt đất đến đến đỉnh bông dài nhất. Giai đoạn sinh

trưởng 8.

Số bông/khóm: Đếm tất cả các bông trong 1 khóm. Giai đoạn sinh trưởng 8.

4 Độ cứng cây (giai đoạn sinh trưởng 8-9): 1 - Cứng, 3 - Cứng trung bình, 5 -

Trung bình, 7 - Yếu, 9 - Rất yếu.

5 Độ thoát cổ bông (giai đoạn sinh trưởng 7-9): 1 - Thoát tốt, 3 - Thoát trung bình,

5 - Vừa đúng cổ bông, 7 - Thoát một phần, 9 - Không thoát được.

6 Độ rụng hạt (giai đoạn sinh trưởng 9): 1 - Khó rụng, 5 - Trung bình,

9 - Dễ rụng.

Số hạt/bông.

Số hạt chắc/bông.

Trọng lượng 1000 hạt: Cân 1000 hạt 13% độ ẩm.

4 Chiều dài hạt (mm): Đo từ gốc vỏ mày lên tới mỏ hạt.

5 Chiều rộng hạt (mm): Đo ngang chỗ rộng nhất giữa hai nửa

vỏ trấu.

Tỷ lệ dài/rộng hạt.

7 Màu vỏ gạo: 1 - Trắng, 2 - Nâu nhạt, 3 - ánh nâu, 4 - Nâu, 5 - Đỏ,

6 - Tím một phần, 7 - Tím.

8 Năng suất lý thuyết (tạ/ha) = Mật độ x Số bông hữu hiệu/khóm x số hạt

chắc/bông x khối lượng 1000 hạt (g) x 1/10000.

theo IRRI, 1996 [21]

Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

- Dụng cụ, máy móc và thiết bị thí nghiệm:

Máy nghiền mẫu, Tủ ủ nhiệt, Tủ hút khí độc, Máy li tâm, Máy lắc vortex,

Cân phân tích, Máy cất nước, Máy khuấy từ, Máy luân nhiệt PCR của hãng,

Máy điện di, Máy soi gel, Micropipette, Tủ lạnh.

- Hóa chất: Một số hóa chất thông dụng của các hãng Sigma,

Merck,...CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orange loading

dye solution, Taq Polymeraza, Ethanol, 2-propanol, Acetic acid glacial, Phenol,

Chloroform, isoamyalcohol, NaOH, HCL, KOH,…

- Các chỉ thị SSR trên nhiễm sắc thể của bộ gen lúa.

Bảng 2.2: Tên và vị trí các mồi trên nhiễm sắc thể

stt Mồi Nhiễm sắc thể Mồi xuôi Mồi ngược

CAACGAGCAAATCAGGTCAG GTTTTGATCCTAAGGCTGCTG 1 RM323 1

TACGTGTTGCACCGATCCGT TGCTGAACATGTACAAATGACC 2 SalT1add6 1

CTGATCGAGAGCGTTAAGGG GGGATCAAACCACGTTTCTG RM452 2 3

CAAGAAACCTCAATCCGAGC CTCCTCCCGATCCCAATC RM341 2 4

TACGTCGGTGAGCCCTGACGG TGCCACGCCGACGAGAACGA SRWD5 3 5

GAGTCGATGTAATGTCATCAGTGC GAAGGAGGTATCGCTTTGTTGGAC RM122 4 6

TCCAACATGGCAAGAGAGAG GGTGGCATTCGATTCCAG RM13 5 7

TAGTGGCATGGAAATATGG TAGGAGAAACTATTCCA xa5add35 5 8

M-WX 6 WxF: AGAGGGGGAGAGGAGAGAACG

9 WxtT:CAGGAAGAACATCTGCGAGT

WxR: CCTAACCAAACATAACGAAGG

ESP:TTGTTTGGAGGCTTGCTGATG

10 BADH2 6 IFAP: CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC

INSP: CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA

stt Mồi Nhiễm sắc thể Mồi xuôi Mồi ngược

EAP: AGTGCTTTACAAAGTCCCGC

11 P3 6 CAGCAATTCACTGGAGTAGTGGTT CATCACGGTCACCGCCATATCGGA

12 RM234 7 ACAGTATCCAAGGCCCTGG CACGTGAGACAAAGACGGAG

13 RM247 7 TAGTGCCGATCGATGTAACG CATATGGTTTTGACAAAGCG

14 RM1 8 GCGAAAACACATGCAAAAA GCGTTGGTTGGACCTGAC

15 RM337 8 GTAGGAAAGGAAGGGCAGAG CGATAGATAGCTAGATGTGGCC

16 RM431 8 TCCTGCGAACTGAAGAGTTG AGAGCAAAACCCTGGTTCAC

17 DREB1A 8 GAGTCTTCGGTTTCCTCAG CCACTTACCGGAGTTTCTC

18 RM225 11 TGCCCATATGGTCTGGATG GAAAGTGGATCAGGAAGGC

19 RM224 11 ATCGATCGATCTTCACGAGG TGCTATAAAAGGCATTCGGG

20 RM160 12 AGCTAGCAGCTATAGCTTAGCTGGAGATCG TCTCATCGCCATGCGAGGCCTC

 Phương pháp phân tích thành phần sinh hóa trong gạo.

Xác định hàm lượng amylose

Tiến hành theo phương pháp Cagampang DNA Rodriguez (1980) [34].

- Bước 1: Chuẩn bị dung dịch

+ Ethanol 95%.

+ HCl 30%.

+ NaOH 1N.

+ Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI).

- Bước 2: Chuẩn bị mẫu

+ Cân 50 mg bột gạo đã được nghiền mịn, cho vào ống 50 ml.

+ Thêm 0,5 ml ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều.

+ Thêm 9,5 ml NaOH 1N. Đun sôi trong 10 phút và lắc đều.

+ Để qua đêm ở nhiệt độ phòng.

- Bước 3: Pha loãng và đo mẫu

+ Rút 100 μl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử

thay dịch trích bằng 100 μl NaOH 1 N).

+ Thêm nước cất khoảng ½ bình, lắc đều.

+ Thêm 250 μl HCl 30%, lắc đều.

+ Thêm 250 μl dung dịch Iod, lắc đều.

+ Thêm nước cất đến vạch định mức.

+ Chuyển sang ống 50 ml, lắc đều và để yên trong 30 phút.

+ Lắc đều trước khi cho vào cuvette. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 580 nm.

- Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả

+ Đường chuẩn có dạng:

Y = aX + b

Trong đó Y: Độ hấp thụ OD

X: Lượng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml).

+ Tính hàm lượng amylose theo công thức:

% Amylose = x 100

+ Đánh giá hàm lượng amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988)

được trình bày như ở Bảng 3.1.

Bảng 2.3. Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lượng amylose cho lúa (IRRI, 1988)

Hàm lượng amylose (%) NHÓM

Gạo nếp 0-2

Gạo tẻ:

Rất thấp 3-9

Thấp 10-19

Trung bình 20-25

Cao > 25

Xác định độ phân hủy kiềm

Tiến hành theo phương pháp của IRRI (1979)

+ Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng được thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt

gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào đĩa petri.

+ Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi đĩa.

+ Đậy dĩa petri, để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.

+ Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm

của IRRI (1986) được trình bày ở Bảng 3.2.

Bảng 2.4. Bảng phân cấp độ trở hồ (IRRI, 1979)

CẤP Độ lan rộng

1 Hạt gạo còn nguyên.

2 Hạt gạo phồng lên.

3 Hạt gạo phồng lên; viền còn nguyên hay rõ nét.

4 Hạt gạo phồng lên; viền còn nguyên và nở rộng.

5 Hạt rã ra; viền hoàn toàn nở rộng.

6 Hạt tan ra hòa chung với viền.

7 Hạt tan hoàn toàn và quyện vào nhau.

Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức:

Σxi x n

Cấp trở hồ =

Trong đó: xi : cấp độ trở hồ.

n : số hạt có cấp độ trở hồ xi

N : số hạt thử nghiệm.

Cấp độ trở hồ được đánh giá theo thang điểm của IRRI (1979) (Bảng 2.5)

Bảng 2.5. Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979)

CẤP

Độ trở hồ

1 - 3

Cao

4 - 5

Trung bình

6 - 7

Thấp

2.3.1.1. Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử

Tách chiết DNA tổng số

Mẫu lá non được thu từ cây lúa sau 30 ngày kể từ ngày cấy.

Các bước tiến hành tách chiết DNA

DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Cheng và cộng sự

(2003) [18]. Quy trình tách chiết được tiến hành với các bước như sau:

Bước 1: Nghiền 1,5 - 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng

chày và cối sứ.

Bước 2: Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml

đệm chiết CTAB (đã được làm nóng đến 65oC).

Bước 3: Ủ mẫu đảo đều và ủ mẫu ở 65oC trong thời gian 60 phút, 10

phút đảo đều một lần.

Bước 4: Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Bổ sung 4 ml

Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều trong 10 phút. Ly tâm 13000

vòng/phút ở nhiệt độ phòng.

Bước 5: Chuyển dịch trong phía trên ống falcon sang một ống mới

(4ml). Bổ sung một thể tích tương đương (4ml) Isopropanol, đảo đều, giữ ở

nhiệt độ - 200C trong 30 phút.

Bước 6: Tủa DNA bằng máy ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong

10 phút. Rửa tủa 2 - 3 lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%.

Bước 7: Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml đệm TE và 15 µl

RNase A (10 mg/ml). Ủ ở 37oC trong 3h.

Bước 8: Chuyển dung dịch DNA vào một ống mới. Thêm 2 ml phenol -

chloroform - isoamyl alcohol (25:24:1), đảo đều trong 5 - 10 phút và ly tâm 10

phút ở 10000 vòng/phút.

Bước 9: Chuyển phần dịch phía trên vào ống mới. Thêm 750 µl NaCl

5M và 3ml Ete bão hòa hơi nước. Trộn đều và ly tâm 10 phút ở 10000

vòng/phút.

Bước 10: Loại bỏ lớp Ete bên trên. Chuyển phần bên dưới vào ống mới

Thêm 3 ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở -20°C trong 30 phút. Lấy

DNA ra bằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh.

Bước 11:Rửa tủa 3 lần với 1.5 ml ethanol 70%.

Bước 12: Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 800 µl đệm TE để hòa

tan tủa. Giữ dung dịch DNA ở - 20°C.

Đo độ tinh sạch của DNA

Sau khi tách chiết, độ tinh sạch và nồng độ của DNA được đánh giá

bằng phương pháp điện di trên agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5X

và dùng DNA nồng độ (50 ng/µl) làm thang chuẩn, trong 30 phút, điện thế

100V. Sau khi chạy điện di, tiến hành nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm

ethidium bromide. Việc chụp mẫu và đo nồng độ được thực hiện bằng máy

Molecular imager FX.

 Phương pháp PCR với mồi SSR

Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Mastercycler – personal và

được trình bày trong bảng 2.6:

Bảng 2.6. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR

Stt

Thành phần

Thể tích (l)

8.95

H2O cất khử trùng

Buffer 10X

1,5

0,45

MgCl2 (50mM)

dNTP (1mM)

1,0

Taq DNA polymeraza (5U)

0,1

0,5

Primer forward 5M

0,5

Primer Revert 5M

2,0

DNA (35ng/ l)

15 Tổng thể tích:

hi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt

chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:

Bảng 2.7 : Chương trình chạy của phản ứng PCR

Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ

94 5 phút 1 1

94 30 giây

55* 30 giây 2 35

72 45 giây

72 5 phút 3 1

10 ∞ 4 1

(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể.

 Phương pháp điện di

Bột Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm TBE 0.5X với nồng

độ 3.0%.

Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng. -

Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C. -

Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) với nồng độ 0.5µg/ml. -

Chuẩn bị khay gel và lược. -

Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lược. Thời -

gian chờ gel đông là 45 - 60 phút.

Tra sản phẩm PCR. -

Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0.5X cho vào bể chạy điện di. -

Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ. -

- Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh.

2.3.2. phân tích số liệu

Số liệu đánh giá các tính trạng hình thái nông học được phân tích, xử lý

trên phần mềm Excel.

 Phân tích số liệu kiểu gen

Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo công thức

của Nei (1972):

I = và D = - ln (I)

Trong đó: I: Hệ số tương đồng di truyền,

D: Khoảng cách di truyền,

q12: Số các alen đồng nhất ở cả 2 mẫu,

Q1 và Q2: Tổng số các alen của giống 1 và 2.

- Đa dạng di truyền alen của các chỉ thị SSR được đánh giá thông qua

hệ số PIC và được tính theo phương trình:

Trong đó: Pij : là tần số xuất hiện của alen thứ j tương ứng với mồi i.

Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch

đại càng lớn, tức là càng nhiều alen được sinh ra.

Sự có mặt hay vắng mặt của các alen của từng chỉ thị SSR được ghi

nhận cho tất cả các giống lúa nghiên cứu, trong đó 0 là không có băng DNA

và 1 là có băng DNA ở cùng một vị trí alen. Số liệu được nhập vào Excel và

xử lý bằng chương trình NTSYS-pc v. 2.1 để xây dựng ma trận tương đồng di

truyền. Tiếp theo, sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các

giống lúa nghiên cứu được xây dựng bằng phương pháp phân nhóm UPGMA

(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages).

2.4. Địa điểm và thời gian thực hiện Địa Điểm:

+ Phòng sinh học phân tử - Bộ môn Kĩ Thuật Di Truyền - Viện Di

truyền Nông nghiệp Việt Nam.

+ Phòng thí nghiệm đại học Sư Phạm kĩ Thuật Hưng yên.

+ Khu nhà lưới Trường Đại học sư phạm kỹ thuật Hưng Yên.

+ Khu khảo nghiệm lúa Trường Cao đẳng nghề Kinh tế Kỹ thuật Tô

Hiệu Hưng Yên.

Thời gian: 2016-2018.

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái

Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu hình thái nông sinh học chính của 20

dòng đột biến từ giống ST19 ở thế hệ M6 so với giống ST19 và 4 dòng đột

biến từ giống Q2 ở thế hệ M6 so với giống Q2 ở vụ mùa năm 2016.

Kết quả đánh giá các đặc điểm bên ngoài hay còn gọi là các tính trạng

nông học của các giống lúa cho chúng ta thấy các đặc trưng của mỗi giống

hoặc nhóm giống. Đặc tính nông học của các dòng lúa triển vọng và giống đối

chứng được trình bày ở bảng 3.1.

Qua bảng 3.1 cho thấy:

- Độ cứng cây (Cs - Culm Strength):

+ Trong 20 đột biến từ dòng ST19 dòng lúa chúng tôi tiến hành đánh

giá, kết quả đánh giá được ghi nhận ở ngoài giống đối chứng có kiểu hình cây

yếu (được cho điểm 7) thì các dòng triển vọng được chia ở 2 mức là cứng

trung bình (thang điểm 3) gồm 4, 8, 14, 15, 18, 19 và mức trung bình gồm các

dòng 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 20, 21 được chấm ở thang điểm

5 như vậy tính trạng thân yếu của ST19 đã được cải thiện.

+ Đối với các dòng đột biến từ Q2 thì cả đối chứng và các dòng đột

biến đều cứng cây và được cho điểm ở thang điểm 1.

- Độ thoát cổ bông (Exs - Panicle Exsertion):

+ Kết quả thu được từ quan sát 20 dòng đột biến và so sánh với giống

đối chứng, các dòng/giống lúa được đánh giá: duy nhất dòng số 15 có điểm

thoát cổ bông là 3 (trung bình). Các dòng còn lại kể cả giống đối chứng đều

thoát cổ bông tốt (thang điểm 1).

+ Các dòng đột biến của giống Q2 vẫn giữ được tính trạng thoát cổ

bông như giống gốc, tất cả đều thoát tốt và ở thang điểm 1.

- Số nhánh hữu hiệu:

+ Đối chiếu giữa giống ST19 với 20 dòng đột biến số nhánh hữu hiệu

trên khóm nhìn chung không có thay đổi đáng kể so với giống gốc (5,24

nhánh/ khóm). Ngoài dòng số 12 và 14 có số nhánh trung bình thấp hơn giống

gốc thì các dòng còn lại đều cao hơn. Dòng cao nhất là dòng số 11 với số

nhánh trung bình là 5,82.

+ Đối chiếu giống Q2 so với 4 dòng đột biến từ Q2 cũng cho kết quả là

các dòng đột biến có đẻ nhánh nhiều hơn dòng gốc nhưng không đáng kể

trung bình chỉ từ 0,42 (ở dòng Q2-3) đến 0,89 (ở dòng Q2-2).

- Chiều cao cây (Ht - Plant Height):

+ Trong 20 dòng lúa được đánh giá so với giống đối chứng ST19 thì

toàn bộ các dòng được chọn đều cao hơn. Chiều cao cây cũng phân li thành 2

dạng: thấp cây (cây cao dưới 110cm) gồm giống ST19 và các dòng số: 1, 2,

3, 7, 16, 17, 18 có chiều cao dao động từ (105,67 - 109,35) và dạng cao trung

bình gồm các dòng số: 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14, 115, 19, 20, 21. Có

chiều cao giao động từ 110,3cm ở dòng số 13 -115,30cm ở dòng số 20.

+ Ở Q2 và các dòng đột biến phát triển từ Q2 thì chiều cao chênh lệch

khá lớn và tất cả các dòng đột biến đều thấp hơn giống gốc. Thấp nhất là dòng

Q2-4 (112,43cm) thấp hơn giống đối chứng 17,82cm, dòng cao nhất là Q2-2

(115,25) thấp hơn giống đối chứng 5cm.

Chiều cao của các giống lúa cao hay thấp ngoài việc chịu ảnh hưởng

vào giống còn phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng,

lượng mưa...vv. Chiều cao cây tuy không liên quan trực tiếp đến năng suất

nhưng có liên quan đến tính chống đổ và khả năng chịu thâm canh của giống,

do vậy nghiên cứu đánh giá về chiều cao cây giúp chúng ta có các biện pháp

kỹ thuật phù hợp phát huy hết tiềm năng của từng giống lúa (Lê Vĩnh Thảo,

2004) [11]. Trong thực tế hiện nay, kiểu cây lúa có chiều cao ở dạng bán lùn

(90 - 110cm) được chấp nhận rộng rãi, có thể gieo cấy ở nhiều vùng khí hậu

kể cả vùng có gió và vùng trũng (Nguyễn Thị Hảo, 2011) [6].

Bảng 3. 1. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu nông học của các dòng đột biến và đối chứng được gieo trồng vào vụ

mùa năm 2016

Khối

Thời gian

Chiều

Độ thoát cổ

Nhánh hữu

Số hạt

lượng

Độ cứng cây (Cs)

cao cây

Màu vỏ trấu

sinh trưởng

Tên

bông (Exs)

hiệu/khóm

chắc/bông

1000 hạt

TT

(Mat)

(Ht)

dòng/giống

(GW)

cm

A

Số nhánh

B

Ngày

A

B

A

gram

102,15

ST19

Yếu

Tốt

Nâu

104,62

5,24

120

22,01

106,25

Dòng số1

Trung bình

Tốt

3 Ánh nâu

185,14

5,43

116

22,61

105,67

3 Dòng số 2

Trung bình

Tốt

Nâu

165,25

5,49

121

22,45

109,34

4 Dòng số 3

Trung bình

Tốt

Nâu

155,56

5,72

120

22,31

5 Dòng số 4

3 Cứng trung bình

113,68

Tốt

Nâu

154,69

5,25

115

22,13

110,19

6 Dòng số 5

Trung bình

Tốt

3 Ánh nâu

175,64

5,45

121

22,43

112,35

7 Dòng số 6

Trung bình

Tốt

3 Ánh nâu

162,13

5,61

116

22,41

109,35

8 Dòng số 7

Trung bình

Tốt

Nâu

153,55

5,74

120

22,36

9 Dòng số 8

3 Cứng trung bình

112,62

Tốt

Nâu

172,97

5,77

121

22,12

115,15

10 Dòng số 9

Trung bình

Tốt

Nâu

156,31

5,62

115

22,27

114,15

11 Dòng số 10 5

Trung bình

Tốt

Nâu

162,93

5,65

118

22,86

114,1

12 Dòng số 11 5

Trung bình

Tốt

3 Ánh nâu

155,8

5,82

120

23,12

13 Dòng số 12 5

Trung bình

111,26

Tốt

Nâu

195,25

5,11

115

22,52

Khối

Thời gian

Chiều

Độ thoát cổ

Nhánh hữu

Số hạt

lượng

Độ cứng cây (Cs)

cao cây

Màu vỏ trấu

sinh trưởng

Tên

bông (Exs)

hiệu/khóm

chắc/bông

1000 hạt

TT

(Mat)

(Ht)

dòng/giống

(GW)

A

B

cm

A

Số nhánh

B

Ngày

B

A

B

gram

14 Dòng số 13 5

Trung bình

110,3

Tốt

Nâu

152,28

5,39

119

22,46

15 Dòng số 14 3 Cứng trung bình

111,85

Tốt

Nâu

160,41

5,2

114

22,61

Trung

114,63

16 Dòng số 15

Nâu

163,56

5,31

121

3 Cứng trung bình

bình

22,78

109,25

17 Dòng số 16 5

Trung bình

Tốt

Nâu

174,15

5,36

113

22,38

108,68

18 Dòng số 17 5

Trung bình

Tốt

3 Ánh nâu

175,41

5,32

117

22,43

19 Dòng số 18 3 Cứng trung bình

108,85

Tốt

3 Ánh nâu

191,32

5,32

112

23,78

20 Dòng số 19 3 Cứng trung bình

113,66

Tốt

Nâu

171,85

5,42

121

22,48

115,23

21 Dòng số 20 5

Trung bình

Tốt

Nâu

162,81

5,59

119

22,21

130,25

Cứng

Tốt

Vàng

168,39

4,72

125

18,73

113,68

Q2-1

Cứng

Tốt

Vàng

207,34

5,48

120

18,95

115,25

Q2-2

Cứng

Tốt

Vàng

215,21

5,61

123

18,75

113,72

Q2-3

Cứng

Tốt

Vàng

221,14

5,14

123

19,58

112,43

Q2-4

Cứng

Tốt

Vàng

217,25

5,35

120

18,36

A: điểm B: Mức mô tả

- Thời gian sinh trưởng (Mat - Maturity):

+ Sinh trưởng và phát triển của cây là kết quả tổng hợp của tất cả các hoạt

động sinh lý xảy ra trong cây, nó là hai mặt biến đổi về lượng và biến đổi về

chất có quan hệ mật thiết đan xen nhau. Thời gian sinh trưởng của cây lúa biến

động từ 90 - 180 ngày, tùy theo giống hay các yếu tố khác như thời vụ (vụ xuân

thời gian sinh trưởng dài hơn vụ mùa), kỹ thuật và thời điểm bón phân hay nói

cách khác là phụ thuộc vào yếu tố kỹ thuật thâm canh (Hoàng Minh Tấn, 2000)

[10]. Xác định được thời gian sinh trưởng cũng như tổng thời gian sinh trưởng

của một giống lúa giúp chúng ta có cơ sở trước khi bố trí khung thời vụ trong hệ

thống canh tác hợp lý, có biện pháp kỹ thuật tác động phù hợp nhằm đem lại

năng suất cao nhất cho từng giống lúa. Để đánh giá thời gian sinh trưởng của

từng giống lúa chúng tôi đã theo dõi các chỉ tiêu từ gieo đến cấy, đến đẻ nhánh,

kết thúc đẻ nhánh, đến làm đòng, đến trỗ bông và đến chín. Kết quả theo dõi các

chỉ tiêu về thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng của từng giống lúa thí nghiệm

thu được cho thấy: ở ST19 và các dòng đột biến. các dòng đột biến được đánh

giá có thời gian sinh trưởng trung bình không quá khác biệt so với giống đối

chứng như các dòng số: 1, 3, 7, 11 có cùng khoảng thời gian sinh trưởng 120

ngày so với ST19 bên cạnh đó có 5 dòng có thời gian sinh trưởng cao hơn ST19

là các dòng số: 2, 5, 8, 15, 19 và các dòng có thời gian sinh trưởng ngắn hơn đối

chứng như dòng số: 1(116 ngày), 4, 9, 12 ( 115 ngày), 6(116 ngày), 10 (118

ngày), 13, 21 (119 ngày), 17 (117ngày). Nhưng đặc biệt chú ý các giống 14 (114

ngày), 16 (113 ngày), 18 (112 ngày) là các dòng có thời gian sinh trưởng rút

ngắn rõ rệt soi với đối chứng ST19 (120 ngày) giảm được từ 6-8 ngày.

+ Ở giống Q2 và 4 dòng đột biến, thời gian sinh trưởng cũng thay đổi

không đáng kể và có xu hướng giảm so với giống gốc ví dụ như dòng Q2-1 và

Q2-4 có thời gian sinh trưởng là 120 ngày thấp hơn giống gốc là 5 ngày, dòng

Q2-2 và dòng Q2-3 có thời gian sinh trưởng là 123 ngày, thấp hơn giống gốc 2

ngày.

- Màu vỏ lúa (SCC - Seed Coat (bran) Color):

+ Kết quả đánh giá chỉ tiêu của 20 dòng lúa và đối chứng cho thấy có đa

số các dòng lúa có màu sắc hạt giống với giống gốc là: 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 12,

13, 14, 15, 16, 19, 20 có màu nâu được đánh giá ở thang điểm 4 và có 6 dòng có

màu sắc khác hơn dòng gốc là: 1, 5, 6,11,17,18 có màu ánh nâu được đánh giá ở

thang điểm 3.

+ 4 dòng đột biến của Q2 vẫn giữ nguyên màu vỏ lúa vàng sáng của

giống gốc nên được đánh giá ở thang điểm 2.

- Khối lượng 1000 hạt (GW - Grain Weight):

+ Chỉ tiêu đánh giá khối lượng 1000 hạt là một trong những chỉ tiêu tác

động đến yếu tố cấu thành năng suất. Khối lượng 1000 hạt phụ thuộc chủ yếu do

di truyền của giống, tuy cũng có yếu tố ngoại cảnh tác động nhưng không nhiều.

Kết quả tổng hợp chỉ tiêu đánh giá khối lượng 1000 hạt (độ ẩm 13%) ở bảng 3.2

cho thấy: Trong 20 dòng lúa tiến hành đánh giá so sánh với đối chứng, khối

lượng 1000 hạt của dòng đối chứng là thấp nhất là 22,01g các dòng đột biến đều

có khối lượng hạt tăng chúng tôi tạm thời chia làm 3 nhóm: nhóm 1 có 2 dòng

tăng ít là dòng số 4 (22,13g) và dòng số 8 (22,12g). Nhóm 2 gồm 9 dòng có khối

lượng 1000g/ hạt từ 22,21g như dòng 20 đến 22,24g như dòng 2 gồm các dòng

3, 5, 6, 7, 9, 16, 17 và 2 dòng vừa nêu. Nhóm 3 là nhóm dòng lúa còn lại có khối

lượng 1000 hạt tăng cao gồm các dòng: số 2 (22,61g), 10 (22,86g), số 11

(23,12g), 12 (22,52g), 13 (22,46g), 14 (22,61g), 13 (22,78g), 18 (23,78g), 19

(22,48g ). Trong số các dòng thì đáng chú ý nhất 2 dòng là dòng số 11 có khối

lượng cao hơn giống đối chứng khoảng 5% và dòng số 18 có khối lượng cao

hơn giống gốc 8%.

+ 4 dòng đột biến phát triển từ Q2 khối lượng 1000 hạt tăng cao nhất ở

dòng Q2-3(19,58g) cao hơn giống gốc 0,85g. Thấp nhất ở giống Q2-4(18,63g)

thấp hơn giống gốc 0,37. Sự khác biệt là không đáng kể.

- Số hạt chắc trên bông:

+ Sau khi đột biến chọn dòng đã tạo ra được tập đoàn các dòng triển vọng

có số hạt trên bông tăng rõ rệt so với giống gốc. Toàn bộ 20 dòng đột biến đều

cho kết quả vượt xa giống gốc ít nhất là 46,43% ở dòng 13 và cao nhất là

86,62% ở dòng số 12.

+ Ở giống Q2 và các dòng đột biến tỉ lệ hạt chắc trên bông thay đổi khá

nhiều. Nhiều nhất ở dòng Q2-3, hơn giống gốc 31%. Thấp nhất ở dòng Q2-1,

cao hơn giống gốc khoảng 23%.

3.2. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của các dòng lúa đột biến

và đối chứng.

Theo Trần Duy Quý (2000) [8], một giống lúa tốt là giống lúa ngoài việc

có năng suất cao còn cần có chất lượng tốt. Những tính trạng chất lượng thường

là những cặp tính trạng tương phản được di truyền đơn gen, mỗi tính trạng có

hai hay nhiều các dạng tương phản xen kẽ của cùng một gen hoặc các gen.

Kết quả đánh giá chỉ tiêu chất lượng của các dòng nghiên cứu được chỉ ra

ở bảng 3.2.

Bảng 3. 2. Một số chỉ tiêu đặc tính chất lượng của các dòng đột biến và đối

chứng được gieo trồng vào vụ mùa năm 2016

Hàm lượng Độ phân hủy trong Hương thơm amylose % Tên kiềm (AlkD) (Sct) TT (Amy) dòng/giống

A B A B A B

1 ST19 2 Thơm Trung Bình 20,5 5 Trung bình

2 Dòng số 1 2 Thơm Trung Bình 21,3 5 Trung bình

3 Dòng số 2 0 Không thơm Thấp 18,2 5 Trung bình

4 Dòng số 3 0 Không thơm Thấp 18,2 5 Trung bình

5 Dòng số 4 2 Thơm Thấp 18,3 5 Trung bình

6 Dòng số 5 2 Thơm Thấp 17,6 5 Trung bình

7 Dòng số 6 2 Thơm Thấp 18,3 5 Trung bình

8 Dòng số 7 2 Thơm Thấp 18,2 5 Trung bình

9 Dòng số 8 0 Không thơm Trung Bình 19,6 5 Trung bình

10 Dòng số 9 2 Thơm Trung Bình 20,4 5 Trung bình

11 Dòng số 10 0 Không thơm Trung Bình 20,1 5 Trung bình

12 Dòng số 11 1 Thơm nhẹ Trung Bình 20,1 5 Trung bình

Hàm lượng Hương thơm Độ phân hủy trong amylose % Tên (Sct) kiềm (AlkD) TT (Amy) dòng/giống

A B B A B A

13 Dòng số 12 2 Thơm Thấp 14,3 5 Trung bình

14 Dòng số 13 0 Không thơm Thấp 15,2 5 Trung bình

15 Dòng số 14 0 Không thơm Thấp 17,4 5 Trung bình

16 Dòng số 15 2 Thơm Thấp 18,5 5 Trung bình

17 Dòng số 16 2 Thơm Thấp 16,5 5 Trung bình

18 Dòng số 17 2 Thơm Thấp 16,3 5 Trung bình

19 Dòng số 18 2 Thơm Trung Bình 20,2 5 Trung bình

20 Dòng số 19 2 Thơm Trung Bình 20,3 5 Trung bình

21 Dòng số 20 2 Thơm Trung Bình 20,1 5 Trung bình

22 Q2 0 Không thơm Trung Bình 24,9 2 Thấp

23 Q2-1 0 Không thơm Cao 25,4 2 Thấp

24 Q2-2 0 Không thơm Trung Bình 24,3 2 Thấp

25 Q2-3 0 Không thơm Trung Bình 23,4 2 Thấp

26 Q2-4 0 Không thơm Trung Bình 23,7 2 Thấp

A: Thang điểm B: Mức mô tả

* Hương thơm

- Hương thơm (Sct - Scent): Hương thơm được xem là một trong những

đặc tính quan trọng của cây lúa. Kết quả đánh giá Trong 20 dòng lúa tiến hành

đánh giá so sánh với đối chứng trong thí nghiệm được chia thành 3 nhóm thang

điểm khác nhau.

- Kết quả trình bày trong bảng 3.2 cho thấy: Trong 21 dòng giống tham

gia thí nghiệm thì có 15 dòng đột biến có hương thơm là dòng số: 1, 4, 5, 6, 7, 9,

10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20 và dòng lúa số 11 thơm nhẹ, còn lại các dòng: 2, 3,

8, 10, 13, 14 không có hương thơm.

 Kết quả Kiểm tra gen BADH2 (gen kiểm soát tính trạng mùi thơm)

Giống Q2 và các dòng đột biến từ Q2 không thơm. Điều đó đã được chứng minh

qua kiểu gen.

Dựa vào sự đa hình DNA của gen BADH2, Bradbury và cộng sự

(2005)[17] đã xây dựng phương pháp ASA (Allele Specific Amplification)

để làm chỉ thị phân tử xác định lúa thơm, không thơm. Nghiên cứu này đã sử

dụng chỉ thị phân tử BADH2 để so sánh với kết quả nghiên cứu được ở kiểu

hình.

Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với mồi

BADH2 (Ghi chú: 1:Q2; 2-5 là các dòng đột biến từ Q2. 6: M: Marker 100 bp

DNA Ladder; 7: Giống ST19; 8-27 các dòng đột biến từ giống ST19)

Kết quả xác định gen BADH2 (Hình 3.1 và Bảng 3.2) cho thấy:

Chỉ thị BADH2 phát hiện gen fgr đồng hợp với 2 vạch băng 580bp +

257bp cho mùi thơm, dị hợp với 3 vạch băng 580bp + 355bp + 257bp không

thơm và không có gen fgr với 2 vạch băng 355bp + 580bp và không thơm.

Đối với giống ST19 là giống có mùi thơm đã được kiểm chứng và trong

ảnh điện di mồi BADH2 đã khẳng định lại điều đó. 20 dòng còn lại từ số 1 – 20

là các dòng đột biến. Các dòng 3, 4, 9, 11, 14 và 15 ở trạng thái dị hợp ở vị trí

257bp và 355bp được xác định là mang gen thơm fgr (ở dạng dị hợp tử) nhưng

không biểu hiện ra kiểu hình. Có 14 dòng là các dòng 2, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 13,

16, 17, 18, 19, 20 và 21 là các dòng có vị trí là 257 và 580bp ở trạng thái đồng

hợp lặn mang gen thơm.

Giống Q2 vốn là giống không có mùi thơm và 4 dòng đột biến cũng

không có mùi thơm chứng tỏ không có đột biến nào về tính trạng này xuất hiện.

Kết quả phân tích với chỉ thị BADH2 trong nghiên cứu này phù hợp với kết quả

đã công bố của tác giả Dương Xuân Tú và cộng sự (2016) [13]. Kết quả này phù

hợp với những đánh giá bằng các phương pháp truyền thống: Các dòng lúa chọn

lọc có hương thơm đều được thể hiện ở bảng 3.2.

Bảng 3. 3. Kết quả kiểm tra gen BADH2 của các dòng lúa nghiên cứu

Tên dòng/ giống

Gen BAD2

Tên dòng/ giống

Gen BAD2

ST19

-/-

Dòng số 13

+/-

Dòng số 1

-/-

Dòng số 14

+/-

Dòng số 2

Dòng số 15

-/-

Dòng số 3

+/-

Dòng số 16

-/-

Dòng số 4

-/-

Dòng số 17

-/-

Dòng số 5

-/-

Dòng số 18

-/-

Dòng số 6

-/-

Dòng số 19

-/-

Dòng số 7

-/-

Dòng số 20

-/-

Dòng số 8

+/-

Dòng số 9

-/-

Q2-1

Dòng số 10

+/-

Q2-2

Dòng số 11

-/-

Q2-3

Dòng số 12

-/-

Q2-4

Ghi chú: (-): Không có gen; (-/-): Đồng hợp lặn; (+/-): Dị hợp

Việc lí giải một số dòng lúa xuất hiện tính trạng cây không thơm từ giống

có mùi thơm như ST19 là một điều khó khăn. Có thể có các trường hợp xảy ra

như sau:

- Trong việc thu hoạch gieo trồng bị lẫn hạt của dòng khác, sau vài thế hệ

gieo trồng thì kiểu gen không thơm phát tán vào quần thể tạo ra tính trạng

không thơm.

- Trong canh tác cây mẹ bị nhiễm phấn từ các giống bên cạnh tạo ra cây

con dị hợp, kết quả tương tự với việc bị lẫn giống cơ giới.

- Trường hợp xảy ra độ biến thuận nghịch (là đột biến biến gen lặn thành

gen trội) điều này rất khó xảy ra vì việc đột biến xảy ra thường là đột biến biến

gen trội thành gen lặn và xác suất để đột biến như vậy rơi vào vùng gen thơm là

gần như không thể xảy ra. Hiện nay chúng ta mới chỉ cải tạo các dòng lúa mang

tính trạng từ không thơm thành thơm bằng cách lai tạo.

Hàm lượng Amylose (Amy - Amylose Content of the Grain):

Kết quả đánh giá chỉ tiêu về hàm lượng amylose của 20 dòng lúa thu được

so với giống ST19 ở bảng 3.2 cho thấy: Có 12 dòng lúa cho hàm lượng amylose

ở mức thấp hơn 19% hay còn gọi là có hàm lượng amylose thấp là các dòng số:

2, 3, 7 (18,2%), 4, 6 (18,3%), 5 (17,6%), 12 (14,3%), 13 (15,2%), 14 (17,4%),

15 (18,5%), 16 (16,5%), 17 (16,3%) trong đó có 2 dòng có 2 dòng 12 và 13 có

hàm lượng amylose thấp đột biến thấp nhất là dòng số 12 với hàm lượng

Amylose là 14,3 %. Và có 9 dòng lúa được đánh giá ở mức trung bình là các

dòng số: (từ 19 – 25) là các giống số: 1 (21,3%), 8 (19,6%), 9 (20,4%), 10, 11,

20 (20,1%), 18 (20,2%), 19 (20,3%) hàm lượng cao nhất là giống số 1 với

21,3% cao hơn giống ST19.

Ở Giống Q2 và các dòng đột biến hàm lượng amylose có thay đổi nhưng

không đáng kể và vẫn ở mức cao, xấp xỉ mức cao. Cao nhất là dòng Q2-1 là

25,4%, thấp nhất ở dòng Q2-3 là 23,4% không khác biệt lắm so với giống gốc là

Q2 mức 24,9%.

Tính trạng dẻo của gạo được quyết định bởi hàm lượng amylose có trong

nội nhũ hạt, amylose chiếm khoảng 16 - 30% trong tinh bột gạo và nó là yếu tố

quyết định của tính dẻo, dính và trắng bóng của hạt gạo. Gạo có hàm lượng

amylose cao thường cứng và khô cơm, khi nấu hạt gạo rời nhau. Gạo có hàm

lượng amylose thấp thường dẻo, dính và bóng cơm.

 Kết quả kiểm tra gen W-xy

Nhìn vào ảnh 3.2 chúng ta thấy băng chỉ thị W-xy của các dòng đột biến và

giống gốc không có gì khác biệt nhau hay nói cách khác là giống nhau hoàn toàn

nên có thể khẳng định trong trường hợp này gen Wx không chịu sự tác động của

đột biến.

Kết quả điện di sản phẩm PCR của chỉ thị W-xy thể hiện ở hình 3.2:

Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với mồi

W-xy (Ghi chú: 1:Q2; 2-5 là các dòng đột biến từ Q2. 6: M: Marker 100 bp

DNA Ladder; 7: Giống ST19; 8-27 các dòng đột biến từ giống ST19)

Vậy ở Giống ST19 và các dòng đột biến kết quả có sự sai khác về tỉ lệ %

amylose có sự chênh lệch lớn giữa dòng thấp nhất là dòng số 12 (14,3%) với

dòng có hàm lượng Amylose cao nhất là dòng số 1 (21,3%) và khác biệt so với

chính giống gốc (20,5%).

-Có hai hướng để giải thích cho trường hợp này:

Hàm lượng amylose ngoài chịu tác động của kiểu gen còn chịu tác động

không nhỏ của môi trường như chế độ ánh sáng, chăm sóc hoặc sai số khi thao

tác nên có thể có sự chênh lệch giữa các dòng. Tuy nhiên sai số này là rất nhỏ vì

tất cả các dòng đột biến và đối chứng đều được trồng ở cùng một địa điểm, cùng

một biện pháp canh tác vào vụ mùa năm 2016.

Nhưng việc hàm lượng amylose trong các dòng lại chênh lệch nhau nhiều

như giữa dòng 1 với dòng 12 hay giữa dòng 12 với đối chứng chỉ có thể giải

thích hàm lượng amylose ngoài việc chịu tác động của gen Wx ra còn do gen

alk và qASS-6 và có thể có một số gen khác điều khiển nhằm tăng mạnh hoặc

giảm nhẹ biểu hiện của gen Wx. Trong trường hợp này có thể gen Wx không bị

tác động của tác nhân gây đột biến nhưng các gen khác chịu trách nhiệm điều

khiển hoặc gen trương tác bị tác động của yếu tố gây đột biến làm tăng độ biểu

hiện của gen Wx nên làm giảm hàm lượng amylose trong các dòng 5 (17,6%), 12

(14,3%), 13 (15,2%), 14 (17,4%), 16 (16,5%), 17 (16,3%). Các dòng còn lại vì tỉ

lệ amylose so với giống gốc thay đổi không đáng kể nên cần nghiên cứu sâu hơn

để có thể có kết luận chính xác hơn.

Ở giống Q2 và 4 dòng đột biến có sự chênh lệch không lớn với nhau nên

có thể sự khác biệt này chỉ là do ngoại cảnh hoặc sai số nghiên cứu.

Độ phân hủy trong kiềm (AlkD - Alkali Digestion):

Sau khi tiến hành làm thí nghiệm đánh giá trên các giống lúa, kết quả cho

thấy tất cả các giống lúa phát triển từ giống ST19 đều cho thang điểm 5, tức là

độ phân hủy trong kiềm ở mức trung bình nên nhiệt độ hóa hồ trung bình, cơm

không quá mềm. Ở dòng Q2 các dòng đều cho thang điểm 2, độ trở hồ thấp,

cơm cứng.

3.3. Đa dạng di truyền của các dòng nghiên cứu và giống gốc dựa vào các

đặc điểm hình thái.

3.3.1. Đa dạng di truyền dựa vào các đặc điểm hình thái giống ST19 và các

dòng đột biến

Từ việc phân tích mức độ đa dạng của 20 dòng đột biến triển vọng và

giống đối chứng ST19 với 11 tính trạng gồm: Chiều cao cây, Độ thoát cổ bông

(Exs), Nhánh hữu hiệu/khóm, Độ cứng cây, Màu vỏ trấu, Số hạt chắc/bông,

Thời gian sinh trưởng (Mat), Khối lượng 1000 hạt (GW), thơm, hàm lượng

amylose và Độ phân hủy trong kiềm. Đã được chỉ ra ở 2 bảng phân tích số liệu

(3.2) vầ (3.3) chúng tôi đã dùng phần mềm BC Cord để tạo ra cây sơ đồ mức độ

đa dạng hình thái (hình 3.3) .

Phân nhóm di truyền của 20 dòng đột biến và giống gốc cho thấy nếu hệ số

tương đồng là 0,70 thì chúng được chia thành 4 nhóm cách biệt di truyền bao gồm:

Nhóm I: chỉ có duy nhất giống ST19

Nhóm II: gồm có 1, 18, 12

Đặc trưng của nhóm II là có năng suất cao, thơm.

Nhóm III: nếu chia ở hệ số tương đồng di truyền là 0,85 sẽ chia 2 nhóm nhỏ là:

Nhóm III.1 chỉ có dòng số 2.

Nhóm III.2 gồm các dòng:5, 17, 16 và 8 , 19.

Hạt ánh nâu, chiều cào bán lùn, thơm hàm lượng amylose thấp.

Nhóm IV: nếu chia ở hệ số tương đồng là di truyền là 0,83 thì có 2 nhóm:

Nhóm IV.1 gồm các dòng 3, 7, 13.

Nhóm IV.2 gồm các dòng 4, 9, 11, 6, 10, 20, 15,14.

Mức độ đa dạng của các dòng đột biến không cao vì các dòng này có

nguồn gốc chung từ ST19 nhờ tác động của đột biến và quá trình chọn lọc nên

có một số tính trạng được cải tạo theo hướng của nhà chọn giống tạo ra các dòng

đột biến khác biệt với giống gốc nhiều nhất (0,6) đặc biệt ở các tính trạng về

năng suất như số hạt chắc, khối lượng hạt.

Sự đa dạng giữa các dòng nói chung là không cao thấp nhất chỉ khoảng

0,55 giữa dòng 1 với dòng 14 và cao nhất là 1 giữa dòng 3 với dòng 7 .

Hình 3.3. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền dựa vào các đặc điểm hình thái của 20 dòng đột biến và giống ST19

3.3.2. Đa dạng di truyền dựa vào các đặc điểm hình thái giống của Q2 và

các dòng đột biến

Dựa vào cây sơ đồ của giống Q2 và 4 dòng đột biến (hình 3.4). Ở mức độ tương

đồng là 0,90 thì có thể chia cây thành 2 nhóm cách biệt di truyền gồm:

Nhóm I: Chỉ có duy nhất giống Q2.

Nhóm II: gồm 4 dòng đột biến. Q2-1, Q2-2, Q2-3, Q2-4. Trong nhóm 2 ở

mức độ tương đồng di truyền là 0,92

Nhìn chung các dòng đột biến của Q2 không đa dạng về các đặc điểm hình thái.

Hình 3.4. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền dựa vào các đặc điểm hình thái của 4 dòng đột biến và giống Q2

3.4. Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử

3.4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Cheng và cộng sự

(2003) [18]. Sau khi thu được DNA, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng

DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, trong thời gian 30 phút

(dùng 3µl và 5 µl ở nồng độ 50ng/µl làm chuẩn để đo nồng độ DNA), sau đó

nhuộm bằng ethidium bromide. Sử dụng máy chuyên dụng (Molercular

imager FX) để xác định nồng độ và chụp ảnh. Ảnh điện di (hình 3.4) cho thấy

các băng gọn sắc nét, DNA không bị đứt gẫy, có độ tinh sạch cao đảm bảo

cho thực hiện các phản ứng PCR và các thí nghiệm tiếp theo.

Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử các dòng đột biến triển

vọng. Dưới đây là một số hình ảnh minh họa về kết quả PCR một số cặp mồi

với các dòng đột biến cùng với giống đối chứng của chúng:

Hình 3.5. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số trên gel agarose 1% các dòng

đột biến và giống gốc của chúng (chú thích: 1:Q2; 2-5 là các dòng đột biến

từ Q2. 6: ST19; từ mẫu số 7-28 dòng số 1 đến dòng số 20 là các dòng đột biến

từ giống ST19; M: Marker 1k bp DNA Ladder)

3.4.2. Kết quả phân tích đa hình DNA bằng các chỉ thị phân tử SSR

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng tổng số 20 chỉ thị SSR để

khảo sát đa hình với một số giống lúa đại diện, kết quả thu được 3 chỉ thị cho

đa hình, số chỉ thị này tiếp tục được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền

của toàn bộ các dòng đột biến và giống gốc.

Dưới đây là một số ảnh minh hoạ kết quả điện di sản phẩm PCR của

các dòng lúa nghiên cứu với các chỉ thị SSR trên gel agarose 2,0% (P3) và

acrylamide (các mồi còn lại).

Hình A: (Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với cặp

mồi P3)

Hình B: (Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với cặp mồi

drep1a)

Hình C: (Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với cặp mồi

Salt1)

Hình 3.6. ảnh điện di sản phẩm PCR các mồi SSR với các dòng đột biến

và đối chứng. (Ghi chú: 1:Q2; 2-5 là các dòng đột biến từ Q2. 6: M: Marker

20 bp DNA Ladder; 7: Giống ST19; 8-27 các dòng đột biến từ giống ST19)

Hệ số PIC, số alen và tổng số băng DNA thể hiện trên từng cặp mồi

Hệ số PIC được coi là thước đo tính đa hình của các alen ở từng locus

SSR. Hệ số PIC cao phản ánh mức đa hình cao trong các đối tượng nghiên

cứu và ngược lại.

Phân tích 20 cặp mồi SSR với tập đoàn 20 dòng lúa cùng đối chứng thu

được tổng số 452 băng DNA thuộc 24 loại alen khác nhau. Có 17 cặp mồi

gồm: xa5add35, RM 122, RM 247, srwd5 và p3, RM 1, RM 431, salt, RM 13,

RM 337, RM 323, drep1a, RM 160, RM 341, RM225, RM452, RM310 cho

locus đơn hình (chỉ thu được 1 loại alen), 3 cặp mồi cho các locus đa hình

gồm: RM224, RM234, BADH2 . Trong số 3 cặp mồi cho các locus đa hình có

2 cặp mồi là RM224, RM 234 thu được 2 alen và cặp mồi BADH2 thu được 3

alen (bảng 3.4).

Số liệu ở bảng 3.4 cho thấy:

- Ở giống lúa ST19 và 20 dòng đột biến nghiên cứu ít đa dạng về thành

phần các alen ở những locus SSR nghiên cứu. Hệ số PIC của 20 cặp mồi thay

đổi từ 0,0 (ở cặp mồi chỉ xuất hiện băng đơn hình) đến 0,46 của RM224. Hệ

số PIC trung bình của 20 cặp mồi nghiên cứu khá thấp là 0,036.

- Ở giống Q2 và 4 dòng đột biến hệ số PIC trung bình bằng 0,0 hay trong

20 cặp mồi này chưa có cặp mồi nào thể hiện đa hình. Như vậy hệ số đa dạng

của giống Q2 và các dòng đột biến bằng 0.

Kết quả nghiên cứu các dòng đột biến và so sánh với giống gốc ST19

nên hệ số đa dạng của mồi thấp hơn so với kết quả nghiên cứu trên các tập

đoàn lúa thơm của một số tác giả trên thế giới. Kết quả sử dụng 12 cặp mồi SSR

để đánh giá đa dạng di truyền các giống lúa thơm của Ấn Độ, Raj đã chỉ ra hệ số

PIC dao động từ 0 đến 0,830 (Raj và cộng sự, 2006) [30]. Sở dĩ hệ số PIC của 20

dòng đột biến so với giống gốc và so với nhau có sự đa dạng thấp như vậy là do:

- Các dòng đột biến đều xuất phát từ giống gốc nên có hệ số tương

đồng cao so với giống gốc và so với nhau.

- Trong chọn lọc từ M2 đến M6 chúng ta đã loại bỏ những kiểu hình

đột biến không mong muốn và phát triển các dòng có kiểu hình mong muốn

theo nhiều hướng khác nhau từ một nguồn gốc cây đột biến.

- Kết quả sử dụng 20 cặp mồi SSR để khảo sát trên 12 nhiễm sắc thể

còn khiêm tốn và chưa phủ kín hệ gen nên chưa tìm ra được hết các điểm đột

biến. Trong khi đó các nghiên cứu về đa dạng nêu trên chủ yếu là đều đánh

giá đa dạng di truyền ở các dòng lúa địa phương có thời gian phát triển hàng

ngàn năm chịu tác động chọn lọc của cả tự nhiên lẫn con người nên hệ số đa

dạng cao.

Bảng 3. 4. Số alen thể hiện và hệ số PIC của 20 cặp mồi SSR trên các dòng đột biến từ giống ST19

Vị trí gắn

Vị trí gắn mồi

Số alen thể

TT

Tên cặp mồi

mồi

PIC

TT

Tên cặp mồi

PIC

(NST)

hiện

(NST)

RM 323

0,00

RM 431

RM 224

0,46

0,00

drep1a

RM 341

0,00

RM 337

RM 452

0,00

srwd5

RM 122

0,00

RM 13

0,00

0,24

BADH2

xa5add35

0,00

W-xy

RM 234

0,36

0,00

RM 225

RM 247

0,00

salt

RM 1

0,00

RM 160

1,07

24 Tổng

1,2

0,036

Trung bình

Bảng 3. 5. Số alen thể hiện và hệ số PIC của 20 cặp mồi SSR trên các dòng đột biến từ giống Q2

Vị trí gắn

Vị trí gắn mồi

Số alen thể

TT

Tên cặp mồi

mồi

PIC

TT

Tên cặp mồi

PIC

(NST)

hiện

(NST)

RM 323

0,00

RM 431

RM 224

0,00

drep1a

RM 341

0,00

RM 337

RM 452

0,00

srwd5

RM 122

0,00

RM 13

0,00

BADH2

xa5add35

0,00

W-xy

RM 234

0,00

RM 225

RM 247

0,00

salt

RM 1

0,00

RM 160

0,00

21 Tổng

1,05

0,000

Trung bình

3.3.4. Tỷ lệ dị hợp tử (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của các dòng lúa

nghiên cứu

Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với

cặp mồi RM224 (chú thích: 1:Q2; 2-5 là các dòng đột biến từ Q2. 6: ST19; từ

mẫu số 7: dòng số 1 đến mẫu số 26: dòng số 20 là các dòng đột biến từ giống

ST19; M: Marker 20 bp DNA Ladder)

Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với cặp

mồi RM234 (Ghi chú: 1:Q2; 2-5 là các dòng đột biến từ Q2. 6: M: Marker 20 bp

DNA Ladder; 7: Giống ST19; 8-27 các dòng đột biến từ giống ST19)

Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội, cho đa hình cao và ổn định, do đó có

thể phân biệt những dòng mang kiểu gen dị hợp. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và

tỷ lệ dị hợp tử (H) của các dòng lúa nghiên cứu dựa trên kết quả phân tích 20

cặp mồi SSR được trình bày ở bảng 3.6 và 3.7:

Bảng 3. 6. Tỷ lệ dị hợp tử và tỷ lệ số liệu khuyết của các dòng lúa đột biến

từ giống ST19

TT Tên dòng/ TT Tên dòng/

Giống M% H% giống M% H%

1 ST19 0 0 12 Dòng số11 0 0

2 Dòng số 1 0 0 13 Dòng số12 0 0

3 Dòng số 2 0 5 14 Dòng số 13 5 0

4 Dòng số 3 0 5 15 Dòng số 14 5 0

5 Dòng số 4 0 0 16 Dòng số 15 10 0

6 Dòng số 5 0 5 17 Dòng số 16 0 0

7 Dòng số 6 0 0 18 Dòng số 17 5 0

8 Dòng số 7 0 0 19 Dòng số 18 0 0

9 Dòng số 8 0 10 20 Dòng số 19 0 0

10 Dòng số 9 0 0 21 Dòng số 20 0 0

11 Dòng số 10 0 10 0 2,5 Trung Bình

Số liệu ở bảng 3.5. cho thấy: các dòng lúa nghiên cứu có độ thuần di

truyền khá cao. Trong số 20 dòng đột biến, 12 dòng có tỷ lệ dị hợp tử là 0%

(bằng mức dị hợp tử của giống gốc ST19) có nghĩa là các dòng này đều đồng

hợp ở cả 20 mồi nghiên cứu (chỉ có 1 alen duy nhất/locus). 6 dòng là 2, 3, 5,

8, 10, 13, 14, 15, 17 có tỷ lệ dị hợp tử là 5% - 10% . Dòng số 15 có tỷ lệ dị

hợp cao nhất là 10%. Tỉ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn là 2,5%. Tỷ lệ

dị hợp tử trong nghiên cứu này cao hơn so với kết quả nghiên cứu của

Nguyễn Minh Công và cộng sự (2012)[3] trên 24 dòng lai, tỷ lệ dị hợp trung

bình là 2,13%.

Tỷ lệ khuyết thiếu (M%) của các dòng lúa nghiên cứu rất thấp, 3 dòng

có tỉ lệ khuyết số liệu là 5% là 6, 17, 18 (bảng 3.6). Như vậy, các số liệu thu

được của cả 20 dòng có độ tin cậy rất cao để đánh giá, thống kê và xác định

mối quan hệ di truyền và có thể được dùng làm vật liệu để lai tạo có thể tạo

được nguồn biến dị đa dạng hơn cho công tác chọn giống đột biến mới.

Bảng 3. 7. Tỷ lệ dị hợp tử và tỷ lệ số liệu khuyết của các dòng lúa đột biến

từ giống Q2

TT Tên dòng/ TT Tên dòng/

Giống M% H% giống M% H%

1 Q2 0 0 12 Q2-3 0 0

2 Q2-1 0 0 13 Q2-4 0 0

3 Q2-2 0 0 0 0 Trung Bình

Tỷ lệ khuyết thiếu M% và tỉ lệ dị hợp tử H% của các dòng phát triển từ Q2

đều bằng 0. Cho thấy số liệu đáng tin cậy và các dòng trên đều thuần về kiểu

gen.

3.5.3. Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của các dòng

lúa nghiên cứu

3.5.3.1. Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của 20 dòng

lúa đột biến và giống gốc ST19

Kết quả phân tích sản phẩm PCR của 20 dòng đột biến phát sinh từ

giống gốc ST19 và đối chứng đã được thống kê và phân tích bằng phần mềm

NTSYSpc verion 2.1, từ đó thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền và vẽ sơ

đồ phân nhóm di truyền dựa trên số liệu đa hình SSR (hình 3.9).

Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa thông qua

ma trận tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây phân nhóm di truyền cho

thấy, sự đa dạng khá lớn về mặt di truyền giữa 21 dòng lúa dao động trong

khoảng từ 81% (ở dòng 1, 2) đến 100% (dòng 13,14; ). Nếu lấy hệ số tương

đồng là 91% thì 21 dòng lúa nghiên cứu được phân thành 5 nhóm như sau:

* Nhóm I: chia thành 2 nhóm nhỏ ở 95%

Nhóm I.1: gồm dòng số 1và giống ST19. Hệ số tương đồng di truyền

nhóm này là 100%. Hai dòng này qua các đặc điểm hình thái có sự tương

đồng cao.

Nhóm I.2: có dòng số 5.

* Nhóm II: Nếu ở mức có hệ số tương đồng từ 90% đến 100% ở mức

tương đồng là 96% có thể chia nhóm này thành 2 nhóm nhỏ.

Nhóm II.1: Các dòng số: 2, 3, 13, 14 có hệ số tương đồng là 100%.

Nhóm II.2: Gồm các dòng số: 6, 18, 16, 20, 7 có hệ số tương đồng là

100%.

*Nhóm III: Chia làm 2 nhóm phụ, có hệ số tương đồng di truyền dao

động từ 90% đến 100%.

Nhóm III.1: Các dòng số: 8 và 15, 17 trong đó 2 dòng số 15 và số 17 có

hệ số tương đồng là 100%. Hệ số tương đồng giữa 2 dòng này với dòng số 8

là 95%.

Nhóm III.2: Gồm các dòng số: 9, 19, 12 có hệ số tương đồng là 100%

(cơm dẻo và không thơm).

*Nhóm IV: Gồm các dòng số: 4 và 11 có hệ số tương đồng là 100%.

*Nhóm V: Chỉ có duy nhất dòng số 10.

ST19

1.00

ST19

1.00

0.86

1.00

0.86

1.00

0.90

0.81

1.00

0.95

0.90

0.86

1.00

0.90

0.95

0.81

0.95

1.00

0.90

0.95

0.81

0.95

1.00

0.82

0.95

0.82

0.86

0.90

1.00

0.81

0.86

0.90

0.86

0.90

1.00

0.82

0.86

0.90

0.86

0.82

0.91

0.90

1.00

0.90

0.81

1.00

0.86

0.81

0.82

0.90

1.00

0.81

0.86

0.90

0.86

0.90

1.00

0.90

1.00

0.86

1.00

0.81

0.90

0.95

0.86

0.81

0.86

1.00

0.86

1.00

0.81

0.90

0.95

0.86

0.81

0.86

1.00

0.86

0.90

0.86

0.90

0.95

0.86

0.95

0.90

1.00

0.90

0.95

0.81

0.95

1.00

0.90

0.82

0.81

0.90

0.95

1.00

0.86

0.90

0.86

0.90

0.95

0.86

0.95

0.90

1.00

0.95

1.00

0.90

0.95

0.81

0.95

1.00

0.90

0.82

0.81

0.90

0.95

1.00

0.95

1.00

0.81

0.86

0.90

0.86

0.90

1.00

0.90

1.00

0.86

0.95

0.90

0.95

0.90

1.00

0.90

0.95

0.81

0.95

1.00

0.90

0.82

0.81

0.90

0.95

1.00

0.95

1.00

0.90

1.00

0.81

0.86

0.81

82.00

0.86

0.82

0.81

0.86

0.95

0.90

0.95

0.90

1.00

0.81

Min

1.00

Max

Bảng 3. 8. Hệ số tương đồng di truyền giữa giống ST19 và 20 dòng đột biến

Hình 3.9. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 21 dòng lúa nghiên cứu

3.5.3.2. Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của 4 dòng

lúa đột biến và giống gốc Q2

Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ phân tử của Q2 và 4 dòng đột

biến thông qua phương pháp sử dụng 20 chỉ thị phân tử SSR chúng tôi nhận thấy

không có sự khác biệt về di truyền ở mức độ phân tử.

PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Kết quả đánh giá đa dạng di truyền về kiểu hình các dòng đột biến so với

giống gốc:

- Đặc điểm hình thái và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đột

* Giống ST19:

biến từ giống ST19 khá đa dạng. Trong đó, dòng số 18 có năng suất thực tế cao

nhất (trên 60 tạ/ha). Về chất lượng mùi thơm: các dòng có mùi thơm là: 1, 4, 5,

6, 7, 9, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20. Hàm lượng amylose của các dòng thu được

sau khi xử lý đột biến đa số thấp hơn so với đối chứng, trong đó có một số dòng

có hàm lượng amylose thấp hơn hẳn so với đối chứng là dòng số 12 (14.3%);

dòng 13 (15.2%). Dựa vào các đặc điểm hình thái 20 dòng đột biến và giống gốc

được chia thành 4 nhóm: Nhóm I có ST19; Nhóm II gồm các dòng số 1, 18, 12;

Nhóm III gồm các dòng số 2, 5, 8, 16, 17, 19; Nhóm IV gồm các dòng số: 3, 4,

6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 20.

- Ở mức phân tử, hệ số tương đồng di truyền của 20 dòng lúa đột biến là

khá cao dao động trong khoảng từ 81% (ở dòng 3 so với dòng 4) đến 100%

(dòng 17, 21). 20 dòng lúa nghiên cứu được chia thành 5 nhóm: Nhóm I gồm

các dòng số: ST19, dòng số1 và 5; Nhóm II gồm các dòng số: 2, 3, 13, 14, 6, 18,

16, 20 và 7; Nhóm III gồm các dòng số: 8, 15, 17, 9, 19 và 12 ; Nhóm IV gồm

các dòng số: 4 và 11; Nhóm V chỉ có dòng số: 10.

* Giống Q2:

- 4 dòng đột biến từ giống Q2 ở thế hệ M6 có kiểu hình gần như giống với

giống Q2 từ chiều cao, độ cứng cây, màu sắc hạt, thời gian sinh trưởng. Trong 4

dòng thì có dòng Q2-3 là năng suất cao nhất năng suất thực tế khoảng 63tạ/ ha.

Dựa vào các đặc điểm hình thái 4 dòng đột biến và giống gốc Q2 có thể chia làm

2 nhóm: nhóm I chỉ có giống Q2, nhóm II gồm 4 dòng còn lại với hệ số tương

đồng thấp nhất khoảng 0.92.

- Ở mức phân tử, 4 dòng đột biến từ giống Q2 giống nhau và giống với

giống gốc 100% ở cả 20 locus SSR nghiên cứu.

Kết quả xác định một số dòng đột biến có triển vọng

Qua đánh giá đa dạng di truyền hình thái và đa dạng di truyền phân tử các

dòng đột biến và giống gốc, chúng tôi đã xác định được một số dòng đột biến có

triển vọng gồm:

- Dòng số 4 tương đối thuần về kiểu hình và gen. Cứng cây, có mùi thơm,

hàm lượng amylose thấp, năng suất khá.

Dòng số 12 tương đối thuần, hàm lượng amylose thấp, thơm, năng suất

khá, sinh trưởng trung bình ngắn ngày.

Dòng số 16 tương đối thuần về cả kiểu hình và gen. ngắn ngày, hàm lượng

amylose thấp, thơm, bán lùn.

Dòng số 18 tương đối thuần về kiểu hình và gen. cứng cây, thơm, năng

suất cao.

Dòng Q2-3 tương đối thuần về kiểu hình và kiểu gen. cứng cây, năng suất

cao, chống chịu khá.

2. Kiến nghị

Cần tiếp tục khảo sát các dạng đột biến chín sớm, cơm ngon có triển vọng

ở các thế hệ tiếp theo để có thể khẳng định được sự di truyền ổn định của các đột

biến.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

, 2017.

1. Hoàng Thị Loan1, Nguyễn Thái Dương2, Trần Trung1, Trần Duy Quí3

Nghiên cứu đánh giá, so sánh hàm lượng amylose và protein các dòng đột biến

triển vọng với giống gốc ST19, Q2. Tạp chí khoa học và phát triển Nông thôn

Việt Nam. Số 36/2017, trang 42

2. Hoàng Thị Loan1, Nguyễn Thái Dương2, Trần Trung1, Trần Duy Quí3, 2018.

Một số đặc điểm hình thái và gen thơm của các dòng lúa chất lượng chọn lọc từ

đột biến giống Q2 và ST19. Tạp chí Khoa học Công Nghệ Nông Nghiệp Việt

Nam. Số 89, trang 10

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Điệp, Lê Thị Muội (1995), “Nghiên cứu khả

năng chịu lạnh và chịu khô ở mô sẹo lúa của các giống có nguồn gốc sinh

thái khác nhau”, Tạp chí Sinh học, 17(1): tr.25 – 29

2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống

chiu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội.

3. Nguyễn Minh Công, Khuất hữu Trung, Nguyễn Tiến Thăng, Nguyễn

Minh Anh Tuấn, nguyễn Văn Tiếp (2012), “ Nghiên cứu quan hệ giữa đa

dạng di truyền ở mức phân tử (DNA) với đặc điểm nông sinh học của 24

dòng lai và bố mẹ của chúng”, Tạp chí Nông nghiệp và phá riển Nông

thôn, số 18, kỳ 2, tháng 9/2012, tr10-18.

4. Lê Xuân Đắc, Bùi Văn Thắng, Lê Trần Bình, Lê Duy Thành, Lê Thị Muội

(2003), “Đánh giáđa dạng di truyền của một số giống lúa Tám ở Việt

Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 1 (4): 493-501.

5. Trần Kim Đổng, Nguyễn Quang Phổ, Lê Thị Hoa (1991) Giáo trình sinh

lý cây trồng, Nxb Đại học và giáo dục chuyên nghiệp, Hà Nội.

6. Nguyễn Thị Hảo, Trần Văn Quang, Đàm Văn Hưng, Nguyễn Tuấn Anh

(2011), Đánh giá đặc điểm nông học và chất lượng một số tổ hợp lúa lai

hai dòng mới chọn tạo trong nước, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2011:

Tập 9, số 6: 884 -891.

7. Nguyễn Thị Anh Hạnh ( 2008) “Nghiên cứu đánh giá đặc điểm sinh

trưởng năng suất, phẩm chất của một số giống lúa chất lượng cao tại

huyện Vĩnh Tường-tỉnh Vĩnh Phúc”.

8. Trần Duy Quý (2000). Cơ sở di truyền và kỹ thuật gây tạo sản xuất lúa lai,

NXB NN, Hà Nội.

9. Trần Danh Sửu, Lưu Ngọc Trình (2001), Sử dụng chỉ thị ADN để nghiên

cứu quan hệ di truyền tiến hóa của lúa địa phương các vùng Tây Bắc và

Tây Nam nước ta. Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng (1), Tr :25-29.

10. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm (2000), Sinh lý

thực vật, Giáo trình dùng cho các trường đại học khối Nông, Lâm, Ngư.

NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.

11. Lê Vĩnh Thảo, Bùi Chí Bửu, Lưu Ngọc Trình, Nguyễn Văn Vương

(2004), Các giống lúa đặc sản, giống lúa chất lượng cao và kỹ thuật canh

tác. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội IRRI, 1996 - Standard evaluation system

for rice, IRRI, 1996.

12. Dương Xuân Tú, Phạm Quang Duy, Tăng Thị Diệp, Tống Thị Huyền.

2008. Ứng dụng chỉ thị phân tử AND xác định gen phục vụ chọn tạo giống

lúa thơm. Viện cây lương thực và cây thực phẩm.

13. Dương Xuân Tú, Phạm Thiên Thành, Tăng Thị Diệp, Tống Thị Huyền, Lê

Thị Thanh, Nguyễn Thị Thu và Nguyễn Trí Hoàn, 2016. Ứng dụng chỉ thị

phân tử trong chọn tạo các giống lúa thơm, kháng bệnh bạc lá cho các tỉnh

phía Bắc. Tạp chí khoa học công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 246-255.

14. Nguyễn Thanh Tuyền (2006), Kết quả nghiên cứu về một số đặc điểm

nông sinh học và chỉ tiêu chất lượng của các dòng giống lúa tẻ thơm ngắn

ngày tăng năng suất cao. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn số

kỳ 1 tháng 4.

15. Mai Thọ Trung , Lê Song Dự , Ngô Thị Đào (1990), Trồng trọt chuyên

khoa, Nxb Giáo dục, Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh

16. Abifarin (1972) Upland rice improvement in West Africa. Pages 625-635

in International Rice Research Institute, Rice breeding. Los Baiios,

Philippines.

17. Bradbury L.M.T, Fitzgerald T.L, Henry R.J, Jin Q. and Waters

D.L.E(2005) The “gene for fragrance in rice”. Plant Biotechnology

Jounrnal, Volume 3 (3), pp.363-370.

18. Cheng C. Y., Motohashi R., Tsuchimoto S., Fukuta Y., Ohtsubo H.

(2003). Polyphyletic of cultivated rice: based on the interspersion pattern

of SINEs. Mol.Biol.Evol., 20, pp.67-75.

19. Hadrys , H.,Balick, M.and Schierwater, B. (1992) Application of random

ampli-fied polymorphic DNA (RAPD) in molecular ecology. Molecular

Ecology, 1, 55-63.

20. Hirano HY, Eiguchi M, Sano Y, “A single base change altered the

regulation of the waxy gene at the posttranscriptional level during the

domestication of rice”, Mol. Biol. Evol. 15 (1998) 978–987.

21. International Network for Genetic Evaluation of Rice, International Rice

Research Institute,( 1996). Standard evaluation system for rice, Manila,

Philippines, IRRI, International Rice Research Institute, 1996.

22. Jarne P, Lagoda PJL.(1996). Microsatellites, from molecules to

populations and back. Trends Ecol Evol 11: 424-429.

23. Kaushik and G.S. Khush (1991), “ Genetic analysis of endosperm mutants

in rice Ovyza sativa L.”, Division of Plant Breeding, Genetics, and

Biochemistry, International Rice Research Institute, P.O. Box 933,

Manila, Philippines.

24. Landry, B. S. and Michelmore, R. W. 1987. Methods and applications of

restriction fragment length polymorphism analysis to plants. In: Tailoring

genes for crop improvement: an agricultural perspective. Ed. by: G. Bruening,

J. Harada, and A. Hollaender. Plenum Press, New York. pp. 25-44.

25. Lu, H.; Redus, M.A.; Coburn, J.R.; Rutger, J.N.; Mccouch, S.R and Ai,

T.H. (2005). Population structure and breeding patterns of 145 US rice

cultivars base don SSR marker analysis. Crop Science, January, no. 1, p.

66-76.

26. Neale, D. B. and Williams, C. G. 1991. Restriction fragment length

polymorphism mapping in conifers and applications to forest genetics and

tree improvement. Can. J. For. Res. 21: 545-554. Nybom, H., Schaal.

27. Mohammadi, S.A. and Prasanna, B.M. (2003) Review and Interpretation

Analysis of Genetic Diversity in Crop Plants —Salient Statistical Tools.

Crop Science, 43, 1235-1248.

28. Olufowote JO, Xu Y, Chen X, Park WD, Beachell HM, Dilday RH, Goto

M, McCouch SR (1997) Comparative evaluation of within-cultivar

variation of rice (Oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP markers.

Genome 38:1170–1176.

29. Pummy Kumari, Uma Ahuja, Sunita Jain ADN R.K.Rain, (2012).

Fragrance analysis using molecular ADN bichemical methods in

recombinant inbred lines of rice. African Journal of Biotechnology, 11

(91): 15784-15789

30. Raj Kumar Joshi and Lambodar Behera (2006), "Identification and

differentiation of indigenous non-Basmati aromatic rice genotypes of

India using microsatellite markers", African Journal of Biotechnology

Vol. 6 (4), pp. 348-354.

31. Reddy PR ADN Sathyanarayaniah K (1980) Inheritance of aroma inrice.

Indian J Genet Plant Breed 40:327-329.

32. Sujatha K, Upadhyay R, Kaladhar K, Rani NS and Sarla N (2004).

Genetic relationship among aromatic short grain and Basmati rice based

on ISSR and SSR markers. Rice Genetic Newsletter vol 21.

33. Weiwei Shi, Yi Yang, Saihua Chen, Mingliang Xu (2008) Discovery of a

new fragrance allele and the development of functional markers for the

breeding of fragrant rice varieties. Molecular Breeding 22(2): 185-1 92

34. Yu, S.B., W.J. Xu, C.H. Vijayakumar, J. Ali, B.Y. Fu, J.L. Xu, Y.Z.

Jiang, R. Marghirang, J. Domingo, C. Aquino, S.S. Virmani, and Z.K. Li.

(2003). Molecular diversity and multilocus organization of the parental

lines used in the International Rice Molecular Breeding Program. Theor.

Appl. Genet. 108:131–140.