Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 nhằm đáp ứng khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán ở cây ngô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --------------------------

NGUYỄN HỮU KIÊN

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ZmNF-YB2 VÀ ZmNAC1 NHẰM ĐÁP ỨNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN HÁN Ở CÂY NGÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

HÀ NỘI, năm 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------------------------

NGUYỄN HỮU KIÊN

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ZmNF-YB2 VÀ ZmNAC1 NHẰM ĐÁP ỨNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN HÁN Ở CÂY NGÔ

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, năm 2014

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng

MỤC LỤC

Lời cảm ơn…………………………………………………………………………………i

Lời cam đoan……………………………………………………………………...………ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT…………………………………..iii

DANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………………………......v

DANH MỤC CÁC HÌNH……………………………………………………………….vi

MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 4

1.1. Tổng quan về cây ngô ........................................................................................... 4

1.1.1. Nguồn gốc địa lý của cây ngô ...................................................................................... 4

1.1.2. Nguồn gốc di truyền của cây ngô ................................................................................ 5

1.1.3. Đặc điểm nông sinh học của cây ngô ......................................................................... 6

1.1.4. Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế ........................................................................ 6

1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam.................................................... 9

1.1.5.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới .......................................................................... 9

1.1.5.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam ......................................................................... 10

1.2. Tình hình phát triển ngô biến đổi gen trên thế giới và ở Việt Nam ............... 11

1.2.1. Các phương pháp chuyển gen vào ngô .................................................................... 11

1.2.2. Thành tựu và triển vọng của cây ngô biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam .... 13

1.3. Ảnh hƣởng của hạn hán đến cây trồng và phản ứng của cây trồng với điều kiện hạn hán ............................................................................................................... 16

1.3.1. Hạn hán và nhu cầu tạo cây trồng kháng hạn ............................................ 16

1.3.2. Khái niệm về tính chiu hạn và phản ứng của cây trồng với điều kiện hạn 17

1.4. Tổng quan về gen NF-YB2 và NAC1 ................................................................. 19

1.4.1. Khái niệm và vai trò của các nhân tố phiên mã với điều kiện bất lợi phi sinh học……………………………………………………………………………………...19

1.4.2. Tổng quan về gen NF-YB2 ........................................................................................ 20

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.4.3. Tổng quan về gen NAC1 ............................................................................................ 22

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 26

2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 26

2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................................................... 26

2.1.2. DNA plasmid và chủng vi khuẩn ................................................................................... 26

2.1.3. Hóa chất ............................................................................................................................ 26

2.1.4. Các thiết bị máy móc ........................................................................................................ 27

2.1.5. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................................... 27

2.2. Phƣơng pháp ....................................................................................................... 27

2.2.1. Phương pháp tìm kiếm dữ liệu và thiết kế mồi đặc hiệu cho gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 ..................................................................................................................................... 27

2.2.2. Phương pháp tổng hợp cDNA ........................................................................................ 28

2.2.3. Tách dòng gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của giống NTCB ...................... 32

2.2.4. Thiết kế vector siêu biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 ..................................... 37

2.2.5. Khảo sát khả năng tiếp nhận gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 của một số dòng ngô Việt Nam ...................................................................................................................................... 42

2.2.6. Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá ................................................................................... 43 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 44

3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số từ giống NTCB ............................................. 44

3.2. Kết quả phân lập gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của giống NTCB .. 45

siêu biểu hiện pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2

3.3. Thiết kế vector và pZY:CaMV5S::ZmNAC1 ........................................................................................... 51

3.4. Kết quả đánh giá khả năng tiếp nhận gen của một số dòng ngô Việt Nam sử dụng vector pZY:CaMV35S::ZmNFYB2 và pZY:CaMV35S::ZmNAC1 ................ 55

3.4.1. Kết quả biến nạp gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 vào các dòng ngô ........................... 55

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.4.2. Kết quả phân tích các cây mang gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 bằng kỹ thuật PCR……………………………………………………………………………………...59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 63 PHỤ LỤC………………………………………………………………………………68

Lời cảm ơn

Trước hết. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ công tác tại Viện

Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong

suốt quá trình học tập tại viện.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng,

người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình công tác cũng

như trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ, anh, chị, em

trong Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông

nghiệp đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học vừa

qua.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã nhiệt tình động viên,

giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học cũng như trong cuộc sống.

Luận văn này được thực hiện từ nguồn kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu tạo giống

ngô chịu hạn bằng công nghệ gen” thuộc chương trình đề tài cấp nhà nước về lĩnh vực

CNSH Nông nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, tháng năm 2014

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Hữu Kiên

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi

kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác, các

số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này chưa từng được công bố.

Mọi dữ liệu hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu

thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Tác giả

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Hữu Kiên

iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Acetosyringone AS

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin) BAP

Base pair Bp

Complementary DNA cDNA

Cộng sự Cs

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide CTAB

Deoxyribonucleic Acid DNA

Diethyl pyrocarbonate DEPC

Deoxyribonucleotide triphosphate dNTP

Escherichia coli E.coli

Ethylen dimine tetra acetic acid EDTA

Gam/lít g/l

Isopropylthio-beta-D-galactoside IPTG

Kilobase Kb

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

KiloDalton kDa

Luria Bertani LB

Miligam/lít mg/l

Ngô tẻ cao bằng NTCB

Optical density OD

Polymerase Chain Reaction PCR

Ribonucleic Acid RNA

Ribonuclease Rnase

Sodium dodecyl sulphate SDS

Tris-Acetic acide-EDTA TAE

Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase

Tris-EDTA TE

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase X-Gal

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Dự báo nhu cầu ngô thế giới đến năm 2020 ....................................................... 9

Bảng 1.2. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế giới 2009 – 2012 ........................ 10

Bảng 1.3. Sản xuất ngô Việt Nam từ năm 2009 – 2012 ..................................................... 11

Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 27

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng ........................................................................................ 29

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng ........................................................................................ 31

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .............................................................. 31

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA ................. 32

Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng PCR .......................................................................... 33

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng gắn 3’A Overhang ......................................................... 34

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector tách dòng .............................. 35

Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR từ khuẩn lạc .......................................................... 36

Bảng 2.10. Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn ..................................................... 37

Bảng 2.11. Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid ......................................................... 38

Bảng 2.12. thành phần phản ứng loại nhóm 5’ phosphatase ............................................ 39

Bảng 2.13. Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector ............................................. 39

Bảng 2.14. Thành phần phản ứng cắt plasmid pZY:CaMV35S ......................................... 40

Bảng 3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số của giống NTCB ............................................. 44

3.2. Kết pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 vector biến nạp quả

và Bảng pZY:CaM35S::ZmNAC1 vào 3 dòng ngô Việt Nam ........................................................... 56

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bảng 3.3. Kết quả phân tích các dòng ngô chuyển gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 thế hệ T0 của 3 dòng ngô sử dụng biến nạp ....................................................................................... 59

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cơ chế đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán ...................................... 19

Hình 2.1. Vector plasmid pGEM-T Easy mở vòng ............................................................ 35

Hình 2.2. Bản đồ cấu trúc vector biểu hiện pZY:CaMV35S .............................................. 38

Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số ............................................................... 45

Hình 3.2. Kết quả khuếch đại gen ZmNF-YB2 từ cDNA ................................................... 46

Hình 3.3.a. Kết quả PCR gen ZmNAC1 từ các cDNA; b. Kết quả PCR đoạn gen ZmNAC1 dự kiến sau khi xử lý với sorbitol 12 giờ ............................................................................ 47

Hình 3.4.a. Kết quả điện điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ khuẩn lạc mang gen ZmNF- YB2; b. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR khuẩn lạc mang gen ZmNAC1 .......................... 49

Hình 3.5. Cấu trúc vector siêu biểu hiện pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 ............................. 52

Hình 3.6. Cấu trúc vector siêu biểu hiện pZY:CaMV35S::ZmNAC1 ................................ 52

Hình 3.7.a. Kết quả PCR gen ZmNF-YB2 sử dụng cặp mồi 35S-F/ZmNF-YB2Asc-R; b. Kết quả PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi 35S-F/ZmNAC1BamHI-R................................. 53

Hình 3.8.a. Kết quả cắt vector pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 bằng enzyme giới hạn AscI; b. Kết quả cắt vector pZY:CaMV35S::ZmNAC1 bằng enzyme giới hạn BamHI ............... 54

Hình 3.9. Quy trình biến nạp gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 vào các dòng ngô Việt Nam . 59

Hình 3.10. Kết quả phân tích PCR gen chọn lọc (Bar) của các cây ngô chuyển genZmNF- YB2 thế hệ To ...................................................................................................................... 60

Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR gen đích ZmNF-YB2 của các cây ngô chuyển gen thế hệ To ................................................................................................................................... 60

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.12. Kết quả phân tích PCR gen chọn lọc (Bar) của các cây ngô chuyển gen ZmNAC1 thế hệ To ............................................................................................................. 61

MỞ ĐẦU

Ngô có tên khoa học (Zea mays L.) là một trong ba cây lương thực quan trọng nhất

trên thế. So với lúa mì và lúa gạo thì ngô đứng thứ ba về diện tích, thứ hai về năng suất

nhưng thứ nhất về sản lượng, ngô được trồng ở hơn 100 quốc gia trên thế giới tập trung ở các

nước Mỹ, Trung Quốc, Braxin, Mehicô, Pháp và Ấn Độ [65].Tính đến năm 2012 diện tích

trồng ngô thế giới vào khoảng 177,38 triệu ha, năng suất 4,92 tấn/ha, sản lượng đạt 872 triệu

tấn. Theo dự đoán vào năm 2020, nhu cầu ngô sẽ tăng lên 50% với hơn 800 triệu tấn một

năm hiện nay và có thể vượt qua cả lúa gạo và lúa mì [44]. Hiện nay, các giống ngô biến đổi

gen chiếm 26% tổng diện tích cây ngô trên thế giới [66].

Nông nghiệp hiện đang sử dụng 70% nguồn nước ở các nước đang phát triển và 86%

nguồn nước đối với các nước phát triển trong khi đó nguồn nước ngọt đang ngày càng trở nên

khan hiếm do hiện tượng biến đổi khí hậu, vì vậy các giống ngô chịu hạn và có khả năng sử

dụng nước hiệu quả đang được coi là hướng ưu tiên nghiên cứu nhằm phát triển giống ngô

trong tương lai. Cả hai phương pháp chọn giống truyền thống và chọn giống bằng công nghệ

sinh học đều đang được áp dụng để chọn tạo ra các giống cây trồng có khả năng chịu hạn.

Trong đó nghiên cứu chọn tạo giống ngô biến đổi gen chịu hạn là một hướng nghiên cứu rất

được chú trọng trên thế giới.

Những nghiên cứu về phản ứng của cây trồng đối với điều kiện trồng trọt thiếu

nước ngày càng trở nên quan trọng trong bối cảnh khí hậu trái đất thay đổi dẫn đến diện

tích khô hạn ngày một tăng [43]. Khi gặp điều kiện thiếu nước, cây trồng thường có

những phản ứng sinh lý chung, phức tạp để thích nghi và tồn tại. Điều kiện thiếu nước sẽ

làm cho thực vật đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước

trong các mô thực vật, quá trình sinh trưởng chậm lại, hệ rễ phát triển xuyên sâu và lan

rộng để hút nước.... [34].

Các nghiên cứu về khả năng chịu hạn và chọn giống ngô chuyển gen chịu hạn đang

được đồng loạt tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm, bởi công ty giống trên thế giới, ở nhiều

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

mức độ khác nhau, từ nghiên cứu cơ chế cơ bản cho đến nghiên cứu ứng dụng chuyển gen

tạo giống mới. Tuy nhiên, khả năng chịu hạn là một tính trạng phức tạp, các nghiên cứu đã

chỉ ra rằng một chiến lược chọn tạo cây ngô chịu hạn biến đổi gen hiệu quả là chiến lược

sử dụng cùng một lúc nhiều gen chịu hạn hiệu quả hoặc sử dụng một gen điều khiển có

tác dụng điều khiển nhiều gen tham gia quá trình chịu hạn [14].

Khả năng chịu hạn ở cây trồng nói chung và ở ngô nói riêng là tính trạng được

kiểm soát bởi nhiều gen. Những công trình nghiên cứu về cơ chế phân tử của khả năng

chịu hạn của thực vật trong những năm gần đây đã chỉ ra rằng: các gen tham gia vào quá

trình chịu hạn của thực vật được chia thành hai nhóm: Nhóm1- gen điều khiển (gen tổng

hợp protein điều khiển quá trình phiên mã - transcription factor, kinase...) và Nhóm 2- gen

chức năng (gen tham gia vào quá trình tổng hợp photphatase, protease, late

embryogenesis abundant (LEA), các protein sinh tổng hợp amino acid, đường: proline,

mannitol, sorbitol làm cho thực vật tạo ra hàng loạt phản ứng sinh hoá và sinh lí để tồn tại

và thích nghi) [25].

Xuất phát từ những vấn đề và yêu cầu cấp thiết này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài “Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 nhằm đáp ứng

khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán ở cây ngô”.

Mục đích của đề tài

Phân lập và thiết kế vector nhằm tăng cường sự biểu hiện của gen ZmNF-YB2 và

ZmNAC1 phục vụ cho công tác chọn tạo các dòng ngô biến đổi gen có khả năng chiu hạn.

Yêu cầu của đề tài

- Phân lập gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ giống ngô Tẻ Cao Bằng.

- Thiết kế các vector siêu biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1.

- Khảo sát khả năng tiếp nhận gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 đối với các dòng ngô

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chọn lọc Việt Nam.

Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa khoa học

- Thực hiện đề tài này giúp chúng tôi có thêm kinh nghiệm, kiến thức về các kỹ

thuật phân lập, tách chiết gen, thiết kế vector biểu hiện gen từ vật liệu, đối tượng

quan tâm, ngoài ra còn cung cấp thêm hiểu biết về các kỹ thuật chuyển nạp gen

vào thực vật mà công nghệ sinh học hiện đại đang áp dụng.

- Kết quả nghiên cứu của để tài sẽ cung cấp các vật liệu khởi đầu cho việc nghiên

cứu chức năng gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1.

Ý nghĩa thực tiễn

Ngoài ý nghĩa về khoa học, vấn đề nghiên cứu trong đề tài của chúng tôi còn có ý

nghĩa trong thực tiễn. Việc thiết kế thành công các vector biểu hiện mang gen ZmNF-YB2

và ZmNAC1 phục vụ cho việc chuyển gen vào các giống ngô Việt Nam bước đầu tạo

thuận lợi cho công tác chọn tạo giống ngô chống chịu các bất lợi phi sinh học nói chung ở

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Việt Nam.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây ngô

1.1.1. Nguồn gốc địa lý của cây ngô

Căn cứ vào những nghiên cứu về nguồn gốc cây trồng của Vavilov (1926) đã

chứng minh rằng: Miền Trung Nam Mexico là Trung tâm phát sinh thứ nhất và vùng núi

Andet thuộc Peru là Trung tâm phát sinh thứ 2 của cây ngô [59]. Năm 1948 người ta đã

tìm thấy hóa thạnh của phấn ngô được khai quật ở Bellar Arter – Mexico, điều này đã

khẳng định những nhận định của Vavilov là đúng đắn.

Từ đây, bằng nhiều con đường ngô đã phân bố ra hầu hết các nước thuộc Châu

Mỹ, lên phía Bắc, sang phía Tây của Hoa Kỳ và vượt đại dương đến các đảo thuộc vịnh

Caribe. Dưới sự tác động mạnh mẽ của con người trong công tác chọn tạo giống, cây ngô

đã nhanh chóng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau và đã hình thành một vùng

“vành đai ngô” nổi tiếng của Mỹ với các giống ngô lai đầu tiên.

Từ Peru cây ngô đã lan truyền xuống phía Nam Chile, đến Ecuador, Columbia và

nhiều vùng thuộc nước Brazil. Cây ngô được đưa vào Châu Âu từ sau chuyến thám hiểm

của Colombus năm 1493. Ở đây người ta đã nhanh chóng nhận ra giá trị lương thực của

nó, nên cây ngô đã được trồng rộng rãi và nhanh chóng lan truyền ra các nước trong châu

lục. Vào khoảng 1521 cây ngô được đưa vào Ấn Độ, Indonesia và năm 1575 ngô được

Theo nhà bác học Lê Quý Đôn, cây ngô được đưa vào Việt Nam từ cuối thế kỷ 17

(thời Khang Hy) do ông Trần Thế Vinh đi sứ Trung Quốc về và được trồng đầu tiên ở Sơn

tây và gọi là “ngô”. Nhờ những đặc điểm quý cây ngô sớm được người Việt Nam chấp nhận

và mở rộng sản xuất, coi như là một trong các cây lương thực chính chỉ sau cây lúa nước về

mặt diện tích nhưng lại là cây năng suất và giá trị kinh tế cao nhất. Cây ngô có khả năng thích

ứng rộng, có thể trồng được nhiều vụ trong năm và trồng được hầu hết các vùng sinh thái

khác nhau trong nước, đặc biệt là vùng đất cao không có khả năng tưới tiêu. Đối với vùng núi

phía Bắc và Tây Nguyên ngô là cây lương thực chính của đồng bào các dân tộc. Trải qua các

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhập vào Trung Quốc.

giai đoạn phát triển, cây ngô ở Việt Nam ngày càng được hoàn thiện và tăng mạnh về diện

tích cũng như năng suất. Việc mở rộng diện tích trồng ngô, cùng với sử dụng những giống

cho năng suất cao đã góp phần to lớn trong giải quyết nhu cầu lương thực, thực phẩm, làm

thức ăn gia súc và sử dụng trong các ngành công nghiệp [7].

1.1.2. Nguồn gốc di truyền của cây ngô

Không giống các cây ngũ cốc khác như lúa mỳ và đại mạch, ngô là những cây

được thuần dưỡng và tiến hóa từ cây hoang dại làm cây lương thực từ thời cổ đại, cây ngô

không có dạng hoang dại nào được tìm thấy ngày nay. Các nhà khoa học đã chỉ ra ngô là

cây trồng cho năng suất cao với cấu trúc sinh sản như hiện nay không thể tồn tại trong

điều kiện tự nhiên quá 2 năm. Muốn sống sót trong điều kiện chọn lọc tự nhiên đòi hỏi

phải có cơ chế phát tán hạt giống, như kiểu quả dễ vỡ, cấu trúc hình thái kiểu lông cứng

dễ vướng vào lông thú hay cấu trúc và kích thước cho phép chuyển động, phát tán theo

gió. Nhưng ở ngô không có kiểu cấu tạo vậy. Hạt trưởng thành được giấu kín trong lá bi,

khi chúng rơi xuống đất hoặc bị phân hủy hoặc nảy mầm mọc thành cụm, những cụm này

có thể không tạo ra con cháu vì độ cạnh tranh giữa các cá thể quá cao. Nếu bị muông thú

ăn, hạt dễ dàng bị tiêu hóa mà không được cơ thể động vật thải ra nguyên hạt để nảy

mầm, mọc, rồi sinh sản vì những hạt này không được bảo vệ trong vỏ cứng. Nếu không

có sự chăm sóc của con người, cây ngô sẽ bị tuyệt chủng qua vài thế hệ [6].

Nguồn gốc di truyền của cây ngô là một đề tài được tranh luận sôi nổi trong suốt

50 năm qua, cho đến nay có nhiều giả thuyết về nguồn gốc di truyền cây ngô và được tóm

lược như sau [6]:

1). Là con lai giữa teosinte và thành viên không rõ thuộc chi Andropogoneae.

2). Là con lai nhị bội tự nhiên giữa các loài Á châu thuộc chi Maydeae và

Andropogoneae.

3). Là con lai giữa ngô bọc, teosinte và tripsacum.

4). Là con lai của ngô bọc Nam Mỹ và tripsacum Trung Mỹ với teosinte.

5). Ngô, teosinte và tripsacum bắt nguồn riêng từ một dạng tổ tiên chung.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

6). Teosinte là nguồn gốc của ngô sau một hoặc nhiều đột biến.

1.1.3. Đặc điểm nông sinh học của cây ngô

Các giống ngô ở Việt Nam có những đặc điểm như chiều cao cây, thời gian sinh

trưởng, chống chịu sâu bệnh và thích ứng với các điều kiện ngoại cảnh khác nhau. Song

cây ngô có những đặc điểm chung về hình thái, giải phẫu. Các bộ phận của cây ngô bao

gồm: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ) và hạt.

Cơ quan sinh dưỡng của cây ngô gồm có: Rễ, thân, lá làm nhiệm vụ duy trì dinh

dưỡng cho cây ngô. Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây, khi hạt nảy mầm sẽ phát

triển thành cây.

Hoa ngô thuộc loại đơn tính. Chùm hoa đực phát sinh ở đầu ngọn thân thường gọi

là bông cờ. Hoa đực nằm ở đỉnh thân gồm một trụ chính, trụ phân thành nhiều nhánh,

nhánh lại được phân thành nhiều nhánh nhỏ. Khi bông cờ chín sẽ bắt đầu tung phấn, thời

gian tung phấn khoảng từ 5-8 ngày khi thời tiết ấm. Nếu gặp thời tiết lạnh thời gian tung

phấn sẽ dài hơn trong khoảng 8-10 ngày. Hoa cái (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách các lá

song chỉ 1 – 3 chồi khoảng giữa thân mới tạo thành bắp. Mỗi cây thường có 2-3 bắp, số

hạt trên bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun dâu, trỗ cờ,… khác nhau tùy từng giống, điều

kiện thời tiết [6].

1.1.4. Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế

Cây ngô được toàn thế giới gieo trồng là do vai trò quan trọng của nó trong nền

kinh tế. Vai trò đó thể hiện qua các mặt sau:

1.1.4.1. Ngô làm lương thực cho con người

Ngô là cây lương thực quan trọng trên toàn thế giới bên cạnh lúa mì và lúa gạo. Tất

cả các nước trồng ngô nói chung đều ăn ngô ở mức độ khác nhau. Toàn thế giới (giai

đoạn 1995 – 1997) sử dụng 17% sản lượng ngô làm lương thực cho con người, trong đó ở

các nước đang phát triển là 30%, các nước phát triển là 4%. Các nước ở Trung Mỹ, Nam

Á và châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính. Các nước Đông Nam Phi sử dụng 72%

sản lượng ngô làm lương thực chính. Tây Trung Phi 66%, Bắc Phi 45%, Tây Á 23%,

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nam Á 75%, Đông Nam Á và Thái Bình Dương 43%, Đông Á 12%, Trung Mỹ và vùng

Caribe 56%, Nam Mỹ 9%, Đông Âu và Liên Xô cũ 7%, Tây Âu, Bắc Mỹ và các nước

phát triển khác 4%. Nếu như ở châu Âu khẩu phần ăn cơ bản là bánh mỳ, khoai tây, sữa;

châu Á là cơm (gạo), cá, rau (canh) thì ở châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt. Vì

vậy trên phạm vi thế giới mà nói, ngô sẽ vẫn là cây lương thực rất quan trọng, vì ngô rất

phong phú về chất dinh dưỡng. Một số thành phần dinh dưỡng của ngô như sau:

- Protein: Ngô có trung bình 10,6% protein, protein chính của ngô là zein, một loại

prolamin gần như không có lysine va triptophan. Nếu ăn phối hợp ngô với đậu đỗ và các

thức ăn động vật thì giá trị protein trong hạt ngô sẽ tăng lên nhiều.

- Lipit: Lipit chiếm 4-5% trong hạt ngô, phần lớn tập trung ở phôi và màng aloron.

Trong chất béo của ngô có chứa 50% là axit linoleic, 31% là acid oleic, 13% là axit

panmitic và 3% là axit stearic.

- Gluxit: Gluxit chiếm khoảng 69% trong hạt ngô chủ yếu là tinh bột. Ở hạt ngô non

còn có thêm một số loại đường đơn và đường kép.

- Chất khoáng: Ngô nghèo canxi, giàu photpho.

- Vitamin: Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm. Ngô có nhiều

vitamin B1, riêng ngô vàng có chứa nhiều carotene (tiền vitamin A) [3].

Mặt khác trong đông y, ngô cũng có giá trị trong điều trị một số bệnh. Dâu ngô và

ruột cây ngô có vị ngọt, có tác dụng lợi tiểu, thông mật, cầm máu.

1.1.4.2. Ngô làm thức ăn chăn nuôi

Phải nói rằng ngô là cây thức ăn chăn nuôi quan trọng nhất hiện nay. Hầu như 70%

tinh bột sử dụng trong chăn nuôi được tổng hợp từ ngô, 71% sản lượng ngô trên thế giới

sử dụng làm thức ăn chăn nuôi. Ở các nước phát triển sản lượng ngô chủ yếu được sử

dụng cho chăn nuôi như: Mỹ sử dụng 76%, Bồ Đào Nha 91%, Italia 90%, Croatia 95%,

Trung Quốc 76%, Thái Lan 96%. Ngoài việc cung cấp chất tinh, cây ngô còn là thức ăn

xanh và ủ chua lý tưởng cho đại gia súc, đặc biệt là bò sữa [6].

Hiện nay, Việt Nam cũng dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi là chính (khoảng 90%)

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

song tỷ lệ ngô trong tổng số chất tinh chỉ khoảng 50% vì ta còn dùng thêm gạo gẫy, cám,

bột sắn… Nhu cầu thức ăn chăn nuôi ở nước ta hiện nay là rất lớn khoảng 8 triệu tấn/năm,

vì vậy ngô cần thiết đòi hỏi hàng năm là 4 triệu tấn. Nhu cầu ngô sẽ ngày một tăng vì

ngành chăn nuôi đang phát triển rất mạnh, kết hợp với ngành thủy sản cũng tiêu thụ một

lượng ngô rất lớn làm thức ăn cho nuôi tôm, cá [6].

1.1.4.3. Ngô làm thực phẩm

Những năm gần đây cây ngô còn là cây thực phẩm, người ta dùng bắp ngô bao tử

làm rau cao cấp. Nghề này phát triển rất mạnh, mang lại hiệu quả cao ở Thái Lan, Đài

Loan. Sở dĩ ngô rau được ưa dùng vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao. Các loại

ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được dùng làm quả ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp

làm thực phẩm xuất khẩu. Ngoài ra còn có ngô rau để xào với thịt, nấu súp, ngô ngọt để

xào, làm kem và sữa ngô… Ở một số nước Mỹ La Tinh và châu Phi người dân còn sử

dụng dạng huyền phù của bột ngô làm thức uống hàng ngày trong gia đình [6].

1.1.4.4. Ngô cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp

Ngoài việc ngô là nguyên liệu chính cho các nhà máy thức ăn chăn nuôi tổng hợp,

ngô còn nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất rượu cồn, tinh bột, dầu, glucoza, bánh

kẹo,… Ngô đã được sử dụng sản xuất cho khoảng 670 mặt hàng khác nhau liên quan đến

ngành công nghiệp lương thực – thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp nhẹ. Ví dụ

nước Mỹ hàng năm sử dụng 18% tổng sản lượng ngô để sản xuất tinh bột, 37% sản xuất

cồn và 5,8% sản xuất bánh kẹo [6].

1.1.4.5. Ngô là nguồn hàng hóa xuất khẩu

Trên thế giới hàng năm lượng ngô xuất nhập khẩu khoảng 80 – 90 triệu tấn bằng

11,5% tổng sản lượng ngô với giá bình quân trên dưới 100 USD/tấn. Đó là một nguồn lợi

lớn của các nước xuất khẩu. Các nước xuất khẩu chính là Mỹ, Argentina, Trung Quốc,

Hungary, Nam Phi, Rumania. Các nước nhập khẩu chính là Nhật Bản, Hàn Quốc,

Angerie, Mexico, Malaysia, EU, Ai Cập, Iran và Colombia [6].

Tình hình xuất nhập khẩu ngô ở Việt Nam không thể hiện trên số liệu thống kê

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

song hoạt động này cũng có thể xẩy ra bằng con đường tiểu ngạch với khoảng trên dưới

300.000 tấn/năm. Cụ thể, các nhà máy thức ăn chăn nuôi thì nhập khẩu, một số tỉnh biên

giới thì xuất khẩu.

Như vậy có thể thấy rằng nhu cầu ngô của thế giới là rất lớn và có chiều hướng

tăng nhanh trong những năm tới. Viện Nghiên cứu chương trình lương thực thế giới

(IFPRI) dự báo nhu cầu ngô trên thế giới vào năm 2020 lên đến 852 triệu tấn, tăng 45%

so với năm 1997 (bảng 1.1).

Bảng 1.1. Dự báo nhu cầu ngô thế giới đến năm 2020

Vùng 1997 (triệu tấn) 2020 (triệu tấn) % thay đổi

Thế giới 852 45 586

Các nước đang phát triển 508 72 295

Đông Á 252 85 136

Nam Á 19 36 14

Cận Sahara-châu Phi 52 79 29

Mỹ La Tinh 118 57 75

Tây và Bắc Phi 28 56 18

Nguồn: IFPRI, 2003[21]

1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam

1.1.5.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới

Trên thế giới, ngô chiếm thứ 3 về diện tích, sản lượng xếp thứ 2 và năng suất cao

nhất trong các cây ngũ cốc. Ngành sản xuất ngô trên thế giới tăng liên tục từ đầu thế kỉ 20

đến nay, nhất là trong hơn 40 năm gần đây. Năm 2009 sản lượng ngô trung bình của thế

giới là 820 triệu tấn, năm 2010 đã đạt 851 triệu tấn. Năm 2012 theo FAOSTAT, sản lượng

ngô trên toàn thế giới đã đạt 872 triệu tấn (bảng 1.2.) [30].

Các kết quả trên đạt được là nhờ ứng dụng rộng rãi thuyết ưu thế lai và cải tiến kĩ

thuật canh tác. Đặc biệt từ 10 năm trở lại đây với sự phát triển vượt bậc của công nghệ

sinh học đã tạo ra nhiều giống ngô vừa có khả năng chống chịu được các điều kiện ngoại

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cảnh khắc nghiệt vừa giúp nâng cao năng suất và chất lượng ngô.

Bảng 1.2. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế giới 2009 – 2012

Diện tích Năng suất Sản lƣợng Năm (triệu ha) (tạ/ha) (triệu tấn)

2009 158,85 51,6 820,0

2010 164,31 51,8 851,17

2011 172,05 51,6 888,01

2012 177,38 49,2 872,07

Nguồn: FAOSTAT, 2014 [65]

1.1.5.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam

Ở nước ta ngô được trồng ở hầu hết các địa phương có địa hình đất cao, dễ thoát

nước. Những vùng trồng ngô lớn là Đông Nam Bộ, Tây Nguyên, miền núi phía Bắc,

Trung du đồng bằng Sông Hồng, Duyên Hải Miền Trung. Trong đó các tỉnh miền núi phía

Bắc chủ yếu sử dụng các giống ngô địa phương. Năng suất ngô Việt Nam những năm

1960 đạt 1 tấn/ha, với diện tích hơn 200 nghìn ha [6].

Đến đầu những năm 1980 năng xuất chỉ đạt 1,1 tấn/ha do vẫn trồng các giống ngô

địa phương với kĩ thuật thâm canh lạc hậu. Từ giữa những năm 1980, nhờ hợp tác kĩ thuật

với Trung tâm Cải tạo Ngô và Lúa mỳ Quốc tế (CIMMYT), nhiều giống ngô cải tiến đã

được đưa vào trồng ở nước ta, góp phần nâng năng xuất lên gần 1,5 tấn/ha vào đầu những

năm 1990. Tuy nhiên, ngành sản xuất ngô thực sự có những bước tiến nhảy vọt từ đầu

những năm 1990 đến nay, gắn liền với việc không ngừng mở rộng các giống ngô lai ra

sản xuất, đồng thời cải tiến kĩ thuật canh tác phù hợp với yêu cầu của giống mới. Năm

2009 diện tích trồng ngô ở Việt Nam là 1089,2 nghìn ha, sản lượng đạt 4,37 triệu tấn

(bảng 1.3). Năm 2010 diện tích trồng ngô tăng lên 1126,4 nghìn ha, sản lượng đạt 4,61

triệu tấn. Năm 2011 diện tích trồng ngô là 1121,3 nghìn ha, sản lượng đạt 4,84 triệu tấn.

Năm 2012 tuy diện tích trồng ngô là 1118, 2 nghìn ha giảm so với năm 2010 và năm 2011

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhưng sản lượng ngô đạt 4,8 tấn cao hơn sản lượng năm 2010.

Bảng 1.3. Sản xuất ngô Việt Nam từ năm 2009 – 2012

Năm 2009 2010 2011 2012

Diện tích 1,09 1,13 1,12 1,12 (triệu ha)

Sản lượng 4,37 4,61 4,84 4,80 (triệu tấn)

Năng suất 40,14 40,90 43,13 42,95 (tạ/ha)

(Nguồn: FAOSTAT, 2014) [65]

1.2. Tình hình phát triển ngô biến đổi gen trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1. Các phương pháp chuyển gen vào ngô

Hiện nay, có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật và được chia thành hai

nhóm: phương pháp chuyển gen trực tiếp và phương pháp chuyển gen gián tiếp. Ở

phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật thông

qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định (bằng hóa chất, xung điện, hay súng bắn gen).

Trong phương pháp chuyển gen gián tiếp gen được chuyển vào tế bào thực vật qua một

sinh vật trung gian, thường là vi sinh vật hoặc virus (thông qua vi khuẩn A. tumefaciens).

Tuy nhiên, hai phương pháp chuyển gen chính được áp dụng rộng rãi và có giá

trị thực tiễn cao với hầu hết các loại cây trồng nói chung và cây một lá mầm nói

riêng (trong đó có cây ngô) là chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen

thông qua vi khuẩn A. tumefaciens [6].

1.2.1.1. Chuyển gen vào ngô bằng súng bắn gen

Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen được áp dụng ở nhiều đối tượng thực

vật như thuốc lá, đậu tương, lúa mạch, lúa mỳ và ngô. Phương pháp súng bắn gen có

nhiều ưu điểm là có tính khả thi cao: có thể áp dụng với hầu hết các loại mô tế bào,

chuyển DNA ngoại lai vào tế bào nhanh, dễ sử dụng, các vector được thiết kế đơn giản,

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cần một lượng nhỏ plasmid DNA, biểu hiện gen tạm thời có thể quan sát được sau vài

ngày, khả năng áp dụng cao trong chuyển gen vào các giống cây trồng thương mại. Tuy

nhiên, phương pháp này cũng tồn tại một số hạn chế như: các mô bị phá hủy dẫn tới khả

năng phục hồi và tái sinh thấp, khả năng tái sinh của một số đối tượng ở dạng cây không

hoàn chỉnh, nhiều bản sao được chuyển vào tế bào cùng một lúc gây khó khăn cho việc

phân tích, hiệu quả chuyển gen thấp.

Nguyên lý của phương pháp súng bắn gen là dựa trên cơ sở các hạt nhỏ bé (bằng

vàng hoặc tungsten) được bọc bên ngoài bằng plasmid DNA, chuyển vào bên trong tế bào

chủ nhờ áp lực cao của nguồn khí helium.

Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã áp dụng phương pháp chuyển gen bằng súng

bắn gen ở ngô và đã thu được cây ngô hữu thụ thông qua các dạng mô đích khác nhau

như: tế bào huyền phù, tế bào mô sẹo, tế bào mô phân sinh chồi đỉnh và tế bào phôi non.

So sánh hiệu quả biến nạp giữa các dạng tế bào đích khác nhau cho thấy phôi non là dạng

mô đích thích hợp nhất cho nghiên cứu chuyển gen ở ngô bằng súng bắn gen [5].

Trên cơ sở nghiên cứu các yếu tố chính ảnh hưởng đến biểu hiện tạm thời và khả

năng tái sinh của mô chuyển gen, Phạm Thị Lý Thu và cộng sự (2007) đã xây dựng quy

trình biến nạp gen vào phôi non ngô của dòng HR8 bằng súng bắn gen [5].

1.2.1.2. Chuyển gen vào ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Trong các phương pháp chuyển gen, cho đến nay người ta nhận thấy phương pháp

chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens có nhiều ưu điểm như giá thành

rẻ, tiện lợi, hiệu quả cao. Do vậy, phương pháp này đang được áp dụng rộng rãi trên nhiều

đối tượng cây trồng.

Sự thành công của việc chuyển gen vào cây trồng thông qua vi khuẩn A.

tumefaciens phụ thuộc vào một loạt các yếu tố liên quan đến vi khuẩn và thực vật. Các

yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, thời gian lây

nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vector. Các yếu

tố liên quan đến thực vật gồm loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mô đích, khả năng phân bào

của các tế bào đích và thành phần môi trường…

Ngô là loại cây trồng khó tính trong chuyển gen thông qua Agrobacterium. Nhiều

nghiên cứu trên thế giới được tiến hành nhằm nâng cao tần số biến nạp như lựa chọn Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chủng vi khuẩn A. tumefaciens và vector thích hợp, tiền xử lý mẫu mô, xử lý áp suất thẩm

thấu, điều chỉnh nhiệt độ đồng nuôi cấy mô thực vật với vi khuẩn Agrobacterium, thành

phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy, các chất kháng sinh loại bỏ vi khuẩn…

Trên cơ sở các nghiên cứu thu được ở điều kiện Việt Nam, Phạm Thị Lý Thu và cộng sự

(2007) đã xây dựng quy trình chuyển gen vào phôi non ngô của dòng HR8 thông qua vi

khuẩn A. tumefaciens[5].

1.2.2. Thành tựu và triển vọng của cây ngô biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam

Ngày nay công nghệ sinh học hiện đại đang được ứng dụng một cách có hiệu quả

trong sản xuất nông nghiệp, công nghiệp, y học và bảo vệ môi trường… tạo ra ngày càng

nhiều sản phẩm hữu ích phục vụ đời sống con người. Sau hơn 30 năm kể từ khi phát hiện

ra các enzyme cắt DNA tại những điểm đặc hiệu (1990), thế giới đã chứng kiến bước phát

triển vượt bậc của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen. Trong nông nghiệp,

thông qua công nghệ gen, người ta đã tạo ra hàng loạt các giống cây trồng biến đổi gen

GMC (Genetically Modified Crops) mang các đặc tính nông học quan trọng và thường

được gọi là cây chuyển gen. Đó là các giống ngô, bông, đậu tương, cải dầu… kháng sâu,

kháng thuốc diệt cỏ, năng suất cao.

Theo số liệu của Clive James (2013), năm 2013 đã có 27 nước trên thế giới trồng

cây trồng biến đổi gen (hay cây trồng công nghệ sinh học) với tổng diện tích 175,3 triệu

ha, tăng 5% so với năm 2012, đáng chú ý trong số đó có 19 nước phát triển và 8 nước

công nghiệp. Hơn một nửa dân số thế giới khoảng 60% dân số (tương đương gần 4 tỷ

người) sống trên 27 nước trồng cây trồng công nghệ sinh học. Trong đó, 10 nước dẫn đầu

đều có diện tích cây trồng công nghệ sinh học trên 1 triệu ha năm 2013. Dẫn đầu là Mỹ

với 70,1 triệu ha (chiếm 40%), tiếp theo lần lượt là Brazil với 40,3 triệu ha (23%),

Argentina 24,4 triệu ha (14%), Ấn Độ 11,0 triệu ha (6%), Canada 10,8 triệu ha (6%),

Trung Quốc 4,2 triệu ha (2%),… [23].

Dựa trên số liệu thống kê năm 2013, các loại cây trồng chuyển gen được sử dụng

rộng rãi là đậu tương, ngô, cải dầu, bông, cà chua, thuốc lá, lúa. Trong đó đậu tương

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

khoảng 48%, ngô 33%, bông 14%, cải dầu 5%, … Các cây trồng được chuyển gen kháng

thuốc trừ cỏ chiếm khoảng 68%, kháng côn trùng 19%, kết hợp vừa kháng thuốc trừ cỏ và

côn trùng 13%. Cây trồng biến đổi gen đã góp phần tăng năng suất, giảm lượng hóa chất

và thu được lợi nhuận cao hơn so với các giống cây trồng thông thường [23].

Năm 2013 cây ngô chuyển gen chiếm 57,4 triệu ha tăng 4% tương đương với 2,3

triệu ha so với năm 2012. Đáng chú ý là có 17 nước trồng ngô chuyển gen năm 2013.

Trong đó có 5 nước trồng hơn 1 triệu ha trong đó bao gồm Mỹ (35,6 triệu ha), Brazil

(12,9 triệu ha), Argentina (3,2 triệu ha), Nam Phi (2,4 triệu ha) và Canada (1,7 triệu ha), 5

nước EU (bao gồm: Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Czech, Romania và Slovakia) có diện

tích trồng ngô chuyển gen Bt là 148,013 nghìn ha tăng 15% so với năm 2012 với 129,071

Hiện nay, cây ngô chuyển gen đang được thương mại hóa chủ yếu là các giống kháng

sâu (Bt) như giống Mon810, Mon863, Mon810 + 830, Mon810 + 830 + NK630 (Monsanto);

giống ngô mang gen kháng thuố trừ cỏ (Glyphosate/Glufosinate) gồm NK603 (Monsanto),

T25 (Aventis), TC1507 + DAS-59122-7 + NK603 (Pioneer Hi-Bred); giống ngô đồng thời có

chứa cả gen kháng sâu và kháng thuốc trừ cỏ gồm có Bt11, SYTGA21, SYTGA21 + Bt11

(Syngenta); TC1057, TC1507 + NK603, DAS-59122-7, TC1507 + DAS-59122-7 (Pioneer

Hi-Bred); Mon810 + NK603, Mon863 + NK603, Mon810 + SYTGA21 (Monsanto); DAS-

59122-7 + NK603 (Pioneer Hi-Bred Monsanto) [5].

nghìn ha [23].

Tuy nhiên, trong các năm gần đây đã có hàng loạt các phòng thí nghiệm trên khắp

thế giới tiến hành nghiên cứu biến nạp gen có khả năng chịu hạn vào ngô. Hiện tại đã có

một số công bố về các giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn được thử nghiệm trên

đồng ruộng như các giống có ký hiệu MON87460; MON87460 X MON89034 X

MON88017; MON87460 X MON89034 X NK603; MON87460 X NK603 do công ty

Monsanto và BASF đều có khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán [67].

Mặc dù cây chuyển gen, trong đó có cây ngô được phát triển ngày càng rộng khắp

và mang lại nhiều lợi ích cho con người trên toàn cầu, song vẫn còn những quan điểm trái

ngược, đặc biệt nhiều ý kiến quan ngại về ô nhiễm môi sinh và sự an toàn trong việc sử

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

dụng các sản phẩm chuyển gen cho đời sống cộng đồng.

Cho đến nay tồn tại một số quan điểm chính sau:

- Lập trường của các nước xuất khẩu và nhập khẩu các sản phẩm chuyển gen là

khuyến khích dùng và tạo điều kiện cho việc sử dụng, xuất nhập khẩu.

- Lập trường của các nước châu Âu muốn có một nghị định thư chặt chẽ đảm bảo

tuyệt đối an toàn cho việc chuyển giao và sử dụng các sản phẩm chuyểm gen.

- Lập trường của đa số các nước đang phát triển thì chưa tỏ rõ quan điểm của mình

vì chưa có nhu cầu xuất nhập khẩu và lợi ích từ các sản phẩm chuyển gen.

Từ năm 2000 đến nay, sau khi 133 nước thông qua Nghị định thư Cartagena về an

toàn sinh học, thì xu thế tích cực theo hướng ủng hộ phát triển các sản phẩm biến đổi gen.

Các nước đã nhất trí không sử dụng các gen kháng thuốc kháng sinh làm chỉ thị chọn lọc

cho cây trồng chuyển gen, đề nghị các nước xúc tiến dự thảo quy chế an toàn sinh học đối

với các sinh vật biến đổi gen, luật bản quyền phát minh và sở hữu trí tuệ.

Trong lĩnh vực chuyển gen vào cây trồng, Việt Nam triển khai chậm hơn so với thế

giới. Một số công trình chuyển gen mới được tiến hành nghiên cứu trong phạm vi một số

phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Sinh

học Nhiệt đới, Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long.

Tại viện Công nghệ Sinh học, đã nghiên cứu chuyển gen Xa21 kháng bệnh bạc lá

và gen cry kháng sâu vào lúa. Viện đã tiến hành nghiên cứu phân lập gen chịu lạnh, chịu

hạn và mặn ở cây lúa, gen kháng bọ hà ở khoai lang, kháng bệnh đốm vòng ở đu đủ, gen

nâng cao sức chống chịu điều kiện ngoại cảnh vào cây hoa, cây bông và cây lâm nghiệp.

Viện cũng đã thiết kế thành công các vector chuyển gen mang gen kháng sâu Cry1ac dưới

sự điều khiển của promoter khởi động Ubi/Suc được phân lập từ các cây ngô/lúa, có biểu

hiện tốt khi chuyển gen vào các cây một lá mầm [2].

Còn ở Viện Sinh học Nhiệt đới, các nghiên cứu về chuyển gen đã thu được nhiều

kết quả. Các nhà khoa học của Viện đã tạo được các cây thuốc lá, đậu xanh, súp lơ, cải

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

xanh, cà tím mang gen kháng côn trùng, gen kháng thuốc trừ cỏ [4].

Trong khi đó, Viện Di truyền Nông nghiệp, đã tiến hành nghiên cứu nhiều khâu

trong quá trình chuyển gen, nhằm mục đích xây dựng các quy trình chuyển gen vào một

số cây trồng quan trọng. Viện cũng đã nghiên cứu các phương pháp chuyển gen khác

nhau và đã áp dụng thành công đưa các gen quý vào các cây trồng quan trọng như lúa, cải

bắp, cải dầu. Đặng Trọng Lương và cộng sự (2001) đã tiến hành phân lập và thiết kế

vector mang gen tổng hợp insulin để chuyển vào cây lúa mỳ, thiết kế vector và chuyển

gen cry1ac vào cây cải bắp. Từ năm 2002, các nghiên cứu bước đầu về biến nạp gen ở

cây ngô đã được thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp. Đặc biệt, năm 2007 Phạm Thị

Lý Thu đã công bố một công trình khá hoàn chỉnh về chuyển gen vào cây ngô ở điều kiện

Việt Nam. Mặc dù cũng còn những hạn chế như thực nghiệm trên các vật liệu nhập nội,

song công trình đã cung cấp rất nhiều thông tin bổ ích thuộc tất cả các khâu trong quá

trình chuyển gen ở ngô. Ngoài ra, Nguyễn Văn Đồng thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm

Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp cũng đang bước đầu nghiên

cứu đề tài chuyển gen tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán vào một số

giống ngô Việt Nam đã và đang thu được một số kết quả nhất định [1].

Nhìn chung, công tác nghiên cứu chuyển gen ở Việt Nam còn lẻ tẻ, chỉ giới hạn

trong một số phòng thí nghiệm và vì vậy các kết quả nghiên cứu của những công trình

trên chỉ là những cây chuyển gen lưu giữ trong điều kiện in vitro hoặc trong nhà kính, mà

chưa có dòng giống cây trồng chuyển gen nào được đưa ra sản xuất.

1.3. Ảnh hƣởng của hạn hán đến cây trồng và phản ứng của cây trồng với điều kiện hạn hán

1.3.1. Hạn hán và nhu cầu tạo cây trồng kháng hạn

Hạn hán là tình trạng lượng nước tự nhiên thấp hơn mức trung bình trong một thời

gian dài trên diện rộng và mang tính khu vực. Trong các yếu tố bất lợi của môi trường, hạn

hán ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất cây trồng trên toàn thế giới [10]. Một số mô hình dự

đoán biến đổi khí hậu cho thấy hạn hán sẽ xảy ra thường xuyên hơn trong tương lai do những

tác động dài hạn của hiện tượng ấm lên toàn cầu [11]; [50]. Hậu quả là diện tích đất canh tác

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ngày càng bị thu hẹp.

Trước những thách thức nêu trên, việc nghiên cứu phát triển những giống cây trồng

mới có khả năng thích ứng, chống chịu các điều kiện bất thuận đang là mục tiêu hàng đầu của

các nhà khoa học. Một trong những kỹ thuật luôn mang lại nhiều kỳ vọng đó là nghiên cứu,

phát triển các giống cây trồng biến đổi gen dựa trên việc phân lập các gen có lợi và thiết kế

các vector hiệu có khả năng tiếp nhận gen cao để chuyển các gen mục tiêu vào đối tượng cây

trồng xác định.

Trong vòng 10 năm trở lại đây, Việt Nam đã và đang chú trọng đến các nghiên cứu

cây trồng biến đổi gen. Trước mắt, chính phủ đã đặt ra một lộ trình cho phát triển cây trồng

chuyển gen ở Việt Nam từ 2006 – 2020, tiến đến chính thức chấp nhận cây trồng biến đổi gen

ở Việt Nam, chia làm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 2006 – 2015: Bắt đầu khảo nghiệm và đưa một số giống cây trồng biến

đổi gen nhập của các công ty nước ngoài trên đồng ruộng của Việt Nam.

- Giai đoạn 2015 - 2020: Diện tích cây trồng biến đổi gen… (ngô, bông, đậu tương)

đạt từ 30-50% diện tích sản xuất của đối tượng này.

1.3.2. Khái niệm về tính chiu hạn và phản ứng của cây trồng với điều kiện hạn

Mỗi cây trồng có một ngưỡng giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của

môi trường như hạn, nóng, lạnh, mặn, ... Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại cho sự

sinh trưởng và phát triển của cây, giảm năng suất sinh học [8]. Đối với thực vật, khái

niệm “hạn” dùng để chỉ sự thiếu hụt nước do môi trường gây nên trong suốt cả quá trình

hay trong từng giai đoạn, làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây. Mức độ

tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức khác nhau như chết, chậm phát

triển hay phát triển tương đối bình thường. Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát

triển và cho năng suất tương đối ổn định trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn

và khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây nên

gọi là tính chịu hạn.

Nghiên cứu về phản ứng của cây trồng đối với điều kiện trồng trọt thiếu nước ngày

càng trở nên quan trọng trong bối cảnh khí hậu trái đất thay đổi dẫn đến diện tích khô hạn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ngày một tăng [43]. Khi gặp điều kiện thiếu nước, cây trồng thường có những phản ứng sinh

lý chung, phức tạp để thích nghi và tồn tại. Điều kiện thiếu nước sẽ làm cho thực vật đóng

các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô thực vật, quá

trình sinh trưởng chậm lại, hệ rễ phát triển xuyên sâu và lan rộng để hút nước…[34].

Khả năng chịu hạn ở cây trồng nói chung và ở ngô nói riêng là tính trạng được kiểm

soát bởi nhiều gen. Những công trình nghiên cứu về cơ chế phân tử của khả năng chịu hạn

của thực vật trong những năm gần đây đã chỉ ra rằng: các gen tham gia vào quá trình chịu hạn

của thực vật được chia thành hai nhóm: Nhóm1 – gen điều khiển (gen tổng hợp protein điều

khiển quá trình phiên mã - transcription factor, kinase...) và Nhóm 2 – gen chức năng (gen

tham gia vào quá trình tổng hợp photphatase, protease, late embryogenesis abundant (LEA),

các protein sinh tổng hợp amino acid, đường: proline, mannitol, sorbitol làm cho thực vật tạo

ra hàng loạt phản ứng sinh hoá và sinh lí để tồn tại và thích nghi (hình 1.1) [25].

Những kết quả nghiên cứu đã công bố [19]; [41]; [46]; [56]; [60] đã chỉ rõ nghiên cứu

tách chiết và sử dụng hệ thống gen điều khiển trong chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen có

khả năng chịu hạn đã và đang là tâm điểm của hàng loạt các phòng thí nghiệm trên toàn thế

giới. Rõ ràng rằng các thành tựu trong việc nghiên cứu và việc khám phá ra hệ thống gen

điều khiển và các promoter cảm ứng đóng vai trò quyết định trong việc kiểm soát tính trạng

chịu hạn ở thực vật đã mở ra một triển vọng mới trong việc chon tạo các giống cây trồng

(trong đó có ngô) biến đổi gen có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi

trường (hạn, nóng, mặn, lạnh…). Vì những ưu điểm này của hệ thống gen điều khiển, chúng

tôi quyết định ưu tiên hướng sử dụng gen điều khiển là nguồn gen chính cho nghiên cứu chọn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tạo cây ngô biến đổi gen chịu hạn.

Hình 1.1. Cơ chế đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán

1.4. Tổng quan về gen NF-YB2 và NAC1

1.4.1. Khái niệm và vai trò của các nhân tố phiên mã với điều kiện bất lợi phi sinh học

Khả năng chống chịu lại yếu tố bất lợi - phi sinh học của thực vật nói chung và của ngô nói riêng là do nhiều gen kiểm soát, trong đó có gen mã hóa các yếu tố phiên mã (transcription factors – TFs) hay còn gọi là gen điều khiển (gen TF).

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Khi gặp điều kiện bất lợi, gen TF bắt đầu hoạt động mạnh để sản sinh ra các protein TF (yếu tố phiên mã). TF này có khả năng nhận biết, tương tác và bám dính đặc hiệu với các yếu tố cis trong vùng promoter của hàng loạt các gen chức năng, để tạo ra

một cấu trúc không gian thuận lợi giúp cho các enzyme ARN polymeraza bắt đầu hoạt động và thúc đẩy quá trình phiên mã của các gen chức năng nhằm sản sinh ra các protein giúp cho cây trồng đáp ứng với các điều kiện bất lợi. Do vậy, gen TF giữ vai hết sức quan trọng trong quá trình thích ứng với các điều môi trường bất lợi của thực vật.

Hiện nay, hệ genome thực vật có khoảng 7% trình tự mã hóa các yếu tố phiên mã

(TFs), chứng tỏ sự phức tạp của quá trình điều khiển phiên mã [57]. Trong hệ genome của

cây Arabidopsis thaliana có khoảng 1500 TFs được nghiên cứu là có liên quan đến biểu

hiện của những gen có khả năng đáp ứng với các yếu tố bất lợi [45]. Các thông tin về

transcriptome trong cây Arabidopsis và nhiều loại cây trồng khác cho rằng có một số con

đường đáp ứng một cách độc lập với các điều kiện bất lợi của môi trường (trong cả 2

trường hợp phụ thuộc và không phụ thuộc vào ABA), cho thấy khả năng chống chịu

stress hay mẫn cảm được điều khiển ở mức độ phiên mã bởi một mạng lưới điều hòa gen

cực kỳ phức tạp [58]. Phytohormone ABA là trung tâm điều khiển stress phi sinh học, đặc

biệt là khả năng kháng hạn ở thực vật do sự kết hợp với một mạng lưới điều khiển gen

phức tạp giúp cây trồng đối phó với sự thiếu hụt nước [13]; [26]. Các hệ thống tín hiệu

phụ thuộc ABA được minh họa như con đường trung gian đáp ứng với những yếu tố bất

lợi qua sự cảm ứng của ít nhất hai regulons riêng biệt (một nhóm các gen được điều khiển

bởi 1 TF nhất định): (1) regulon AREB/ABF (protein liên kết nhân tố đáp ứng ABA/yếu tố

liên kết ABA) và (2) regulon MYC (oncogene myelocytomatosis)/MYB (myeloblastosis

oncogene) [49]. Trong khi đó các regulon không phụ thuộc ABA là: (1) CBF/DREB

regulon và (2) NAC (NAM, ATAF và CUC) và ZF-HD (zinc-finger homeodomain)

regulon [39]; [49]. Ngoài ra, một số nghiên cứu đã xác định được sự tồn tại của cả 2 con

đường phụ thuộc và không phụ thuộc vào ABA trong quá trình đáp ứng stress có chức

năng thông qua một số thành viên của họ AP2/EREBP (ERF) [28].

1.4.2. Tổng quan về gen NF-YB2

Các yếu tố phiên mã Nuclear Factor Y (NF-Y) (cũng được biết đến như là các

protein Heme-associated (HAPs) và yếu tố liên kết với vùng CCAAT (CBFs)) đóng vai

trò quan trọng trong phản ứng của thực vật với các tín hiệu môi trường và hormone khác

nhau một cách dễ dàng [47]. NF-Ys được biết đến như là trình tự yếu tố phiên mã đặc hiệu Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

với histone như cấu trúc siêu phân tử, với cấu trúc đặc biệt để chúng liên kết với DNA ở

các vị trí khác nhau như các vùng phức hợp CCAAT bao gồm các tiểu đơn vị từ mỗi

nhóm trong 3 nhóm protein: NF-YA, NF-YB và NF-YC. Trong các loài thực vật, mỗi tiểu

đơn vị được mã hóa bởi một nhóm trong số gần 10 gen ở cả cây hai lá mầm và cây một lá

mầm [24]. Sự phát triển của các nhóm NF-Y trong thực vật kết hợp với heterotrimeric tự

nhiên của chúng dẫn đến nhiều phức NF-Y được hình thành. Điều này dẫn đến sự hình

thành của một hệ thống tổ hợp linh hoạt của các yếu tố phiên mã cho phép điều chỉnh phù

hợp với nhiều điều kiện môi trường khác nhau [24].

NF-YB và NF-YC có chứa motif của histone 2A (H2A) và histone 2B (H2B) và

hình thành 1 heterodimer ở vị trí bề mặt của histone-fold-motif (HFM) trên mỗi tiểu đơn

vị [34]. Cả hai cấu trúc siêu phân tử được hình thành trên cơ sở liên kết với tiểu đơn vị

DNA-binding của NF-YA [54]. Chức năng của NF-Y trên hộp CCAAT chủ yếu được

nghiên cứu trên động vật có vú và nấm men. Mỗi cấu trúc được quy định bởi một gen

riêng biệt trong cơ thể sinh vật. Nét đặc trưng và riêng biệt của hoạt động phiên mã được

hoạt hóa bởi sự tương tác với các nhân tố vận chuyển ngược chiều khác [33].

Ngược lại, trong thực vật các NF-Y mã hóa bởi các nhóm gen lớn [53]. Lúc đầu

người ta tìm thấy trong cây Arabidopsis thaliana có 29 gen mã hóa cho NF-YA, B hoặc C

được nghiên cứu [16]. Nhưng sau đó thêm vào một vài gen được biết đễn cũng quy định

cho các nhóm NF-Y bao gồm 10 gen của phân họ NF-YA, còn trong 2 phân họ NF-YB và

NF-YC mỗi loại có 13 gen [53]. Phần lớn các gen đặc trưng bởi sự biểu hiện khác nhau

trong các mẫu mô khác nhau và trong quá trình sinh dưỡng và phát triển của thực vật. Có

nhiều gen trong 3 nhóm NF-Y được biết đến có vai trò rất phức tạp trong quá trình điều

khiển sự phiên mã của NF-Y. Chúng được biết đến với các thành viên trong mỗi nhóm

gen đặc biệt góp phần kích hoạt các gen cụ thể và NF-Y heterotrimeric phức tạp, có thể

đóng vai trò như nhân tố phiên mã kết hợp. Do đó, nhiều gen có thể được quy định bởi

thời gian và không gian với sự tái tổ hợp của các tiểu đơn vị NF-Y khác nhau [15]. Sự kết

hợp đa dạng của các NF-Y trong cây Arabidopsis đã được khảo sát bằng nghiên cứu tương

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tác của 2 chủng nấm men lai [17].

NF-Y được biết đến như là khả năng điều hòa sự phát triển kiểu hình khác nhau và

phản ứng với stress. Ví dụ như, NF-YB và NF-YC điều khiển sự nở hoa phụ thuộc chu kỳ

sáng [18] và sự biểu hiện quá mức của cả 2 protein NF-YA và NF-YB có thể dẫn đến tăng

khả năng chịu đựng với điều kiện hạn trong thực vật [27]. Trong các cây họ đậu

Phaseolus vulgaris và Medicago truncatula, đặc biệt là NF-YA và NF-YC cần thiết cho sự

phát triển khả năng cố định nitơ [55]. Một số nghiên cứu khác cho thấy NF-Ys có tham

gia vào quá trình phát sinh phôi, sự hấp thụ ánh sáng, quang tổng hợp [31]. AtNF-YB6

(L1L) và AtNF-YB9 (LEC1) có liên quan đến sự phát triển phôi ở hạt [62], [64]. Trong

những năm gần đây, NF-Y đã được tìm thấy chức năng có liên quan đến stress hạn. Li và

cộng sự (2010) đã chứng minh sự biểu hiện quá mức của AtNF-YA5 làm giảm độ mở khí

khổng và mất nước ở lá và khởi động tín hiệu tăng chống chịu hạn, AtNF-YA5 được biết

là có thể điều khiển phiên mã bởi abscisic acid và tín hiệu phiên mã bởi miR169 [30]. Sự

biểu hiện quá mức của AtNF-YB1 làm cải thiện những bất lợi gây ra khi dư thừa nước và

tốc độ quang tổng hợp dưới điều kiện xử lý hạn của cây Arabidopsis. Các cây ngô chuyển

gen với ZmNFY-YB2 là đồng đẳng của AtNF-YB1, cho thấy khả năng chống chịu với điều

kiện hạn hán như tăng hàm lượng diệp lục, đóng mở khí khổng, tốc độ quang tổng hợp và

giảm nhiệt độ của lá dưới điều kiện hạn và ức chế sự thúc đẩy năng suất hạt [41].

Nelson và cộng sự (2007) đã biến nạp gen ZmNF-YB2 mã hóa yếu tố phiên mã NF-

YB2 vào cây ngô. Kết quả đánh giá cây ngô chuyển gen dựa trên các thông số như là hàm

lượng diệp lục, độ mở khí khổng, nhiệt độ của lá, giảm héo rũ và khả năng duy trì quang

hợp cho thấy các cây ngô chuyển gen có biểu hiện chịu hạn tốt. Các tác giả này cũng đã

chỉ ra rằng giống ngô biến đổi gen mang gen điều khiển tính chịu hạn (ZmNF-YB2) của

công ty Monsanto - Mỹ có năng suất cao gấp hai lần so với đối chứng khi thử nghiệm trên

đồng ruộng Châu Phi [41].

1.4.3. Tổng quan về gen NAC1

Các nhân tố phiên mã NAC là một trong nhóm lớn nhất của các chất điều hòa phiên

mã trong thực vật, và các thành viên của nhóm gen NAC đóng vai trò quan trọng điều

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

khiển quá trình phiên mã kết hợp với phản ứng stress của thực vật [37]. Trong vùng trình

tự đầu tiên của cDNA mã hóa một protein NAC là gen đáp ứng với sự mất nước (RD26) ở

trong cây Arabidopsis [63]. Vùng NAC được đặc trưng cơ bản trên các trình tự nhất quán

từ các protein NAM trong cây thuốc lá (Petunia) và ATAF1/2 và CUC2 trong Arabidopsis

[8]. Nhiều TFs NAC bao gồm CUC2 trong Arabidopsis đóng vai trong sự phát triển của

thực vật một vài gen NAC làm trung gian kháng virus [38], trong khi đó một số nhóm

khác tăng khả năng điều hòa cân bằng khi bị tổn thương và nhiễm khuẩn [12].

Các domain NAC được biết đến như là trung gian cho sự điều hòa phiên mã của

các quá trình sinh học khác nhau bằng việc tạo cấu trúc helix-turn-helix liên kết đặc biệt

với DNA đích [9]. Các TFs NAC thay đổi khác nhau không nhiều lắm trong trình tự kết

thúc -C của chúng và có khả năng hoạt hóa hoặc ngăn chặn sự hoạt động. Có hơn 100 gen

NAC đã được phát hiện trong cây Arabidopsis và lúa, chúng được phân loại vào 6 nhóm

chính. TFs NAC đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của thực vật và đáp ứng stress

phi sinh học [38]. Ở một số loài thực vật quá trình sinh trưởng và phát triển được điều

khiển bởi TFs NAC, bao gồm hình thành hệ thống phân sinh đỉnh chồi, sự phát triển rễ

bên, quá trình già hóa, sự phát triển thành tế bào, và trao đổi chất thứ cấp. Phần lớn các

TFs NAC có biểu hiện khác nhau trong quá trình đáp ứng với stress sinh học và phi sinh

học [61] và ở các cây Arabidopsis và lúa biến đổi gen NAC có biểu hiện đáp ứng mạnh

với stress giúp cải thiện khả năng chống chịu hạn hán. Các nghiên cứu này cho thấy các

nhân tố phiên mã NAC đáp ứng với stress đóng vai trò quan trọng khi điều khiển làm tăng

cường khả năng đáp ứng của thực vật với stress phi sinh học và có thể cải thiện khả năng

chống chịu với stress nhờ vào kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại [38].

Thú vị hơn, sự biểu hiện quá mạnh của OsNAC6 ở các cây lúa đã tăng cường khả

năng chống chịu với các stress phi sinh học (mất nước, nồng độ muối cao) cũng như là

trong điều kiện stress sinh học (bệnh đạo ôn) [40]. Trong cây Arabidopsis yếu tố phiên

mã NAC, ATAF2 được kích hoạt bằng cách xử lý salicylic acid và methyl jasmonate, và

có biểu hiện khác nhau trong quá trình đáp ứng lại sự tổn thương [20]. Gen StNAC trong

cây khoai tây cho thấy cũng biểu hiện trong quá trình đáp ứng với lây nhiễm

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Phytophthora infestant và xử lý tổn thương [22]. Với các nghiên cứu đó, dường như các

TFs NAC trong thực vật đóng vai trò đa dạng trong việc đáp ứng quá trình chống chịu với

sự tấn công của các nguồn bệnh cũng như các kích thích bên ngoài [61].

Trong các công trình nghiên cứu của Lam-Son Phan Tran và cộng sự (2009) đã chỉ

ra rằng ở đậu tương trong số 31 gen điều khiển GmNAC thuộc nhóm gen điều khiển NAC

được kiểm tra, có 9 gen liên quan đến khả năng chịu hạn, mặn và lạnh. Trong số các gen

GmNAC này thì các gen ở NST số 1 (GmNAC002, GmNAC003, GmNAC004) có khả năng

biểu hiện mạnh hơn cả [36]. Cùng với đó Lê và cộng sự (2011), cũng cho thấy ở đậu

tương có ít nhất 205 gen GmNAC điều khiển, ít nhất có 31 gen tham gia vào khả năng

chống chịu, đặc biệt là gen GmNAC085 [29]. Mặt khác, bộ gen của đậu tương đã được

giải mã hoàn toàn tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu toàn diện các gen điều khiển

(transcription factors) ở đậu tương [51]. Rõ ràng rằng, nghiên cứu phân lập và sử dụng hế

thống gen điều khiển trong chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen chống chịu các điều

kiện bất lợi đang là hướng đi được rất nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm.

Trong những năm gần đây, các công bố đã chỉ ra rằng các gen mã hóa các yếu tố

phiên mã NAC (NAM, ATAF và CUC) có khả năng tham gia vào quá trình chống chịu của

cây trồng đối với các điều kiện bất thuận như hạn, mặn và lạnh [56]. Các nghiên cứu sâu

về yếu tố NAC trên một số cây trồng đã đưa ra giả thuyết là ít nhất có 105 yếu tố phiên mã

NAC ở cây Arabidopsis, 140 ở cây lúa, 205 ở cây đậu tương và 152 ở cây thuốc lá [15];

[36]; [42]; [48]. Cùng với việc khám phá ra khả năng sử dụng các gen NAC để làm tăng

khả năng chống chịu với các điều kiện bất thuận ở cây mô hình Arabidopsis, rất nhiều

nghiên cứu ứng dụng thành công gen NAC trên cây trồng bằng kỹ thuật biến đổi gen đã

được công bố [19]. Cây lúa được chuyển gen NAC1 cho kết quả chịu hạn và mặn tốt ở

giai đoạn 4 lá, ngoài ra cây chuyển gen còn cho năng suất cao hơn đối chứng từ 22-34%

[19]. Tuy nhiên, chỉ một vài gen nhóm NAC được phát hiện trong cây ngô. Lu và cộng sự

(2012), đã phân lập và nghiên cứu chức năng đặc trưng của gen ZmNAC1 từ ngô. Phân

tích sự biểu hiện cho thấy gen ZmNAC1 có khả năng thích nghi cao với nhiệt độ thấp,

nồng độ muối cao, stress hạn và xử lý với ABA, nhưng khả năng điều hòa giảm xuống khi

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

xử lý với salicylic acid. Khi tiến hành thí nghiệm ở cấp độ dưới mức tế bào của tế bào

nguyên sinh chất cho thấy ZmNAC1 tồn tại ở trong nhân. Phân tích microarray đã chứng

minh được chức năng ZmNAC1 như là chất hoạt hóa phiên mã. Sự biểu hiện mạnh của

ZmNAC1 trong cây Arabidopsis dẫn đến sự nhạy cảm với ABA và stress thẩm thấu ở giai

đoạn nảy mầm, nhưng tăng cường khả năng chống chịu với sự mất nước khi so sánh với

hạt nảy mầm wild-type. Kết quả đó chứng minh được chức năng của ZmNAC1 như các

yếu tố phiên mã để đáp ứng với bất lợi phi sinh học và có thể áp dụng trong các kỹ thuật

tăng cường khả năng chống chịu với hạn hán trên đồng ruộng [32].

Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa. Ngô được trồng

trong những điều kiện sinh thái khác nhau trên nhiều vùng. Thời vụ trồng ngô chủ yếu

được căn cứ vào tác động của chế độ nhiệt, lượng mưa. Hầu như các diện tích trồng ngô

của nước ta là không chủ động được về tưới tiêu. Chọn tạo giống cây trồng nói chung và

giống ngô chịu hạn nói riêng là nội dung quan trọng nhất mà các nhà tạo giống ở Việt

Nam và trên toàn thế giới đang tập trung giải quyết. Các phương pháp chọn giống truyền

thống, phương pháp gây đột biến và các phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

(MAS), cũng như phương pháp biến nạp các gen chức năng đã được ứng dụng trong chọn

tạo giống nhằm cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng và đã thu được một số thành

công nhất định. Xuất phát từ những vấn đề và yêu cầu cấp thiết này, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài “Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhằm đáp ứng khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán ở cây ngô”.

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu thực vật

Vật liệu thực vật sử dụng để tách chiết và phân lập gen: Giống ngô tẻ Cao Bằng

(NTCB) do viện Nghiên cứu Ngô cung cấp và được lưu giữ tại Phòng Thí nghiệm Trọng

điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp.

Vật liệu để biến nạp gen: Sử dụng 3 dòng ngô VH1, CM8, CH9.

2.1.2. DNA plasmid và chủng vi khuẩn

Vector nhân dòng pGEM–T Easy, vector biểu hiện pZY:CaMV35S, chủng vi

khuẩn E. coli DH5α, chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101 được cung cấp

bởi Trung tâm Quốc gia về Công nghệ sinh học Đậu tương, Đại học Missouri, Columbia,

Missouri, Hoa Kỳ.

2.1.3. Hóa chất

Các loại hóa chất thông dụng: Thang DNA 1kb plus (Fermentas), thang DNA 1kb

(Fermentas), Plasmid DNA extraction kit, PCR extraction kit, Gel purification kit

(Invitrogen), ampicillin, spectinomycin, streptomycin, agarose, của hãng Merck, Sigma.

Các hóa chất dùng cho tách chiết DNA và RNA tổng số: Nitơ lỏng, CTAB, EDTA,

DEPC, NaCl, isopropanol, β-mecaptoethanol, Ethanol, Trizol Reagent, Chloroform,

isoamylalcohol, DNase, RNase…

Các hóa chất dùng cho tách dòng gen: Enzyme giới hạn AscI, BamHI, môi trường

LB, kháng sinh chọn lọc, T4 DNA ligase…

Dung dịch điện di DNA và RNA: Dung dịch đệm TAE, agarose 1%, ethidium

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bromide (EtBr).

Một số hóa chất cho nuôi cấy mô đều thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công

nghệ Tế Bào Thực vât, Viện Di truyền Nông nghiệp mua từ các hãng nổi tiếng như

Invitrogen, Merk, Amers ham Parmacia Biotech, Fermentas, New England Biolabs.

2.1.4. Các thiết bị máy móc

Quá trình thực hiện đề tài sử dụng Pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh

(amersham Pharmacia Biotech, máy ly tâm (Ependorf), máy đo pH (Mettler), bộ điện di

(Bio-Rad), máy ly tâm hút chân không (Savant), máy PCR (MJ Research), bể ổn nhiệt,

nồi khử trùng, máy đo OD, máy vortex, … của Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ

Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp.

2.1.5. Địa điểm nghiên cứu

Luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào

Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp, Việt Nam.

2.2. Phƣơng pháp

2.2.1. Phương pháp tìm kiếm dữ liệu và thiết kế mồi đặc hiệu cho gen ZmNF-YB2 và

Để tiến hành tách chiết và phân lập gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của giống

NTCB, chúng tôi đã truy cập cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen genebank NCBI có mã số

(gb|DQ333304.1|) và |EU224278.1|. Dựa vào trình tự trên ngân hàng gen chúng tôi đã tiến

hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của

giống NTCB sử dụng phần mền thiết kế Primer 3 cho kỹ thuật RT-PCR (bảng 2.1).

ZmNAC1

Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi

Trình tự mồi

Tm (oC)

ZmNfyb2Asc-F

5’-ACAAAAGGCGCGCCATGGCGGAAGCTCCGGCGAG-3’

74,1

ZmNfyb2Asc-R

5’-ACAAAAGGCGCGCCTTAGTTTGAGATATCCCCGTTATG-3’

65,5

ZmNAC1BamHI-F

5’- ACAAAGGATCCATGAGCGGCGCCGGTCCGGA-3’

71,4

ZmNAC1BamHI-R

5’-ACAAAAGGATCCTAGAACGGCTTGCCCCAGTACATG-3’

66,9

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’

45,6

35S-F

5’-CTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’

58,4

Bar-F

5’-TTGAGCAGATCTCGGTGACG-3’

60,9

Bar-R

5’-CCACTGACGTAAGGGATGAC-3’

56,4

2.2.2. Phương pháp tổng hợp cDNA

2.2.2.1. Chuẩn bị vật liệu cho tổng hợp cDNA

Hạt ngô sau khi khử trùng được nảy mầm trên giấy thấm 7 – 8 ngày ở 26oC trong

điều kiện 16 giờ sáng và 8 giờ tối. Sau khi nảy mầm 7 – 8 ngày các cây ngô được xử lý với sorbitol nồng độ 0.2M ở 26oC với các thời gian khác nhau. Mẫu được thu ở các thời

điểm khác nhau: 0 giờ, 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ, và 24 giờ sau khi xử lý với sorbitol, sau đó

cho ngay mẫu vào nitơ lỏng. Tiếp theo sẽ tiến hành tách chiết RNA tổng số với hóa chất

Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Tiếp đó tiến hành xử lý RNA tổng số với DNase

để loại bỏ DNA và được sử dụng làm vật liệu để tổng hợp cDNA sợi đơn.

2.2.2.2. Quy trình tách chiết RNA tổng số từ mẫu ngô

Sau khi thu mẫu ngô, tiến hành tách chiết RNA tổng số theo quy trình sau:

- Nghiền 100 mg mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chầy sứ cho đến khi thành bột mịn.

Chuyển nhanh mẫu sang ống eppendorf 2ml.

- Bổ sung ngay 1ml hóa chất Trizol và vortex trong 1 phút.

- Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.

- Bổ sung 0.2 ml Chloroform và vortex khoảng 1 phút.

- Ủ 2-3 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm 13000 rpm ở 4oC, 15 phút.

- Chuyển dịch pha trên sang ống eppendorf mới (RNase-free).

- Bổ sung isopropanol (RNase-free) tỷ lệ 1:1 với mẫu và đảo đều sau đó đặt trong tủ

-20oC, 2 giờ.

- Li tâm 13000 rpm ở 4oC, 15 phút.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

- Loại bỏ dịch và rửa cặn RNA với ethanol 75% (RNase-free).

- Li tâm 13000 rpm ở 4oC, 15 phút.

- Làm khô RNA ở nhiệt độ phòng. - Hòa tan RNA trong nước (RNase-free) và giữ ở tủ -20oC.

2.2.2.3. Phương pháp khử DNA

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng

STT Thành phần Thể tích (µl)

3 10X Buffer 1

1,5 DNase 2

3 RNA tổng số 3

22,5 4 H2O (RNase-free)

30 Tổng 5

Quy trình:

- Ủ hỗn hợp trên ở 37oC trong 30 phút.

- Bổ sung 6 µl hóa chất Inactivation.

- Để nhiệt độ phòng 2 phút, lắc nhẹ nhàng. - Ly tâm 13000 ở 4oC khoảng 1,5 phút.

- Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới.

- Kiểm tra độ tinh sạch và chất lượng DNA bằng điện di và đo nồng độ DNA bằng

máy nanodrop. - Lưu giữ ở tủ -80oC.

2.2.2.4. Phương pháp tổng hợp cDNA sợi đơn

RNA tổng số được sử dụng để nhân gen bằng phương pháp tổng hợp cDNA của

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hãng Invitrogen theo quy trình sau:

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng

STT Thành phần Thể tích (µl)

RNA tổng số 4 1

1 2 Primer* 50µM oligo (dT)20

dNTP mix (10 mM) 1 3

DEPC-treated water 4 4

Tổng 10 5

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (bảng 2.3). - Ủ ở 65oC trong 5 phút, sau đó đặt ngay lên đá ít nhất 1 phút.

- Chuẩn bị phản ứng tổng hợp cDNA theo thành phần bảng 2.4.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA

STT Thành phần Thể tích (10 µl)

Buffer (10X) 2 1

4 2 MgCl2 (25mM)

2 3 DTT (0,1 M)

1 4 RNaseOUTTM (40 U/µl)

1 5 SuperScriptTM III RT (200U/µl)

- Bổ sung 10µl thành phần phản ứng tổng hợp cDNA (bảng 2.4) vào ống thành phần

(bảng 2.3) mix và ly tâm nhẹ nhàng. Ủ ở 50oC trong 50 phút.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

- Dừng phản ứng ở 85oC trong 5 phút sau đó giữ lạnh trên đá.

- Ly tâm nhẹ nhàng. Bổ sung 1 µl RNaseH hỗn hợp và ủ ở 37oC trong 20 phút. - Phản ứng tổng hợp cDNA có thể được lưu giữ ở tủ -20oC hoặc sử dụng cho phản

ứng PCR ngay lập tức.

2.2.3. Tách dòng gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của giống NTCB

2.2.3.1. Phương pháp khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 và gen ZmNAC1 từ cDNA

Gen ZmNF-YB2 được khuếch đại từ cDNA của giống NTCB bằng kỹ thuật PCR

với cặp mồi đặc hiệu: ZmNfyb2Asc-F/ZmNfyb2Asc-R. Vùng mã hóa cho gen ZmNAC1

được khuếch đại với cặp mồi ZmNAC1BamHI-F/ZmNAC1BamHI-R (bảng 2.1) theo quy

trình sau:

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA

STT Thành phần Thể tích (50 µl)

1 Buffer (10X) 5

2 5 MgCl2 (25 mM)

3 dNTP (10 mM) 5

4 Primer F (10 pmol/µl) 5

5 Primer R (10 pmol/µl) 5

6 Phusion Taq DNA polymerase (5U/µl) 1

7 cDNA (100 ng) 1

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

8 22 H2O

Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Chu trình nhiệt PCR gen ZmNF-YB2 Chu trình nhiệt PCR gen ZmNAC1

2 phút 2 phút Biến tính 95oC Biến tính 98oC

30 giây 30 giây Biến tính 95oC Biến tính 95oC

30 giây 30 giây 40 chu kỳ 40 chu kỳ Gắn mồi 59oC Gắn mồi 57oC

45 giây 45 giây Kéo dài 72oC Kéo dài 72oC

10 phút 10 phút Kéo dài 72oC Kéo dài 72oC

∞ ∞ Giữ 10oC Giữ 10oC

2.2.3.2. Phương pháp tách dòng gen

Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit GenCatchTM Advanced Gel extraction

- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm.

- Bổ sung đệm hòa tan GEX theo tỷ lệ: V mẫu:V GEX = 1:3 (1 µl tương ứng với 1

mg mẫu).

- Ủ ở 55oC, 15 phút trộn nhẹ một lần, đến khi gel tan hết.

- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel GenCatchTM Advanced Gel Extraction

Column, ly tâm 13000 rpm 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.

- Rửa cột một lần với 0,5 ml buffer WN bằng ly tâm 30 giây 13000 rpm.

- Rửa cột một lần với 0,5 ml buffer WS bằng ly tâm 60 giây 13000 rpm.

- Ly tâm 13000 rpm 3 phút để loại bỏ toàn bộ ethanol.

- Chuyển cột sang ống tube 1.5 ml mới. Bổ sung 30 ul buffer EB vào giữa cột.

- Để cột 2 phút và ly tâm 13000 rpm 60 giây để hòa thu DNA. Lưu giữ DNA ở tủ -

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

20oC.

Gắn đầu 3’A Overhang vào sản phẩm PCR

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng gắn 3’A Overhang

Thể tích (50µl) Thành phần STT

24 Sản phẩm PCR (1 µg) 1

1 dATP (10 mM) 2

5 PCR Buffer with Mg (10X) 3

0.2 Taq DNA polymerase (5 U/ µl) 4

19.8 H2O 5

Ủ ở 72oC 20 phút.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Gắn đoạn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy

Hình 2.1. Vector plasmid pGEM-T Easy mở vòng

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector tách dòng

Thành phần phản ứng Thể tích (10 µl) STT

5 Buffer rapid ligation (2X) 1

1 pGEM-T easy vector 2

3 Sản phẩn PCR gắn 3’A Overhang 3

1 T4 DNA ligase 4

Đủ 10 µl H2O 5

Ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ.

Sau đó biến nạp vào chủng tế bào khả biến E.coli DH5α theo quy trình sau:

- Bổ sung 10 µl vector đã gắn gen vào 100 µl ống tế bào khả biến, mix nhẹ, đặt trên

đá 30 phút.

- Ủ ở 42oC 1 phút 30 giây

- Để ở nhiệt độ phòng 10 phút - Bổ sung 1ml LB lỏng nuôi lắc 2 giờ ở 37oC.

- Ly tâm 8000 rpm 2 phút, loại bỏ dịch, giữ 100 µl dịch hòa tan cặn khuẩn.

- Cấy trải lên môi trường có chứa kháng ampicillin. - Ủ đĩa petri ở 37oC qua đêm trong vòng 16 giờ.

Phương pháp PCR kiểm tra khuẩn lạc

Khuẩn lạc sau khi mọc trên môi trường LB có chứa kháng sinh ampicillin sẽ được

kiểm tra bằng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc sử dung cặp mồi ZmNfyb2Asc-F/ZmNfyb2Asc-

R cho gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1BamHI-F/ZmNAC1BamHI-R cho gen ZmNAC1(bảng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.1).

Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR từ khuẩn lạc

Thành phần Thể tích (20 µl) STT

Buffer (10X) 2 1

2 MgCl2 (25 mM) 2

dNTP (10 mM) 2 2

Primer F (10 pmol/µl) 2 3

Primer R (10 pmol/µl) 2 4

Taq DNA polymerase (5 U/µl) 0.25 5

Khuẩn lạc - 6

9.75 H2O 7

Tổng 20 8

- Sử dụng chu trình nhiệt giống như bảng 2.6.

- Sản phẩm PCR sau đó được điện di kiểm tra.

- Sản phẩm điện di của các khuẩn lạc cho kết quả dương tính sẽ được sử dụng để

nuôi tăng sinh khối tách DNA plasmid phục vụ cho giải trình tự.

Quy trình tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp sử dụngkit GencatchTM plasmid DNA

minprep

- Lấy 1 khuẩn lạc nuôi lắc (150 vòng/phút) trong 5 ml LB lỏng có bổ sung kháng

sinh ampicillin ở 37oC qua đêm.

- Ly tâm 8000 rpm 5 phút, loại bỏ dịch khuẩn thu cặn.

- Hòa tan cặn khuẩn trong 200 µl buffer MX1 bằng vortex.

- Bổ sung 250 µl buffer MX2 và đảo nhẹ nhàng. Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

- Bổ sung 350 µl buffer MX3 đảo nhẹ nhàng.

- Ly tâm 13000 rpm 5 phút. - Chuyển dịch sang cột GenCatchTM plus Column.

- Ly tâm 13000 rpm 60 giây. Loại bỏ dịch qua cột.

- Rửa cột với 500 µl buffer WN bằng ly tâm 13000 rpm 1 phút.

- Rửa cột với 700 µl buffer WS bằng ly tâm 13000 rpm 1 phút.

- Ly tâm 13000 rpm 2 phút loại bỏ toàn bộ ethanol.

- Chuyển cột sang ống 1.5 ml mới. Bổ sung 50 µl buffer EB vào giữa màng.

- Để 2 phút ở nhiệt độ phòng và ly tâm 13000 rpm 60 giây để thu DNA plasmid. - Lưu giữ ở tủ -20oC và sử dụng cho giải trình tự gen.

2.2.4. Thiết kế vector siêu biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1

Sau khi giải trình tự và biết được trình tự chính xác của gen ZmNF-YB2 và

ZmNAC1 trong vector tách dòng pGEM-T Easy tiến hành bước sau:

- Khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu

ZmNfyb2Asc-F/ZmNfyb2Asc-R và gen ZmNAC1 bằng cặp mồi đặc hiệu

ZmNAC1BamHI-F/ZmNAC1BamHI-R từ vector pGEM-T Easy có chứa đoạn gen (bảng

2.1). Thành phần phản ứng và chu trình gia nhiệt giống PCR từ cDNA trình bày trong

mục 2.2.3.

- Sản phẩm PCR được điện di trên gel Agrarose 1% và tinh sạch bằng kit Gel

Purification (trình bày trong mục 2.2.3).

- Cắt sản phẩm PCR của đoạn gen ZmNF-YB2 bằng enzyme giới hạn AscI và

ZmNAC1 bằng enzyme giới hạn BamHI.

Bảng 2.10. Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn

Thành phần Thể tích (µl) STT

1 Buffer fastdigest (10X) 10

2 Sản phẩm PCR (1 µg) 10

3 Enzyme AscI fastdigest (10 U/µl) 2

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

4 Hoặc Enzyme BamHI fastdigest (10 U/µl) 2

5 78 H2O

6 Tổng 100

Phản ứng ủ 37oC 30 phút.

Chạy điện di kiểm tra sản phẩm cắt. Tinh sạch sản phẩm cắt bằng kit GenCatchTM

Advanced Gel extraction trình bày ở mục 2.2.3.

- Cắt vector pZY:CaMV35S (hình 2.2) với enzyme giới hạn AscI đối với đoạn gen

ZmNF-YB2 và BamHI đối với đoạn gen ZmNAC1.

Hình 2.2. Bản đồ cấu trúc vector biểu hiện pZY:CaMV35S

Bảng 2.11. Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid

Thể tích (µl) Thành phần STT

10 Buffer fastdigest (10 X) 1

15 DNA plasmid (pZY:CaMV35S) (5 µg) 2

2 Enzyme AscI fastdigest (10 U/µl) 3

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2 Hoặc Enzyme BamHI fastdigest (10 U/µl) 4

69 H2O 5

100 Tổng 6

Phản ứng ủ ở 37oC 15 phút.

Chạy điện di kiểm tra sản phẩm cắt. Tinh sạch sản phẩm cắt bằng kit GenCatchTM

Advanced Gel extraction trình bày ở mục 2.2.3.

- Xử lý vector pZY:CaMV35S với Alkaline Phosphatase để loại gốc phosphate ở

đầu 5’.

Bảng 2.12. Thành phần phản ứng loại nhóm 5’ phosphatase

STT Thành phần Thể tích (10µl)

NE Buffer (10X) 1 1

DNA plasmid (0.5µg) 1 2

CIP (10U/µl) 0.5U 3

Đủ 10 µl 4 H2O

Ủ ở 37oC 60 phút.

Sau đó tinh sạch DNA bằng kit GenCatchTM Advanced Gel extraction trình bày ở

mục 2.2.3.

- Tiến hành phản ứng nối vector pZY:CaMV35S với sản phẩm PCR đã tinh sạch của

đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1.

Bảng 2.13. Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector

STT Thành phần Thể tích (µl)

Vector pZY:CaMV35S 2 1

Đoạn gen NF-YB2/NAC1 6 2

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Buffer (10X) 2 3

4 T4 ligase 1

5 9 H2O

6 Tổng 20

Hỗn hợp phản ứng ủ ở nhiệt độ phòng 3 giờ.

- Sử dụng sản phẩm gắn nối để biến nạp vào chủng vi khuẩn E.coli DH5α.

- Chọn lọc dòng bằng phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc sử dụng 2 cặp mồi: 35S-

F/ZmNfyb2Asc-R để kiểm tra gen ZmNF-YB2, 35S-F/ZmNAC1BamHI-R để kiểm tra

gen ZmNAC1 (bảng 2.1). Thành phần phản ứng và chu trình gia nhiệt PCR giống như

chu trình PCR từ khuẩn lạc trình bày trong mục 2.2.3. Tiến hành điện di để kiểm tra sản

phẩm PCR.

- Tách chiết DNA plasmid theo bộ kit GenCatchTM PCR Purification trình bày trong

mục 2.2.3.2.

- Giải trình tự gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 có trong vector biểu hiện

pZY:CaMV35S.

- Cắt plasmid bằng 2 enzyme giới hạn AscI để kiểm tra kết quả nối vector và đoạn

gen ZmNF-YB2 và BamHI để kiểm tra kết quả nối vector và đoạn gen ZmNAC1.

Bảng 2.14. Thành phần phản ứng cắt plasmid pZY:CaMV35S

Thể tích (µl) Thành phần STT

2 µl Buffer fastdigest (10 X) 1

3 µl Plasmid DNA (1 µg) 2

0.5 µl Enzyme AscI fastdigest (10 U/µl) 3

0.5 µl Hoặc Enzyme BamHI fastdigest (10 U/µl) 4

14 µl H2O 5

20 µl Tổng 6

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Điện di kiểm tra sản phẩm cắt.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.5. Khảo sát khả năng tiếp nhận gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 của một số dòng ngô

Việt Nam

Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn

- Cấy trải Agrobacterium cất giữ trong glycerol (-800C) trên đĩa môi trường YEB

(phụ lục 1) đặc có bổ sung kháng thích hợp, nuôi ở 28oC trong 3 ngày.

- Bổ sung 5 ml môi trường lây nhiễm vô trùng IM-AS vào ống Falcon. Lấy hai vòng

khuẩn (kích thước vòng 5mm) từ đĩa YEB bổ sung vào trong ống, để 2 phút sau đó lắc

ống trộn đều khuẩn vào môi trường, điều chỉnh mật độ vi khuẩn tới OD550 = 0,35 (0,5 X

109 cfu/ml).

- Lắc ống dịch khuẩn bằng máy lắc ở 100 rpm trong 4-5 giờ.

Lây nhiễm vi khuẩn với phôi và nuôi cộng sinh

- Phôi non có kích thước 1-1,5mm được lựa chọn để tiến hành lây nhiễm

- Tách phôi trong môi trường lỏng IM (phụ lục 2) bổ xung AS nồng độ 200 μM.

- Phôi non sau khi tách được tiến hành lây nhiễm ngay với vi khuẩn. - Loại bỏ môi trường IM, thêm 5 ml dịch huyền phù vi khuẩn, lắc nhẹ ở 250C, thời

gian 1 giờ.

- Hút bỏ dịch vi khuẩn, chuyển phôi đã được lây nhiễm sang môi trường nuôi cộng

sinh CCM bổ xung AS nồng độ 200 μM, nuôi tối ở 20oC trong 3 ngày.

Nuôi phục hồi

- Chuyển phôi đã biến nạp từ môi trường CCM (phụ lục 2) sang môi trường ReM,

nuôi trong tối ở 28oC, thời gian 7 ngày.

Chọn lọc mô sẹo chuyển gen

- Cấy chuyển mô sẹo sang môi trường ECM (phụ lục 2) có bổ sung kháng sinh chọn

lọc thực vật glufosinate (2 mg/lít), nuôi trong tối ở 28oC, thời gian 15-20 ngày.

Tạo chồi chuyển gen

- Cấy chuyển mô sẹo phôi hoá sang môi trường SeM (phụ lục 2) có bổ sung kháng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sinh chọn lọc thực vật glufosinate (2 mg/lít), nuôi sáng ở 25oC, thời gian 15-20 ngày.

Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh

- Cấy chuyển chồi tái sinh sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh RM (phụ lục 2), nuôi

sáng ở 25oC, 10-20 ngày sau đó chuyển cây ra bầu đất.

Phân tích cây chuyển gen

- Khi cây chuyển gen tái sinh trồng trên đất xuất hiện khoảng 2-3 lá mới, tiến hành

thu mẫu lá để thực hiện các phân tích PCR với cặp mồi gen đích và gen chỉ thị chọn lọc

(bảng 2.1).

2.2.6. Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá Các thông số sau được quan tâm để đánh giá hiệu quả của quá trình nuôi cấy và biến nạp gen:

- Tỷ lệ tạo mô sẹo chuyển gen (%) = Số mô sẹo chuyển gen tạo thành*100%/Tổng số

phôi biến nạp

- Tỷ lệ tái sinh cây chuyển gen (%) = Số cây chuyển gen tái sinh*100%/Tổng số mô

sẹo chuyển gen phôi hóa.

- Hiệu quả biến nạp (%) = Số cây hữu thụ mang gen chuyển *100%/Tổng số phôi biến

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nạp.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số từ giống NTCB

Từ các mẫu ngô thu được sau khi xử lý hạn, chúng tôi đã tách chiết được RNA

tổng số tinh sạch có chất lượng tốt phục vụ tổng hợp cDNA chịu hạn của ngô. Kết quả

tinh sạch các mẫu RNA được trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số của giống NTCB

Thân

Rễ

Lá

12h 24h

A260/A280 2,02 2,03 2,02 2,05 2,04 2,02 2,04 2,07 2,04 2,10 2,04 2,02 2,08 2,04 2,05

A260/A230 1,97 1,98 1,96 1,98 1,98 1,98 1,97 1,98 1,96 1,97 1,98 1,96 1,95 1,97 1,93

Nồng độ

0,16 0,17 0,18 0,15 0,16 0,20 0,17 0,21 0,17 0,16 0,15 0,16 0,13 0,17 0,19

(µg/µl)

Qua bảng 3.1, Các mẫu khi đo nanodrop đều có chỉ số A260/A280 và A260/A230

trong khoảng giới hạn từ 1,8 đến 2.2 với nồng độ RNA cao trên 100 ng/µl về lý thuyết có

nghĩa là RNA tổng số đủ điều kiện để sử dụng làm vật liệu cho công việc tách dòng gen.

Tuy nhiên, phân tích quang phổ bằng máy đo nanodrop chỉ cho phép đánh giá độ

tinh sạch của mẫu mà không cho biết độ nguyên vẹn của mẫu do bước sóng hấp thụ 260

nm của RNA không phụ thuộc vào chiều dài các phân tử này. Phương pháp điện di cho

phép phân tích độ nguyên vẹn (độ phân hủy) của mẫu RNA dựa vào kích thước của các

sản phẩm RNA quan sát được. Trong mẫu RNA tổng số, RNA vận chuyển và RNA

ribosome thường chiếm lượng lớn trên 95%, do đó khi điện di khó có thể quan sát được kích

thước của RNA thông tin. Tuy nhiên, chất lượng của RNA thông tin có thể đánh giá gián tiếp

thông qua kích thước của RNA ribosome. Với các mẫu nguyên vẹn, không bị phân hủy, sản

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

phẩm điện di sẽ hiện lên các băng rõ nét trong khi các mẫu bị phân hủy sẽ cho các vệt mờ do

RNA ribosome bị phân hủy thành sản phẩm có kích thước khác nhau. Kết quả điện di RNA

tổng số được tách chiết từ giống NTCB được trình bày trong hình 3.1.

Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số

Kết quả điện di cũng cho thấy các mẫu RNA có chất lượng cao, không bị phân

hủy. Trong tất cả các mẫu đều có 2 vạch RNA ribosome rõ nét. Không có vết mờ chứng

tỏ mẫu RNA không bị đứt gãy hay phân hủy, phù hợp cho việc tổng hợp cDNA sợi đơn.

Từ các mẫu RNA tổng số này, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp và thu được cDNA

của giống NTCB như mô tả trong phần phương pháp để sử dụng cho quá trình tách dòng

gen.

3.2. Kết quả phân lập gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của giống NTCB

RNA tổng số được tách chiết từ các mẫu thu lúc: 0 giờ, 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ

sau khi xử lý sorbitol 0,2M tương ứng là: RNA-0h, RNA-1h, RNA-6h, RNA-12h và

RNA-24h. Mẫu RNA xử lý hạn với sorbitol lúc 1 giờ sau khi tổng hợp cDNA được chúng

tôi sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen ZmN-YB2. Các mẫu RNA xử lý ở các

thời gian khác nhau ở trên được sử dụng làm vật liệu cho phản ứng RT-PCR để tạo các

cDNA tương ứng là: cDNA-0h, cDNA-1h, cDNA-6h, cDNA-12h và cDNA-24h được

chúng tôi sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen ZmNAC1.

Dựa vào trình tự nucleotide của gen ZmNF-YB2 được công bố trên ngân hàng gen

có mã số (gb|DQ333304.1|), chúng tôi đã tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu

ZmNfyb2Asc-F/ZmNfyb2Asc-R (bảng 2.1) để khuếch đại trình tự nucleotide chứa phần

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

mã hóa gen ZmNF-YB2. Trình tự mồi ZmNfyb2Asc-F có chứa trình tự nhận biết của

enzyme giới hạn AscI và 20 nucleotide ở vùng mã hóa gen đầu 5’ từ bộ ba khởi đầu dịch

mã (ATG). Mồi ZmNfyb2Asc-R chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn AscI và 24

nucleotide ở vùng mã hóa gen đầu 3’ bắt đầu từ bộ ba kết thúc dịch mã (TTA). Để tiến

hành phân lập đoạn gen ZmNAC1 từ giống ngô tẻ cao bằng NTCB, chúng tôi sử dụng cặp

mồi đặc hiệu ZmNAC1BamHI-F/ZmNAC1BamHI-R (bảng 2.1) nhằm khuếch đại phần

mã hóa gen ZmNAC1 bằng phản ứng PCR. Mồi ZmNAC1BamHI-F có trình tự nhận biết

của enzyme giới hạn BamHI và 20 nucleotide ở vùng mã hóa đầu 5’ từ bộ ba khởi đầu

(ATG). Mồi ZmNAC1BamHI-R có trình tự BamHI và 24 nucleotide mã hóa ở đầu 3’ từ

bộ ba kết thúc (TAG). Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 sử

dụng 1µl cDNA chịu hạn của giống NTCB làm sợi khuôn, 2 mM dNTPs, 5 Unit Phusion

Taq DNA polymerase trong thể tích phản ứng 50µl, chu trình gia nhiệt đã được trình bày

trong phần phương pháp.

Sản phẩm của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 được tiến hành điện

di kiểm tra và thu được kết quả là một băng DNA đặc hiệu kích thước khoảng 565 bp,

đúng với kích thước lý thuyết dự tính (hình 3.2).

Hình 3.2. Kết quả khuếch đại gen ZmNF-YB2 từ cDNA

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chú thích: M. ladder 1kb plus; 1-2. cDNA-1h

Qua hình 3.2, chúng tôi thấy cả 2 sản phẩm PCR khuếch đại từ cDN-1h có kích

thước đúng với dự kiến của ZmNF-YB2. Chúng tôi sử dụng để chuyển vào vector tách

dòng pGEM – T easy.

Kết quả khuếch đại đoạn gen mã hóa gen ZmNAC1 từ các cDNA khác nhau sau đó

được điện di kiểm tra và chúng tôi thu được kết quả như hình 3.3.a.

Hình 3.3.a. Kết quả PCR gen ZmNAC1 từ các cDNA; b. Kết quả PCR đoạn gen ZmNAC1 dự kiến sau khi xử lý với sorbitol 12 giờ Ghi chú: M. Ladder 1kb plus; (-). H2O; 0h: cDNA-0 giờ; 1h: cDNA-1 giờ; 6h: cDNA-6 giờ;12h: cDNA-12 giờ; 24h: cDNA-24 giờ; cDNA-rễ; cDNA-lá; cDNA-thân

Qua hình 3.3.a, không thấy có sản phẩm khuếch đại khi sử dụng khuôn mẫu

cDNA-0h và cDNA-1h. Với khuôn mẫu cDNA-6h, cDNA-12h và cDNA-24h chúng tôi

nhận được sản phẩm khuếch đại khoảng 906 bp, đúng như kích thước dự kiến của gen

ZmNAC1, tuy nhiên trong 3 sản phẩm PCR đó thì chỉ có sản phẩm của khuôn mẫu cDNA-

12h cho thấy khả năng khuếch đại cao hơn cả.

Dựa vào kết quả khuếch đại gen ZmNAC1 từ cDNA của các mẫu xử lý với sorbitol

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ở các thời gian khác nhau. Chúng tôi đã tiếp tục làm thí nghiệm đánh giá sự biểu hiện của

gen ZmNAC1 thông qua việc khuếch đại gen ZmNAC1 từ các mẫu cDNA được tổng hợp

trên cơ sở RNA tách chiết ở các phần khác nhau như rễ, đoạn thân và lá đã xử lý sorbitol

12 giờ bằng phản ứng PCR.

Kết quả PCR thu được sau khi khuếch đại gen ZmNAC1 với cặp mồi đặc hiệu

ZmNAC1BamHI-F/ZmNAC1BamHI-R, chúng tôi thấy trong số 3 mẫu PCR, cho thấy

mức độ biểu hiện ở các mẫu cDNA được tổng hợp từ các phần khác nhau là khác nhau.

Trong các mẫu sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR thì chỉ có mẫu cDNA được tổng

hợp từ RNA tách chiết ở rễ và lá cho kết quả dương tính với cặp ZmNAC1BamHI-

F/ZmNAC1BamHI-R có băng DNA khuếch đại trùng với kích thước dự kiến của gen

ZmNAC1 khoảng 906 bp ( Mẫu 1 và 2, hình 3.3.b).

Theo nghiên cứu của Yu-Jun Hao và cs (2011), cũng chỉ ra rằng gen mã hóa nhân

tố phiên mã NAC cũng hoạt động mạnh ở các bộ phận khác nhau của cây khi bị các yếu

tố bất lợi tác động [18]. Trong nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy gen ZmNAC1 biểu

hiện ở rễ và lá còn thân không cho biểu hiện. Chính vì thế, trong thí nghiệm của chúng

tôi, băng DNA từ mẫu rễ và lá (hình 3.3.b) có khả năng đúng là gen ZmNAC1 đã được

tách chiết, do đó chúng tôi đã lựa chọn đoạn gen được khuếch đại từ cDNA ở rễ để tinh

sạch và đưa vào vector tách dòng pGEM-T Easy.

Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 dự kiến từ cDNA-1h và đoạn gen

ZmNAC1 từ cDNA-12h ở rễ được tinh sạch và xử lý gắn đầu 3’A Overhang trước khi gắn

vào vector pGEM – T Easy đã mở vòng sẵn, chứa gen kháng kháng sinh Ampicillin, và

gen chỉ thị X-gal (hình 2.1). Sau khi phản ứng đóng vòng, plasmid mang trình tự đoạn

gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 được biến nạp vào chủng tế bào khả biến E.coli DH5α và được nuôi cấy trên môi trường có chứa kháng sinh Ampicillin ở 37oC qua đêm 16 giờ.

Các khuẩn lạc E.coli DH5α mọc trên môi trường có chứa kháng sinh Ampicillin được

kiểm tra bằng phản ứng PCR trực tiếp với khuẩn lạc sử dụng cặp mồi đặc hiệu

ZmNfyb2Asc-F/ZmNfyb2Asc-R cho đoạn gen ZmNF-YB2 và cặp mồi đặc hiệu

ZmNAC1BamHI-F/ZmNAC1BamHI-R cho đoạn gen ZmNAC1 (bảng 2.1). Kết quả PCR

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

được điện di kiểm tra (hình 3.4 a và b).

Hình 3.4.a. Kết quả điện điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ khuẩn lạc mang gen ZmNF- YB2; b. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR khuẩn lạc mang gen ZmNAC1 Ghi chú: M. Ladder 1kb; (-). H2O; 1-5: khuẩn lạc

Kết quả hình 3.4.a, cho thấy 5 khuẩn lạc kiểm tra đều cho kết quả dương tính với

cặp mồi đặc hiệu của gen ZmNF-YB2 và đúng với kích thước dự kiến ban đầu khuếch đại

từ cDNA khoảng 565 bp. Qua hình 3.4.b, các khuẩn lạc cho kết quả dương tính với cặp

mồi đặc hiệu gen ZmNAC1 có kích thước đúng với kết quả dự kiến khoảng 906 bp.

Từ kết quả PCR kiểm tra các khuẩn lạc chứa đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 của

giống NTCB trong vector tách dòng pGEM – T Easy chúng tôi tiến hành tách chiết và

tinh sạch DNA plasmid từ các khuẩn lạc dương tính và gửi đi giải trình tự. Để đọc trình tự

đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1, chúng tôi đã sử dụng mồi T7 (bảng 2.1) để tiến hành

giải trình tự.

Kết quả đã xác định được kích thước trình tự DNA của gen ZmNF-YB2 tách chiết

từ giống ngô tẻ Cao Bằng (NTCB) có chiều dài 537 nucleotide và mã hóa cho 178 amino

acid (được trình bày ở phụ lục 3).

Khi so sánh trình tự nucleotide của gen ZmNF-YB2 phân lập được với trình tự

nucleotide ban đầu chúng tôi sử dụng để thiết kế cặp mồi đặc hiệu bằng phần mềm

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

GeneStream align cũng như nucleotide blast trên NCBI, chúng tôi nhận thấy gen ZmNF-

YB2 phân lập được từ giống ngô địa phương “ngô tẻ Cao Bằng”của Việt Nam có tỷ lệ

tương đồng với gen ZmNF-YB2 được phân lập từ giống ngô B73 của Mosanto

(gb|DQ333304.1|) là 95%. Trình tự mã hóa amino acid của NF-YB2 thu được từ giống

NTCB ngắn hơn 21 nucleotide so với gen ZmNF-YB2 của gb|DQ333304.1|. Đoạn trình tự

này mã hóa cho 7 amino acid T I P A N G K (được trình bày ở phụ lục 4).

Như vậy, với trình tự nucleotide của gen ZmNF-YB2 được phân lập và tách chiết từ

giống NTCB có độ mức độ tương đồng 95% với gb|DQ333304.1| hoàn toàn có thể sử dụng để

thiết kế vector biểu hiện ở những bước tiếp theo.

Kết quả đọc trình tự của gen ZmNAC1 được phân lập từ giống NTCB, chúng tôi đã

xác định được kích thước trình tự DNA của gen ZmNAC1 có chiều dài 882 nucleotide và

mã hóa cho 293 amino acid (được trình bày ở phụ lục 5).

Khi tiến hành so sánh trình tự nucleotide và amino acid ZmNAC1 của giống NTCB

với trình tự gen ZmNAC1 có mã số |EU224278.1| trên ngân hàng Genebank chúng tôi

thấy tỷ lệ tương đồng là 100% (phụ lục 6).

Ngoài ra, khi tiến hành phân tích trình tự axit amin của ZmNAC1 với trình tự axit

amin của các nhân tố phiên mã OsNAC1 trên đối tượng Japonica (ABD52007.1) cho thấy

sự tương đồng là 83%. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về nhân tố phiên mã đã

chứng minh: có rất nhiều gen mã hóa nhân tố phiên mã trong mỗi hệ gen (8-10%); các

gen này có sự tương đồng cao về trình tự nucleotide, axit amin trong cùng một họ và cùng

một nhân tố phiên mã ở các loài thực vật khác nhau; có sự tương đồng về chức năng của

chức năng của các gen mã hóa các nhân tố trong việc tăng cường tính chống chịu với điều

kiện hạn, lạnh, mặn và nhiệt độ cao [40]; [52]. Vì vậy, cùng một gen mã hóa nhân tố

phiên mã có thể sử dụng để tăng tính chịu hạn trên nhiều đối tượng thực vật và cho các

điều kiện ngoại cảnh bất lợi khác nhau như hạn, lạnh mặn…

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng chỉ ra rằng: ZmNAC1 mã hóa nhân tố phiên

mã ZmNAC1 đã được phân lập thành công từ giống NTCB hoạt động mạnh trong điều

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kiện có tác động của ngoại cảnh hạn hán. Ngoài ra gen ZmNAC1 hoạt động ở các bộ phận

khác nhau là khác nhau. Trong điều kiện xử lí hạn nhân tạo bằng sorbitol sau 12 giờ gen

ZmNAC1 hoạt động mạnh ở vùng rễ và lá của giống NTCB. Đây là cơ sở ban đầu hết sức

quan trọng trong quá trình nghiên cứu thiết kế vevtor siêu biểu hiện gen ZmNAC1 phục vụ

công tác chọn tạo các giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chống chịu với các điều

kiện bất lợi của môi trường.

3.3. Thiết kế vector siêu biểu hiện pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 và

pZY:CaMV5S::ZmNAC1

Từ kết quả tách dòng gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 chúng tôi tiếp tục tiến hành thiết

kế vector biểu hiện cho gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 dưới sự điều khiển của promoter

35S. Bước đầu trong việc thiết kế, chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu ZmNfyb2Asc-

F/ZmNfyb2Asc-R để khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1BamHI-

F/ZmNAC1BamHI-R cho gen ZmNAC1 (bảng 2.1) bằng phản ứng PCR. Phản ứng PCR

được tiến hành như mô tả ở phần phân lập gen từ cDNA, chỉ khác là thành phần phản ứng

sử dụng sợi khuôn là 50 ng DNA plasmid của vector pGEM – T Easy chứa đoạn gen

ZmNF-YB2 và ZmNAC1. Phần mã hóa gen ZmNF-YB2 sau đó được cắt với enzyme giới hạn

AscI và phần mã hóa gen ZmNAC1 được cắt với với enzyme giới hạn BamHI trước khi gắn

vào vector pZY:CaMV35S cũng được cắt tại vị trí enzyme giới hạn AscI hoặc BamHI và đã xử

lý Alkaline Phosphatase để loại gốc phosphate ở đầu 5’ để tạo thành vector biểu hiện

pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 và pZY:CaM35S::ZmNAC1 trong phản ứng tái tổ hợp sử dụng T4

DNA ligase. Sản phẩm tái tổ hợp của phản ứng được biến nạp vào chủng vi khuẩn E.coli

DH5α và nuôi cấy trên môi trường có chứa 2 loại kháng sinh spectinomycin và streptomycin. Nuôi qua đêm 16 tiếng ở 37oC.

Vector biểu hiện pZY:CaMV35S có chứa đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 được

thiết kế dựa trên bộ khung của vector pZY101 có gắn thêm promoter 35S, vùng MCS

(vùng đa tách dòng) và vùng kết thúc phiên mã (nos-Ter) (hình 2.2). Promoter 35S và

TEV enhancer trước vùng MSC cho phép điều hòa biểu hiện của gen lạ được chèn vào vị

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trí MCS ở thực vật. Với cấu trúc này, chúng tôi đã mô tả sự biểu hiện của gen ZmNF-YB2

và ZmNAC1 trong vector pZY:CaMV35S được điều khiển bởi promoter 35S (hình 3.5 và

3.6).

Hình 3.5. Cấu trúc vector siêu biểu hiện pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2

Hình 3.6. Cấu trúc vector siêu biểu hiện pZY:CaMV35S::ZmNAC1

Trong phản ứng gắn, nối đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 vào vector biểu hiện

pZY:CaMV35S, chúng tôi chỉ sử dụng một enzyme giới hạn AscI hoặc BamHI nên theo

lý thuyết hoàn toàn có thể xảy ra các trường hợp: i) vector sẽ tự đóng vòng; ii) vector sẽ

nối cùng chiều với đoạn gen quan tâm (tức là gen cùng chiều với promoter); iii) vector sẽ

nối ngược chiều với đoạn gen quan tâm (gen ngược chiều với promoter). Như vậy, với

mong muốn thiết kế được vector biểu hiện mang đoạn gen đúng chiều dịch mã. Chúng tôi

đã lựa chọn các phương án nhằm loại bỏ kết quả gắn, nối không đúng chiều giữa vector

và đoạn gen chèn vào. Với trường hợp (i) để khắc phục việc tự đóng vòng của vector, sau

khi cắt với enzyme giới hạn AscI/BamHI chúng tôi đã xử lý loại bỏ gốc phosphate ở đầu

5’ của vector pZY:CaMV35S bằng Alkaline Phosphatase. Còn với cả hai trường hợp (ii)

và (iii) vi khuẩn mang vector tái tổ hợp đều phát triển trên môi trường LB có chứa 2 loại

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kháng sinh spectinomycin và streptomycin. Để có thể loại bỏ trường hợp nối ngược chiều,

chúng tôi đã tiến hành PCR kiểm tra trực tiếp các khuẩn lạc sử dụng cặp mồi 35S-

F/ZmNF-YB2asc-R và 35S-F/ZmNAC1BamHI-R. Nếu đoạn gen được gắn đúng chiều thì

sản phẩm khuếch đại trong phản ứng PCR của gen ZmNF-YB2 cộng với kích thước tính

từ mồi 35S-F tương ứng khoảng 747 bp và gen ZmNAC1 khoảng 1081 bp. Ngược lại, nếu

gen gắn ngược chiều thì phản ứng PCR sẽ không cho sản phẩm khuếch đại. Kết quả được

trình bày trong hình 3.7.a và b.

Hình 3.7.a. Kết quả PCR gen ZmNF-YB2 sử dụng cặp mồi 35S-F/ZmNF-YB2Asc-R; b. Kết quả PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi 35S-F/ZmNAC1BamHI-R Chú thích: M: Ladder 1kb; (-): H2O; 1-3: khuẩn lạc

Qua hình 3.7.a, trong 3 khuẩn lạc lựa chọn để PCR kiểm tra chiều gắn của gen vào

vector biểu hiện pZY:CaMV35S thì 2 khuẩn lạc số 1 và 2 cho kết quả dương tính với cặp

mồi 35S-F/ZmNFYB2Asc-R (bảng 2.1) với kích thước khoảng 747 bp, đúng với dự tính

ban đầu. Như vậy, 2 khuẩn lạc 1 và 2 đã gắn đúng chiều với vector pZY:CaMV35S, còn

khuẩn lạc 3 có kết quả âm tính với cặp mồi đặc hiệu do đoạn gen ZmNF-YB2 đã gắn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ngược chiều với vector pZY:CaMV35S.

Kết quả điện di sản phẩm PCR hình 3.7.b cho thấy, trong số 3 khuẩn lạc lựa chọn

thì có 2 khuẩn lạc cho kết quả dương tính với cặp mồi 35S-F/ZmNAC1BamHI-R có băng

kích thước đúng khoảng 1081bp như kết quả dự kiến, đồng nghĩa với vector nối cùng

chiều với đoạn gen ZmNAC1, còn lại 1 khuẩn lạc không cho kết quả dương với cặp mồi

tức là vector đã nối ngược chiều với đoạn gen mã hóa gen ZmNAC1.

Từ kết quả này, chúng tôi đã sử dụng các khuẩn lạc cho kết quả dương tính để nuôi

cấy, tách DNA plasmid và giải trình tự trên hệ thống ABI3100 sử dụng mồi 35S-F để

kiểm tra lại kết quả sau khi thiết kế vector biểu hiện và trong vector tách dòng. Kết quả

cho thấy trình tự của gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 trong vector tách dòng PGEM-T trùng

lặp với trình tự gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 trong vector biểu hiện pZY:CaMV35S.

Ngoài ra, chúng tôi đã sử dụng DNA plasmid của các khuẩn lạc có kết quả dương

tính với cặp mồi đặc hiệu của gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 để kiểm tra việc chèn đoạn gen

vào cấu trúc vector biểu hiện pZY:CaMV35S bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn

AscI và BamHI (hình 3.8.a và b).

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.8.a. Kết quả cắt vector pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 bằng enzyme giới hạn AscI; b. Kết quả cắt vector pZY:CaMV35S::ZmNAC1 bằng enzyme giới hạn BamHI Chú thích: M. Ladder 1kb; 1-2: sản phẩm cắt

Kết quả cắt bằng enzyme giới hạn AscI hình 3.8.a, cho thấy sản phẩm chèn vào

vector có kích thước khoảng 551 bp đúng là đoạn gen ZmNF-YB2 được tách dòng từ

giống NTCB. Qua hình 3.8.b, chúng tôi thấy sản phẩm cắt từ vector pZY:CaMV35S có

kích thước khoảng 894 bp đúng với kích thước đoạn gen ZmNAC1 được tách dòng từ

giống NTCB.

Với kết quả này, chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện pZY:CaMV35S

có chứa đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 (ký hiệu pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 và

pZY:CaMV35S::ZmNAC1) để sử dụng cho mục đích chuyển gen vào thực vật, nhằm tăng

cường khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán của cây trồng.

3.4. Kết quả đánh giá khả năng tiếp nhận gen của một số dòng ngô Việt Nam sử dụng vector pZY:CaMV35S::ZmNFYB2 và pZY:CaMV35S::ZmNAC1

3.4.1. Kết quả biến nạp gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 vào các dòng ngô

Sau khi thiết kế thành công vector biểu hiện mang đoạn gen ZmNF-YB2 và

ZmNAC1 được khởi động bằng promoter 35S. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát

khả năng tiếp nhận gen của các dòng ngô Việt Nam với 2 vector pZY:CaMV35S::ZmNF-

YB2 và pZY:CaM35S::ZmNAC1 đã được thiết kế ở trên.

Trong thí nghiệm này, vector biểu hiện pZY:CaMV35S mang đoạn gen ZmNF-

YB2 và ZmNAC1 được chuyển vào chủng vi khuẩn Agrobacterium EHA101 làm trung

gian để chuyển đoạn gen vào phôi non của 3 dòng ngô Việt Nam (VH1, CM8 và CH9).

Phôi non của 3 dòng ngô (VH1, CM8 và CH9) được lây nhiễm với chủng vi khuẩn mang

gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 sau quá trình đồng nuôi cấy, tạo callus và sàng lọc cây mang

gen chuyển bằng glufosinate (được trình bày trong phần phương pháp biến nạp) chúng tôi

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thu được kết quả trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả biến nạp vector pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 và

pZY:CaM35S::ZmNAC1 vào 3 dòng ngô Việt Nam

Số lƣợng mẫu

Số

cây

Số

Tỷ lệ

sống

Số

cây

Vector

tạo mô

tái sinh

sót

cây

Dòng

đƣa

sẹo

chồi

khi

hữu

biến nạp

CCM

REM

ECM

SEM RM

ra

(%)

đƣa

thụ

đất

ra

đất

VH1

11074

7154

4261

1953

256

59,56

45,83

pZY:CaMV35S

CM8

7011

3888

1924

398

100

49,49

20.69

ZmNF-YB2

CH9

7246

4763

3160

972

310

66,34

30,76

25331

15805

9345

3323

666

Tổng số

VH1

10225

5251

3578

1313

68,1

36,7

pZY:CaMV35S

CM8

6577

3391

2391

702

70,5

29,4

ZmNAC1

C8H9

6540

3267

1740

601

53,3

34,5

23342

11909

7709

2616

Tổng số

Từ kết quả bảng 3.5, chúng tôi đã biến nạp vector pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 vào

3 dòng ngô VH1, CM8 và CH9 được 25.331 phôi. Qua bảng chúng tôi thấy tỷ lệ tạo mô

sẹo của 3 dòng ngô khi biến nạp với vector pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 là khác nhau. Tỷ

lệ tái sinh của dòng CH9 đạt cao nhất 66.34% tiếp theo là dòng VH1 59.56% còn dòng

CM8 cho tỷ lệ thấp nhất chỉ đạt 49.49%. Sau khi tạo mô sẹo, mẫu được chuyển sang môi

trường ECM có bổ sung chất chọn lọc glufosinate để sàng lọc các mẫu có mang gen

chuyển loại bỏ các mẫu mô sẹo không có khả năng tái sinh. Tỷ lệ tái sinh của 3 dòng ngô

rất khác nhau không chỉ phụ thuộc vào tỷ lệ tạo mô sẹo cao mà còn phụ thuộc vào khả

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

năng tiếp nhận gen của từng dòng. Chúng tôi nhận thấy dòng VH1 cho tỷ lệ tái sinh cao

nhất đạt 45.83% tiếp theo dòng CH9 30.76% còn CM8 chỉ đạt 20.69%. Sau khi các mẫu

tái sinh sẽ được chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh RM, tiếp sau sẽ chuyển cây

ra bầu đất, thu nhận các cây sống sót sau khi trồng, chăm sóc và tiến hành tự thụ cho các

cây, chúng tôi thu nhận được các cây có khả năng hữu thụ ở các dòng như sau: VH1 có 14

cây, CM8 chỉ có 2 cây, cao nhất là CH9 25 cây hữu thụ.

Qua bảng kết quả 3.5, chúng tôi đã sử dụng 23.342 phôi của 3 dòng vật liệu để

biến nạp bởi cấu trúc vector pZY:CaMV35S::ZmNAC1 và thu được một số kết quả như

sau. Tỷ lệ tạo mô sẹo và tỷ lệ tái sinh chồi sau chọn lọc của 3 dòng này tương đối khác

nhau. Dòng CM8 cho tỷ lệ tạo mô sẹo đạt cao nhất 70.5% nhưng tỷ lệ tái sau chọn lọc chỉ

đạt 29.4%. Trong khi đó, 2 dòng VH1 và CH9 tỷ lệ tạo mô sẹo thấp hơn nhưng lại cho tỷ

lệ tái sinh sau chọn lọc cao hơn lần lượt là 36.7% và 34.5%. Tiếp theo các mẫu mô sẹo

được chọn lọc trên môi trường glufosinate và chúng tôi thu nhận được 61 cây để đưa ra

bầu đất, có 50 cây còn sống, nhưng chỉ thu được 11 cây hữu thụ của 3 dòng ngô được

biến nạp.

Hình ảnh một số bước chuyển nạp gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 vào các dòng ngô

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chọn lọc Việt Nam (hình 3.9).

a. Giai đoạn đồng nuôi cấy, tạo callus và chọn lọc của các dòng ngô lây nhiễm với chủng vi khuẩn EHA101 mang vector biểu hiện có chứa đoạn gen

b. Chồi tái sinh của các mẫu sống sót sau chọn lọc của 3 dòng ngô chuyển gen ZmNF- YB2 và ZmNAC1

c. Các cây chuyển gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 sống sót trong bầu đất

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

d. Bắp ngô thu được của cây chuyển gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1

Hình 3.9. Quy trình biến nạp gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 vào các dòng ngô Việt Nam

3.4.2. Kết quả phân tích các cây mang gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 bằng kỹ thuật PCR

Các cây sau chuyển gen sống sót ngoài bầu đất sẽ được tách chiết DNA tổng số và

PCR với cặp mồi Bar-F/Bar-R để kiểm tra cây mang gen chọn lọc Bar cho cả 2 gen

chuyển ZmNF-YB2 và ZmNAC1. Bản thân gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 được phân lập từ

cây ngô, do vậy chúng tôi sử dụng cặp mồi 35S-F/ZmNfyb2Asc-R và 35S-

F/ZmNAC1BamHI-R để kiểm tra sự có mặt của gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 trong các

cây đã được biến nạp (kết quả được trình bày trong bảng 3.3).

Bảng 3.3. Kết quả phân tích các dòng ngô chuyển gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 thế hệ T0

của 3 dòng ngô sử dụng biến nạp

Kết quả PCR thế Số cây hữu

Số cây Số cây sống hệ T0 thụ có kết

Vector Dòng sống sót sót đã tách quả PCR (+) gen biến nạp ngô khi đƣa ADN và phân (+) gen đích (+) gen chỉ thị ra đất tích PCR đích (Bar)

VH1 27 4 1 1 27

CaMV35S: CM8 6 0 0 0 6 :ZmNF-YB

CH9 31 4 3 3 31

Tổng số 64 8 4 4 64

VH1 18 6 0 0 18

CaMV35S: CM8 12 0 0 0 12 :ZmNAC1

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CH9 20 3 0 0 20

Tổng số 50 9 0 0 50

Hình 3.10. Kết quả phân tích PCR gen chọn lọc (Bar) của các cây ngô chuyển genZmNF- YB2 thế hệ To

Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR gen đích ZmNF-YB2 của các cây ngô chuyển gen thế hệ To

Kết quả PCR kiểm tra các cây ngô được biến nạp gen ZmNF-YB2 với cặp mồi gen

chọn lọc (Bar) và gen đích ZmNF-YB2 cho thấy, trong 64 cây có 8 cây trong 2 dòng VH1

và CH9 cho kết quả dương tính với gen chỉ thị Bar, có 4 mẫu dương tính với gen đích

ZmNF-YB2. Cả 4 cây này đều hữu thụ gồm: 1 cây thuộc dòng VH1 và 3 cây thuộc dòng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CH9 (Bảng 3.6, hình 3.10 và hình 3.11).

Qua kết quả này, chúng tôi nhận thấy dòng ngô CH9 có khả năng tiếp nhận vector

pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 tốt hơn so với 2 dòng ngô VH1 và CM8.

Hình 3.12. Kết quả phân tích PCR gen chọn lọc (Bar) của các cây ngô chuyển gen ZmNAC1 thế hệ To

Kết quả phân tích PCR các cây ngô chuyển gen được biến nạp gen ZmNAC1 với

cặp mồi đặc hiệu gen Bar cho thấy, trong 50 mẫu DNA của 3 dòng ngô thí nghiệm có 6

mẫu thuộc dòng VH1 và 3 mẫu thuộc dòng CH9 cho kết quả dương tính với cặp mồi gen

chỉ thị (Bar) (hình 3.12). Tuy nhiên, do thời gian không cho phép nên chúng tôi chưa thể

tiến hành kiểm tra PCR gen đích ZmNAC1 của các dòng ngô đã biến nạp.

Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và

ZmNAC1 được điều khiển bởi promoter 35S và thu được một số kết quả khả quan khi

khảo sát khả năng tiếp nhận gen của 3 dòng ngô chọn lọc với gen ZmNF-YB2. Tuy nhiên,

kết quả biến nạp gen ZmNAC1 vào các dòng ngô Việt Nam mới chỉ kiểm tra được ở kết

quả mang gen chọn lọc, chưa có thời gian để kiểm tra với gen ZmNAC1. Chúng tôi hy

vọng sẽ sớm kiểm tra được các cây biến nạp gen ZmNAC1 với cặp mồi đặc hiểu để có thể

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kịp bổ sung vào luận án.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

I. KẾT LUẬN

1. Tách dòng thành công đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 thuộc nhóm nhân tố phiên

mã có khả năng nâng cao khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán từ giống ngô

tẻ Cao Bằng. Kết quả tách dòng cho thấy gen ZmNF-YB2 có 537 nucleotide mã hóa

cho 178 amino acid, gen ZmNAC1 có 882 nucleotide mã hóa cho 293 amino acid.

2. Thiết kế thành công vector siêu biểu hiện có chứa đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1

dưới sự điều khiển của promoter 35S.

3. Kết quả phân tích PCR của các dòng ngô sau khi biến nap đã chứng tổ rằng tổ hợp

vector siêu biểu hiện pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 và pZY:CaMV35S:ZmNAC1 có

thể sử dụng để chuyển gen vào các dòng ngô chọ lọc của Việt Nam.

II. KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên cứu quy trình biến nạp ngô nhằm nâng cao hiệu quả chuyển gen

ZmNF-YB2 và ZmNAC1 vào các dòng ngô Việt Nam.

2. Tiếp tục phân tích đánh giá cây sau chuyển gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 ở thế hệ

tiếp theo bằng các kỹ thuật PCR, Southern blot…

3. Từ kết quả thu được cây chuyển gen, tiếp tục nghiên cứu đánh giá sự biểu hiện của

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

các gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 ở các điều kiện hạn hán khác nhau.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TRONG NƢỚC

1. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Phạm Thị Hương, Lê Thị

Thu Về, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Lê Huy Hàm (2013), Nghiên cứu biến nạp

gen kháng hạn vào một số dòng ngô chọn lọc thông qua vi khuẩn Agrobacterium.

Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 2(41): 61-67.

2. Lê Thị Thu Hiền và cộng sự (2003),Cây trồng biến đổi di truyền: thực trạng và triển

vọng, Công nghệ sinh học, 1(3): 265-285.

3. Nguyễn Hữu Hoàng (2009), Giá trị dinh dưỡng của ngô, Viện Khoa học Nông

nghiệp Việt Nam.

4. Nguyễn Thị Thanh và cộng sự (1999), Tạo cây cải bông (Brassica oleracea var

botrycis) và cây cải xanh (B. juncea) mang gen kháng sâu cry1ac và gen bar kháng

thuốc cỏ dại thông qua A. tumefaciens, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh

học toàn quốc: 1121-1128.

5. Phạm Thị Lý Thu (2007), Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác

định phương pháp chuyển gen thích hợp ở ngô. Luận án Tiến Sĩ sinh học, Viện Công

nghệ Sinh học.

6. Ngô Hữu Tình (2009), Chọn lọc và lai tạo giống ngô, Nxb Nông nghiệp.

7. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2007), Công nghệ sinh học tập năm công nghệ vi

sinh và môi trường, Nxb Giáo dục.

8. Vũ Văn Vụ (1996), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo Dục.

TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI

9. Aida M., Ishida T., Fukaki H., Fujisawa H., & Tasaka M. (1997), Genes involved in

organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant,

Plant Cell, 9:841-857.

10. Boyer J.S. (1982), Plant productivity and environment, Science, 218:443-448.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

11. Cook E. R., Seager R., Cane M. A., Stahle D.W. (2007), Earth, Sci Rev, 81:93-134.

12. Collinge M., & Boller T. (2001), Differential induction of two potato genes, Stprx2

and StNAC, in response to infection by Phytophthora infestans and to wounding,

Plant Mol Biol, 46(5):521e9.

13. Cutler S. R., Rodriguez P. L., Finkelstein R. R., Abrams S. R. (2010), Abscisic

acid: emergence of acoresignaling network”, Annual Reviewof Plant

Biology, 61:651-679.

14. Edmeades O. G. (2007), Drought tolerance in Maize: An Emerging Reality. Companion document to excutive summary, ISAAA briefs: 39-2008.

15. Fang Y., You J., Xie K., Xie W., Xiong L. (2008), Systematic sequence analysis and

identification of tissue-specific or stress-responsive genes of NAC transcription

factor family in rice, Mol Genet Genomics, 280:535-46.

16. Gusmaroli G., Tonelli C., Mantovani R. (2001), Regulation of the CCAAT-binding

NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana, Gene, 264:173-185.

17. Hankenberg D., Wu Y., Voigt A., Adams R., Schramm P., Grimm B. (2011), Studies

on differential nuclear translocation mechanism and assembly of the three subunits

of the arabidopsis thaliana transcription factor NF-Y, Mol. Plant, doi:

10.1093/mp/ssr107.

18. Hao Y. J., Wei W., Song Q. X., Chen H. W., Zhang Y. Q., Wang F., Zou H. F., Lei

G., Tian A. G., Zhang W. K., Ma B., Zhang J. S., Chen S. Y. (2011), Soybean NAC

transcription factor promote abiotic stress tolerance and lateral root formation in

transgenic plants, The Plant Journal, 68:302-313.

19. Hu H., Dai M., Yao J., Xiao B., Li X., Zhang Q., et al. (2006), Overexpressing a

NAM, ATAF and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and

salt tolerance in rice, Proc Natl Acad Sci USA, 103(129):87-92.

20. Huang T., Duman J. G. (2002), Cloning and characterization of a thermal hysteresis

(antifreeze) protein with DNA-binding activity from winter bittersweet nightshade,

Solanum dulcamara, Plant Mol Biol, 48:339-50.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

21. IFPRI. (2003), 2020 Projections, Washington, D.C.

22. Ishiguro S., & Nakamura K. (1994), Characterization of a cDNA encoding a novel

DNA-binding protein, SPF1, that recognizes SP8 sequences in the 5, upstream

regions of genes coding for sporamin and b-amylase from sweet potato, Mol Genet

Genomics, 244:563-571.

23. James, C. (2013), Global status of commercialized biotech/GM crops: 2013, ISAAA:

Ithaca, NY.

24. Katia P., Roderick W. K., Nerina G., Valentina C., Monica F., Chiara T., Ben F. H.,

Roberto M. (2012), The promiscuous life of plant nuclear factor Y transcription

factors, The Plant Cell, 24: 4777-4792.

25. Kazuo N., Kazuko Y. S. (2005), Molecular studies on stress-responsive gene

expression in Arabidopsis and improvement of stress tolerance in crop plants by

regulon biotechnology, JARQ39 (4): 221-229.

26. Kim T. H., Bohmer M., Hu H., Nishimura N., Schroeder J. I. (2010), Guard cell

Signal transduction network: Advances in understanding abscisis acid, CO1, and Ca2+ signaling, Annu Rev Plant Biol, 61:561-591.

27. Kumimoto R. W., Zhang Y., Siefers N., Holt B. F. (2010), NF-YC3, NF-YC4 and

NF-YC9 are required for constants-mediated, photoperiod-dependent flowering in

Arabidopsis thaliana, Plant J, 63:379-391.

28. Kizis D., Pages M. (2002), Maize DRE-binding proteins DBF1 and DBF2 are

involved in rab17 regulation through the drought-responsive element in an ABA-

dependent pathway, Plant J, 30:679-689.

29. Le D. T., Nishiyama R., Watanabe Y., Mochida K., Yamaguchi-Shinozaki K.,

Shinozaki K., Tran L. S. P. (2011), Genome-wide survey and expression analysis of

the plant-specific NAC transcription factor family in soybean during development

and dehydration stress, DNA Research, 18:263-276.

30. Li W. X., Oono Y., Zhu J., He X. J., Wu J. M., Lida K., Lu X. Y., Cui X., Jin H.,

Zhu J. K. (2010), The Arabidopsis NFYA5 transcription factor is regulated

transcriptionally and postranscriptionally to promote drought resistance, The Plant

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Cell, 20:2238-2251.

31. Liu J.X., Howell S.H. (2010), bZIP28 and NF-Y transcription factors are activated

by ER stress and assemble into a transcriptional complex to regulate stress response

genes in Arabidopsis, Plant Cell, 22:782-796.

32. Lu M., Ying S., Zhang D. F., Shi Y. S., Song Y. C., Tian Y., Li Y. (2012), A maize

stress-responsive NAC transcription factor, ZmNAC1, confers enhanced tolerance to

dehydration in transgenic Arabidopsis”, Plant Cell Reports, 31(9):1701.

33. Maity S.N., Crombrugghe B. D. (1998), Role of the CCAAT-binding protein

CBF/NF-Y in transcription, Trends Biochem Sci, 23:174-178.

34. Manuela M. C., João P. M., João S. P. (2003), Understanding plant response to drought from genes to the whole plant, Functional Plant Biology, 30:239-264.

35. Masiero S., Imbriano C., Ravasio F., Favaro R., Pelucchi N., Gorla M. S.,

Mantovani R., Colombo L., Kater M. M. (2002), Ternary complex formation

between MADS-box transcription factors and the histone fold protein NF-YB,

J.Biol. Chem, 277(22):6529-26435.

36. Mochida K., Yoshida T., Sakurai T., Yamaguchi- Shinozaki K., Shinozaki K., Tran

L-S.P. (2009), In silico analysis of transcription factor repertoire and prediction of

stress responsive transcription factors in soybean, DNA Res.

37. Mohammed N., Akhter M. S., Shoshi K., (2013), Roles of NAC transcription factors

in the regulation of biotic and abiotic stress responses in plants, Microbiology 4:doi

10.3389/fmicb.

38. Nakashima K., Takasaki H., Mizoi J., Shinozaki K., & Yamaguchi-shinozaki K.

(2012), NAC transcription factors in plant abiotic stress responses, Biochimica et

Biophysica Acta, 1819:97-103.

39. Nakashima K., Ito Y., & Yamaguchi-shinozaki K. (2009), Transcriptional regulatory

networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and grasses, Plant Physiol,

149:88-95.

40. Nakashima K., Tran L. P., Nguyen D. V., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., et al.

(2007), Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

abiotic and biotic stress responsive gene expression in rice, Plant J, 51:617e30.

41. Nelson D. E., Repetti P. P., Adams T. R., Creelman R. A., Wu J., Warney D. C.,

Anstrom D. C., Bensen R. J., Castiglioni P. P., Donnarummo M. G., HinChey B. S.,

Kumimoto R. W., Maszle D. R., Canales R. D., Krolikowski K. A., Dotson S. B.,

Gutterson N., Ratcliffe O. J., Heard J. E. (2007), Plant nucleare factor Y (NF-Y) B

subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limted

acres, Pnas, 104:16450-16455.

42. Ooka H., Satoh K., Doi K., Nagata T., Otomo Y., Murakami K. (2003),

Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis

thaliana, DNA Res, 20:239-247.

43. Petit J. R., Jouzel J., Raynaud D., Barkov N. I., Barnola J. M., Basile I., Bender M.,

Chappellaz J., Davis M., Delaygue G., Delmotte M., Kotlyakov V. M., Legrand M.,

Lipenkov V. Y., Lorius C., Pespin L., Ritz C., Saltzman E., Stivernard M. (2009),

Climate and atmospheric history of the past 420,000 years from the Vostok ice core,

Antarctica, Nature, 399:429-436.

44. Pingali P. L., Pandey S. (2001), World maize needs meeting: technological

opportunities and priorities for the public section, Pingali P (ed) CIMMYT 1999-

2000. World maize facts and trends. Meeting world maize needs: technological

opportunities and priorities for the public section.CIMMYT, Mexico city: 1-3.

45. Riechmann J. L., Heard J., Martin G., Reuber L., Jiang C. Z., Keddie J., Adam L.,

Pineda O., Racliffe O. J., Samaha R. R. (2000), Arabidopsis transcription factors:

genome-wide comparative analysis among eukaryotes, Science, 290: 2105-2110.

46. Rivero M. R, Kojima M., Gepstein A., Sakakibara H., Mittler R., Gepstein S., Blumwald E. (2007), Delayed leaf senescence induces extreme drought tolerance in a flowering plant, PNAS, 104(49):19631-19636.

47. Roderick W. K., Chamindika L. S., Krystal K. G., Jan R. R., Nicholas S., Ben F. H.

(2013), Nuclear factor Y transcription factors have both opposing and additive roles

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

in ABA-mediated seed germination, PLoS ONE, 8(3):e59841.

48. Rushton P. J., Bokowiec M. T., Han S., Zhang H., Brannock J. F., Chen X., et al.

(2008), Tobacco transcription factors: novel insights into transcriptional regulation

in the Solanaceae, Plant Physiol.

49. Saibo N. J. M., Lourenco T., Oliveira M. M. (2009), Transcription factors and

regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses,

Annals of Botany, 103: 609-623.

50. Salinger M. J, Sivakumar M. V. K., Motha R. (2005), Climatic, Change, 70:341–362.

51. Schmutz J., Steven B. C., Jessica S., Jianxin M., Therese M., Nelson W., David L.

H., Qijian S., Jay J. T., Jianlin C., Xu D., Hellsten U., May G. D., Yu Y., Sakurai T.,

Umezawa T., Bhattacharyya M. K., Sandhu D., Valliyodan B., Lindquist E., Peto

M., Grant D., Shu S., Goodstein D., Barry K., Montona F. G., Abernathy B.,

Jianchang D., Zhixi T., Liucun Z., Navdeep G., Trupti J., Marc L., Anand S., Zhang

X. C., Shinozaki K., Nguyen H. T., Wing R. A., Cregan P., Specht J., Grimwood J.,

Rokhsar D., Stacey G., Shoemaker R. C., Jackson S. A. (2010), Genome sequence of

the palaeopolyploid soybean, Nature, 463:178-183.

52. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2007), Gene networks involved in drought

stress response and tolerance, J Exp Bot, 58:221-227.

53. Siefers N., Dang K. K., Kumimoto R. W., Bynum W. E. T., Tayrose G., Holt B. F.

(2009), Tissue-specific expression patterns of Arabidopsis NF-Y transcription

factors suggest potential for extensive combinatorial complexity, Plant Physiol,

149:625-641.

54. Sinha S., Maity S. N., Lu J., de Crombrugghe B. (1995), Recombinant rat CBF-C,

the third subunit of CBF/NFY, allows formation of a protein-DNA complex with

CBF-A and CBF-B and with yeast HAP2 and HAP3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

92:1624-1628.

55. Tiwari S. B., Shen Y., Chang H. C., Hou Y., Harris A., Ma S. F., McPartland M.,

Hymus G. J., Adam L., Marion C., Belachew A., Repetti P. P., Reuber T. L.,

Ratcliffe O. J. (2010), The flowering time regulator constans is recruited to the

flowering locus T promoter via a unique cis-element, New Phytol, 187:56-66. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

56. Tran L.S., Nishiyama R., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (2010), Potential

utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic stress tolerance in plants

by biotechnological approach, GM Crops, 1(1):32-39.

57. Udvardi M. K., Kakar K., Wandrey M., Montanari O., Murray J., Andriankaja A.,

Zhang J. Y., Benedito V., Hofer J. M. I., Chueng F., et al. (2007), Legume

transcription factors: global regulators of plant development and response to the

environment, Plant Physiol, 144: 538-549.

58. Umezawa T., Nakashima K., Miyakawa T., Kuromori T., Tanokura M., Shinozaki

K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2010), Molecular basis of the core regulatory network

in ABA responses: Sensing, Signaling and transport, Plant Cell Physiol,

51(11):1821-1839.

59. Vavilov N.I. (1926), Studies on the Conbining Ability of CIMMYT Germplasm,

CIMMYT Research Highlights: 24-33.

60. Wang Y, Ying J., Kuzma M. , Chalifoux M., Sample A., Arthur M. C., Uchacz T.,

Sarvas C., Wan J., Dennis T. D. , Court M. P., Huang Y. (2005), Molecular tailoring

of farnesylation for plant drought tolerance and yield protection, The Plant Journal,

43:413-424.

61. Xia N., Zhang G., Sun Y. F., Zhu L., Xu L. S., Chen X. M., Liu. B., Yu Y. T., Wang

X. J., Huang L. L., & Kang Z. S. (2010), TaNAC8, a novel NAC transcription factor

gene in wheat, responds to stripe rust pathogen infection and abiotic stresses,

Physiol. Mol. Plant Pathol, 74: 394e402.

62. Xiao H., Sha T., Yi A., Dong-Chao Z., Xin-Li X., Wie-Lun Y. (2013),

Overexpression of the poplar NF-YB7 transcription factor factor drought tolerance

and improves water-use efficiency in Arabidopsis, Journal of Experimental Botany,

64(14):4589-4601.

63. Yamaguchi-shinozaki K., Koizumi M., Urao S., & Shinozaki K. (1992), Molecular

cloning and characterization of 9 cDNAs for genes that are responsive to desiccation

in Arabidopsis thaliana: sequence analysis of one cDNA clone that encodes a

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

putative transmembrane channel protein, Plant Cell Physiol, 33:217-224.

64. Yamamoto A., Kagaya Y., Toyoshima R., Kagaya M., Takeda S., Hattori T. (2009),

Arabidopsis NF-YB subunits LEC1 and LEC1-like activate transcription by

interacting with seed-specific ABRE-binding factors, The Plant Journal 58:843-856.

TÀI LIỆU WEB

65. FAOSTAT (2014), http://faostat.fao.org/

66. ISAAA (2009), Brief report 41-2009.

67. ISAAA (2014),

http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/commercialtrait/default.asp?TraitTypeID

=6&Trait=Abiotic%20Stress%20Tolerance.

68. PlantTFDB database, http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

69. NCBI, http://ncbi.nlm.nih.gov/.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Môi trường nuôi cấy khuẩn

Môi trƣờng LB:

- Môi trường LB lỏng:

5g/l Yeast extract, 10 g/l Triptone, 10 g/l Nacl, pH=7.

- Môi trường LB đặc: LB lỏng bổ sung 15g/l Bactor-agar, pH=7.

Môi trƣờng YEB:

- Môi trường YEB lỏng:

55g/l Yeast extract, 10 g/l Peptone, 10 g/l Nacl. pH=7.

- Môi trường YEB đặc: YEB lỏng bổ sung 15 g/l Bactor-agar, pH=7.

Phụ lục 2. Thành phần môi trường nuôi cấy ngô

Thành phần IM CCM ReM EcM SeM RM

+ + + + + - N6 salts

+ + + + + N6 vitamin

- - - - - + MS salts

- - - - - + MS vitamin

5ml 5ml Glycine (0,2g/500ml) 5ml 5ml 5ml

68.5 g 30 g 30 g 30 g Sucrose 30 g 60 g

36 g Glucose

0.7 g 0.7 g 0.7 g 0.7 g 0.7 g L-proline

0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g MES

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2,4-D, 1mg/ml 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml

BAP (mg/l) 1mg

Myo inositol (mg/l) 100 mg

pH w/KOH 5.2 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8

Gellan-gum (g/l) 5,5-6 5,5-6 5,5-6 5,5-6

Agar (g/l) 8 - 9

Khử trùng, sau đó bố sung:

0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml Silver nitrate, 8.5 mg/ml

L-cysteine 0.4 g

1 ml Acetosyringone, 100 mM

1ml 1ml 1ml 1ml Cefotaxime (250mg/ml)

PPT (Phosphinothricin) 3 mg/l 3 mg/l

Hygromycin 5mg/l 5mg/l

MS*: Thành phần muối khoáng và vitamin theo Murashige và Skoog (Murashige et al., 1962)

N6*: Thành phần muối khoáng và vitamin theo Chu et al. (1975)

Phụ lục 3. Trình tự nucleotide và amino acid mã hóa của gen NTCB-ZmNF-YB2

ATG GCG GAA GCT CCG GCG AGC CCT GGC GGC GGC GGC GGG AGC CAC

GAG AGC GGG AGC CCC AGG GGA GGC GGA GGC GGT GGC AGC GTC AGG

GAG CAG GAC AGG TTC CTG CCC ATC GCC AAC ATC AGT CGC ATC ATG

AAG AAG GCC ATC CCG GCT AAC GGG AAG ATC GCC AAG GAC GCT AAG

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

GAG ACC GTG CAG GAG TGC GTC TCC GAG TTC ATC TCC TTC ATC ACT

AGC GAA GCG AGT GAC AAG TGC CAG AGG GAG AAG CGG AAG ACC ATC

AAT GGC GAC GAT CTG CTG TGG GCC ATG GCC ACG CTG GGG TTT GAA

GAC TAC ATT GAA CCC CTC AAG GTG TAC CTA CAG AAG TAC AGA GAG

ATG GAG GGT GAT AGC AAG TTA ACT GCT AAA TCT AGC GAT GGC TCG

ATT AAA AAG GAT GCT CTT GGT CAT GTG GGA GCA AGT AGC TCA GCT

GCA GAA GGG ATG GGC CAA CAG GGA GCA TAC AAC CAA GGA ATG GGT

TAT ATG CAA CCT CAG TAC CAT AAC GGG GAT ATC TCA AAC TAA

MAEAPASPGGGGGSHESGSPRGGGGGGSVREQDRFLPIANISRIMKKAIPANGKIAKDAK

ETVQECVSEFISFITSEASDKCQREKRKTINGDDLLWAMATLGFEDYIEPLKVYLQKYRE

MEGDSKLTAKSSDGSIKKDALGHVGASSSAAEGMGQQGAYNQGMGYMQPQYHNGDISN*

Phụ lục 4. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen NTCB-ZmNF-YB2 phân lập từ

ZmNF-YB2 1 ATGGCGGAAGCTCcggcgagccctggcggcggcggcgggagccacgagagcgggagcccc 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DQ333304.1 1 ATGGCGGAAGCTCCGGCGAGCCCTGGCGGCGGCGGCGGGAGCCACGAGAGCGGGAGCCCC 60 ZmNFY-B2 61 aggggaggcggaggcggTGGCAGCGTCAGGGAGCAGGACAGGTTCCTGCCCATCGCCAAC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DQ333304.1 61 AGGGGAGGCGGAGGCGGTGGCAGCGTCAGGGAGCAGGACAGGTTCCTGCCCATCGCCAAC 120 ZmNF-YB2 121 ATCAGTCGCATCATGAAGAAGG---------------------CCATCCCGGCTAACGGG 159 |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| DQ333304.1 121 ATCAGTCGCATCATGAAGAAGGCCATCCCGGCTAACGGGAAGACCATCCCGGCTAACGGG 180 ZmNF-YB2 160 AAGATCGCCAAGGACGCTAAGGAGACCGTGCAGGAGTGCGTCTCCGAGTTCATCTCCTTC 219 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DQ333304.1 181 AAGATCGCCAAGGACGCTAAGGAGACCGTGCAGGAGTGCGTCTCCGAGTTCATCTCCTTC 240 ZmNF-YB2 220 ATCACTAGCGAAGCGAGTGACAAGTGCCAGAGGGAGAAGCGGAAGACCATCAATGGCGAC 279 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DQ333304.1 241 ATCACTAGCGAAGCGAGTGACAAGTGCCAGAGGGAGAAGCGGAAGACCATCAATGGCGAC 300 ZmNF-YB2 280 GATCTGCTGTGGGCCATGGCCACGCTGGGGTTTGAAGACTACATTGAACCCCTCAAGGTG 339 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DQ333304.1 301 GATCTGCTGTGGGCCATGGCCACGCTGGGGTTTGAAGACTACATTGAACCCCTCAAGGTG 360 ZmNF-YB2 340 TACCTACAGAAGTACAGAGAGATGGAGGGTGATAGCAAGTTAACTGCTAAATCTAGCGAT 399 ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| DQ333304.1 361 TACCTGCAGAAGTACAGAGAGATGGAGGGTGATAGCAAGTTAACTGCAAAATCTAGCGAT 420 ZmNF-YB2 400 GGCTCGATTAAAAAGGATGCTCTTGGTCATGTGGGAGCAAGTAGCTCAGCTGCAGAAGGG 459 ||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| DQ333304.1 421 GGCTCAATTAAAAAGGATGCCCTTGGTCATGTGGGAGCAAGTAGCTCAGCTGCACAAGGG 480 ZmNF-YB2 460 ATGGGCCAACAGGGAGCATACAACCAAGGAATGGGTTATATGCAACCTCAGTACCATAAC 519 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| DQ333304.1 481 ATGGGCCAACAGGGAGCATACAACCAAGGAATGGGTTATATGCAACCCCAGTACCATAAC 540 ZmNF-YB2 520 GGGGATATCTCAAACTAA 537 |||||||||||||||||| DQ333304.1 541 GGGGATATCTCAAACTAA 558

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

giống ngô tẻ Cao Bằng với giống ngô B73(gb|DQ333304.1|)

NTCB-NFYB2 1 MAEAPASPGGGGGSHESGSPRGGGGGGSVREQDRFLPIANISRIMKKAIPANGK------ 54 MAEAPASPGGGGGSHESGSPRGGGGGGSVREQDRFLPIANISRIMKKAIPANGK DQ333304.1 1 MAEAPASPGGGGGSHESGSPRGGGGGGSVREQDRFLPIANISRIMKKAIPANGKTIPANG 60 NTCB-NFYB2 55 -IAKDAKETVQECVSEFISFITSEASDKCQREKRKTINGDDLLWAMATLGFEDYIEPLKV 113 IAKDAKETVQECVSEFISFITSEASDKCQREKRKTINGDDLLWAMATLGFEDYIEPLKV DQ333304.1 61 KIAKDAKETVQECVSEFISFITSEASDKCQREKRKTINGDDLLWAMATLGFEDYIEPLKV 120 NTCB-NFYB2 114 YLQKYREMEGDSKLTAKSSDGSIKKDALGHVGASSSAAEGMGQQGAYNQGMGYMQPQYHN 173 YLQKYREMEGDSKLTAKSSDGSIKKDALGHVGASSSAA+GMGQQGAYNQGMGYMQPQYHN DQ333304.1 121 YLQKYREMEGDSKLTAKSSDGSIKKDALGHVGASSSAAQGMGQQGAYNQGMGYMQPQYHN 180 NTCB-NFYB2 174 GDISN 178 GDISN DQ333304.1 181 GDISN 185

Phụ lục 5. Kết quả trình tự nucleotide và trình tự mã hóa các amino axit của gen NTCB-

ZmNAC1

ATGAGCGGCGCCGGTCCGGATCTGCAGCTGCCACCGGGGTTCCGGTTCCACCCGACGGAC

GAGGAGCTGGTGATGCACTACCTCTGCCGCCGCTGCGCCGGCCTGCCCATCGCCGTCCCC

ATCATCGCCGAGATCGACCTCTACAAGTTCGACCCATGGCAGCTCCCCAGGATGGCACTG

TACGGCGAGAAGGAGTGGTACTTCTTCTCCCCGCGGGACCGCAAGTACCCGAACGGGTCC

AGGCCCAACCGCGCCGCCGGGGCTGGGTACTGGAAGGCCACCGGCGCTGACAAGCCCGTG

GGCACGCCCAAGCCGCTGGCCATCAAGAAGGCGCTCGTCTTCTACGCCGGCAAGGCGCCC

AAGGGCGAGAAGACCAACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCGCCGACGTCGACCGCTCG

GCGCGCAAGAAGAACAGCCTCAGGTTGGATGACTGGGTCCTGTGCCGCATCTACAACAAG

AAGGGCGGCGGGCTGGAGAAGGCGCCGGCGGCCGGCGGCGACCACAAGCCTGTGTTCGCC

ACGGCGGCGGTGAGCTCCCCGCCGGAGCAGAAGCCGTTCGTGGCGGCGGCGGGCGGGCTG

CCCCCGGCGTTCCCGGGGCTGGCGGCGTACTACGACCGGCCATCGGACTCGATGCCGCGG

CTGCACGCGGACTACTCCAGCTGCTCGGAGCAGGTGCTGTCCCCGGAGCAGCTGGCGTGC

GACCGGGAGGTGCAGAGCCAGCCCAAGATCAGCGAGTGGGAGCGGACCTTCGCCTCCGAC

CCCGTGAGCCCCGCGGGCTCCATGCTCGACCCCGTCCTCGGCCACGCCGGCGGCGACCCG

CTGCTGCAGGACATCCTCATGTACTGGGGCAAGCCGTTCTAG

MSGAGPDLQLPPGFRFHPTDEELVMHYLCRRCAGLPIAVPIIAEIDLYKFDPWQLPRMAL

YGEKEWYFFSPRDRKYPNGSRPNRAAGAGYWKATGADKPVGTPKPLAIKKALVFYAGKAP

KGEKTNWIMHEYRLADVDRSARKKNSLRLDDWVLCRIYNKKGGGLEKAPAAGGDHKPVFA

TAAVSSPPEQKPFVAAAGGLPPAFPGLAAYYDRPSDSMPRLHADYSSCSEQVLSPEQLAC

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DREVQSQPKISEWERTFASDPVSPAGSMLDPVLGHAGGDPLLQDILMYWGKPF

Phụ lục 6. Kết quả so sánh trình tự gen ZmNAC1 phân lập từ giống NTCB với trình tự

Query 1 ATGAGCGGCGCCGGTCCGGATCTGCAGCTGCCACCGGGGTTCCGGTTCCACCCGACGGAC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 26 ATGAGCGGCGCCGGTCCGGATCTGCAGCTGCCACCGGGGTTCCGGTTCCACCCGACGGAC 85 Query 61 GAGGAGCTGGTGATGCACTACCTCTGCCGCCGCTGCGCCGGCCTGCCCATCGCCGTCCCC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 86 GAGGAGCTGGTGATGCACTACCTCTGCCGCCGCTGCGCCGGCCTGCCCATCGCCGTCCCC 145 Query 121 ATCATCGCCGAGATCGACCTCTACAAGTTCGACCCATGGCAGCTCCCCAGGATGGCACTG 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 146 ATCATCGCCGAGATCGACCTCTACAAGTTCGACCCATGGCAGCTCCCCAGGATGGCACTG 205 Query 181 TACGGCGAGAAGGAGTGGTACTTCTTCTCCCCGCGGGACCGCAAGTACCCGAACGGGTCC 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 206 TACGGCGAGAAGGAGTGGTACTTCTTCTCCCCGCGGGACCGCAAGTACCCGAACGGGTCC 265 Query 241 AGGCCCAACCGCGCCGCCGGGGCTGGGTACTGGAAGGCCACCGGCGCTGACAAGCCCGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 266 AGGCCCAACCGCGCCGCCGGGGCTGGGTACTGGAAGGCCACCGGCGCTGACAAGCCCGTG 325 Query 301 GGCACGCCCAAGCCGCTGGCCATCAAGAAGGCGCTCGTCTTCTACGCCGGCAAGGCGCCC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 326 GGCACGCCCAAGCCGCTGGCCATCAAGAAGGCGCTCGTCTTCTACGCCGGCAAGGCGCCC 385 Query 361 AAGGGCGAGAAGACCAACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCGCCGACGTCGACCGCTCG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 386 AAGGGCGAGAAGACCAACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCGCCGACGTCGACCGCTCG 445 Query 421 GCGCGCAAGAAGAACAGCCTCAGGTTGGATGACTGGGTCCTGTGCCGCATCTACAACAAG 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 446 GCGCGCAAGAAGAACAGCCTCAGGTTGGATGACTGGGTCCTGTGCCGCATCTACAACAAG 505 Query 481 AAGGGCGGCGGGCTGGAGAAGGCGCCGGCGGCCGGCGGCGACCACAAGCCTGTGTTCGCC 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 506 AAGGGCGGCGGGCTGGAGAAGGCGCCGGCGGCCGGCGGCGACCACAAGCCTGTGTTCGCC 565 Query 541 ACGGCGGCGGTGAGCTCCCCGCCGGAGCAGAAGCCGTTCGTggcggcggcgggcgggctg 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 566 ACGGCGGCGGTGAGCTCCCCGCCGGAGCAGAAGCCGTTCGTGGCGGCGGCGGGCGGGCTG 625 Query 601 cccccggcgttcccggggctggcggcgTACTACGACCGGCCATCGGACTCGATGCCGCGG 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 626 CCCCCGGCGTTCCCGGGGCTGGCGGCGTACTACGACCGGCCATCGGACTCGATGCCGCGG 685 Query 661 CTGCACGCGGACTACTCCAGCTGCTCGGAGCAGGTGCTGTCCCCGGAGCAGCTGGCGTGC 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 686 CTGCACGCGGACTACTCCAGCTGCTCGGAGCAGGTGCTGTCCCCGGAGCAGCTGGCGTGC 745 Query 721 GACCGGGAGGTGCAGAGCCAGCCCAAGATCAGCGAGTGGGAGCGGACCTTCGCCTCCGAC 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 746 GACCGGGAGGTGCAGAGCCAGCCCAAGATCAGCGAGTGGGAGCGGACCTTCGCCTCCGAC 805 Query 781 CCCGTGAGCCCCGCGGGCTCCATGCTCGACCCCGTCCTCGGCCACGCCGGCGGCGACCCG 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 806 CCCGTGAGCCCCGCGGGCTCCATGCTCGACCCCGTCCTCGGCCACGCCGGCGGCGACCCG 865 Query 841 CTGCTGCAGGACATCCTCATGTACTGGGGCAAGCCGTTCTAG 882 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 866 CTGCTGCAGGACATCCTCATGTACTGGGGCAAGCCGTTCTAG 907

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

gen có mã số gb|EU224278.1|

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 nhằm đáp ứng khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán ở cây ngô

NGUYỄN HỮU KIÊN

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ZmNF-YB2 VÀ ZmNAC1 NHẰM ĐÁP ỨNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN HÁN Ở CÂY NGÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGUYỄN HỮU KIÊN

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ZmNF-YB2 VÀ ZmNAC1 NHẰM ĐÁP ỨNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN HÁN Ở CÂY NGÔ

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

MỞ ĐẦU

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tên mồi

Trình tự mồi

Tm (oC)

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Thân

Rễ

Lá

Số lƣợng mẫu

Số

cây

Số

Tỷ lệ

Tỷ lệ

sống

Số

cây

Vector

tạo mô

tái sinh

sót

cây

Dòng

đƣa

sẹo

chồi

khi

hữu

biến nạp

CCM

REM

ECM

SEM RM

ra

(%)

(%)

đƣa

thụ

đất

ra

đất

Tổng số

Tổng số

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn năm 2023 tại tỉnh Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xác định biến đổi gen ở một số bệnh nhân thông liên nhĩ bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích toàn bộ hệ gen ty thể và đa hình nucleotide đơn vùng không trao đổi chéo của nhiễm sắc thể Y người Việt Nam thuộc năm dân tộc Pa Kô, Cơ-Tu, Rơ-Măm, Kinh miền Trung và Kinh miền Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn có lợi sinh trưởng trong môi trường chứa tảo

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh rụng lá Pestalotiopsis hại cây cao su tại một số vùng trồng chính của Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng gene kháng thuốc, gene độc lực và hệ vi khuẩn đường ruột cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng giải trình tự metagenomics

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm gây hại trên hòm gỗ thu thập tại đồng nai và khảo sát hiệu quả ức chế nấm của một số chế phẩm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sử dụng thông tin di truyền trên vùng gen ITS DNA trong định loại các mẫu sâm (Panax L.) thu thập ở tỉnh Hà Giang

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh