Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào Bạch đàn lai phục vụ công nghiệp chế biến giấy

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI & TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----------

ĐỖ THỊ THỤC

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ

(EcHB1)VÀO BACHJ ĐÀN LAI PHỤC VỤ CÔNG NGHIỆP CHẾ

BIẾN GIẤY

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

Các loài Bạch đàn được nhập vào Việt Nam từ những năm 1930 và đến nay đã trở

thành nhóm cây trồng chủ lực trong các chương trình trồng rừng tập trung và phân tán ở

nước ta. Đến năm 2011, tổng diện tích rừng trồng Bạch đàn ở Việt Nam là 353,000 ha,

chiếm 32% diện tích rừng trồng cả nước (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2011).

Bạch đàn là loài cây sinh trưởng nhanh, thích nghi tốt. Tại Việt Nam, Bạch đàn

được trồng tại các tỉnh thuộc vùng Tây Bắc, Đông Bắc, vùng trung tâm, đồng bằng sông

Hồng, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Gỗ Bạch đàn được dùng làm nguyên liệu giấy

(hiệu suất bột giấy 49.5%), ván dăm, ván sợi ép, trụ mỏ, gỗ lớn được dùng trong xây

dựng, đóng đồ mộc; gỗ nhỏ dùng làm gỗ củi. Tỷ trọng gỗ ở năm 6 tuổi là 488 kg m3 (Luo

Jianzhong , 2003), chiều dài sợi gỗ là 982,4 mm (cho phần gỗ mềm) và 110,46 mm (cho

phần gỗ cứng) (Bai Jyayu và cs , 2003) [15].

Gỗ Bạch đàn được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp

sản xuất giấy vì gỗ Bạch đàn có thành phần hóa học và cấu tạo sợi rất thích hợp cho sản

xuất bột giấy. Mỗi năm trên thế giới có hàng triệu tấn bột giấy được sản xuất từ gỗ Bạch

đàn. Bên cạch đó, gỗ Bạch đàn còn được sử dụng làm đồ mộc, sản phẩm thủ công mỹ

nghệ, sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, gỗ xây dựng, cột chống,… Ngoài ra, lá của một

số loài Bạch đàn còn được sử dụng để tách chiết tinh dầu, tanin và chế biến dược phẩm.

Bạch đàn lai được đánh giá có ưu thế lai và sinh trưởng tốt hơn bố mẹ của chúng

(Lê Đình Khả và cs, 1993) [6]. Cho đến nay, nhiều tổ hợp Bạch đàn lai có sinh trưởng

vượt trội hơn bố mẹ đã được công nhận giống tiến bộ khoa học kỹ thuật và được khuyến

khích gây trồng rộng rãi.

Dân số thế giới đã đạt đến con số kỷ lục 7 tỷ người và nó được dự đoán sẽ tăng lên

8 tỷ người vào năm 2025 và 10 tỷ người vào những năm 2050. Do vậy vấn đề cung cấp

lương thực cũng như các nguyên vật liệu khác cho nhu cầu sinh hoạt của con người trong

những thập niên tới là một thách thức rất lớn đối với toàn nhân loại. Các phương pháp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chọn giống truyền thống sẽ khó có thể đáp ứng nhu cầu cung cấp thực phẩm cho con

người trong tương lai. Để đáp ứng được nhu cầu đó, trong những thập kỷ vừa qua, công

nghệ sinh học đã đem lại những thành quả to lớn, đặc biệt là công nghệ biến đổi gen đã

đem lại một bước nhảy vọt không những trong việc tăng năng suất và chất lượng cây

trồng như tạo giống năng suất cao, chống bệnh sâu hại, chống chịu khí hậu lạnh, khô hạn

và thiếu nguồn dinh dưỡng, kháng thuốc trừ cỏ…mà còn cải thiện được môi trường như

giảm hàm lượng thuốc bảo vệ thực vật, giảm lượng phân bón….

Trong lĩnh vực Lâm nghiệp, cây biến đổi gen cũng đã được quan tâm nghiên cứu.

Trong những năm gần đây một số kết quả nghiên cứu chuyển gen cho một số loài cây

rừng như Bạch dương, Thông radiata, Liễu và Bạch đàn đã được tiến hành và thử nghiệm

thành công ở một số nước như Hoa Kỳ, Nhật Bản, Brasil, Chi Lê và Trung Quốc. Mục

đích chính cho nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp ở đây là chuyển một số gen liên

quan đến tăng sinh khối, chống chịu sâu bệnh và điều kiện khô hạn, giảm hàm lượng

lignin, tăng hàm lượng và độ dài sợi cellulose, mang lại lợi ích to lớn cho ngành công

nghiệp giấy cũng như cải tạo môi trường tại những vùng đất suy thoái thiếu chất dinh

dưỡng…

Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng rộng rãi hơn

cả, vì phương pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém nhưng lại mang lại hiệu quả cao (lượng

bản sao gen biến nạp ít tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn

thương tế bào). Hầu hết các nghiên cứu chuyển gen vào cây lâm nghiệp đã công bố đều

sử dụng vector trung gian là vi khuẩn A. tumefaciens (Chen và cs, 2001; Han và cs, 2000;

Vengadesan và cs, 2006;…) [17].

Ở cây rừng, một số tính trạng có giá trị kinh tế như tính chất gỗ (hàm lượng

cellulose, hàm lượng lignin, chiều dài sợi gỗ ...) và khả năng ra rễ... do nhiều gen

(polygene) quy định. Những gen này tùy từng giai đoạn phát triển của cây mà có ảnh

hưởng nhất định, tuy nhiên, trong đó có những gen chính (major genes) có ảnh hưởng lớn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đến biểu hiện tính trạng của cây.

Đối với tính trạng chiều dài sợi gỗ, các nhà khoa học đã xác định được một số gen

chính có ảnh hưởng đến tính trạng này, trong đó có gen EcHB1 (accession number:

AB458829). Gen EcHB1 được xác định là mã hóa cho nhân tố phiên mã HD-Zip class II

ở Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) và thường biểu hiện ở thân trưởng thành và tế bào

rễ. Các nghiên cứu cho thấy gen EcHB1 sau khi biến nạp vào cây Thuốc lá đã cho chiều

dài sợi gỗ dài hơn 1,2 lần so với đối chứng.

Xuất phát từ cơ sở trên tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chuyển gen tăng chiều dài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sợi gỗ (EcHB1) vào Bạch đàn lai phục vụ công nghiệp chế biến giấy”

CHƯƠNG 1

TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU

1.1. Tổng quan về Bạch đàn nói chung và Bạch đàn lai nói riêng

Bạch đàn (Ecucalyptus) là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), bộ Sim

(Myrtaces), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp Hai lá mầm (Dycotyledone). Tên Bạch

đàn Ecucalyptus lần đầu tiên được nhà thực vật học người Pháp Charles Louis L’Heritier

de Brutell đặt cho vào năm 1788. Từ đó đến nay đã có tới 600 loài và biến chủng đã

được mô tả và đặt tên, gần đây 500 loài đã được chấp nhận chính thức. Theo Boland và

cs (1987), Eldridge và cs (1993) chi Bạch đàn được chia làm 8 chi phụ. Trong đó, chi phụ

Symphyomyrtus có nhiều loài được sử dụng và trồng rừng đại trà như: E. camaldulensis,

E. urophylla, E. tereticornis, E. grandis… Bạch đàn có xuất xứ từ Australia và chỉ có 2

loài phân bố ngoài Australia là loài E. deglupta Blume và E. urophylla S.T. Blake.

Bạch đàn bao gồm nhiều loài khác nhau và là cây trồng rừng phổ biến trên thế giới.

Ước tính có trên 10 triệu ha Bạch đàn được trồng ở châu Á, Nam Mỹ, Nam Âu, Úc và

New Zealand. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophyllaST. Blake) và Bạch đàn grandis (E.

grandis) thuộc chi phụ Symphyomyrtus, họ Sim (Myrtaceae), là những loài cây gỗ lớn,

mọc nhanh, được trồng nhiều tại các nước nhiệt đới có nhiệt độ trung bình từ 24 – 280C.

Bạch đàn là cây thân gỗ lâu năm, mọc nhanh, cây trồng 5-6 năm tuổi thường có

chiều cao trên 7m và đường kính thân khoảng 9- 10cm. Cây Bạch đàn có cơ chế tự bảo

vệ nhờ một cơ quan dưới mặt đất gọi là “củ gỗ” và cơ chế phát triển nhanh nhờ chồi bất

định và búp phụ, do đó cây có khẳ năng thích nghi cao với nhiều loại lập địa và khí hậu

lại cho năng suất tương đối cao (18-20m3/ha/năm).

Trên thế giới Bạch đàn là cây trồng rừng sản xuất chính với diện tích ngày càng

được mở rộng. Theo số liệu công bố năm 2009, rừng trồng Bạch đàn năm 2009 đã đạt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

khoảng 19,5 triệu ha tại 3 châu lục lớn là Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Á-Thái Bình

Dương, Ấn Độ là nước có diện tích rừng trồng Bạch đàn lớn nhất thế giới, năm 2009 ước

tính có khoảng 3,9 triệu ha (Nguồn www.git-forestry.com).

Ở Việt Nam, cây Bạch đàn được người Pháp đưa vào gây trồng từ trước năm 1945,

song việc gây trồng Bạch đàn trên quy mô lớn mới chỉ được bắt đầu từ năm 1960 (Bùi

Thị Huế). Trong một thời gian ngắn, cây Bạch đàn đã phát triển mạnh mẽ và trở thành

một trong số các loài cây lâm nghiệp trồng rừng quan trọng của nước ta hiện nay.

Bạch đàn là nhóm cây được trồng rộng rãi ở nước ta, đặc biệt là các tỉnh miền

Trung và miền Nam. Đây cũng là cây trồng chủ yếu trên các đường nông thôn, các bờ

vùng, bờ thửa ở đồng bằng Bắc Bộ và đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả nghiên cứu và

gây trồng nhiều năm qua cho thấy nhiều loài Bạch đàn được nhập vào nước ta chỉ một số

loài sinh trưởng nhanh và có khả năng thích ứng lớn. Trong đó, đáng chú ý là các loài

Bạch đàn urô (E. urophylla), Bạch đàn tere (E. tereticornis) và Bạch đàn trắng (E.

camaldulensis), Bạch đàn liễu (E. exserta). Ở những nơi thấp Bạch đàn urô (E.

urophylla) có thể mọc lẫn với Bạch đàn trắng (E. alba) (Martin and Cossalater, 1975 -

1976). Bạch đàn urô là cây thích hợp với các lập địa có vùng đất sâu ẩm ở các tỉnh miền

Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Các xuất xứ có triển vọng nhất cho vùng trung tâm

miền Bắc là Lewotobi và Egor Flores (Lê Đình Khả, 1996). Egor Flores cũng là một

trong những xuất xứ có triển vọng nhất ở Mang Linh và Hang Hanh của vùng Đà Lạt (Lê

Đình Khả, 1996; Phạm Văn Tuấn và cs, 2000) [7][14].

Bạch đàn urô là một trong những loài Bạch đàn chính được trồng chủ yếu ở Việt

Nam (Nguyễn Đức Kiên, 2009). Tác giả đã chỉ ra rằng các tính trạng sinh trưởng và chất

lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu xuất bột giấy cho ngành công nghiệp. Các nghiên cứu

đánh giá về sinh trưởng của Bạch đàn urô tại Việt Nam cũng cho thấy tỷ lệ sinh trưởng

của Bạch đàn tại Việt Nam chậm hơn so với các nước khác như Trung Quốc, Braxin

(Santos, 1990; Wei và Borralho, 1998a; Nguyễn Đức Kiên, 2009). Vì vậy, các chương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trình chọn giống Bạch đàn ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng sinh trưởng, tuy nhiên

ở các vùng sinh thái suy thoái, nghèo chất dinh dưỡng, tỷ lệ sinh trưởng của Bạch đàn

vẫn tồn tại ở dạng sinh trưởng chậm so với nhiều nước khác. Do vậy, các định hướng

nghiên cứu làm tăng hiệu suất bột giấy và tăng khả năng sinh trưởng của cây Bạch đàn tại

các vùng sinh thái suy thoái và nghèo chất dinh dưỡng tại Việt Nam đã và đang được

quan tâm nghiên cứu.

Bạch đàn lai được đánh giá có ưu thế lai và sinh trưởng tốt hơn bố mẹ của chúng

(Lê Đình Khả và cs, 1993) [6]. Một số giống Bạch đàn lai có năng suất cao đã được chọn

và gây trồng rất thành công ở một số nước như Brasil và Công Gô. Tại đây, trên những

lập địa tốt và áp dụng kỹ thuật trồng thâm canh có thể đạt năng suất 40 - 80m3/ha/năm.

Trung Quốc và Philippin cũng tạo được một số giống Bạch đàn lai có năng suất cao và

đang được trồng làm nguyên liệu giấy.

1.2.Tình hình trồng và sinh trưởng Bạch đàn lai ở Việt Nam

Bạch đàn là một trong những nhóm cây đang được gây trồng rộng rãi ở nước ta.

Hiện nay Bạch đàn được coi là cây nguyên liệu giấy chủ yếu ở vùng trung tâm miền Bắc.

Các nghiên cứu trong nước về lai giống và sử dụng giống lai đang là hướng đi được

nhiều nhà chọn giống quan tâm. Nghiên cứu về giống lai tự nhiên giữa Bạch đàn trắng

(E. camaldulensis) với Bạch đàn đỏ (E. robusta) cho thấy giống lai có năng suất cao hơn

rất nhiều so với giống bố mẹ (Lê Đình Khả, 1970) [5]. Từ năm 1994, những nghiên cứu

về lai nhân tạo cho một số loài Bạch đàn đã được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu

Giống cây rừng và đã tạo được hàng chục tổ hợp lai thuận nghịch trong loài và khác loài

ở 3 loài Bạch đàn chính của nước ta là Bạch đàn urô (E. urophylla), Bạch đàn trắng (E.

camaldulensis) và Bạch đàn liễu (E. exserta). Qua khảo nghiệm đã chọn được 31 cây trội

trong 8 tổ hợp lai Bạch đàn có năng suất cao hơn giống sản xuất tốt nhất trên 30%.

Những giống này đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống

tiến bộ kỹ thuật và cho phép triển khai khảo nghiệm trên các vùng sinh thái khác nhau.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nghiên cứu lai giống Bạch đàn cũng cho thấy một số tổ hợp lai có hiệu suất bột giấy cao

hơn, trong lúc độ bền của giấy tương đương với các loài bố mẹ (Lê Đình Khả và Nguyễn

Việt Cường, 2001) [4].

Ở Việt Nam từ các năm 1996 – 2000, Trung tâm Nghiên cứu giống cây rừng thuộc

Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tạo được gần 80 tổ hợp lai trong loài và lai khác

loài giữa các loài Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla), Bạch đàn trắng (E.

camaldulensis) và Bạch đàn liễu (E.exserta).

Giai đoạn 2001-2010 nghiên cứu lai giống cho các loài bạch đàn đã tạo được trên

(E.tereticornis), Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) , Bạch đàn grandis (E. grandis), Bạch

100 tổ hợp lai đôi, ba cho các loài cho 7 loài bạch đàn là Bạch đàn urô, Bạch đàn tere

đàn saligna (E. saligna), Bạch đàn microcorys (E.microcorys), Bạch đàn pellita

(E.pellita). Sau 2 năm tại đất đồi trọc nghèo dinh dưỡng ở Cẩm Quỳ- Ba Vì- Hà Nội,

năng suất của các tổ hợp lai P18U29 đạt 17,3dm3/cây vượt mẹ (P18) là 316%, vượt bố

của chúng (U29) là 363% về thể tích, còn vượt giống lai đối chứng nhập từ Brasin GU8

là 160%. Tổ hợp lai U29S6 có thể tích thân cây đạt 16,62dm3/cây vượt thể tích của mẹ

(U29) là 349% và vượt giống lai đối chứng GU8 là 153%. Tại hiện trường Minh Đức-

Bình Phước sau 2 năm tổ hợp lai T1P17, C18P17, P18U29C3, P18U29 và C9G15 đạt thể

tích thân cây tương ứng là 26,1; 26,1; 22,8; 21,8 và 21 dm3/cây vượt giống đối chứng

PN14 tương ứng là 383%, 384%, 335%, 321% và 309% về thể tích (Nguyễn Việt Cường.

2006) [13].

Qua khảo nghiệm cũng đã chọn được 30 dòng bạch đàn lai có sinh trưởng nhanh

hơn các giống đối chứng PN2, PN14, U6 và GU8 ở hầu hết các điểm khảo nghiệm và có

thể tích thân cây vượt hơn giống đối chứng từ 110% đến 300% ở năm thứ 3. Một nghiên

cứu khảo nghiệm giống Bạch đàn lai tại lâm trường Vạn Xuân cho thấy trong các dòng

lai được chọn lọc có một số dòng sinh trưởng vượt trội so với dòng kiểm chứng U6,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

GU8, PN2, PN14 cả về đường kính, chiều cao và chỉ số thể tích thân cây, đặc biệt là

dòng lai UE24, UE83, UE5. Những dòng này có chỉ số thể tích bằng 70,4-73,9; trong khi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đó dòng GU8 có chỉ số thể tích là 50,3.

Trong một vài năm gần đây công ty trồng rừng Innov Green Quảng Ninh đã tiến

hành trồng rừng các giống Bạch đàn lai nhập từ Trung Quốc (giống lai giữa Bạch đàn urô

x grandis, Bạch đàn urô x tere, với tên gọi là Bạch đàn cự vĩ và vĩ hệ) với diện tích vài

trăm ha ở Quảng Ninh. Bạch đàn lai này có sinh trưởng nhanh hơn Bạch đàn U6 (Bảng

1.1)

Bảng 1.1. Sinh trưởng dòng Bạch đàn lai cự vĩ và vĩ hệ ở Quảng Ninh (2007-2009)

Kí hiệu IG01 IG02 IG03 IG04 U6

U x G G x U U x G U x T Uro Tên KH

(BĐ cự vĩ) (BĐ cự vĩ) (BĐ cự vĩ) (BĐ vĩ hệ)

Xã Quảng Xã Quảng Xã Quảng Xã Quảng Xã Quảng Nơi trồng

Sơn Huyện Sơn Huyện Sơn Huyện Sơn Huyện Sơn Huyện ( 2007 và

Hải Hà- QN Hải Hà- QN Hải Hà- QN Hải Hà- QN Hải Hà- QN 2008)

246 1,2 1,7 1 3,6 D.tích (ha)

1500 1500 1500 1500 1500 Mật độ

10,4 9,3 7,9 9,8 7,7 D13 (m)

(Nguồn: Innov Green Quảng Ninh) [12].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

12,5 12,1 9,0 12,8 7,6 Hvn (m)

1.3. Kỹ thuật chuyển gen thực vật

1.3.1 Khái niệm chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng

DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi

sinh vật, động vật,..) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào

bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc

trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen (Nguyễn Quang

Thạch và cs, 2005) [10].

Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng đi ̣nh tính khách quan tự nhiên củ a vâ ̣t chất di truyền: khả năng mã hó a cho các tính tra ̣ng nhất đi ̣nh, khả năng phiên mã, di ̣ch mã và khả năng di truyền. Thông qua chuyển gen, cách nhà sinh lý, hó a sinh và di truyền có thể nghiên cứ u các quá trình điều khiển, thể hiê ̣n và ảnh hưở ng củ a các yếu tố di truyền và ngoa ̣i cảnh lên hoa ̣t đô ̣ng củ a gen.

Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai

nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển

gen trực tiếp.

Phương pháp chuyển gen trực tiếp

- Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện

- Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm

- Phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn

- Chuyển gen nhờ súng bắn gen

- Chuyển gen nhờ silicon carbide

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Phương pháp chuyển gen gián tiếp

- Chuyển gen nhờ virus

- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.

Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm 1960 -

1970. Việc phát kiến ra Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) có khả năng chuyển

gen vào thực vật vào đầu những năm 1980 đã biến loài này trở thành một trong những

công cụ quan trọng nhất của Công nghệ sinh học (CNSH) thực vật với những ưu điểm

nổi trội: số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1 - 2

gen, trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn). Do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu

hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững hiệu quả chuyển gen cao;

tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm; kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện;

không đòi hỏi thiết bị đắt tiền.

Phương pháp này đã khắc phục được những hạn chế chủ yếu của các phương pháp

chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận được cây trông có nhiều bản sao của một gen

dẫn tới sự "nhiễu gen" và không bền vững của gen trong thực vật, tần số chuyển gen thấp,

kết quả có thể thu được những cây mang thể khảm nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí

trên cây...

Đặc biệt là khi nhược điểm của A. tumefaciens chỉ chuyển gen trên cây Hai lá mầm

được khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành hiện thực và được ứng

dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ngày càng

gây được sự quan tâm và dần trở thành một phương pháp chuyển gen được ưu tiên lựa

chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạo giống trên thế giới.

* Đặc điểm chung của vi khuẩn A. tumefaciens

Agrobacterium là các vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cây khi xâm nhiễm qua vết thương.

A. tumerfaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau đó sử dụng bộ

máy thực vật để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A.

tumerfaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những

nốt sần ở cây (bệnh mụn cây - crown gall disease), khi đó các tế bào khối u ở thực vật có

gắn một đoạn DNA từ vi khuẩn. Khi phân tích khối u cho thấy trong khối u có sự hình

thành một số vật chất như: nopaline, octopine gọi chung là opine. Các chất này không hề

có trước đó và không hề có ở cây trồng thông thường. Như vậy vi khuẩn đã truyền vào

cây qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây và tác nhận này có bản chất là vật chất

di truyền.

(Nguồn: http://www.wikipedia.org)

Hình 1.1. Sơ đồ Ti-Plasmit

Qua nghiên cứu người ta kết luận rằng tác nhân gây u này chính là Ti-plasmit có

trong vi khuẩn A.tumerfaciens.

Đây là một plasmit được cấu tạo bao gồm một phân tử DNA kép, vòng tròn lớn có

kích thước 200kb, có khả năng tái bản độc lập với sự tái bản của DNA nhiễm sắc thể của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

vi khuẩn.

Trên Ti-plasmit có đoạn T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ

trái (left border) có trình tự nucleotit tương tự nhau. T-DNA là đoạn nucleotit có kích

thước 25kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư (oncogenic gene), mã hóa cho một

enzyme liên quan tới tổng hợp các auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ 2 liên

quan tới tổng hợp opine. Đoạn này được gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì đây là đoạn sẽ

được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể và gây ra bệnh u. Trên Ti-

plasmit còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp

và tiêu hóa opine (Hình 1.1).

Khi cây bị nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt đầu hoạt

động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các

tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một

loại thức ăn, nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmit.

* Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn

Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất độc vết thương có bản chất phenol:

Cetosyringone và Hydroxyacetosyringone. Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào

vùng bị thương đồng thời chúng hoạt hóa các gen ở vùng Vir là E, D, C, G, B, A, F và

tạo ra các protein tương ứng. Các protein này có hai chức năng chính: cắt đứt bờ phải và

bờ trái để giải phóng đoạn T-DNA, bao bọc và vận chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực

vật và tiếp cận với genom cây chủ.

Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A.tumefaciens sang tế bào cây chủ được thực

hiện bởi hoạt động của các gen vir A, B, C, D, E, G, F (hình 1.4). Các gen này có vai trò

quan trọng trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua tín hiệu hóa học

Acetosyringone (AS). Tín hiệu hóa học được nhận biết đầu tiên bởi vir A. Gen vir A sẽ

tổng hợp nên một loại protein nằm trong màng tế bào để đáp ứng sự trao đổi chất của vết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thương trên cây. Protein vir A tự photphoryl hóa đồng thời làm cho protein vir G được

photphoryl hóa (Jin và cs., 2001) và kích hoạt sao mã của các gen vir B, C, E, F, G, H

(Ziemienowcz, 2001).

Hình 1.2. Quá trình chuyển T-DNA từ A. tumefaciens sang tế bào thực vật

Tiếp đó các protein được mã hóa bởi vir D, vir E thực hiện chức năng giải phóng

sợi T-DNA, protein D2 cắt T-DNA tại vị trí 5' của bờ phải và 3' của bờ trái và giải phóng

sợi T-DNA, protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzyme nuclease trong cây

(Deng và cs,. 1998). Đồng thời thực hiện chức năng này có các protein vir C1, vir C2 có

tác dụng tăng cường việc giải phóng T-DNA.

Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B đảm nhiệm. Vir B có chức năng tạo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi đơn T-DNA vào nhân tế bào. Đồng thời

protein vir B4, vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp năng lượng cho vận chuyển T-

DNA (Zhu và cs, 2000).

Như vậy thực chất đã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn đất vào cây trồng

tồn tại trong tự nhiên.

1.3.2. Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn chuyển gen

Đến nay trên thế giới, phương pháp chuyển gen vào Bạch đàn phổ biến nhất được

sử dụng là chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (Chirqui và cs, 1992;

Spokevicius và cs, 2005; Mullins và cs, 1997; Machado và cs, 1997; Spokevicius, 2005)..

Các phương pháp khác có được thử nghiệm nhưng rất hạn chế: Chuyển qua xung điện

(Teuliers và cs, 1991; Manders và cs, 1992), súng bắn gen (Serrano và cs,1996; Sartoretto

và cs, 2002), siêu âm (Tournier và cs, 2003) [45].

Đối với Bạch đàn, một số gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin,

cellulose, tính chất gỗ cũng đã được xác định cho các loài Bạch đàn E.globulus (Poke và

cs, 2003) [36]; E. gunnii (Lauvergeat và cs, 2002); E. camaldulensis (Ho và cs, 2002)

[26]; E. grandis (Ranik và Myburg, 2006). Các gen liên quan đến tăng khả năng hấp thụ

lân cũng đã được phân lập từ Bạch đàn trắng (E. camaldulensis), trong số 5 gen được

phân lập thì chỉ có 2 gen có khả năng làm tăng độ hấp thụ lân trên cả điều kiện nghèo và

giàu lân (Koyama và cs, 2006). Các gen mã hóa cho quá trình tổng hợp cellulose

(cellulose synthase CesA gene) đã được phân lập và nghiên cứu (Myburg và cs, 2008).

Bảy gen mã hóa sinh tổng hợp cellulose đã được phân lập từ Bạch đàn grandis các gen

này được cho là đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất cellulose về chất lượng

cũng như độ dài sợi gỗ.

Chuyển gen Bạch đàn đã được thực hiện từ những năm 1990 cho nhiều loài Bạch

đàn như E. gunnii, E. globus, E. camaldulensis, E. nitens vv. (Girijashankar, 2011) và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chủ yếu tập trung cho các tính trạng về tăng sinh khối, thay đổi tính chất gỗ (thay đổi hàm

lượng lignin, cellulose), chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn hán, lạnh,

nhiễm mặn…) và sâu bệnh hại.

Một số công trình nghiên cứu về chuyển gen trên đối tượng Bạch đàn urô và các

loài lai của nó đã được công bố trên thế giới. Năm 2002, Shao và cs đã công bố kết quả

chuyển gen trên đối tượng E.urophylla thu được dòng kháng Pseudomonas solanasearum

tăng 35% [41]. Năm 2003, Tounier và cs đã thu được 9 dòng E.grandis x E.urophylla

giảm hoạt tính của CAD từ 69 – 78%, từ đó làm giảm quá trình sinh tổng hợp lignin. Một

nghiên cứu khác của Kwasu và cs được tiến hành vào năm 2003 trên đối tượng E.grandis

x E.urophyllac thử nghiệm chuyển gen mtCS từ Cà rốt đã thu được những dòng chuyển

gen thích ứng được với điều kiện đất bị chua do cải thiện kênh dẫn truyền photphat vô cơ

trên loại lập địa này. Năm 2003- 2004, Shani và cs đã đã tạo thành công 25 dòng cây

Bạch đàn camal và grandis chuyển gen Cbd và cel1 là 2 gen mã hoá cho cellulose trong

chu trình sinh tổng hợp cellulose. Kết quả nghiên cứu cho thấy 2 gen này biểu hiện hoạt

động mạnh hơn và dẫn đến việc phân chia tế bào trong cây nhanh hơn và các thành tế bào

được kéo dài hơn. Họ tiến hành chuyển gen này vào E. camaldulensis, E. grandis và các

dòng lai của nó.

Để tăng cường cho Bạch đàn chống chịu với các điều kiện bất lợi như khả năng

chịu lạnh, mặn, chua, khô hạn. Năm 2003, Yamada- Watanabe và cs đã chuyển gen chịu

mặn cod A từ Arthrobacter globiformis vào Bạch đàn. Công ty giấy Nhật Bản Oji paper

đã chuyển gen ti thể citrate synthetase vào Bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla nhằm

tăng cường khả năng hấp thu phosphate vô cơ trong môi trường đất chua. Theo Kondo và

cs, 2003 [31]; Ishige và cs, 2004 đã chuyển gen dreb1 vào Bạch đàn nhằm tăng khả năng

chịu hạn hán cũng như chịu mặn.

Tại Việt Nam, nghiên cứu tạo giống Bạch đàn chuyển gen vẫn còn khá mới mẻ và

phát triển chậm. Một số thử nghiệm bước đầu đang được tiến hành, tuy nhiên tính cho

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đến nay vẫn chưa có kết quả nào được công bố.

1.4. Gen mục tiêu EcHB1

1.4.1. Vai trò của nhân tố phiên mã trong sinh trưởng của thực vật

Nhân tố phiên mã (transcription factors) là những protein được gắn vào điểm đặc

biệt của trình tự ADN và kiểm soát sự phiên mã của gen. Nhân tố phiên mã thực hiện

chức năng của mình bằng cách tăng cường hoạt hóa hoặc kìm hãm tốc độ phiên mã của

RNA tại vùng bắt đầu phiên mã của gen (Ruan, 2013) [38].

Nhân tố phiên mã có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phá triển của

sinh vật vì nó đảm bảo các gen được biểu hiện trong tế bào vào đúng thời điểm và đúng

số lượng trong cơ thể sinh vật. Nó có vai trò trong việc bật/tắt sự phiên mã của các gen

thích hợp để làm thay đổi quá trình trao đổi chất trong sinh vật, quá trình biệt hóa tế bào

vv.

Đã có 53.319 nhân tố phiên mã thuộc 58 nhóm (family) được tìm thấy ở 49 loài

thực vật, trong đó gồm 9 loài tảo, 1 loài rêu, 3 loài cây hạt trần và 35 loài cây hạt kín

(Zhang và cs, 2011) [48].

Protein HD-Zip là nhân tố phiên mã có trong các loài thực vật. HD-Zip có cấu tạo

gồm miền ADN có chức năng liên kết chặt chẽ với motif khóa kéo leucine (leucine

zipper motif) trong việc hình thành dimmer. Hai chuỗi polypeptide ở khóa kéo leucine

được giữ với nhau bởi tương tác kỵ nước giữa acid amin leucine và sự lồng vào của 2

vòng xoắn α. Đây là loại homeodomain (miền đồng hình) chỉ có mặt trong thực vật và

được coi là gen HD-Zip có nguồn gốc từ thực vật bằng cách trao đổi giữa một gen exon

của miền đồng hình với một chuỗi khóa kéo leucine (Schena và Davis, 1994) [40].

Protein HD-Zip bao gồm 4 phân nhóm (từ I đến IV) dựa trên 4 đặc điểm: (1) sự bảo

thủ của domain HD-Zip mà xác định vị trí ADN gắn kết, (2) cấu trúc gen, (3) các motif

bảo thủ phụ thêm (additional conserved motif) và (4) chức năng (Haake và cs, 2002)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

[27].

Mỗi một nhân tố phiên mã kiểm soát sự họat động và phát triển của một vùng thực

vật đặc biệt. Nhân tố phiên mã ATHB5 thuộc HD-Zip phân nhóm I có chức năng kiểm

soát sự hình thành trụ dưới lá mầm và kéo dài rễ sơ cấp (Johannesson và cs, 2001),

ATHB2 thuộc HD-ZIP phân nhóm II có chức năng kiểm soát việc kéo dài tế bào liên

quan đến chất lượng ánh sáng (Carabelli và cs, 1996), ATHB8 thuộc phân nhóm III có

chức năng kiểm soát sự phát triển của tượng tầng trong quá trình biệt hóa tế bào (Baima

và cs, 1995), ATHB10/GLABRA 2 thuộc phân nhóm IV có chức năng kiểm soát sự biệt

hóa các dạng khác nhau của tế bào trichomes trên lá và thân, và tế bào lông rễ (Di

Cristina và cs, 1996) [21].

Nhiều nhân tố phiên mã chỉ hoạt động khi có sự thay đổi của điều kiện sống.

Nghiên cứu trên cây Arabidopsis cho thấy nhóm nhân tố phiên mã CBF/DREB1 chỉ hoạt

động trong điều kiện lạnh, nhân tố phiên mã CBF4 hoạt động trong điều kiện hạn và các

nhân tố phiên mã này hoạt động để thúc đẩy sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính

chống chịu với điều kiện bất lợi này (Haake và cs, 2002) [25].

1.4.2. Nhân tố phiên mã EcHB1

Năm 2009, Sonoda và cộng sự đã phân tích biểu hiện của các gen nhân tố phiên mã

trong mô gỗ Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) bằng kỹ thuật microsarray và đã

phân lập được 21 gen nhân tố phiên mã liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin và

cellulose và các gen này thuộc nhóm HD-Zip phân nhóm II.

Gen EcHB1 – nhân tố phiên mã liên quan đến việc hình thành và phát triển sợi gỗ

đã được phân lập từ các nhóm gen nhân tố phiên mã trên Bạch đàn trắng (Eucalyptus

camaldulensis) và vai trò của gen này đã được đánh giá thông qua việc phân tích biểu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hiện của gen

Hình 1.3. Trình tự gen EcHB1 được tách dòng từ Bạch đàn E. Camaldulensis

Bằng phương pháp phân tích RT-PCR cho thấy gen EcHB1 này biểu hiện ở thân

thành thục 5 tuổi (mature stem) và mô rễ (1 tuổi) của Bạch đàn trắng.

Sử dụng kỹ thuật microarray cho thấy ở Bạch đàn biến nạp gen E. camaldulensis

chiều dài sợi gỗ (EcHB1), biểu hiện của các gen chính liên quan đến quá trình sinh tổng

hợp lignin như CCoAOMT, CAD, CCR và C4H đều giảm (Sonoda và cs, 2009) [42]. Điều

này cho thấy việc tăng cường hoạt động của gen EcHB1 có ảnh hưởng đến quá trình hình

thành xylem trong cây.

Gen EcHB1 có trình tự như sau: (GenBank: AB458829.1)

1 atgtgccctatcgattcgggccgctccttcgacacgagccttagtctcggtttaggctgt

61 tatggggatcctgaagatcacgagatcaagatcaagaaaccgctcgcgaagctcagtggt

121 aactccacgtgcctcacgataggcttgcccggcggggaggcgtgcggctgggatccgcg

181 agtggggacgaggtcaggaacatcccgagcaggtcggcatcgtcgttctcaaactcaagc

241 agtgcgaagagggagaaggcggagcaaggagaggaagaagcggttgagagagggacgggc

301 tcgccgagggcgactatcaatatcgaagatgaagatgagttcagccccaggaagaagctc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

361 aggctttctaaagcacaaagttccattttggaagagagcttcaaagcgcacacaaccctc

421 aacactaaacaaaagcacgatttggcaaatcggttgaatctccggccacggcaagtggaa

481 gtgtggttccagaataggagagccaggactaaattaaaacaaactgaagtagagtgcgag

541 atgctgaagaaatgctgcgaaaccctaaaagaagagaacagaaggttgaagaaggagttg

601 caagagctcaactcattgaagccaactgcgtcggtttataggcagattcctgcagctgct

661 ctccctctatgcccttcttgtgaaaggattgcccatccagaattcccgttctcgactgaa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

721 tctcgactttggcctgctcatccatcagccgcttgttaa

CHƯƠNG 2

MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu

Tạo được dòng Bạch đàn lai mang gen tăng chiều dài sợi gỗ ( EcHB1)

2.2. Đối tượng

Cây Bạch đàn lai trội UU dòng 89 được Viện Giống và Công nghệ sinh học Lâm

nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp.

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (GV3101) có chứa vector nhị thể

(pGWB2) mang gen làm tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) được phòng thí nghiệm tại Viện

Nghiên cứu RIKEN (Nhật Bản) cung cấp.

2.3. Nội dung

- Xác định các điều kiện phù hợp cho tái sinh từ nguồn vật liệu được tuyển chọn

- Nghiên cứu chuyển gen EcHB1

- Xác định sự có mặt của gen EcHB1 trong cây chuyển gen (chọn lọc kháng sinh,

Kỹ thuật PCR).

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Vật liệu nghiên cứu

2.4.1.1. Mẫu nghiên cứu

Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu là đoạn thân, cây Bạch đàn invitro từ cây Bạch

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đàn lai trội UU89

2.4.1.2. Vật liệu chuyển gen

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (GV3101) có chứa vector nhị thể

(pGWB2) và gen làm tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1).

Hình 2.1. Cấu trúc vector pGWB2 chứa gen EcHB1

2.4.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng

- Thiết bị: bao gồm các loại box cấy vô trùng; nồi khử trùng; máy nước cất một lần,

hai lần; máy đo pH; máy đo OD; máy PCR; máy điện di; máy chụp ảnh gel; tủ ấm; tủ lắc;

dàn nuôi cấy và một số dụng cụ, thiết bị và máy móc khác của các hãng: Nuaire, Wealtec,

Amerex, AB, Hoirba, Hettech, Sartorius, Olympus,...

- Hóa chất:

+ Môi trường sử dụng để nuôi cấy mô, tế bào cây Bạch đàn urô là môi trường MS

cơ bản (Murashige và Skoog 1962); các chất điều hòa sinh trưởng: Benzyl amino purine

(BAP), Kinetin (K), Indol-3-butyric acid (IBA) và Naphthyl acetic acid (NAA); các chất

kháng sinh như: Kanamycin, Cefotaxim và Hygromycine... được cung cấp bởi các hãng:

New England Biolabs (Anh), Amerham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals

(Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan).

+ Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm là môi trường

nuôi cấy LB (Luria and Betani)

2.4.3. Địa điểm bố trí thí nghiệm

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Nghiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cứu giống và CNSH Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.

2.4.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.4.1. Xác định các điều kiện phù hợp cho tái sinh từ nguồn vật liệu được tuyển

chọn

 Tạo mẫu Bạch đàn invitro

Đoạn thân của các dòng Bạch đàn lai UU89 được thu thập, cắt bỏ lá, được rửa dưới

vòi nước chảy khoảng 5 phút, sau đó được rửa sạch lại bằng nước cất đã khử trùng và

được khử trùng bằng HgCl2 0,1% với thời gian khử trùng là 3 phút, 5 phút, 7 phút, 9

phút, 11 phút. Cuối cùng là rửa sạch mẫu bằng nước cất đã khử trùng. Sau đó được nuôi

trong môi trường MS cơ bản bổ sung thêm đường 8g/l, pH= 5.8, nuôi dưới ánh đèn Neon,

có cường độ sáng 2500 lux với thời gian 12 giờ sáng/12 giờ tối.

 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

Chồi Bạch đàn invitro được cắt thành các đoạn nhỏ có chiều dài 1-1,5cm với 2-4

nách lá. Mẫu được cấy trên môi trường tạo đa chồi có thành phần:

Bảng 2.1. Thành phần môi trường nhân nhanh chồi

CT TN BAP (mg/l) NAA (mg/l)

ĐC 0 0

CT1 0.5 0.1

CT2 1 0.1

CT3 0.5 0.3

CT4 1 0.3

CT5 0.5 0.5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CT6 1 0.5

Các đoạn chồi được nuôi trong tối với thời gian 1 tuần, sau đó được nuôi trong điều

kiện chiếu sáng 16giờ/ngày, nhiệt độ phòng nuôi 25oC ± 2oC. Cường độ chiếu sáng 2500

lux.

Chỉ tiêu đánh giá: HSNC, chất lượng chồi.

 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi

Đoạn thân cây in-vitro được cắt thành các đoạn nhỏ có chiều dài 5-10mm (không

có mắt ngủ). Mẫu được cấy trên các công thức môi trường tái sinh (CT1 – CT16):

Bảng 2.2. Thành phần môi trường tái sinh

CT TN BAP (mg/l) K (mg/l) NAA (mg/l)

0 0 ĐC 0

CT1 0.1

CT2 0.3

CT3 0.5

CT4 0.7

CT5 1

CT6 1.5

CT7 0.3 0.2

CT8 0.5 0.2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CT9 0.7 0.2

CT10 1 0.2

CT11 1.5 0.2

CT12 0.3 0.2

CT13 0.5 0.2

CT14 0.7 0.2

CT15 1 0.2

CT16 1.5 0.2

Thí nghiệm được đặt trong điều kiện ánh sáng 2000 lux

Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi và chất lượng

chồi.

 Ảnh hưởng của NAA, ABT và IBA đến khả năng ra rễ

Chồi Bạch đàn invitro có chiều cao từ 3-5cm gồm 4- 6 nách lá được cấy trên môi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trường tạo rễ có thành phần:

Bảng 2.3. Thành phần môi trường ra rễ

CT TN IBA (mg/l) NAA (mg/l) ABT (mg/l)

ĐC 0 0 0

CT1 0.5 0.5

CT2 1 0.5

CT3 1.5 0.5

CT4 2 0.5

CT5 0.5 0.5

CT6 1 0.5

CT7 1.5 0.5

CT8 2 0.5

CT9 2 1

CT10 2 1

Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trên chồi, chất lượng rễ

2.4.4.2. Chuyển gen vào cây Bạch đàn lai UU89 thông qua vi khuẩn A.tumefaciens.

 Tạo vật liệu trước khi chuyển gen

Thân cây Bạch đàn UU89 in vitro được cắt thành các đoạn nhỏ có chiều dài từ 0,5 -

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1cm (không có mắt ngủ). Mẫu sau khi cắt được ngâm trong dịch huyền phù để lây nhiễm.

 Tạo dịch huyền phù

- Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: lấy khuẩn A. tumefaciens chủng

GV3101/pGWB2/EcHB1 được bảo quản trong Glycerol ở -80oC, cấy trải khuẩn trên môi

trường LB đặc bổ sung 50mg/l Kanamycin. Nuôi khuẩn ở nhiệt độ 28oC trong 2 ngày.

- Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: chọn một khuẩn lạc cho vào 10ml môi trường LB

lỏng bổ sung 50mg/l Kanamycin. Nuôi lắc 200v/p, ở nhiệt độ 28oC trong vòng 14 - 16

giờ. Sau đó hút 5ml dịch vi khuẩn cho vào 50ml LB lỏng. Nuôi lắc 200v/p, ở nhiệt độ

28oC, trong 4 - 5 giờ. Dịch vi khuẩn được ly tâm lạnh ở tốc độ 5.000v/p, trong 10 phút,

rồi loại bỏ dịch nổi thu cặn vi khuẩn. Hòa tan cặn vi khuẩn trong dung dịch 1/2 MS lỏng

để thu được dịch huyền phù vi khuẩn với OD600 0,5 - 0,8. Dịch huyền phù vi khuẩn

này được dùng để biến nạp gen.

 Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy

Mẫu sau khi xử lý, chuẩn bị cho biến nạp như mục 2.4.4.1 được ngâm trong dung

dịch huyền phù vi khuẩn với thời gian 30phút. Sau đó thấm khô mẫu bằng giấy thấm vô

trùng. Chuyển mẫu sang môi trường nuôi cấy cộng sinh (thành phần môi trường phụ

thuộc vào thí nghiệm tái sinh trên). Môi trường nuôi cộng sinh được bổ sung thêm

Acetosyringone (AS) với nồng độ 200µM. Nuôi cấy cộng sinh ở nhiệt độ 25oC, được

nuôi trong buồng tối các khoảng thời gian 48 giờ.

 Diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen

Các mẫu sau khi đồng nuôi cấy, được rửa bằng nước cất vô trùng 2 lần. Sau đó

ngâm mẫu trong dung dịch ½ MS có bổ sung 500mg/l kháng sinh Cefotaxim trong 10

phút, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng. Thấm khô mẫu, chuyển lên môi trường nuôi

diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen.

Môi trường diệt khuẩn và tái sinh có bổ sung kháng sinh Cefotaxim với nồng độ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

500mg/l và chất chọn lọc là kháng sinh Kanamycin để chọn lọc chồi chuyển gen. Sau 4

tuần nuôi cấy, các chồi phát triển được chuyển vào môi trường ra rễ có bổ sung 500mg/l

Cefotaxim và Kanamycin. Sau 4 tuần nghiệm thu kết quả xác định số mẫu cấy tái sinh/

mẫu cấy ban đầu, số chồi tái sinh/ tổng số mẫu cấy ban đầu.

 Xác định ngưỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin cho quá trình tái

sinh

Mẫu sau khi được diệt khuẩn như trên được cấy chuyển sang môi trường tái sinh có

bổ sung thêm 500mg/l Cefotaxim và nồng độ chất chọn lọc Kanamycin khác nhau:

0mg/l, 50mg/l, 100mg/l, 150mg/l, 200mg/l, 250mg/l. Sau 4 tuần nuôi cấy đếm mẫu sống

và xác định tỷ lệ mẫu sống ở mỗi công thức thí nghiệm.

 Xác định ngưỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin cho qúa trình ra rễ

Chồi Bạch đàn sau khi được tái sinh và chọn lọc ở trên có chiều cao 3- 5cm với 4-

6 nách lá. Mẫu được cấy trên môi trường tạo rễ ở mục 2.4.4.1 có bổ sung thêm 500mg/l

Cefotaxim và nồng độ chất chọn lọc Kanamycin khác nhau: 0mg/l, 50mg/l, 100mg/l,

150mg/l. Sau 4 tuần nuôi cấy, đếm số mẫu ra rễ, xác định tỷ lệ mẫu ra rễ ở mỗi công thức

thí nghiệm.

2.4.4.3. Kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 bằng PCR

Sau khi cây chuyển gen ra vườn được 3 tháng tuổi thu lá và kiểm tra sự có mặt của

gen EcHB1.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

+ Phương pháp tách chiết ADN

Bảng 2.4. Thành phần dung dịch đệm tách chiết

STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng Thể tích (ml)

1 Tris-HCl, 1M, pH= 8 0,1M 2,0

2 NaCl 5M 1,4M 5,6

3 EDTA 0,5M 0,02M 0,8

4 CTAB 2% 0,4

5 11,2 H2O

20 Tổng thể tích

Quy trình:

B1: Cân 200mg mẫu và nghiền cẩn thận trong Nitơ lỏng bằng cối chày sứ cho đến

khi thành dạng bột mịn.

B2: Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách chiết ADN và trộn đều bằng cách đảo

ngược nhẹ.

B3: Ủ ở nhiệt độ 65oC khoảng 1 giờ (cứ 5’đảo nhẹ 1 lần)

B4: Thêm 600µl dung dịch Chloroform: Isoamyl (24:1) và đảo đều, để 5’ ở nhiệt độ

phòng.

B5: Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 vòng/phút, ở 4oC, trong 5’. Dùng pipet hút

lấy 500µl dịch nổi sang ống Eppendorf 1,5ml, ủ vào đá.

B6: Thêm 500µl Isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15’. Ly tâm hỗn hợp với tốc

độ 13000 vòng/phút, ở 4oC, trong 10’.

B7: Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, rửa ADN kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70%

(1 lần). Ly tâm 13000 vòng/phút và làm khô ADN kết tủa ở đáy ống Eppendorf.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

B8: Thêm 50µl nước khử ion và 2l RNAse, ủ ở 37oC trong 30’.

B9: Bảo quản ADN tổng số ở -20oC.

+ Kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân một đoạn gen EcHB1 có chiều dài

759bp. Trình tự cặp mồi:

EcHB1-F: 5’-CACCACGCGTGATATCATGTGCCCTATCGAT - 3’

EcHB1-R: 5’- GGGTCGACTTAACAAGCGGCTGAT - 3’

Chu kỳ nhiệt: - 940C trong 4 phút.

- 940C trong 1 phút, 550C trong 1 phút; 720C trong 1 phút lặp lại 30

chu kỳ.

- 720C trong 7 phút, giữ sản phẩm ở 40C.

Bảng 2.5. Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng PCR

TT Thành phần Nồng độ(µl)

1 16 H2O cất 2 lần deion

2 10X PCR buffer 2,5

3 dNTP 2,5

4 Taq polymerase 1

5 Mồi EcHB1-F 1

6 Mồi EcHB1-R 1

7 ADN khuôn 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Tổng thể tích 25

ADN khuôn được tách chiết từ lá của các dòng cây Bạch đàn chuyển gen ngoài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

vườn ươm.

2.4.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại; các bình thí

nghiệm được đặt trong tủ tối hoặc trên giàn đèn có cường độ ánh sáng 2000 lux, chu kỳ

16 giờ sáng, 8 giờ tối tùy theo thí nghiệm. Nhiệt độ phòng nuôi cấy điều chỉnh ở mức 26

± 2oC. Số liệu được thu thập, xử lý tính toán theo phương pháp phân tích thống kê toán

học. Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính sử dụng hàm thống kê Anova

để phân tích phương sai một nhân tố và hai nhân tố với ba lần lặp.

2.4.6. Các chỉ tiêu theo dõi

 Mẫu sống

Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100

 Mẫu ban đầu

 Mẫu nhiễm

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x 100

 Mẫu ban đầu

 Mẫu nảy chồi

Tỷ lệ mẫu bật chồi hữu hiệu (%) = x 100

 Mẫu sống

 Số chồi mới tạo thành

Hệ số nhân chồi (lần) =

 Số chồi của mẫu

 Chồi đủ tiêu chuẩn cho ra rễ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) = x 100

 Chồi tạo được

 Chồi ra rễ

Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = x 100

 Chồi nuôi cấy

 Số rễ

Số rễ trung bình (cái/cây) =

 Chồi ra rễ

 Mẫu tạo mô sẹo

Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) = x 100

 Mẫu nuôi cấy

 Mẫu tái sinh chồi

Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) = x 100

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

 Mẫu biến nạp

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định các điều kiện phù hợp cho tái sinh từ nguồn vật liệu được tuyển chọn

3.1.1. Tạo mẫu Bạch đàn lai trội UU89 sạch in -vitro

Tạo mẫu sạch là giai đoạn đầu tiên của quá trình nuôi cấy in-vitro và có vai trò

quan trọng nhằm cung cấp nguồn vật liệu sạch cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.

Yêu cầu của giai đoạn này là thu được mẫu có tỷ lệ mẫu sạch cao.

Hiện nay, phương pháp hóa học được sử dụng phổ biến để vô trùng mẫu cấy.

Những hóa chất có tác dụng diệt khuẩn hay được dùng phổ biến trong nuôi cấy mô tế bào

thực vật như: NaClO, Ca(OCl)2, HgCl2, H2O2, AgNO3, các chất kháng sinh…

Để các hóa chất diệt khuẩn có thể xâm nhập và bám dính tốt hơn trên bề mặt mẫu

cấy, một số hóa chất có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt thường được bổ sung thêm

vào các dung dịch khử trùng như: Tween 20, Tween 80,..hoặc xử lý bằng cồn 70% phối

hợp với các hóa chất diệt khuẩn. Tùy loài cây mà ta lựa chọn loại hóa chất ở nồng độ và

thời gian phù hợp.

Nhìn chung một loại hóa chất được lựa chọn cho quá trình vô trùng mẫu cấy phải

đảm bảo 2 thuộc tính: có khả năng diệt vi sinh vật cao, không hoặc có mức độ độc tính

thấp đối với mẫu cấy. Bên cạnh đó phải đảm bảo được tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu sống

và tỷ lệ bật chồi hữu hiệu cao. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm

với các công thức thí nghiệm khác nhau với HgCl2, kết quả được trình bày trong bảng 3.1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

dưới đây :

Bảng 3.1. Kết quả khử trùng tạo mẫu sạch in-vitro

Thời gian Tỷ lệ Tỷ lệ sạch Tỷ lệ bật chồi Hóa chất (phút) mẫu nhiễm bệnh hữu hiệu

3 45.76 54.5 67.6 HgCl2

0,1% 5 14.84 85.2 74.8

7 16.10 83.7 65.5

9 16.01 83.6 61.6

11 21.31 78.7 31.8

Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian khử trùng khác nhau có ảnh hưởng khác

nhau về các chỉ tiêu: mẫu nhiễm, chết, mẫu sạch bệnh, mẫu bật chồi. Ở công thức khử

trùng 5 phút, 7 phút, 9 phút cho tỷ lệ sạch bệnh tương đương nhau. Tuy nhiên tỷ lệ bật

chồi hữu hiệu ở các công thức khử trùng lại khác nhau. Với thời gian khử trùng 5 phút

cho tỷ lệ bật chồi hữu hiệu cao nhất (74,8%).

Với nồng độ HgCl2 1%, ở các công thức khử trùng cho thấy thời gian khử trùng

tăng lên thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm; tuy nhiên tỷ lệ bật chồi hữu hiệu cũng thay đổi. Với

thời gian khử trùng 3 phút, 5 phút, 7 phút và 9 phút cho tỷ lệ bật chồi hữu hiệu lần lượt

là: 67,6% ; 74,6% ; 65,5% ; 61,6% ; 31,8%. Điều này cho thấy thời gian khử trùng có ảnh

hưởng trực tiếp đến khả năng bật chồi của mẫu. Nguyên nhân ở đây là do HgCl2 là một

chất khử trùng cực độc đối với tế bào, với thời gian khử trùng dài thì khả năng ngấm của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

muối HgCl2 vào tế bào nhiều hơn, dẫn đến tế bào bị nhiễm độc và mất khả năng bật chồi.

Lấy tỷ lệ bật chồi hữu hiệu làm chỉ tiêu so sánh theo tiêu chuẩn Bonferoni cho thấy

các công thức thí nghiệm trên có sai khác nhau có ý nghĩa.

Hình 3.1. Chồi bạch đàn lai bật chồi sau khi khử trùng

Như vậy khử trùng đoạn thân của Bạch đàn lai bằng HgCl2 0,1% với thời gian 5

phút cho tỷ lệ mẫu sạch nảy bật chồi cao nhất, đáp ứng đủ tiêu chuẩn cho các bước

nghiên cứu tiếp theo.

3.1.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

NAA là chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin có tác dụng kích

thích tạo rễ trong nuôi cấy mô thực vật. Tuy nhiên, khi bổ sung vào môi trường nhân

chồi, nó có thể kích thích quá trình phát sinh hình thái chồi do tỷ lệ auxin/cytokinin trong

môi trường nuôi cấy được tăng lên. Do đó để tìm ra tổ hợp giữa BAP và auxin thích hợp

cho nhân nhanh chồi phải tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

NAA đến HSNC.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

CT TN BAP (mg/l) NAA (mg/l) HSNC Chất lượng chồi

ĐC 0 0 1.27 ++

CT1 0.5 0.1 4.8 ++

CT2 1 0.1 4.5 +++

CT3 0.5 0.3 6.1 +++

CT4 1 0.3 4.4 +++

CT5 0.5 0.5 5.0 +++

CT6 1 0.5 4.4 +++

Ghi chú: - Chồi không phát triển

+ Chồi phát triển kém

++ Chồi phát triển ở mức độ trung bình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

+++ Chồi phát triển tốt

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

ĐC CT3

Hình 3.2: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

Trong thí nghiệm này chỉ tiêu HSNC đóng vai trò quyết định hệ số nhân chồi càng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cao thì số lượng chồi tạo ra càng nhiều .

Trong kết quả nghiên cứu này công thức thí nghiệm ĐC chỉ gồm môi trường MS

không bổ sung BAP và NAA thì có HSNC đạt 1,27 và chồi kém phát triển và yếu. Trong

CT1 thì có HSNC đạt khá cao là 4,8 chất lượng chồi tốt, chồi phát triển đồng đều nhưng

thấp. Ở CT2 HSNC đạt 4,5 và CT3 HSNC đạt rất cao là 6,1 và chồi phát triển tốt, mập,

thẳng và không phân nhánh. Khi tiếp tục thay đổi nồng độ BAP và NAA thì HSNC đã

thay đổi rất nhiều. Ở CT4, CT5, CT6 thì HSNC đạt tương ứng là 4,4; 5,0 và 4,4, chồi ở

các công thức này đều phát triển đồng đều nhưng phân nhiều nhánh.

Như vậy qua phân tích số liệu bảng 3.2 thì ở CT3 với nồng độ BAP 0,5mg/l và

NAA 0,3mg/l là môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi tạo nguồn vật

liệu cho quá trình chuyển gen.

3.1.3. Ảnh hưởng của BAP, K và NAA đến khả năng tái sinh chồi

Theo Vuglteke (1989) môi trường nuôi cấy mô bổ sung Cytokinin có tác dụng kích

thích tạo chồi. Trong đó BAP và Kinetin là những Cytokinin có hoạt tính sinh học cao

nên thường được sử dụng để thúc đẩy sự phân chia tế bào và phát triển chồi của các mô

nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu trước đây của Sung và cs (2003); Gorinova (2005); Gubis và

cs (2004) đều cho thấy khi phối hợp các Cytokinin như BAP và Kinetin và Zeatin với các

Auxin như NAA, IBA, 2,4D thì tác động phức hợp của chúng sẽ cho tỷ lệ tạo chồi cao

hơn so với khi sử dụng riêng rẽ từng chất [24].

Các lá mầm và thân mầm sau khi cắt thành những mảnh nhỏ được cấy lên các công

thức môi trường tái sinh (CT1 – CT16) và được nuôi dưới dàn đèn neon. Sau 4 tuần, kết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

quả thu thập và xử lý số liệu trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP, K và NAA đến khả năng tái sinh chồi

CT TN BAP (mg/l) K (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) Chất lượng chồi

- 0 0 ĐC 0 0

CT 1 0.1 17.22 +

CT 2 0.3 28.97 +

CT 3 0.5 43.54 ++

CT 4 0.7 53.19 ++

CT 5 1 59.22 ++

CT 6 1.5 46.54 ++

CT 7 0.3 46.90 ++ 0.2

CT 8 0.5 55.98 ++ 0.2

CT 9 0.7 63.82 +++ 0.2

CT 10 1 52.28 ++ 0.2

CT 11 1.5 42.41 ++ 0.2

CT 12 0.3 52.36 ++ 0.2

CT 13 0.5 71.82 +++ 0.2

CT 14 0.7 75.28 +++ 0.2

CT 15 1 62.25 +++ 0.2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CT16 1.5 48.65 +++ 0.2

Ghi chú: - Chồi không phát triển

+ Chồi phát triển kém

++ Chồi phát triển ở mức độ trung bình

+++ Chồi phát triển tốt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Biểu đồ 3.2. Chồi tái sinh trên các công thức môi trường

Hình 3.3: Ảnh hưởng của BAP, K và NAA đến khả năng tái sinh chồi

Từ bảng số liệu thu thập được ở bảng 3.2 cho thấy việc kết hợp BAP với nhóm

auxin NAA vào môi trường nuôi cấy đã thể hiện rõ hiệu quả tái sinh. Ở môi trường đối

chứng 100% các mẫu cấy không có khả năng tái sinh, còn trên các công thức môi trường

có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP, K và NAA đã cho hiệu quả tái sinh chồi khá

cao.

Trong các công thức nghiên cứu này thì hiệu quả tạo chồi và chất lượng chồi của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

các công thức là:

Từ công thức CT1 đến CT6 ta chỉ bổ sung thêm BAP vào môi trường nuôi cấy,

nồng độ BAP tăng dần từ 0,1mg/l đến 1,5mg/l ta thấy tỷ lệ tái sinh chồi đã tăng lên dần

từ 17,22% đến 59,22% và đạt múc cao nhất ở nồng độ 1mg/l. Nhưng khi tiếp tục tăng

nồng độ BAP lên 1,5 mg/l ở CT6 thì tỷ lệ tái sinh chồi lại giảm xuống còn 46,54% và

chất lượng chồi ở cả 6 CT này đều phát triển kém, không đồng đều và mảnh.

Từ CT7- CT11 ta bổ sung thêm vào môi trường BAP và 0,2mg/l K thì tỷ lệ tái sinh

đã có sự biến động. Khi tăng BAP từ 0,3mg/l- 0,7mg/l thì tỷ lệ tái sinh tăng từ 46,90%

đến 63,82% và đạt tỷ lệ cao nhất ở nồng độ 0,7mg/l và khi ta tiếp tục tăng nồng độ BAP

lên 1mg/l và 1,5mg/l thì tỷ lệ tái sinh đã giảm xuống từ 63,82% còn 42,41%. Chất lượng

chồi của các công thức này đều phát triển kém chỉ có ở CT9 thì chồi phát triển đẹp đồng

đều và mập.

Từ CT12 – CT16 ta bổ sung thêm vào môi trường BAP và 0,2mg/l NAA thì tỷ lệ

tái sinh đã có sự biến động rõ rệt. Khi tăng BAP từ 0,3mg/l- 0,7mg/l, tỷ lệ tái sinh tăng từ

53,36% đến 75,28% và khi tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 1,5mg/l, tỷ lệ tái sinh đã giảm

đáng kể xuống còn 48,65%. Chồi tái sinh từ công thức CT13- CT16 đều phát triển đồng

đều, mập và khỏe.

Như vậy, nếu xét các tiêu chí để đánh giá khả năng tái sinh chồi là tỷ lệ mẫu tái

sinh chồi và đặc điểm chồi tạo ra thì công thức CT14 là có ưu thế hơn cả. Tỷ lệ mẫu tái

sinh chồi đạt khá cao là 75,25% và những chồi tạo ra trên môi trường này phát triển

nhanh, đồng đều, chồi mập và khỏe như vậy sẽ cung cấp nguồn vật liệu tốt cho quá trình

ra rễ ở giai đoạn sau.

3.1.4. Ảnh hưởng của NAA, IBA và ABT đến khả năng ra rễ

Tạo cây ra rễ là giai đoạn cuối cùng của quá trình vi nhân giống với mục đích để

tạo câu con hoàn chỉnh với yêu cầu cây khỏe mạnh, có bộ rễ cứng cáp để có thể sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trưởng và phát triển tốt khi đưa ra ngoài vườn ươm hoặc vườn sản xuất.

Auxin là một phytohormon có tác dụng sinh lý đến quá trình sinh trưởng của tế

bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ. Ở giai đoạn này mục đích chính là

tạo rễ cho chồi nên sự có mặt cũng như nồng độ phù hợp của auxin cho từng đối tượng là

rất có ý nghĩa. IBA (3 - Indol Butyric Acid), IAA (Indol Acetic Acid), NAA (Napthyl

Acetic Acid), ABT là những chất kích thích sinh trưởng thường được dùng trong nuôi

cấy mô. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng kết hợp hai loại chất kích thích sinh

trưởng cho quá trình ra rễ của Bạch đàn. Các chồi Bạch đàn sinh trưởng, phát triển tốt có

chiều cao từ 3 - 4cm được cấy chuyển sang môi trường ra rễ (R1-R4) được nuôi dưới dàn

đèn neon. Sau 2 - 4 tuần nuôi thu thập và xử lý số liệu trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của NAA, IBA và ABT đến khả năng ra rễ

CT IBA NAA ABT Tỷ lệ Số rễ TB Chiều dài TB Chất

TN (mg/l) (mg/l) (mg/l) chồi ra rễ (%) (rễ/cây) của rễ (cm) lượng rễ

ĐC 0 0 0 13.3 1 1.3 +

CT1 0.5 0.5 46.7 1.9 1.7 +

CT2 1 0.5 60.0 2.7 2.0 ++

CT3 1.5 0.5 73.3 3.5 2.1 +++

CT4 2 0.5 70.0 3.2 2.4 +++

CT5 0.5 0.5 36.7 1.8 1.2 +

CT6 1 0.5 43.3 2.7 1.9 ++

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CT7 1.5 0.5 60.0 3.3 2.1 ++

2 0.5 53.3 3.4 2.1 CT8 ++

2 1 78.1 4.9 2.8 +++ CT9

2 1 66.7 4.2 2.5 CT10 ++

Ghi chú: - Rễ không phát triển

+ Rễ phát triển kém

++ Rễ phát triển ở mức độ trung bình

+++ Rễ phát triển tốt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của NAA, IBA và ABT đến khả năng ra rễ

Hình 3.4: Ảnh hưởng của NAA, IBA và ABT đến khả năng ra rễ

Qua số liệu bảng 3.4, ta thấy ở công thức môi trường đối chứng không có bổ sung

IBA, NAA và ABT thì tỷ lệ chồi ra rễ là thấp nhất (13,3%) và rễ mảnh, ngắn và bị thâm

đen. Từ CT1- CT4 và CT9 khi bổ sung thêm IBA và NAA vào môi trường thì tỷ lệ chồi

ra rễ đã tăng rất rõ rệt. Ở công thức môi trường CT1- CT4 tỷ lệ ra rễ đạt được tương ứng

là 46,7%; 60,0%; 73,3%; 70% số rễ/chồi là 1,9; 2,7; 3,5; 3,2 và ở CT9 khi tăng lên nồng

độ 2mg/l BAP và 1mg/l NAA R2 thì tỷ lệ chồi ra rễ tăng lên rất cao đạt 735,25 và số

rễ/chồi đạt là 4,9 và rễ tạo ra ở công thức này khỏe, dài, mập và trắng.

Từ CT5- CT8 và CT10 khi bổ sung thêm IBA và ABT vào môi trường thì tỷ lệ ra

rễ đạt tương ứng là 36,7%; 43,3%; 60%, 53,3% và 66,7% và chất lượng rễ của các công

thức này phát triển nhiều, dài và khá mập nhưng rễ bị sùi và hơi thâm đen.

Qua phân tích kết quả thu được ta thấy ở CT9 cho tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất và số lượng,

chất lượng rễ rất tốt. Ta có thể sử dụng công thức môi trường này trong việc nghiên cứu

ra rễ phục vụ quá trình tái sinh cây Bạch đàn cho quy trình chuyển gen.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.2. Nghiên cứu chuyển gen EcHB1

Lấy khuẩn lạc vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (GV3101) có chứa vector nhị

thể (pGWB2) và gen mang gen EcHB1 được nuôi phục hồi để thu dịch huyền phù phục

vụ cho nội dung chuyển gen.

Dịch huyền phù vi khuẩn thu được có giá trị đo OD600 = 0,5- 0,8 đủ điều kiện biến

nạp vào thân và lá mầm Bạch đàn.

Đoạn thân Bạch đàn được cho vào dịch huyền phù vi khuẩn với thời gian 30 phút,

sau đó được thấm khô trên giấy thấm vô trùng. Các mảnh thân được đồng nuôi cấy trong

tối 48h (Diwakar Aggarwal và cs, 2011; Prakash và cs, 2009; Ho và cs, 1998)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

[22][37][26].

3.2.1. Ảnh hưởng của kháng sinh Kanamycin tới khả năng sống của mẫu

Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu được rửa sạch vi khuẩn bằng dung dịch 500mg/l

Cefotaxime, thấm khô và cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi chọn lọc ở mục 3.1.2

Môi trường tái sinh này có bổ sung Kanamycin ở các nồng độ khác nhau và Cefotaxime

500mg/l (Bùi Văn Thắng và cs, 2013).

Mỗi loài cây có khả năng mẫn cảm với nồng độ Kanamycin khác nhau, vì vậy, nếu

nuôi mẫu trên môi trường Kanamycin quá cao sẽ làm mẫu bị chết, hoặc bị ức chế không

tái sinh. Ngược lại, nuôi trên môi trường có nồng độ kháng sinh thấp sẽ khó chọn lọc

được chồi chuyển gen. Vì vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xác định

ngưỡng nồng độ của kháng sinh Kanamycin để chọn lọc hiệu quả cây Bạch đàn chuyển

gen.

Một số báo cáo trước đây về tái sinh và chuyển gen cây Bạch đàn, nồng độ

Kanamycin được sử dụng phổ biến là ở nồng độ 50mg/l (Cheng và cs, 2006; Tounier và

cs, 2003; Kawazu và cs, 2003) [18][45] và 100mg/l (Kawazu và cs, 2003; Serrano và cs,

1997) [30]. Trong nghiên cứu này chúng tôi thử nghiệm các nồng độ từ 50mg/l đến

250mg/l. Sau 4 tuần nuôi cấy kết quả được trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của Kanamycin tới khả năng sống của mẫu

CT TN Kanamycin ( mg/l) Tỷ lệ mẫu sống sau 4 tuần (%)

ĐC 0 100.0

K1 50 89.5

K2 100 82.9

K3 150 68.6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

K4 200 24.8

K5 250 0.0

Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của kanamycin tới khả năng sống của mẫu

K4 ĐC

Hình 3.5: Ảnh hưởng của Kanamycin tới khả năng sống của mẫu

Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 cho thấy, Kanamycin có ảnh hưởng rõ rệt đến

khả năng sống sót, sinh trưởng, phát triển của các chồi Bạch đàn được nuôi cấy. Ngay

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nồng độ 50mg/l thì tỷ lệ mẫu sống chỉ còn 89,5% sau 4 tuần nuôi cấy và tỷ lệ này là

68,6% với nồng độ 150mg/l và còn 24,8% với nồng độ 200mg/l, khi nồng độ Kanamycin

250mg/l thì 100% mẫu đều chết. Theo Nguyễn Thị Thanh Nga và cs (2012) [11], ngưỡng

nồng độ chất chọn lọc phù hợp là khi nó loại bỏ được khoảng 90% các cây không chuyển

gen. Căn cứ vào kết quả trên, chúng tôi lựa chọn Kanamycin 200mg/l là ngưỡng chọn lọc

cho các dòng Bạch đàn chuyển gen.

3.2.2. Ảnh hưởng của kháng sinh Kanamycin tới khả năng ra rễ

Đối với cây Bạch đàn urô hoặc Bạch đàn lai thì nồng độ chất chọn lọc cho giai

đoạn đầu như tái sinh chồi được chọn lọc ở nồng độ cao: 200mg/l (Laudete và cs, 2002)

[32], 100mg/l (Kawasu và cs, 2003) [29]; trong khi chọn lọc ra rễ thường chỉ là 50mg/l

(Cheng và cs, 2006; Tounier và cs, 2003; kawasu và cs, 2003) [18][30][45]. Vì vậy trong

nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thử nghiệm bổ sung đánh giá khả năng ra rễ của chồi

Bạch đàn ở những thang nồng độ Kanamycin khác nhau để tìm ra nồng độ Kanamycin

thích hợp cho giai đoạn ra rễ tạo cây chuyển gen.

Các chồi Bạch đàn sinh trưởng, phát triển tốt có chiều cao từ 3 - 4cm được cấy

chuyển sang môi trường ra rễ ở mục 3.1.4 có bổ sung thêm Cefotaxime 500mg/l và nồng

độ Kanamycin khác nhau. Sau 4 tuần thu được kết quả như Bảng 3.6:

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của kanamycin tới khả năng ra rễ

CT TN Kanamycin(mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Chất lượng rễ

ĐC 0 71.43 +++

C1 50 27.62 ++

C2 75 12.38 ++

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

C3 100 4.76 +

C4 150 0 -

Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của Kanamycin tới khả năng ra rễ

100mg/l

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.6: Ảnh hưởng của Kanamycin tới khả năng ra rễ

Kết quả thu được trong bảng 3.6 cho thấy: CT TN đối chứng thì có tỷ lệ ra rễ rất

cao đạt 71,43% và rễ trắng, mập và dài nhưng khi nồng độ Kanamycin bổ sung vào môi

trường thì chất chọn này đã ức chế rất mạnh khả năng ra rễ. Ở công thức C1 nồng độ

Kanamycin là 50mg/l thì khả năng ra rễ của Bạch đàn bị ức chế rõ rệt, tỷ lệ ra rễ đã giảm

xuống chỉ còn 27,62% và rễ mảnh, ngắn và đầu rễ hơi thâm đen. Khi tiếp tục tăng nồng

độ Kanamycin lên 75mg/l thì tỷ lệ ra rễ đã giảm xuống là 12,38%.

Ở môi trường bổ sung 100mg/l Kanamycin thì gần như các mẫu cấy đều bị ức chế

bởi Kannamycin chỉ một vài mẫu mới ra rễ nhưng rễ rất mảnh, ngắn và thâm đen. Khi

nồng độ Kanamycin tăng lên 150mg/l thì các mẫu cấy bị ức chế hoàn toàn khả năng ra rễ.

Như vậy trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn Kanamycin nồng độ 100mg/l là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ngưỡng nồng độ thích hợp để chọn lọc cây chuyển gen ở giai đọan ra rễ cho Bạch đàn lai.

Sơ đồ: Các bước tạo cây Bạch đàn lai chuyển gen

Tóm tắt quy trình chuyển gen vào cây Bạch đàn lai trội UU89

Cây Bạch đàn UU89

Khử trùng HgCl2 0,1% - 5 phút

Cây Bạch đàn lai trội UU89 invitro

Nhân nhanh chồi

MS + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l NAA

Cắt đoạn thân 0,5- 1cm

Lây nhiễm trong 15 phút với chủng A. tumefaciens GV3101

Đồng nuôi cấy trên môi trường có AS

Rửa khuẩn, cấy lên môi trường tái sinh

MS + 0,7mg/l BAP + 0,2mg/l + 500mg/l Cefotaxim + 200mg/l Kanamycin

Cấy chuyển sang môi trường tạo rễ MS + 2mg/l IBA + 1mg/l NAA + 500mg/l Cefotaxim +150mg/l Kanamycin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 54

3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 bằng PCR

Các cây ra rễ trên môi trường ra rễ chọn lọc được thu mẫu lá để tách chiết AND

tổng số và chạy phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 với cặp mồi đặc hiệu

EcHB1-F: 5’-CACCACGCGTGATATCATGTGCCCTATCGAT - 3’ và EcHB1-R: 5’-

GGGTCGACTTAACAAGCGGCTGAT - 3’. Kết quả thu được:

Theo thứ tự: Đối chứng dương (plasmid), đối chứng âm (nước), cây WT (đối chứng), cây Bạch

đàn trắng, DNA ladder 1 kb, TG1, TG3, TG7, TG8, TG9, TG10, TG11, TG14, TG15, TG19, TG20,

TG21, TG31.

Hình 3.7: Sản phẩm kiểm tra PCR

Kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy có 10 dòng chuyển gen (TG3, TG7, TG8,

TG9, TG10, TG11, TG19, TG20, TG21, TG31) xuất hiện một băng duy nhất với kích

thước khoảng 759bp tương đương với kích thước của gen EcHB1, còn dòng cây đối

chứng thì không xuất hiện. Điều này chứng tỏ sự có mặt của gen EcHB1 trong 10 dòng

cây Bạch đàn chuyển gen.

Như vậy, kết quả bước đầu có thể khẳng định gen EcHB1 đã được chuyển thành

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

công vào cây Bạch đàn lai trội UU89.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

- Đề tài đã xác định các điều kiện và thành phần nuôi cấy phù hợp cho quá trình tái

sinh chồi, nhân tạo chồi và ra rễ.

Tái sinh chồi: Mẫu cấy được nuôi trên môi trường: MS + 0,7mg/l BAP + 0,2mg/l

NAA, tỷ lệ tái sinh chồi đạt 75,28%.

Nhân nhanh chồi: chồi tái sinh được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh chồi:

MS + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l NAA, HSNC đạt 6,1.

Ra rễ: Chồi được cấy trên môi trường ra rễ có thành phần: MS + 2mg/l IBA +

1mg/l NAA, tỷ lệ chồi ra rễ đạt 78,1%, 4,9 rễ/chồi.

- Đã xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình chuyển gen: Nồng độ kháng sinh

Kannamycin cho giai đoạn đầu chồi chuyển gen là 200mg/l và 100mg/l cho giai đoạn ra

rễ.

- Đã xác định sự có mặt của gen EcHB1 trong cây chuyển gen (chọn lọc kháng

sinh, Kỹ thuật PCR): Tiến hành chuyển gen EcHB1 vào cây Bạch đàn UU89 thu được

xác định được 10 dòng Bạch đàn UU89 chuyển gen cho kết quả dương tính khi kiểm tra

PCR.

4.2. Kiến nghị

- Tiếp tục đánh giá sự tồn tại và biểu hiện của gen biến nạp ở các dòng Bạch đàn lai

trội UU89 chuyển gen bằng các kỹ thuật lai Southern, lai Northern, lai Western. Chuyển

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

các dòng đã chuyển gen ra chăm sóc tại vườn ươm và đánh giá sự sinh trưởng của chúng.

- Sử dụng các kết quả đã tìm ra cho cây Bạch đàn lai UU để tạo cây Bạch đàn

chuyển gen mang các gen đích có giá trị khác.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TRONG NƯỚC

1. Hà Thị Hiền (2000) Nghiên cứu nhân giống sao đen (Hopea odorata roxb) bằng

phương pháp giâm hom. Luận văn thạc sỹ KH Lâm nghiệp,Trường ĐHLN.

2. Huỳnh Đức Nhân, (1996). Khảo nghiệm dòng dõi bạch đàn urô (1989- 1994).

''Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ lâm nghiệp 1991-1995" trang 205-208, Nhà

xuất bản nông nghiệp, Hà nội 1996.

3. Lê Đình Khả và cộng tác viên, (1995). Nghiên cứu xây dựng cơ sở khoa học và

công nghệ cho việc cung cấp nguồn gốc cây rừng được cải thiện. Thông tin khoa học và

kinh tế lâm nghiệp số 2 – 1995.

4. Lê Đình Khả và Nguyễn Việt Cường (2001), Ưu thế lai về sinh trưởng và tính

chống chịu của một số tổ hợp lai khác loài ở Bạch đàn, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr

41-43.

5. Lê Đình Khả, (1970), "Một dạng Bạch đàn mới sinh trưởng nhanh ở miên Bắc

Việt Nam", Tập san lâm nghiệp, (số 3), 6 trang

6. Lê Đình Khả, (1993). Trồng bạch đàn ở nước ta như thế nào cho có hiệu quả. Tạp

chí lâm nghiệp, số 2, trang 9-10.

7. Lê Đình Khả, Phạm văn Tuấn, Đoàn Thị Bích, (1996). Nghiên cứu chọn giống

bạch đàn. '' Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ lâm nghiệp 1991-1995" trang 151-

155, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội.

8. Nguyễn Hoàng Nghĩa (2000), Chọn giống bạch đàn Eucalytus theo sinh trưởng và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

kháng bệnh ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

9. Nguyễn Quang Hà và Trần Xuân Thiệp, (1990). Có nên trồng rừng bạch đàn công

nghiệp không?. Tạp chí lâm nghiệp, số 8, Trang 4-6.

10. Nguyễn Quang Thạch, (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương

Thảo (2005). Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

11. Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân,

Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2012). Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào cây dưa hấu.

Tạp chí Công nghệ Sinh học 34(3): 389-396.

12. Nguyễn Việt Cường (2012). Lai giống Bạch đàn, Tràm, Keo, Thông và khảo

nghiệm chọn lọc giống lai, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

13. Nguyễn Việt Cường, (2006) “Nghiên cứu lai tạo một số dòng bạch đàn, keo,tràm

và thông” giai đoạn 2001 – 2005, Báo cáo tổng kết đề tài

14. Phạm Văn Tuấn, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Lê Đình Khả, Hoàng Chương, (2000). Kết

quả khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn ở Việt Nam. Tài liệu viết cho Hội nghị công

nhận giống bạch đàn và keo, 17 trang.

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

15. Bai Jyayu, Xu Jianmin and Gan Siming (2003). Genetic improvement of Tropical

Eucalypts in China. In Eucalyptus in Asia. Procedding of an international conference.

Turbull J.E. edit. 64-70.

16. Carabelli, M., Morelli, G., Whitelam, G., Ruberti, I., 1996. Twilight-zone and

canopy shade induction of the Athb-2 homeobox gene in green plants. Proceedings of the

National Academy of Sciences 93, 3530-3535.

17. Chen Z.Z., Chang S.H., Ho C.K., Chen Y.C., Tsai J.B., Chiang V.L. (2001). Plant

production of transgenic Eucalyptus camaldulensis carrying the populous tremuloides

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cinnamate 4-hydroxylase gene. Taiwan J. For. Sci 16: 249-258.

18. Cheng (2006). Eucalyptus urophylla transformation anf selection. Patent:

US20060101535 A1.

19. Demura, T. and Ye, Z.-H. (2010) Regulation of Plant Biomass Production. Current

Opin. Plant Biology. in press.

20. Demura, T., Tashiro, G., Horiguchi, G., Kishimoto,N., Kubo, M., Matsuoka, N.,

Minami,A., Nagata-Hiwatashi, M., Nakamura,K., Okamura, Y., Sassa, N., Suzuki,S.,

Yazaki,J., Kikuchi,S., and Fukuda, H. (2002) Visualization by comprehensive microarray

analysis of gene expression programs during transdifferentiation of mesophyll cells into

xylem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 15794-15799.

21. Di Cristina, M., Sessa, G., Dolan, L., Linstead, P., Baima, S., Ruberti, I., Morelli,

G., 1996. The Arabidopsis Athb-10 (GLABRA2) is an HD-Zip protein required for

regulation of root hair development. The Plant Journal 10, 393-402.

22. Diwakar Aggarwal., Anil Kumar., Sudhakara Reddy. M. (2001). Agrobacterium

tumefaciens mediated genetic transformation of selected elite clone(s) of Eucalyptus

tereticornis. Acta Physioll Plant. 33: 1603-1611.

23. Endo, S., Pesquet, E., Yamaguchi, M., Tashiro, G., Sato, M., Toyooka, K.,

Nishikubo, N., Udagawa-Motose, M., Kubo, M., Fukuda, H., and Demura, T. (2009)

Identifying new components participating in the secondary cell wall formation of vessel

elements in zinnia and Arabidopsis. Plant Cell, 21: 1155-1165.

24. Gubis J. Zuzana L., Jurai F., Zuzana J., (2004). Effect of growth regulators on

shoot induction and plant regerenation in tomato. Biologia, Brastislava 59/3: 405-408.

25. Haake, V., Cook, D., Riechmann, J., Pineda, O., Thomashow, M. F., Zhang, J. Z.,

2002. Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Plant Physiology 130, 639-648.

26. Ho C.K., Chang S.H., Tsay J.Y., Tsai C.J., Chiang V.L., Chen Z.Z. (1998).

Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of Eucalyptus camaldulensis and

production of transgenic plants. Plant Cell Reports. 17: 675 - 680.

27. Johannesson, H., Wang, Y., Engström, P., 2001. DNA-binding and dimerization

preferences of Arabidopsis homeodomain-leucine zipper transcription factors in vitro.

Plant Molecular Biology 45, 63-73.

28. Kawaoka A., Nanto K., Ishii K., Ebinuma H. (2006). Reduction of lignin content

by suppression of expression of the LIM domain transcription factor in Eucalyptus

camaldulensis. Silvae Genet 55(6): 269-277.

29. Kawasu T., Keigo D. K., Keiko Kondo K. (2003). Process for transformation of

mature trees of Eucalyptus plants. Patent No: US 6.563.024 B1.

30. Kawasu T., Suzuki Y ., Wada T., Kondo K., Koyama H. (2003). Over expression

of a plant mitochondrial citrate synthase in Eucalyptus trees improved growth when

cultured by alphosphate as a sole phosphate source. Plant Cell Physiol 44: S91

31. Kondo K., Furuyo A., Ishigi N., Kasuga M., Shinozaki K., Yamaguchi S.K,

Hibino T. (2003). Analysis of the stress rresponse genes in Eucalyptus and effect of

introducing several stress tolerance- giving genes in to Eucalyptus ; A development

situation and a practical possibility of an environmental stress resistant tree. Plant and

Animal Genome 11th, San Diego California.

32. Laudete M. S., Luis P. B. Cid, Ana C. M.B. (2002). Biolistic transformation of

Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla callus. Functional Plant Biology 29(8): 917-

924.

33. Luo Jianzhong (2003). Variation in growth and wood density of Eucalyptus

urophylla. In Eucalyptus in Asia. Procedding of an international conference. Turbull J.E.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

edit. 94-100

34. Mullins K. V., Llewllyn D. J., Hartney V. J., Strauss S., Dennis E. S. (1997).

Regeneration and transformation of Eucalyptus camaldulensis. Plant Cell Reports 16:

787-791.

35. Nguyen Duc Kien, Tran Ho Quang, Gunnar Jansson, Chris Harwood, David

Clapham, Sara von Arnold (2009). Cellulose content as a selection trait in breeding for

kraft pulp yield in Eucalyptus urophylla (Ann. For. Sci. (66) 711-719)

36. Poke, F.S., R.E. Vaillancourt, R.C. Elliott & J.B. Reid (2003). Sequence variation

in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol

dehydrogenase 2 (CAD2). Mol. Breed. 12(2): 107-118.

37. Prakash M.G., Gurumurthi K. (2009). Genetic transformation and regeneration of

transgenic plant from precultured cotyledon and hypocotyl explants of Eucalyptus

tereticornis Sm. Using Agrobacterium tumefaciens. In vitro Cell.Biol-Plant. 45: 429-434.

38. Ruan, J., 2013. Transcription Factor. In: Dubitzky, W., Wolkenhauer, O., Cho, K.-

H.,Yokota, H. (Ed.)^(Eds.) Encyclopedia of Systems Biology. ed. Springer New York,

vol. p.^pp. 2224-2224.

39. Santos, P.E.T (1990). Potential for genetic improvement program, estimates of

genetic parameters and genotype x environment interaction in Eucalyptus urophylla

S.T.Blake stands. Scienctia Forestalis 43-44,11-19.

40. Schena, M., Davis, R. W., 1994. Structure of homeobox-leucine zipper genes

suggests a model for the evolution of gene families. Proceedings of the National

Academy of Sciences 91, 8393-8397.

41. Shao Z., Chen W., Luo H., Ye X., Zhang J. (2002). Studio on the introduction of

the cecropin D gene into Eucalyptus urophylla to breed the resistant varieties to

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Pseudomonas solanacearum. Scientia Silvae Sinicae 38: 92-97

42. Sonoda, T., Koita, H., Nakamoto-Ohta, S., Kondo, K., Suezaki, T., Kato, T.,

Ishizaki, Y., Nagai,N., Iida, N., Sato, S., Umezawa, T., and Hibino, T. (2009) Increasing

fiber length and growth in transgenic tobacco plants overexpressing a gene encoding the

Eucalyptus camaldulensis HD-Zip class II transcription factor. Plant Biotech. 26: 115-

120.

43. Spokevicius A.V., Beveren K.V., Leith M.A., Bossinger G. (2005).

Agrobacterium mediated in vitro transformation of wood- producing stem segments in

eucalyptus. Plant Cell Reports 23: 617-624.

44. Suzuki Y., Kawasu T., Tsuyama M., Wada T., Kondo K., Mizuno R., Hara T.,

Koyama H. (2004). Characteristics of transgenic Eucalyptus hybrids with an over

expression of a plant mitochondrial citrate synthase. Nippon Shokubutsu Seiri Gakkai

nenkai oyobi Shinpojiumu Koen Yoshishu 45:07.

45. Tournier V., Grat S., Marque C., kayal W., Penchel R., Andrade D.G., Boudet

A.M., Teulieres C. (2003). An efficient procedure to stably introduce genes into an

economically important pulp tree (Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla). Trans

Res 12: 403-411.

46. Wei, X and Borralho, N.M.G (1998a). Genetic control of growth traits of

Eucalyptus urophylla. S.T. Blake in Southest China. Silvae Genetica 47(2-3), 158-165.

47. Yamada-Watanabe K., Kawaoka A., Matsunaga K., Nanto K., Sugita K., Endo S.,

Ebinuma H., Murata N. (2003). Molecular breeding of Eucalyptus: analysis of salt stress

tolerance in transgenic Eucalyptus camaldulensis that overexpressed choline oxidase

gene (cod A). IUFRO tree biotechnology. Umea Plant Science Centre, Umea: S7-S9.

48. Zhang, H., Jin, J., Tang, L., Zhao, Y., Gu, X., Gao, G., Luo, J., 2011. PlantTFDB

2.0: update and improvement of the comprehensive plant transcription factor database.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nucleic Acids Research 39, D1114-D1117.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962)

Thành phần Hàm lượng (mg/l)

1900 KNO3

1650 NH4NO3

370 MgSO4.7H2O

170 KH2PO4

332 CaCl2

6,2 H3BO3

22,3 MnSO4.H2O

8,6 ZnSO4

0,25 Na2MO4

0,025 CuSO4.7H2O

0,025 CoCl2

37,3 Na2EDTA

27,8 FeSO4.7H2O

Glycin 2

Myo-inositol 100

Nicotinic acid 0,5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Thiamin.HCl 0,1

Prydoxin.HCl 0,5

Phụ lục 2: Kết quả xử lý thống kê

1. Thí nghiệm tạo mẫu in vitro

Table Analyzed

Nhan nhanhchoi

One-way analysis of variance

P value P<0.0001

P value summary

***

Are means signif. different? (P < 0.05) Yes

Number of groups

11,32

R squared

0,2454

Bartlett's test for equal variances

Bartlett's statistic (corrected) 11,03

P value 0,0508

P value summary

Do the variances differ signif. (P < 0.05) No

ANOVA Table SS

Treatment (between columns) 60,07 5

12,01

Residual (within columns)

184,7 174

1,062

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2. Thí nghiệm nhân nhanh chồi

Total 244,8 179

Table Analyzed

Tai sinh than

One-way analysis of variance

P value P<0.0001

P value summary

***

Are means signif. different? (P < 0.05) Yes

Number of groups

32,57

R squared

0,6196

Bartlett's test for equal variances

Bartlett's statistic (corrected) 35,18

P value 0,0023

P value summary

Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes

ANOVA Table SS

Treatment (between columns) 135,9 15

9,058

Residual (within columns)

83,43 300

0,2781

Total 219,3 315

3. Thí nghiệm tái sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

4. Thí nghiệm ra rễ

Table Analyzed

Ra re_so re

One-way analysis of variance

P value

P<0.0001

P value summary

***

Are means signif. different? (P < 0.05) Yes

Number of groups

14,26

R squared

0,4331

Bartlett's test for equal variances

Bartlett's statistic (corrected) 14,53

P value 0,1046

P value summary

Do the variances differ signif. (P < 0.05) No

ANOVA Table SS

Treatment (between columns) 142,4 9

15,82

Residual (within columns)

186,3 168

1,109

Total 328,7 177

Table Analyzed

Ra re_chieudai re

One-way analysis of variance

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

P value

P<0.0001

P value summary

***

Are means signif. different? (P < 0.05) Yes

Number of groups

9,927

R squared

0,3472

Bartlett's test for equal variances

Bartlett's statistic (corrected) 5,428

P value 0,7956

P value summary

Do the variances differ signif. (P < 0.05) No

ANOVA Table SS

Treatment (between columns) 29,56 9

3,284

Residual (within columns)

55,58 168

0,3308

Total 85,13 177

5. Thí nghiệm xác định nồng độ chất chọn lọc kanamycin tới khả năng sống của

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Row 1

Average 100

Row 2

300 268.571428 6

89.52381

Variance 0 19.04761 9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

mẫu

Row 3

Row 4

Row 5 Row 6

248.571428 6 205.714285 7 74.2857142 9 0

82.85714 3 68.57142 9 24.76190 5 0

32.65306 1 32.65306 1 10.88435 4 0

3 3

ANOVA

Source of Variation

Between Groups

23711.5646

F 298.7657 1

P-value 3.717E- 12

F crit 3.105875 2

MS 4742.312 9 15.87301 6

Within Groups

190.47619

Total

23902.0408

Anova: Single Factor

SUMMARY Groups

Count

Sum

Average

Variance

Row 1 Row 2 Row 3 Row 4 Row 5

3 214.2857143 71.42857143 32.65306122 3 82.85714286 27.61904762 2.721088435 3 37.14285714 12.38095238 2.721088435 3 14.28571429 4.761904762 2.721088435 0 3

ANOVA

Source of Variation

F crit

P-value 2.052E-

10 3.4780497

Between Groups Within Groups

10022.31293 81.63265306

4 2505.578231 306.9333333 10 8.163265306

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

6. Thí nghiệm xác định nồng độ chất chọn lọc kanamycin tới khả năng ra rễ

Total

10103.94558

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1 .................................................................................................................................................... 5

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................................................................... 5

1.1. Tổng quan về Bạch đàn nói chung và Bạch đàn lai nói riêng ...................................................... 5

1.2.Tình hình trồng và sinh trưởng Bạch đàn lai ở Việt Nam ............................................................ 7

1.3. Kỹ thuật chuyển gen thực vật ....................................................................................................... 11

1.3.1 Khái niệm chuyển gen .............................................................................................................. 11

1.3.2. Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn chuyển gen ............................................................................ 16

1.4. Gen mục tiêu EcHB1 ..................................................................................................................... 18

1.4.1. Vai trò của nhân tố phiên mã trong sinh trưởng của thực vật ................................................. 18

1.4.2. Nhân tố phiên mã EcHB1 .......................................................................................................... 19

CHƯƠNG 2 .................................................................................................................................................. 22

MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 22

2.1. Mục tiêu .......................................................................................................................................... 22

2.2. Đối tượng ........................................................................................................................................ 22

2.3. Nội dung .......................................................................................................................................... 22

2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................................................. 22

2.4.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................................... 22

2.4.3. Địa điểm bố trí thí nghiệm ........................................................................................................ 23

2.4.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................................... 24

2.4.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................................................. 33

2.4.6. Các chỉ tiêu theo dõi.................................................................................................................. 33

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................................................................................................... 35

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.1. Xác định các điều kiện phù hợp cho tái sinh từ nguồn vật liệu được tuyển chọn .................... 35

3.1.1. Tạo mẫu Bạch đàn lai trội UU89 sạch in -vitro .......................................................................... 35

3.1.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi ................................................... 37

3.1.3. Ảnh hưởng của BAP, K và NAA đến khả năng tái sinh chồi ....................................................... 40

3.1.4. Ảnh hưởng của NAA, IBA và ABT đến khả năng ra rễ ............................................................... 44

3.2. Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 ..................................................................................................... 47

3.2.1. Ảnh hưởng của kháng sinh Kanamycin tới khả năng sống của mẫu ......................................... 49

3.2.2. Ảnh hưởng của kháng sinh Kanamycin tới khả năng ra rễ ....................................................... 51

3.3. Đánh giá biểu hiện gen EcHB1 bằng PCR ................................................................................... 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................................................. 57

4.1. Kết luận ........................................................................................................................................... 57

4.2. Kiến nghị ......................................................................................................................................... 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................................................. 58

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào Bạch đàn lai phục vụ công nghiệp chế biến giấy

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI & TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----------

ĐỖ THỊ THỤC

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ

(EcHB1)VÀO BACHJ ĐÀN LAI PHỤC VỤ CÔNG NGHIỆP CHẾ

BIẾN GIẤY

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2014

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................................... 1

1.1. Tổng quan về Bạch đàn nói chung và Bạch đàn lai nói riêng ...................................................... 5

1.2.Tình hình trồng và sinh trưởng Bạch đàn lai ở Việt Nam ............................................................ 7

1.3. Kỹ thuật chuyển gen thực vật ....................................................................................................... 11

1.4. Gen mục tiêu EcHB1 ..................................................................................................................... 18

2.1. Mục tiêu .......................................................................................................................................... 22

2.2. Đối tượng ........................................................................................................................................ 22

2.3. Nội dung .......................................................................................................................................... 22

2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................................................. 22

3.1. Xác định các điều kiện phù hợp cho tái sinh từ nguồn vật liệu được tuyển chọn .................... 35

3.2. Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 ..................................................................................................... 47

3.3. Đánh giá biểu hiện gen EcHB1 bằng PCR ................................................................................... 55

4.1. Kết luận ........................................................................................................................................... 57

4.2. Kiến nghị ......................................................................................................................................... 57

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn năm 2023 tại tỉnh Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xác định biến đổi gen ở một số bệnh nhân thông liên nhĩ bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích toàn bộ hệ gen ty thể và đa hình nucleotide đơn vùng không trao đổi chéo của nhiễm sắc thể Y người Việt Nam thuộc năm dân tộc Pa Kô, Cơ-Tu, Rơ-Măm, Kinh miền Trung và Kinh miền Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn có lợi sinh trưởng trong môi trường chứa tảo

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh rụng lá Pestalotiopsis hại cây cao su tại một số vùng trồng chính của Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng gene kháng thuốc, gene độc lực và hệ vi khuẩn đường ruột cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng giải trình tự metagenomics

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm gây hại trên hòm gỗ thu thập tại đồng nai và khảo sát hiệu quả ức chế nấm của một số chế phẩm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sử dụng thông tin di truyền trên vùng gen ITS DNA trong định loại các mẫu sâm (Panax L.) thu thập ở tỉnh Hà Giang

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP