TIẾP CẬN VẤN ĐỀ PHÁT HIỆN TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG CÁC THỰC PHẨM CÓNGU ỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT (Phần1)
PHẠM KIM ĐĂNG
KhoaCh ănnuôivàNuôitr
ồngthu ỷ sản
Đại họcNôngnghi ệpHà N ội
THỰC PHẨM CÓNGU ỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT
Khángsinhvàch ănnuôithâmcanh
Chăn nuôithâmcanh
Mật độ cao
Tổnth ương, ô nhiễmti ểukhí h ậu chuồngnuôi, m ất vệ sinh
Tổnth ấtkinh t ế rấtquantr ọng
Tăng tỷ lệ chết, con non thường yếu ớt, đề khángkém,
Chậmsinh trưởng
Sản lượnggi ảmhaygi ảm năng suấtch ănnuôi
Cácnhómkhángsinhchính s ử dụng trogch ănnuôi
~100 hợpch ất Khácnhau
§ b-lactam(penicilline, cephalosporine) § Tetracyclines (oxy- và chlortetracycline, …) § Aminoglycosides (streptomycine, …) § Macrolides (Erythromycine, …) § Phenicol (chloramphenicol, …) § Peptid (avoparcine, …) § Ionophores (monensine, …) § Sulfonamides (25 loại, sulfaméthazine, …) § Trimétroprim § Nitrofurannes (furazolidone,…) § (Fluo)quinolones § Carbadox
Côngth ức rấtkhácnhauvàph ức tạp
NH
NH
HO
C
NH
NH2
HO
OH
O
O
NH
C
NH2
CHO
NH
H3C
OH
O
NHCH 3
OH
OH
O
CH 2OH
H O H H O O2N N N O CH3 NH CH2CO N FURAZOLIDONE CH3 CH3 COOH CH2OH O Benzylpenicilline (penicilline) OH C2H5 N O HH S O NH CH2CO COOH N O CH3 O OXOLINIC ACID COOH H Cephalexine (cephalosporine) NHCOCHCl2 Streptomycine (aminoglycoside)
OH
H3C
O
N
S
H N
H2N
CH3
N
O
CH3
C C O2N CH2OH HH O HOCH 3 N(CH 3)2 OH H H OH H OH N H N O O O H3CHN CH3 N CHLORAMPHENICOL CH3 NH 2 N O O HO OH O OH OH O O O O O H NHCH 3 CARBADOX Tétracycline S Spectinomycine (aminocyclitol) (C2H5)2N O O CH3 H OCH3 N NH 2 H3CO H2C O N H3C H3CO H3C CH3 TIAMULIN HO CH3 OH HO NH 2 Trimethoprim OH H3C CH3 N(CH 3)2 HO O CH3 H3C HO O H3C O H3C CH3 H5C2 CH2 CH3 H3C H O O OCH3 CH3 O O CH3O O O O CH3 CH3 H H H CH2OH OH H3C O OH H CH3 CH3 MONENSIN Erythromycine(macrolide) COOH Sulphadimidine ou sulfamethazine (sulphonamide)
Côngth ức rấtkhácnhauvàph ức tạp
OH
H
H3CO2S
H
CH2F NHCOCHCl2
Florfenicol (FF)
OH
H
OH
H
H3CO2S
O2N
H
CH2OH NHCOCHCl2
H
CH2OH NHCOCHCl2
Chloramphenicol (CAP)
Thiamphenicol (TAP)
OH
H
H3CO2S
CH2F
H
NH2
Florfenicol amine (FFA)
Côngth ức rấtkhácnhauvàph ức tạp
7 FQ lưỡngtính : -Norfloxacine -Ofloxacine -Enoxacine -Marbofloxacine -Enrofloxacine -Ciprofloxacine -Danofloxacine
4 FQ acides: -Cinoxacine -Flumequine -acideOxolinic -acideNalidixic
Tạisao l ạiph ảiki ểmtra t ồn dư khángsinh trongth ựcph ẩmcóngu ồn gốc động vật?
p Ảnh hưởng kỹ thuật chế biến, bảo quản sản
phẩm: ức chế sự lên men sản xuất acid
p Độc hại
n Bảo vệ ngườitiêudùng n Bảo vệ môitr ường: khángthu ốc (cid:224) thúy, nhân y
p Người tiêu dùng: Vấn đềđạ o đức
Khángsinhvàti ềmtàngnguyhi ểm
p Ít độc cấptính p Khángsinh c ấm (ungth ư, quáithai, b ất thường… ) p Gây dị ứng p Mất cần bằng hệ vsv đườngru ột (cid:224) Rốilo ạn p Gâykhángthu ốc ở vi khuẩn
- xuấthi ệncácch ủngvi khu ẩngây b ệnhkhángnhi ềulo ại
khángsinh(multi-resistante) - Vô hiệuhoácáclo ạikhángsinh - Nguy cơ ô nhiễmmôi trường
Nguồn gốc tồn dư tồn dư khángsinh Khángsinh+ l ợinhu ậnch ănnuôi
Sử dụngkhángsinh ( lạm dụng, bất hợppháp )
- Điềutr ị bệnhcáth ể - Phòng bệnhcho đànho ặclô - Kíchthíchsinhtr ưởng(Feedadditives ????) - Bảoqu ản????
Tồn dư trong sảnph ẩmch ănnuôi Ảnh hưởng xấu đếnmôitr ường vàng ườitiêudùng
Nguyênnhân
p Sử dụngsainguyên t ắcvà b ất hợppháp:
§ Các sảnph ẩmch ợ đen
§ Bảoqu ản????
§ Sainguyên t ắcho ặccóch ủ định 1. Khôngcó đơn thuốc củaBSTY,
2. Khôngtuânth ủ liều
3. Thờigian d ừngthu ốc. Đặcbi ệtcácVùngdântríth
ấp
LUẬT LIÊN QUAN TỒN DƯ
HAI NHÓM Nhómcácch ấtchophép s ử dụng (cid:224) MRL (Maximum Residue Limit).
- Nhómcácch ất cấm (cid:224) MRPL (Minimum
Require Performance Limit)
Cơ sở qui định MRL vàMRPL????
Cơ sở qui địnhMRL vàMRPL????
Tác độngcó thể quansát
Tổng lượng khángsinh
Mứckhôngth ể quansátth ấytác động bất lợi
Hệ số an toàn
ADI = Acceptable Daily Intake
MRL=Maximum Residue Limit
Khángsinh t ừ chuồngnuôi đếnbàn ăn
Kiểmsoátnh ậpkh ẩu Thúy c ửakh ẩu????
•Kiểmsoátvs gi ết mổ, dịch bệnh •Bắtbu ộccóthôngbáo •Kiểmsoátthânth ịtvà n ội tạng
• Điềutr ị bệnh củaThú y (ngườich ănnuôi) •Cácthu ốc đượcphép •H.d ẫn sử dụng, thờigianch ờ • Cấmkíchthíchsinh trưởng
Cơ quanth ẩmquy ền:
Cụcthúy -B ộ nôngnghi ệp
CụcVSATTP - B ộ y tế
•Traçability •KiểmsoátMRL
CụcVSANTYTS - B ộ Thuỷ sản
Hệ thốngLab ???????
Kiểmsoátcáckhángsinh
Khó khăn: chất cầntìmkhôngbi ết trước
LiệucóKhángsinhnào trongth ựcph ẩmkhông?
Cáchti ếp cận theophântích
!
ể
Cáchti ếp cận theolýthuy ết t h
g
n
ô
h
h
n
Pháttri ển, sử dụngmultianalyse
k Điềutrathú y ư n ầ
G
-Sàng l ọc(screening) - Kỹ thuậtphântách - Kỹ thuậtphântíchph ổ (MS)
Xác địnhdanh sáchcácch ất cần kiểmsoát
CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG
Mẫu
Nhanh, hạnch ế tốithi ểu dươngtínhgi ả, âmtínhgi ả
Sàng lọc
Phântích định lượng
Phântích địnhtính
Kếtqu ả cógiátr ị theotiêuchí đặtra
CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG
Mục đíchphântích kiểmtra1 m ẫu(hay 1 lô) đạttiêuchu ẩn hay không?
Nhómchophép s ử dụng
(cid:216)
Nồng độ < MRL
(cid:240) Đạttiêuchu ẩn
(cid:216)
Nồng độ > MRL
(cid:240) Không đạttiêuchu ẩn
CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG
Mục đíchphântích kiểmtra1 m ẫu(hay 1 lô) đạttiêuchu ẩn hay không?
Nhóm cấm sử dụng
(cid:216)
Nồng độ < MRPL (LOD)
(cid:240) Đạttiêuchu ẩn
(cid:216)
Nồng độ > MRPL (LOD)
(cid:240) Không đạttiêuchu ẩn
CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG
1.Sàng l ọc (screening)
Đạt tiêuchu ẩn (< LOD hoặc < MRL)
Nghing ờ (> LOD hoặc > MRL)
Lô đượcch ấpnh ận
2. Phântích khẳng định
Đạt tiêuchu ẩn (< LOD hoặc< MRL)
Không đạttiêuchu ẩn (> LOD hoặc> MRL)
Bị từ chối????
Lô đượcch ấpnh ận
CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG
I.
Phươngphápsàng l ọc (screening)
-
-
-
-
-
Nhanh Phântíchnhi ềuch ấtcùnglúc(Multi-analyte) Rẻ Cóth ể tựđộ nghoá Khôngcho k ếtqu ả âmtínhgi ả
II. Phươngphápkh ẳng định(lýhoá)
-
-
Đặchi ệu Khôngcho k ếtqu ả dươngtínhgi ả
CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG
I.
Phươngphápsàng l ọc (screening)
-
Test vsv (“Test thận Bỉ”, test 4 đĩa ChâuÂu Premitest, Delvotest, Copan, …)
n
Test miễn dịch (ELISA, RIA …), Receptor-essais (Beta-STAR, Tetrasensor, …)
II. Phươngphápkh ẳng định(lýhoá)
-
-
Nhậndi ệnch ất tồn dư Định lượngchínhxácvà
đốichi ếuMRL
CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC VÀKH ẲNG ĐỊNH
Phù hợp để khẳng định các chất cấm
MS-MS
LC/GC-MS
Phù hợp để khẳng định các chất cóMRL
HPLC-F
HPLC-UV
Thích hợp để sàng lọc
ELISA
VSV
Cácch ủngvsv đượcdùngtrongtest VSV kiểm tra tồn dư
1. BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS var. CALIDOLACTIS p IMPROVED AGAR DIFFUSION TESTDELVOTEST SP-NT p CHARM AIM-96 p DELVOTEST MCS
DISK ASSAY PLATE METHOD COPAN MILK TEST
2. STREPTOCOCCUS SALIVARIUS ssp. THERMOPHILUS
or ACIDIFICATION TEST+ TMP VALIO T102
ACIDIFICATION TEST VALIO T101 LUMAC RAPID ANTIBIOTIC TEST KIT
3. BACILLUS CEREUS
BACILLUSCEREUS -TEST (tetracyclines)
4. ESCHERICHIA COLI
ESCHERICHIA COLI -TEST (quinolones)
5. BACILLUS SUBTILIS BGA
6. MICROCOCCUS LUTEUS
7. BACILLUS BRONCHESEPTICA 8. …..
Ưunh ược điểm củatest VSV
p Nhược điểm
p Ưu điểm
n Một số trường hợp đọc bằngmàu
n Đơn giản
n Trang bịđơ ngi ản
n Cầnít m ẫu
n Ảnh hưởng một số chấtcótrong m ẫu (chấtcókh ả năng ứcch ế VSV (FP), VSV (FN))
n Phổ pháthi ện rộng
n Thờigiantest quálâu
n Tương đốinh ạy
n Không đặchi ệu
n Tương đốinhanh
n Không định lượng
n Rẻ
n Một số chấtkhôngpháthi ện được
n Một số trường hợp đặchi ệu
p CAP, nitrofurans, nitro-imidazoles
nhóm
n Độ nhạyph ụ thuộc điềuki ện củach ủng
n Cóth ể tựđộ nghoá
vSV sử dụng
n Rấtti ện để sàng lọc
Các dạng test VSV
- Ứcch ế vi sinh vật tạovòngvôkhu ẩn
-1 ch ủngcùng1 điềuki ệnmôitr ường
-1 ch ủng điềuki ệnmôitr ườngkhácnhau(pH)
-Cácch ủngch ọn lọcchocácnhómkhángsinh
-Cácch ủngch ọn lọc+ pH khácnhau
STAR (B.subtilispH 7.2, Kocuriavarians8, B.cereus6, E.coli
8, Geobacillusstearothermophilus7)
-Ph ản ứnglênmen: ch ỉ thị màu(premitest, DelvoTest….)
Enzym, receptor, miễn dịch
p ENZYM
PENZYM 100S
n PENZYM 100 n TG (tetracycline galactosidase) –test
p RECEPTOR & MIỄN DỊCH
• LacTek
• Delvo –X-
• PARALLUX
-lactam, tetra or both)
n SNAP (beta lactam en tetracycline test kit) n b _S.T.A.R. Press (II) n ELISA n Charm MRL-test (ROSA) (b n CHARM II (5 groups)
• Twin Sensor
Ưunh ược điểm củaph ươngpháp miễn dịch
p Ưu điểm
p Nhược điểm
n Đặc hiệu
n Giáthành
n Đa số rấtnh ạy
n Đa số cần KTV được đào tạo
n Độ đặc hiệu cao đôi khi trở
n Cóth ể sử dụngcác m ẫu
khácnhau
thành bất lợi
n Phản ứng chéo (FP)
n Bán định lượng
n Cóth ể ảnh hưởng mẫu matrix
n Tương đốinhanh
n Một số KT không cótrên th ị
n Thích hợp dùng kiểm
trường
soát đầu vào
Ưunh ược điểm củaph ươngpháp lýhoá(HPLC, GC, MS, MS/MS)
p Nhược điểm
p Ưu điểm
n Qui trình rấtph ức tạp(chu ẩn
n Nhậndiện rõ ràng
bị, tách chiết, làm sạch)
n Thiết bị đắt
n Thông tin định lượng
n KTV chuyên nghiệp cao
n Rất nhạy
n Một số KS không cóqui trình
n Thích hợp cho khẳng
phân tích bằng PP này
n Một số trường hợpthay đổi
định
độ thu hồi
Khả năng phân biệt vàti ềm tàng các chất gây nhiễu (interference)
MS-MS
LC/GC-MS
HPLC-F
Tăng tiềm tàng các chất gây nhiễu
Tăng khả năng phân biệt
HPLC-UV
ELISA
VSV
CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG
Các sảnph ẩmkhácnhau???
Chiến lượcphântích c ụ thể vàcác phươngphápkhácnhau
SỮA
Mẫu sữa
Test vsv
+ -
Nhận định: Ł Ảnh hưởng kỹ thuật (quality errors) Ł Nghi ngờ có chất kháng khuẩn
Nhận định: Ł Không có vấn đề kỹ thật Ł Có thể có một số chất kháng khuẩn nào đó
N ếu cần thiết
Khẳng định (nhận dạng) và định lượng
Bước 1: Test nhận diện chất/nhóm đặc hiệu = Penase, Penzym, PABA, Receptor test, Immuno assay
Bước 2: Phân tích lý hoá = HPLC, GC, GC/MS
K ết quả đối chiếu MRL
Kiểmtrakhángsinhtrongth
ịtvàth ận ở Bỉ
Procéder à un test rénal
Résultat négatif
Résultat positif
Pas d’analyse de l’échantillon de viande La carcasse est acceptée
Analyse de l’échantillon de viande par la méthode des 4 plaques
Résultat négatif
Résultat positif
La carcasse est acceptée
Analyse physico-chimique de l’échantillon de viande
Concentration < LMR
Concentration > LMR
La carcasse est acceptée
La carcasse est rejetée
Kiểmtrakhángsinhtrongth
ịtvàth ận ở Bỉ
Analyse de la lésion d’injection
Concentration > LMR
Concentration < LMR
La carcasse est acceptée
Analyse de l’échantillon de viande
Concentration > LMR
Concentration < LMR
La carcasse est rejetée
La carcasse est acceptée partiellement
Cáccông đoạntrongphântích t ồn dư
Chuẩn bị mẫu
p Lấy mẫu p Làm sạch p Nghiền
p Dungmôi h ữu cơ
Táchchi ết
Tinhch ế, cô đặc
p Phân táchpha l ỏng-l ỏng p Táchchi ếtpha r ắn(silice) p Bằngái l ựcmi ễn dịch
Đo định lượngho ặc địnhtính
Ý tưởngpháttri ểnph ươngpháp
Yêu cầuth ực tế
Dư luận Phântích điềutra Yêu cầutheolu ật
Hìnhthànhý
tưởng
Tổ chứcth ựchi ện ý tưởng
Kiểmtra k ếtqu ả
Nguyênlý “ Test thận Bỉ”
Đốich ứng dương
Mẫu -
Mẫu + )/2 >= 20 mm ((ФФ1 1 + + ФФ22)/2 >= 20 mm ouou L >= 2 mm L >= 2 mm
20 mm
17 mm
ФФ11
Tyl
Sulf
L
Strep
Oxyt
20 mm
18 mm
ФФ22
Vòngvô khuẩn
Mẩu vỏ thận
Thạch cấy B. subtilis
Đĩagi ấych ứa 1µg khángsinh chuẩn
Giấy tẩm dịch vùng vỏ thận
Nguyênlý “ Test thận Bỉ”
Ưunh ược điểm????
Ý tưởngkh ắcph ụcnh ược điểm
Khôngdùng d ịchth ận, mẩuth ậnmà
dùng mẫutáchchi ết
Táchchi ếtth ế nào?
Lượng mẫubaonhiêu?
Làmth ế nào để kiểmtra đượcch ất lượngtest??
Yêu cầuqui trìnhtáchchi ếtth ế nào?
p Tách đượcch ất cầntìmrakh ỏi mẫu
p Đảm bảo độ thu hồi
p Cácch ất sử dụngkhông ảnh hưởng đếnch ất cầntìmvà k ếtqu ảđọ c
p Nếucóth ể hạnch ếđượ ccácch ất
gây dươngtínhgi ả
Thích ứngPremi-Test
Lượng mẫubaonhiêu?
KiểmsoátCh ất lượngmôi trường, Đĩa cấyvsv
Xác định Độ mẫn cảm của VSV vớikhángsinh
Xác định lượngKS ítnh ất cóth ể tạovòngvôkhu ẩn (A)
Kiểmtra l ạiqui trìnhtách chiết= kschu ẩn
M (g) = A * MRL-1
Xây dựngcôngth ứctính lượng mẫubénh ất cần lấy(M)
Làmth ế nào để kiểmtra đượcch ất lượngtest??
Đánhgiácáctham s ốđộ mạnh (LOD, Độ nhạy, Độđặ chi ệu, độ chínhxác)
Phạm Kim Đăng, Marie-Louise SCIPPO; Guy DEGAND;
Caroline DOUNY; Guy MAGHUIN-ROGISTER (2007): Chuẩn hóa phương pháp sàng lọc định tính kiểm soát tồn dư kháng sinh trong thực phẩm cóngu ồn gốc động vật theo qui định số 2002/657/EC (bài tổng hợp). Tạp chíKHKT Nông nghiệp, ĐHNN I, TậpV, S ố 1/2007; Trang 24-30. http://www.hua.edu.vn/tc_khktnn/default.asp?i d=11&ID_S=20
Chuẩn bị thựchi ện
Nguyênli ệuvàhoáchât
- Dung dịchchu ẩn (dung môi, chấtchu ẩn) - Giốngvisinh v ật: Bacillussubtilis BGA - Môi trường nuôi cấy
Standard IINutrient Agar for microbiology
- Mẫu “trắng” - Dextrose, methanol, NH4OH 2M, NaOH1M , HCl1 và2M . - Trimethoprime (TMP) 1 mg/ml - Đĩagi ấy đườngkính12 mm - ĐĩaPetri - Acetonitrile, Acetone
Dụng cụ
ổiNit ơ)
p Micropipet p Cânphântích(gam, mg, µg) p Nồi hấpti ệttrùng p Nồi hấpcáchthu ỷ (cid:224)45-47°C p Vortex p Máy lắc đảo đầu p Lytâm(2000-6000 vòng/phút) p Hệ thốngbay h ơi(lytâmchânkhôngor th p Tủ ấm30°C
Chuẩn bị môitr ường(1 l ít)
§ Cân 25 g môi trường
§ Thêm 6 g dextrose = 0,6% (nếudùngdung d ịch20% c ần?)
§ Hoàtrong 1 lit nước cất(– s ố ml đường) (đunsôi, khu ấy
liên tục, cẩnth ậnkhi s ắpsôi)
§ Chovàocác l ọ (4x250 ml) (nắp hơi lỏng)
§ Tiệttrùngtrong15 phút ở 121°C +/-0,1.
§ Làmngu ồi về 47°C bằng nồicáchthu ỷ (Nếuth ạch dự trữ(cid:224)90°C trong3h, làmngu ội(cid:224)47°C khoảng30 phút)
Chuẩn bị môitr ường(1 l ít)
§ Môitr ường đưavào s ử dụngsaukhihi ệuch ỉnh pH=7,2±0,1 ở 25°C bằngHClho ặcNaOH1M
§ Mỗi lọ 100 ml môitr ường: 20µl TMP (1mg/ml) + 100 µldung d ịchhuy ềnphùB.subtilis đượcphaloãngtheo hướng dẫn (cid:224) lắc đều
§ Đổ 14 ml thạch/đĩa (dày2,2 mm) (cid:224) (200 ml = 14 đĩa) § Sau khi để thạch cứng, đĩa baogóibaonilonplastic và được bảoqu ản ở 4°C tối đa 1 tuần(úp n ắpxu ống)
Kiểmtrach ất lượng đĩachu ẩn bị
XÁC ĐỊNH MIC
Solution
µg/ml
8
0,625
7
1,25
6
2,5
5
5
4
6,67
3
10
XÁC ĐỊNH MIC
6.0
Oxolinic acid
Difloxacine
Danofloxacine
Norfloxacine
Enrofloxacine
Ciprofloxacine
Sulfadiazine
Sulfadimethoxine
Flumequine
5.0
Oxytetracycline
Sulfamethoxazole
Chlortetracycline
Tetracycline
4.0
3.0
)
i
m m
ĩ
u h k ô v g 2.0 n ò v g rộn
ộ Đ
h n a u q ẩn
( ấy
g a
đ
1.0
0.0
25.00
37.50
50.00
62.50
75.00
87.50
100.00
112.50
125.00
137.50
150.00
162.50
175.00
Lương kháng sinh chu ẩn/đĩa (ng)
Độ rộngvòngvôkhu ẩnquanh đĩa giấybi ến độngtu ỳ theo
lượngkhángsinhcótrong50 µldung d
ịchchu ẩn
Qui trìnhtáchchi ết
3 ± 0,1g t ômnghi ền
5 ml acetonitrile/acetone(70/30: V/V)
Lắc đảo đầutrong10 phút
Lytâm t ốc độ 3000 vòng/phúttrong10 phút ở 15°C
Thu hồi Lớptrên được
3 gam tôm/200 µl methanol
Làmbay h ơi đếnkhô = «SAVANT» or khi N2 40°C
Phầnch ấtkhôcòn l ại đượcthu h ồitrong200 µlmethanol
Lytâm t ốc độ 3000 vòng/phúttrong10 phút ở 15°C
50µl chứa0,75 gamtôm
Lớptrên được(cid:224) đĩa
Xác địnhkh ối lượng mẫutômbénh ất cần lấycho m ột lầntáchchi ết
Qui trìnhtáchchi ết
Giới hạn nồng độ tối đa (LMR)
QME (g) = QMI * LMR-1
QMI (ngtrong50 µl/ đĩa)
Khối lượng mẫutômbé nhất cần lấy(QME)/phân tích
Phương pháphi ểuch ỉnhph ươngpháp Chuẩnhoá theo QĐ 2002/657/CE -LCR, AFSSA, FOUGERES
Xác địnhLOD: MIC (cid:224) mẫutr ắng củng cố gần vớiMIC (cid:224) <5% âmtính
Kếtqu ả test
Mẫuth ực sự dươngtính (N+) (mẫu củng cố)
Mẫuth ực sự âmtính (N-) (mẫutr ắng)
PA (Dươngtínhtheo qui
Dươngtính
FP (Dươngtínhgi ả)
định)
Âmtính
FN (Âmtínhgi ả)
NA (Âmtínhtheo qui định)
PA + NA
Độ xácth ực (%)=
x 100
OùN = N + + N-
N
PA
NA
Độ nhạy (%)=
x 100
Độ đặchi ệu (%)=
x 100
N+
N-
NGUYÊN LÝ CỦAKÍT ELISA
(FLUORO)QUINOLONES 2 HOURS
DO CER CUNG CẤP
Giánti ếp-Canhtranh
(FLUORO)QUINOLONES 2 HOURS CER _ BỈ
Thànhph ần của mộtKit
1. Mộtplate 96 gi ếngcóph ủ KT tinh sạch của cừukháng l ạiKT cóngu ồn
gốcth ỏ
2.
7 lọ cóch ứadung d ịchchu ẩn(KN): 1, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 và0 ng/ml
3.
Dung dịchch ứaKN có g ắn vớimengâyph ản ứng tạomàu(Peroxide cọnugatednorfloxacin)
4.
Lọ chứaKT cóngu ồn gốc từ thỏ đặchi ệu với KN được đông khô
5.
1 lọ 18 ml Substrate/chromogen(thamgiaph ản ứng tạomàu perocide/TMB)
6.
50 ml dung dịch đệmphaloãngpH 7,4 -10x
7.
Dung dịch dừngph ản ứng H2SO4 6N
8.
50 ml dung dịch đệm để rửa-10x
9.
Tàili ệuthông s ố kỹ thuật củaKit
1.1. PhPhủủ khkháángng ththểể đãđã đư đượợcc tinhtinh llọọcc lênlên bbềề mmặặtt rrắắnn (1 (1 µµgg khkháángng ththểể ccừừuu khkháángng
llạạii khkháángng nguyên
nguyên ccóó ngunguồồnn ggốốcc ththỏỏ IgGIgG))
Kháng thể
+ °C
16/04/2008
2. b) ChoCho khkháángng nguyên 2. b)
2. a) ChoCho mmẫẫuu đãđã đư đượợcc ttááchch chichiếếtt hohoặặcc 2. a) nguyên chuchuẩẩnn vvààoo
dung ddịịchch khkháángng nguyên dung
nguyên ccóó ggắắnn menmen vvààoo
Antigen
EEEAg-Enz EEE
E E
EE EE
2. c) ChoCho khkháángng ththểể đ đặặcc hihiệệuu ththỏỏ vvààoo 2. c)
3.3. ủủ 2h 2h ởở 44°°CC
SpecificAb
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
không 4.4. RRửửaa loloạạii bbỏỏ ccáácc chchấấtt không
dung ddịịchch phphảảnn ứứngng mmààuu vvààoo trong bbóóngng ttốốii
đưđượợcc ggắắnn ((baba llầầnn))
5.5. ChoCho dung TMB/H22OO22 vvàà ủủ 3030’’ trong TMB/H
Substate /chromophore
E
E
E
E
E E
E
E
6.6. DDừừngng phphảảnn ứứngng bbằằngng HH22SOSO44..
7.7. ĐĐọọcc ởở 450 nm. 450 nm.
Chuẩn bị hoách ất PBS pH 7.4 : 9g NaCl+ 7,78g Na 2HPO4.2H2O+ 0,75 g KH2PO4 trong1 lít H 2O
Methanol/PBS (50/50 V/V)
Phaloãngdung d ịch đệm10x
PhaloãngKN g ắnenzyme 100x
Khôiph ụcKT đôngkhô(+ 6 ml dung d ịchphaloãng)
!
Lượnghoách ấtchu ẩn bị số mẫuphântích+ đườngchu ẩn
QUI TRÌNH TÁCH CHIẾT MẪU
30’’
10’, 4000rpm
lắc đảo đầu30’
5 gam mẫu 5 ml methanol/PBS (50/50v/v)
0,5 ml
50 µl/giếng
Ly tâm10 phút với vận tốc3000 vòng/phút
30 giây
4,5 ml d2 đệm phaloãng (phaloãng10x )
(*) PBS pH 7.4 :9 gamNaCl, 7,78 gamNa 2HPO4.2H2O và0,75 gamKH 2PO4 trong1 lít nước cất
QUI TRÌNH TEST
QUI TRÌNH TEST
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
NS
NS
S1
S1
S9
A
0
S2
S2
S9
0B
.05
.05
S3
S3
S10
C
Chuẩn bị Plate
0.1
0.1
S4
S4
S10
D
0.2
0.2
S5
S5
S11
E
0.3
0.3
S6
S6
S11
F
0.5
S7
S7
S12
0.5G
1
S8
S8
S12
1H
Dung dịchchu ẩn Mẫu
QUI TRÌNH TEST
ô
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B2
Bước 1
-
A1
A2
150 µl dd đệmp.loãng
B1
B2
50 µl dd0 ng/ml
C1
C2
50 µl dd1 ng/ml
L ắ c n h ẹ ,
5 0
D1
D2
50 µl dd0.5 ng/ml
đo
µ
l
L ắ c n h ẹ ,
E1
E2
50 µl dd0.3 ng/ml
1 0 0
1 5 0
ở bư
µ
µ
l
F1
F2
50 µl dd0.2 ng/ml
l
L ắ c n h ẹ
G1
G2
50 µl dd0.1 ng/ml
1 0 0
d d E
µ
.
l
H1
H2
50 µl dd0.05 ng/ml
1 p h ú t
j
r ồ i
A3
A4
50 µl mẫu1 táchchi ết
ủ 1 h ở 4 ° C
/
B3
B4
50 µl mẫu2 táchchi ết
/
C o n u g a t e /
d ố c b ỏ h ế t , r ử a 3 l ầ n = d d đ ệ m
ủ 1 h ở
C3
C4
50 µl mẫu3 táchchi ết
d d K T g i ế n g
ủ 3 0 p h ú t t r o n g b ó n g t ố i
/
p e r o x i d e / T M B g i ế n g
4 ° C
g i ế n g
D3
D4
50 µl mẫu4 táchchi ết
d d d ừ n g p h ả n ứ n g m à u g i ế n g
E3
E4
50 µl mẫu5 táchchi ết
, v ỗ ú p h ế t
t ° p h ò n g
F3
F4
50 µl mẫu6 táchchi ết
ớ c s ó n g 4 5 0 t r o n g v ò n g 3 0 p h ú t
G3
G4
50 µl mẫu7 táchchi ết
H3
H4
50 µl mẫu8 táchchi ết
Tính kếtqu ả
2,000
y = -1,0115x - 1,2697 R2 = 0,9915
1,500
) )
1,000
S N - 0 B
0,500
( / )
-
S N B
T
0,000
( ( t i
-3,500
-3,000
-2,500
-2,000
-1,500
-1,000
-0,500
0,000
0,500
g o
l
-0,500
-1,000
-1,500
ln (concentration)
Đồ thị 1. Đườngchu ẩn
-B, B0 t ương ứnglà m ật độ quang củadung d ịchchu ẩn ở các nồng độ khácnhauvà t ại nồng độ bằng0.
-NS m ật độ quang củadung d ịchkhông đặchi ệu
