BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã ngành: 62540101
NGUYỄN ÁI THẠCH
ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT LÊN MEN, XỬ LÝ NHIỆT VÀ NANO TRONG CHẾ BIẾN VÀ NÂNG CAO GIÁ TRỊ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TỎI
Cần Thơ, 2020
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Nguyễn Minh Thủy Người hướng dẫn phụ: TS. Hà Phương Thư
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở Họp tại: ………………………………., Trường Đại học Cần Thơ. Vào lúc ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm …..
Phản biện 1: Phản biện 2:
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Thị Mỹ Tuyền và Võ Thị Diệu. 2016. Thay đổi đặc tính lý hóa của củ tỏi trong quá trình thuần thục và tồn trữ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 45b: 16-24. ISSN 1859-2333.
2. Nguyễn Ái Thạch, Lê Thái Anh Thư và Nguyễn Minh Thủy. 2016. Ảnh hưởng của quá trình chần, mật độ Lactobacillus platarum và nồng độ muối đến các hoạt chất sinh học trong sản phẩm tỏi lên men muối chua. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn. Chuyên đề: Nông nghiệp xanh: 161-166. ISSN 1859–4581.
3. Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy. 2017. Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến các đặc tính lý hóa của sản phẩm tỏi đen. Tạp chí Hóa học. 55(4E23): 130-134. ISSN: 0866-7144.
4. Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy. 2017. Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến hàm lượng các hợp chất sinh học trong tỏi đen. Tạp chí Hóa học. 55(4E23): 135-139. ISSN: 0866- 7144.
5. Nguyen Ai Thach and Nguyen Minh Thuy. 2017. Effect of extraction conditions on polyphenols, flavonoids, S-Allyl cysteine content and antioxidant activity of black garlic extract. Vietnam Journal of Science and Technology, 55(5A), 18-25. ISSN: 0866-708X.
6. Nguyễn Ái Thạch và Nguyễn Minh Thủy. 2018. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến các hợp chất có hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa của sản phẩm tỏi đen. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 1(86): 59-63. ISSN: 1859-1558.
total polyphenols,
7. Nguyen Ai Thach and Nguyen Minh Thuy. 2019. Study of synthesis and characteristics of total flavonoids and S-allyl cysteine-loaded alginate nanoparticles with various black garlic extracts and alginate ratios. International Journal of Engineering Sciences and Reasearch Technology, 8(6): 261-272. ISSN: 2277-9655.
8. Nguyen Ai Thach, Ha Phuong Thu and Nguyen Minh Thuy. 2019. In-vitro evaluation of cytotoxicity, antimicrobial, and enzyme inhibition activity of black garlic and its nanoparticles. International Journal of Engineering Sciences and Reasearch Technology, 8(10): 59-63. ISSN: 2277-9655.
Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của luận án Ở Việt Nam, tỏi được trồng nhiều tại các vùng Hải Dương, Hà Nội, Bắc Giang, Phan Rang, Lý Sơn, Đà Lạt,… Tỏi Phan Rang có đặc điểm củ nhỏ, vỏ lụa trắng, tinh dầu rất thơm. Nhiều nông hộ áp dụng quy trình VIETGAP vào sản xuất, cung cấp cho người tiêu dùng sản phẩm tỏi bảo đảm chất lượng an toàn. Bảo quản tỏi rất quan trọng để cung cấp sản phẩm cho thị trường rau củ tươi và cho quá trình chế biến. Tỏi có thể được lưu trữ khoảng 1-2 tháng trong điều kiện tốt ở nhiệt độ môi trường xung quanh với RH thấp (< 75%). Tuy nhiên, trong những điều kiện này, củ tỏi sẽ dần dần trở nên mềm, xốp và nhăn nheo do mất nước. Khảo sát độ thuần thục và phương pháp tồn trữ giúp duy trì ổn định nguồn nguyên liệu cho quá trình chế biến và mua bán. Việc tiêu thụ tỏi tươi chưa qua chế biến bị hạn chế do có mùi hăng, vị cay đặc trưng và có xu hướng gây khó chịu cho dạ dày. Trong những năm gần đây, các phương pháp chế biến khác nhau như xử lý nhiệt, lão hóa (aging) và lên men đã được sử dụng để loại bỏ mùi khó chịu và cải thiện vị của tỏi (Bae et al., 2014). Tỏi đen có vị ngọt dịu và độc đáo, cấu trúc mềm dẻo như trái cây sấy, không gây mùi vị khó chịu như tỏi tươi (Wang et al., 2010). Hơn nữa, quá trình chế biến tỏi đen còn liên quan đến sự hình thành các hợp chất phenolic, S-allyl-L-cysteine (SAC) và các hợp chất hoà tan trong nước có tác dụng chống oxy hoá mạnh (Corzo- Martinez et al., 2007; Imai et al., 1994). Vì vậy đây là thực phẩm lý tưởng trong phòng ngừa và điều trị bệnh tim, Alzheimer, viêm khớp và các bệnh mãn tính như bệnh tiểu đường, đặc biệt là bệnh ung thư. Ngoài ra, quá trình lên men, ngoài việc là một phương pháp để bảo quản nguyên liệu tươi trong thời gian ngắn trước khi tiếp tục chế biến, nó có thể
1
mang lại một vài thuận lợi (cải thiện mùi, làm giàu các chất chuyển hóa mong muốn được tạo ra bởi các vi sinh vật và tăng độ an toàn) như đã được báo cáo trong các sản phẩm len men thực vật khác (Buckenhuskes et al., 1990). Hiện nay, các nghiên cứu chuyên sâu về quy trình chế biến và các biến đổi chất lượng sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic đã bắt đầu được quan tâm tại Việt Nam. Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc tạo ra sản phẩm mới (tỏi đen), chưa quan tâm nhiều đến hoạt chất sinh học trong sản phẩm. Do đó, việc nghiên cứu, thiết lập và kiểm soát các thông số kỹ thuật trong chế biến là điều cần thiết và cấp bách nhằm tạo ra sản phẩm có giá trị sinh học và khả năng phòng ngừa bệnh cao tại Việt Nam. Khả năng hấp thu các dược chất quý trong tỏi vào cơ thể đến nay công bố vẫn còn hạn chế, tuy nhiên có thể khẳng định rằng khi nano hóa các hoạt chất trên thì khả năng hấp thu sẽ tăng lên gấp hàng chục lần (Shaikh et al., 2009). Quy trình chế tạo hạt nano tỏi đen khá phức tạp bởi chúng chỉ được hình thành khi đáp ứng các tiêu chí về tính chất vật lý và hóa học đặc trưng. Hạt nano tỏi đen cũng chưa được chế tạo và công bố ở các nghiên cứu trong nước và quốc tế. Vì vậy, nghiên cứu chế biến các sản phẩm từ tỏi với hàm lượng cao các hoạt chất sinh học, đồng thời cùng với việc trích ly hiệu quả các hoạt chất này và ứng dụng công nghệ nano để tăng cường hoạt tính của chúng là cấp thiết. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Nâng cao và cải thiện sinh khả dụng của các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi (tỏi đen và tỏi len men lactic) và công nghệ nano. 1.3 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Khảo sát sự thay đổi đặc tính lý học và hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ.
2
Nội dung 2: Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic.
Nội dung 3: Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải thiện sinh khả dụng của các hợp chất sinh học từ sản phẩm tỏi đen. 1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Nguyên liệu tỏi tươi cổ mềm, giống địa phương được thu hoạch và chọn lựa vào thời điểm mùa vụ năm 2014, 2015, 2016 và 2017 tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận.
Sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic được chế biến và nghiên cứu tại Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ.
Hạt nano tỏi đen được chế tạo bằng cách sử dụng polymer alginate mạch ngắn và thử nghiệm hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào ung thư, ức chế enzyme -glucosidase và AChE, khả năng hạ đường huyết trên chuột nhắt trắng bị tiểu đường tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 1.5 Ý nghĩa của luận án 1.5.1 Ý nghĩa khoa học
Luận án đã cung cấp nhiều kết quả nghiên cứu về độ thuần thục, thời gian thu hoạch và điều kiện bảo quản tỏi tươi. Ngoài ra, cơ chế hình thành tỏi đen và tỏi lên men lactic trong suốt quá trình chế biến cũng được làm rõ. Các mô hình đề xuất và các thiết lập liên quan đến các giá trị tham số động học được đánh giá nhằm có các hiểu hiết chính xác về sự thay đổi của các hợp chất có hoạt tính sinh học trong sản phẩm thực phẩm trong quá trình chế biến. Hạt nano tỏi đen được chế tạo và thử nghiệm thành công ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo góp phần làm đa dạng cơ sở dữ liệu thuốc phục vụ hỗ trợ và điều trị bệnh. 1.5.2 Ý nghĩa thực tế
3
Thông qua quy trình chế biến tỏi đen và tỏi lên men lactic sẽ làm tăng lượng tiêu thụ tỏi cho người nông dân. Nghiên cứu đồng thời quy trình sản xuất hai dạng sản phẩm này cũng nhằm tạo ra nguồn thực phẩm mới có giá trị sinh học cao và là công việc có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Tỏi đen và tỏi lên men lactic trải qua quá trình chế biến có hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học (S-allyl cysteine, polyphenol, flavonoid,…) và hoạt động chống oxy hóa cao hơn so với tỏi tươi. Đặc biệt, các hợp chất này có khả năng ứng dụng cao trong việc bảo vệ sức khỏe và là một liệu pháp phòng ngừa bệnh ung thư cho người tiêu thụ chúng.
Tỏi đen và tỏi lên men lactic cũng góp phần làm đa dạng hơn các sản phẩm từ tỏi ngoài thị trường và cung cấp nguồn thực phẩm giàu “giá trị dược liệu” trong bữa ăn hàng ngày.
Công nghệ nano được áp dụng đồng thời sẽ tăng giá trị sinh học của sản phẩm và mở hướng mới cho việc sử dụng các sản phẩm của tỏi Việt Nam ở mức độ cao và hiệu quả hơn. Ngoài ra, sự ra đời của hệ nano tỏi đen sẽ là niềm hy vọng mới cho các bệnh nhân ung thư, tiểu đường và một số loại bệnh khác. 1.6 Những điểm mới của luận án
Luận án cung cấp thông tin thời điểm thuần thục và điều kiện bảo quản tỏi tươi liên quan đến đặc tính lý học và các hợp chất có hoạt tính sinh học trong suốt quá trình tồn trữ.
Xây dựng được quy trình chế biến tỏi đen và tỏi lên men lactic nhằm tạo ra sản phẩm tỏi có chất lượng cao vượt trội so với tỏi tươi (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng chống oxy hóa trong tỏi đen).
Xây dựng quy trình trích ly các hợp chất sinh học từ tỏi đen và ứng dụng công nghệ nano chế tạo thành công hạt nano tỏi đen mang các chất có hoạt tính sinh học với kích
4
thước 100 nm, hình dạng gần với hình cầu và độ ổn định cao. Hiệu quả thu nhận được từ thử nghiệm hoạt tính của hệ nano tỏi đen ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo cũng được xác định. 1.7 Kết cấu của luận án
Luận án gồm 5 chương: Chương 1-Giới thiệu (trang 1-5); Chương 2-Tổng quan tài liệu (trang 6-30); Chương 3- Phương tiện và phương pháp (trang 31-47); Chương 4-Kết quả và thảo luận (trang 48-135); Chương 5-Kết luận và đề nghị (trang 136-137). Trong nội dung chính có 36 bảng và 84 hình. Trong bài viết sử dụng 282 tài liệu tham khảo (263 tài liệu tiếng Anh và 19 tài liệu tiếng Việt).
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quát về tỏi
lectin, prostaglandin,
Tỏi (Allium sativum L.), một trong những loại thực vật lâu đời nhất được sử dụng trong y học, đã trở thành một phần quan trọng trong của sống của con người qua nhiều thế kỷ. Tỏi được sử dụng như gia vị thực phẩm, tăng cường sức khỏe cho người lính trong chiến tranh, chữa cảm lạnh, nhiễm trùng và điều trị nhiều loại bệnh khác nhau, từ bệnh tim mạch đến ung thư và thậm chí cả bệnh dịch hạch (Amagase, 2006). Thành phần của tỏi rất phức tạp, với hơn 200 hợp chất khác nhau góp phần vào hiệu quả có lợi của tỏi. Những tính năng quan trọng và độc đáo nhất của tỏi là hàm lượng hợp chất lưu huỳnh hữu cơ cao. Tỏi có chứa nhiều lưu huỳnh hơn (ít nhất gấp 4 lần) so với nhiều loại rau chứa lưu huỳnh cao khác: hành tây, bông cải xanh và súp lơ. Tỏi cũng chứa nhiều carbohydrate chứa fructose, protein, xơ, saponin, phospho, kali, kẽm, lượng selen vừa phải và vitamin C, steroid glycoside, tinh dầu, adenosine, vitamins B1, B2, B6, và E, biotin, acid nicotinic, acid béo, glycolipid, phospholipid, anthocyanin, flavonoid, phenol, và
5
acid amin thiết yếu (Borek, 2001; Imai et al., 1994; Amagase et al., 2001; Ide et al., 1999; Borek, 2006; Rahman, 2003). 2.2 Các nghiên cứu liên quan đến điều kiện thu hoạch và tồn trữ củ tỏi sau thu hoạch
Tại Thổ Nhĩ Kỳ, tỏi có thể được bảo quản tại 0-5oC, 60-70% RH trong ít nhất 3-4 tuần trong kho. Đến năm 2012, chưa có phương pháp xử lý nào được thực hiện ở trước và sau thu hoạch tỏi bảo quản tại Thổ Nhĩ Kỳ. Bảo quản tỏi trong điều kiện kiểm soát khí quyển và điều chỉnh khí quyển được sử dụng phổ biến với phương pháp chiếu xạ, hóa chất và gia nhiệt khác nhau ở nước ngoài (Selen and Nilgün, 2012).
Geraldine et al. (2008) đánh giá tính chất vật lý của agar-agar (1%) dựa trên lớp màng phủ kết hợp với 0,2% chitosan và 0,2% acid acetic, cũng như ảnh hưởng của chúng đến lớp màng phủ của tỏi chế biến. Tổn thất ẩm trung bình của tỏi phủ màng thấp hơn 3 lần so với mẫu đối chứng (không phủ màng). Có sự gia tăng đáng kể sự khác biệt về màu sắc (DE*) của mẫu đối chứng so với cách xử lý khác. Tỏi bao màng có cường độ hô hấp (30 mg CO2/kg.giờ) giảm một nửa so với tỏi đối chứng.
Hiện nay, ở Việt Nam, củ tỏi sau khi thu hoạch từ ruộng tỏi sẽ được nông dân xử lý, phơi nắng nhiều ngày và lưu kho. Quy trình đơn giản này sẽ làm tỏi dễ bị thối hỏng, mất nước và dẫn đến giảm giá trị kinh tế. Ngoài ra, các nghiên cứu sau thu hoạch củ tỏi vẫn chưa được công bố nhiều ở nước ta. 2.3 Các nghiên cứu nâng cao hoạt chất sinh học trong tỏi liên quan đến chế biến tỏi đen và tỏi lên men lactic
Ở Việt Nam trước đó, tỏi đen chỉ được nghiên cứu tại Học viện Quân y ở quy mô cấp Nhà nước mã số KC10.TN05/11-15. Theo chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu lên men tỏi đen từ tỏi Lý Sơn và đánh giá tác động sinh học của
6
sản phẩm tạo ra” cho biết quá trình lên men, các hoạt tính sinh học của tỏi Lý Sơn tăng đáng kể, trong đó hàm lượng đường tổng tăng khoảng 13 lần, fructose tăng khoảng 52 lần và SAC tăng gấp 6 lần.
Tỏi đen được chế biến từ tỏi tươi thu hoạch ở xã Quảng Hòa, huyện Quảng Trạch, tỉnh Quảng Bình để ủ và lên men tỏi đen sau 35-55 ngày.Nồi ủ sử dụng có phần nắp trong là viền cao su giữ kín nhiệt, lỗ thông hơi gắn với một nhiệt kế 100oC để theo dõi nhiệt độ trong nồi (Nguyễn Đức Vượng và ctv., 2015). Ngoài ra, Nguyễn Đức Vượng và ctv. (2017) cũng đã sử dụng quy trình lên men tự nhiên bằng nhiệt để chuyển tỏi trắng thành tỏi đen. Tiến hành lên men trong điều kiện 70oC và thời gian lên men từ 35-45 ngày.
Hàm lượng S-allyl cysteine (SAC) tăng lên cũng là một thay đổi quan trọng trong tiến trình chế biến tỏi đen. Tỏi tươi chứa 20-30 g/g SAC (Kodera et al., 2002) và lượng SAC trong tỏi đen cao gấp 5-6 lần so với tỏi tươi (Bae et al., 2012; Wang et al., 2010). SAC được hình thành bởi quá trình thủy phân của -glutamyl-S-allyl cysteine (GSAC) bởi - glutamyl transpeptidase (-GTP, EC 2.3.2.2) (Kodera et al., 2002). SAC là một trong những hợp chất amino acid chứa lưu huỳnh chính và là chất có nhiều lợi ích nhất của tỏi, như chống oxy hóa, chống ung thư, chống các bệnh lý về gan và thần kinh (Kodera et al., 2002). Tỏi muối chua từ năm công ty ở Tây Ban Nha được phân tích về các đặc tính hóa lý, thành phần gần đúng, acid ascorbic, thiamin, riboflavin, -tocopherol, và hàm lượng acid amin. Acid chuẩn độ dao động trong khoảng 0,70 đến 2,66%, trong khi hàm lượng muối trong khoảng 2,39 đến 7,40%. Một sự khác biệt đáng kể trong hàm lượng vitamin, cũng như các đặc điểm hóa lý. Mức độ vitamin phân tích là thiamine (0-0,055 mg/kg), riboflavin (0,013-0,032 mg/kg),
7
-tocopherol (0,36-2,53 mg/kg), và acid ascorbic (0-47,9 mg/100 g) (Casado et al., 2004). Tỏi được bóc vỏ, xử lý (chần và không chần) và tiến hành lên men trong nước muối với sự tham gia của giống vi khuẩn L. plantarum. Quá trình lên men diễn ra trong 7 ngày ở nơi duy trì nhiệt độ 30oC. Theo dõi các tính chất hóa học và vật lý của tỏi sau lên men và sau quá trình bảo quản 3 tháng. Sự phát triển của nấm men hoặc nấm mốc không được phát hiện trong tỏi chần hoặc không chần trong 7 ngày của quá trình lên men. Đối với tỏi chần, pH của nước muối giảm dần, đạt giá trị 3,77 ở 7 ngày. Đối với tỏi không chần có một sự khởi đầu giảm pH của môi trường (4,00), nhưng do sự phát triển của L. Plantarum đã không diễn ra, pH tăng lên (5,65), có lẽ do sự khuếch tán sự hình thành acid vào tỏi trong nước muối (de Castro et al., 1998).
Tỏi tươi (đã bóc vỏ) ngâm ngập trong dung dịch acid acetic 2% và NaCl được bảo quản ở 20oC trong 60 ngày. pH của tỏi muối chua giảm còn khoảng 4 ở ngày thứ 20 của quá trình tồn trữ. Số lượng allicin (thành phần vị cay nồng chính yếu) của tỏi muối chua bởi phân tích HPLC giảm 5,9% vào ngày thứ 40 của quá trình tồn trữ so với allicin trong tỏi tươi (Kim et al., 1993).
Các nghiên cứu trong nước về tỏi cũng còn hạn chế. Đặc biệt các nghiên cứu chuyên sâu về tác động trong quá trình chế biến, tồn trữ và khả năng hấp thu của các hoạt chất có giá trị sinh học trong các sản phẩm từ tỏi vẫn còn rất hạn chế, chưa thấy công bố trên các tài liệu khoa học trong nước và trên thế giới. 2.4 Các nghiên cứu tạo hạt nano mang chất có hoạt tính sinh học từ tỏi hoặc sản phẩm tỏi
Theo Lu et al. (2014) allicin, thành phần hoạt động chính bắt nguồn từ một tác nhân mùi truyền thống trong tỏi, tạo nên hàng loạt các tác dụng sinh học. Nhưng đáng tiếc,
8
tiềm năng lớn của tỏi trong quá trình chế biến bị hạn chế bởi sự nhạy cảm của tỏi đối với các điều kiện nhiệt và kiềm kèm theo mùi hăng của tỏi. Trong nghiên cứu này, nanoliposome allicin đã được điều chế bằng cách sử dụng phương pháp bốc hơi ngược pha nhằm khắc phục các hạn chế đã nêu.
Vũ Bình Dương và Hồ Anh Sơn (2015) đã đánh giá được tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ người A549 của cao khô tỏi đen bằng thử nghiệm trypan blue và MTT. Kết quả cho thấy tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi ủ với tỏi đen nồng độ 2,5-10 mg/mL, tỏi đen ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào A549 với nồng độ gây IC50 ở 24 giờ là 10,57 mg/mL.
Đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào ở trong và ngoài nước chế tạo thành công hạt nano nhỏ hơn 100 nm mang hoạt chất từ tỏi đen đi kèm với các thử nghiệm in-vitro và in- vivo.
Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
Các thí nghiệm được tiến hành thông qua việc lấy mẫu, 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu thực nghiệm, phân tích và xử lý dữ liệu tại:
Ruộng tỏi vào thời điểm mùa vụ năm 2014, 2015, 2016 và 2017 tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận.
Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học; Phòng Thí nghiệm Chuyên sâu - Trường Đại học Cần Thơ.
Phòng Vật liệu Nano Y sinh, Viện Khoa học Vật liệu; Phòng Hóa sinh Ứng dụng, Phòng Hoạt chất Sinh học, Phòng Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên, Viện Hóa học; Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học; Phòng Thiết bị dùng chung, Viện Kỹ thuật Nhiệt đới;
9
Thời gian thực hiện từ tháng 06/2014 đến tháng
Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 03/2018. 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ Một số thiết bị và dụng cụ cơ bản được sử dụng trong các thí nghiệm như sau: - Cân phân tích Ohaus, model PX224/E (Mỹ) - Máy đo cấu trúc Rheotex, model SD700 (Nhật Bản) - Máy đo quang phổ, model 722N (Trung Quốc) thống HPLC-UVD Shimadzu
- Tủ đông Sanyo, model SF- CR27K (Nhật Bản) - Tủ sấy Amerex, model CV250 (Mỹ) - Hệ (Shimadzu, Corporation, Nhật Bản) - Cột sắc ký LiChroCART (Merck, Đức) - Kính hiển vi điện tử quét S-4800 Hitachi, model (Singapore)
- Cân sấy ẩm hồng ngoại, model MX50 (Godex, Mỹ)
- Máy Elisa reader (Biotek, ELx800, USA)
- Tủ mát Alaska, model SL-8C (Trung Quốc) - Tủ làm tỏi đen (80cm x 71cm x 110cm, 50-100oC, RH tối đa ở các nhiệt độ tương ứng) (Việt Nam) - Máy tán xạ ánh sáng động (DLS) Zetasizer Nano, model 7.03 (Anh) - Máy quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier Perkin Elmer (Waltham, Massachusetts, USA) - Máy cô quay chân không Ika, model RV10 digital V (Đức)
- Máy Tecan Genios Fluorescence Luminescence Microplate Reader, model A-5082 (Thụy Sĩ) - Máy đo đường huyết Omron, - Máy khuấy từ gia nhiệt
10
model HGM-111 (Nhật Bản)
IKA, model C-MAGHS7 (Đức) - Máy Elisa reader, model ELx800 (Biotek, Mỹ)
- Bể siêu âm, model Elma P300H (Đức) 3.1.2.2 Hóa chất Một số hóa chất cơ bản được sử dụng trong các thí
- Chất chuẩn S-allyl-L- cysteine ( 98%, Sigma, Mỹ) - Acetonitrile (độ tinh khiết 99,8%) (Merck, Đức)
nghiệm như sau: - Thuốc thử Folin-Ciocalteu (độ tinh khiết 99%) (Merck, Đức) - 1,1-diphenyl-2-picryl- hydrazil (độ tinh khiết 99%) (Merck, Đức) - Chất chuẩn quercetin (độ tinh khiết 98% Sigma, Mỹ)
- Dimethyl sulfoxide (CAS No 67-68-5, Sigma, Mỹ) - Acetylcholinesterase (CAS No 9002-53-8, Sigma, Mỹ)
thử Ellman's
- Enzyme -glucosidase (CAS No 9001-42-7, Sigma, Mỹ) - Alloxan monohydrate (Sigma, Mỹ) -Nitrophenyl--D- - glucopyranoside (CAS No 3767-28-0, Sigma, Mỹ) - Thuốc (DTNB) (Sigma, Mỹ) - Natri alginate (Sigma, Mỹ) trường MRS broth
- 4-Notrophenol (CAS No 100-02-7, Sigma, Mỹ) - Môi (Hemidia, Ấn Độ) Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn để sử dụng trong phân tích. 3.1.3 Nguyên liệu
Nguyên liệu tỏi cổ mềm, giống địa phương được thu hoạch vào buổi sáng sớm, thời tiết nắng ráo. Hình dạng bên ngoài cho thấy cổ cây tỏi đã ngã sang một bên, đầu lá vàng úa và trong khoảng thời gian 130 đến 140 ngày (sau khi gieo) tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận. Chọn lựa củ tỏi không bị sâu, thối hoặc nhiễm
11
nấm. Củ tỏi được cho vào thùng carton và vận chuyển bằng ô tô đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự thay đổi đặc tính lý học và hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ 3.2.1.1 Mục tiêu
Xác định ảnh hưởng của thời điểm thuần thục và điều kiện bảo quản đến đặc tính lý học và các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quá trình tồn trữ. Chọn được thời điểm thu hoạch tỏi có chất lượng tốt nhất và điều kiện tồn trữ thích hợp để áp dụng trong chế biến các sản phẩm tỏi. 3.2.1.2 Bố trí thí nghiệm a Chất lượng củ tỏi ở các thời điểm thu hoạch
Các củ tỏi được thu hoạch tại nhiều ruộng tỏi ở địa bàn phường Văn Hải, thành phố Phan Rang – Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận. Ở mỗi độ tuổi thu hoạch 5 kg củ tỏi. Các củ tỏi được tồn trữ trong túi vải dạng lưới (kích thước lỗ khoảng 0,9 mm). Củ tỏi được phân tích tại phòng thí nghiệm có nhiệt độ phòng 28 – 30oC và RH 68 – 71%. Thí nghiệm được bố trí một nhân tố.
Nhân tố A: độ thuần thục (ngày sau khi gieo): 120, 125, 130, 135 và 140 Số nghiệm thức: 5. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. b Ảnh hưởng của nhiệt độ tồn trữ đến chất lượng củ tỏi
Nhân tố B: nhiệt độ tồn trữ (oC): 0, 5, 20 và nhiệt độ Củ tỏi sau khi thu hoạch được xử lý sơ bộ và tách một lớp vỏ ngoài của củ tỏi nhằm loại bỏ đất cát. Sau đó, các củ tỏi được chứa trong túi vải lưới và tồn trữ ở các nhiệt độ khác nhau. Thí nghiệm được bố trí một nhân tố. phòng (28-30)
Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
12
c Ảnh hưởng của loại bao bì sử dụng đến sự hao hụt khối lượng Chọn củ tỏi ở độ tuổi và nhiệt độ bảo quản thích hợp từ các thí nghiệm trước. Khối lượng tỏi trong bao bì là 500-550 g. Các loại bao bì được sử dụng trong thí nghiệm: PE (24 x 34 cm và dày 38 m), thùng carton (30 x 22,5 x 12,5 cm) với tỷ lệ đục lỗ là 0,5% (đường kính lỗ 5 mm, 20 lỗ trên hai mặt của bao bì với khoảng cách đều nhau) và vải lưới (24 x 34 cm và dày 0,21 mm, kích thước lỗ lưới khoảng 0,9 mm). Các mẫu được tồn trữ ở nhiệt độ thích hợp đã chọn. Thí nghiệm được bố trí một nhân tố.
tương đương (QE/g d.w), hàm
Nhân tố C: loại bao bì: PE, thùng carton và vải lưới Số nghiệm thức: 3. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hao hụt khối lượng (%), hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) (mg acid gallic tương đương (GAE)/g d.w), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) (mg quercetin lượng thiosulfinate tổng số (mol/g d.w), hoạt động chống oxy hóa (%), chỉ số nảy mầm bên trong, màu sắc, độ ẩm (%), cường độ hô hấp. 3.2.2 Nội dung 2: Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic 3.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý nhiệt đến quy trình sản xuất sản phẩm tỏi đen. a Mục tiêu: xác định các thông số tối ưu cho quá trình sản xuất tỏi đen nhằm tạo ra sản phẩm tỏi đen có chất lượng cao (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng chống oxy hóa của tỏi đen). b Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp xử lý nhiệt nguyên liệu đến chất lượng củ tỏi tươi
13
Chọn các củ tỏi còn nguyên vỏ lụa có đường kính trong khoảng 3,60,2 cm để tiến hành thí nghiệm - Phương pháp 1: Chần bằng hơi nước (100oC) trong khoảng thời gian 4, 6, 8 và 10 phút. Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. - Phương pháp 2: Lạnh đông ở nhiệt độ -18oC trong khoảng thời gian 12, 24, 36 và 48 giờ. Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Mẫu đối chứng: không xử lý nhiệt.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: TPC (mg GAE/g d.w), TFC (mg QE/g d.w), hàm lượng thiosulfinate (mol/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%) và đánh giá cảm quan theo phương pháp Phân tích mô tả định lượng (QDA). Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lăo hóa đến chất lượng sản phẩm tỏi đen
Củ tỏi tươi sau khi được xử lý nhiệt sẽ tiếp tục được lão hóa để thành tỏi đen. Chất lượng của tỏi đen được theo dõi sau mỗi 5 hoặc 7 ngày lão hóa cho đến khi kết thúc quá trình chế biến 45 ngày. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với hai nhân tố.
Nhân tố D: nhiệt độ lão hóa (oC): 60, 70, 80 và 90 Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu cần theo dõi: độ ẩm (%), pH, oBrix, hàm lượng đường khử (% d.w), hàm lượng polyphenol tổng số (TPC), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC), hàm lượng thiosulfinate tổng số (mol/g d.w), hoạt động chống oxy hóa (%), hàm lượng SAC (mg/kg d.w) bằng phương pháp HPLC. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến chất lượng sản phẩm tỏi đen
Củ tỏi sau khi lão hóa được tiến hành sấy khô lớp vỏ bên ngoài. Nghiên cứu được bố trí theo mô hình Box- Behnken với 2 nhân tố: Nhân tố F: nhiệt độ sấy (oC): 50, 60 và 70
14
Nhân tố G: thời gian (giờ): 8, 12 và 16 Số nghiệm thức: 3 x 3 = 9. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: hàm lượng polyphenol tổng số (TPC), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) và hoạt động chống oxy hóa (%). Đánh giá cảm quan: theo phương pháp hồi quy logistic. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tồn trữ đến khả năng duy trì các hoạt chất sinh học trong sản phẩm tỏi đen
Tỏi sau khi kết thúc quá trình sấy, được đem bảo quản ở nhiệt độ môi trường (282oC) và nhiệt độ mát (5oC) với hai loại bao bì bảo quản là PA và bao bì phức hợp (tráng nhôm). Mỗi bao bì chứa 300 gram tỏi đen. Tiến hành theo dõi hàm lượng các hợp chất sinh học, khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi đen theo thời gian bảo quản (2 tuần/lần). Mục đích của thí nghiệm là xác định nhiệt độ và loại bao bì bảo quản thích hợp nhằm duy trì giá trị của sản phẩm tỏi đen với chất lượng tốt nhất. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Nhiệt độ tồn trữ (oC): nhiệt độ môi trường (282) và nhiệt độ mát (5) Loại bao bì chứa: polyamide (PA) và bao bì phức hợp (nhôm) Tổng số nghiệm thức: 2 x 2 = 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), hàm lượng flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%). 3.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (pH, nồng độ muối, mật số vi khuẩn acid lactic) đến quy trình sản xuất sản phẩm tỏi lên men lactic.
15
a Mục tiêu: xác định các thông số tối ưu cho quá trình sản xuất lên men nhằm tạo ra sản phẩm tỏi muối chua có chất lượng cao (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng chống oxy hóa trong sản phẩm). b Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chần nguyên liệu tỏi đến chất lượng sản phẩm
Chọn các tép tỏi đã bóc vỏ có chiều dài giữa 20–30 mm, chiều rộng giữa 5–10 mm, có chiều dày giữa 5–10 mm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Các củ tỏi được bóc vỏ và đặt tép tỏi vào trong túi chần với hai lít nước đã được đun nóng trước tới nhiệt độ, thời gian bố trí. Sau khi chần, mẫu tỏi được nhanh chóng làm lạnh trong bồn nước đá 3 phút. Tỏi được để ráo nước ở nơi thoáng mát và đặt vào các túi PA bảo quản ở nhiệt độ 5oC cho đến khi phân tích các hoạt chất sinh học. Nhân tố H: nhiệt độ chần (oC): 70, 80 và 90 Nhân tố I: thời gian chần (giây): 60, 90, 120, 150 và 180 - Đối chứng HoIo: không chần Số nghiệm thức: 3 x 5 = 15. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate (µmol/g d.w), flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%), độ cứng (g lực), màu sắc. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nước muối và mật số vi khuẩn thuần chủng (Lactobacillus plantarum) đến khả năng lên men lactic tỏi Vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuần chủng được sử dụng có nguồn gốc từ bộ sưu tập giống vi sinh vật của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Chủng Lactobacillus plantarum sử dụng bao gồm dòng XK 1.4 được phân lập từ dưa leo muối chua (theo
16
công thức truyền thống) và S 1.2 được phân lập từ bồn bồn (Typha orientalis G.A.) muối chua. Mỗi mẻ tỏi lên men có 0,5 kg tép tỏi đã bóc vỏ, chần ở nhiệt độ và thời gian thích hợp từ thí nghiệm trước. Sau đó bổ sung 0,5 lít dung dịch muối NaCl 0,5, 1,0, 1,5 và 2,0% và đường sucrose bổ sung đến 5 oBrix và đem thanh trùng 100oC trong 5 phút. Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum khởi động được phát triển khoảng 24 giờ ở nhiệt độ phòng trong môi trường MRS Broth với mật độ 108 CFU/mL. Sau đó pha loãng thành 100 mL dung dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum có các mật độ 105, 106 và 107 CFU/mL đến tiến hành len men muối chua. Quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ môi trường và được theo dõi thường xuyên. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Nhân tố J: Nồng độ dung dịch muối (w/v, %): 0,5, 1, 1,5 và 2 Nhân tố K: Mật số vi khuẩn thuần chủng (CFU/mL): 105, 106 và 107 Mẫu đối chứng không bổ sung vi khuẩn thuần chủng. Số nghiệm thức: 4 x 3 = 12. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate (µmol/g d.w), flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%), pH, đánh giá cảm quan. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ và loại rau bổ sung đến chất lượng tỏi lên men
Tỏi được chần ở nhiệt độ và thời gian thích hợp được chọn ra từ thí nghiệm trước. Bổ sung hành lá, hành tây và hành tím với phần trăm khối lượng khác nhau (2,5; 5; 7,5; 10%) vào phần tỏi vừa chần. Sau đó tiến hành lên men thuần chủng với mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum tối thích trong dung dịch muối có nồng độ phù hợp được chọn ra từ kết quả thí nghiệm trên. Sau khi kết thúc quá trình lên men,
17
các nguyên liệu phụ được loại bỏ, phần tỏi còn lại sau lên men được tiến hành phân tích các chỉ tiêu. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Nhân tố L: Loại rau: hành tây, hành tím và hành lá Nhân tố M: Tỷ lệ (%): 2,5, 5, 7,5 và 10 so với lượng tỏi nguyên liệu Số nghiệm thức: 3 x 4 = 12. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate (µmol/g d.w), flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%). Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tồn trữ đến khả năng duy trì các hoạt chất sinh học trong sản phẩm tỏi lên men
Sau khi tách riêng từng tép, loại bỏ những tép nhỏ, bóc lớp vỏ mỏng bên ngoài và rửa sạch, tỏi được chần trong nước ở nhiệt độ và thời gian thích hợp được chọn ra từ thí nghiệm trên. Bổ sung thêm một loại phụ liệu với phần trăm khối lượng nhất định được chọn ra từ kết quả tốt nhất của thí nghiệm trên. Sau đó tiến hành lên men thuần chủng với mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum tối thích trong dung dịch muối có nồng độ phù hợp được chọn ra từ kết quả thí nghiệm trên. Sau khoảng thời gian lên men thích hợp, phụ liệu sẽ được loại bỏ, dịch lên men được thanh trùng ở 100°C trong thời gian 5 phút, sau đó rót nóng ở 70oC vào tỏi sau lên men. Các mẫu được bảo quản ở hai khoảng nhiệt độ khác nhau (30±2 và 5±1oC). Theo dõi khả năng bảo quản đến khi sản phẩm không còn được chấp nhận bởi người tiêu dùng. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố. Nhiệt độ (oC): Nhiệt độ phòng (30±2) và nhiệt độ mát (5±1) Tổng số nghiệm thức: 2. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
18
Các chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng S-allyl cysteine
Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate (µmol/g d.w), hàm lượng flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng trung hòa gốc tự do DPPH (%) và giá trị cảm quan. 3.2.3 Nội dung 3: Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải thiện sinh khả dụng của các hợp chất sinh học từ sản phẩm tỏi chế biến 3.2.3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi đen a Mục tiêu: xác định được điều kiện trích ly tối ưu các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi đen b Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly đến hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học Nhân tố R: Loại dung môi: nước và ethanol pha trong nước cất (50% và 100%) Nhân tố S: Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/5, 1/10 và 1/15 Số nghiệm thức: 3 x 3 = 9. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học Nhân tố T: Nhiệt độ (oC): 40, 50, 60, 70 và 80 Nhân tố U: Thời gian (phút): 30, 60, 90 và 120 Số nghiệm thức: 5 x 4 = 20. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. (mg/kg), polyphenol (mg/g d.w), flavonoid (mg/g d.w). 3.2.3.2 Ứng dụng công nghệ nano góp phần nâng cao giá trị sinh học của sản phẩm tỏi đen a Mục tiêu: chế tạo hạt nano tỏi đen mang các chất có hoạt tính sinh học với kích thước 100 nm, hình dạng gần với hình cầu và độ ổn định cao.
19
b Bố trí thí nghiệm: Tỏi đen được trích ly theo tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10 trong ethanol 50% ở nhiệt độ 60oC trong khoảng 90 phút. Nhỏ từ từ dịch trích tỏi đen thu được vào dung dịch alginate (1 mg/mL) trong máy rung siêu âm với tần số 40 KHz theo tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/1, 2/1, 3/1, 1/2, 1/3. Hỗn hợp được đậy kín và đem khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sau đó, tiến hành bốc hơi ethanol trong thiết bị cô quay chân không ở nhiệt độ 35oC trong 1 giờ với tốc độ 50 vòng/phút. Sau khi đã đuổi hết ethanol, hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu nhận phần dịch phía trên và đem trữ ở nhiệt độ 5oC đến khi sử dụng.
Xác định tính chất và đặc trưng của vật liệu: Hiệu suất bọc thuốc (EE%), hình thái, kích thước và điện thế zeta, quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FT-IR). 3.2.3.3 Thử nghiệm hoạt tính ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo về khả năng hấp thu và tác dụng của các hoạt chất sinh học của hệ nano tỏi đen a Mục tiêu: Xác định và so sánh hiệu quả hoạt tính của hệ nano tỏi đen và tỏi đen ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo b Thử nghiệm in-vitro Thí nghiệm 1: Đánh giá tác dụng gây độc tế bào
Các dòng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn của Mỹ (ATCC) gồm: ung thư biểu mô biểu bì miệng KB (CCL -17TM), ung thư gan Hep G2 (HB - 8065TM), ung thư phổi LU-1 (HTB - 57TM), ung thư vú MCF-7 (HTB - 22TM), ung thư biểu mô thận khỉ Vero và ung thư da SK-Mel 2 (HTB - 68TM).
pháp MTT
Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium) được mô tả lần đầu tiên bởi Tim (1983) và điều chỉnh bởi Cos et al. (1998) và Scudiero et al. (2006). Đây là phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào
20
qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp tím đen) bởi hoạt động của enzym formazan (màu dehydrogenase trong ty thể. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng sinh
(-glucosidase) và
Các chủng vi khuẩn và nấm đại diện gây bệnh ở người trong bộ sưu tập giống vi sinh vật của Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, bao gồm vi khuẩn gram âm: Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442, E. Coli (Ec) ATCC 25922; vi khuẩn gram dương: Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709, Bacillus subtilis (Bs) ATCC 6633, Lactobacillus fermentum N4, Enterococus faecium B650 và nấm mốc Candida albicans (Ca) ATCC 10231. Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp của Franz and Greger (2000) và điều chỉnh bởi Paul et al. (2005). Thí nghiệm 3: Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme gây bệnh bệnh Alzheimer đường tiểu (acetylcholinesterase) - Khả năng ức chế enzyme -glucosidase: Hoạt tính ức chế enzyme gây bệnh tiểu đường -glucosidase được thử nghiệm bằng hai phương pháp:
Phương pháp (1) của Yamaki and Mori (2006) Phương pháp (2) của Kim et al. (2004) và Haimin et al.
(2004) và được điều chỉnh bởi Hakamata et al. (2009) - Khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE)
Hoạt tính ức chế AChE gây bệnh Alzheimer được thử nghiệm bằng phương pháp thử của Ellman et al. (1961), được điều chỉnh bởi Yueqing et al. (2013) và Karthikeyan et al. (2015). c Thử nghiệm in-vivo
Chuột được gây bệnh tiểu đường bằng cách tiêm alloxan monohydrate (Sigma) 135 mg/kg trọng lượng chuột vào dưới da ở khoang bụng.
21
Chuột nhắt trắng 25 con được nuôi trong phòng thí nghiệm có nhiệt độ 272oC, độ ẩm tương đối 42-59%. Các con chuột được chia thành 5 con/nhóm gồm: - Nhóm không uống thuốc (bình thường) - Nhóm uống thuốc điều trị Gliclazide 80 mg - Nhóm uống bột nano tỏi đen - Nhóm uống bột tỏi đen - Nhóm chuột bệnh (không điều trị) 3.3 Phân tích dữ liệu Các số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bìnhđộ lệch chuẩn (STD), đồ thị, biểu đồ bề mặt đáp ứng ở mỗi thí nghiệm. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centurion (version 16.1; Statpoint Technologies, Inc., War, Vir, USA). Sự khác biệt được xem là có ý nghĩa thống kê ở P < 0,05.
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Sự thay đổi đặc tính lý học và hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ 4.1.1 Chất lượng củ tỏi ở các độ tuổi thu hoạch a. Cường độ hô hấp Cường độ hô hấp của củ tỏi chưa thuần thục cao (55-58 mg CO2/kg.giờ) ở giai đoạn thu hoạch 120 đến 125 ngày và bắt đầu chậm lại ở ngày thu hoạch 130 (49 mg CO2/kg.giờ), có thể do củ tỏi đạt đến trạng thái ngủ tự nhiên ở giai đoạn chín sinh lý. Tuy nhiên, cường độ hô hấp của củ tỏi vẫn là rất thấp so với các loại rau củ khác (Brennan and Grandison, 2012). b. Hao hụt khối lượng (%) của củ tỏi ở các giai đoạn thuần thục Sau 10 ngày tồn trữ, hao hụt khối lượng ở các giai đoạn thuần thục đều ở mức thấp. Hao hụt khối lượng trên củ tỏi chủ yếu do sự bay hơi nước. Hàm lượng nước bắt đầu mất ở
22
lớp vỏ bên ngoài. Từ sau 10 ngày tồn trữ, sự hao hụt khối lượng thể hiện rõ ở củ tỏi thu hoạch ở giai đoạn 120 - 125 và giai đoạn 130 đến 140 ngày. Kết thúc quá trình tồn trữ 30 ngày, củ tỏi thu hoạch ở giai đoạn 130-140 ngày thể hiện hao hụt khối lượng thấp nhất. c Thành phần hóa học
Kết quả nghiên cứu cho thấy pH của củ tỏi Phan Rang thu hoạch ở các giai đoạn 120–140 ngày có giá trị pH trong khoảng 6,30 đến 6,53. Kết quả thu được gần giống với nhiều nghiên cứu khác, tỏi tươi có giá trị pH trong khoảng 6,33- 6,42 (Choi et al., 2014; Bae et al., 2014; Fante and Noreña, 2015).
Khi thu hoạch ở thời gian 120 và 125 ngày, tổng hàm lượng chất khô hòa tan trong tỏi ở mức thấp và đạt cao nhất ở ngày 130 (39,0%) và 135 (37,4%). Theo Nuevo and Bautista (2001), hàm lượng chất khô hòa tan và mùi hăng cay trong củ tỏi chưa thuần thục đều thấp. Tuy nhiên, tổng chất khô hòa tan (oBrix) của củ tỏi Phan Rang trong giai đoạn thu hoạch ở giai đoạn120–140 ngày vẫn cao hơn so với một số nghiên cứu khác. Hàm lượng chất khô hòa tan trong tỏi tươi trong khoảng 29-37 °Brix (Vázquez-Barrios et al., 2006; Põldma et al., 2011; Fante and Noreña, 2015).
Độ ẩm trong củ tỏi có sự khác biệt ý nghĩa giữa ngày thu hoạch 120–125 và 130–140. Độ ẩm chỉ đạt đến 63,7% ở ngày 125 và tăng lên 65,94% ở thời điểm 130 ngày có thể do quá trình trương cấu trúc tế bào, sau đó có khuynh hướng giảm nhẹ đến ngày 140. Bên cạnh đó, hàm lượng ẩm trong tỏi tươi đã được công bố vào khoảng 64 đến 66% (Bae et al., 2014; Fante and Noreña, 2015).
Nhìn chung, hàm lượng polyphenol tổng số (2,32-2,7 mg GAE/g d.w), thiosulfinate (7,6-7,96 mol/g d.w) trong củ tỏi Phan Rang không có sự khác biệt ý nghĩa giữa các ngày thu hoạch từ 120–140. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng
23
các chất này trong tỏi Phan Rang ở mức độ trung bình so với nhiều giống tỏi trong các nghiên cứu trước đây. Chẳng hạn, hàm lượng polyphenol tổng số trong tỏi tươi là 511-722 mg GAE/100 g trọng lượng tươi (Põldma et al., 2011).
Hoạt tính chống oxy hóa của tỏi Phan Rang dao động trong khoảng 7,7-8,7%. Trong nghiên cứu của Somman and Napa (2015), hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH của củ tỏi là khá cao, đạt 25,53%. Tuy nhiên, hoạt tính chống oxy hóa của tỏi tươi ở Hàn Quốc được công bố với giá trị thấp hơn như 6,21% (Bae et al., 2014) và 4,65% (Choi et al., 2014). Như vậy, thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi phụ thuộc rất lớn vào giống, điều kiện trồng trọt và khí hậu (Põldma et al., 2011). 4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tồn trữ đến sự thay đổi thành phần hóa lý của củ tỏi a. Hao hụt khối lượng
Hao hụt khối lượng của củ tỏi tăng trong suốt quá trình tồn trữ ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Hao hụt khối lượng thấp nhất khi tồn trữ củ tỏi ở 0oC (6,7%). Tỏi không nhạy cảm với lạnh đông và nhiệt độ 0oC vẫn trên điểm đóng băng của tỏi (Cantwell et al., 2003). Nhiệt độ tồn trữ cao hơn sẽ làm tốc độ bay hơi nước nhanh. Đặc biệt, ở nhiệt độ tồn trữ 5oC, hao hụt khối lượng tăng cao đột ngột sau 120 ngày tồn trữ và hao hụt nhiều hơn so với củ tỏi tồn trữ ở 20oC và nhiệt độ phòng. Mặc dù RH trong các điều kiện tồn trữ thấp nhưng do cấu tạo phần thịt củ tỏi được bao bọc bởi nhiều lớp vỏ lụa và do đó hạn chế tối đa quá trình mất nước. b. Hàm lượng chất khô hòa tan Khi tồn trữ củ tỏi ở các nhiệt độ khác nhau (0, 20 và nhiệt độ phòng 28–30oC) cho thấy có sự ổn định về hàm lượng chất khô hòa tan sau 120 ngày tồn trữ. Tuy nhiên sau 180 ngày tồn trữ, củ tỏi bảo quản ở 5oC thể hiện sự suy giảm đáng kể hàm lượng chất khô hòa tan (từ 38,6 xuống còn 32,1oBrix).
24
Điều này có thể liên quan đến sự nảy mầm nhưng không có mối liên hệ rõ ràng đến chỉ số nảy mầm bên trong hoặc tổn thất khối lượng. c. Hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng lượng polyphenol tổng số biến đổi phức tạp ở các nhiệt độ tồn trữ và có khuynh hướng giảm. Hàm lượng polyphenol tổng số ít bị biến đổi hơn ở nhiệt độ tồn trữ 0oC so với các nhiệt độ tồn trữ còn lại. Đặc biệt, khi tồn trữ củ tỏi ở 5oC, hàm lượng polyphenol tổng số tăng nhanh ở ngày 120. Điều này có thể do hoạt động sinh lý nảy mầm trong củ tỏi đang diễn ra làm tăng hàm lượng polyphenol (Zakarova et al., 2014). Tuy nhiên, sau ngày 120 của quá trình tồn trữ, hàm lượng này lại giảm nhanh. d. Hoạt tính chống oxy hóa
Bên cạnh sự giảm hàm lượng polyphenol tổng số, hoạt tính chống oxy hóa của củ tỏi vẫn ổn định trong suốt quá trình tồn trữ. Kết quả phân tích cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của củ tỏi tồn trữ ở các nhiệt độ 0, 5, 20 và 28-30oC biểu thị các giá trị tương ứng là 7,34-8,45%, 7,37-7,55%, 7,12- 7,67% và 6,64-7,85%. Ngoài polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa, các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong củ tỏi cũng có chức năng tương tự (Gorinstein et al., 2006). e. Hàm lượng thiosulfinate
Nhìn chung, hàm lượng thiosulfinate của củ tỏi ít biến đổi trong quá trình tồn trữ ở các nhiệt độ khác nhau. Tuy nhiên, khi kết thúc quá trình tồn trữ trong khoảng 180 ngày, hàm lượng thiosulfinate đều tăng nhẹ ở mỗi nhiệt độ tồn trữ. Điều này có thể do tiền chất góp phần tạo nên thiosulfinate là alliin tăng trong thời gian tồn trữ ở các nhiệt độ khác nhau (Ichikawa et al., 2006). 4.2 Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic
25
4.2.1 Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen Ảnh hưởng của phương pháp lạnh đông đến chất lượng tỏi tươi Khi thực hiện quá trình lạnh đông củ tỏi trong 36 giờ, các hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng loại bỏ gốc tự do tăng cao nhất (gấp 1,28; 1,20 và 1,19 lần tương ứng so với mẫu đối chứng). Thời gian lạnh đông 36 và 48 giờ cho hàm lượng polyphenol cao hơn đáng kể so với thời gian đông lạnh ở 12 và 24 giờ (P<0,05). Hàm lượng flavonoid trong tỏi thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa (P<0,05) trong thời gian lạnh đông 36 giờ. Với các thời gian đông lạnh còn lại, hàm lượng flavonoid tăng không đáng kể. Ngoài ra, quá trình lạnh đông trong thí nghiệm này ít ảnh hưởng đến hàm lượng thiosulfinate (dao động khoảng 7,89-11,9 mol/g d.w). Khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu tỏi đối chứng 53,99% sau 12, 24, 36 và 48 giờ lần lượt là 58,6; 61,2; 64,2 và 64,0%, tương ứng. Kết quả nghiên cứu phù hợp với kết luận của Tomsone and Kruma (2014) và cho rằng các hợp chất sinh học trong nguyên liệu thực vật sau khi đông lạnh gia tăng có ý nghĩa. Kết quả tương tự có sự gia tăng hàm lượng polyphenol ở nhiệt độ -18oC trong trái cam và táo cũng đã được báo cáo trong nghiên cứu của Polinati et al. (2010). Theo Leong and Oey (2012), những hợp chất sinh học tồn tại dưới dạng liên kết trong tế bào thực vật có thể được giải phóng trong quá trình xử lý chần hoặc đông lạnh, do đó có sự gia tăng những hợp chất sinh học sau quá trình chế biến so với sản phẩm tươi. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lão hóa đến chất lượng sản phẩm tỏi đen a Hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số
Trong quá trình lão hóa, hàm lượng polyphenol tăng nhanh đến đỉnh điểm và giảm nhanh sau đó. Thời gian để
26
hàm lượng polyphenol đạt giá trị cao nhất ở 60, 70, 80, 90oC tương ứng là 45, 25, 20 và 15 ngày. Như vậy, trong khoảng nhiệt độ từ 60-90oC, sử dụng chế độ nhiệt độ cao có thể rút ngắn thời gian cần thiết để hàm lượng polyphenol đạt cực điểm. Tuy nhiên, hàm lượng polyphenol cực điểm thu được ở các chế độ nhiệt độ xử lý không giống nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy, chế độ lão hóa ở 70oC trong 25 ngày cho hàm lượng polyphenol cao nhất (17 mg GAE/g d.w). Kim et al. (2013) cũng đã báo cáo rằng tỏi rất giàu hợp chất phenolic và các hợp chất này trong tỏi đen tăng nhiều lần so với tỏi tươi. b Hàm lượng SAC
Nhân tố
Hàm lượng SAC tăng lên đáng kể trong quá trình xử lý nhiệt, các mẫu tỏi đã qua xử lý nhiệt ở nhiệt độ thấp có lượng SAC cao hơn các mẫu tỏi đã qua xử lý nhiệt ở nhiệt độ cao. Hàm lượng SAC của mẫu tỏi lão hóa ở nhiệt độ 60oC trong 45 ngày là 135,5 mg/kg, trong khi đó lượng SAC trong các mẫu tỏi lão hóa 90oC là 90,8 mg/kg. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến chất lượng sản phẩm tỏi đen Bảng 4.1 Giá trị tối ưu của các hợp chất có hoạt tính sinh học Hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học và khả năng loại bỏ DPPH
Giá trị đạt được/Thông số tối ưu
18,97
Hàm lượng TPC (mgGAE/g)
65,38 10,38
8,67
Hàm lượng TFC (mgQE/g)
57,61 11,11
85,06
Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%)
Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ)
55,51 13,14
27
Đồ thị bề mặt đáp ứng và contour cũng đồng thời thể hiện nhiệt độ và thời gian sấy cần thiết để thu nhận được sản phẩm tỏi đen chứa các hoạt chất sinh học đạt hàm lượng tối ưu. Các điểm giá trị này cũng được thể hiện ở Bảng 4.1. 4.2.2 Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi lên men lactic Ảnh hưởng của phương pháp chần nguyên liệu tỏi đến hoạt chất sinh học và hoạt tính chống oxy hóa trong tỏi a Polyphenol tổng số
Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) có khuynh hướng giảm dưới tác dụng của nhiệt độ chần. Khi chần tỏi ở các nhiệt độ khác nhau (70, 80 và 90oC) thì hàm lượng polyphenol khác biệt có ý nghĩa thống kê P<0,05. Cụ thể, hàm lượng polyphenol cao nhất được xác định trong mẫu tỏi nguyên liệu 4,47 mgGAE/g d.w, hàm lượng polyphenol giảm khi chần ở 70oC là 3,70 mgGAE/g d.w; ở 80oC là 3,93 mgGAE/g d.w và ở nhiệt độ 90oC là 3,16 mgGAE/g d.w. b Flavonoid tổng số
Quá trình xử lý nhiệt bằng phương pháp chần có thể gây thiệt hại các hợp chất flavonoid. Kết quả thu được cho thấy có sự tổn thất nhỏ hàm lượng flavonoid khi chần tỏi ở 80oC trong 90 giây. Hàm lượng flavonoid tổng số trong tỏi chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ và thời gian chần. Hàm lượng flavonoid của mẫu nguyên liệu không qua quá trình chần là 1,67±0,05 mgQE/g d.w và giảm ở các mẫu chần ở nhiệt độ 70, 80 và 90oC. Khi nhiệt độ chần tăng từ 70 đến 80oC thì hàm lượng flavonoid cũng tăng lần lượt từ 1,21 mgQE/g d.w và 1,31 mg QE/g d.w. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá cao thì hàm lượng flavonoid lại giảm, ở 90oC là 1,04 mgQE/g d.w. Điều này cho thấy hàm lượng flavonoid của tỏi phụ thuộc vào nhiệt độ chần (Litaiem et al., 2013).
28
Ảnh hưởng của nồng độ NaCl và mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum bổ sung vào dịch lên men đến hoạt chất sinh học và hoạt tính chống oxy hóa trong tỏi lên men a Polyphenol tổng số
Khi tăng mật số vi khuẩn (từ 105 đến 107 CFU/mL) và nồng độ NaCl (từ 0,5 đến 2%), hàm lượng polyphenol thay đổi theo mô hình đường cong. Kết quả d ṭ ́m từ đồ thị được giá trị TPC cao nhất đạt 17,70 mgGAE/g d.w ứng với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL, nồng độ muối 1% (sau 6 ngày lên men). Hàm lượng polyphenol tăng lên sau quá trình lên men có thể được giải thích là do giải phóng các hợp chất phenol đơn giản bởi acid và enzyme thủy phân. b Flavonoid tổng số
Khi tăng mật số vi khuẩn (từ 105 đến 107 CFU/mL) và nồng độ NaCl (từ 0,5 đến 2%) thì hàm lượng flavonoid thay đổi theo mô hình đường cong. Kết quả dò tìm từ đồ thị tìm được giá trị TFC cao nhất đạt 6,1 mg QE/g d.w ứng với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL, nồng độ muối 1% (sau 6 ngày lên men). Enzyme glucosidase, amylase, cellulase, tannase, esterase, invertase và các enzyme khác có nguồn gốc từ vi khuẩn trong quá tŕnh lên men lactic có thể thủy phân các hợp chất glucoside. Các enzyme này đóng vai trò trong việc phá hủy thành tế bào thực vật và do đó làm tăng hàm lượng flavonoid. 4.3 Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải thiện sinh khả dụng của các hợp chất sinh học từ các sản phẩm tỏi chế biến 4.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi đen Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu tỏi đen/dung môi và loại dung môi đến các chất có hoạt tính sinh học và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi đen
29
Hàm lượng polyphenol của các dịch trích thu được theo tỷ lệ nguyên liệu tỏi đen/dung môi và loại dung môi trích ly khác nhau cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa (p<0,05). Hàm lượng polyphenol cao nhất (7,94 mg GAE/g) thu được với dung môi ethanol 50%, tiếp theo là ethanol 100% và thấp nhất là nước (4,97 mg GAE/g) ở tỷ lệ trích ly 1/10. Hàm lượng polyphenol thu được trong dung dịch ethanol cao hơn so với nước. Điều này có thể do sự hiện diện của các tạp chất (acid hữu cơ, glucid, protein hòa tan). Tạp chất làm ảnh hưởng đến việc xác định các hợp chất phenol.
a.
b.
Hình 4.1 Sắc ký đồ của dung dịch SAC chuẩn (a) và SAC trong tỏi đen (b)
30
Hàm lượng SAC được phân tích bằng phương pháp HPLC (Hình 4.1). SAC là một hợp chất có hoạt tính sinh học tan trong nước được hình thành trong quá trình thủy phân γ- glutamyl-S-allylcysteine do γ-glutamyl transpeptidase. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng SAC thu được trong dịch trích nước (76,0 mg/kg) cao hơn đáng kể so với so với dung dịch ethanol (50% và 100%) (62,6 mg/kg và 20,3 mg/kg, tương ứng) ở tỷ lệ trích 1/10. Dung môi ethanol không thích hợp để trích ly SAC. Tỷ lệ trích 1/5 cho thấy hàm lượng SAC thu được là thấp nhất; tỷ lệ trích 1/10 và 1/15 cho thấy không có sự khác biệt ý nghĩa (p>0,05) ở cả 3 loại dung môi. 4.3.2 Đặc trưng và tính chất của hệ nano tỏi đen Hình thái và kích thước
Các ảnh FE-SEM cho thấy hạt nano tỏi đen được chế tạo ở các tỷ lệ khác nhau đều có hình dạng gần với hình cầu, kích thước nằm trong khoảng 60-80 nm và ít kết tụ (Hình 4.2). Riêng Hình 4.2a thể hiện hình thái của tỏi đen khi chưa được nano hóa, các hợp chất tạo thành khối không có hình dạng xác định và kích thước khá lớn. Kết quả cho thấy sự phân bố kích thước của hệ nano tỏi đen cho thấy kích thước hạt trung bình là 109-178 nm, tất cả đều phân tán tốt (100%). Đường kính đo được trong DLS là đường kính thủy động lực học nên kết quả là kích thước lớn hơn hạt được đo bằng kính hiển vi điện tử quét. Kích thước hạt nhỏ (< 200 nm) có thể đảm bảo làm tăng tính thấm qua thành mạch, mức độ thấp hơn sự hấp thu của hệ thống lưới nội mô và nâng cao tỷ lệ sử dụng vật liệu bọc (Lu et al., 2014). Do đó, phạm vi kích thước của hệ nano tỏi đen được chuẩn bị trong nghiên cứu này là hoàn toàn phù hợp trong thử nghiệm in vivo.
31
(a)
(b)
(c)
(d)
(f)
(e) Hình 4.2 Ảnh FE-SEM của hệ dịch tỏi đen (a) và hệ nano tỏi đen tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/1 (b), 2/1 (c), 3/1 (d), 1/2 (e), 1/3 (f).
Sự phân bố hạt và điện thế zeta
Khi dấu điện tích của các hạt giống nhau có thể đẩy nhau, với alginate có kích thước đủ nhỏ và tỷ trọng thấp trong hệ treo, điện thế zeta cao sẽ làm ổn định bởi vì sự phân tán sẽ chống lại sự kết tụ (Sou, 2011). Sự phân bố điện thế zeta của hệ nano tỏi đen (Hình 4.3) được chế tạo ở các tỷ lệ cho thấy giá trị điện thế zeta trong khoảng 11,0-22,5 mV. Từ những kết quả này có thể suy luận rằng hệ treo hạt nano tỏi đen mang điện tích âm với kích thước hạt nhỏ và điện thế zeta khá cao là một sự phân tán tương đối ổn định. Phổ FT-IR
Việc xác định các hợp chất bằng cách sử dụng phổ hồng ngoại dựa trên sự tồn tại tần số đặc trưng của nhóm chức, chúng có cùng một giá trị gần như nhau bất kể hợp chất có nhóm chức năng nào khác xuất hiện trong đó. Sự khác biệt về quang phổ hồng ngoại của chúng chủ yếu do khác biệt về cường độ hấp thụ. Phổ FT-IR (Hình 4.4) của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/1, 2/1, 3/1, 1/2 và 1/3 không có sự khác biệt ý
32
nghĩa và cũng không có sự hình thành các đỉnh lạ. Điều này minh chứng cho việc không có liên kết hóa học mới nào được hình thành, khẳng định hơn nữa rằng các hợp chất và vật liệu alginate được kết hợp thông qua các tương tác vật lý chứ không phải là các phản ứng hóa học.
bot toi
105
4 1 1. 0 4
100
95
90
)
%
8 3 9. 5 8
8 8.9 0 7
8 3 3. 6 7
0 1 8. 7 5
(
85
6 6 1. 3 9
80
75
0 8 6. 3 6 1
70
e c n a tt mi s n a Tr %
3 3 9. 1 4 1
n ề y u r t n ẫ d ộ Đ
65
3 8 7. 2 9 2
60
0 0 5. 5 1 1
2 1 0. 8 0 1
55
50
9 0 3. 2 0 1
45
4 7.7 1 4 3
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
Wav enu mber s ( cm- 1)
Số sóng (cm-1)
Hình 4.3 Điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 2/1
Hình 4.4 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen 4.4 Hoạt tính trong thử nghiệm in-vitro và in-vivo về khả năng hấp thu và tác dụng của các hoạt chất sinh học của hệ nano tỏi đen 4.4.1 Thử nghiệm in-vitro Tác dụng gây độc tế bào
Trị liệu sử dụng dạng hạt nano là một phương pháp đang nổi lên trong điều trị ung thư và các rối loạn viêm 33
nhiễm khác. Viện ung thư quốc gia Mỹ (The National Cancer Institute) đã công nhận công nghệ nano là một lĩnh vực đang có tiềm năng trong cuộc cách mạng y học hiện đại nhằm phát hiện, điều trị và phòng ngừa ung thư (Nair et al., 2010). Kết quả cho thấy cả hai hệ nano tỏi đen và tỏi đen đều dương tính với các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, ngoại trừ tế bào ung thư vú. Điều này cho thấy tác dụng tích cực của hệ nano tỏi đen và tỏi đen trong điều trị bệnh ung thư ở kỹ thuật in-vitro. Hoạt tính kháng sinh
Mẫu tỏi đen không thể hiện hoạt tính đối với các dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Enterococus faecium, E. Coli và nấm Candida albicans ở nồng độ 256 g/mL. Trong khi đó, hệ nano tỏi đen đều thể hiện hoạt tính trên tất cả 7 dòng vi sinh vật thử nghiệm. Ở nồng độ 256 g/mL, hệ nano tỏi đen đã cho hoạt tính với Staphylococcus aureus và Enterococus faecium. Tiếp theo ở nồng độ 64 g/mL và 16 g/mL đã thể hiện hoạt tính lần lượt với Lactobacillus fermentum, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus subtilis, E. Coli, Candida albicans, tương ứng. Hoạt tính ức chế enzyme gây bệnh tiểu đường (- glucosidase) và bệnh Alzheimer (acetylcholinesterase) a Enzyme -glucosidase
Khả năng ức chế enzyme -glucosidase ở cả hai phương pháp thử (1) và (2). Đối với phương pháp (1), hệ nano tỏi đen ức chế 33,2% cao hơn so với tỏi đen 13,4%. Bên cạnh đó, ở phương pháp (2), tỏi đen không ức chế được enzyme -glucosidase ở nồng độ 256 g/mL. Song song đó, hệ nano tỏi đen đã ức chế được nó ở nồng độ ≥ 64 g/mL. b Enzyme acetylcholinesterase Cả hai hệ nano tỏi đen và tỏi đen đều không có khả
năng ức chế AChE ở nồng độ 128 g/mL.
34
4.4.2 Thử nghiệm in-vivo Ảnh hưởng của bột hệ nano tỏi đen và tỏi đen trên glucose huyết và sự tăng trọng của chuột
Kết quả thử nghiệm cho thấy không có sự khác biệt ý nghĩa về đường huyết và trọng lượng chuột sau thời gian 1 tuần giữa chuột được sử dụng bột hệ nano tỏi đen/tỏi đen và chuột đối chứng (uống nước cất). Ngoài ra, quan sát bằng mắt thường cho thấy các con chuột thí nghiệm vẫn bình thường, không có các biểu hiện xấu như rụng lông nhiều, lông bị vón cục, di chuyển chậm hay chết. Điều này cho thấy tác nhân điều trị là bột hệ nano tỏi đen/tỏi đen không có ảnh hưởng xấu (gây độc tính cấp) đến đường huyết và sức khỏe của chuột ở liều sử dụng 250 mg/kg trọng lượng chuột trong 7 ngày. Khả năng hạ đường huyết của bột hệ nano tỏi đen và tỏi đen ở chuột bị tiểu đường
Sau khi tiêm alloxan monohydrate 135 mg/kg trọng lượng chuột khoảng 1 tuần, đường huyết của nhóm chuột thử nghiệm điều trị tăng lên đáng kể (từ 124-131 đến 421-445 mg/dL) so với nhóm chuột đối chứng (uống nước cất) (130 mg/dL).
Kết thúc quá trình sau 21 ngày điều trị, nhóm chuột không uống thuốc (đối chứng) vẫn giữ được đường huyết ổn định từ 130-137 mg/dL, sức khỏe vẫn duy trì tốt. Nhóm chuột sử dụng thuốc điều trị Gliclazide cho thấy hiệu quả làm giảm đường huyết là tốt nhất từ 445 mg/dL xuống còn 167 mg/dL. Theo sau đó là nhóm chuột uống bột nano tỏi đen (từ 421 mg/dL xuống còn 195 mg/dL) và bột tỏi đen (từ 436 mg/dL xuống còn 332 mg/dL). Mặt khác, nhóm chuột bệnh (không điều trị) có dấu hiệu di chuyển chậm, không linh hoạt, bỏ ăn, chạy sảng, chết không đồng loạt ở giai đoạn đầu và chết hoàn toàn sau 7 ngày.
35
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận Thời gian thu hoạch tỏi phù hợp trong khoảng 130 đến 135 ngày sau khi gieo. Củ tỏi được bảo quản trong bao bì vải lưới ở nhiệt độ 0oC có khả năng duy trì tốt chất lượng khoảng 6 tháng.
Trong chế biến tỏi đen, tỏi được lạnh đông -18oC trong 36 giờ có khả năng thúc đẩy làm tăng các hợp chất sinh học trong tỏi. Nhiệt độ 70oC tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chế biến tỏi đen, cụ thể hàm lượng polyphenol tăng 6,5 lần so với tỏi tươi. Hàm lượng SAC tăng lên ở mức độ cao hơn ở nhiệt độ lão hóa tương đối thấp. Sản phẩm tỏi đen có khả năng tồn trữ tốt ở nhiệt độ mát (khoảng 5oC) trong bao bì nhôm. Đối với sản phẩm tỏi lên men, tép tỏi được chần ở nhiệt độ 80oC trong 90 giây thể hiện sự ít tổn thất các hợp chất trên. Trong quá trình lên men acid lactic, hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số, hoạt tính chống oxy hóa của tỏi tăng lên đáng kể. Trong khi đó, hàm lượng thiosulfinate giảm dần sau 6 ngày lên men trong dung dịch có nồng độ muối NaCl 1% và mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum 106 CFU/mL. Sản phẩm tỏi lên men lactic vẫn duy trì được các hợp chất sinh học (polyphenol, flavonoid và thiosulfinate) và khả năng chống oxy hóa khi được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4-6oC trong dung dịch lên men thanh trùng trong thời gian 2 tháng. Hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học thu được cao theo tỷ lệ trích ly nguyên liệu/dung môi là 1/10 trong dung môi ethanol 50%. Bên cạnh đó, khả năng trích ly các hợp chất sinh học cao nhất ở nhiệt độ 60oC trong khoảng 90 phút. Hệ nano tỏi đen được chế tạo bởi alginate có kích cỡ hạt trong khoảng 60-80 nm và phân bố trong nước với kích thước 109-178 nm. Các hạt nano tỏi đen phân tán khá ổn định với điện thế zeta -11-22,5 mV. Thông qua phổ FT-IR
36
cũng cho thấy không có sự hình thành các hợp chất mới trong quá trình chế tạo hạt nano.
Hệ nano tỏi đen đều dương tính và có hoạt tính vượt trội so với tỏi đen trên tế bào ung thư biểu mô biểu bì miệng, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư biểu mô thận khỉ, tế bào ung thư da và âm tính với tế bào ung thư vú. Chúng đều thể hiện hoạt tính trên tất cả 7 dòng vi sinh vật thử nghiệm. Hệ nano tỏi đen có thể ức chế enzyme - glucosidase gây bệnh tiểu đường nhưng không có tác dụng đối với AChE gây bệnh Alzheimer. Thêm vào đó, hệ nano tỏi đen có khả năng hạ đường huyết ở chuột bệnh tiểu đường từ 421 xuống còn 195 mg/dL sau 21 ngày điều trị. 5.2 Đề nghị
Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm trong quá trình chế biến tỏi đen hoặc thay đổi nhiệt độ trong chế biến tỏi đen theo gradient.
Chế tạo hạt nano tỏi đen bằng các phức hợp polymer nhân tạo và thử nghiệm ở kỹ thuật in-situ và ex-vivo về hoạt tính của hệ nano tỏi đen.
