Luận án Tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Ứng dụng các kỹ thuật lên men, xử lý nhiệt và nano trong chế biến và nâng cao giá trị các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN ÁI THẠCH

ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT LÊN MEN,

XỬ LÝ NHIỆT VÀ NANO TRONG CHẾ BIẾN VÀ NÂNG CAO GIÁ TRỊ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TỎI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÃ NGÀNH 62540101

2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN ÁI THẠCH

ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT LÊN MEN,

XỬ LÝ NHIỆT VÀ NANO TRONG CHẾ BIẾN VÀ NÂNG CAO GIÁ TRỊ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TỎI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÃ NGÀNH 62540101

NGƯỜI HƯỚNG DẪN

PGs. Ts. NGUYỄN MINH THỦY

Ts. HÀ PHƯƠNG THƯ

2020

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn PGs. Ts. Nguyễn Minh Thủy và Ts. Hà Phương Thư đã hướng dẫn tận tình; truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu; động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ.

Tôi xin thể hiện lòng biết ơn đến:

Quý Thầy, Cô và các anh, chị, em nghiên cứu viên trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức và quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu.

Tập thể cán bộ Phòng Vật liệu Nano Y sinh, Viện Khoa học Vật liệu; Phòng Hóa sinh Ứng dụng, Phòng Hoạt chất Sinh học, Phòng Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên, Viện Hóa học; Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học; Phòng Thiết bị dùng chung, Viện Kỹ thuật Nhiệt đới; Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện nghiên cứu, giúp đỡ và truyền đạt kiến thức cho tôi.

Tập thể cán bộ Phòng nghiên cứu chuyên sâu, Trường Đại học Cần Thơ

đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu.

Các anh, chị, em và tập thể lớp Cao học Công nghệ sau thu hoạch K21

đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến:

Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ;

Ban giám hiệu Trường Đại học Tiền Giang;

Lãnh đạo Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam;

Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp;

Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học;

Ban chủ nhiệm Khoa Sau đại học;

Đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận án.

Ngoài ra, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ba Mẹ và người thân đã nuôi dạy và giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu làm luận án.

Trân trọng,

Nguyễn Ái Thạch

TÓM TẮT

Các sản phẩm chế biến từ tỏi (Allium sativum L.) có thể mở ra hướng sử dụng tỏi nhiều hơn để đáp ứng nhu cầu sức khỏe và phòng chống bệnh tật cho người sử dụng. Tỏi đen hoặc tỏi lên men thể hiện tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ và hương vị dịu hơn so với tỏi tươi. Bên cạnh đó, hội tụ của công nghệ nano với các công nghệ khác cũng sẽ tác động lớn đến sản xuất, chế biến và bảo quản tỏi. Vì vậy, nghiên cứu tác động của kỹ thuật chế biến, bảo quản, xây dựng các mô hình động học biến đổi các hoạt chất quan trọng trong các sản phẩm từ tỏi với công nghệ nano được ứng dụng nhằm duy trì và nâng cao chất lượng sản phẩm cho quá trình sử dụng ở mức độ cao và hiệu quả hơn.

Củ tỏi được thu hoạch ở độ tuổi 130-135 ngày sau khi gieo có chất lượng cao nhất và cường độ hô hấp thấp. Nhiệt độ 0oC cung cấp điều kiện tồn trữ tốt nhất đảm bảo chất lượng của củ tỏi đến 180 ngày tồn trữ trong bao bì vải lưới.

Trong chế biến tỏi đen, cả hai biện pháp chần và lạnh đông tỏi nguyên củ đều cho hàm lượng các hợp chất sinh học cao hơn so với tỏi tươi. Thực hiện quá trình đông lạnh tỏi trong thời gian 36 giờ ở nhiệt độ -18oC là biện pháp tiền xử lý hiệu quả cho hàm lượng các hợp chất sinh học và khả năng chống oxy hóa cao. Nhiệt độ 70oC tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chế biến tỏi đen, cụ thể hàm lượng polyphenol tăng 6,5 lần so với tỏi tươi. Các thông số tối ưu đạt được khi sấy tỏi đen ở nhiệt độ 58,78oC với thời gian 12,25 giờ. Ngoài ra, sản phẩm tỏi đen có khả năng tồn trữ tốt ở nhiệt độ mát (5oC) trong bao bì nhôm. Trong điều kiện này, hàm lượng các hợp chất sinh học trong sản phẩm được duy trì ở mức độ cao nhất.

Trong chế biến tỏi lên men lactic, các tép tỏi được chần ở nhiệt độ 80oC trong 90 giây thể hiện sự tổn thất thấp nhất các hợp chất trên. Trong quá trình lên men acid lactic, hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số, hoạt tính chống oxy hóa của tỏi tăng lên đáng kể. Trong khi đó, hàm lượng thiosulfinate giảm dần sau 6 ngày lên men trong dung dịch có nồng độ muối NaCl 1% và mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum 106 CFU/mL. Bên cạnh đó, sản phẩm tỏi lên men lactic vẫn duy trì được các hợp chất sinh học (polyphenol, flavonoid và thiosulfinate) và khả năng chống oxy hóa khi được bảo quản ở điều kiện nhệt độ 4-6oC trong dung dịch lên men thanh trùng trong thời gian 2 tháng.

Từ các kết quả đạt được (được đề cập phần trên) cho thấy tỏi đen là sản phẩm chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học hơn tỏi lên men lactic. Hệ nano tỏi đen được chế tạo bởi alginate có kích cỡ hạt trong khoảng 60-80 nm đo bằng kính hiển vi điện tử quét và phân bố trong nước với kích thước 109- 178 nm. Các hạt nano tỏi đen phân tán khá ổn định với điện thế zeta -11-22,5 mV và không có sự hình thành các hợp chất mới trong quá trình chế tạo hạt nano thông qua phổ chuyển đổi hồng ngoại Fourier.

Hệ nano tỏi đen đều dương tính và có hoạt tính vượt trội so với tỏi đen trên tế bào ung thư biểu mô biểu bì miệng, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư biểu mô thận khỉ, tế bào ung thư da và âm tính với tế bào ung thư vú. Trong khi đó, hệ nano tỏi đen đều thể hiện hoạt tính trên tất cả bảy dòng vi sinh vật thử nghiệm. Hệ nano tỏi đen có thể ức chế enzyme - glucosidase gây bệnh tiểu đường nhưng không có tác dụng đối với AChE gây bệnh Alzheimer. Ngoài ra, hạt nano tỏi đen sử dụng an toàn cho chuột ở liều sử dụng 250 mg/kg trọng lượng cơ thể và có khả năng hạ đường huyết ở chuột bệnh tiểu đường từ 421 xuống còn 195 mg/dL sau 21 ngày điều trị.

Từ khóa: Chống oxy hóa, lão hóa, lên men, nano hóa, tỏi, tồn trữ.

SUMMARY

The products made from garlic (Allium sativum L.) which might help to use more garlic for health promotion and disease prevention. Black garlic or lacto-fermented garlic has strong antioxidant and milder flavor than fresh garlic. Besides that, convergence of nanotechnology with other technologies also has a major impact on production, processing and preservation of garlic. Therefore, study the effect of processing techniques, preservation and construction of kinetic model to describe the bioactive compounds changes in garlic products with nanotechnology applications will be helpful to maintain and enhance quality products in order to use them efficiently.

Raw garlic bulbs were harvested at 130-135 days after planting which had the highest quality and low respiration rate. The temperature at 0°C provides the best storage conditions for garlic quality up to 180 days during storage in mesh bag.

For black garlic processing, both blanching and freezing treatments help to improve bioactive compounds than fresh garlic. Among the pretreatment conditions, frozen garlic at -18oC for 36 hours had the greatest impact on the total phenolic content, flavonoid and antioxidant activities of garlic. These results indicated that freezing can promote the generation of functional materials. At 70oC, the total polyphenol content increased by about 6.5 times in black garlic than that in fresh garlic. The optimal drying was found at 58.78°C for 12.25 hours by means of response surface methodology. Moreover, black garlic has good storage capacity at low temperature (about 5oC) in aluminum packaging. In this condition, the content of bioactive compounds in which is maintained to the highest level.

For lacto-fermented garlic processing, the obtained results showed that the minor losses in bioactive compounds were observed after blanching operation at 80oC for 90 seconds. Pickled garlic processing with bacteria density of 106 CFU/mL after 6 days showed the highest polyphenol content than that with 105 and 107 CFU/mL. Besides, additional salt concentration also affects the polyphenol content. Pickled garlic in salt concentration solution of NaCl 1% and Lactobacillus plantarum density about 106 CFU/mL after 6 days of fermentation showed that phenolic and flavonoid contents and radical scavenging activity using DPPH method of garlic increased significantly while decreasing thiosulfinate content. In addition, lacto-fermented garlic still maintains bioactive compounds such as polyphenols, flavonoids and

iii

thiosulfinates and antioxidant capacity when that was stored at 4-6°C in pasteurized fermentation solution for two months.

The above results showed that black garlic is a product containing more bioactive compounds than pickled garlic. The black garlic nanoparticles produced by alginate polymer had a particle size of 60-80 nm using SEM and were distributed in water with particle size about 109-178 nm. Black garlic nanoparticles well dispersed stability with zeta potential about -11.0-22.5 mV. There were not new substances were formed during nanoparticles creating by using FT-IR.

Black garlic nanoparticles system are positive for human oral cancer cells, liver cancer cells, lung cancer cells, monkey kidney cancer cells, skin cancer cells and negative for breast cancer cells. They showed inhibited activity on seven microorganism lines in this study. Black garlic nanoparticles may inhibit -glucosidase enzyme which is involved diabetic but not AChE that is involved Alzheimer's. Nanosize of black garlic systems were safety at doses of 250 mg/kg body weight and were hypoglycemic in the diabetic rats from 421 to 195 mg/dL after 21 days of treatment.

Từ khóa: Aged, antioxidant, fermentation, garlic, nanoization, storage.

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

-----------------------------------

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này được thực hiện và hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và những kết quả này chưa được sử dụng cho bất kỳ luận án cùng cấp nào.

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2020

(ký, ghi rõ họ tên)

Cán bộ hướng dẫn chính Tác giả luận án

(ký, ghi rõ họ tên)

Nguyễn Ái Thạch Nguyễn Minh Thủy

(ký, ghi rõ họ tên)

Cán bộ hướng dẫn phụ

Hà Phương Thư

MỤC LỤC

TÓM TẮT............................................................................................................... i

SUMMARY .......................................................................................................... iii

DANH SÁCH BẢNG.............................................................................................ix

DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ..............................................................................xvi

Chương 1: GIỚI THIỆU........................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề ..........................................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ...........................................................................................2 1.2.1 Mục tiêu chung................................................................................................2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể................................................................................................3 1.3 Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................3 1.3.1 Nội dung 1: Khảo sát sự thay đổi đặc tính lý học và hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ............3 1.3.2 Nội dung 2: Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic...................................3 1.3.3 Nội dung 3: Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải thiện sinh khả dụng của các hợp chất sinh học từ sản phẩm tỏi đen ................................................................3 1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.......................................................................4 1.5 Ý nghĩa của luận án ............................................................................................4 1.5.1 Ý nghĩa khoa học.............................................................................................4 1.5.2 Ý nghĩa thực tế ................................................................................................4 1.6 Những điểm mới của luận án ..............................................................................5

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................6 2.1 Giới thiệu tổng quan ...........................................................................................6 2.1.1 Tổng quát về tỏi...............................................................................................6 2.1.2 Áp dụng các biện pháp xử lý nhiệt trong chế biến tỏi đen ..............................10 2.1.3 Chế biến theo phương pháp lên men lactic.....................................................12 2.1.4 Một số sản phẩm tỏi khác ..............................................................................14 2.1.5 Kỹ thuật nano trong công nghệ thực phẩm.....................................................15 2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước........................................................21 2.2.1 Các nghiên cứu liên quan đến điều kiện thu hoạch và tồn trữ củ tỏi sau thu hoạch................................................................................................................21 2.2.2 Các nghiên cứu nâng cao hoạt chất sinh học trong tỏi liên quan đến chế biến tỏi đen.............................................................................................................23

2.2.3 Các nghiên cứu nâng cao hoạt chất sinh học trong tỏi liên quan đến chế biến tỏi lên men acid lactic .....................................................................................27 2.2.4 Các nghiên cứu tạo hạt nano mang chất có hoạt tính sinh học từ tỏi hoặc sản phẩm tỏi và thử nghiệm hoạt tính có liên quan .................................................28

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................31 3.1 Phương tiện nghiên cứu ....................................................................................31 3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................31 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất .........................................................................31 3.1.3 Nguyên liệu ...................................................................................................33 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu ..............................................................33 3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự thay đổi đặc tính lý học và hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ..........33 3.2.2 Nội dung 2: Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic.................................35 3.2.3 Nội dung 3: Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải thiện sinh khả dụng của các hợp chất sinh học từ sản phẩm tỏi chế biến.......................................................40 3.3 Phân tích dữ liệu...............................................................................................46 3.3.1 Xây dựng các mô hình động học....................................................................47 3.3.2 Xây dựng các mô hình bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) ............................................................................................47

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................48 4.1 Sự thay đổi đặc tính lý học và hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ........................................48 4.1.1 Chất lượng củ tỏi ở các độ tuổi thu hoạch ......................................................48 4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tồn trữ đến sự thay đổi thành phần hóa lý của củ tỏi...........................................................................................................................52 4.1.3 Ảnh hưởng của loại bao bì đến sự hao hụt khối lượng của củ tỏi trong quá trình tồn trữ......................................................................................................56 4.2 Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic ......................................................57 4.2.1 Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen.......................................................................................57 4.2.2 Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi lên men lactic.............................................................................83 4.3 Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải thiện sinh khả dụng của các hợp chất sinh học từ các sản phẩm tỏi chế biến...................................................................116 4.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi đen ..................................................................................................116

vii

4.3.2 Đặc trưng và tính chất của hệ nano tỏi đen...................................................122 4.4 Hoạt tính trong thử nghiệm in-vitro và in-vivo về khả năng hấp thu và tác dụng của các hoạt chất sinh học của hệ nano tỏi đen.............................................130 4.4.1 Thử nghiệm in-vitro.....................................................................................130 4.4.2 Thử nghiệm in-vivo .....................................................................................133

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..............................................................136 5.1 Kết luận..........................................................................................................136 5.2 Đề nghị...........................................................................................................137

TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................138

PHỤ LỤC.............................................................................................................xix

viii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1 Thành phần hóa học và đặc tính chống oxy hóa của củ tỏi ở các thời điểm thu hoạch .......................................................................................................51

Bảng 4.2 Độ cứng chủ quan của củ tỏi ở các nhiệt độ khác nhau theo thời gian tồn trữ ....................................................................................................................53

Bảng 4.3 Sự thay đổi hàm lượng SAC (mg/kg d.w) của tỏi trong suốt quá trình lão hóa ở các mức nhiệt độ khác nhau ....................................................................65

Bảng 4.4 Mô hình sự thoái hóa thiosulfinate ở các nhiệt độ khác nhau ...................70

Bảng 4.5 Bảng phân tích độ sai lệch .......................................................................73

Bảng 4.6 Giá trị tối ưu của các hợp chất có hoạt tính sinh học ................................76

Bảng 4.7 Giá trị tối ưu nhiệt độ, thời gian sấy, hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi đen ....................................78

Bảng 4.8 Bảng phân tích độ sai lệch .......................................................................79

Bảng 4.9 Bảng kiểm định sự tương thích (Likelihood) ...........................................80

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chần đến hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w) trong tỏi........................................................84

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chần đến hàm lượng thiosulfinate (µmol/g d.w) của tỏi...........................................................................87

Bảng 4.12 Dự đoán các thông số động học, hệ số xác định (R2) cho sự tổn thất hàm lượng polyphenol, flavonoid tổng số trong tỏi ở các điều kiện chần khác nhau .......................................................................................................................89

Bảng 4.13 Dự đoán thông số động học, hệ số xác định (R2) cho sự phân hủy của thiosulfinate trong tỏi ở các điều kiện chần khác nhau......................................91

Bảng 4.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến màu sắc của tỏi.................................93

Bảng 4.15 Ảnh hưởng thời gian chần đến giá trị L, a, b của tỏi...............................94

Bảng 4.16 Hàm lượng polyphenol, flavonoid, thiosulfinate và khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của tỏi sau chần 80oC thời gian 90 giây. ................................95

Bảng 4.17 Tương tác giữa mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men.................................................................................96

Bảng 4.18 Sự thay đổi pH của tỏi lên men theo thời gian, mật số vi khuẩn và nồng độ muối .........................................................................................................97

Bảng 4.19 Tương tác giữa mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men đến hàm lượng polyphenol trong tỏi.......................................................................99

Bảng 4.20 Tương tác giữa mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men đến hàm lượng flavonoid trong tỏi........................................................................101

Bảng 4.21 Tương tác giữa mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men đến hàm lượng thiosulfinate trong tỏi ...................................................................102

Bảng 4.22 Tương tác giữa mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men đến khả năng chống oxy hóa của tỏi.....................................................................105

Bảng 4.23 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm tỏi lên men lactic ......................106

Bảng 4.24 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến hàm lượng polyphenol (mg GAE/g d.w) trong tỏi lên men .......................................................................109

Bảng 4.25 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến hàm lượng flavonoid (mg QE/g d.w) trong tỏi lên men .................................................................................110

Bảng 4.26 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến hàm lượng thiosulfinate (μmol/g d.w) trong tỏi lên men .............................................................................112

Bảng 4.27 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến khả năng trung hòa gốc tự do DPPH (%) của tỏi lên men ..........................................................................113

Bảng 4.28 Hàm lượng polyphenol (mg GAE/g d.w), flavonoid (mg QE/g d.w), thiosulfinate (μmol/g d.w) và khả năng trung hòa gốc tự do DPPH (%) của tỏi lên men theo thời gian bảo quản ...........................................................................114

Bảng 4.29 Sự phân bố cỡ hạt và điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate khác nhau .....................................................123

Bảng 4.30 Hiệu suất bọc thuốc của hệ nano tỏi đen ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate khác nhau................................................................................................130

Bảng 4.31 Hoạt tính trên các dòng tế bào ung thư của các tác nhân thử ................131

Bảng 4.32 Hoạt tính kháng khuẩn và nấm của hệ nano tỏi đen và tỏi đen .............131

Bảng 4.33 Hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase của hệ nano tỏi đen và tỏi đen .......................................................................................................................132

Bảng 4.34 Hoạt tính ức chế AChE của chất thử hệ nano tỏi đen và tỏi đen ...........133

Bảng 4.35 Đường huyết (mg/dL) của chuột khi sử dụng tác nhân điều trị để thử độ an toàn trong 7 ngày. .................................................................................133

Bảng 4.36 Đường huyết (mg/dL) của các nhóm chuột thử nghiệm trước và sau khi tiêm alloxan monohydrate 135 mg/kg trọng lượng chuột................................134

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Cấu tạo trong của củ tỏi cổ mềm và tỏi cổ cứng .........................................7

Hình 2.2 Một số giống tỏi phổ biến tại Việt Nam .....................................................8

Hình 2.3 Sự chuyển hóa GSAC thành SAC trong tép tỏi đen..................................11

Hình 2.4 Các hợp chất khác nhau được tạo ra khi tép tỏi bị tổn thương ..................12

Hình 2.5 Một số sản phẩm tỏi trên thị trường .........................................................15

Hình 2.6 Chuột nhắt trắng sử dụng trong thử nghiệm hoạt tính...............................46

Hình 4.1 Cường độ hô hấp của củ tỏi ở các giai đoạn thuần thục............................48

Hình 4.2 Củ tỏi ở các độ tuổi thu hoạch khác nhau .................................................48

Hình 4.3 Đường kính và khối lượng củ tỏi theo thời gian tăng trưởng ....................49

Hình 4.4 Hao hụt khối lượng (%) của củ tỏi ở các giai đoạn thu hoạch theo thời gian tồn trữ......................................................................................................50

Hình 4.5 Hao hụt khối lượng (%) của củ tỏi ở các nhiệt độ tồn trữ .........................52

Hình 4.6 Độ Brix của củ tỏi theo thời gian tồn trữ ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau ...............................................................................................................54

Hình 4.7 Thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số trong củ tỏi tồn trữ ở các điều kiện nhiệt độ ...................................................................................................55

Hình 4.8 Thay đổi hàm lượng thiosulfinate của tỏi tươi theo thời gian tồn trữ ở các nhiệt độ ............................................................................................................56

Hình 4.9 Hao hụt khối lượng của củ tỏi tồn trữ trong các loại bao bì khác nhau ở nhiệt độ 0oC ........................................................................................................56

Hình 4.10 Ảnh hưởng của thời gian chần đến hàm lượng polyphenol tổng số (TPC), flavonoid tổng số (TFC) và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi ........58

Hình 4.11 Hàm lượng thiosulfinate của củ tỏi chần ở các mức thời gian khác nhau .......................................................................................................................59

Hình 4.12 Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh đến hàm lượng polyphenol tổng số (TPC), flavonoid tổng số (TFC) và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi...........................................................................................................................60

Hình 4.13 Giá trị cảm quan của củ tỏi sau khi chần và lạnh đông ...........................61

Hình 4.14 Ảnh hưởng của tiền xử lý lạnh đông đến giá trị L trong suốt quá trình chế biến tỏi đen ..............................................................................................61

Hình 4.15 Ảnh hưởng của tiền xử lý lạnh đông đến hàm lượng polyphenol tổng số trong quá trình chế biến tỏi đen ..................................................................62

Hình 4.16 Hàm lượng polyphenol trong tỏi đen ở các mức nhiệt độ lão hóa...........63

Hình 4.17 Hàm lượng flavonoid trong tỏi đen ở các mức nhiệt độ lão hóa..............63

Hình 4.18 Hoạt động chống oxy hóa của tỏi đen ở các mức nhiệt độ lão hóa..........64

Hình 4.19 Thay đổi độ cứng của tỏi ở các nhiệt độ khác nhau trong suốt quá trình chế biến tỏi đen ..............................................................................................66

Hình 4.20 Sự thay đổi màu sắc của tép tỏi (a) và mặt cắt ngang củ tỏi (b) theo nhiệt độ và thời gian lão hóa...................................................................................67

Hình 4.21 Thay đổi màu sắc tỏi đen trong suốt quá trình lão hóa ở 60oC ................68

Hình 4.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến giá trị L của tỏi theo thời gian .......68

Hình 4.23 Độ ẩm của tỏi đen ở các mức nhiệt độ lão hóa khác nhau.......................69

Hình 4.24 Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến hàm lượng thiosulfinate trong tỏi đen ....................................................................................................................70

Hình 4.25 Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến hàm lượng acid tổng số của tỏi đen .........................................................................................................................71

Hình 4.26 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lão hóa đến hàm lượng đường khử của tỏi đen.......................................................................................................72

Hình 4.27 Giản đồ mạng nhện (QDA) biểu thị điểm cảm quan của tỏi đen theo nhiệt độ và thời gian lão hóa...................................................................................72

Hình 4.28 Tỷ số khả dĩ theo thời gian xử lý ở các nhiệt độ khác nhau ....................73

Hình 4.29 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến TPC của tỏi đen .........................................................................................75

Hình 4.30 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến TFC của tỏi đen .........................................................................................75

Hình 4.31 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến khả năng loại bỏ gốc tự do của tỏi đen .......................................................76

Hình 4.32 Sự tương thích của hàm lượng polyphenol tổng số giữa giá trị thực nghiệm và dự đoán theo phương trình (4.2)............................................................77

Hình 4.33 Sự tương thích của hàm lượng flavonoid tổng số giữa giá trị thực nghiệm và dự đoán theo phương trình (4.3)............................................................77

xii

Hình 4.34 Sự tương thích của khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH giữa giá trị thực nghiệm và dự đoán theo phương trình (4.4) ....................................................77

Hình 4.35 Biểu đồ contour tối ưu nhiệt độ và thời gian sấy tỏi đen.........................78

Hình 4.36 Tương quan giữa tỷ số khả dĩ và nhiệt độ với thời gian xử lý .................80

Hình 4.37 Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản và điều kiện bao gói đến hàm lượng (a) TPC, (b) TFC và (c) khả năng loại trừ gốc tự do DPPH của tỏi đen...................82

Hình 4.38 Sản phẩm tỏi đen bảo quản trong bao bì PA...........................................83

Hình 4.39 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chần đến hàm lượng flavonoid trong tỏi..................................................................................................................85

Hình 4.40 Thay đổi hoạt tính chống oxy hóa trong tỏi ở các điều kiện chần khác nhau ...............................................................................................................88

Hình 4.41 Mô hình dự đoán hàm lượng polyphenol tổng số ở các điều kiện chần khác nhau.......................................................................................................90

Hình 4.42 Mô hình dự đoán hàm lượng flavonoid tổng số ở các điều kiện chần khác nhau ...............................................................................................................90

Hình 4.43 Mô hình dự đoán hàm lượng thiosulfinate ở các điều kiện chần khác nhau .......................................................................................................................91

Hình 4.44 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chần đến độ cứng của tỏi..............92

Hình 4.45 Tỏi trước và sau khi chần ở 70, 80 và 90oC trong 90 giây ......................94

Hình 4.46 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl và mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum bổ sung vào dịch lên men đến hàm lượng polyphenol tổng số trong tỏi...........................................................................................................................99

Hình 4.47 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl và mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum bổ sung vào dịch lên men đến hàm lượng flavonoid tổng số trong tỏi.........................................................................................................................101

Hình 4.48 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl và mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum bổ sung vào dịch lên men đến hàm lượng thiosulfinate trong tỏi .........103

Hình 4.49 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl và mật số vi khuẩn L. plantarum bổ sung vào dịch lên men đến hoạt tính chống oxy hóa trong tỏi...............................105

Hình 4.50 Kết quả đánh giá cảm quan của các thành viên đối với 16 mẫu tỏi sau lên men ..........................................................................................................107

Hình 4.51 Mẫu tỏi lên men trong dung dịch có nồng độ muối NaCl 1%, mật số vi khuẩn L. plantarum 106 CFU/mL sau 6 ngày....................................................108

xiii

Hình 4.52 Một số mẫu tỏi lên men có bổ sung hành lá (A), hành tây (B) và hành tím (C) .........................................................................................................108

Hình 4.53 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến hàm lượng polyphenol tổng số trong tỏi lên men ......................................................................................110

Hình 4.54 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến hàm lượng flavonoid tổng số trong tỏi lên men..............................................................................................111

Hình 4.55 Kết quả đánh giá cảm quan tỏi lên men lactic bảo quản ở 30±2 và 5±1oC ...................................................................................................................115

Hình 4.56 Sản phẩm tỏi lên men lactic sau 9 tuần bảo quản..................................115

Hình 4.57 Hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch tỏi đen được trích ly theo tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và loại dung môi khác nhau .......................................117

Hình 4.58 Hàm lượng flavonoid tổng số trong dịch tỏi đen được trích ly theo tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và loại dung môi khác nhau .......................................117

Hình 4.59 Hàm lượng S-allyl cysteine trong dịch tỏi đen được trích ly theo tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và loại dung môi khác nhau ...........................................118

Hình 4.60 Hoạt tính chống oxy hóa DPPH của dịch tỏi đen được trích ly theo tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và loại dung môi khác nhau .......................................118

Hình 4.61 Sắc ký đồ của dung dịch SAC chuẩn (a) và SAC trong tỏi đen (b) .......119

Hình 4.62 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hàm lượng polyphenol trong dịch tỏi đen ...............................................................................121

Hình 4.63 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hàm lượng flavonoid trong dịch tỏi đen..................................................................................121

Hình 4.64 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hàm lượng SAC trong dịch tỏi đen .................................................................................................121

Hình 4.65 Ảnh FE-SEM của hệ dịch tỏi đen (a) và hệ nano tỏi đen tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/1 (b), 2/1 (c), 3/1 (d), 1/2 (e), 1/3 (f).........................122

Hình 4.66 Điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/1 ..............................................................................123

Hình 4.67 Điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 2/1 ..............................................................................124

Hình 4.68 Điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 3/1 ..............................................................................124

xiv

Hình 4.69 Điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/2 ..............................................................................124

Hình 4.70 Điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/3 ..............................................................................125

Hình 4.71 Phổ FT-IR của tỏi đen..........................................................................126

Hình 4.72 Phổ FT-IR của alginate ........................................................................126

Hình 4.73 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen.............................................................127

Hình 4.74 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/1 ...............................................................................................127

Hình 4.75 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 2/1 ...............................................................................................128

Hình 4.76 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 3/1 ...............................................................................................128

Hình 4.77 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/2 ...............................................................................................129

Hình 4.78 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/3 ...............................................................................................129

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AChE: Enzyme acetylcholinesterase

AGE (Aged garlic extract): Chiết xuất tỏi lão hóa

DLS: Tán xạ ánh sáng động

DMSO: Dimethyl sulfoxide

DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

D.W (Dried weight): Trọng lượng khô

EE: Hiệu suất bọc

FE-SEM (Field Emission Scanning Electron Microscope): Kính hiển vi điện tử quét

FT-IR (Fourier-transform infrared spectroscopy): Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier

GAE (Gallic Acid Equivalent): Đương lượng acid gallic

GSAC: γ-glutamyl-S-allyl-L-cysteine

IC50 (The half maximal inhibitory concentration): Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử.

LAB (Lactic Acid Bacteria): Vi khuẩn acid lactic

mg GAE: mg acid gallic tương đương

mg QE: mg quercetin tương đương

MTT: (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium)

OD: Mật độ quang

PA: Polyamide

QDA (Quantitative Descriptive Analysis): Phân tích mô tả định lượng

QE (Quercetin equivalent): Đương lượng quercetin

RH (Relative Humidity): Độ ẩm tương đối

SAC: S-allyl-cysteine

TFC (Total Flavonoids Content): Hàm lượng flavonoid tổng số

TPC (Total Polyphenols Content): Hàm lượng polyphenol tổng số

-GTP: -glutamyl transpeptidase

xvi

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam, tỏi được trồng nhiều tại các vùng Hải Dương, Hà Nội, Bắc Giang, Phan Rang, Lý Sơn, Đà Lạt,… Tỏi Phan Rang có đặc điểm củ nhỏ, vỏ lụa trắng, tinh dầu rất thơm. Nhiều nông hộ áp dụng quy trình VIETGAP vào sản xuất, cung cấp cho người tiêu dùng sản phẩm tỏi bảo đảm chất lượng an toàn.

Bảo quản tỏi rất quan trọng để cung cấp sản phẩm cho thị trường rau củ tươi và cho quá trình chế biến. Các thành phần hóa học và mùi hăng cay của tỏi đều là các thông số quan trọng rất ít được nghiên cứu liên quan đến các điều kiện bảo quản. Tỏi có thể được lưu trữ khoảng 1-2 tháng trong điều kiện tốt ở nhiệt độ môi trường xung quanh với RH thấp (< 75%). Tuy nhiên, trong những điều kiện này, củ tỏi sẽ dần dần trở nên mềm, xốp và nhăn nheo do mất nước. Sự đa dạng giống tỏi, thời gian và điều kiện tồn trữ đều có thể ảnh hưởng đến thời gian bảo quản củ tỏi. Khảo sát độ thuần thục và phương pháp tồn trữ giúp duy trì ổn định nguồn nguyên liệu cho quá trình chế biến và mua bán.

Tỏi được biết đến với nhiều công dụng bảo vệ sức khỏe do chứa các hợp chất chống khuẩn gây bệnh, chất kháng sinh, khả năng chống gốc tự do; chống xơ vữa động mạch; kháng ung thư và chống mỡ máu cao (Kim et al., 2012). Tuy nhiên, việc tiêu thụ tỏi tươi chưa qua chế biến bị hạn chế do có mùi hăng, vị cay đặc trưng và có xu hướng gây khó chịu cho dạ dày. Trong những năm gần đây, các phương pháp chế biến khác nhau như xử lý nhiệt, lão hóa (aging) và lên men đã được sử dụng để loại bỏ mùi khó chịu và cải thiện vị của tỏi (Bae et al., 2014). Tỏi đen được tạo ra từ tỏi tươi bằng cách xử lý ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp trong khoảng thời gian nhất định. Các hợp chất gây mùi khó chịu của tỏi bị mất sau quá trình sản xuất, màu đen của tỏi được hình thành do các phản ứng sinh hoá và hoá học (chủ yếu phản ứng Maillard). Tỏi đen có vị ngọt dịu và độc đáo, cấu trúc mềm dẻo như trái cây sấy, không gây mùi vị khó chịu như tỏi tươi (Wang et al., 2010). Hơn nữa, quá trình chế biến tỏi đen còn liên quan đến sự hình thành các hợp chất phenolic, S-allyl-L- cysteine (SAC) và các hợp chất hoà tan trong nước có tác dụng chống oxy hoá mạnh (Corzo-Martinez et al., 2007; Imai et al., 1994). Vì vậy đây là thực phẩm lý tưởng trong phòng ngừa và điều trị bệnh tim, Alzheimer, viêm khớp và các bệnh mãn tính như bệnh tiểu đường, đặc biệt là bệnh ung thư. Ngoài ra, quá trình lên men, ngoài việc là một phương pháp để bảo quản nguyên liệu tươi trong thời gian ngắn trước khi tiếp tục chế biến, nó có thể mang lại một

vài thuận lợi (cải thiện mùi, làm giàu các chất chuyển hóa mong muốn được tạo ra bởi các vi sinh vật và tăng độ an toàn) như đã được báo cáo trong các sản phẩm lên men thực vật khác (Buckenhuskes et al., 1990). Orlov et al. (1991) đã nghiên cứu sự thay đổi một số thành phần hóa học (hàm lượng đường, acid lactic, vitamin C) trong suốt quá trình lên men tự nhiên của tỏi chần trong nước muối. Hiện nay, các nghiên cứu chuyên sâu về quy trình chế biến và các biến đổi chất lượng sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic đã bắt đầu được quan tâm tại Việt Nam. Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc tạo ra sản phẩm mới (tỏi đen), chưa quan tâm nhiều đến hoạt chất sinh học trong sản phẩm. Do đó, việc nghiên cứu, thiết lập và kiểm soát các thông số kỹ thuật trong chế biến là điều cần thiết và cấp bách nhằm tạo ra sản phẩm có giá trị sinh học và khả năng phòng ngừa bệnh cao tại Việt Nam.

Tình hình kinh tế Việt Nam đã được cải thiện đáng kể và sự thay đổi này đã đóng góp kết quả tốt cho việc thay đổi số lượng và loại bệnh tật trong nước với sự giảm các bệnh truyền nhiễm và suy dinh dưỡng, nhưng lại tăng các bệnh mãn tính như bệnh tiểu đường type II, tăng lipid máu, tăng huyết áp và thừa cân, đặc biệt là ở các thành phố lớn. Do vậy với các đặc tính rất tốt từ các sản phẩm chế biến từ tỏi (như đã đề cập) có thể mở ra hướng sử dụng tỏi nhiều hơn để đáp ứng nhu cầu sức khỏe và phòng chống bệnh tật trong tình hình dinh dưỡng Việt Nam đang có nhiều biến động. Bên cạnh đó, khả năng hấp thu các dược chất quý trong tỏi vào cơ thể đến nay công bố vẫn còn hạn chế, tuy nhiên có thể khẳng định rằng khi nano hóa các hoạt chất trên thì khả năng hấp thu sẽ tăng lên gấp hàng chục lần (Shaikh et al., 2009). Quy trình chế tạo hạt nano mang thuốc khá phức tạp bởi chúng chỉ được hình thành khi đáp ứng các tiêu chí về tính chất vật lý và hóa học đặc trưng. Vật liệu nano mang thuốc có thể cho thấy nhiều hoạt tính sinh học vượt trội. Hạt nano tỏi đen cũng chưa được chế tạo và công bố ở các nghiên cứu trong nước và quốc tế. Vì vậy, nghiên cứu chế biến các sản phẩm từ tỏi với hàm lượng cao các hoạt chất sinh học, đồng thời cùng với việc trích ly hiệu quả các hoạt chất này và ứng dụng công nghệ nano để tăng cường hoạt tính của chúng là điều cần thiết.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu chung

Nâng cao và cải thiện sinh khả dụng của các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi (tỏi đen và tỏi len men lactic) và công nghệ nano.

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

Xác định ảnh hưởng của thời điểm thuần thục của tỏi và điều kiện bảo quản tỏi đến đặc tính lý học và các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quá trình tồn trữ tỏi. Chọn được thời điểm thu hoạch tỏi có chất lượng tốt nhất và điều kiện tồn trữ thích hợp để áp dụng trong chế biến các sản phẩm tỏi.

Xác định các thông số tối ưu cho quá trình sản xuất tỏi đen và tỏi lên men lactic nhằm tạo ra sản phẩm tỏi có chất lượng cao (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng chống oxy hóa).

Xác định các điều kiện tồn trữ thích hợp cho 2 loại sản phẩm tỏi đen và

tỏi lên men lactic.

Xây dựng quy trình trích ly các hợp chất sinh học từ tỏi đen và chế tạo các hạt nano tỏi đen mang các chất có hoạt tính sinh học với kích thước thích hợp ( 100 nm), hình dạng tốt nhất (gần với hình cầu) và độ ổn định cao.

Hiệu quả thu được từ thử nghiệm hoạt tính của hệ nano tỏi đen trong kỹ

thuật in-vitro và in-vivo.

1.3 Nội dung nghiên cứu

1.3.1 Nội dung 1: Khảo sát sự thay đổi đặc tính lý học và hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ.

1.3.2 Nội dung 2: Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi

thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (phương pháp tiền xử lý, nhiệt độ)

đến quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen.

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (pH, nồng độ muối, loại và mật số vi

khuẩn acid lactic) đến quy trình sản xuất sản phẩm tỏi muối chua.

Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tồn trữ đến khả năng duy trì các hoạt chất sinh học ở mức độ cao nhất trong cả hai sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic.

1.3.3 Nội dung 3: Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải thiện sinh khả

dụng của các hợp chất sinh học từ sản phẩm tỏi đen

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các chất có hoạt

tính sinh học trong tỏi đen

Ứng dụng công nghệ nano góp phần nâng cao giá trị sinh học của các

hợp chất trong sản phẩm tỏi đen.

Thử nghiệm hoạt tính của hệ nano tỏi đen ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo về khả năng hấp thu và tác dụng của các hoạt chất sinh học thu nhận được từ công nghệ nano.

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Nguyên liệu tỏi tươi cổ mềm, giống địa phương được thu hoạch và chọn lựa vào thời điểm mùa vụ năm 2014, 2015, 2016 và 2017 tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận.

Sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic được chế biến và nghiên cứu tại Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ.

Hạt nano tỏi đen được chế tạo bằng cách sử dụng polymer alginate mạch ngắn và thử nghiệm hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào ung thư, ức chế enzyme -glucosidase và AChE, khả năng hạ đường huyết trên chuột nhắt trắng bị tiểu đường tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

1.5 Ý nghĩa của luận án

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Luận án đã cung cấp nhiều kết quả nghiên cứu về độ thuần thục, thời gian thu hoạch và điều kiện bảo quản tỏi tươi. Ngoài ra, cơ chế hình thành tỏi đen và tỏi lên men lactic trong suốt quá trình chế biến cũng được làm rõ. Các mô hình đề xuất và các thiết lập liên quan đến các giá trị tham số động học được đánh giá nhằm có các hiểu biết chính xác về sự thay đổi của các hợp chất có hoạt tính sinh học trong sản phẩm thực phẩm trong quá trình chế biến. Đây cũng sẽ là nguồn tài liệu quý giá cho công việc giảng dạy, nghiên cứu khoa học. Hạt nano tỏi đen được chế tạo và thử nghiệm thành công ở kỹ thuật in- vitro và in-vivo góp phần làm đa dạng cơ sở dữ liệu thuốc phục vụ hỗ trợ và điều trị bệnh.

1.5.2 Ý nghĩa thực tế

Như đã đề cập, Việt Nam có nhiều vùng trồng tỏi nổi tiếng như Phan Rang, Lý Sơn, chất lượng các giống tỏi này được đánh giá rất cao trên các phương tiện truyền thông và người tiêu dùng. Tuy nhiên chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu giá trị thực sự của giống tỏi địa phương (chất lượng và phương pháp tồn trữ) và sử dụng cho quá trình chế biến, nâng cao giá trị từ nguồn nông sản này.

Đối với nhiều hộ gia đình tại Phan Rang-Tháp Chàm và nhiều vùng trồng tỏi trên cả nước, tỏi được xem là cây trồng truyền thống, tuy nhiên giá trị

thương phẩm của củ tỏi Việt Nam chưa cao, giá cả bấp bênh, chưa thể cạnh tranh với tỏi giá rẻ từ Trung Quốc, đời sống của người trồng tỏi không ổn định. Thông qua quy trình chế biến tỏi đen và tỏi lên men lactic sẽ làm tăng lượng tiêu thụ tỏi cho người nông dân. Nghiên cứu đồng thời quy trình sản xuất hai dạng sản phẩm này cũng nhằm tạo ra nguồn thực phẩm mới có giá trị sinh học cao và là công việc có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Tỏi đen và tỏi lên men lactic trải qua quá trình chế biến có hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học (S-allyl cysteine, polyphenol, flavonoid,…) và hoạt động chống oxy hóa cao hơn so với tỏi tươi. Đặc biệt, các hợp chất này có khả năng ứng dụng cao trong việc bảo vệ sức khỏe và là một liệu pháp phòng ngừa bệnh ung thư cho người tiêu thụ chúng (như đã đề cập ở trên).

Tỏi đen và tỏi lên men lactic cũng góp phần làm đa dạng hơn các sản phẩm từ tỏi ngoài thị trường và cung cấp nguồn thực phẩm giàu “giá trị dược liệu” trong bữa ăn hàng ngày.

Công nghệ nano được xem là công nghệ tiên tiến bậc nhất hiện nay. Trên thế giới việc áp dụng công nghệ nano được thực hiện đối với các hoạt chất có giá trị dược liệu cao nhưng khả năng hấp thu kém. Bên cạnh đó, kỹ thuật nano được áp dụng đồng thời sẽ tăng giá trị sinh học của sản phẩm và mở hướng mới cho việc sử dụng các sản phẩm của tỏi Việt Nam ở mức độ cao và hiệu quả hơn. Ngoài ra, sự ra đời của hệ nano tỏi đen sẽ là niềm hy vọng mới cho các bệnh nhân ung thư, tiểu đường và một số loại bệnh khác.

1.6 Những điểm mới của luận án

Luận án cung cấp thông tin thời điểm thuần thục và điều kiện bảo quản tỏi tươi liên quan đến đặc tính lý học và các hợp chất có hoạt tính sinh học trong suốt quá trình tồn trữ.

Xây dựng được quy trình chế biến tỏi đen và tỏi lên men lactic nhằm tạo ra sản phẩm tỏi có chất lượng cao vượt trội so với tỏi tươi (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng chống oxy hóa trong tỏi đen). Ngoài ra, nghiên cứu còn xác định các điều kiện tồn trữ thích hợp cho hai loại sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic

Xây dựng quy trình trích ly các hợp chất sinh học từ tỏi đen và ứng dụng công nghệ nano chế tạo thành công hạt nano tỏi đen mang các chất có hoạt tính sinh học với kích thước  100 nm, hình dạng gần với hình cầu và độ ổn định cao. Hiệu quả thu nhận được từ thử nghiệm hoạt tính của hệ nano tỏi đen ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo cũng được xác định.

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu tổng quan

2.1.1 Tổng quát về tỏi

2.1.1.1 Lịch sử của tỏi

Tỏi là một trong những loại thực vật lâu năm nhất trên thế giới và thuộc họ Lily. Mặc dù nguồn gốc địa lý chính xác của tỏi vẫn chưa được xác định, nhưng những nhà thực vật học hiện báo cáo rằng tỏi đến từ Trung Á. Một số tác giả khác cho rằng là Siberia, nơi tỏi được phát hiện và trồng bởi những người tìm kiếm thực phẩm và thảo dược chữa bệnh trên đồng ruộng. Đặc tính của củ tỏi trắng là không mùi khi còn nguyên vẹn, nhưng khi cắt ra tỏi có mùi vị cay nồng (Borek, 2001). Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, tỏi đã trở thành loại thảo dược tăng cường sức khỏe phổ biến ở vùng Viễn và nước Cận Đông, Châu Âu và Mỹ. Một bộ phận người Trung Quốc thường ăn cố định 20 gram tỏi/ngày, xấp xỉ trung bình 8 tép tỏi. Tại Đức, đa số những người trưởng thành bổ sung tỏi hằng ngày để tăng cường sức khỏe. Ở Mỹ, việc sử dụng chất bổ sung tỏi đã nhanh chóng tăng cao trong những năm qua, chất bổ sung phổ biến nhất là chiết xuất tỏi lão hóa không mùi (Borek, 2001).

2.1.1.2 Củ tỏi

Trong tất cả phương thuốc thảo dược được tiêu thụ cho mục đích lợi ích đối với sức khỏe, củ tỏi xếp hạng cao nhất, trong cả hai sự phổ biến và hiệu quả. Tỏi (Allium sativum L.), một trong những loại thực vật lâu đời nhất được sử dụng trong y học, đã trở thành một phần quan trọng trong của sống của con người qua nhiều thế kỷ. Tỏi được sử dụng như gia vị thực phẩm, tăng cường sức khỏe cho người lính trong chiến tranh, chữa cảm lạnh, nhiễm trùng và điều trị nhiều loại bệnh khác nhau, từ bệnh tim mạch đến ung thư và thậm chí cả bệnh dịch hạch (Amagase, 2006).

Ở Việt Nam, tỏi được trồng nhiều tại các vùng Hải Dương, Hà Nội, Bắc Giang, Phan Rang - Ninh Thuận, Lý Sơn – Quảng Ngãi, Đà Lạt – Lâm Đồng,… Trong đó, diện tích trồng tỏi lớn nhất ở Hải Dương (5,100 ha), Lý Sơn (307 ha),…Tại Ninh Thuận, theo thống kê của Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, trong vụ Đông Xuân 2011-2012, diện tích trồng tỏi toàn tỉnh là 126 ha, chiếm 11,54% diện tích gieo trồng tỏi của cả tỉnh. Tỏi Ninh Thuận được trồng chủ yếu tại 3 huyện, thành phố đó là thành phố Phan Rang – Tháp Chàm (44 ha) tập trung ở phường Văn Hải; huyện Ninh Hải (70 ha) tập trung ở các xã Nhơn Hải, Thanh Hải, Vĩnh Hải; huyện Thuận Bắc (12 ha) ở xã Bắc Sơn. Diện tích trồng tỏi toàn tỉnh sẽ có xu hướng tăng trong năm 2013 và 2014

(dự kiến đạt trên 210 ha), sản lượng ước đạt 1.600 tấn, tập trung ở các huyện Ninh Hải, Thuận Bắc và thành phố Phan Rang - Tháp Chàm (Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngư Ninh Thuận, 2012).

Tỏi được phân thành 2 loại: cổ cứng và cổ mềm, dựa trên sự hình thành

phần thân giữa (central stalk) (Hình 2.1).

Tỏi cổ mềm

Tỏi cổ cứng Tỏi cổ mềm Tỏi cổ cứng

(Nguồn: https://www.garlicfarm.ca/garlic-bulbils.htm truy cập ngày 29/10/2019 )

Hình 2.1 Cấu tạo trong của củ tỏi cổ mềm và tỏi cổ cứng

Tỏi cổ cứng (Allium sativum ophioscorodon ) rất gần với tỏi dại, được biết đến như sự đa dạng của giống tỏi ophioscorodon. Tỏi cổ mềm (Allium sativum sativum) là loại tỏi phổ biến nhất. Đa số tỏi được bán ở các siêu thị là loại này. Tỏi cổ mềm không có cuống hoa tỏi, chịu được khí hậu nóng (trong khi tỏi cổ cứng thường trồng ỏ vùng khí hậu lạnh), củ tỏi có nhiều tép hơn loại cổ cứng, thường tạo thành nhiều lớp quanh lõi trung tâm và có lớp da mỏng như giấy trắng bao bên ngoài. Khả năng tồn trữ của loại tỏi này cũng tốt hơn. Tỏi cổ mềm rất dễ bện lại thành từng chùm. Cấu tạo bên trong củ tỏi cổ cứng và cổ mềm cũng không giống nhau. Tỏi cổ cứng có cuống hoa tỏi ở giữa củ và số lượng tép tỏi trên một củ tỏi ít hơn tỏi cổ mềm.

Các giống tỏi thường được sử dụng trong sản xuất của nước ta (Hình 2.2):

- Tỏi Hà Nội: lá mần xanh hơi sẫm, lá thật dạng mền và có màu xanh ngà, phiến lá mỏng, thân củ khi non có màu tía nhạt, khi già màu nâu nhạt, tròn dẹt, năng suất bình quân 14 - 15 tấn/ha/vụ.

- Tỏi trắng: lá mần xanh ngà, phiến lá mỏng, thân củ khi non có màu phớt tím, khi già màu trắng, củ to và đường kính củ từ 4,0 - 4,5 cm, năng suất bình quân 12 - 13 tấn/ha/vụ và khi bảo quản củ thường hay bị óp.

- Tỏi Vân Nam - Trung Quốc: lá xanh thẩm, củ non và củ già đều có màu tía, hình dạng củ tròn dẹp, năng suất bình quân 15 - 20 tấn/ha/vụ.

- Tỏi tía: lá mần xanh thẩm, dạng lá đứng và có hình lòng máng, cuống lá

xanh, cây cao to, có non có màu tím sẫm, củ già có màu tím, hình dạng củ tròn đều, kính thước củ từ 3,5 - 4,0 cm và mỗi củ có từ 10 - 11 tép, năng suất bình quân 13 - 15 tấn/ha/vụ.

Ngoài ra còn có một số giống tỏi đặc sản của địa phương như tỏi Lý Sơn

của Quảng Ngãi, tỏi trắng của Ninh Thuận.

Tỏi Hà Nội Tỏi trắng Tỏi Trung Quốc

Tỏi tía Tỏi Lý Sơn Tỏi Phan Rang

(Nguồn: https://www.nguoidothi.vn/vn truy cập ngày 29/10/2019)

Hình 2.2 Một số giống tỏi phổ biến tại Việt Nam

Ngày nay, sau hơn 6000 năm của văn hóa dân gian, nền khoa học hiện đại đã xác nhận nhiều lợi ích của tỏi. Với nguồn phytochemical dồi dào, hợp chất lưu huỳnh hữu cơ phong phú và hoạt động chống oxy hóa cao, tỏi đã được chứng minh có hàng loạt lợi ích cho sức khỏe con người và tác dụng chống lão hóa, giúp ngăn ngừa bệnh tật và tình trạng bệnh lý liên quan đến lão hóa. Những nghiên cứu khoa học và lâm sàng đã chỉ ra rằng tỏi có thể tăng cường hệ miễn dịch, bảo vệ chống lại sự lây nhiễm và nhiễm trùng, và giúp làm giảm nguy cơ ung thư, bệnh tim, bệnh mất trí nhớ, và hầu hết các dạng của bệnh Alzheimer. Nghiên cứu khoa học cho thấy tỏi không phải được ăn tươi hoặc ăn sống mới có hiệu quả mà tỏi được lão hóa, chiết xuất tỏi khử mùi (kyolic) rất giàu hoạt động chống oxy hóa (Borek, 2001; Imai et al., 1994; Amagase et al., 2001; Ide et al., 1999; Borek, 2006a; Rahman, 2003), thường hoạt động tốt hơn so với tỏi tươi, mà không gây rối loạn tiêu hóa và “hơi thở tỏi”.

2.1.1.3 Thành phần hóa học của củ tỏi

Thành phần của tỏi rất phức tạp, với hơn 200 hợp chất khác nhau góp phần vào hiệu quả có lợi của tỏi. Những tính năng quan trọng và độc đáo nhất của tỏi là hàm lượng hợp chất lưu huỳnh hữu cơ cao. Tỏi có chứa nhiều lưu huỳnh hơn (ít nhất gấp 4 lần) so với nhiều loại rau chứa lưu huỳnh cao khác: hành tây, bông cải xanh và súp lơ. Tỏi cũng chứa nhiều carbohydrate chứa fructose, protein, xơ, saponin, phospho, kali, kẽm, lượng selenium vừa phải và vitamin C, steroid glycoside, lectin, prostaglandin, tinh dầu, adenosine, vitamins B1, B2, B6, và E, biotin, acid nicotinic, acid béo, glycolipid, phospholipid, anthocyanin, flavonoid, phenol, và acid amin thiết yếu (Borek, 2001; Imai et al., 1994; Amagase et al., 2001; Ide et al., 1999; Borek, 2006; Rahman, 2003).

Tùy thuộc vào điều kiện canh tác mà tỏi có thể chứa ít nhất 33 hợp chất lưu huỳnh hữu cơ khác nhau. Thành phần allyl lưu huỳnh trong tỏi đảm nhiệm phần lớn lợi ích đối với sức khỏe của tỏi. Hàm lượng allyl lưu huỳnh chính yếu trong tỏi tươi nghiền/cắt nhỏ/băm nhỏ là allicin. Allicin không ổn định và nhanh chóng bị phá vỡ tạo thành di-allyl sulfide, di-allyl disulfide, di-allyl trisulfide và ajoene có mùi tan trong dầu. Thành phần allyl lưu huỳnh chính yếu trong chiết xuất tỏi lão hóa (AGE) gồm S-allyl-cysteine và S-allyl- mercaptocysteine tan trong nước và được hình thành bởi quá trình chuyển hóa sinh học trong lão hóa tự nhiên (Borek, 2001; Imai et al., 1994; Amagase et al., 2001; Ide et al., 1999; Borek, 2006a; Rahman, 2003).

Từ quan điểm y học và những hiệu quả trong ngăn ngừa bệnh liên quan đến sự lão hóa, hợp chất lưu huỳnh hữu cơ ổn định tan trong nước trong tỏi có hiệu quả cao. Lưu huỳnh hữu cơ hiện diện rất giới hạn trong tỏi tươi, mức độ của chúng tăng lên đáng kể trong quá trình lão hóa (Borek, 2001; Imai et al., 1994; Amagase et al., 2001; Ide et al., 1999).

2.1.1.4 Lợi ích đối với sức khỏe của tỏi

Theo Watson and Preedy (2010), có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng những lợi ích cho sức khỏe và tác dụng chống lão hóa của tỏi. Do giàu hợp chất chống oxy hóa và lưu huỳnh hữu cơ, tỏi được chứng minh giúp ngăn chặn nhiều bệnh mãn tính và tình trạng liên quan đến quá trình lão hóa, đặc biệt là bệnh tim mạch và bệnh mạch máu não, ung thư, và bệnh Alzheimer. Tỏi làm giảm yếu tố nguy cơ bệnh tật và lão hóa, bao gồm việc giảm stress oxy hóa và viêm nhiễm, giảm cholesterol, triglyceride và homocysteine, ức chế sự hình thành mảng bám động mạch vành và ngăn chặn kết tụ tiểu cầu. Điều trị tỏi làm tăng giãn mạch và lưu thông máu, giảm huyết áp, ngăn chặn việc chết tế bào

thần kinh và tăng trí nhớ và khả năng nhận thức, tăng khả năng miễn dịch, tăng cường glutathione, chất chống oxy hóa nội bộ quan trọng, tăng sức chịu đựng về thể chất và cải thiện sự mệt mỏi. Trong số nhiều nghiên cứu về tác dụng chống lão hóa của tỏi, những kết quả nhất quán nhất, báo cáo trong hơn 600 bài báo khoa học, đều là các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng với chiết xuất tỏi lão hóa (Kyolic) (chất bổ sung không mùi được tiêu chuẩn hóa cao) được tạo ra bằng cách chiết xuất và lão hóa tỏi tươi trong thời gian dài, hoạt động này làm giàu thêm hàm lượng chất chống oxy hóa của tỏi và hợp chất tan trong nước ổn định của tỏi, như S-allyl cysteine có sinh khả dụng (bioavailability) cao (Kasuga et al., 2001). Nhìn chung, chế độ ăn uống giàu tỏi và chất bổ sung ổn định được tiêu chuẩn hóa của tỏi tăng cường sức khỏe nói chung và giúp nâng cao bảo vệ cơ thể tránh khỏi nhiều bệnh mãn tính và sự lão hóa.

2.1.2 Áp dụng các biện pháp xử lý nhiệt trong chế biến tỏi đen

2.1.2.1 Nhiệt độ thấp

Lạnh đông là hoạt động giảm nhiệt độ của thực phẩm xuống dưới điểm đóng băng của chúng và một tỷ lệ nước trải qua sự thay đổi về trạng thái để tạo thành các tinh thể đá. Bảo quản thực phẩm được kết hợp bằng cách sử dụng nhiệt độ thấp và giảm độ hoạt động của nước. Giá trị dinh dưỡng và chất lượng cảm quan của thực phẩm chỉ bị thay đổi nhẹ khi lạnh đông và tồn trữ đúng cách (Fellows, 2000). Phương pháp chế biến tỏi đen truyền thống cực kỳ đơn giản nhưng tốn nhiều thời gian. Tỏi đen được chế biến trong thời gian dài mà không có bất kỳ biện pháp tiền xử lý nào. Nhiệt độ cao phá hủy cấu trúc tế bào và tạo điều kiện cho các cơ chất phản ứng với nhau. Trong khi đó, xử lý lạnh đông trước khi chế biến làm tổn thương sơ bộ tế bào thực vật. Các cơ chất nội bào chảy ra ngoài tế bào bị vỡ do tiền xử lý lạnh đông. Vì vậy, giai đoạn lạnh đông có thể được sử dụng để phá hủy màng tế bào tỏi trước khi chế biến tỏi đen giúp rút ngắn thời gian chế biến.

2.1.2.2 Nhiệt độ cao

Nhằm rút ngắn thời gian lão hóa tỏi đen (tương tự lạnh đông,), chần làm biến đổi các tính chất vật lý của mô gây ra sự phá hủy bởi nhiệt độ cao trên màng tế bào và biến đổi một số tính chất vật lý như độ rỗng.

Tỏi đen được chế biến từ tỏi tươi bằng phương pháp kiểm soát nhiệt độ và độ ẩm mà không cần bất kỳ phương pháp xử lý và phụ gia bổ sung (Jang et al., 2008; Kang et al., 2008; Wang et al., 2010; Kim et al., 2013). Các hợp chất gây cay gắt và khó chịu bị mất trong quá trình sản xuất, hương vị và màu sắc đen độc đáo được phát triển bởi các phản ứng sinh hóa và hóa học (chủ

yếu là phản ứng Maillard). Hoạt động chống oxy hóa của tỏi có thể bị ảnh hưởng bởi quá trình chế biến (Queiroz et al., 2009), liên quan đến sự hình thành các hợp chất phenolic và sự hiện diện của allicin (Kim et al., 2013).

Phản ứng Maillard xảy ra giữa đường khử và protein, peptide hoặc acid amin trong suốt quá trình chế biến và/hoặc bảo quản thực phẩm, cũng có thể làm tăng hoạt động chống oxy hóa trong nhiều sản phẩm khác nhau (Del Castillo et al., 2002a; Delgado-Andrade et al., 2005; Farag et al., 1982; Friedman, 1996; Nicoli et al., 1997; Somoza, 2005). Ide et al. (1999) và Ryu et al. (2001) đã chứng minh vai trò chống oxy hóa của sản phẩm chuyển vị Amadori fructosyl arginine (được bắt nguồn trong suốt giai đoạn đầu của phản ứng Maillard) trong dịch chiết tỏi lão hóa cô đặc thu được bằng cách bảo quản ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài hơn 10 tháng. Các tác giả mô tả fructosyl arginine như là một chất thu dọn hydrogen peroxide (H2O2) tương đương với vitamin C. Cardelle-Cobas et al. (2005) báo cáo rằng sự hiện diện của một vài hợp chất Amadori, được đo như là 2-furoylmethyl-amino acids (2-FM-AA), trong tỏi bị khử nước thương mại. Ngoài ra, hợp chất S-allyl cysteine hòa tan trong nước cũng đã được chứng minh có hoạt động chống oxy hóa trong quá trình chế biến tỏi đen. Do đó, nhiều hợp chất phát sinh từ sản phẩm tỏi chế biến cũng góp phần tăng tính kháng khuẩn. Sự chuyển hóa tạo thành hợp chất có lợi trong củ tỏi khi chế biến được thể hiện ở Hình 2.3 và 2.4.

(Nguồn: Majewski, 2014)

Hình 2.3 Sự chuyển hóa GSAC thành SAC trong tép tỏi đen

H2N Alliin

Alliinase

SOH

Acid allylsulf enic

SOH

H2O

O Allicin

SOH

Thioacrolein

SOH

Vinyl-1,3-dithiin Vinyl-1,2-dithiin

Diallyldisulf ide (DADS)

(E)-ajoene

(Z)-ajoene

S O

(Nguồn: Majewski, 2014)

Hình 2.4 Các hợp chất khác nhau được tạo ra khi tép tỏi bị tổn thương

2.1.3 Chế biến theo phương pháp lên men lactic

2.1.3.1 Sơ lược về vi khuẩn acid lactic (LAB)

Vi khuẩn acid lactic (LAB) là một nhóm vi khuẩn không đồng nhất được đặc trưng bởi khả năng của chúng nhằm tạo ra chất chuyển hóa thông thường (acid lactic) từ đường. Hoạt động phân giải protein và lipid của chúng thường được ghi nhận chủ yếu và hầu như không đóng góp vào hương vị của thực phẩm lên men. Hoạt động chính của nhóm vi khuẩn này là sử dụng carbohydrate để lên men, tạo ra acid lactic (Mehta et al., 2012).

Công nghệ lên men acid lactic là phản ứng lên men chính trong đa số các thực phẩm sữa, thịt và rau củ lên men. Lên men acid lactic được thực hiện

trong điều kiện yếm khí bởi các vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn hỗ trợ sinh acid lactic. Khi lên men đồng hình lactic (homolactic), lộ trình tiếp theo là con đường Embden-Meyerhof-Parnas và chỉ có acid lactic là sản phẩm cuối cùng. Khi lên men dị hình lactic (heterolactic), lộ trình tiếp theo là con đường pentose phosphate (phosphogluconate pathway) và sản phẩm cuối là lactate, ethanol, và cuối cùng là acetate. Trên cơ sở các kiểu lên men acid lactic đã thực hiện, các loại LAB được chia thành: (1) lên men đồng hình bắt buộc, (2) lên men dị hình bắt buộc, (3) lên men đồng hình tùy tiện (Mehta et al., 2012).

Trong suốt quá trình lên men, việc sử dụng hệ vi khuẩn lactic trong dung dịch NaCl và hướng đến làm giảm pH là sự lựa chọn hàng đầu (tăng từ 1% tổng quần thể vi khuẩn trong nước muối tươi (fresh brine) đến 80% sau vài ngày). Vi khuẩn acid lactic (LAB) bản xứ thay đổi một cách tự phát trong suốt quá trình lên men tự nhiên, và khi kết thúc quá trình, các loài Lactobacillus tham gia, chủ yếu là Lactobacillus plantarum (Rodríguez et al., 2009) tại tỷ lệ 39,9% của tổng (Sanchez-Gomez et al., 2006), mặc dù các loài LAB khác như Lactobacillus pentosus và Leuconostoc mesenteroides, trong số nhiều loài khác, cũng đã được phân lập (Rodriguez et al., 2009). Trong suốt giai đoạn đầu lên men, trực khuẩn gram âm là các vi sinh vật đặc trưng nhất, cơ chế của chúng dẫn đến phát sinh CO2, hydro, acid acetic, acid lactic, ethyl alcohol,… như là những sản phẩm cuối. Trong suốt giai đoạn thứ hai, do hệ quả của sự sụt giảm pH (pH giảm đến 4,5), sự phát triển mạnh của Lactobacilli bắt đầu; chúng chỉ sản xuất acid lactic như là sản phẩm cuối của quá trình lên men glucose. Trong suốt giai đoạn thứ ba, khi pH đạt 4,0 hoặc thấp hơn, sự hình thành acid bị dừng lại (Minguez-Mosquera et al., 1989), và khi đường cạn kiệt, thời kỳ lên men có thể được coi là kết thúc và bắt đầu thời gian bảo quản.

Quá trình lên men acid lactic diễn ra một cách tự nhiên ngay sau khi các chất hữu cơ được bao bọc trong một không gian bị hạn chế sự xâm nhập của oxy. Do đó, khi vi sinh vật phát triển, oxy bị tiêu thụ và CO2 được tạo ra. Sự thay đổi môi trường khí này là yếu tố môi trường đầu tiên kiểm soát vi thực vật địa phương (microflora) về mùi của LAB. Việc sản sinh acid hữu cơ và giảm pH góp phần vào môi trường khí bị thay đổi, và trở nên cực kỳ quan trọng cho việc kiểm soát vi sinh vật. Ngoài các cơ chế kiểm soát môi trường chủ yếu này, các hợp chất kháng khuẩn bên cạnh các acid hữu cơ, như hydrogen peroxide (Price and Lee, 1970; Gilliland and Speck, 1977), nitrogen oxide (Kelley et al., 1995; Malawista et al., 1992), hoặc protein hay peptide kháng khuẩn có thể được tạo ra bởi LAB (Daeschel and Nes, 1995).

Để tăng cường áp lực chọn lọc của sự lên men acid lactic tự nhiên, muối có thể được thêm vào hoặc độ hoạt động của nước được làm giảm. Một cách

tinh tế hơn để tăng cường kiểm soát lên men acid lactic là thêm vào một nguồn giống khởi động hoặc nguồn giống thuần chủng Lactobacillus plantarum (theo phương pháp công nghiệp hiện đại). Mục tiêu ban đầu của việc lên men acid lactic nhằm làm tăng thời gian bảo quản sản phẩm. Theo kinh nghiệm, nhân loại đã biết đây là cách an toàn trong bảo quản thực phẩm và cũng có chất lượng dinh dưỡng đáng kể, thậm chí còn cải thiện ở nhiều khía cạnh (mùi). Đôi khi, lên men acid lactic cũng có nhiều ưu điểm khác như cải thiện vị và tính đồng nhất của sản phẩm. Ngoài ra, lên men acid lactic cũng được công nhận là có hiệu quả có lợi đối với sức khỏe con người có thể do tiêu thụ LAB sống (live LAB) (Mehta et al., 2012).

2.1.3.2 Vai trò của lên men trong việc nâng cao các chất có hoạt tính

sinh học trong cơ thể con người

Vài chủng Lactobacillus có khả năng tạo ra hoặc làm tăng cường các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thực phẩm lên men, ví dụ như L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. lactis, L. plantarum, L. rhamnosus,… Đặc điểm hoạt động phân giải protein nổi bật của LAB được gây ra do proteinase liên kết thành tế bào và vài peptidase nội bào, gồm aminopeptidase, dipeptidase, endopeptidase, và tripeptidase. Một số peptide có hoạt tính sinh học, ví dụ, chống oxy hóa, chống đột biến, điều hòa miễn dịch. Việc giải phóng peptide có hoạt tính sinh học phụ thuộc nhiều vào sự lựa chọn chủng vi khuẩn đảm bảo cân bằng giữa sự toàn vẹn sản phẩm và mức độ thích hợp của hoạt động phân giải protein cần thiết để giải phóng các peptide có hoạt tính sinh học này (Mehta et al., 2012).

Folate có thể được tạo ra bởi một số vi sinh vật trong thực phẩm nhất định. Với vài ngoại lệ (L. acidophilus, L. plantarum), Lactobacilli được biết đến không có khả năng tổng hợp folate chứ không phải tiêu thụ folate (Mehta et al., 2012).

2.1.4 Một số sản phẩm tỏi khác

Các chế phẩm tỏi sẵn có trên thị trường ở nhiều dạng (Hình 2.5), chẳng hạn như chiết xuất tỏi (garlic extract), chiết xuất tỏi đã xử lý nhiệt (heating garlic extract), chiết xuất tỏi lão hóa (aged garlic extract), bột tỏi và dầu tỏi (Banerjee et al., 2003).

(Nguồn: Block, 2010)

Hình 2.5 Một số sản phẩm tỏi trên thị trường

2.1.5 Kỹ thuật nano trong công nghệ thực phẩm

2.1.5.1 Giới thiệu

Vật liệu nano là vật liệu có cấu trúc hóa lý ở kích thước lớn hơn thứ nguyên nguyên tử/phân tử nhưng nhỏ hơn 100 nm (thể hiện những đặc tính vật ly, hóa học và/hoặc sinh học liên quan đến cấu trúc nano của vật liệu nano). Thực sự, công nghệ nano liên quan đến các chất có tính chất mới lạ do kích thước của chúng, và nếu dựa trên cấu tạo phân tử tự nhiên (ví dụ, một phân tử sinh học sau khi được chế tạo) thì chức năng của chúng khác với chức năng trong tự nhiên (Linkov and Steevens, 2008; Narlikar and Fu, 2010; NRC, 2006).

Phương pháp tiếp cận công nghệ nano nhằm hỗ trợ phát triển vật liệu trong quá trình chế biến, cho phép thao tác trên vật chất ở kích thước nano. Điều này liên quan đến sự tự động tập hợp một cách tự phát của nhiều phân tử thành cấu trúc nano tồn tại vốn dĩ trong tự nhiên và sự tập hợp nhiều phân tử thành cấu trúc siêu phân tử được hỗ trợ bởi tiến trình gây ra thay đổi trên vật liệu. Thuật ngữ “công nghệ nano” mô tả cách tiếp cận nhằm thao tác trên vật chất ở kích thước phân tử dẫn đến tạo ra vật liệu và/hoặc sản phẩm mới. Quy trình phát triển vật liệu nano được hỗ trợ bởi công cụ và kỹ thuật phân tích mới (ví dụ, kính hiển vi lực nguyên tử, AFM; kính hiển vi điện tử truyền quét,

TEM; phổ khối lượng nguyên tử nano thứ cấp, nano-SIMS; tán xạ neutron góc nhỏ và tia X, SANS và SAXS) có thể được sử dụng để xác định và mô tả cấu trúc nano. Điều này giúp hiểu rõ mối quan hệ giữa tính chất vĩ mô của vật liệu và cấu trúc nano-, micro- của chúng.

Công nghệ nano có tầm quan trọng đáng kể trong ngành công nghiệp thực phẩm. Phương pháp tiếp cận công nghệ nano hứa hẹn nhiều cơ hội mới tạo ra những cấu trúc mới lạ nhằm cải thiện hương vị, cấu trúc và chất lượng thực phẩm (ví dụ thực phẩm tăng cảm giác ngon miệng), thiết bị mới (ví dụ, cảm biến nano, vật liệu bao bì dựa trên công nghệ nano, thiết bị đánh dấu nano), hệ thống bọc nang có thể phân tán hoạt tính sinh học (chế phẩm thuốc thực phẩm, nutraceutical) (ví dụ, dầu omega-3, chế phẩm sinh học, polyphenol, lycopene) thông qua thực phẩm và quy trình chế biến mới có tiềm năng ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất, an toàn và an ninh lương thực (Chaudhry et al., 2008; Farhang, 2007; Sanguansri and Augustin, 2006; Sozer and Kokini, 2009). Rất nhiều các phương pháp tiếp cận này do những tiến bộ trong các lĩnh vực cơ bản (ví dụ, hóa học, sinh học, cơ khí, chế biến, khoa học keo và khoa học vật liệu) là nền tảng cho khoa học thực phẩm truyền thống.

2.1.5.2 Tiến trình chế tạo ra vật liệu nano

Việc chế tạo vật liệu nano có thể được tiếp cận bởi “cấu trúc từ trên xuống”, “cấu trúc từ dưới lên” hoặc kết hợp cả hai. Trong cấu trúc từ trên xuống, một vật liệu nano được tạo ra từ vật liệu có thứ nguyên thích hợp lớn hơn bằng cách sử dụng tiến trình giảm kích thước (ví dụ, xay, hóa lỏng micro, đồng hóa). Trong cấu trúc từ dưới lên, vật liệu nano phát sinh từ sự tự tập hợp của các thành phần tồn tại từ trước, chẳng hạn như phân tử và nguyên tử. Ví dụ cấu trúc từ dưới lên bao gồm sự hình thành micell thông qua sự tự tập hợp của phân tử có cả tính ưa nước và kỵ nước (amphiphilic), việc tập hợp hai chiều của sợi cellulose trong thành tế bào thực vật, và sự hình thành giọt tụ (coacervate) protein-polysaccharide thông qua tương tác polymer sinh học.

Nghiên cứu gần đây kết hợp cấu trúc từ trên xuống và từ dưới lên để chế tạo vật liệu nano. Ví dụ, Lesmes et al. (2008) sử dụng thiết bị đồng hóa áp suất cao nguồn kép để tạo ra glucose xoắn đơn lẻ và thúc đẩy sự hình thành amylose gồm nhiều phức hợp với acid stearic (cấu trúc từ dưới lên). Tương tự, McClements (2010) lớp phủ phiến lá nano bởi sự nhũ tương hóa lượng dầu lớn để tạo thành những giọt dầu phân tán (cấu trúc từ trên xuống) sau đó được phủ với lớp polymer sinh học (cấu trúc từ dưới lên).

Các quá trình khác nhau nhằm đạt được sự giảm kích thước từ trên xuống (ví dụ, trộn, nghiền, sấy phun, dựa vào chất lỏng siêu tới hạn), những

công nghệ từ trên xuống hứa hẹn nhất là tán nhỏ (ví dụ, nghiền, hóa lỏng micro, đồng hóa) và lộ trình phun (ví dụ, điện phun, sấy phun).

Trích ly là một quá trình mà một hợp chất (ở dạng hòa tan hay dạng rắn) chuyển từ pha này sang pha khác bằng cách cho hai pha tiếp xúc với nhau để tách các hợp chất cần thiết ra khỏi tạp chất. Phương pháp trích ly gồm ngâm trích hoặc có hỗ trợ của enzyme, vi sóng, sóng siêu âm,... Trong đó, ngâm trích với dung môi ethanol hoặc nước là phương pháp đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện và an toàn trong chế biến thực phẩm chức năng.

a Quy trình giảm kích thước

Nhiều quy trình khác nhau có thể được sử dụng làm giảm kích thước nguyên liệu thực phẩm qua hàng loạt kích thước chiều dài và điều này tạo ra khả năng điều chỉnh thuộc tính chức năng của chúng, điều chỉnh sự tự tập hợp thứ bậc và sự tự tổ chức hơn nữa của thành phần thực phẩm.

Quy trình cơ học: Phương pháp tiếp cận giảm kích thước cơ học trong ngành công nghiệp thực phẩm thường sử dụng kỹ thuật nghiền, đồng hóa hoặc siêu âm.

Nghiền: kích thước hạt liên quan rất lớn đến chức năng; sự gia tăng tổng diện tích bề mặt của nguyên liệu thực phẩm ứng với cả hai sự gia tăng về tốc độ và phạm vi hydrate hóa (ví dụ, cải thiện khả năng hòa tan và phân tán) và cũng có thể dẫn đến sự gia tăng phản ứng bề mặt (ví dụ, tiêu hóa enzyme, oxy hóa), cải thiện hiệu suất chế biến, cải thiện chất lượng sản phẩm, và cải thiện khả năng tiêu hóa và sinh khả dụng chất dinh dưỡng (Acosta, 2009).

Nghiền siêu mịn dùng để chỉ việc tán nhỏ vật liệu xuống kích thước nano. Hàng loạt phương pháp nghiền siêu mịn khác nhau (ví dụ, nghiền phun chảy siêu âm, nghiền lạnh đông, giãn nở áp suất cao, nghiền cuộn, nghiền bụi dòng khí tốc độ cao) sẵn có để tạo ra sự đa dạng vật liệu với nhiều thuộc tính khác biệt rất rõ (de Castro and Mitchell, 2002; Wang and Forssberg, 2007 ; Zhao et al., 2009).

Đồng hóa: Quy trình đồng hóa điển hình tùy thuộc vào sự phân tán và hệ treo đến ứng suất biến dạng cao. Mặc dù đồng hóa được sử dụng phổ biến để giảm kích thước giọt dầu và do đó cải thiện sự ổn định của nhũ tương. Zhong and Jin (2009a) sử dụng thiết bị đồng hóa rotor-stator để tạo ra hạt nano zein (đường kính tối đa 200 nm). Zein được hòa tan trong dung dịch ethanol chứa nước 55-90%, và sau đó dung dịch được biến dạng trong lượng nước lớn, gây kết tủa zein và hình thành hạt nano.

b Quy trình tạo hạt nano đối với cấu trúc vật liệu sinh học

Polymer sinh học (protein, polysaccharide, lipid) là những thành phần tạo thành cấu trúc cơ bản trong thực phẩm. Trong suốt quá trình chế biến thực phẩm, polymer sinh học bị tiếp xúc với nhiều kiểu ứng suất (ví dụ, gia nhiệt, biến dạng, áp suất) điều này có thể thay đổi tính chất hóa lý của chúng. Đây là một đòn bẩy khác trong cấu trúc nano thực phẩm, và do đó những tích chất vĩ mô về sau, có thể được thiết kế lại.

Gia nhiệt: Những ảnh hưởng của nhiệt đến đặc điểm cấu trúc và chức năng của protein hình cầu (ví dụ, whey protein) đã được nghiên cứu nhiều (Damodaran, 1996; Oakenfull et al., 1997). Tính chất hóa lý của protein cũng có thể bị thay đổi bởi sự gia nhiệt có sự hiện diện của đường khử để tạo thành liên kết hóa trị, khối co-polymer thông qua sự diễn ra phản ứng Maillard một cách tự nhiên (Oliver et al., 2006). Trong điều kiện được kiểm soát, khối co- polymer amphiphilic (ví dụ, liên hợp casein-polysaccharide) có khả năng tự tập hợp thành micell với lõi kỵ nước và vỏ ưa nước. Khối co-polymer có thể được sử dụng để xây dựng hệ thống hạt bao hạt nano. Pan et al. (2007) báo cáo rằng sự hình thành đồng thời hạt nano dựa trên casein-dextran (đường kính 170-300 nm, phụ thuộc vào pH) và bọc nang hoạt tính sinh học kỵ nước, -carotene. Lõi viên nang được tạo thành bởi tương tác kỵ nước giữa - carotene và -casein. Dextran ưa nước được đính kèm ở vỏ -casein được hình thành, nâng cao độ ổn định và phân tán các hạt trên phạm vi pH rộng (pH 2-12). Sự điều chỉnh trong phương pháp tiếp cận này là đầu tiên hình thành hạt nano liên hợp Maillard và theo sau tiến trình gia nhiệt gây ra (tại nhiệt độ trên nhiệt độ biến tính, Td, của protein) để tạo thành nanogel lõi-vỏ (đường kính 100-200 nm) (Li and Yao, 2009 ; Li et al., 2008).

Alginate đã được sử dụng rộng rãi bởi các tính chất vật lý và hóa học đặc biệt. Chúng thường dùng để tạo các hạt (kích thước nano hoặc micro) và gel đặc (Gombotz and Wee, 1998; Khotimchenko et al., 2001; Tønnesen and Karlsen, 2002; Shilpa et al., 2003; George and Abraham, 2006; Zimmermann et al., 2007; Zimmermann et al., 2007; D'Ayala et al., 2008; Murtaza et al., 2011; Goh et al., 2012; Lee and Mooney, 2012). Alginate không độc hại, dễ phân hủy sinh học, giá thành thấp và sẵn có trên thị trường. Alginate còn được xem là loại thuốc có thể dính vào thành ruột rồi nhả thuốc (mucoadhesion), tương hợp sinh học (biocompatibility) và không gây sinh miễn dịch (non- immunogen). Alginate là một loại polymer mang điện tích âm, được sản xuất từ tảo nâu và vi khuẩn, chứa bao gồm acid α-L-guluronic và acid β-D- mannuronic dạng khử, liên kết tuyến tính với nhau bởi liên kết 1,4-glycosidic. Thành phần và trình tự của acid α-L-guluronic và acid β-D-mannuronic dạng

khử phụ thuộc vào nguồn gốc của tảo được sử dụng và chúng ảnh hưởng đến tính chất của alginate. Alginate cũng có thể được biến đổi về mặt hóa học để điều chỉnh tính chất đặc trưng của nó (Yang et al., 2011; Pawar and Edgar, 2012). Ngoài ra, nanoaggregates, nanocapsules và nanospheres là các hệ nano có đường kính hạt khoảng 10 đến 100 nm. Các hệ này có thể chứa enzyme, thuốc và các hợp chất khác nhau bằng cách hòa tan hoặc nhốt chúng vào bên trong hoặc gắn (kẹp) chúng vào ma trận hạt. Đối với mạch polymer, alginate sẽ cuộn tròn hoặc “vê” để nhốt các hợp chất bên trong.

2.1.5.3 Các loại cấu trúc nano

Vật liệu nano hiển thị kích cỡ, hình dạng, cấu trúc và tính chất khác nhau, có thệ được tạo thành phụ thuộc vào quy trình chế tạo, điều kiện sản xuất, điều kiên môi trường, tính chất của thành phần và bất kỳ cách tiền xử lý (ví dụ, hóa lỏng micro, quy trình áp suất cao, phun, siêu âm) được thực hiện nhằm điều chỉnh nhiều thuộc tính của các thành phần.

Phiến lá nano là một dạng của vật liệu nano. Một phiến lá nano (thường dày 1-100 nm) bao gồm hai hoặc nhiều lớp vật liệu với thứ nguyên kích thước nano (ràng buộc vật lý hoặc hóa học lẫn nhau). Cách tiếp cận thường được sử dụng để tạo ra các phiến lá là phương pháp lắng đọng tĩnh điện theo từng lớp (layer by layer, LBL). Phương pháp này dựa trên những nguyên tắc của sự tự tập hợp trực tiếp của chất đa điện phân để xây dựng film nhiều lớp. Một trong những lợi thế lớn của kỹ thuật LBL là cho phép điều khiển chính xác độ dày và tính chất của film tiếp giáp (McClements, 2009; 2010).

2.1.5.4 Cấu trúc kích thước nano làm thay đổi tính chất của thực phẩm

Thị trường vật liệu cấu trúc nano được dự đoán sẽ vượt quá 20 tỷ USD trong năm 2000 (Anonymous, 2009). Việc áp dụng công nghệ nano trong ngành công nghiệp thực phẩm trên toàn thế giới có tiềm năng tác động thông qua nhiều lĩnh vực thực phẩm gồm sản xuất, chế biến, đóng gói và an toàn.

Các tính chất của thực phẩm phụ thuộc vào sự hình thành, chuẩn bị và chế biến được sử dụng trong sản xuất. Nhiều thành phần nguyên liệu có chức năng sẵn có liên quan đến thành phần và cấu trúc hóa học độc đáo của chúng. Tuy nhiên, chế biến gây ra sự thay đổi thành phần thực phẩm ảnh hưởng đến tính chất của từng thành phần riêng lẻ trong sự hình thành và ảnh hưởng đến cách chúng tập hợp thành cấu trúc nano- và micro-, và cuối cùng là tổ chức cấu trúc macro-. Cấu tạo, bảo quản, chuyển đổi và tiêu hủy thực phẩm ảnh hưởng đáng kể đến tính chất hóa lý của vật liệu thực phẩm. Cấu trúc thực phẩm cũng ảnh hưởng đến chất lượng dinh dưỡng, sự ổn định hóa học và vi sinh vật, và giá trị cảm quan (Aguilera, 2005). Những hiểu biết về mối quan hệ

giữa cấu trúc và tính chất của thực phẩm cho phép thiết kế nâng cao vật liệu thực phẩm và sản phẩm thực phẩm có kích thước nano (Aguilera and Lillford, 2008)

a Cấu trúc thực phẩm để điều chỉnh sự phân tán mùi: Độ nhớt thực phẩm ảnh hưởng đến nhận thức mùi bởi sự trì hoãn độ phân tán hợp chất mùi và vị (làm giảm tổng thể mùi nhận thức) (Taylor, 2009). Điều chỉnh cấu trúc sản phẩm thực phẩm nâng cao cung cấp một phương tiện kiểm soát sự phân tán mùi. Ví dụ, cấu trúc nhũ tương ảnh hưởng đến sự phân tán hợp chất mùi và vị. Sự phân tán mùi của ester kỵ nước (ví dụ, geranyl acetate) từ nhũ tương có thể được tăng bằng cách giảm kích thước giọt nhũ tương trong khi duy trì hàm lượng dầu của nhũ tương, mặc dù điều này không được ghi nhận đối với nhiều ester ưa nước (ví dụ, ethyl butanoate) (Weel et al., 2004). Trong một nghiên cứu khác, sự nhận thức về độ chua (từ acid citric) của cặp nhũ tương (nước trong dầu trong nước) chứa lượng acid citric cố định được nhận thấy là giảm với việc tăng thể tích pha nước bên trong (Malone et al., 2003). Sử dụng cấu trúc nhũ tương khác nhau để thay đổi trạng thái phân tán mùi có tiềm năng đối với ứng dụng sản phẩm thực phẩm béo thấp. Phan et al. ( 2008) cho thấy trạng thái phân tán hợp chất mùi ưa lipid từ nhũ tương cấu trúc nano lipid 5% (với monoglyceride) tương tự với nhũ tương dầu trong nước 10% lipid thông thường được ổn định bằng natri caseinate.

b Cấu trúc thực phẩm để kiểm soát cấu trúc: Cấu trúc thực phẩm là một yếu tố quan trọng để tạo ra cảm giác ngon miệng (mouthfeel) của thực phẩm, trong số các tính chất khác như diện mạo bên ngoài, và âm thanh trong quá trình xử lý và tiêu thụ bằng miệng (Wilkinson et al., 2000). Những tính chất lưu biến của thực phẩm ban đầu và làm thế nào thay đổi nó khi nhai (ví dụ, trạng thái gãy của thực phẩm rắn, sự phá vỡ tinh bột bởi amylase trong nước bọt, sự kết tụ của hạt dẫn đến tăng độ nhớt) ảnh hưởng đến thuộc tính cảm quan của thực phẩm (van Aken et al., 2007).

c Cấu trúc thực phẩm để điều chỉnh độ ổn định: Sản phẩm thực phẩm được yêu cầu duy trì tính ổn định thông qua thời gian bảo quản. Kiểm soát cấu trúc micro thực phẩm là một cách mà trong đó những phản ứng hóa học và vi sinh vật có hại bị trì hoãn (Aguilera, 2005).

Sự ổn định vật lý của nhũ tương, một phần, bị ảnh hưởng bởi tinh thể của pha béo, và sự thay đổi kích thước giọt béo trong nhũ tương có thể làm thay đổi tính chất kết tinh của chất béo trong phạm vi giọt hình cầu. Điều này chỉ ra rằng nhiệt độ tan chảy và kết tinh của trilaurin (glycerin trilaurate) trong nhũ tương dầu trong nước (đường kính 40-120 nm) bị giảm so với trilaurin trong

pha số lượng lớn (Higami et al., 2003). Những thao tác này được kỳ vọng ảnh hưởng đến cấu trúc và độ ổn định của nhũ tương.

Nhũ tương chứa hạt đầu chưa bão hòa dễ bị oxy hóa, có thể gây ra mùi ôi thiu. Cả hai vùng tiếp giáp và tinh chất tiếp giáp của giọt nhũ tương có thể được mong đợi góp phần ổn định oxy hóa. Điều này dường như không là sự đồng thuận về ảnh hưởng của kích thước giọt dầu nhũ tương đến sự ổn định oxy hóa của dầu. Trong khi vài tác giả phát hiện rằng tốc độ oxy hóa ở nhũ tương dầu trong nước được ổn định albumin huyết thanh bò tăng như là một chức năng của việc giảm kích thước giọt dầu (Lethuaut et al., 2002), nhưng một số tác giả khác nhận thấy sự oxy hóa và kích thước giọt dầu không có liên quan nhau (Shimada et al., 1996). Dimakou et al. (2007) khảo sát tác động của tính chất hoạt động bề mặt đến sự ổn định oxy hóa; nhũ tương ổn định Tween dễ bị oxy hóa hơn so với nhũ tương ổn định protein. Điều này có lẽ do sự khác nhau về cấu trúc phần tiếp giáp. Tuy nhiên, nhiều yếu tố khác, chẳng hạn như tính chất chống oxy hóa của protein, có thể không được đánh giá như là yếu tố đóng góp.

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.2.1 Các nghiên cứu liên quan đến điều kiện thu hoạch và tồn trữ củ

tỏi sau thu hoạch

Rajesh and Yu (2010) nghiên cứu ảnh hưởng của các giai đoạn thu hoạch đến sự tổn thất khối lượng và nảy mầm trong suốt quá trình bảo quản ở nhiệt độ phòng và được tiến hành trên 2 giống tỏi Great Leaf Black (GLB) và Ho- mei (HM). Củ của 2 giống tỏi này được thu hoạch ở các giai đoạn thu hoạch được định nghĩa khác nhau, ví dụ, lá chuyển sang vàng (chưa thuần thục), 50% lá khô (độ thuần thục tối ưu) và 100 lá khô (vượt quá độ thuần thục). Cả 2 giống thể hiện sự biến đổi hình thái học khác biệt ở các giai đoạn thu hoạch. Củ tỏi GLB được thu hoạch khi chưa thuần thục, thể hiện sự tổn thất khối lượng vượt mức, các củ có dạng hình quả trứng, vỏ bọc nhăn nheo và hóa nâu so với HM. HM đạt đến độ thuần thục tối ưu thu được tại giai đoạn 50-70% lá bị khô, trong khi lá khô 100%, củ tỏi bị nứt tách và biến dạng. Củ tỏi GLB thu hoạch tại giai đoạn lá khô 50% đều chưa thuần thục hoàn toàn. Sự tổn thất khối lượng của củ tỏi chưa thuần thục là rất cao trong suốt quá trình hong khô.

Tỏi loại phía Bắc “Seosan” và tỏi loại cận nhiệt đới “Daeseo” được bảo quản trong điều kiện kiểm soát khí quyển (controlled atmosphere, CA) (O2 3%, CO2 5%, -11oC), nhiệt độ thấp (-11oC), và nhiệt độ phòng (205oC). Tỷ lệ nảy mầm, tổn thất khối lượng, hàm lượng acid pyruvic, và mức độ hóa xanh green trong tỏi nghiền được xác định trong suốt quá trình tồn trữ. Tỷ lệ nảy

mầm cao hơn trong tỏi “Daeseo” so với tỏi “Seosan”ở điều kiện bảo quản nhiệt độ thấp và CA. Tổn thất khối lượng ở tỏi “Daeseo” cao hơn tỏi “Seosan”. Hàm lượng acid pyruvic enzyme (EP) tăng trong 3 tháng thời gian tồn trữ, và sao đó giảm dần do thời gian bảo quản kéo dài ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ thấp. Tuy nhiên, hàm lượng EP giảm rất mạnh trong suốt thời gian bảo quản trong điều kiện CA đối với cả hai giống (Choi et al., 2004).

Croci et al. (1987) đã áp dụng liều chiếu 10,0 Gy sau trạng thái ngủ làm giảm đáng kể sự mọc mầm; mầm bị thay đổi kích thước (chiều dài), màu sắc và hoạt động peroxidase. Không có sự thay đổi nào được quan sát thấy đối với những phương pháp xử lý trong giai đoạn trạng thái ngủ. Sau thời gian bảo quản, lá không có sự thay đổi. Áp dụng một vài chất điều hòa sinh trưởng có hiệu quả trong việc điều chỉnh tiếp xúc tia gamma. Acid acetic indole có hiệu quả nhất, tiếp theo là acid gibberellic; benzyl-adenine không đưa ra bằng chứng về sự đảo ngược ức chế sự phát triển mầm trong điều kiện in vitro.

Tại Thổ Nhĩ Kỳ, tỏi có thể được bảo quản tại 0-5oC, 60-70% RH trong ít nhất 3-4 tuần trong kho. Đến năm 2012, chưa có phương pháp xử lý nào được thực hiện ở trước và sau thu hoạch tỏi bảo quản tại Thổ Nhĩ Kỳ. Bảo quản tỏi trong điều kiện kiểm soát khí quyển và điều chỉnh khí quyển được sử dụng phổ biến với phương pháp chiếu xạ, hóa chất và gia nhiệt khác nhau ở nước ngoài (Selen and Nilgün, 2012).

Geraldine et al. (2008) đánh giá tính chất vật lý của agar-agar (1%) dựa trên lớp màng phủ kết hợp với 0,2% chitosan và 0,2% acid acetic, cũng như ảnh hưởng của chúng đến lớp màng phủ của tỏi chế biến. Tổn thất ẩm trung bình của tỏi phủ màng thấp hơn 3 lần so với mẫu đối chứng (không phủ màng). Có sự gia tăng đáng kể sự khác biệt về màu sắc (DE*) của mẫu đối chứng so với cách xử lý khác. Nấm mốc dạng sợi và hiếu khí ưa nhiệt trung bình bị ức chế trên tỏi phủ màng kết hợp với hợp chất acid acetic và chitosan kháng khuẩn. Trong suốt 6 ngày tồn trữ , tại 25oC, số lượng nấm mốc dạng sợi và nấm men được duy trì giữa 102-103 CFU/g đối với tỏi phủ màng và 106 CFU/g đối với tỏi đối chứng. Lớp màng phủ làm giảm đáng kể (p<0,05) hô hấp của tỏi. Tỏi bao màng có cường độ hô hấp (30 mg CO2/kg.giờ) giảm một nửa so với tỏi đối chứng.

Hiện nay, ở Việt Nam, củ tỏi sau khi thu hoạch từ ruộng tỏi sẽ được nông dân xử lý, phơi nắng nhiều ngày và lưu kho. Quy trình đơn giản này sẽ làm tỏi dễ bị thối hỏng, mất nước và dẫn đến giảm giá trị kinh tế. Ngoài ra, các nghiên cứu sau thu hoạch củ tỏi vẫn chưa được công bố nhiều ở nước ta.

2.2.2 Các nghiên cứu nâng cao hoạt chất sinh học trong tỏi liên quan

đến chế biến tỏi đen

Các nhà nghiên cứu trên thế giới đặc biệt quan tâm đến các dược tính của những hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh được tách ra từ tỏi trong phòng và chữa bệnh như alliin, diallyl disulfide, S-allylmercaptocysteine và S-trityl-L- cysteine. Các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ này có thể ngăn chặn sự phát triển của bệnh ung thư, tim mạch, thần kinh, bệnh gan, triệu chứng dị ứng và viêm khớp (Yun et al., 2014).

Ở Việt Nam trước đó, tỏi đen chỉ được nghiên cứu tại Học viện Quân y ở quy mô cấp Nhà nước mã số KC10.TN05/11-15. Theo chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu lên men tỏi đen từ tỏi Lý Sơn và đánh giá tác động sinh học của sản phẩm tạo ra” cho biết quá trình lên men, các hoạt tính sinh học của tỏi Lý Sơn tăng đáng kể, trong đó hàm lượng đường tổng tăng khoảng 13 lần, fructose tăng khoảng 52 lần và SAC tăng gấp 6 lần. Chiết xuất tỏi đen đã được thử nghiệm trên chuột, kết quả cho thấy tác dụng chống oxi hoá tăng gấp 2-4 lần và khả năng miễn dịch của các cơ quan cao hơn nhiều so với tỏi tươi. Bên cạnh đó, đề tài “Nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư trên thực nghiệm và bào chế viên nang tỏi đen” thuộc Chương trình nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng (KC.10/11-15).

Tỏi đen được chế biến từ tỏi tươi thu hoạch ở xã Quảng Hòa, huyện Quảng Trạch, tỉnh Quảng Bình để ủ và lên men tỏi đen sau 35-55 ngày.Nồi ủ sử dụng có phần nắp trong là viền cao su giữ kín nhiệt, lỗ thông hơi gắn với một nhiệt kế 100oC để theo dõi nhiệt độ trong nồi (Nguyễn Đức Vượng và ctv., 2015). Ngoài ra, Nguyễn Đức Vượng và ctv. (2017) cũng đã sử dụng quy trình lên men tự nhiên bằng nhiệt để chuyển tỏi trắng thành tỏi đen. Tiến hành lên men trong điều kiện 70oC và thời gian lên men từ 35-45 ngày.

Tỏi đen được chế biến từ giống tỏi bản địa Đồng Mu, Cao Bằng. Tỏi thu về đem rửa sạch để ráo hết nước rồi được ngâm bia Hà Nội (bia có chứa béo tổng 14 g, béo bão hòa 9 g, trans fat 0g, Cholesterol 55 mg, Sodilum 40 mg, carbohydrate tổng 17 g, chất xơ ăn được 1 g, đường 14 g, protein 3 g, vitamin A 10%) trong 20 phút. Sau đó để ráo và quạt khô. Tiếp theo, tỏi được cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 55oC và được lên men trong 55 ngày ở tủ sấy. Kết quả cho thấy sản phẩm tỏi đen từ nghiên cứu có lượng đường khử là 46,93 (g/100 g), protein 11,30 (g/100 g), lipid 0,27 (g/100 g), polyphenol 47,06 (mg/g) và flavonoid là 14,68 (mg/g) (Nguyễn Thị Tình và ctv., 2019). Đào Văn Minh (2015) cũng nghiên cứu nâng cao chất lượng và giá trị kinh tế cho sản phẩm

tỏi bằng việc nghiên cứu sản xuất tỏi đen. Từ đó bước đầu đưa ra quy trình và xác định một số hoạt chất như SAS, SOD enzyme, polyphenol.

Nghiên cứu đã khảo sát được các chỉ tiêu chất lượng của bột cao khô tỏi đen, từ đó đưa ra bộ chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm bao gồm: hình thức cảm quan, độ ẩm, độ mịn, hàm lượng kim loại nặng, định tính, định lượng, độ nhiễm khuẩn. Trong đó có các chỉ tiêu chất lượng quan trọng và đặc trưng của bột cao khô tỏi đen như hàm lượng SAC trong bột cao không được ít hơn 350 g/g, kim loại nặng không quá 10 ppm, độ ẩm không quá 5%. Với bộ chỉ tiêu chất lượng khảo sát được, có thể sử dụng trong kiểm nghiệm bột cao khô tỏi đen trong sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng chứa tỏi đen (Vũ Bình Dương và Vũ Đình Tiến, 2016).

Vũ Đình Tiến và ctv. (2014) nghiên cứu xây dựng được quy trình chiết xuất cao tỏi đen bằng phương pháp chiết siêu âm ở âm tần số 60 MHz, với dung môi là nước (tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/10), chiết 2 lần trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ 60oC, cô cao khô ở nhiệt độ 60oC dưới áp suất giảm. Hiệu suất chiết SAC đạt 87,36%.

Vũ Bình Dương và Nguyễn Trọng Điệp (2014) đã khảo sát các điều kiện thích hợp cho phun sấy cao khô tỏi đen gồm: tá dược hỗ trợ phun sấy: maltodextrin:aerosol (9:1) với tỷ lệ 1:1 và nhiệt độ phun sấy là 140oC, tỷ lệ chất rắn trong dịch phun sấy 15%, tốc độ cấp dịch 50 mL/phút. Hiệu suất thu hồi hoạt chất và hiệu suất sấy lần lượt là 91,60% và 86,06%.

Hầu hết các nghiên cứu về tỏi ở các quốc gia thể hiện các đặc tính tốt của tỏi đối với các bệnh mãn tính. Sovová and Sova (2004) báo cáo rằng bổ sung tỏi làm giảm sự tích tụ của cholesterol trên thành mạch máu của động vật. Yeh and Liu (2001) cũng nghiên cứu tương tự nhưng thực hiện trên con người. Một nghiên cứu khác cho thấy việc bổ sung chiết xuất từ tỏi ức chế vôi hóa mạch máu ở bệnh nhân có cholesterol cao trong máu (Durak et al., 2004). Hiệu quả ảnh hưởng đến khả năng gây giãn nở mạch máu của tỏi được gây ra bởi quá trình dị hóa của polysulfides tỏi có nguồn gốc từ khí hydro lưu huỳnh trong các tế bào hồng cầu. Hydrogen sulfide bảo vệ tim mạch mạch phân tử tế bào tín hiệu nội sinh (Benavides et al., 2007).

Tỏi được sử dụng như một chất khử trùng để ngăn chặn hoại tử. Củ tỏi được sử dụng như một biện pháp khắc phục các bệnh nhiễm trùng (đặc biệt là vấn đề ngực), rối loạn tiêu hóa và nhiễm nấm (Shuford et al, 2005; Jones and Goebel, 2001). Simonetti (1990) cũng khẳng định tỏi có tính chất kháng khuẩn và diệt khuẩn. Tỏi cũng tăng cường hấp thu thiamin, và do đó làm giảm khả năng phát triển bệnh beriberi do thiếu hụt thiamin (Jones and Goebel, 2001).

Dịch chiết xuất tỏi rất tốt cho việc giảm huyết áp tâm thu ở những bệnh nhân được điều trị tăng huyết áp nhưng không kiểm soát được (Ried et al., 2010). Nghiên cứu về ức chế streptolysin O (chất độc tạo thành từ các dòng vi khuẩn streptococci nhóm A) bởi allicin (hoạt chất trong tỏi) cũng đã được thực hiện (Arzanlou and Bohlooli, 2010) và sự ổn định của hợp chất allicin trong dịch chiết tỏi cũng được ghi nhận.

Kết quả nghiên cứu của Queiroz et al. (2009) cho rằng hoạt động chống oxy hóa của tỏi có thể bị ảnh hưởng bởi quá trình chế biến. Tỏi đen là một trong những sản phẩm tỏi có khả năng chống oxy hóa mạnh, được sản xuất bởi quá trình xử lý ở nhiệt độ cao (70oC) và độ ẩm cao (90% RH) (Jang et al., 2008; Kang et al., 2008). Trong quá trình lão hóa, các hợp chất không ổn định của tỏi tươi bao gồm alliin được chuyển đổi thành các hợp chất ổn định bao gồm S-allyl cysteine (SAC), các hợp chất hòa tan trong nước có tác dụng chống oxy hóa mạnh (Corzo-Martinez et al., 2007; Imai et al., 1994). Nghiên cứu in vivo cho thấy tỏi đen có hoạt tính chống oxy hóa trong ống nghiệm hơn so với tỏi tươi (Jang et al., 2008).

Ngoài ra các kết quả nghiên cứu khác trên thế giới liên quan đến nghiên cứu này đã được thực hiện với kết quả cho thấy có sự tăng hoặc giảm các chất có hoạt tính sinh học trong sản phẩm tỏi đen được chế biến (đã đề cập ở phần 2.1). Tuy nhiên, tỏi đen hoặc tỏi lên men với công nghệ được kiểm soát, động học biến đổi các hoạt chất có giá trị trong tỏi và tối ưu hóa quy trình công nghệ được áp dụng vẫn chưa được công bố rộng rãi.

S-allyl cysteine (SAC) (sản phẩm phân hủy chủ yếu từ γ-glutamyl-S- allyl-L-cysteine) là hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh tan trong nước. Nồng độ SAC tăng lên khi thời gian trích ly tăng trong môi trường nước. Amagase and Milner (1993) cho thấy tỏi lão hóa chứa hàm lượng SAC là 0,45 mg/g. Yoo et al. (2010) cũng đã công bố tỏi Hàn Quốc trích ly trong nước chứa lượng SAC khoảng 0,36-0,6 mg/g.

Hàm lượng S-allyl cysteine (SAC) tăng lên cũng là một thay đổi quan trọng trong tiến trình chế biến tỏi đen. Tỏi tươi chứa 20-30 g/g SAC (Kodera et al., 2002) và lượng SAC trong tỏi đen cao gấp 5-6 lần so với tỏi tươi (Bae et al., 2012; Wang et al., 2010). SAC được hình thành bởi quá trình thủy phân của -glutamyl-S-allyl cysteine (GSAC) bởi -glutamyl transpeptidase (-GTP, EC 2.3.2.2) (Kodera et al., 2002). SAC là một trong những hợp chất amino acid chứa lưu huỳnh chính và là chất có nhiều lợi ích nhất của tỏi, như chống oxy hóa, chống ung thư, chống các bệnh lý về gan và thần kinh (Kodera et al., 2002).

Ajoene (4,5,9-trithiadodeca-1,6,11-triene-9-oxide) là sản phẩm từ quá trình phân hủy allicin. Nhiệt độ lão hóa được xem là rất quan trọng đối với sự hình thành ajoene. Khi nhiệt độ lão hóa là 40, 60 và 80oC, nồng độ ajoene tăng dần. Lượng cao nhất E-ajoene (172 μg/g tỏi) and Z-ajoene (476,3 μg/g tỏi) được tìm thấy trong tỏi Nhật trộn với dầu cám ở 80oC (nhiệt độ tối ưu) (Naznin et al., 2008). Riêng tỏi trong dầu đậu nành thì lượng E-ajoene tạo thành là 172 μg/g tỏi và Z-ajoene là 120 μg/g tỏi.

Hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) trong tỏi ở các giai đoạn xử lý nhiệt khác nhau cao hơn nhiều (p < 0,05) so với tỏi tươi. TPC trong tỏi đen tăng khoảng 4-10 lần so với tỏi tươi. Choi et al. (2008) cho rằng hàm lượng các hợp chất polyphenol và flavonoid tự do trong tỏi đã gia nhiệt cao hơn nhiều so với tỏi tươi và tỏi chần bằng hơi nước.

Theo Bae et al. (2014), các hoạt động loại bỏ gốc tự do DPPH trong các mẫu tỏi đã gia nhiệt cao hơn đáng kể so với các mẫu tỏi tươi. Hơn nữa, hoạt động loại bỏ gốc tự do tăng khi nhiệt độ tăng từ 40oC lên 85oC (P <0,05). Hoạt động loại bỏ gốc tự do của tỏi tươi là 6,21%, hoạt động này tăng lên 44.77% khi gia nhiệt tỏi tươi ở 85oC trong 45 ngày. Trong khi các mẫu tỏi gia nhiệt ở 40oC chỉ tăng lên 22,50%. Sự giảm phức hợp Fe3+/ferricyanide sang hình thức chứa sắt diễn ra trong sự hiện diện của chất chống oxy hóa, điều này làm cho giảm năng lực khử. Thay đổi trong việc giảm năng lực khử ở các nhiệt độ khác nhau trong quá trình sản xuất tỏi đen. Việc giảm năng lực khử của các mẫu tỏi đã qua xử lý nhiệt tăng lên đáng kể cùng với nhiệt độ và thời gian (P <0,05) và cao nhất ở nhiệt độ cao sau 45 ngày xử lý nhiệt.

Guihua et al. (2007) cũng cho thấy quá trình gia nhiệt làm tăng hàm lượng phenol do sự phá hủy trạng thái kết hợp của chúng (hoạt động ester hóa và glycosyl hóa) làm gia tăng trạng thái tự do. Ngoài ra, một lý do khác làm tăng lượng phenol trong các mẫu tỏi gia nhiệt là sự giảm/ức chế quá trình oxy hóa bởi enzyme bao gồm hợp chất chống oxy hóa trong nguyên liệu tươi ban đầu (Dewanto et al., 2002; Nicoli et al., 1999). Sự tăng hàm lượng polyphenol cũng có nguyên nhân từ sự tăng hàm lượng của các hợp chất polyphenol phức được hình thành ở giai đoạn cuối của phản ứng Maillard (Robards et al., 1999). Hàm lượng acid phenolic tổng trong tỏi đen tăng 4,6-7,8 lần so với tỏi tươi. Hơn nữa, các dẫn xuất của acid hydroxycinnamic được tìm thấy là acid phenolic chủ yếu có trong tỏi đã qua xử lý nhiệt (Kim et al., 2013).

2.2.3 Các nghiên cứu nâng cao hoạt chất sinh học trong tỏi liên quan

đến chế biến tỏi lên men acid lactic

Tỏi muối chua từ năm công ty ở Tây Ban Nha được phân tích về các đặc tính hóa lý, thành phần gần đúng, acid ascorbic, thiamin, riboflavin, - tocopherol, và hàm lượng acid amin. Acid chuẩn độ dao động trong khoảng 0,70 đến 2,66%, trong khi hàm lượng muối trong khoảng 2,39 đến 7,40%. Nước, protein, và hàm lượng chất xơ cho thấy sự biến động thấp giữa các mẫu, trung bình 86,89%, 3,35%, và 2,1%, tương ứng. Phạm vi nồng độ (căn bản trọng lượng ướt, wwb) của các thành phần quan trọng là chất béo (0,21- 0,35%), tro (2,65-8,40%), và đường (2,21-4,22%). Acid amin thiết yếu tổng số dao động trong khoảng 46,3-53,9% trong tổng protein, các acid amin giới hạn là lysine và các acid amin chứa lưu huỳnh. Một sự khác biệt đáng kể trong hàm lượng vitamin, cũng như các đặc điểm hóa lý. Mức độ vitamin phân tích là thiamine (0-0,055 mg/kg), riboflavin (0,013-0,032 mg/kg), -tocopherol (0,36-2,53 mg/kg), và acid ascorbic (0-47,9 mg/100 g) (Casado et al., 2004).

Tỏi được bóc vỏ, xử lý (chần và không chần) và tiến hành lên men trong nước muối với sự tham gia của giống vi khuẩn L. plantarum. Quá trình lên men diễn ra trong 7 ngày ở nơi duy trì nhiệt độ 30oC. Theo dõi các tính chất hóa học và vật lý của tỏi sau lên men và sau quá trình bảo quản 3 tháng. Sự phát triển của nấm men hoặc nấm mốc không được phát hiện trong tỏi chần hoặc không chần trong 7 ngày của quá trình lên men. Đối với tỏi chần, pH của nước muối giảm dần, đạt giá trị 3,77 ở 7 ngày. Đối với tỏi không chần có một sự khởi đầu giảm pH của môi trường (4,00), nhưng do sự phát triển của L. Plantarum đã không diễn ra, pH tăng lên (5,65), có lẽ do sự khuếch tán sự hình thành acid vào tỏi trong nước muối (de Castro et al., 1998).

Tỏi tươi (đã bóc vỏ) ngâm ngập trong dung dịch acid acetic 2% và NaCl được bảo quản ở 20oC trong 60 ngày. pH của tỏi muối chua giảm còn khoảng 4 ở ngày thứ 20 của quá trình tồn trữ. Số lượng allicin (thành phần vị cay nồng chính yếu) của tỏi muối chua bởi phân tích HPLC giảm 5,9% vào ngày thứ 40 của quá trình tồn trữ so với allicin trong tỏi tươi. Một bảng đánh giá cảm quan của 10 cảm quan viên về các mãu tỏi muối chua (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ngày tồn trữ) bằng cách chấm điểm (thang điểm 7). Kết quả đánh giá cảm quan cho thấy vị cay nồng của tỏi muối chua giảm dần và điểm đạt 3,07 ở ngày tồn trữ thứ 40. Mối quan hệ giữa kết quả điểm đánh giá cảm quan vị cay nồng và số lượng allicin đã chứng minh một mối tương quan rất rõ ràng (r = 0,9646) (Kim et al., 1993).

Các nghiên cứu trong nước về tỏi cũng còn hạn chế. Đặc biệt các nghiên cứu chuyên sâu về tác động trong quá trình chế biến, tồn trữ và khả năng hấp thu của các hoạt chất có giá trị sinh học trong các sản phẩm từ tỏi vẫn còn rất hạn chế, chưa thấy công bố trên các tài liệu khoa học trong nước và trên thế giới.

2.2.4 Các nghiên cứu tạo hạt nano mang chất có hoạt tính sinh học từ

tỏi hoặc sản phẩm tỏi và thử nghiệm hoạt tính có liên quan

Sự ra đời và phát triển của công nghệ nano đã và đang tạo ra những bước tiến to lớn trong rất nhiều các lĩnh vực khoa học. Trong số đó, những hệ chất mang nano đã được nghiên cứu, ứng dụng trong việc nâng cao hiệu quả của các loại thuốc, các loại hoạt chất sinh học dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm. Bằng việc bao bọc những thành phần hoạt tính bên trong tạo ra những hệ dẫn có kích thước nano, những hệ chất mang nano có khả năng bảo vệ những thành phần hoạt tính tránh khỏi sự tác động của môi trường như nhiệt độ, ánh sáng hay những tác động của môi trường sinh lý bên trong cơ thể. Qua đó, làm nâng cao độ bền của những thành phần hoạt tính (Milad et al., 2014). Không những vậy, những hệ chất mang nano còn làm tăng khả năng thẩm thấu qua thành ruột, do đó nâng cao hiệu quả của những hoạt chất được sử dụng qua đường uống. Sự hấp thụ những hệ dẫn nano qua thành ruột cao gấp từ 15-250 lần so với những hệ dẫn thuốc có kích thước trong khoảng từ 1 đến 10 micromet. Lý giải cho điều này, rất nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và chứng minh tính ưu việt của những hệ dẫn thuốc có kích thước nano. Saltzman và Olmsted đã chỉ ra rằng, những hạt nano có kích thước 38 nm và 55 nm có khả năng khuếch tán một cách dễ dàng qua những lớp niêm mạc thành ruột vì kích thước của những khe trống trên niêm mạc xấp xỉ 100nm (Olmsted et al., 2001; Saltzman et al., 1994). Jani et al. (1990) đã đánh giá khả năng khả năng hấp thu qua màng ruột của những hạt nano polystyrene với những kích thước hạt khác nhau (50–100–200–300–1000–3000 nm). Kết quả chỉ ra rằng, sự hấp thu xảy ra lớn nhất đối với những hạt có kích thước 50 nm (34%) và giảm tới mức rất thấp 0,8% đối với những hạt có kích thước 1000 nm.

Nhằm nâng cao độ bền của allicin dưới tác động của môi trường ngoài như nhiệt độ, ánh sáng, độ acid (pH) và cải thiện tính tan của allicin, Wang et al. (2012) đã sử dụng hỗn hợp gồm beta-cyclodextrin và tinh bột để tạo ra hệ mang allicin có kích thước micromet. Kết quả đã cho thấy rằng, độ bền và độ tan trong nước của allicin được tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, hoạt tính sinh học của allicin trong hệ mang này chưa được tăng lên, mới chỉ ở mức độ tương đồng so với allicin nguyên chất.

Theo Lu et al. (2014) allicin, thành phần hoạt động chính bắt nguồn từ một tác nhân mùi truyền thống trong tỏi, tạo nên hàng loạt các tác dụng sinh học. Nhưng đáng tiếc, tiềm năng lớn của tỏi trong quá trình chế biến bị hạn chế bởi sự nhạy cảm của tỏi đối với các điều kiện nhiệt và kiềm kèm theo mùi hăng của tỏi. Trong nghiên cứu của Lu et al. (2014), nanoliposome allicin đã được điều chế bằng cách sử dụng phương pháp bốc hơi ngược pha nhằm khắc phục các hạn chế đã nêu.

Tại Việt Nam, viên nang cứng tỏi đen đã được nghiên cứu và đánh giá độc tính cấp trên động vật thực nghiệm là chuột. Kết quả cho thấy, không phát hiện được độc tính cấp ở liều tối đa 10 g/kg thể trọng sau khi chuột uống liều duy nhất bột viên nang tỏi đen có nguồn gốc từ tỏi Việt Nam. Các kết quả kiểm tra cũng cho thấy, không có sự khác biệt đáng kể về sự thay đổi tình trạng toàn thân, số lượng tế bào máu, chức năng gan thận của chuột thực nghiệm so với nhóm đối chứng (Vũ Bình Dương và Hồ Anh Sơn, 2016).

Vũ Bình Dương và Hồ Anh Sơn (2015) đã đánh giá được tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ người A549 của cao khô tỏi đen bằng thử nghiệm trypan blue và MTT. Kết quả cho thấy tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi ủ với tỏi đen nồng độ 2,5-10 mg/mL, tỏi đen ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào A549 với nồng độ gây IC50 ở 24 giờ là 10,57 mg/mL.

Các hoạt chất có tác dụng sinh học chủ yếu do các thành phần lưu huỳnh hữu cơ trong tỏi, các chất này có hiệu lực cao trong ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư trong môi trường nuôi cấy thông qua cơ chế gây chết theo chương trình (apoptosis). Trong nghiên cứu này, khả năng chống ung thư của tỏi đen được đánh giá trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT 29 bằng hệ thống máy FACS. Tại thời điểm 24 giờ sau khi ủ tế bào với môi trường có tỏi đen nồng độ 0,1 mg/mL đã gây chết apoptosis tế bào ung thư đại tràng HT 29 (Phạm Xuân Phong và Hồ Anh Sơn, 2015a). Phạm Xuân Phong và Hồ Anh Sơn (2015b) nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của tỏi đen trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư gan người với liều 10 g/kg/ngày hàng ngày kéo dài một tháng có tác dụng kìm hãm sự phát triển khối ung thư rõ rệt so với nhóm đối chứng (p<0,05). Đồng thời, chuột mang khối ung thư gan người được uống tỏi đen có tỷ lệ sống nhiều hơn và thời gian sống dài hơn rõ rệt so với nhóm chứng không điều trị (p<0,05).

Chuột thiếu hụt miễn dịch (athymic mouse) được uống dịch tỏi đen hàng ngày với liều 1 g/kg và 10 g /kg thể trọng trong 1 tháng. Sau đó, chuột được ghép 106 tế bào ung thư gan người. Liều tỏi đen 10 g/kg thể trọng/hàng ngày,

kéo dài 1 tháng, tỷ lệ chuột hình thành khối u giảm rõ rệt so với nhóm chứng (p<0,05) và còn ức chế phát triển của khối u, kéo dài thời gian sống và tỷ lệ chuột sống so với nhóm chứng (p<0,05) (Phạm Xuân Phong, 2015).

Trong nghiên cứu này, Nguyễn Trọng Tài và Nguyễn Viết Trung (2014) đánh giá khả năng chống ung thư của SAC và dịch chiết tỏi đen trên dòng ung thư gan người Hep-3B. Kết quả cho thấy tế bào Hep-3B bị ức chế ở nồng độ SAC 100 mM và dịch chiết tỏi đen với nồng độ tính theo SAC là 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM.

Đến nay, chưa có nghiên cứu nào ở trong và ngoài nước chế tạo thành công hạt nano có kích thước nhỏ hơn 100 nm mang hoạt chất từ tỏi đen đi kèm với các thử nghiệm in-vitro và in-vivo để đánh giá hoạt tính của chúng.

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành thông qua việc lấy mẫu, thực nghiệm,

phân tích và xử lý dữ liệu tại:

Ruộng tỏi vào thời điểm mùa vụ năm 2014, 2015, 2016 và 2017 tại

phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận.

Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học; Phòng Thí nghiệm Chuyên sâu - Trường Đại học Cần Thơ.

Phòng Vật liệu Nano Y sinh, Viện Khoa học Vật liệu; Phòng Hóa sinh Ứng dụng, Phòng Hoạt chất Sinh học, Phòng Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên, Viện Hóa học; Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học; Phòng Thiết bị dùng chung, Viện Kỹ thuật Nhiệt đới; Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Thời gian thực hiện từ tháng 06/2014 đến tháng 03/2018.

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ

Một số thiết bị và dụng cụ cơ bản được sử dụng trong các thí nghiệm như sau:

- Cân phân tích Ohaus, model PX224/E (Mỹ) - Tủ đông Sanyo, model SF-CR27K (Nhật Bản)

- Máy đo cấu trúc Rheotex, model SD700 (Nhật Bản) - Tủ sấy Amerex, model CV250 (Mỹ)

- Máy đo quang phổ, model 722N (Trung Quốc) - Hệ thống HPLC-UVD (Shimadzu, Shimadzu Corporation, Nhật Bản)

- Tủ mát Alaska, model SL-8C (Trung Quốc) - Cột sắc ký LiChroCART (Merck, Đức)

- Kính hiển vi điện tử quét Hitachi, model S-4800 (Singapore)

- Tủ làm tỏi đen (80cm x 71cm x 110cm, 50-100oC, RH tối đa ở các nhiệt độ tương ứng) (Việt Nam)

- Máy tán xạ ánh sáng động (DLS) Zetasizer Nano, model 7.03 (Anh) - Cân sấy ẩm hồng ngoại, model MX50 (Godex, Mỹ)

reader (Biotek,

- Máy Elisa ELx800, USA)

- Máy quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier Perkin Elmer (Waltham, Massachusetts, USA)

- Máy cô quay chân không Ika, model RV10 digital V (Đức)

- Máy Tecan Genios Fluorescence Luminescence Microplate Reader, model A-5082 (Thụy Sĩ)

- Máy đo đường huyết Omron, model HGM-111 (Nhật Bản) - Máy khuấy từ gia nhiệt IKA, model C-MAGHS7 (Đức)

- Bể siêu âm, model Elma P300H (Đức)

- Máy Elisa reader, model ELx800 (Biotek, Mỹ)

Các dụng cụ, thiết bị cần thiết khác trong phòng thí nghiệm: bình tam giác, ống đong, buret, pipet, pH kế, Brix kế, thước kẹp Caliper,… cũng được dùng trong các thí nghiệm.

3.1.2.2 Hóa chất

Một số hóa chất cơ bản được sử dụng trong các thí nghiệm như sau:

- Thuốc thử Folin-Ciocalteu (độ tinh khiết  99%) (Merck, Đức) - Chất chuẩn S-allyl-L- cysteine ( 98%, Sigma, Mỹ)

- Acetonitrile (độ tinh khiết 99.8%) (Merck, Đức) - 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil (độ tinh khiết  99%) (Merck, Đức)

- Chất chuẩn quercetin (độ tinh khiết  98% Sigma, Mỹ) - Enzyme -glucosidase (CAS No 9001-42-7, Sigma, Mỹ)

- Alloxan monohydrate (Sigma, Mỹ)

- Dimethyl sulfoxide (CAS No 67-68- 5, Sigma, Mỹ)

(CAS No

- Acetylcholinesterase 9002-53-8, Sigma, Mỹ) - -Nitrophenyl--D-glucopyranoside (CAS No 3767-28-0, Sigma, Mỹ)

thử Ellman's (DTNB)

- 4-Notrophenol (CAS No 100-02-7, Sigma, Mỹ) - Thuốc (Sigma, Mỹ)

- Natri alginate (Sigma, Mỹ)

- Môi trường MRS broth (Hemidia, Ấn Độ)

Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn để sử dụng trong phân tích.

3.1.3 Nguyên liệu

Nguyên liệu tỏi cổ mềm (Allium sativum var sativum), giống địa phương được thu hoạch vào buổi sáng sớm, thời tiết nắng ráo. Hình dạng bên ngoài cho thấy cổ cây tỏi đã ngã sang một bên, đầu lá vàng úa và trong khoảng thời gian 130 đến 140 ngày (sau khi gieo) tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận. Chọn lựa củ tỏi không bị sâu, thối hoặc nhiễm nấm. Củ tỏi được cho vào thùng carton và vận chuyển bằng ô tô đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự thay đổi đặc tính lý học và hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ

3.2.1.1 Mục tiêu

Xác định ảnh hưởng của thời điểm thuần thục và điều kiện bảo quản đến đặc tính lý học và các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quá trình tồn trữ. Chọn được thời điểm thu hoạch tỏi có chất lượng tốt nhất và điều kiện tồn trữ thích hợp để áp dụng trong chế biến các sản phẩm tỏi.

3.2.1.2 Địa điểm

Ruộng tỏi tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận và Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ.

3.2.1.3 Bố trí thí nghiệm

Nguyên liệu tỏi cổ mềm, giống địa phương được thu hoạch lúc cổ cây tỏi đã ngã sang một bên và chọn lựa ở độ tuổi 120 đến 140 ngày (sau khi gieo) tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận. Tỏi được thu hoạch vào buổi sáng sớm, thời tiết nắng ráo.

a Chất lượng củ tỏi ở các thời điểm thu hoạch

Các củ tỏi được thu hoạch tại nhiều ruộng tỏi ở địa bàn phường Văn Hải, thành phố Phan Rang – Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận. Ở mỗi độ tuổi thu hoạch 5 kg củ tỏi. Các củ tỏi được tồn trữ trong túi vải dạng lưới (kích thước lỗ khoảng 0,9 mm). Củ tỏi được phân tích tại phòng thí nghiệm có nhiệt độ phòng 28 – 30oC và RH 68 – 71%. Thí nghiệm được bố trí một nhân tố.

Nhân tố A: độ thuần thục (ngày sau khi gieo): 120, 125, 130, 135 và 140

Số nghiệm thức: 5. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

b Ảnh hưởng của nhiệt độ tồn trữ đến chất lượng củ tỏi

Củ tỏi sau khi thu hoạch được xử lý sơ bộ và tách một lớp vỏ ngoài của củ tỏi nhằm loại bỏ đất cát. Sau đó, các củ tỏi được chứa trong túi vải lưới và tồn trữ ở các nhiệt độ khác nhau. Thí nghiệm được bố trí một nhân tố.

Nhân tố B: nhiệt độ tồn trữ (oC): 0, 5, 20 và nhiệt độ phòng (28-30)

Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

c Ảnh hưởng của loại bao bì sử dụng đến sự hao hụt khối lượng

Chọn củ tỏi ở độ tuổi và nhiệt độ bảo quản thích hợp từ các thí nghiệm trước. Khối lượng tỏi trong bao bì là 500-550 g. Các loại bao bì được sử dụng trong thí nghiệm: PE (24 x 34 cm và dày 38 m), thùng carton (30 x 22,5 x 12,5 cm) với tỷ lệ đục lỗ là 0,5% (đường kính lỗ 5 mm, 20 lỗ trên hai mặt của bao bì với khoảng cách đều nhau) và vải lưới (24 x 34 cm và dày 0,21 mm, kích thước lỗ lưới khoảng 0,9 mm). Các mẫu được tồn trữ ở nhiệt độ thích hợp đã chọn. Thí nghiệm được bố trí một nhân tố.

Nhân tố C: loại bao bì: PE, thùng carton và vải lưới

Số nghiệm thức: 3. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

3.2.1.4 Các chỉ tiêu cần theo dõi

- Độ cứng chủ quan (subjective firmness) theo mô tả của Vázquez-Barrios et al. (2006). Độ cứng chủ quan được đánh giá bởi duy nhất một người tiến hành thí nghiệm bằng cách ép thủ công mỗi lần 5 củ tỏi (3 lần lặp lại) và cho điểm với giá trị độ cứng tăng dần từ 0 (rất xốp) đến 5 (cứng chắc).

- Hao hụt khối lượng (%): xác định khối lượng ban đầu (md) của mẫu và khối lượng sau thời gian tồn trữ (mc). Hao hụt khối lượng được tính = (md – mc) x 100/md.

- Hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) (mg acid gallic tương đương (GAE)/g d.w): sử dụng thuốc thử Folin – Ciocalteu (Wolfe et al., 2003) (Phụ lục A).

- Hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) (mg quercetin tương đương (QE/g d.w) (Zhu et al., 2010) (Phụ lục A).

- Hàm lượng thiosulfinate tổng số (mol/g d.w): Đo độ hấp thu ở bước sóng 412 nm của 2-nitro-5-thiobenzoate được tạo ra bằng cách kết hợp các phương pháp của Sariri et al. (2002); Li et al. (2007) và được điều chỉnh bởi Kinalski and Noreña (2014) (Phụ lục A).

- Hoạt động chống oxy hóa (%): hoạt động loại bỏ gốc tự do được phân tích thông qua thử nghiệm 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH) (Blois, 1958) (Phụ lục A).

- Chỉ số nảy mầm bên trong: tính theo tỷ lệ % chiều dài mầm và chiều dài tép tỏi (Vázquez-Barrios et al., 2006).

- Màu sắc: sử dụng phần mềm Artweaver 1.0 để lấy giá trị R, G, B từ ảnh kỹ thuật số. Sử dụng phần mềm hiệu chỉnh và chuyển đổi giá trị R, G, B sang giá trị L, a,b (Phụ lục A).

- Độ ẩm (%): thực hiện theo phương pháp sấy ở 105oC đến khối lượng không đổi (Phụ lục A).

- Cường độ hô hấp: được đo bằng hệ thống cường độ hô hấp Respirometer (Phụ lục A).

Các thiết bị khác sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: chiết quang kế, pH

kế, máy đo cấu trúc Rheotex, thước kẹp Caliper và máy quang phổ.

3.2.2 Nội dung 2: Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi

thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic

3.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý nhiệt đến

quy trình sản xuất sản phẩm tỏi đen.

a Mục tiêu: xác định các thông số tối ưu cho quá trình sản xuất tỏi đen nhằm tạo ra sản phẩm tỏi đen có chất lượng cao (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng chống oxy hóa của tỏi đen).

b Địa điểm: Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp; Phòng

Thí nghiệm Chuyên sâu, Trường Đại học Cần Thơ.

c Phương pháp thực hiện:

Quy trình chế biến tỏi đen dự kiến như sau: củ tỏi tươi  Rửa sạch, để ráo  Tiền xử lý nhiệt (chần hoặc lạnh đông)  Thiết bị làm tỏi đen (%RH tối đa có thể tại nhiệt độ cài đặt)  Lão hóa  Đóng gói  Bảo quản.

d Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp xử lý nhiệt nguyên

liệu đến chất lượng củ tỏi tươi

Chọn các củ tỏi còn nguyên vỏ lụa có đường kính trong khoảng 3,60,2 cm để tiến hành thí nghiệm

- Phương pháp 1: Chần bằng hơi nước (100oC) trong khoảng thời gian 4, 6, 8 và 10 phút. Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

- Phương pháp 2: Lạnh đông ở nhiệt độ -18oC trong khoảng thời gian 12, 24, 36 và 48 giờ. Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Mẫu đối chứng: không xử lý nhiệt.

Các chỉ tiêu cần theo dõi: TPC (mg GAE/g d.w), TFC (mg QE/g d.w), hàm lượng thiosulfinate (mol/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%) và đánh giá cảm quan theo phương pháp Phân tích mô tả định lượng (QDA) (Phụ lục A).

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lão hóa đến

chất lượng sản phẩm tỏi đen

Củ tỏi tươi sau khi được xử lý nhiệt sẽ tiếp tục được lão hóa để thành tỏi đen. Chất lượng của tỏi đen được theo dõi sau mỗi 5 hoặc 7 ngày lão hóa cho đến khi kết thúc quá trình chế biến 45 ngày. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với hai nhân tố.

Nhân tố D: nhiệt độ lão hóa (oC): 60, 70, 80 và 90

Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Các chỉ tiêu cần theo dõi:

Chỉ tiêu hóa học: Độ ẩm (%), pH, oBrix, hàm lượng acid tổng (acid tartaric) (% d.w), hàm lượng đường khử (% d.w), hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) (mg acid gallic tương đương (GAE)/g d.w) (Wolfe et al., 2003), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) (mg quercetin tương đương (QE/g d.w) (Zhu et al., 2010), hàm lượng thiosulfinate tổng số (mol/g d.w) theo phương pháp của Sariri et al. (2002), Li et al. (2007) và được điều chỉnh bởi Kinalski and Noreña (2014), hoạt động chống oxy hóa (%) (Blois, 1958), hàm lượng SAC (mg/kg d.w) bằng phương pháp HPLC (Phụ lục A).

Các chỉ tiêu vật lý: Độ cứng (g lực): máy đo cấu trúc Rheotex, Nhật Bản.

Màu sắc (Phụ lục A).

Đánh giá cảm quan: theo phương pháp phân tích mô tả định lượng

(QDA), hồi quy logistic (Phụ lục A).

Mô hình động học giá trị L của tỏi đen có dạng: A/Ao = a.e-kt, trong đó A và Ao là giá trị L của tỏi tại thời điểm t và t = 0; k là hằng số tốc độ hóa nâu (ngày-1) và t (ngày) là thời gian lão hóa.

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến

chất lượng sản phẩm tỏi đen

Củ tỏi sau khi lão hóa được tiến hành sấy khô lớp vỏ bên ngoài. Nghiên

cứu được bố trí theo mô hình Box-Behnken với 2 nhân tố:

Nhân tố F: nhiệt độ sấy (oC): 50, 60 và 70

Nhân tố G: thời gian (giờ): 8, 12 và 16

Số nghiệm thức: 3 x 3 = 9. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Các chỉ tiêu cần theo dõi:

Chỉ tiêu hóa học: Hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) (mg acid gallic tương đương (GAE)/g d.w) (Wolfe et al., 2003), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) (mg quercetin tương đương (QE/g d.w) (Zhu et al., 2010) và hoạt động chống oxy hóa (%) (Blois, 1958) (Phụ lục A).

Đánh giá cảm quan: theo phương pháp hồi quy logistic (Phụ lục A). Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tồn trữ đến khả năng

duy trì các hoạt chất sinh học trong sản phẩm tỏi đen

Tỏi sau khi kết thúc quá trình sấy, được đem bảo quản ở nhiệt độ môi trường (282oC) và nhiệt độ mát (5oC) với hai loại bao bì bảo quản là PA và bao bì phức hợp (tráng nhôm). Mỗi bao bì chứa 300 gram tỏi đen. Tiến hành theo dõi hàm lượng các hợp chất sinh học, khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi đen theo thời gian bảo quản (2 tuần/lần). Mục đích của thí nghiệm là xác định nhiệt độ và loại bao bì bảo quản thích hợp nhằm duy trì giá trị của sản phẩm tỏi đen với chất lượng tốt nhất. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.

Nhiệt độ tồn trữ (oC): nhiệt độ môi trường (282) và nhiệt độ mát (5)

Loại bao bì chứa: polyamide (PA) và bao bì phức hợp (nhôm)

Tổng số nghiệm thức: 2 x 2 = 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), hàm lượng flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%) (Phụ lục A).

3.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (pH, nồng độ muối, mật số vi

khuẩn acid lactic) đến quy trình sản xuất sản phẩm tỏi lên men lactic.

a Mục tiêu: xác định các thông số tối ưu cho quá trình sản xuất lên men nhằm tạo ra sản phẩm tỏi muối chua có chất lượng cao (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng chống oxy hóa trong sản phẩm).

b Địa điểm: Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp; Viện

Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.

c Phương pháp thực hiện: sau khi xác định được giai đoạn thu hoạch tỏi có chất lượng cao nhất. Các củ tỏi được thu hoạch, rửa sạch bụi bẩn, sau đó chế biến tỏi lên men lactic theo quy trình dự kiến như sau: tỏi  bóc vỏ các tép  chần (80oC, 1 phút 30 giây)  Làm nguội nhanh  Lên men (dung dịch nước muối 1%, oBrix 5, mật số vi khuẩn L. plantarum 106 CFU/mL) (6 ngày, nhiệt độ phòng)  Kết thúc lên men Rửa, làm sạch  Dịch đem thanh trùng  Đóng gói  Bảo quản (51oC).

d Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chần nguyên liệu

tỏi đến chất lượng sản phẩm

Chọn các tép tỏi đã bóc vỏ có chiều dài giữa 20–30 mm, chiều rộng giữa 5–10 mm, có chiều dày giữa 5–10 mm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Các củ tỏi được bóc vỏ và đặt 200 g tép tỏi vào trong túi chần với hai lít nước đã được đun nóng trước tới nhiệt độ, thời gian bố trí. Sau khi chần, mẫu tỏi được nhanh chóng làm lạnh trong bồn nước đá 3 phút. Tỏi được để ráo nước ở nơi thoáng mát và đặt vào các túi PA bảo quản ở nhiệt độ 5oC cho đến khi phân tích các hoạt chất sinh học.

Nhân tố H: nhiệt độ chần (oC): 70, 80 và 90

Nhân tố I: thời gian chần (giây): 60, 90, 120, 150 và 180

- Đối chứng HoIo: không chần

Số nghiệm thức: 3 x 5 = 15. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate (µmol/g d.w), flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%), độ cứng (g lực), màu sắc (Phụ lục A).

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nước muối và mật số vi khuẩn thuần chủng (Lactobacillus plantarum) đến khả năng lên men lactic tỏi

Vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuần chủng được sử dụng có nguồn gốc từ bộ sưu tập giống vi sinh vật của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Chủng Lactobacillus plantarum sử dụng bao gồm dòng XK 1.4 được phân lập từ dưa leo muối chua (theo công thức truyền thống) và S 1.2 được phân lập từ bồn bồn (Typha orientalis G.A.) muối chua. Mỗi mẻ tỏi lên men có 0,5 kg tép tỏi đã bóc vỏ, chần ở nhiệt độ và

thời gian thích hợp từ thí nghiệm trước. Sau đó bổ sung 0,5 lít dung dịch muối NaCl 0,5, 1,0, 1,5 và 2,0% và đường sucrose bổ sung đến 5 oBrix và đem thanh trùng 100oC trong 5 phút. Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum khởi động được phát triển khoảng 24 giờ ở nhiệt độ phòng trong môi trường MRS Broth với mật độ 108 CFU/mL. Sau đó pha loãng thành 100 mL dung dịch vi khuẩn Lactobacillus plantarum có các mật độ 105, 106 và 107 CFU/mL để tiến hành lên men muối chua. Quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ môi trường và được theo dõi thường xuyên. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.

Nhân tố J: Nồng độ dung dịch muối (w/v, %): 0,5, 1, 1,5 và 2

Nhân tố K: Mật số vi khuẩn thuần chủng (CFU/mL): 105, 106 và 107

Mẫu đối chứng không bổ sung vi khuẩn thuần chủng.

Số nghiệm thức: 4 x 3 = 12. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Động học phân hủy của polyphenol, flavonoid và thiosulfinate:

Mô hình động học được sử dụng để mô tả sự tổn thất hàm lượng polyphenol và flavonoid. Mô hình có dạng phương trình: A/Ao = a.e-kt (1). Trong đó A và Ao là hàm lượng polyphenol (mg GAE/g) hoặc flavonoid (mg QE/g) của tỏi tại thời điểm t và t = 0; k là hằng số tốc độ phản ứng (giây-1) và t (giây) là thời gian chần (Ankit et al., 2011).

Sự phân hủy của thiosulfinate được biểu diễn theo mô hình động học có dạng phương trình: Ln(C/Co) = -kt (2). Trong đó C và Co (mol/g) là nồng độ thiosulfinate tại thời điểm t và t = 0; k là hằng số tốc độ phản ứng (giây-1) và t (giây) là thời gian chần (Muhammad et al., 2013).

Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate (µmol/g d.w), flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%), pH, đánh giá cảm quan (Phụ lục A).

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ và loại rau bổ sung đến

chất lượng tỏi lên men

Tỏi được chần ở nhiệt độ và thời gian thích hợp được chọn ra từ thí nghiệm trước. Bổ sung hành lá, hành tây và hành tím với phần trăm khối lượng khác nhau (2,5; 5; 7,5; 10%) vào phần tỏi vừa chần. Sau đó tiến hành lên men thuần chủng với mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum tối thích trong dung dịch muối có nồng độ phù hợp được chọn ra từ kết quả thí nghiệm trên. Sau khi kết thúc quá trình lên men, các nguyên liệu phụ được loại bỏ, phần tỏi còn lại sau lên men được tiến hành phân tích các chỉ tiêu. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.

Nhân tố L: Loại rau: hành tây, hành tím và hành lá

Nhân tố M: Tỷ lệ (%): 2,5, 5, 7,5 và 10 so với lượng tỏi nguyên liệu

Số nghiệm thức: 3 x 4 = 12. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate (µmol/g d.w), flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%) (Phụ lục A).

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tồn trữ đến khả năng

duy trì các hoạt chất sinh học trong sản phẩm tỏi lên men

Sau khi tách riêng từng tép, loại bỏ những tép nhỏ, bóc lớp vỏ mỏng bên ngoài và rửa sạch, tỏi được chần trong nước ở nhiệt độ và thời gian thích hợp được chọn ra từ thí nghiệm trên. Bổ sung thêm một loại phụ liệu với phần trăm khối lượng nhất định được chọn ra từ kết quả tốt nhất của thí nghiệm trên. Sau đó tiến hành lên men thuần chủng với mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum tối thích trong dung dịch muối có nồng độ phù hợp được chọn ra từ kết quả thí nghiệm trên. Sau khoảng thời gian lên men thích hợp, phụ liệu sẽ được loại bỏ, dịch lên men được thanh trùng ở 100°C trong thời gian 5 phút, sau đó rót nóng ở 70oC vào tỏi sau lên men. Các mẫu được bảo quản ở hai khoảng nhiệt độ khác nhau (30±2 và 5±1oC). Theo dõi khả năng bảo quản đến khi sản phẩm không còn được chấp nhận bởi người tiêu dùng. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố.

Nhiệt độ (oC): Nhiệt độ phòng (30±2) và nhiệt độ mát (5±1)

Tổng số nghiệm thức: 2. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate (µmol/g d.w), hàm lượng flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng trung hòa gốc tự do DPPH (%) và giá trị cảm quan (Phụ lục A).

3.2.3 Nội dung 3: Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải thiện sinh khả

dụng của các hợp chất sinh học từ sản phẩm tỏi chế biến

3.2.3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các chất có

hoạt tính sinh học trong tỏi đen

a Mục tiêu: xác định được điều kiện trích ly tối ưu các chất có hoạt tính

sinh học trong tỏi đen

b Địa điểm: Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Trường

Đại học Cần Thơ.

c Phương pháp thực hiện: các tép tỏi đen được bóc vỏ và nghiền mịn

bằng cối và chày, sau đó đem trích ly.

d Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và tỷ lệ nguyên

liệu/dung môi trích ly đến hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học

Nhân tố R: Loại dung môi: nước và ethanol pha trong nước cất (50% và 100%)

Nhân tố S: Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/5, 1/10 và 1/15

Số nghiệm thức: 3 x 3 = 9. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly đến

hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học

Nhân tố T: Nhiệt độ (oC): 40, 50, 60, 70 và 80

Nhân tố U: Thời gian (phút): 30, 60, 90 và 120

Số nghiệm thức: 5 x 4 = 20. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

e Các chỉ tiêu theo dõi

Hàm lượng S-allyl cysteine (mg/kg), polyphenol (mg/g d.w), flavonoid (mg/g d.w) (Phụ lục A)

3.2.3.2 Ứng dụng công nghệ nano góp phần nâng cao giá trị sinh học của

sản phẩm tỏi đen

a Mục tiêu: chế tạo hạt nano tỏi đen mang các chất có hoạt tính sinh học

với kích thước  100 nm, hình dạng gần với hình cầu và độ ổn định cao.

b Địa điểm: Phòng Vật liệu Nano Y sinh, Viện Khoa học Vật liệu – Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

c Tiến trình chế tạo hạt nano tỏi đen

Tỏi đen được trích ly theo tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10 trong ethanol 50% ở nhiệt độ 60oC trong khoảng 90 phút. Dùng ống nhỏ giọt nhỏ từ từ dịch trích tỏi đen thu được vào dung dịch alginate (1 mg/mL) trong máy rung siêu âm với tần số 40 KHz theo tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/1, 2/1, 3/1, 1/2, 1/3. Hỗn hợp được đậy kín và đem khuấy từ với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sau đó, tiến hành bốc hơi ethanol trong thiết bị cô quay chân không ở nhiệt độ 35oC trong 1 giờ với tốc độ 50 vòng/phút. Sau khi đã đuổi hết ethanol, hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 5000

vòng/phút trong 5 phút, thu nhận phần dịch phía trên và đem trữ ở nhiệt độ 5oC đến khi sử dụng.

d Xác định tính chất và đặc trưng của vật liệu

- Hiệu suất bọc thuốc (EE%): Hiệu suất bọc của hệ nano được tính theo công thức EE% = (M1/M2)x100. Trong đó, M1: Khối lượng hợp chất trong hệ nano, M2: Khối lượng hợp chất ban đầu. M1 và M2 đều tính theo trọng lượng khô.

- Hình thái và kích thước hạt được xác định bằng kính hiển vi điện tử

quét Hitachi S-4800, Singapore.

- Kích thước và điện thế zeta: được đo bằng máy đo thế zeta và kích thước hạt được đo bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) Zetasizer Nano 7.03 (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Anh). Điện thế zeta là một trong những lực chính trung gian tương tác giữa các hạt. Điện tích bề mặt của hệ nano tỏi đen có thể làm tăng lực đẩy tĩnh điện giữa các hạt, cải thiện độ ổn định của hệ thống các hạt nano. Điện thế của hệ nano tỏi đen được xác định ở 25oC.

- Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FT-IR): sử dụng viên KBr và máy đo quang phổ hồng ngoại Perkin Elmer (Waltham, Massachusetts, USA) để xác định các nhóm chức đặc trưng giữa số sóng 4000 và 400 cm-1.

3.2.3.3 Thử nghiệm hoạt tính ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo về khả năng

hấp thu và tác dụng của các hoạt chất sinh học của hệ nano tỏi đen

a Mục tiêu

Xác định và so sánh hiệu quả hoạt tính của hệ nano tỏi đen và tỏi đen ở

kỹ thuật in-vitro và in-vivo

b Địa điểm

Phòng Hóa sinh Ứng dụng, Phòng Hoạt chất Sinh học, Phòng Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên, Viện Hóa học; Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học; Phòng Thiết bị dùng chung, Viện Kỹ thuật Nhiệt đới; Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

c Thử nghiệm in-vitro

Thí nghiệm 1: Đánh giá tác dụng gây độc tế bào (Phụ lục A) Các dòng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn của Mỹ (ATCC) gồm: ung thư biểu mô biểu bì miệng KB (CCL -17TM), ung thư gan Hep G2

(HB - 8065TM), ung thư phổi LU-1 (HTB - 57TM), ung thư vú MCF-7 (HTB - 22TM), ung thư biểu mô thận khỉ Vero và ung thư da SK-Mel 2 (HTB - 68TM).

Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) được mô tả lần đầu tiên bởi Tim (1983) và điều chỉnh bởi Cos et al. (1998) và Scudiero et al. (2006). Đây là phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím đen) bởi hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể. Sản phẩm formazan được hòa tan bằng DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 540 nm. Giá trị OD sẽ giúp phản ánh số lượng tế bào sống. Nếu chất thử có hoạt tính gây độc tế bào thì số lượng tế bào sống giảm và giá trị OD giảm.

% ức chế = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)– ODchứng (-)) x 100

Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng sinh (Phụ lục A)

Các chủng vi khuẩn và nấm đại diện gây bệnh ở người trong bộ sưu tập giống vi sinh vật của Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, bao gồm vi khuẩn gram âm: Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442, E. Coli (Ec) ATCC 25922; vi khuẩn gram dương: Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709, Bacillus subtilis (Bs) ATCC 6633, Lactobacillus fermentum N4, Enterococus faecium B650 và nấm mốc Candida albicans (Ca) ATCC 10231. Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp của Franz and Greger (2000) và điều chỉnh bởi Paul et al. (2005).

Thí nghiệm 3: Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme gây bệnh tiểu đường

(-glucosidase) và bệnh Alzheimer (acetylcholinesterase)

Khả năng ức chế enzyme -glucosidase: Hoạt tính ức chế enzyme gây

bệnh tiểu đường -glucosidase được thử nghiệm bằng hai phương pháp:

Phương pháp (1) của Yamaki and Mori (2006)

Sử dụng khay vi thể 96 giếng, thí nghiệm được lặp lại 3 lần, có đối chứng, mỗi giếng gồm: 20 µL mẫu thí nghiệm (giếng đối chứng thay bằng 20 µL đệm potasium phosphate 0,5 M, pH 6,7), 50 µL enzyme α-glucosidase nồng độ 25 mg/mL, 50 µL cơ chất pNPG (p-nitrophenyl -D- glucopyranoside) 3 mM và 120 µL đệm potasium phosphate 0,5 M, pH 6,7. Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 45 phút, sau đó thêm 50 µL Na2CO3 0,67 M vào mỗi giếng để dừng phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 415 nm trên máy Elisa reader (Biotek, ELx800, Mỹ). Một đơn vị α- glucosidase được định nghĩa như là lượng enzyme giải phóng 1 µmol của

pNPG ở điều kiện thí nghiệm. Mức độ ức chế α-glucosidase được tính theo công thức:

A415 ĐC – A415 TN % Ức chế = x 100

A415 ĐC

Trong đó: A415ĐC và A415TN là giá trị OD mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm đo tại bước sóng 415 nm.

Phương pháp (2) của Kim et al. (2004) và Haimin et al. (2004) và được

điều chỉnh bởi Hakamata et al. (2009)

Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase được thực

hiện trên đĩa 96 giếng với tổng thể tích phản ứng là 200 µL/giếng.

Mẫu thử được pha loãng bằng DMSO (dimethyl sulfoxide) 100% hoặc nước cất vô trùng đến nồng độ cuối cùng trong phản ứng là 256; 64; 16; 4; 1; 0,25 g/mL. Acarbose được sử dụng làm chất tham khảo.

Các thành phần phản ứng bao gồm: 40 µL đệm phosphate 100 mM pH 6,8, 25 µL -glucosidase 0,4 U/mL, 10 µL mẫu thử, 25 µL p-nitrophenyl -D- glucopyranoside 2,5 mM.

Ở mẫu đối chứng âm, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng. Thí nghiệm được ủ ở nhiệt độ 37oC. Sau 30 phút, phản ứng được dừng bằng 100 µL Na2CO3. Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên máy Tecan GENios với bước sóng 405 nm (A).

Khả năng ức chế enzyme -glucosidase của mẫu thử được xác định bằng

công thức:

Độ ức chế (%) = [A(đối chứng âm) – A(mẫu thử)] / A(đối chứng âm) x 100%

IC50 được tính bằng phần mềm Tablecurve 2D phiên bản số 4, Systat

Software Inc (Mỹ).

Khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE)

Hoạt tính ức chế AChE gây bệnh Alzheimer được thử nghiệm bằng phương pháp thử của Ellman et al. (1961), được điều chỉnh bởi Yueqing et al. (2013) và Karthikeyan et al. (2015).

Chuẩn bị chất thử

Chất thử được cân với khối lượng chính xác và pha nồng độ ban đầu 20 mg/mL trong DMSO 100%. Sau đó được pha loãng thành một dãy 5 nồng độ

mỗi nồng độ pha loãng 4 lần trong DMSO 100%. Bước tiếp theo pha loãng chất trong đệm PBS 0,1M pH 8 sao cho nồng độ mẫu thử sẽ đạt 128; 25; 5; 1; 0,2 g/mL. Chất tham khảo Doneperil pha trong đệm sao cho nồng độ thử đạt 2; 0,4; 0,08; 0,016; 0,0032 g/mL. Thực hiện phép thử

Giếng phản ứng bao gồm: 10 µL chất thử được pha ở các nồng độ; 15 µL đệm PBS; 25 µL ở các giếng điều khiển dương (enzyme hoạt động 100%) và 50 µL ở giếng blank (không có enzyme); 25 µL enzyme AChE (Electriceel) được cung cấp bởi hãng Sigma pha trong đệm PBS với nồng độ 0,22 U/mL; 25 µL acetylthiocholine chloride 15mM; 125 µL thuốc thử Ellman’s DTNB 3mM.

Để phản ứng 30 phút ở điều kiện 37oC. Đọc độ hấp thụ của phản ứng ở bước sóng 410 nm sử dụng máy Microplate reader Biotek, Mỹ.

Xác định giá trị IC50:

Phần trăm ức chế hoạt tính enzyme được tính bằng công thức:

(%) = (ODgiếng thử - ODgiếng blank )/(ODgiếng điều khiển dương - ODgiếng blank) x 100.

Giá trị IC50 được tính theo giá trị % hoạt độ enzyme tương quan với các

nồng độ khác nhau của chất thử.

d Thử nghiệm in-vivo

Chuột nhắt trắng (Mus musculus L.) đủ chuẩn (Hình 2.6), không phân biệt giống, bình thường được mua ở Trường Đại học Dược Hà Nội và được nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nước uống tự do (cho uống bằng kim cong đầu tù). Các cá thể chuột được cho uống bột nano tỏi đen/tỏi đen với nồng độ 250 mg/kg trọng lượng chuột và chuột bình thường uống nước cất làm nhóm đối chứng, theo dõi đường huyết bằng máy đo đường huyết Omron HGM-111 trong 7 ngày.

Chuột nhắt trắng khỏe mạnh đáp ứng đủ các tiêu chuẩn thí nghiệm, trọng lượng 22-28 g. Nồng độ đường huyết của chuột thí nghiệm dao động từ 1299 mg/dL đến 13812 mg/dL. Chuột được gây bệnh tiểu đường bằng cách tiêm alloxan monohydrate (Sigma) 135 mg/kg trọng lượng chuột vào dưới da ở khoang bụng. Sau khi được ổn định 1 tuần, chuột được điều trị bằng cách cho uống thuốc Gliclazide (Gliclazide STADA® 80 mg) ở 10 mg/kg trọng lượng chuột hoặc dịch hệ nano tỏi đen/dịch tỏi đen ở 250 mg/kg trọng lượng chuột. Liều dùng mỗi lần là 250 mg/trọng lượng chuột bột hệ nano tỏi đen/tỏi đen

pha trong 0,15 mL nước cất, cho uống 2 lần/ngày và điều trị trong 3 tuần. Buổi sáng trước khi cho ăn (lúc 8 giờ), chuột được đo đường huyết và xác định trọng lượng; sau đó khoảng 1 tiếng (lúc 9 giờ), chuột được cho ăn uống bình thường.

Hình 2.6 Chuột nhắt trắng sử dụng trong thử nghiệm hoạt tính

Chuột nhắt trắng 25 con được nuôi trong phòng thí nghiệm có nhiệt độ 272oC, độ ẩm tương đối 42-59%. Các con chuột được chia thành 5 con/nhóm gồm:

- Nhóm không uống thuốc (bình thường)

- Nhóm uống thuốc điều trị Gliclazide 80 mg

- Nhóm uống bột nano tỏi đen

- Nhóm uống bột tỏi đen

- Nhóm chuột bệnh (không điều trị)

3.3 Phân tích dữ liệu

Các số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình  độ lệch chuẩn (STD), đồ thị, biểu đồ bề mặt đáp ứng ở mỗi thí nghiệm. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centurion (version 16.1; Statpoint Technologies, Inc., War, Vir, USA). Sự khác biệt được xem là có ý nghĩa thống kê ở P < 0,05.

3.3.1 Xây dựng các mô hình động học

Xây dựng mô hình động học thể hiện sự thay đổi hàm lượng các hoạt

chất sinh học theo quá trình xử lý nhiệt (nhiệt độ và thời gian).

Mô hình động học cho sự thay đổi các hợp chất có hoạt tính sinh học



nkC

dC dt

trong quá trình xử lý nhiệt được diễn tả bằng phương trình động học bậc một:

Trong đó: C là hàm lượng của các chất được khảo sát ở thời gian t, k là hằng số tốc độ phân giải, n là bậc phản ứng và t là thời gian xử lý.

Với phản ứng bậc 1 (n=1) và dưới các điều kiện ảnh hưởng (ví dụ: nhiệt độ), phương trình bậc 1 ở trên có thể chuyển thành phương trình: Ln I = ln (Co) – kt

Với Co là hàm lượng ban đầu của các chất được khảo sát.

3.3.2 Xây dựng các mô hình bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

(Response Surface Methodology)

Các dữ liệu thu được phân tích thống kê bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, trên cơ sở xây dựng mô hình toán học bậc hai phù hợp được đề xuất bằng sử dụng phần mềm STAGRAPHIC Centurion XVI (Mỹ). Để xây dựng tương quan giữa biến phụ thuộc với các biến độc lập, hồi quy đa thức được áp dụng để tạo sự tương thích của các hệ số của mô hình đa thức của mỗi biến trong từng trường hợp. Chất lượng về độ tương thích của mô hình được đánh giá bằng cách kiểm định mức độ ý nghĩa và phân tích phương sai (ANOVA) với kiểm định LSD ở mức ý nghĩa 5%. Mô hình toán học bậc hai được mô tả trong phương trình 6.





b o

Xb i

Xb ii

2 i

XXb i ij

(6)



1 



Trong đó: Y là biến phụ thuộc, bo là hệ số chặn, bi (I = 1, 2,…, k) là hệ số phương trình bậc 1, bij là hệ số tương tác, bii là hệ số phương trình bậc 2 của biến Xi và e là sai số ngẫu nhiên.

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Sự thay đổi đặc tính lý học và hợp chất có hoạt tính sinh học của

củ tỏi (Allium sativum L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ

4.1.1 Chất lượng củ tỏi ở các độ tuổi thu hoạch

4.1.1.1 Tính chất vật lý

a. Cường độ hô hấp

) ờ i ) g ờ . i g g k . g / 2 k O / 2 C O C g m g m ( p ( ấ p h ấ h ô ô h h ộ ộ đ đ g c n ố ờ T ư C

120

125

135

140

130 Thời gian thu hoạch (ngày sau khi gieo)

Trái cây và rau củ vẫn còn là mô sống cho đến khi chúng được chế biến, vì vậy quá trình hô hấp vẫn diễn ra (Nguyễn Minh Thủy và ctv., 2013). Cường độ hô hấp của củ tỏi chưa thuần thục cao (55-58 mg CO2/kg.giờ) ở giai đoạn thu hoạch 120 đến 125 ngày (Hình 4.1) và bắt đầu chậm lại ở ngày thu hoạch 130 (49 mg CO2/kg.giờ), có thể do củ tỏi đạt đến trạng thái ngủ tự nhiên ở giai đoạn chín sinh lý. Tuy nhiên, cường độ hô hấp của củ tỏi vẫn là rất thấp so với các loại rau củ khác (Brennan and Grandison, 2012). Nuevo and Bautista (2001) khuyến cáo củ tỏi không nên thu hoạch sớm hơn 105 ngày trong điều kiện trời không có mưa. Củ tỏi tươi ở các giai đoạn thu hoạch được thể hiện ở Hình 4.2.

Hình 4.1 Cường độ hô hấp của củ tỏi ở các giai đoạn thuần thục

120 ngày 125 ngày 135 ngày 140 ngày

130 ngày Hình 4.2 Củ tỏi ở các độ tuổi thu hoạch khác nhau

b. Đường kính và khối lượng củ

Khối lượng củ tỏi không có sự khác biệt ý nghĩa giữa ngày thu hoạch 120–140 (Hình 4.3). Bên cạnh đó, đường kính củ và số tép/củ cũng không khác biệt ở các ngày thu hoạch 120 đến 140. Tuy nhiên, đường kính củ tỏi Phan Rang (3,80,1 cm) lớn hơn so với tỏi Lý Sơn (3,10,4 cm) (Hồ Huy Cường, 2013).

)

m m

) g ( ủ c g n ợ ư

l i ố h K

( ủ c h n í k g n ờ ư Đ

120

125

130

135

140

Thời gian thu hoạch (ngày sau khi gieo)

Đường kính củ (mm)

Khối lượng củ (g)

Hình 4.3 Đường kính và khối lượng củ tỏi theo thời gian tăng trưởng

c. Cấu trúc và số lượng tép/củ tỏi

Củ tỏi Phan Rang có nhiều lớp vỏ lụa màu trắng bao bọc bên ngoài. Số lượng tép/củ tỏi Phan Rang và Lý Sơn là tương đương nhau (cụ thể là 23,5±1,1 và 21,5±4,7 (Hồ Huy Cường, 2013)) và xếp tương đối chặt chẽ. Trong khi củ tỏi voi (elephant garlic) (A. ampeloprasum) có kích thước lớn với ít tép tỏi hơn khoảng 4-8 tép (Block, 2010). Cấu trúc tép tỏi Phan Rang cứng chắc và độ cứng tăng theo từng giai đoạn thu hoạch (từ 25019 g lực ở ngày thu hoạch 125 lên 348±24 g lực ở ngày 140), điều này có thể liên quan đến quá trình trương cấu trúc ở thời kỳ thuần thục của củ tỏi.

d. Hao hụt khối lượng (%) của củ tỏi ở các giai đoạn thuần thục

Sau 10 ngày tồn trữ, hao hụt khối lượng ở các giai đoạn thuần thục đều ở mức thấp (Hình 4.4). Hao hụt khối lượng trên củ tỏi chủ yếu do sự bay hơi nước. Hàm lượng nước bắt đầu mất ở lớp vỏ bên ngoài. Từ sau 10 ngày tồn trữ, sự hao hụt khối lượng thể hiện rõ ở củ tỏi thu hoạch ở giai đoạn 120 - 125 và giai đoạn 130 đến 140 ngày. Kết thúc quá trình tồn trữ 30 ngày, củ tỏi thu hoạch ở giai đoạn 130-140 ngày thể hiện hao hụt khối lượng thấp nhất. Bên cạnh đó, Rajesh Kumar and Yu (2010) đã báo cáo rằng giống tỏi Great Leaf

Black được thu hoạch lúc chưa thuần thục thể hiện sự hao hụt khối lượng vượt mức.

)

%

( g n ợ ư

l i ố h k

t ụ h

o a H

10 20 Thời gian tồn trữ (ngày)

120 (ngày)

125 (ngày)

130 (ngày)

135 (ngày)

140 (ngày)

Hình 4.4 Hao hụt khối lượng (%) của củ tỏi ở các giai đoạn thu hoạch theo

thời gian tồn trữ

4.1.1.2 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi được trình bày ở Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu cho thấy pH của củ tỏi Phan Rang thu hoạch ở các giai đoạn 120–140 ngày có giá trị pH trong khoảng 6,30 đến 6,53. Kết quả thu được gần giống với nhiều nghiên cứu khác, tỏi tươi có giá trị pH trong khoảng 6,33-6,42 (Choi et al., 2014; Bae et al., 2014; Fante and Noreña, 2015).

Khi thu hoạch ở thời gian 120 và 125 ngày, tổng hàm lượng chất khô hòa tan trong tỏi ở mức thấp và đạt cao nhất ở ngày 130 (39,0%) và 135 (37,4%). Theo Nuevo and Bautista (2001), hàm lượng chất khô hòa tan và mùi hăng cay trong củ tỏi chưa thuần thục đều thấp. Tuy nhiên, tổng chất khô hòa tan (oBrix) của củ tỏi Phan Rang trong giai đoạn thu hoạch ở giai đoạn120–140 ngày vẫn cao hơn so với một số nghiên cứu khác. Hàm lượng chất khô hòa tan trong tỏi tươi trong khoảng 29-37 °Brix (Vázquez-Barrios et al., 2006; Põldma et al., 2011; Fante and Noreña, 2015).

Độ ẩm trong củ tỏi có sự khác biệt ý nghĩa giữa ngày thu hoạch 120–125 và 130–140. Độ ẩm chỉ đạt đến 63,7% ở ngày 125 và tăng lên 65,94% ở thời điểm 130 ngày có thể do quá trình trương cấu trúc tế bào, sau đó có khuynh hướng giảm nhẹ đến ngày 140. Bên cạnh đó, hàm lượng ẩm trong tỏi tươi đã được công bố vào khoảng 64 đến 66% (Bae et al., 2014; Fante and Noreña, 2015).

Bảng 4.1 Thành phần hóa học và đặc tính chống oxy hóa của củ tỏi ở các thời điểm thu hoạch

Thời gian thu hoạch (ngày)

Chỉ tiêu

120

125

130

135

140

6,53b±0,10* 6,40ab±0,10 6,40ab±0,10 6,30a±0,20 6,43ab±0,10

oBrix

35,7ab±0,6

36,7ab±0,6

39,0c±1,0

37,4bc±1,5

35,1a±1,8

Độ ẩm (%)

62,8c±0,1

63,7c±0,1

65,9ab±1,1

67,1a±1,2

64,4bc±1,9

2,66a±0,43

2,32a±0,77

2,43a±0,67 2,70a±0,70 2,54a±0,68

TPC (mg GAE/g d.w)

7,90a±0,17

7,67a±0,25

7,96a±0,16 7,72a±0,56 7,60a±0,25

Hàm lượng thiosulfinate (mol/g d.w)

7,71a±0,32

8,70a±0,71

7,83a±0,74 8,11a±0,80 8,32a±0,53

Hoạt tính chống oxy hóa (%)

Ghi chú: *Độ lệch chuẩn của giá trị trung bình; Các chữ cái đi kèm với các trung bình nghiệm thức khác nhau trong cùng một hàng biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa (độ tin cậy 95%).

Nhìn chung, hàm lượng polyphenol tổng số (2,32-2,7 mg GAE/g d.w), thiosulfinate (7,6-7,96 mol/g d.w) trong củ tỏi Phan Rang không có sự khác biệt ý nghĩa giữa các ngày thu hoạch từ 120–140. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng các chất này trong tỏi Phan Rang ở mức độ trung bình so với nhiều giống tỏi trong các nghiên cứu trước đây. Chẳng hạn, hàm lượng polyphenol tổng số trong tỏi tươi là 511-722 mg GAE/100 g trọng lượng tươi (Põldma et al., 2011).

Hoạt tính chống oxy hóa của tỏi Phan Rang dao động trong khoảng 7,7- 8,7%. Trong nghiên cứu của Somman and Napa (2015), hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH của củ tỏi là khá cao, đạt 25,53%. Tuy nhiên, hoạt tính chống oxy hóa của tỏi tươi ở Hàn Quốc được công bố với giá trị thấp hơn như 6,21% (Bae et al., 2014) và 4,65% (Choi et al., 2014). Như vậy, thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi phụ thuộc rất lớn vào giống, điều kiện trồng trọt và khí hậu (Põldma et al., 2011).

4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tồn trữ đến sự thay đổi thành phần hóa

lý của củ tỏi

4.1.2.1 Tính chất vật lý

a. Hao hụt khối lượng

)

0°C

5°C

20°C

Nhiệt độ phòng

( g n ợ ư l i ố h k t ụ h o a H

15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180

Thời gian tồn trữ (ngày)

Hao hụt khối lượng của củ tỏi tăng trong suốt quá trình tồn trữ ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau (Hình 4.5). Hao hụt khối lượng thấp nhất khi tồn trữ củ tỏi ở 0oC (6,7%). Tỏi không nhạy cảm với lạnh đông và nhiệt độ 0oC vẫn trên điểm đóng băng của tỏi (Cantwell et al., 2003). Nhiệt độ tồn trữ cao hơn sẽ làm tốc độ bay hơi nước nhanh. Đặc biệt, ở nhiệt độ tồn trữ 5oC, hao hụt khối lượng tăng cao đột ngột sau 120 ngày tồn trữ và hao hụt nhiều hơn so với củ tỏi tồn trữ ở 20oC và nhiệt độ phòng. Mặc dù RH trong các điều kiện tồn trữ thấp nhưng do cấu tạo phần thịt củ tỏi được bao bọc bởi nhiều lớp vỏ lụa và do đó hạn chế tối đa quá trình mất nước. Iglesias-Enriquez and Fraga (1998) đã công bố quá trình sinh lý của củ tỏi tương tác với môi trường và ảnh hưởng đến việc vận chuyển hơi nước, sự phát triển mầm và rễ làm thay đổi hình dạng của củ tỏi, gây ra sức căng và phá vỡ mô bề mặt, tạo điều kiện mất nước.

Hình 4.5 Hao hụt khối lượng (%) của củ tỏi ở các nhiệt độ tồn trữ

b. Màu sắc

Liên quan đến sự thay đổi màu sắc, củ tỏi tồn trữ ở 0 và 20oC không thể hiện sự thay đổi đáng kể về giá trị L và b trong suốt quá trình tồn trữ. Riêng củ tỏi tồn trữ ở 5oC và nhiệt độ khí quyển (28–30oC), màu sắc vỏ củ không có sự khác biệt đến ngày 90 của quá trình tồn trữ. Sau thời gian này, màu vỏ bắt đầu

chuyển nhẹ sang màu vàng cho đến khi kết thúc quá trình tồn trữ, cụ thể giá trị b của tỏi ở 5oC tăng từ 23,1 lên 25,7 và ở nhiệt độ khí quyển (28–30oC) tăng từ 23,7 lên 26,1. Theo Vázquez-Barrios et al. (2006) vẫn chưa có báo cáo về sự thay đổi màu sắc trong quá trình tồn trữ củ tỏi ở các nhiệt độ khác nhau.

c. Độ cứng chủ quan (subjective firmness)

Sự hóa mềm tép tỏi trong suốt quá trình tồn trữ bị gây ra chủ yếu bởi sự mất ẩm quá nhiều. Nhiệt độ và thời gian tồn trữ ảnh hưởng đến việc đánh giá độ cứng (chủ quan). Điểm đánh giá độ cứng củ tỏi giảm trong suốt quá trình bảo quản và ảnh hưởng nhiều bởi nhiệt độ (Bảng 4.2). Củ tỏi bảo quản ở 0oC vẫn duy trì độ cứng ban đầu (thể hiện bằng điểm đánh giá 4,6±0,3) sau 180 ngày. Trong khi đó, điểm đánh giá độ cứng chủ quan của tỏi ở 5oC bị giảm đáng kể (2,1±0,2) với cùng thời gian tồn trữ.

Bảng 4.2 Độ cứng chủ quan của củ tỏi ở các nhiệt độ khác nhau theo thời gian tồn trữ

Nhiệt độ tồn trữ (oC)

Nhiệt độ phòng Thời gian tồn trữ (ngày) 0 5 20 (28-30)

0 4,80,2* 4,80,2 4,80,2 4,80,2

30 4,80,1 4,50,3 4,80,1 4,70,1

60 4,70,2 4,50,3 4,50,2 4,70,2

90 4,50,2 4,10,5 4,30,3 4,30,5

120 4,50,3 3,30,4 3,50,5 3,70,3

150 4,60,2 3,10,3 3,50,4 3,80,4

Ghi chú: *Độ lệch chuẩn của giá trị trung bình

180 4,60,3 2,10,2 3,70,3 3,50,5

d. Chỉ số nảy mầm bên trong

Củ tỏi sẽ nảy mầm sau khi trạng thái ngủ kết thúc. Hiện tượng nảy mầm bên trong không được tìm thấy ở các nhiệt độ tồn trữ ở 0 và 20oC và nhiệt độ phòng. Điều này có thể do củ tỏi được hong khô tốt và độ ẩm tương đối của không khí (RH) trong quá trình tồn trữ thấp. Tuy nhiên, củ tỏi bảo quản ở 5oC

đến ngày 90 vẫn chưa xuất hiện mầm và đến ngày 105, mầm xuất hiện với chỉ số nảy mầm là 7,1±0,5% và tăng liên tục cho đến khi kết thúc quá trình tồn trữ 125,6±2,8% (dữ liệu không đưa ra ở đây). Mầm xuất hiện nhanh ở nhiệt độ bảo quản trung gian như 5-18oC (Hardenburg et al., 1986); 10-20oC (Miedema, 1994) hoặc 4,5-10oC (De La and Garcia, 2007). Bên cạnh đó, tỏi tồn trữ ở nhiệt độ cao hơn 20oC có thể làm khô tép tỏi, và trong điều kiện độ ẩm cao có thể dẫn đến sự phát triển của nấm mốc và thối hỏng (Brewster and Rabinowitch, 1990). Ngoài nhiệt độ, độ ẩm tương đối của không khí (RH %) và thời gian tồn trữ, sự nảy mầm của củ tỏi còn bị ảnh hưởng bởi giống, điều kiện nghiên cứu và trạng thái ngủ.

4.1.2.2 Thành phần hóa học

a. Hàm lượng chất khô hòa tan

x i r

B ộ Đ

0°C

5°C

20°C

Nhiệt độ phòng

15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180

Thời gian tồn trữ (ngày)

Khi tồn trữ củ tỏi ở các nhiệt độ khác nhau (0, 20 và nhiệt độ phòng 28– 30oC) cho thấy có sự ổn định về hàm lượng chất khô hòa tan sau 120 ngày tồn trữ (Hình 4.6). Tuy nhiên sau 180 ngày tồn trữ, củ tỏi bảo quản ở 5oC thể hiện sự suy giảm đáng kể hàm lượng chất khô hòa tan (từ 38,6 xuống còn 32,1oBrix). Điều này có thể liên quan đến sự nảy mầm nhưng không có mối liên hệ rõ ràng đến chỉ số nảy mầm bên trong hoặc tổn thất khối lượng. Rutherford and Whittle (1982) chỉ ra rằng hàm lượng đường tổng của hành tây không thay đổi trước khi nảy mầm, nhưng sau đó suy giảm (7-12%).

Hình 4.6 Độ Brix của củ tỏi theo thời gian tồn trữ ở các điều kiện nhiệt độ

khác nhau

b. Hàm lượng polyphenol tổng số

Hàm lượng lượng polyphenol tổng số biến đổi phức tạp ở các nhiệt độ tồn trữ và có khuynh hướng giảm (Hình 4.7). Hàm lượng polyphenol tổng số ít

0°C

5°C

20°C

Nhiệt độ phòng

Nảy mầm

)

w d

C P T

g / E A G g m

(

15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180

Thời gian tồn trữ (ngày)

bị biến đổi hơn ở nhiệt độ tồn trữ 0oC so với các nhiệt độ tồn trữ còn lại. Đặc biệt, khi tồn trữ củ tỏi ở 5oC, hàm lượng polyphenol tổng số tăng nhanh ở ngày 120. Điều này có thể do hoạt động sinh lý nảy mầm trong củ tỏi đang diễn ra làm tăng hàm lượng polyphenol (Zakarova et al., 2014). Tuy nhiên, sau ngày 120 của quá trình tồn trữ, hàm lượng này lại giảm nhanh.

Hình 4.7 Thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số trong củ tỏi tồn trữ ở các

điều kiện nhiệt độ

c. Hoạt tính chống oxy hóa

Bên cạnh sự giảm hàm lượng polyphenol tổng số, hoạt tính chống oxy hóa của củ tỏi vẫn ổn định trong suốt quá trình tồn trữ. Kết quả phân tích cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của củ tỏi tồn trữ ở các nhiệt độ 0, 5, 20 và 28- 30oC biểu thị các giá trị tương ứng là 7,34-8,45%, 7,37-7,55%, 7,12-7,67% và 6,64-7,85%. Ngoài polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa, các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong củ tỏi cũng có chức năng tương tự (Gorinstein et al., 2006).

d. Hàm lượng thiosulfinate

Nhìn chung, hàm lượng thiosulfinate của củ tỏi ít biến đổi trong quá trình tồn trữ ở các nhiệt độ khác nhau (Hình 4.8). Tuy nhiên, khi kết thúc quá trình tồn trữ trong khoảng 180 ngày, hàm lượng thiosulfinate đều tăng nhẹ ở mỗi nhiệt độ tồn trữ. Điều này có thể do tiền chất góp phần tạo nên thiosulfinate là alliin tăng trong thời gian tồn trữ ở các nhiệt độ khác nhau (Ichikawa et al., 2006).

)

e t a n i f l u s o i h t g n ợ ư l

w . d g / l o m o r c i m

(

0°C

5°C

20°C

Nhiệt độ phòng

m à H

15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180

Thời gian tồn trữ (ngày)

Hình 4.8 Thay đổi hàm lượng thiosulfinate của tỏi tươi theo thời gian tồn trữ ở

các nhiệt độ

4.1.3 Ảnh hưởng của loại bao bì đến sự hao hụt khối lượng của củ tỏi

trong quá trình tồn trữ

)

(

Đối chứng Thùng carton

PE Vải lưới

g n ợ ư l i ố h k t ụ h o a H

90 105 120 135 150 165 180

60 Thời gian tồn trữ (ngày)

Hao hụt khối lượng tăng theo thời gian tồn trữ ở cả 3 loại bao bì (Hình 4.9). Ngoài ra, loại bao bì không có ảnh hưởng đáng kể đến sự hao hụt khối lượng. Bao bì vải lưới ghi nhận hao hụt khối lượng cao nhất (6,02%), trong khi bao bì carton ghi nhận sự mất ẩm thấp nhất (5,46%). Mặc khác, bao bì vải lưới thể hiện tính tiện dụng, rẻ tiền và thông thoáng khí tốt so với hai loại bao bì còn lại. De La and Garcia (2007) cũng báo cáo khả năng bảo quản tỏi trong bao bì plastic hoặc hộp kín có ảnh hưởng xấu đến củ tỏi do thúc đẩy sự thối hỏng.

Hình 4.9 Hao hụt khối lượng của củ tỏi tồn trữ trong các loại bao bì khác nhau

ở nhiệt độ 0oC

Nhìn chung, củ tỏi thu hoạch ở độ tuổi 130-135 ngày sau khi gieo có chất lượng cao nhất và tốc độ hô hấp thấp. Nhiệt độ ở 0oC cung cấp điều kiện tồn trữ tốt nhất đảm bảo chất lượng của củ tỏi lên đến 180 ngày tồn trữ, với chỉ số nảy mầm và phần trăm hao hụt khối lượng rất thấp, cũng như độ cứng tốt và màu sắc đẹp. Bao bì vải lưới sử dụng tồn trữ củ tỏi tốt và ít chiếm thể tích hơn so với thùng carton và PE trong quá trình tồn trữ, vận chuyển.

4.2 Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua

quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic

4.2.1 Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua

quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen

4.2.1.1 Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý nhiệt đến quy trình

sản xuất sản phẩm tỏi đen.

a Ảnh hưởng của phương pháp chần đến chất lượng sản phẩm tỏi tươi

Hoạt động chần giúp lưu giữ giá trị dinh dưỡng sản phẩm thực vật, bất hoạt các phản ứng phân hủy các hợp chất phenol (Abu-Ghannam and Jaiswal, 2015). Hàm lượng các hợp chất sinh học và khả năng loại bỏ gốc tự do của tỏi chần ở các mức thời gian khác nhau được thể hiện ở Hình 4.10. Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng loại bỏ gốc tự do tăng cao nhất ở thời gian chần 6 phút (gấp 1,15; 1,08 và 1,15 lần tương ứng so với mẫu đối chứng). Ở thời gian chần 4 và 6 phút, hàm lượng polyphenol tổng đo được từ mẫu cao hơn đáng kể so với thời gian chần 8 và 10 phút (P<0,05). Hàm lượng flavonoid có sự khác biệt có ý nghĩa (P<0,05) ở thời gian chần 6 phút so các mức thời gian chần còn lại. Kết quả cũng được ghi nhận tương tự đối với khả năng loại bỏ gốc tự do của tỏi. Với thời gian chần từ 4 đến 10 phút, so với mẫu đối chứng (54%), khả năng loại bỏ gốc tự do đều tăng ở mức ý nghĩa thống kê (P<0,05) và đạt cao nhất ở thời gian chần 6 phút (62,3%).

Kết quả đạt được từ nghiên cứu phù hợp với kết quả nghiên cứu của Priecina et al. (2013). Nhóm tác giả cho rằng tiền xử lý bằng biện pháp chần làm gia tăng hàm lượng các hợp chất sinh học trong nguyên liệu. Với phương pháp xử lý chần bông cải xanh trong 10 phút, hàm lượng polyphenol tăng lên 1,63 mg GAE/g (so với 1,36 mg GAE/g trong mẫu đối chứng) (Roy et al., 2009). Wolfe and Liu (2003) đã báo cáo khi chần táo trong nước sôi khoảng 10-20 giây tăng hàm lượng polyphenol và flavonoid so với mẫu tươi. Tương tự, Nayak et al. (2011) nghiên cứu chần một số loại rau, củ bằng hơi nước trong 8 phút tăng khả năng chống oxy hóa lên nhiều lần.

Hình 4.10 Ảnh hưởng của thời gian chần đến hàm lượng polyphenol tổng số (TPC), flavonoid tổng số (TFC) và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi

Nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy sự tăng các hoạt tính chống oxy hóa trong chế biến nhiệt có thể từ nguyên nhân do sự phá vỡ thành tế bào của nguyên liệu và giải phóng các hợp phần chống oxy hóa từ các thành phần không hòa tan hiện diện trong các nguyên liệu như tỏi (Kwon et al., 2006), vỏ các loại quả họ citrus (Jeong et al., 2004) và cà chua (Dewanto et al., 2002). Đồng thời xử lý ở nhiệt độ cao cũng có khả năng vô hoạt các enzyme oxy hóa hợp chất phenol, do đó cũng hạn chế (hoặc giảm) tổn thất hợp chất phenol (Dewanto et al., 2002). Ngoài ra, khả năng chống oxy hóa bằng thử nghiệm loại bỏ gốc tự do DPPH ở trái cà tím cho thấy tăng lên có ý nghĩa (p<0,05) khi trái được gia nhiệt bằng cách chần trong nước, chần bằng hơi hoặc microwave trong thời gian 5, 10, 15 phút so với trái không chần (Chumyama et al., 2013). Dewanto et al. (2002), Turkmen et al. (2005) và Francisco and Resurreccion (2009) đều báo cáo rằng các phương pháp xử lý nhiệt cải thiện khả năng chống oxy hóa trong tiêu, đậu que, bông cải xanh, rau bina, bắp và đậu phộng (Arachis hypogaea). Nhiều hợp chất chống oxy hóa trong thực vật hiện nay chủ yếu là các dạng liên kết đồng hóa trị với nhiều polymer không tan (Choi et al., 2006) và có thể nhiệt phá vỡ thành tế bào, giải phóng các hợp chất chống oxy hóa, dẫn đến làm tăng khả năng chống oxy hóa (Choi et al., 2006; Chumyama et al., 2013). Ngược lại, theo Kinalski and Norena (2014), trong suốt quá trình chần hoạt động chống oxy hóa tổn thất đáng kể theo thời gian (p<0,05) được nhận thấy, khi tép tỏi được chần trong nước ở 80 đến 90oC và trong hơi nước.

)

w d

e t a n i f l u s o i h t g n ợ ư l

g / l o m o r c i m

(

m à H

10 Thời gian chần (phút)

Hàm lượng thiosulfinate giảm nhanh trong suốt quá trình chần (Hình 4.11). Trong 4 phút đầu tiên, hàm lượng thiosulfinate giảm nhanh và liên tục giảm đến phút 10. Kết quả của việc phá vỡ củ tỏi là sự hình thành các thiosulfinate như allicin, do tác động của enzyme allinase. Tuy nhiên, allicin không ổn định và nhanh chóng chuyển thành hợp chất khác (Lawson and Hughes, 1992). Các thiosulfinate khác hiện diện trong tỏi là allyl methyl- methyl allyl- và trans-1 propenyl-thiosulfinate và đều không ổn định (Lawson et al., 1991).

Hình 4.11 Hàm lượng thiosulfinate của củ tỏi chần ở các mức thời gian khác

nhau

b Ảnh hưởng của phương pháp lạnh đông đến chất lượng tỏi tươi

Lạnh đông là một phương pháp phổ biến nhằm phá vỡ tế bào. Sự phá vỡ màng tế bào được suy luận là nguyên nhân chính của tổn thương lạnh (Lyons et al., 1979). Do đó, lạnh đông có thể được sử dụng để phá hủy màng tế bào tỏi trước khi tiến hành quá trình chế biến tỏi đen. Thời gian lạnh đông cũng được xem là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến các hợp chất sinh học trong nguyên liệu. Dữ liệu thể hiện ở Hình 4.12 cho thấy ảnh hưởng của phương pháp lạnh đông đến hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng loại bỏ gốc tự do của tỏi. Khi thực hiện quá trình lạnh đông tỏi trong 36 giờ, các hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng loại bỏ gốc tự do tăng cao nhất (gấp 1,28; 1,20 và 1,19 lần tương ứng so với mẫu đối chứng). Thời gian lạnh đông 36 và 48 giờ cho hàm lượng polyphenol cao hơn đáng kể so với thời gian đông lạnh ở 12 và 24 giờ (P<0,05). Hàm lượng flavonoid trong tỏi thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa (P<0,05) trong thời gian lạnh đông 36 giờ. Với các thời gian đông lạnh còn lại, hàm lượng flavonoid tăng không đáng kể.

Hình 4.12 Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh đến hàm lượng polyphenol tổng

số (TPC), flavonoid tổng số (TFC) và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi

Ngoài ra, quá trình lạnh đông trong thí nghiệm này ít ảnh hưởng đến hàm lượng thiosulfinate (dao động khoảng 7,89-11,9 mol/g d.w). Khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu tỏi đối chứng 53,99% sau 12, 24, 36 và 48 giờ lần lượt là 58,6; 61,2; 64,2 và 64,0%, tương ứng. Kết quả nghiên cứu phù hợp với kết luận của Tomsone and Kruma (2014) và cho rằng các hợp chất sinh học trong nguyên liệu thực vật sau khi đông lạnh gia tăng có ý nghĩa. Kết quả tương tự có sự gia tăng hàm lượng polyphenol ở nhiệt độ -18oC trong trái cam và táo cũng đã được báo cáo trong nghiên cứu của Polinati et al. (2010). Theo Leong and Oey (2012), những hợp chất sinh học tồn tại dưới dạng liên kết trong tế bào thực vật có thể được giải phóng trong quá trình xử lý chần hoặc đông lạnh, do đó có sự gia tăng những hợp chất sinh học sau quá trình chế biến so với sản phẩm tươi.

c Ảnh hưởng của phương pháp chần/lạnh đông đến giá trị cảm quan của

tỏi tươi

Củ tỏi tươi có cấu trúc giòn và mùi vị hăng cay mạnh (Hình 4.13). Củ tỏi sau khi lạnh đông ở -18oC ở các mức thời gian vẫn còn khá giòn và săn chắc. Củ tỏi sau khi tan giá vẫn còn mùi vị hăng cay và không biến đổi về màu sắc. Ngược lại, củ tỏi trải qua quá trình chần bị mềm và rất ít mùi hăng cay. Màu sắc các tép tỏi trở nên trắng hơn và bị đục. Ngoài ra, quan sát bằng mắt thường cho thấy khi củ tỏi lạnh đông ở -18oC sau 36 giờ vẫn chưa có hiện tượng rỉ dịch. Ngược lại cùng nhiệt độ trên, củ tỏi lạnh đông ở 48 giờ bị rỉ dịch sau khi tan giá. Điều này chứng tỏ các chất nội bào chảy ra khỏi tế bào của củ tỏi do

Lạnh đông 24 giờ

Lạnh đông 36 giờ

Lạnh đông 48 giờ

Chần 6 phút

Cấu trúc

Mùi

Màu 5 4 3 2 1 0

Chần 8 phút

Chần 10 phút

Vị

tiền xử lý lạnh đông. Do đó, từ các dữ liệu và phân tích (đề cập ở trên) cho thấy tiền xử lý bằng phương pháp chần là không thích hợp cho quá trình chế biến tỏi đen sau này.

Hình 4.13 Giá trị cảm quan của củ tỏi sau khi chần và lạnh đông

d Ảnh hưởng của quá trình lạnh đông tỏi tươi đến màu sắc và hàm lượng

polyphenol của sản phẩm tỏi đen

Tỏi tươi thay đổi màu sắc từ màu trắng sang màu nâu và cuối cùng trở

Đối chứng

Lạnh đông

ị r t á i G

Thời gian lão hóa (ngày)

thành màu đen trong quá trình lão hóa (Hình 4.14).

Hình 4.14 Ảnh hưởng của tiền xử lý lạnh đông đến giá trị L trong suốt quá

trình chế biến tỏi đen

Trong quá trình chế biến, củ tỏi đã xử lý lạnh đông có sự chuyển hóa thành màu nhanh hơn so với củ tỏi không xử lý. Đối với tỏi lạnh đông, màu củ

tỏi sậm nhanh sau 15 ngày đầu tiên lão hóa và thay đổi thành màu đen ở ngày 30. Tỏi đối chứng chuyển thành màu đen trễ hơn 10 ngày. Kết quả cho thấy, để đạt đến mức độ đen giống nhau, việc chế biến tỏi đen từ tỏi đã qua xử lý lạnh đông giúp giảm thời gian hơn nhiều so với tỏi đối chứng.

Đối chứng

Lạnh đông

)

w ) . g d / E g / A E G A G g m g ( m

(

ố ố s s g g n n ổ ổ t t l l o o n n e e h h p p y y l l o o p p g g n n ợ ợ ư ư l l m m à à H H

15 Thời gian lão hóa (ngày)

Hàm lượng polyphenol trong tỏi đen tăng nhiều so với tỏi tươi (Hình 4.15). Hợp chất phenol cho thấy khả năng kháng khuẩn, chống khối u, tính chất chống oxy hóa và đóng vai trò quan trọng trong tỏi đen (Park et al., 2009; Nencini et al., 2011). Tỏi đen chế biến từ tỏi đã lạnh đông có hàm lượng polyphenol cao nhất (16,70,55 mg GAE/g) ở ngày 30. Trong khi đó, hàm lượng polyphenol trong tỏi đen chế biến từ tỏi không xử lý lạnh đông cũng có khuynh hướng tăng nhưng chậm hơn tỏi đen làm từ tỏi đã qua xử lý lạnh đông và đạt cao nhất (14,60,81 mg GAE/g) ở ngày 30. Tiền xử lý lạnh đông phá hủy cấu trúc tế bào tỏi và cải thiện phản ứng giữa các chất khác nhau nhằm tạo ra các dạng tự do.

Hình 4.15 Ảnh hưởng của tiền xử lý lạnh đông đến hàm lượng polyphenol

tổng số trong quá trình chế biến tỏi đen

Tỏi được lạnh đông ở -18oC trong 36 giờ có khả năng thúc đẩy làm tăng các hợp chất sinh học trong tỏi. Hơn nữa, lạnh đông giúp phá vỡ tế bào củ tỏi, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lão hóa khi chế biến tỏi đen nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm tỏi đen, rút ngắn thời gian chế biến, tiết kiệm năng lượng điện.

4.2.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lão hóa đến chất lượng sản

phẩm tỏi đen

a Hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số

)

C P T

w . d g / E A G g m

(

90°C

80°C

70°C

60°C

Thời gian lão hóa (ngày)

Trong quá trình lão hóa, hàm lượng polyphenol tăng nhanh đến đỉnh điểm và giảm nhanh sau đó. Thời gian để hàm lượng polyphenol đạt giá trị cao nhất ở 60, 70, 80, 90oC tương ứng là 45, 25, 20 và 15 ngày (Hình 4.16). Như vậy, trong khoảng nhiệt độ từ 60-90oC, sử dụng chế độ nhiệt độ cao có thể rút ngắn thời gian cần thiết để hàm lượng polyphenol đạt cực điểm. Tuy nhiên, hàm lượng polyphenol cực điểm thu được ở các chế độ nhiệt độ xử lý không giống nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy, chế độ lão hóa ở 70oC trong 25 ngày cho hàm lượng polyphenol cao nhất (17 mg GAE/g d.w). Kim et al. (2013) cũng đã báo cáo rằng tỏi rất giàu hợp chất phenolic và các hợp chất này trong tỏi đen tăng nhiều lần so với tỏi tươi.

)

w d

ố s g n ổ t d i o n o v a l f

g / E Q g m

(

g n ợ ư l

60ᵒC

70ᵒC

80ᵒC

90ᵒC

m à H

Thời gian (ngày)

Hình 4.16 Hàm lượng polyphenol trong tỏi đen ở các mức nhiệt độ lão hóa

Hình 4.17 Hàm lượng flavonoid trong tỏi đen ở các mức nhiệt độ lão hóa

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự gia tăng hàm lượng flavonoid (Hình 4.17) trong tỏi đen phù hợp với kết quả nghiên cứu đã được công bố (Xu et al., 2007). Các điều kiện chế biến tỏi đen dẫn đến những thay đổi các hợp chất có hoạt tính sinh học như TPC, TFC và sự thay đổi ảnh hưởng bởi điều kiện cùng thời gian xử lý nhiệt.

Các hợp chất sinh học gia tăng do sự thay đổi hóa học xảy ra trong quá trình lão hóa của tỏi tươi. Các hợp chất khác nhau trong tỏi khi tiếp xúc với nhiệt độ cao sẽ chuyển đổi thành các hợp chất polyphenol. Do đó, khi tỏi trải qua quá trình lão hóa, các hợp chất lưu huỳnh từ tỏi tươi sẽ được chuyển đổi thành các hợp chất có lợi khác thông qua các phản ứng hóa học tự nhiên (Kim et al., 2012).

b Hoạt tính chống oxy hóa

)

90°C

80°C

70°C

60°C

( a ó h y x o g n ố h c g n ộ đ t ạ o H

Thời gian lão hóa (ngày)

Tỏi đen thể hiện hoạt động chống oxy hóa mạnh hơn so với tỏi tươi (Hình 4.18). Hoạt động chống oxy hóa cũng có thể được liên kết với sự hiện diện của hợp chất phenolic, bao gồm flavonoid (quercetin, kaempferol và mericitin) (Willett, 1994).

Hình 4.18 Hoạt động chống oxy hóa của tỏi đen ở các mức nhiệt độ lão hóa

Các hoạt động loại bỏ gốc tự do DPPH trong các mẫu tỏi đã lão hóa cho thấy khả năng của một hợp chất chống oxy hóa cho điện tử hoặc hydro. Do đó, chuyển đổi DPPH thành một phân tử ổn định hơn với độ hấp thụ giảm (Brand- Williams et al., 1995; Guerard and Suyama-Martinez, 2003). Các hoạt động loại bỏ gốc tự do DPPH trong các mẫu tỏi đã lão hóa cao hơn đáng kể so với các mẫu tỏi tươi. Hơn nữa, hoạt động loại bỏ gốc tự do tăng khi nhiệt độ tăng nhanh ở 90oC. Hoạt động loại bỏ gốc tự do của tỏi tươi là 6,87%, hoạt động

này tăng lên 56,3% khi lão hóa tỏi tươi ở 90oC ở ngày 20. Trong khi các mẫu tỏi lão hóa ở 60oC chỉ tăng lên 38,6% với cùng thời gian. Các thành phần hoạt động khác cũng có thể đóng góp cho hoạt động chống oxy hóa trong các mẫu tỏi đã lão hóa. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự hiện diện của sản phẩm hóa nâu có liên quan đến việc gia tăng hoạt động chống oxy hóa và các sản phẩm hóa nâu này cũng phát huy khả năng chống oxy hóa bằng cách phá vỡ các chuỗi gốc tự do thông qua sự hỗ trợ của các nguyên tử hydro (Manzocco et al., 2000).

Trong nghiên cứu này, cường độ hóa nâu tăng dần lên trong quá trình sản xuất tỏi đen và chúng thể hiện như một khuynh hướng của hoạt động loại bỏ gốc tự do DPPH trong các mẫu tỏi đã xử lý ở các nhiệt độ khác nhau. Ngoài ra, hàm lượng polyphenol tổng tăng lên nhiều hơn trong tỏi đen so với trong tỏi tươi đã được chứng minh. Nhiệt độ trong quá trình chế biến tỏi đen được cho là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động chống oxy hóa trong các mẫu tỏi đã gia nhiệt.

c Hàm lượng SAC

Sự thay đổi lượng SAC ở các nhiệt độ xử lý khác nhau trong quá trình chế biến tỏi đen thể hiện ở Bảng 4.3. Hàm lượng SAC tăng lên đáng kể trong quá trình xử lý nhiệt, các mẫu tỏi đã qua xử lý nhiệt ở nhiệt độ thấp có lượng SAC cao hơn các mẫu tỏi đã qua xử lý nhiệt ở nhiệt độ cao.

Nhiệt độ (oC)

Thời gian (ngày)

29,3*0,3**

29,30,3

83,31,2

71,51,9

48,91,3

41,31,2

111,41,5

118,51,7

62,81,5

52,81,7

119,81,3

127,51,5

73,91,6

58,41,5

122,41,3

131,80,7

83,51,4

61,80,9

135,50,7

114,21,4 115,20,8

90,81,5

Ghi chú: *Số liệu là trung bình của ba lần lặp lại;**Độ lệch chuẩn của giá trị trung bình

Bảng 4.3 Sự thay đổi hàm lượng SAC (mg/kg d.w) của tỏi trong suốt quá trình lão hóa ở các mức nhiệt độ khác nhau

Hàm lượng SAC của mẫu tỏi lão hóa ở nhiệt độ 60oC trong 45 ngày là 135,5 mg/kg, trong khi đó lượng SAC trong các mẫu tỏi lão hóa 90oC là 90,8 mg/kg. Quá trình tạo ra hàm lượng SAC cao nhất ở nhiệt độ chế biến 60oC trong nghiên cứu này có liên quan đến hoạt động của enzyme γ-GTP. Hoạt động của enzyme γ-GTP bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ chế biến và được cho là sự hình thành SAC. Kết quả tương tự cũng được tìm thấy trong nghiên cứu của Guerard và Suyama-Martinez (Park et al., 2010), nhóm tác giả cho rằng sự thay đổi lượng SAC của tỏi bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và thời gian lão hóa. Việc tăng lượng SAC nhiều hơn đã được quan sát thấy lúc gia nhiệt ở 40oC so với 30oC và 50oC. Sự hình thành SAC cũng bị ảnh hưởng bởi phản ứng được sự hỗ trợ của nước, giữa GSAC và enzyme γ-GTP (Koch and Lawson, 1996). Nước trong tỏi hỗ trợ phản ứng do enzyme γ-GTP, giúp thủy phân và lượng nước nhiều hỗ trợ việc chuyển đổi GSAC thành SAC. Mẫu tỏi lão hóa ở nhiệt độ cao cho thấy sự mất nước nhiều hơn, đây là nguyên nhân gây ra các phản ứng do enzyme γ-GTP ít hơn so với các mẫu lão hóa ở nhiệt độ thấp. Kết quả là các mẫu tỏi lão hóa ở 60oC có hàm lượng SAC cao hơn so với 90oC. Mặt khác, tại thời điểm 25 và 30 ngày, hàm lượng SAC của mẫu tỏi lão hóa ở 60oC thấp hơn so với mẫu tỏi ở 70oC. Điều này cho thấy, khi lão hóa tỏi đen ở nhiệt độ 60oC sẽ kéo dài thêm thời gian chế biến (khoảng 15 ngày) gây tiêu tốn nhiều năng lượng. Do đó, nhiệt độ thích hợp để lão hóa tỏi đen là 70oC.

d Màu sắc, độ cứng và độ ẩm

Độ cứng của tỏi bị ảnh hưởng bởi nhiệt trong giai đoạn lão hóa (Hình

350

300

250

200

150

) f g ( g n ứ c ộ Đ

100

90°C

80°C

70°C

60°C

15 30 Thời gian lão hóa (ngày)

4.19).

Hình 4.19 Thay đổi độ cứng của tỏi ở các nhiệt độ khác nhau trong suốt quá

trình chế biến tỏi đen

Khi thời gian lão hóa càng dài, độ cứng củ tỏi giảm ở tất cả các mức nhiệt độ thực hiện. Độ cứng của tỏi giảm nhanh ở nhiệt độ 90oC đến ngày 25 (90,57,1 g lực). Trong quá trình xử lý nhiệt, tỏi nguyên liệu chuyển sang màu đen, cấu trúc của sản phẩm cuối hơi dính tương tự jelly, hương vị chua ngọt hài hòa (Shin et al., 2008).

Sự thay đổi màu sắc của tép tỏi theo nhiệt độ và thời gian lão hóa được

thể hiện ở Hình 4.20 và Hình 4.21.

(a)

(b)

Hình 4.20 Sự thay đổi màu sắc của tép tỏi (a) và mặt cắt ngang củ tỏi (b) theo

nhiệt độ và thời gian lão hóa

40 ngày

20 ngày

30 ngày

Tỏi tươi

10 ngày

Hình 4.21 Thay đổi màu sắc tỏi đen trong suốt quá trình lão hóa ở 60oC

Màu sắc của tỏi trở nên sậm hơn theo thời gian kéo dài lão hóa. Tốc độ nhanh hơn khi được lão hóa ở các mức nhiệt độ cao (Hình 4.22). Ngoài ra, các phản ứng hóa nâu cũng bị ảnh hưởng bởi hàm lượng ẩm của tỏi nguyên liệu (Kim et al., 1992). Tốc độ hóa nâu diễn ra nhanh hơn khi lão hóa ở nhiệt độ cao hơn.

1,6

60°C

70°C

80°C

90°C

1,2

) 0 A A

( L

0,8

0,4

ị r t á i g ệ l ỷ T

0,0

Thời gian lão hóa (ngày)

Hàm lượng nước hiện diện làm ảnh hưởng đến năng lượng hoạt hóa phản ứng hóa nâu không do enzyme và hàm lượng nước cao hơn làm giảm sự phụ thuộc nhiệt độ của phản ứng hóa nâu. Lão hóa trong quá trình sản xuất tỏi đen làm tăng tốc độ loại bỏ ẩm. Bên cạnh đó, nhiệt độ cũng góp phần thúc đẩy tốc độ phản ứng sinh hóa. Như vậy, lão hóa ở nhiệt độ cao được cho là yêu cầu quan trọng trong quá trình chế biến tỏi đen nhằm giảm độ ẩm của tỏi và cung cấp năng lượng cho các phản ứng hóa nâu.

Hình 4.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến giá trị L của tỏi theo thời gian

Mô hình phản ứng có dạng: A/Ao = a.e-kt, trong đó A và Ao là giá trị L của tỏi tại thời điểm t và t = 0; k là hằng số tốc độ hóa nâu (ngày-1) và t (ngày) là thời gian lão hóa. Hệ số k trong mô hình càng cao khi nhiệt độ lão hóa tăng chứng tỏ tốc độ hóa nâu của tỏi tỷ lệ thuận với nhiệt độ (Bảng 4.4).

Bảng 4.4 Mô hình sự hóa nâu và chuyển thành màu đen của tỏi ở các nhiệt độ khác nhau

Dạng mô hình Nhiệt độ (oC)

a

k

R2

1,3447

0,0486

0,9338

1,3101

0,0585

0,9376

A/Ao = a.e-kt

0,9589

0,0593

0,9556

0,8865

0,0653

0,9646

)

(

m ẩ ộ Đ

90°C

80°C

70°C

60°C

Thời gian lão hóa (ngày)

Hàm lượng ẩm trong tỏi đen thay đổi theo các chế độ xử lý nhiệt khác nhau (Hình 4.23). Hàm lượng ẩm trong tỏi tươi là 64,81,5%. Trong suốt quá trình sản xuất tỏi đen, hàm lượng ẩm giảm liên tục theo thời gian. Hàm lượng ẩm của các mẫu tỏi ở 60oC và 90oC giảm xuống khoảng 49,4 và 31,3%, tương ứng trong thời gian 45 ngày. Nhiệt độ cao thì hàm lượng ẩm thấp.

Hình 4.23 Độ ẩm của tỏi đen ở các mức nhiệt độ lão hóa khác nhau

e Hàm lượng thiosulfinate

Từ dữ diệu thu nhận được có thể xây dựng mô hình động học diễn tả sự thoái hóa các hợp chất thiosulfinate ở các mức nhiệt độ lão hóa với hệ số xác định tương quan cao (R2>0,9) và cho thấy mô hình này có thể mô tả hơn 90% số liệu thu được (Hình 4.24). Hệ số k trong mô hình càng lớn thì tốc độ phân

(Bảng 4.4). Allicin thiosulfinate càng nhanh

0,0

-0,5

-1,0

) 0 C C

-1,5

( n L

-2,0

60°C

70°C

80°C

90°C

-2,5

Thời gian lão hóa (ngày)

(allyl 2-propene hủy thiosulfinate) là thiosulfinate phong phú nhất được tạo ra (chiếm 70% tổng số thiosulfinate), trong khi allyl methyl thiosulfinate xếp thứ 2 (18%) và các thiosulfinate phụ cũng được hình thành với hàm lượng thấp hơn (Mazza, 2002). Hàm lượng thiosulfinate giảm liên tục ở tất cả nhiệt độ lão hóa. Do thiosulfinate cũng như allicin dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, chúng sẵn sàng trải qua nhiều chuyển đổi khác nhau để tạo thành nhiều hợp chất ổn định hơn (Shi et al., 2005). Nhiều hợp chất được hình thành trong suốt quá trình phân hủy nhiệt của thiosulfinate.

Hình 4.24 Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến hàm lượng thiosulfinate trong

tỏi đen

Mô hình phương trình phản ứng bậc 1 có dạng: Ln(C/Co) = -kt, trong đó C và Co (mol/g) là hàm lượng thiosulfinate tại thời điểm t và t = 0; k là hằng số tốc độ phản ứng (ngày-1) và t (ngày) là thời gian lão hóa.

Bảng 4.4 Mô hình sự thoái hóa thiosulfinate ở các nhiệt độ khác nhau

Dạng mô hình

Nhiệt độ (oC)

k

R2

0,0236

0,9351

0,0291

0,9125

Ln(C/Co) = -kt

0,0333

0,9704

0,0465

0,9787

f Hàm lượng acid tổng số

Hàm lượng acid tổng số trong tỏi đen cao hơn trong tỏi tươi ở tất cả các khoảng nhiệt độ (P<0,05) (Hình 4.25). Hàm lượng acid tổng số trong tỏi tươi 0,99%, tăng lên đến 4,51; 4,96; 5,44% trong tỏi đen ở điều kiện lão hóa 70, 80 và 90oC tương ứng. Khi quá trình lão hóa được thực hiện ở nhiệt độ 60oC, hàm lượng acid của tỏi chỉ tăng lên đến 3,08%, do đó tỏi đen lão hóa ở nhiệt độ này có vị chua ít hơn so với các mẫu tỏi lão hóa ở các khoảng nhiệt độ còn lại. Đánh giá vị chua của sản phẩm tỏi đen ở các điều kiện lão hóa cho thấy vị chua của tỏi đen ở nhiệt độ 70oC cho giá trị cảm quan về hương vị tốt hơn so với các mẫu tỏi còn lại.

Hình 4.25 Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến hàm lượng acid tổng số của tỏi

đen

g Hàm lượng đường khử

Hàm lượng đường khử trong tỏi tăng khi xử lý ở nhiệt độ 60 và 70oC trong suốt tiến trình (Hình 4.26). Hàm lượng đường tăng cao nhất ở thời gian xử lý 42 ngày là 44,29 và 52,62%, tương ứng với nhiệt độ 60 và 70oC. Ở các nhiệt độ này, tốc độ hình thành đường nhanh hơn so với tốc độ tiêu thụ. Với điều kiện xử lý ở nhiệt độ 80 và 90oC, hàm lượng đường khử tăng lên đáng kể ở giai đoạn đầu của tiến trình. Ở điều kiện nhiệt độ cao, thúc đẩy tỷ lệ phản ứng Maillard xảy ra, do đó dẫn đến tỷ lệ tiêu thụ đường nhiều hơn tỷ lệ tích lũy. Kết quả là hàm lượng đường khử giảm ở giai đoạn sau với điều kiện nhiệt độ chế biến cao (80 và 90oC). Theo kết quả nghiên cứu, hàm lượng đường khử tăng trong suốt thời gian lão hóa ở nhiệt độ 60 và 70oC. Ở nhiệt độ cao hơn, hàm lượng đường khử tăng nhanh ở giai đoạn đầu và giảm ở giai đoạn lão hóa sau.

Hình 4.26 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lão hóa đến hàm lượng đường

khử của tỏi đen

h Giá trị cảm quan

Kết quả đánh giá cảm quan tỏi đen ở các khoảng nhiệt độ khác nhau bằng phương pháp QDA (Hình 4.27) cho thấy ở nhiệt độ 70oC, thời gian lão hóa 42 ngày, sản phẩm được đánh giá tốt với điểm cảm quan cao (trung bình 4,68 điểm), điều này cho thấy nhiệt độ lão hóa 70oC thuận lợi cho sự hình thành tỏi đen với giá trị cảm quan tốt. Sản phẩm có màu đen đặc trưng của tỏi đen, vị chua ngọt hài hòa với cấu trúc dẻo của trái cây sấy. Ở nhiệt độ ủ 90oC, sản phẩm có cấu trúc kém, xuất hiện mùi cháy khét, sản phẩm tỏi đen lão hóa ở 90oC có điểm cảm quan thấp nhất (3,87 điểm).

Hình 4.27 Giản đồ mạng nhện (QDA) biểu thị điểm cảm quan của tỏi đen theo

nhiệt độ và thời gian lão hóa.

Kết quả tương tự cũng được tìm thấy khi đánh giá cảm quan sản phẩm tỏi đen bằng phương pháp khả dĩ (logistic) dựa trên sự chấp nhận (điểm 1)

hoặc không chấp nhận (điểm 0) của người tiêu dùng đối với sản phẩm. Kết quả thống kê cho thấy hồi quy logistic có thể chấp nhận được vì diễn tả sự tương quan giữa tỷ số khả dĩ và 2 biến độc lập (nhiệt độ và thời gian lão hóa). Phương trình tương quan 4.1 được thể hiện:

Tỉ số khả dĩ = exp(eta)/(1+exp(eta))

Trong đó: Eta= -49,9504 + 1,0745X + 0,7709Y – 0,0063X2 – 0,0061XY – 0,0045Y2 (4.1)

Với: X là nhiệt độ (oC); Y là thời gian (ngày)

Phần trăm độ sai lệch của mô hình là 29,88% và phần trăm độ lệch được điều chỉnh (Adjusted percentage) là 26,28%. Theo kết quả thống kê, phân tích độ sai lệch của mô hình và sai số được trình bày ở Bảng 4.5.

Bảng 4.5 Bảng phân tích độ sai lệch

Nguồn Độ sai lệch Độ tự do Giá trị P

Mô hình (Model) 99,56 5 0,0000

Sai số (Residual) 233,62 274 0,9632

Tổng (Total) 333,18 279

Kết quả cho thấy độ sai lệch của mô hình là 99,56 và giá trị P của mô hình nhỏ hơn 0,05, điều này khẳng định độ tương quan có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Hơn nữa giá trị P của sai số là 0,96>0,05, càng có thể khẳng định rằng mô hình được xem như là khá tốt. Tương quan giữa tỷ số khả dĩ và nhiệt độ với thời gian xử lý được trình bày ở Hình 4.28. Kết quả cho thấy khả năng ưa thích của sản phẩm (hay tỷ số khả dĩ) cao nhất khi lão hóa tỏi ở nhiệt độ 70oC.

Hình 4.28 Tỷ số khả dĩ theo thời gian xử lý ở các nhiệt độ khác nhau

4.2.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến chất lượng sản

phẩm tỏi đen

a Hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng chống oxy hóa

Quá trình sấy rau, củ không chỉ đơn thuần loại bỏ độ ẩm mà còn có thể ảnh hưởng đến chất lượng dinh dưỡng, giá trị cảm quan và khả năng bảo quản của sản phẩm sấy (Idah et al., 2010). Tối ưu hóa quá trình sấy tỏi đen nhằm tạo sản phẩm có chứa các hoạt chất sinh học và giá trị cảm quan tốt được thực hiện theo phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology). Trong tối ưu hóa quá trình sấy, nhiệt độ (X: 50-70°C) và thời gian sấy (Y: 8- 16 giờ) ảnh hưởng đến TPC, TFC và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH. Từ

phân tích dữ liệu thực nghiệm, các phương trình hồi quy (4.2, 4.3 và 4.4) được xây dựng thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến TPC, TFC và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (với hệ số xác định tương quan khá cao R2≥0,88).

DPPH = -66,339 + 4,099X + 5,732Y - 0,112Y2 - 0,0504YX - 0,031X2

(R2=0,90) (4.2)

TFC = -4,213 + 0,371X + 0,396Y - 0,011Y2 - 0,002YX - 0,003X2

(R2=0,92) (4.3)

TPC = -23,637 + 1,010X + 1,885Y - 0,036Y2 - 0,017YX - 0,006X2

(R2=0,88) (4.4)

Guan and Yao (2008) cho rằng mô hình tương quan tốt khi hệ số xác định R2 lớn hơn 0,8. Các phương trình trên có các giá trị R2 tương đối cao nên đã thỏa điều kiện trên. Tương quan giữa nhiệt độ và thời gian sấy đến hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH được thể hiện ở Hình 4.29, Hình 4.30 và Hình 4.31. Kết quả thu nhận cho thấy nhiệt độ và thời gian sấy có ảnh hưởng đến hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng chống oxy hóa của tỏi đen. Phân tích thống kê các dữ liệu thu nhận cho

thấy có sự khác biệt ý nghĩa (P<0,05). Nhìn chung, ở nhiệt độ sấy 60°C kết hợp thời gian sấy 12 giờ cho hàm lượng cao nhất của các hợp chất có hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa. Kết quả này phù hợp với báo cáo của Wiriya et al. (2009) khi nghiên cứu sấy ớt ở nhiệt độ từ 50-70°C và kết luận rằng sấy ở nhiệt độ 60°C cho TPC đạt giá trị cao hơn ở các khoảng nhiệt độ còn lại. Katsube et al. (2009) cũng có báo cáo tương tự khi sấy lá dâu ở nhiệt

độ từ 40-110°C. Ở nhiệt độ sấy 70°C, TPC thu được có giá trị thấp hơn do sự

suy thoái nhiệt của các hợp chất phenol (Wiriya et al., 2009). Đồ thị bề mặt đáp ứng và contour (Hình 4.29, 4.30 và 4.31) cũng đồng thời thể hiện nhiệt độ và thời gian sấy cần thiết để thu nhận được sản phẩm tỏi đen chứa các hoạt chất sinh học đạt hàm lượng tối ưu. Các điểm giá trị này cũng được thể hiện ở Bảng 4.6.

Hình 4.29 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian

sấy đến TPC của tỏi đen

Hình 4.30 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian

sấy đến TFC của tỏi đen

Hình 4.31 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian

sấy đến khả năng loại bỏ gốc tự do của tỏi đen

Nhân tố

Giá trị đạt được/Thông số tối ưu

18,97

Hàm lượng TPC (mg GAE/g)

65,38 10,38

8,67

Hàm lượng TFC (mg QE/g)

57,61 11,11

85,06

Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%)

Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ)

55,51 13,14

Bảng 4.6 Giá trị tối ưu của các hợp chất có hoạt tính sinh học Hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học và khả năng loại bỏ DPPH

Ngoài ra, so sánh các giá trị thực nghiệm (hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng khử gốc tự do DPPH) và giá trị được tính toán tương ứng từ các phương trình hồi quy (4.2), (4.3) và (4.4) cho thấy có sự tương

thích cao giữa dữ liệu thực nghiệm và dữ liệu được dự đoán từ các phương trình hồi quy này (thể hiện ở Hình 4.32, 4.33 và 4.34) với các hệ số xác định tương quan R2 khá cao (0,89).

y = 0,9269x + 1,3422 R2 = 0,8966

) ) g g / / E E A A G G g g m m ( ( n á n o á đ o ự đ d ự d

l l o o n n e e h h p p y y l o l o p p g g n ợ n ư ợ l ư m l à m H à H

19 Hàm lượng polyphenol thực nghiệm (mgGAE/g)

Hình 4.32 Sự tương thích của hàm lượng polyphenol tổng số giữa giá trị thực

9.0

y = 0,9156x + 0,7019 R2 = 0,9153

) g /

8.5

d i o n o v a l f

E Q g m

8.0

(

g n ợ ư l

7.5

n á o đ ự d

m à H

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

Hàm lượng flavonoid thực nghiệm (mgQE/g)

nghiệm và dự đoán theo phương trình (4.2)

Hình 4.33 Sự tương thích của hàm lượng flavonoid tổng số giữa giá trị thực

)

y = 0,8965x + 8,4169 R2 = 0,8965

( n á o đ ự d H P P D

o d ự t c ố g ỏ b i ạ o l g n ă n ả h K

80 Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH thực nghiệm (%)

nghiệm và dự đoán theo phương trình (4.3)

Hình 4.34 Sự tương thích của khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH giữa giá trị

thực nghiệm và dự đoán theo phương trình (4.4)

Từ cơ sở dữ liệu phân tích được cho thấy, để đạt được TPC, TFC và khả

năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi đen ở mức độ tối ưu thì nhiệt độ và thời gian sấy tối ưu cũng thể hiện khác nhau. Vì vậy, việc tìm điểm tối ưu chung về các thông số nhiệt độ và thời gian là vấn đề cần thiết để có thể có được sản phẩm chất lượng cao (về hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học và khả năng loại trừ gốc tự do). Biểu đồ contour tối ưu (Hình 4.35) cùng với Bảng 4.7 chỉ ra điểm tối ưu chung về nhiệt độ và thời gian cần thiết để sấy tỏi đen là 58,78°C và 12,25 giờ.

Hình 4.35 Biểu đồ contour tối ưu nhiệt độ và thời gian sấy tỏi đen

Bảng 4.7 Giá trị tối ưu nhiệt độ, thời gian sấy, hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi đen

Giá trị

Nhân tố

Giá trị ban đầu Giá trị tối ưu

thực nghiệm

Nhiệt độ (°C)

58,78

Thời gian (giờ)

12,25

TPC (mg GAE/g)

17,00

18,80

18,53

TFC (mg QE/g)

5,06

8,65

8,71

60,50

84,78

84,90

Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%)

Ở điều kiện này, tỏi đen chứa TPC, TFC và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH tương ứng là 18,80 mg GAE/g, 8,65 mg QE/g và 84,78%. Ngoài ra, kiểm định T-test cũng được thực hiện cho thấy không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa (giá trị P>0,05) giữa các giá trị tối ưu và thực nghiệm. Do đó, quá trình sấy tỏi đen có thể được tối ưu hóa ở nhiệt độ 58,78°C trong 12,25 giờ sẽ cho

sản phẩm tỏi đen có hàm lượng polyphenol là 18,53 mg GAE/g; TFC là 8,71 mg QE/g và loại bỏ 84,90% gốc tự do DPPH. So với sản phẩm cuối thu nhận được, ban đầu tỏi đen có TPC, TFC và khả năng khử gốc tự do lần lượt là 17,00 mg GAE/g, 5,06 mg QE/g và 60,50%.

b Giá trị cảm quan

Đối với sản phẩm thực phẩm, ngoài giá trị dinh dưỡng và an toàn thực phẩm, giá trị cảm quan cũng đóng vai trò quan trọng trong sản xuất và tiêu dùng. Xác định được khả năng chấp nhận (1) hay không chấp nhận (0) của người tiêu dùng đối với sản phẩm, hội đồng đánh giá cảm quan gồm 15 thành viên đã được thành lập để đánh giá cảm quan theo phương pháp khả dĩ (logistic). Kết quả thống kê cho thấy hồi quy logistic có thể chấp nhận được vì diễn tả sự tương quan giữa tỷ số khả dĩ và 2 biến độc lập (nhiệt độ và thời gian sấy). Phương trình tương quan 4.5 được thể hiện:

Tỷ số khả dĩ = exp(eta)/(1+exp(eta))

và: eta = -374,586 + 8,974X + 17,255Y - 0,057X2 - 0,166XY - 0,296Y2 (4.5)

Với: X là nhiệt độ sấy (oC); Y là thời gian (phút).

Phần trăm độ sai lệch của mô hình là 44,9% và phần trăm độ lệch được điều chỉnh (Adjusted percentage) là 36,0%. Theo kết quả thống kê, phân tích độ sai lệch của mô hình và sai số được trình bày ở Bảng 4.8.

Nguồn

Độ sai lệch

Độ tự do

Giá trị P

Mô hình (Model)

60,59

0,0000

Sai số (Residual)

74,51

129

1,0000

Tổng (Total)

135,11

134

Bảng 4.8 Bảng phân tích độ sai lệch

Kết quả cho thấy độ sai lệch của mô hình là 60,59 và giá trị P của mô hình nhỏ hơn 0,05, điều này khẳng định độ tương quan có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Hơn nữa giá trị P của sai số là 1,000> 0,05, càng có thể khẳng định rằng mô hình được xem như là khá tốt.

Bên cạnh đó, kiểm định Likelihood cũng nhằm đánh giá độ tương thích của mô hình, đặc biệt đánh giá sự đóng góp của từng nhân tố vào trong mô hình được đề xuất. Thông thường so sánh độ lệch của mô hình dựa trên phân bố Chi-Squared (Chi bình phương) với một độ tự do duy nhất để kiểm tra tính độc lập thống kê và mức độ khớp của dữ liệu. Với hồi quy logistic, thay vì sử

dụng R2 để mô tả sự phù hợp của mô hình thì độ sai lệch (deviance) có thể được thay thế. Ngoài ra phân tích Chi2 cũng là một biện pháp đánh giá độ tương thích của giá trị thực nghiệm và dự đoán từ mô hình. Kết quả kiểm định Likelihood (Bảng 4.9) cho giá trị P của các nhân tố đều rất nhỏ (P<0,05), cho thấy sự đóng góp có ý nghĩa của các nhân tố vào mô hình được thiết lập và dự đoán từ mô hình. Độ sai lệch nhỏ nhất là giá trị mong muốn.

Hệ Số

Chi2 (Chi-Squared) Độ tự do Giá trị P

X: Nhiệt độ (oC)

46,96

0,0000

Y: Thời gian (giờ)

43,44

0,0000

41,21

0,0000

31,93

0,0000

31,57

0,0000

Bảng 4.9 Bảng kiểm định sự tương thích (Likelihood)

Mô hình bề mặt đáp ứng được trình bày ở Hình 4.36 cho thấy kết quả thu nhận được khả năng ưa thích của sản phẩm (hay tỷ số khả dĩ) cao nhất khi sấy tỏi đen ở nhiệt độ 60oC và thời gian 12 giờ (dữ liệu được tính toán từ mô hình dự đoán). Khi so sánh thông số tối ưu của quá trình xử lý nhiệt về hàm lượng các chất chống oxy hóa cũng như khả năng loại trừ gốc tự do với giá trị cảm quan sản phẩm có sự chênh lệch không đáng kể về nhiệt độ và thời gian, vì vậy tiến hành sấy tỏi ở ở nhiệt độ 60oC với thời gian 12 giờ được chọn lựa.

Hình 4.36 Tương quan giữa tỷ số khả dĩ và nhiệt độ với thời gian xử lý

4.2.1.4 Ảnh hưởng của loại bao bì và nhiệt độ bảo quản đến chất lượng

sản phẩm tỏi đen

Khảo sát sự biến đổi của hàm lượng các hợp chất sinh học, khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH theo điều kiện nhiệt độ và bao bì bảo quản trong 12 tuần cho thấy, hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số và khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH trong sản phẩm tỏi đen có khuynh hướng giảm theo thời gian tồn trữ. Sự thay đổi hàm lượng các hợp chất sinh học trong tỏi chủ yếu do sự oxy hóa hợp chất phenol và sự phân huỷ dưới tác động của ánh sáng. Bên cạnh sự thay đổi các chất có hoạt tính sinh học trong sản phẩm, khả năng loại bỏ gốc tự do của tỏi cũng thay đổi theo chiều hướng giảm. Kết quả nghiên cứu khá trùng khớp với kết quả đã công bố của Huang et al. (2010) trên đậu nành đen, nhóm tác giả cho rằng sự phân huỷ và quá trình oxy hóa của hợp chất phenolic xảy ra trong thời gian lưu trữ có thể dẫn đến sự giảm hàm lượng polyphenol tổng số.

Ảnh hưởng của hai loại bao bì sử dụng (bao bì PA và bao bì nhôm) cùng hai nhiệt độ bảo quản (nhiệt độ mát và nhiệt độ môi trường) đến hoạt tính sinh học của tỏi đen được thể hiện ở Hình 4.37 a, b và c.

Hàm lượng polyphenol và flavonoid của tỏi đen sau 12 tuần bảo quản ở điều kiện NĐMT–BBPA, NĐM–BBPA, NĐMT–BBN, NĐM–BBN lần lượt là 17,55; 17,84; 17,91; 18,05 (mg GAE/g) đối với polyphenol tổng số và 7,81; 8,01; 8,04; 8,32 (mg QE/g) đối với flavonoid tổng số. Dữ liệu thu nhận cho thấy tồn trữ ở nhiệt độ mát duy trì hàm lượng các hợp chất sinh học và khả năng loại bỏ gốc tự do cao hơn so với tồn trữ ở nhiệt độ môi trường.

(a)

(b)

(c)

Hình 4.37 Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản và điều kiện bao gói đến hàm lượng

Ghi chú: NĐMT -BBPA: Nhiệt độ môi trường kết hợp bao bì PA NĐMT -BBN: Nhiệt độ môi trường kết hợp bao bì nhôm NĐM -BBPA: Nhiệt độ mát kết hợp bao bì PA NĐM -BBN: Nhiệt độ mát kết hợp bao bì nhôm

(a) TPC, (b) TFC và (c) khả năng loại trừ gốc tự do DPPH của tỏi đen

Bên cạnh đó, bao bì tồn trữ cũng ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng loại bỏ gốc tự do. Tỏi đen tồn trữ trong bao bì nhôm có khả năng duy trì hàm lượng các hợp chất sinh học và khả năng loại bỏ gốc tự do tốt hơn bao bì PA. Ở điều kiện bảo quản NĐMT–BBPA, hàm lượng các hợp chất sinh học và khả năng loại bỏ gốc tự do có sự khác biệt có ý nghĩa (P<0,05) so với các điều kiện tồn trữ còn lại. Sự ổn định về hàm lượng các hợp chất sinh học trong tỏi chính nhờ đặc điểm của bao bì nhôm có tính chống ẩm, khí và ánh sáng rất tốt (Nguyễn Thị Lại Giang và Trần Thanh Hà, 2013). Bao bì PA có tính chống thấm khí tốt nhưng tính chống thấm hơi nước và sáng lại kém, do đó khi tỏi đen được tồn trữ trong bao bì PA (Hình 4.38) có hàm

lượng polyphenol, flavonoid và khả năng loại bỏ gốc tự do thấp hơn tồn trữ trong bao bì nhôm.

Hình 4.38 Sản phẩm tỏi đen bảo quản trong bao bì PA

4.2.2 Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi thông qua quy

trình chế biến sản phẩm tỏi lên men lactic

4.2.2.1 Ảnh hưởng của phương pháp chần nguyên liệu tỏi đến hoạt chất

sinh học và hoạt tính chống oxy hóa trong tỏi

a Polyphenol tổng số

Hàm lượng polyphenol tổng số trong tỏi chịu ảnh hưởng bởi thời gian và nhiệt độ chần (Bảng 4.10). Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) có khuynh hướng giảm dưới tác dụng của nhiệt độ chần. Khi chần tỏi ở các nhiệt độ khác nhau (70, 80 và 90oC) thì hàm lượng polyphenol khác biệt có ý nghĩa thống kê P<0,05. Cụ thể, hàm lượng polyphenol cao nhất được xác định trong mẫu tỏi nguyên liệu 4,47 mg GAE/g d.w, hàm lượng polyphenol giảm khi chần ở 70oC là 3,70 mg GAE/g d.w; ở 80oC là 3,93 mg GAE/g d.w và ở nhiệt độ 90oC là 3,16 mg GAE/g d.w. Kết quả này cho thấy nhiệt độ có tác động mạnh mẽ đến hàm lượng polyphenol của tỏi. Shilpi et al. (2011) cho rằng trong giới hạn nào đó nhiệt độ chần tăng thì hàm lượng polyphenol tăng, nhưng nhiệt độ chần quá cao và thời gian chần kéo dài dẫn đến TPC giảm do sự biến đổi của các hợp chất polyphenol dưới tác động nhiệt. Hợp chất phenol trong rau quả hiện diện ở dạng hòa tan và dạng kết hợp với thành tế bào thực vật, vì vậy mô rau quả tiếp xúc với nước nóng và thời gian dài, nhiệt sẽ tác động đến vách tế bào. Tổn thất có thể là do sự phân hủy hoặc do hợp chất phenol hòa tan vào môi trường chần vì hầu hết các hợp chất

hoạt tính sinh học tương đối không bền nhiệt và dễ dàng hòa tan (Farsi and Lee, 2008).

Nhiệt độ chần (oC)

Trung bình

Thời gian (giây)

Nguyên liệu

70 80

4,47*±0,12

4,47±0,12

4,47a

4,47±0,12

3,95±0,23

4,25±0,31

3,36±0,24

4,00b

4,47±0,12

3,81±0,13

4,29±0,18

3,21±0,08

3,94b

120

4,47±0,12

3,20±0,08

3,63±0,13

3,29±0,57

3,64c

150

4,47±0,12

3,43±0,18

3,53±0,16

2,49±0,39

3,48cd

180

4,47±0,12

3,34±0,12

3,38±0,16

2,17±0,92

3,34d

Trung bình

4,47a

3,70c

3,93b

3,16d

Ghi chú: *Số liệu là trung bình của ba lần lặp lại; các số trung bình trong cùng một cột hoặc một hàng mang chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) theo phép thử LSD.

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chần đến hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w) trong tỏi

Thời gian chần cũng ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol của tỏi, hàm lượng này trong tỏi có khuynh hướng giảm khi thời gian chần kéo dài. Với thời gian chần tỏi 60 và 90 giây, hàm lượng polyphenol lần lượt là 4,00 và 3,94 mg GAE/g d.w và không thể hiện sự khác biệt ý nghĩa trong hai khoảng thời gian này, tuy nhiên có sự khác biệt ý nghĩa và thấp hơn so với nguyên liệu ban đầu. Với các thời gian chần 120, 150 và 180 giây, hàm lượng polyphenol của tỏi lần lượt là 3,64; 3,48 và 3,34 mg GAE/g d.w và có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các thời gian còn lại. Nếu thời gian chần kéo dài sẽ làm ảnh hưởng đến các hợp chất phenol có trong nguyên liệu. Shela et al. (2010) cũng đã tiến hành thí nghiệm trên nguyên liệu tỏi và kết luận rằng khi chần tỏi ở thời gian 90 giây và 10 phút thì hàm lượng polyphenol của tỏi đạt cao nhất ở thời gian chần 90 giây. Quá trình chần tỏi trong nước làm cho các chất có hoạt tính sinh học hòa tan vào dung môi. Một số hợp chất phenol có chứa các nhóm chức phân cực tan tốt trong dung môi nước. Khi thời gian chần kéo dài, tạo cơ hội cho các hợp chất sinh học tiếp xúc với dung môi dẫn đến hàm lượng polyphenol giảm càng nhiều. Thời gian và nhiệt độ chần có thể gây thiệt hại đến các hợp chất phenol trong tỏi. Kết quả khảo sát cho thấy có sự tổn thất nhỏ hàm lượng polyphenol sau khi chần tỏi ở 80oC trong 60 hoặc 90 giây.

b Flavonoid tổng số

TFC (mgQE/ gD.W)

Nhiệt độ o C) (

Thời gian (giây)

Quá trình xử lý nhiệt bằng phương pháp chần có thể gây thiệt hại các hợp chất flavonoid. Kết quả thu được cho thấy có sự tổn thất nhỏ hàm lượng flavonoid khi chần tỏi ở 80oC trong 90 giây. Hàm lượng flavonoid tổng số trong tỏi chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ và thời gian chần (Hình 4.39). Hàm lượng flavonoid của mẫu nguyên liệu không qua quá trình chần là 1,67±0,05 mg QE/g d.w và giảm ở các mẫu chần ở nhiệt độ 70, 80 và 90oC. Khi nhiệt độ chần tăng từ 70 đến 80oC thì hàm lượng flavonoid cũng tăng lần lượt từ 1,21 mg QE/g d.w và 1,31 mg QE/g d.w. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá cao thì hàm lượng flavonoid lại giảm, ở 90oC là 1,04 mg QE/g d.w. Điều này cho thấy hàm lượng flavonoid của tỏi phụ thuộc vào nhiệt độ chần (Litaiem et al., 2013). Theo báo cáo của Alonzo et al. (2013) ở nhiệt độ 90°C hàm lượng flavonoid trong tỏi giảm là do sự thoái hóa do nhiệt của các hợp chất nhạy cảm với nhiệt.

Hình 4.39 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chần đến hàm lượng flavonoid

trong tỏi

Ngoài ra, sự giảm hoạt động của enzyme peroxidase và polyphenol oxidase tham gia vào quá trình oxy hóa hợp chất phenol có thể dẫn đến sự gia tăng hàm lượng polyphenol (Ramani and Kant, 1989; Vega et al., 2012). Khi tỏi được bóc vỏ, các tép tỏi tiếp xúc với môi trường và xảy ra những thay đổi không mong muốn trong chất lượng, bao gồm cả sự hóa nâu nhanh chóng. Vì vậy, xử lý nhiệt trước khi chế biến là cần thiết để làm giảm sự thay đổi các hợp chất sinh học và thu được một sản phẩm ổn định. Luciane and Caciano (2012) nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chần đến hoạt động của peroxidase và polyphenol oxidase trong tỏi cho kết quả chần trong nước ở 80oC, hoạt động của peroxidase và polyphenol oxidase giảm theo thời gian

(giảm nhanh chóng trong những phút đầu tiên và sau đó liên tục giảm). Hiện tượng này xảy ra chậm lại khi thời gian chần đạt được khoảng 10 phút. Mizobutsi et al. (2010) báo cáo rằng enzyme polyphenol oxidase bị bất hoạt ở nhiệt độ cao (90-100°C). Không có nhiều nghiên cứu liên quan đến sự bất hoạt của các enzyme trong tỏi. Tuy nhiên, so với các nguồn nguyên liệu khác chẳng hạn như bạc hà (Neves et al., 2009) và đào (Garro and Gasull, 2010), tỷ lệ bất hoạt của polyphenol oxidase tăng với sự gia tăng nhiệt độ chần. Thí nghiệm tương tự cũng được khảo sát trên enzyme peroxidase trong cà rốt thái lát, bất hoạt enzyme ở nhiệt độ cao có liên quan đến việc phân giải cấu trúc bậc ba của enzyme (Shivhare et al., 2009).

Tương tự, thời gian chần cũng ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid của tỏi. Shela et al. (2010) cho rằng trong quá trình chần, hàm lượng flavonoid có khuynh hướng giảm khi thời gian chần dài. TFC của tỏi ở các khoảng thời gian chần 60, 90, 120, 150 và 180 giây có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê và đạt giá trị lần lượt là 1,48; 1,53; 1,22; 1,13 và 1,06 mg QE/g d.w. Do đó, ở thời gian chần 90 giây, làm TFC trong tỏi tổn thất ít nhất. Hàm lượng flavonoid chiếm lượng lớn trong nhóm polyphenol; do đó hàm lượng polyphenol giảm trong quá trình chần chủ yếu là do sự giảm hàm lượng các flavonoid. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Chandan et al. (2015) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chần và phương pháp chần ảnh hưởng đến các hợp chất sinh học có trong tỏi. Theo đó, tác giả cho rằng khi tỏi được chần ở 80oC trong nước sẽ cho hàm lượng flavonoid cao nhất so với các phương pháp xử lý nhiệt khác.

c Thiosulfinate

Thời gian và nhiệt độ chần ảnh hưởng đến hàm lượng thiosulfinate trong tỏi được thể hiện qua Bảng 4.11. Hàm lượng thiosulfinate trong quá trình chần tỏi thay đổi và có sự khác biệt ý nghĩa thống kê giữa mẫu nguyên liệu tỏi không qua xử lý chần và mẫu tỏi có qua xử lý chần. Theo đó, hàm lượng thiosulfinate của tỏi nguyên liệu đạt giá trị cao nhất 18,29 µmol/g d.w.

Hàm lượng thiosulfinate chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ chần. Khi tỏi được chần ở nhiệt độ 70 và 80oC, hàm lượng thiosulfinate trung bình không khác biệt thống kê và đạt giá trị 16,68 và 16,73 µmol/g d.w, cao hơn so với khi chần ở 90oC (có giá trị thấp nhất 11,14 µmol/g d.w). Trong điều kiện thuận lợi, enzyme alliinase tiếp xúc với alliin và cùng với sự hiện diện của một hợp chất khác có sẵn trong tỏi là pyridoxal phosphate, alliin được chuyển thành một hợp chất trung gian không bền là acid 2-propenesulfinic. Chất này sau đó sẽ nhị trùng hợp thành allicin (diallylthiosulfinate) (Block, 1985). Enzyme

alliinase xúc tác chuyển cysteine sulfoxide thành thiosulfinate làm cho hàm lượng thiosulfinate tăng lên. Tuy nhiên, Yin and Cheng (1991) báo cáo rằng các hợp chất lưu huỳnh giảm nhanh theo nhiệt độ cao vì alliinase có trách nhiệm cho sự hình thành của thiosulfinate bị vô hoạt bằng nhiệt.

Nhiệt độ chần (oC)

Thời gian

Trung bình

(giây)

Nguyên liệu

18,29±0,60

18,29a

18,29±0,60

18,63±0,23

18,56±0,91

11,94±0,91

16,85b

18,29±0,60

18,87±0,80

18,03±0,82

10,63±0,48

16,68b

120

18,29±0,60

18,56±0,41

18,19±0,60

8,37±0,76

15,96c

150

18,29±0,60

11,62±0,75

14,22±0,67

8,78±0,48

13,23d

180

18,29±0,60

14,13±0,49

11,78±0,98

8,83±0,87

13,26d

Trung bình

18,29a

16,68b

16,73b

11,14c

Ghi chú: Số liệu là trung bình của ba lần lặp lại; các số trung bình trong cùng một cột hoặc một hàng mang chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) theo phép thử LSD.

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chần đến hàm lượng thiosulfinate (µmol/g d.w) của tỏi

Tương tự, kết quả thể hiện ở Bảng 4.11 còn cho thấy thời gian chần cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự biến đổi hàm lượng thiosulfinate có trong nguyên liệu tỏi. Quá trình chần, hàm lượng thiosulfinate có khuynh hướng giảm khi kéo dài thời gian chần. Với thời gian chần ở 60 và 90 giây, hàm lượng thiosulfinate không thể hiện sự khác biệt với giá trị lần lượt là 16,85 và 16,68 µmol/g d.w. Tuy nhiên, hàm lượng này khác biệt về ý nghĩa thống kê (p<0,05) và thấp hơn so với nguyên liệu ban đầu. Tuy nhiên ở thời gian chần ở 150 và 180 giây, hàm lượng thiosulfinate không thể hiện sự khác biệt, giá trị thấp nhất lần lượt là 13,23 và 13,26 µmol/g d.w, nhưng vẫn có sự khác biệt so với các thời gian còn lại. Nghiên cứu của Tenisa and Caciano (2014) cũng cho kết quả tương tự khi chần tỏi trong nước ở 80 và 90°C, thiosulfinate sẽ giảm theo thời gian. Thời gian chần kéo dài làm cho enzyme alliinase bị vô hoạt nên hàm lượng thiosulfinate giảm.

Thời gian và nhiệt độ chần có ảnh hưởng đến hàm lượng thiosulfinate trong nguyên liệu tỏi. Theo đó, khi chần tỏi ở 70 hoặc 80oC trong 60 và 90 giây hàm lượng thiosulfinate ít tổn thất nhất.

d Khả năng chống oxy hóa của tỏi

)

H P P D %

( a ó h

y x o

g n ố h c

70oC

80oC

90oC

h n í t t ạ o H

120

150

180

Thời gian (giây)

Hoạt tính chống oxy hóa của tỏi ở các điều kiện chần khác nhau được thể hiện ở Hình 4.40. Tỏi sau khi chần 90 giây ở nhiệt độ 70oC và 80oC cho thấy hoạt tính chống oxy hóa tăng so với mẫu ban đầu. Ở nhiệt độ 90oC, hoạt tính chống oxy trong tỏi cũng tăng sau 60 giây. Tuy nhiên, sau các điểm thời gia đó, hoạt tính chống ô xy hóa bị giảm nhanh chóng khi kéo dài thời gian chần. Nhiều hợp chất chống oxy hóa trong thực vật hiện nay chủ yếu là các dạng liên kết đồng hóa trị với nhiều polyme không tan. Tác dụng làm tăng hoạt tính có thể do nhiệt phá vỡ thành tế bào và giải phóng các hợp chất chống oxy hóa.

Hình 4.40 Thay đổi hoạt tính chống oxy hóa trong tỏi ở các điều kiện chần

khác nhau

Kết quả này tương tự với kết quả thí nghiệm của Zhang and Hmauzu (2004), khi nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình chế biến đến hoạt động chống oxy hóa của bông cải. Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của bông cải xanh giảm khi chần ở nhiệt độ cao (90oC). Block (1995) cũng cho biết khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của súp lơ giảm 23% khi chần súp lơ trong nước ở nhiệt độ cao.

Thời gian chần cũng ảnh hưởng đến khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của tỏi. Trong quá trình chần, khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của tỏi có khuynh hướng giảm khi thời gian chần kéo dài. Với thời gian chần 60 và 90

giây, khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của tỏi không có sự khác biệt. Tuy nhiên, thời gian chần 120, 150 và 180 giây thì khả năng trung hòa gốc tự do của tỏi không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê và đạt giá trị thấp nhất, nhưng có sự khác biệt so với các thời gian còn lại. Kết quả đạt được phù hợp với kết quả nghiên cứu của Lin and Chang (2005), khi thời gian chần tỏi kéo dài khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của tỏi giảm do mô tế bào thực vật bị phá hủy khi đun nóng, giải phóng các chất chống oxy hóa. Thất thoát ra nước chần cũng có thể dẫn đến những mất mát các hợp chất chống oxy hóa (Nicoli et al., 1999). Yin and Cheng (1998) nhận thấy sự suy giảm khả năng chống oxy hóa của tỏi khi được xử lý nhiệt liên quan đến sự phân hủy thiosulfinate và sự bất hoạt enzyme alliinase bởi nhiệt, ngăn chặn sự chuyển hoá alliin để tạo allicin. Willett (1994) báo cáo rằng các hợp chất phenol như flavonoid cũng góp phần vào các hoạt động chống oxy hóa trong tỏi nhưng xử lý nhiệt có thể thúc đẩy sự suy thoái của các hợp chất này. Nghiên cứu của Prasad et al. (1996) cũng cho kết quả tương tự, ảnh hưởng của nhiệt trên các hoạt động chống oxy hóa của tỏi giảm khoảng 10% khi tỏi được đun nóng đến 100°C. Kết quả thí nghiệm cho thấy có sự tổn thất nhỏ khả năng chống oxy hóa của tỏi khi chần tỏi ở 80oC trong 60 hoặc 90 giây.

Bảng 4.12 Dự đoán các thông số động học, hệ số xác định (R2) cho sự tổn thất hàm lượng polyphenol, flavonoid tổng số trong tỏi ở các điều kiện chần khác nhau

Dạng mô hình

Nhiệt độ (oC)

a

k

R2

Polyphenol

0,9888

0,0016

0,9900

A/Ao = a.e-kt

1,0290

0,0017

0,9155

1,0016

0,0037

0,9134

Flavonoid

0,9683

0,0030

0,9593

A/Ao = a.e-kt

1,0392

0,0032

0,9790

1,0198

0,0054

0,9677

Động học phân hủy của polyphenol, flavonoid và thiosulfinate

1,2

0,8

0,6

) 0 A A

(

0,4

70oC

80oC

90oC

0,2

120

150

180

Thời gian (giây)

Các thông số động học trong mô hình giúp dự đoán sự tổn thất hàm lượng polyphenol và flavonoid được thiết lập theo phương trình của Ankit et al. (2011) với hệ số xác định tương đối cao (R2>0,9) (Bảng 4.12). Hằng số tốc độ phản ứng (k) tăng lên đáng kể theo nhiệt độ, từ 0,0016-0,0037 giây-1 và 0,0030-0,0054 giây-1 lần lượt trong mô hình về sự phân hủy polyphenol và flavonoid, tương ứng (Hình 4.41 và Hình 4.42).

Hình 4.41 Mô hình dự đoán hàm lượng polyphenol tổng số ở các điều kiện

1,2

0,8

0,6

) 0 A A

(

0,4

70oC

80oC

90oC

0,2

120

150

180

Thời gian (giây)

chần khác nhau

Hình 4.42 Mô hình dự đoán hàm lượng flavonoid tổng số ở các điều kiện chần

khác nhau

Hàm lượng thiosulfinate được xem là chất chỉ thị cho cường độ mùi hăng cay trong tỏi. Đặc tính mùi hăng cay của tỏi do các hợp chất chứa lưu huỳnh bay hơi. Khi tỏi bị nghiền hoặc cắt, alliin bị chuyển hóa thành allicin với sự tác dụng của enzyme alliinase (Amagase et al., 2001). Mô hình phương trình bậc nhất: Ln(C/Co) = -kt (Muhammad et al., 2013) được sử dụng để nghiên cứu sự phân hủy của hợp chất thiosulfinate trong tỏi. Các dữ liệu thực nghiệm cho thấy một sự phù hợp khi áp dụng kiểu mô hình đối với sự phân hủy của hợp chất thiosulfinate với hệ số xác định cao (R2>0,95) (Bảng 4.13). Hằng số tốc độ (k) tăng lên một cách có ý nghĩa (p<0,05), từ 0,0023-0,0134 giây-1 (Hình 4.43)

Bảng 4.13 Dự đoán thông số động học, hệ số xác định (R2) cho sự phân hủy của thiosulfinate trong tỏi ở các điều kiện chần khác nhau

Nhiệt độ (oC)

k

R2

Dạng mô hình

0,0023

0,9900

Ln(C/Co) = -kt

0,0039

0,9853

0,0134

0,9538

0,5

-0,5

-1

) 0 C C ( n L

-1,5

-2

70oC

80oC

90oC

-2,5

120

150

180

Thời gian (giây)

Hình 4.43 Mô hình dự đoán hàm lượng thiosulfinate ở các điều kiện chần khác

nhau

e Độ cứng

Nhiệt độ và thời gian chần ảnh hưởng khá lớn đến độ cứng của tỏi (Hình 4.44), không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê giữa độ cứng của tỏi nguyên

1000

800

Nguyên li?u Đối chứng 70oC 70oC 80oC 80oC 90oC 90oC

600

400

) ) c c ? ự l l m g a ( g g ( n g ứ n c ? c ộ Đ ? Ð

200

150

180

90 120 Th?i gian (giây) Thời gian (giây)

liệu và mẫu tỏi chần ở 70oC. Ở nhiệt độ chần 80 và 90oC, độ cứng của tỏi có sự khác biệt và thấp hơn so với độ cứng mẫu tỏi chần ở nhiệt độ 70oC và mẫu không chần. Khi chần ở nhiệt độ 90oC, độ cứng của tỏi giảm nhiều nhất.

Hình 4.44 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chần đến độ cứng của tỏi

Độ cứng của tỏi có khuynh hướng giảm khi kéo dài thời gian chần do rau quả bị mất kết cấu vững chắc. Không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê về độ cứng của mẫu tỏi nguyên liệu (không chần) và mẫu tỏi chần ở 60 giây. Tuy nhiên, khi chần trong các khoảng thời gian 90, 120, 150 và 180 giây, độ cứng của tỏi giảm dần theo thời gian. Trong khi gia nhiệt (chần), rau quả bị mềm do sự co lại các tế bào bên trong dẫn đến một số tế bào bị sụp đổ và vách tế bào bị phá vỡ (Amagase et al., 2001), điều đó làm cho cấu trúc của tỏi trở nên mềm hơn và mức độ mềm tùy thuộc vào nhiệt độ và thời gian gia nhiệt.

Chần là một quá trình tiền xử lý nhiệt đối với các loại rau quả trước khi chế biến tiếp theo. Đây là một hoạt động cơ bản có ảnh hưởng đến các thuộc tính như màu sắc và kết cấu thực phẩm, bên cạnh lợi ích về khả năng diệt vi sinh vật bề mặt và bất hoạt enzyme (Jaiswal, 2012). Quá trình chần sẽ phát huy tác dụng khác nhau trong từng sản phẩm thực phẩm cụ thể. Hiệu quả của quá trình tiền xử lý nhiệt giúp giảm thời gian lên men đối với sản phẩm muối chua, chẳng hạn như thời gian lên men dưa leo muối chua có qua tiền xử lý nhiệt ở 77oC trong thời gian 180 giây sẽ ngắn hơn mẫu đối chứng không chần (Constantinescu and Enescu, 1985). Salmah and Kalaivani (1994) tiến hành so sánh sản phẩm dưa khế từ nguyên liệu khế có hoặc không qua quá trình chần. Kết quả không có sự khác biệt đáng kể tính chất vật lý và hóa học của sản phẩm thu được từ cả hai phương pháp chế biến. Tuy nhiên, xét về mặt cảm

quan cho thấy dưa khế có qua tiền xử lý nhiệt được đánh giá cao hơn, đồng thời phương pháp chần đã rút ngắn thời gian lên men là lợi thế chính của quá trình. Kết quả nghiên cứu của Rejano et al. (2007) đã xác định rằng khi chần tỏi ở nhiệt độ 80 và 90oC có thể loại bớt vị cay và ngăn sự xuất hiện của màu xanh, đồng thời cấu trúc của tỏi ít bị ảnh hưởng trong quá trình chế biến tiếp theo cho các sản phẩm đóng hộp.

f Màu sắc

Màu sắc của tỏi theo nhiệt độ chần có sự thay đổi như trình bày trong Bảng 4.14. Ở nhiệt độ chần 70, 80 và 90oC, giá trị a và b của các mẫu tỏi không thể hiện sự khác biệt về ý nghĩa so với tỏi không chần. Tỏi được chần ở nhiệt độ 90oC có giá trị L cao nhất (82,06) và có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê với giá trị L ở nhiệt độ 70oC (65,30), 80oC (78,39) và tỏi không chần (65,33).

Giá trị màu sắc

Nhiệt độ chần (

Không chần

-2,33

65,33

22,89

-2,00

65,30

22,33

-1,83

78,39

23,32

-2,00

82,06

22,49

Ghi chú: số liệu là giá trị trung bình thống kê; trong cùng một cột, những chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép thử LSD ở độ tin cậy 95%.

Bảng 4.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến màu sắc của tỏi

Không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê giá trị L của mẫu tỏi chần ở 70oC và mẫu tỏi nguyên liệu vì 70oC chưa vô hoạt enzyme hóa nâu. Tuy nhiên, 80oC chỉ ức chế một phần rất nhỏ enzyme polyphenol oxidase và ở nhiệt độ 90oC enzyme này bị vô hoạt nhiều hơn nên tỏi có màu sáng hơn (Hình 4.45).

Chần 90oC

Chần 80oC

Chần 70oC

Không chần

Hình 4.45 Tỏi trước và sau khi chần ở 70, 80 và 90oC trong 90 giây

Tương tự, thời gian chần cũng ảnh hưởng đến màu sắc của tỏi. Giá trị L của tỏi có khuynh hướng tăng dần (đạt giá trị cao nhất ở 150 giây hoặc 180 giây), trong khi giá trị a và b không thay đổi theo thời gian chần (Bảng 4.15).

Thời gian chần (giây)

Giá trị

120

150

180

65,33

71,75

75,58

78,75

81,00

81,92

-2,33

-2,00

-2,25

-1,75

-2,17

22,89

22,57

22,36

23,72

22,67

22,47

Ghi chú: số liệu là giá trị trung bình thống kê; trong cùng một hàng, những chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép thử LSD ở độ tin cậy 95%.

Bảng 4.15 Ảnh hưởng thời gian chần đến giá trị L, a, b của tỏi

Luciane and Caciano (2012) một lần nữa khẳng định chần tỏi ở nhiệt độ 90oC trong thời gian 240 giây có thể làm giảm 93,53% và 92,15% hoạt động của enzyme peroxidase và polyphenol oxidase nên tỏi có màu sáng hơn sau khi chần. Kết quả thí nghiệm đạt được phù hợp với nghiên cứu của Fante et al. (2012), khi nghiên cứu khả năng ức chế hoạt động của enzyme có trong tỏi bởi nhiệt độ chần. Theo đó, nhóm tác giả cho rằng khi chần tỏi ở nhiệt độ 90oC sẽ tốt hơn do tỏi có màu sáng hơn so với chần ở 80oC trong thời gian 4 phút.

Sau khi chần tỏi nguyên liệu ở 80oC thời gian 90 giây, hàm lượng polyphenol, flavonoid, thiosulfinate và khả năng loại bỏ gốc tự do so với nguyên liệu không chần được trình bày trong Bảng 4.16.

Thành phần

Đơn vị tính

Trước khi chần

Sau khi chần

Polyphenol tổng

mg GAE/g d.w

4,47±0,12

4,29±0,19

Flavonoid tổng

mg QE/g d.w

1,67±0,05

1,49±0,13

Thiosulfinate

µmol/g d.w

18,29±0,60 18,03±0,82

Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH

8,02±0,41

8,92±0,40

Bảng 4.16 Hàm lượng polyphenol, flavonoid, thiosulfinate và khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của tỏi sau chần 80oC thời gian 90 giây.

4.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl và mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum bổ sung vào dịch lên men đến hoạt chất sinh học và hoạt tính chống oxy hóa trong tỏi lên men

a pH

Sau khi chần tỏi trong nước ở 80oC thời gian 90 giây, tỏi được cho vào các dung dịch muối có nồng độ 0,5-2%, được lên men với chủng Lactobacillus plantarum 105-107 CFU/mL ở nhiệt độ 30±2oC. Diễn biến thay đổi giá trị pH của dịch lên men theo thời gian, mật số vi khuẩn và nồng độ muối được trình bày ở Bảng 4.18. Từ kết quả thống kê cho thấy giá trị pH của các mẫu tỏi lên men có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05). Lên men lactic có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus plantarum sẽ rút ngắn thời gian lên men sản phẩm. Bổ sung vi khuẩn với mật số 105, 106 và 107 CFU/mL vào dịch lên men, tất cả các mẫu đều đạt pH thấp nhất vào ngày lên men thứ 6, tuy nhiên mẫu lên men không bổ sung vi khuẩn lactic cần khoảng thời gian là 8 ngày để đạt độ pH thấp nhất. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Antonio (1998), khi lên men tỏi sau chần với vi khuẩn lactic thuần chủng có mật số 107 CFU/mL thì pH đạt 3,8 sau 7 ngày. Sau khi đạt giá trị pH thấp nhất ở các mẫu lên men, pH các mẫu thí nghiệm có khuynh hướng tăng lên. Điều này có thể giải thích do lúc đầu vi khuẩn acid lactic phát triển mạnh tạo acid lactic làm pH môi trường giảm xuống nhanh, nhưng khi acid lactic trong môi trường quá nhiều, đồng thời lượng chất dinh dưỡng trong môi trường đã cạn mà sản phẩm của quá trình trao đổi chất của quần thể vi khuần tăng dần theo thời gian sẽ ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của quần thể vi sinh vật (Trần Minh Tâm, 2004).

Mẫu tỏi lên men ở các nồng độ muối 0,5; 1,5 và 2,0% có giá trị pH cao hơn (ở ngày thứ 8 đối với mẫu không bổ sung vi khuẩn và ngày thứ 6 đối với các mẫu có bổ sung vi khuẩn) so với mẫu lên men ở nồng độ muối 1,0%. Khi

tăng hay giảm nồng độ muối đều làm giảm lượng acid lactic hình thành trong quá trình lên men. Nồng độ muối thấp gây áp suất thẩm thấu nhỏ nên chất dinh dưỡng khuếch tán vào dung dịch lên men ít, vì vậy hàm lượng acid sinh ra thấp, với nồng độ muối cao trong quá trình lên men sẽ hạn chế một phần sự phát triển của vi khuẩn acid lactic, do đó làm chậm sự phát triển vi khuẩn acid lactic, hàm lượng acid lactic hình thành cũng thấp (Pederson, 1960).

Bảng 4.17 thể hiện sự tương tác giữa mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men đến giá trị pH của dịch lên men. Tất cả các nhân tố riêng lẽ đều có ảnh hưởng mạnh đến pH của tỏi lên men (cao nhất là nhân tố thời gian, % ảnh hưởng là 87,24%) và sự tương tác của từng cặp nhân tố (mật số vi khuẩn với thời gian, mật số vi khuẩn với nồng độ muối và thời gian với nồng độ muối), cũng như tương tác đồng thời của ba nhân tố với nhau (mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men) đều có ảnh hưởng đến pH.

Nhân tố

Trung bình bình phương

% ảnh hưởng

A: Mật số vi khuẩn

3,94***

3,05

B: Nồng độ muối

0,86***

0,67

C: Thời gian

37,64***

87,24

AxB

0,05***

0,13

AxC

1,06***

7,38

BxC

0,07***

0,46

AxBxC

0,04***

0,79

Sai số

0,01

0,29

Ghi chú: P<0,001: ***; 0,001

Bảng 4.17 Tương tác giữa mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men

Thời gian lên men (ngày)

Nồng độ muối (%)

Vi khuẩn (CFU/mL)

0,5 1 1,5 2

105

0,5 1 1,5 2

106

0,5 1 1,5 2

107

0,5 1 1,5 2

1 6,21a±0,03 6,15a±0,02 6,19a±0,04 6,22a±0,04 6,36a±0,05 6,34a±0,03 6,41a±0,06 6,37a±0,04 6,26a±0,04 6,19a±0,02 6,33a±0,15 6,36a±0,03 6,35a±0,02 6,22a±0,04 6,46a±0,02 6,44a±0,06

2 5,37b±0,02 5,33b±0,01 5,17c±0,03 5,09c±0,04 5,68c±0,04 5,70b±0,02 5,70b±0,04 5,72bc±0,08 5,58b±0,03 5,58b±0,03 5,60b±0,15 5,63b±0,07 5,65c±0,04 5,62b±0,06 5,72bc±0,03 5,81bc±0,03

3 5,26c±0,05 5,18c±0,04 5,23b±0,06 5,26b±0,02 5,82b±0,03 5,64b±0,03 5,73b±0,02 5,75b±0,03 5,56bc±0,04 5,44b±0,04 5,54b±0,04 5,58b±0,06 5,86b±0,03 5,64b±0,03 5,79b±0,03 5,86b±0,14

4 5,15d±0,05 5,08d±0,02 5,21bc±0,02 5,29b±0,01 5,60c±0,02 5,54c±0,04 5,67b±0,02 5,65c±0,08 5,43c±0,01 5,35b±0,04 5,46c±0,03 5,57b±0,02 5,83b±0,04 5,62b±0,05 5,71c±0,02 5,77c±0,01

5 4,23f±0,03 4,07f±0,02 4,33f±0,01 4,37e±0,04 5,42d±0,04 5,24d±0,02 5,29c±0,02 5,29d±0,07 4,44d±0,04 4,12d±0,04 4,22e±0,1 4,57c±0,08 5,30d±0,03 5,20c±0,03 5,36d±0,04 5,37d±0,02

6 7 4,21f±0,03 4,17f±0,09 4,26f±0,04 3,96g±0,03 4,42e±0,02 4,18g±0,01 4,51d±0,01 4,19f±0,05 3,94g±0,02 4,13f±0,08 3,56h±0,07 3,95g±0,06 3,62g±0,06 4,07f±0,05 3,65h±0,03 4,11g±0,08 3,24g±0,03 3,38f±0,02 3,17e±0,02 3,35e±0,01 3,24g±0,04 3,26g±0,02 3,27e±0,05 3,67g±0,10 3,86i±0,03 4,27g±0,02 3,66g±0,07 4,19d±0,01 3,72g±0,04 4,32e±0,03 3,85h±0,02 4,21g±0,08

10 9 8 4,36e±0,06 4,21f±0,07 3,28g±0,01 4,27e±0,05 4,08f±0,05 3,06h±0,09 4,58d±0,04 4,35f±0,07 3,22h±0,09 4,54d±0,03 4,39e±0,06 3,93g±0,05 4,30e±0,07 4,15f±0,04 4,12f±0,01 4,31e±0,07 4,13f±0,05 3,95g±0,06 4,39d±0,09 4,21e±0,09 4,15ef±0,05 4,45e±0,03 4,23f±0,02 4,07g±0,03 4,40d±0,05 4,09e±0,02 4,14e±0,04 4,43c±0,14 4,10d±0,11 3,47e±0,38 4,50d±0,01 4,24e±0,01 3,65f±0,01 4,56c±0,03 4,21d±0,09 3,94f±0,01 4,91e±0,05 4,40f±0,06 4,10h±0,07 4,09f±0,11 4,12ef±0,01 4,16de±0,02 4,36e±0,02 4,17f±0,03 4,33e±0,03 4,38f±0,08 4,20g±0,05 4,59e±0,04

Ghi chú: số liệu là trung bình của 3 lần lặp lại; trong cùng một hàng, những chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép thử LSD ở độ tin cậy 95%.

Bảng 4.18 Sự thay đổi pH của tỏi lên men theo thời gian, mật số vi khuẩn và nồng độ muối

b Polyphenol tổng số

Mô hình tương quan giữa thời gian, mật số vi khuẩn lactic và nồng độ muối được thể hiện ở phương trình 4.9. Các hệ số trong mô hình bao gồm các hệ số tuyến tính, hệ số tương tác và hệ số bậc hai. Các hệ số này đều thể hiện mức ý nghĩa p<0,05. Với giá trị F=1064 và giá trị p<0,0001 chứng tỏ mô hình thiết lập có ý nghĩa thống kê cao.

Phương trình tương quan 4.9 theo mức độ thực của các biến độc lập (nhân tố):

2 - 6,5888.10-8 X2X3

2 - 3,1934.10-13 X2

Y = -0,0799 + 3,2896 X1 + 3,2515.10-6 X2 + 5,3785 X3 - 5,3488.10-9 2- 0,2173 X1 (4.9) X1X2 – 2,3182 X3

Trong đó, X1 là thời gian lên men (ngày), X2 là mật số vi khuẩn (CFU/mL), X3 là nồng độ muối (%) và Y là hàm lượng polyphenol (mg GAE/g d.w).

Mức độ phù hợp của mô hình cũng được đánh giá thông qua giá trị F, mô hình tương quan tốt cần sự phù hợp giữa số liệu thực tế và lý thuyết. Mô hình tương quan xây dựng từ thí nghiệm đã thỏa các điều kiện trên với hệ số xác định tương quan R2 cao (R2 =0,96), cho thấy mô hình có thể sử dụng để dự đoán hàm lượng polyphenol tổng của sản phẩm tỏi trong quá trình lên men lactic.

Đồ thị bề mặt đáp ứng 3D thể hiện mối liên hệ tác động tương hỗ của mật số vi khuẩn và nồng độ muối NaCl theo thời gian lên men đến hàm lượng polyphenol (Hình 4.46). Khi tăng mật số vi khuẩn (từ 105 đến 107 CFU/mL) và nồng độ NaCl (từ 0,5 đến 2%), hàm lượng polyphenol thay đổi theo mô hình đường cong. Kết quả dò tìm từ đồ thị được giá trị TPC cao nhất đạt 17,70 mg GAE/g d.w ứng với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL, nồng độ muối 1% (sau 6 ngày lên men).

Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol của sản phẩm được thể hiện ở Bảng 4.19 cho thấy, từng nhân tố riêng lẻ (thời gian, nồng độ muối NaCl và mật số vi khuẩn) và tương tác đồng thời giữa 2 nhân tố (mật số vi khuẩn với thời gian, mật số vi khuẩn với nồng độ muối và thời gian với nồng độ muối) đều có ảnh hưởng đến TPC. Trong đó, nhân tố thời gian ảnh hưởng mạnh nhất đến TPC, mức độ ảnh hưởng 77,62%, kế đến là nhân tố mật số vi khuẩn (% ảnh hưởng là 14,69%). Trong khi đó, tương tác đồng thời giữa ba nhân tố thời gian, nồng độ muối NaCl và mật số vi khuẩn không ảnh hưởng đến TPC.

Hình 4.46 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl và mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum bổ sung vào dịch lên men đến hàm lượng polyphenol tổng số trong tỏi

Nhân tố

Trung bình bình phương

% ảnh hưởng

A: Thời gian

77,62

479,35***

B: Nồng độ muối

3,95

73,23***

C: Mật số vi khuẩn

14,69

272,08***

AxB

0,27

0,55*

AxC

0,83

1,72***

BxC

0,23

1,43***

AxBxC

0,39

0,27

Sai số

2,02

0,35

Ghi chú: P<0,001: ***; 0,001

Bảng 4.19 Tương tác giữa mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men đến hàm lượng polyphenol trong tỏi

Hàm lượng polyphenol tăng lên sau quá trình lên men có thể được giải thích là do giải phóng các hợp chất phenol đơn giản bởi acid và enzyme thủy phân. Lee et al. (2006) nghiên cứu hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của tỏi cho kết quả tỏi có khả năng chống oxy hóa cao nhất trong số 10 loại nguyên liệu rau quả trước và sau khi lên men lactic. Khi lên men cà tím

với Lactobacilus acidophilus mật số 1010 CFU/mL, TPC đạt đỉnh điểm vào ngày lên men thứ 3, cao hơn so với mẫu thí nghiệm không bổ sung vi khuẩn lactic (Ngan and Dao, 2015). Trong một nghiên cứu khác trên bắp cải lên men, dung dịch muối có nồng độ muối thấp sẽ nhanh chóng tạo nhiều acid (Breidt et al., 1995), do đó giảm pH nhanh và tăng khả năng giải phóng phenol tự do. Mặt khác trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic có thể sản xuất enzyme, xúc tác việc giải phóng các hợp chất phenol (Stechell, 2000). Lactobacillus plantarum sinh enzyme tannase và gallate decarboxylase thủy phân acid tannic thành acid gallic và glucose, làm gia tăng hàm lượng acid galic và ellagic. Enzyme feruloyl esterase trong các chủng L. plantarum chuyển hóa các hợp chất glycosid của flavol (rutin và myricitrin) thành flavol aglycone (myricetin và quercetin). Như vậy, lên men lactic làm tăng tổng hàm lượng polyphenol so với hơn nguyên liệu trước lên men.

c Flavonoid tổng số

Mô hình tương quan giữa thời gian, mật số vi khuẩn lactic và nồng độ muối được thể hiện ở phương trình 4.10. Các hệ số trong mô hình bao gồm các hệ số tuyến tính, hệ số tương tác và hệ số bậc hai. Các hệ số này đều thể hiện mức ý nghĩa p<0,05. Với giá trị F=1064,07 và giá trị P<0,0001, chứng tỏ mô hình thiết lập có ý nghĩa thống kê cao.

Phương trình tương quan 4.10 theo mức độ thực của các biến độc lập (nhân tố):

Y = -28,8776 + 0,9574 X1+ 10,0424 X2 + 2,4721 X3 + 0,0186 X1X2 -

2 – 0,8426 X2

2- 0,0643 X1

2- 0,1111 X2X3

(4.10) 0,8102 X3

Trong đó, X1 là thời gian lên men (ngày), X2 là mật số vi khuẩn (CFU/mL), X3 là nồng độ muối (%) và Y là hàm lượng flavonoid (mg QE/g d.w).

100

Mô hình tương quan xây dựng từ thí nghiệm với hệ số xác định tương quan R2=0,94, cho thấy mô hình có thể sử dụng để dự đoán hàm lượng flavonoid (mg QE/g d.w) của sản phẩm tỏi trong quá trình lên men lactic. Đồ thị bề mặt đáp ứng 3D (Hình 4.47) cho thấy khi tăng mật số vi khuẩn (từ 105 đến 107 CFU/mL) và nồng độ NaCl (từ 0,5 đến 2%) thì hàm lượng flavonoid thay đổi theo mô hình đường cong. Kết quả dò tìm từ đồ thị tìm được giá trị TFC cao nhất đạt 6,1 mg QE/g d.w ứng với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL, nồng độ muối 1% (sau 6 ngày lên men). Enzyme glucosidase, amylase, cellulase, tannase, esterase, invertase và các enzyme khác có nguồn gốc từ vi khuẩn trong quá trình lên men lactic có thể thủy phân các hợp chất glucoside. Các enzyme này đóng vai trò trong việc phá hủy thành tế bào thực vật và do

đó làm tăng hàm lượng flavonoid. Mặt khác, enzyme β-glucosidase có trong chính bản thân vi khuẩn L. plantarum cũng có thể được sử dụng để thủy phân hợp chất phenol (Stechell, 2000).

Hình 4.47 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl và mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum bổ sung vào dịch lên men đến hàm lượng flavonoid tổng số trong tỏi

Trung bình bình phương

% ảnh hưởng

Nhân tố

79,20

63,85***

A: Thời gian

3,71

8,97***

B: Nồng độ muối

11,78

28,49***

C: Mật số vi khuẩn

0,25

0,06*

AxB

2,58

0,69***

AxC

0,22

0,17***

BxC

0,36

0,03

AxBxC

1,90

0,35

Sai số

Ghi chú: P<0,001: ***; 0,001

Bảng 4.20 Tương tác giữa mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men đến hàm lượng flavonoid trong tỏi

101

Kết quả phân tích hàm lượng flavonoid một lần nữa khẳng định ưu điểm của quá trình lên men lactic tỏi sử dụng vi khuẩn Lactobacillus plantarum

(Bảng 4.20). Từng nhân tố riêng lẻ (thời gian, nồng độ muối và mật số vi khuẩn) và tương tác đồng thời giữa 2 nhân tố (thời gian và nồng độ muối, thời gian và mật số vi khuẩn, nồng độ muối và mật số vi khuẩn) đều có ảnh hưởng đến TFC. Trong đó, nhân tố thời gian ảnh hưởng mạnh nhất đến TFC, mức độ ảnh hưởng 79,20%, kế đến là nhân tố mật số vi khuẩn (% ảnh hưởng là 11,78%). Trong khi đó, tương tác đồng thời giữa ba nhân tố thời gian, nồng độ muối và mật số vi khuẩn không ảnh hưởng đến TFC.

d Thiosulfinate

Kết quả thống kê cho thấy từng nhân tố riêng lẻ (thời gian, nồng độ muối và mật số vi khuẩn), tương tác giữa hai nhân tố (thời gian với nồng độ muối, thời gian với mật số vi khuẩn và nồng độ muối với mật số vi khuẩn) và tương tác đồng thời giữa ba nhân tố trên đều ảnh hưởng đến hàm lượng thiosulfinate của sản phẩm. Trong đó, nhân tố thời gian có ảnh hưởng đến thiosulfinate nhiều nhất, mức độ ảnh hưởng 44,75%, kế đến là tương tác đồng thời giữa hai nhân tố thời gian với mật độ vi khuẩn (mức độ ảnh hưởng 27,97%) (Bảng 4.21).

Nhân tố

Trung bình bình phương

% ảnh hưởng

A: Thời gian

231,30***

44,75

3,89

B: Nồng độ muối

60,31***

4,18

C: Mật số vi khuẩn

64,81***

1,74

AxB

2,99***

27,97

AxC

48,19***

3,45

BxC

17,84***

5,52

AxBxC

3,17***

8,50

Sai số

1,24

Ghi chú: P<0,001: ***; 0,001

Bảng 4.21 Tương tác giữa mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men đến hàm lượng thiosulfinate trong tỏi

102

Mô hình tương quan giữa thời gian, mật số vi khuẩn lactic và nồng độ muối được thể hiện ở phương trình 4.11.

2 – 0,6374 X1 (4.11)

Y = 6,4499 X1+ 5,5719 X2 + 0,0743 X3X1 – 2,7345 X2

2 – 0,3527 X1X2 + 0,2069 X3X2

0,0575 X3

Trong đó, X1 là thời gian lên men (ngày), X2 là mật số vi khuẩn (CFU/mL), X3 là nồng độ muối (%) và Y là hàm lượng thiosulfinate (μmol/g d.w).

Mô hình tương quan xây dựng từ thí nghiệm với R2=0,99 cho thấy mô hình có thể sử dụng để dự đoán hàm lượng thiosulfinate của tỏi trong quá trình lên men lactic. Đồ thị bề mặt đáp ứng 3D (Hình 4.48) cho thấy khi tăng mật số vi khuẩn (từ 105 đến 107 CFU/mL) và nồng độ NaCl (từ 0,5 đến 2%) thì hàm lượng thiosulfinate thay đổi theo mô hình đường cong. Kết quả dò tìm từ đồ thị tìm được giá trị hàm lượng thiosulfinate cao nhất 18,51 μmol/g d.w ứng với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL, nồng độ muối 1% (sau 6 ngày lên men).

Hình 4.48 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl và mật số vi khuẩn Lactobacillus

plantarum bổ sung vào dịch lên men đến hàm lượng thiosulfinate trong tỏi

103

Trong quá trình lên men, tổng hàm lượng thiosulfinate trong tỏi tương đối ổn định vì có sự chuyển đổi qua lại giữa các hợp chất thiosulfinate trong tỏi lên men. Các γ-glutamyl peptide (GSAC, GSPC, GSMC) giảm đáng kể, nhưng tương ứng S-alk(en)yl-L-cysteine (cụ thể là SAC, SPC, SMC và cycloalliin) lại tăng lên nhiều trong quá trình lên men. Ngoài ra, alliin trong tỏi giảm trong quá trình lên men có thể do L. plantarum sản sinh các enzyme chuyển đổi S-alk(en)yl-L-cysteine sulfoxide thành S-alk(en)yl-L-cysteine. Mặt khác, GSPC cũng được chuyển hóa thành cycloalliin (Agarwal et al., 1977; Xiao and Parkin, 2002; Yanagita et al., 2003).

e Hoạt tính chống oxy hóa của tỏi

Từ các số liệu đã thu thập, mô hình tương quan giữa nhiệt độ và thời gian chần được xây dựng và thể hiện ở phương trình 4.12. Các hệ số trong mô hình bao gồm các hệ số tuyến tính, hệ số tương tác và hệ số bậc hai, trong đó các hệ số không có ý nghĩa có thể được lược bỏ nhằm rút gọn phương trình.

Phương trình tương quan 4.12 theo mức độ thực của các biến độc lập

(nhân tố):

2 – 0,4597 X2X3+ 0,0140 X1X3

2 – 0,3123 X1

Y = -138,9 + 5,5005 X1+ 47,2680 X2 + 10,1629 X3 – 0,1237 X1X2- 3,3572 X3 (4.12) – 3,9055 X2

Trong đó, X1 là thời gian lên men (ngày), X2 là mật số vi khuẩn (CFU/mL), X3 là nồng độ muối (%) và Y là khả năng trung hòa gốc tự do DPPH (%).

Mô hình tương quan xây dựng gồm các hệ số tuyến tính, hệ số tương tác và hệ số bậc hai, các hệ số này đều thể hiện mức ý nghĩa p<0,05. Với giá trị F=672,12 và giá trị P<0,0001, chứng tỏ mô hình thiết lập có ý nghĩa thống kê cao. Với R2=0,96, mô hình có thể sử dụng để dự đoán hoạt tính chống oxy hóa của tỏi trong quá trình lên men lactic. Đồ thị biểu diễn Hình 4.49 cho thấy khi mật số vi khuẩn tăng từ 105 đến 107 CFU/mL và nồng độ NaCl từ 0,5 đến 2% thì hoạt tính chống oxy hóa thay đổi theo mô hình đường cong. Theo kết quả dò tìm từ đồ thị, khả năng trung hòa gốc tự do đạt 25,13% ứng với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL, nồng độ muối 1% (sau 6 ngày lên men). Khả năng chống oxy hóa trong tỏi có liên quan phần lớn đến các hợp chất phenol bao gồm cả flavonoid (quercetin, kaempferol và merycitin) (Willett, 1994) và thiosulfinate (Banerjee et al., 2003). Suwannaporn et al. (2014) cũng đã chứng minh rằng tỏi muối chua có khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH cao hơn nhiều so với tỏi tươi.

104

Sự thay đổi hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số trong quá trình lên men lactic tỏi bằng vi khuẩn Lactobacillus plantarum là tiền đề cho sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa. Kết quả ghi nhận khả năng chống oxy hóa của tỏi được thể hiện ở Bảng 4.22 cho thấy, từng nhân tố riêng lẽ (thời gian, nồng độ muối NaCl và mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum) và tương tác đồng thời giữa 2 nhân tố đều có ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa. Trong đó, nhân tố thời gian ảnh hưởng mạnh đến khả năng chống oxy hóa, mức độ ảnh hưởng 77,62%, kế đến là nhân tố mật số vi khuẩn ảnh hưởng đến khả năng chống oxy là 14,69%. Trong khi đó, tương tác đồng thời giữa ba nhân tố không ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa.

Hình 4.49 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl và mật số vi khuẩn L. plantarum bổ

sung vào dịch lên men đến hoạt tính chống oxy hóa trong tỏi

Nhân tố

Trung bình bình phương

% ảnh hưởng

A: Thời gian

77,62

1007,83***

B: Nồng độ muối

3,95

153,96***

C: Mật số vi khuẩn

14,69

572,06***

AxB

0,27

1,16*

AxC

0,83

3,61***

BxC

0,23

3,00***

AxBxC

0,39

0,55

Sai số

2,02

0,73

Ghi chú: P<0,001: ***; 0,001

Bảng 4.22 Tương tác giữa mật số vi khuẩn, nồng độ muối và thời gian lên men đến khả năng chống oxy hóa của tỏi

f Giá trị cảm quan của tỏi sau lên men

105

Sau khi kết thúc lên men (8 ngày đối với các mẫu tỏi không bổ sung Lactobacillus plantarum và 6 ngày đối với các mẫu bổ sung Lactobacillus plantarum), tất cả các mẫu được đánh giá cảm quan theo thang điểm 5 (từ 1 đến 5) (Bảng 4.23).

Kết quả ở Hình 4.50 minh họa kết quả đánh giá của các thành viên đối với các mẫu tỏi sau lên men. Mẫu 13, 14, 15 và 16 có điểm số cao nhất về các chỉ tiêu màu, mùi, vị và cấu trúc. Đó là mẫu tỏi lên men với mật số vi khuẩn 107 CFU/mL và 2% muối; mẫu tỏi lên men với mật số vi khuẩn 107 CFU/mL và 1,5% muối; tỏi lên men với mật số vi khuẩn 107 CFU/mL và 1% muối; mẫu tỏi lên men với mật số vi khuẩn 107 CFU/mL và 0,5% muối. Các mẫu này được đánh giá cao nhất, kế đến là mẫu 12 (mẫu tỏi lên men với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL và 0,5% muối) và mẫu 11 (mẫu tỏi lên men với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL và 1% muối).

Mẫu

Màu

Mùi

Vị

Cấu trúc

2,36cd±0,05

2,31e±0,13

2,42bcdef±0,08

3,00gh±0,17

2,56bcd±0,13

2,56bcde±0,05

2,56bcdef±0,13

3,22defg±0,13

2,11d±0,13

2,33de±0,14

2,39dcef±0,05

2,81h±0,05

4,11a±0,10

2,44de±0,21

2,44bcdef±0,05

3,06fgh±0,10

2,31cd±0,05

2,41de±0,05

2,5bcdef±0,15

3,06fgh±0,05

2,47cd±0,26

2,45e±0,10

2,39e±0,13

3,22efg±0,25

2,59bc±0,07

2,56de±0,20

2,34f±0,14

3,24cde±0,07

2,53cd±0,13

2,53de±0,10

2,53bcdef±0,13

3,28def±0,13

2,69bc±0,13

2,53de±0,20

2,50def±0,29

3,44abc±0,08

2,67bc±0,08

2,53de±0,13

2,45ef±0,05

3,28ef±0,17

2,86b±0,71

2,58bcde±0,10

2,58bcde±0,24

3,40bcd±0,05

3,83a±0,08

2,75abc±0,17

2,58bcde±0,25

3,58a±0,05

3,78a±0,05

2,75abc±0,14

2,72abc±0,29

3,53ab±0,13

3,86a±0,13

2,81ab±0,24

2,95a±0,10

3,61a±0,22

3,89a±0,05

2,67babcd±0,17

2,69abc±0,14

3,64a±0,17

3,69a±0,10

2,89a±0,15

2,75ab±0,25

3,44abc±0,17

Ghi chú: Trong cùng một cột, những chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép thử LSD ở độ tin cậy 95%.

106

Bảng 4.23 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm tỏi lên men lactic

Trong đó: Mẫu 1: Tỏi lên men tự nhiên trong dung dịch muối 2% Mẫu 2: Tỏi lên men tự nhiên trong dung dịch muối 1,5% Mẫu 3: Tỏi lên men tự nhiên trong dung dịch muối 1% Mẫu 4: Tỏi lên men tự nhiên trong dung dịch muối 0,5% Mẫu 5: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 105 CFU/mL và 2% muối Mẫu 6: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 105 CFU/mL và 1,5% muối Mẫu 7: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 105 CFU/mL và 1 % muối Mẫu 8: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 105 CFU/mL và 0,5% muối Mẫu 9: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL và 2% muối Mẫu 10: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL và 1,5% muối Mẫu 11: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL và 1% muối Mẫu 12: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL và 0,5% muối Mẫu 13: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 107 CFU/mL và 2% muối Mẫu 14: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 107 CFU/mL và 1,5% muối Mẫu 15: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 107 CFU/mL và 1% muối Mẫu 16: Tỏi lên men với mật số vi khuẩn 107 CFU/mL và 0,5% muối

Màu Mùi Vị Cấu trúc

m ể i Đ

10 11 12 13 14 15 16

Mẫu

Hình 4.50 Kết quả đánh giá cảm quan của các thành viên đối với 16 mẫu tỏi sau lên men

107

Mặc dù mẫu tỏi lên men với mật số vi khuẩn 106 CFU/mL và bổ sung 1% muối bị đánh giá thấp, nhưng giá trị cảm quan của mẫu tỏi này vẫn ở mức chấp nhận được so với các mẫu khác. Mặt khác, hàm lượng polyphenol, flavonoid và hoạt động loại bỏ gốc tự do của mẫu tỏi này tăng nhiều hơn so với các mẫu tỏi còn lại sau quá trình lên men. Kết thúc thí nghiệm, mẫu tỏi lên men trong dung dịch có nồng độ muối NaCl 1% và mật số vi khuẩn Lactobacillus plantarum 106 CFU/mL trong 6 ngày là mẫu tỏi lên men được lựa chọn (Hình 4.51).

Hình 4.51 Mẫu tỏi lên men trong dung dịch có nồng độ muối NaCl 1%, mật số

vi khuẩn L. plantarum 106 CFU/mL sau 6 ngày

4.2.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến hoạt chất sinh học trong

quá trình lên men tỏi sử dụng vi khuẩn Lactobacillus plantarum

Sau khi chần tỏi ở nhiệt độ 80oC trong 90 giây, tiến hành quá trình lên men lactic 6 ngày trong dung dịch muối nồng độ 1%, chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum mật số 106 CFU/mL, kết hợp với bổ sung hành lá, hành tây và hành tím với tỷ lệ khối lượng khác nhau (0; 2,5; 5; 7,5; 10%) trên bề mặt tỏi (Hình 4.52).

A

B

C

Hình 4.52 Một số mẫu tỏi lên men có bổ sung hành lá (A), hành tây (B) và

hành tím (C)

a Polyphenol tổng số

108

Kết quả phân tích ở Bảng 4.24 cho thấy các nguyên liệu phụ (hành lá, hành tây và hành tím) ở các nồng độ khác nhau có ảnh hưởng tích cực đến khả năng duy trì và cải thiện hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi ở mức ý nghĩa 95% thể hiện ở hàm lượng polyphenol tổng số.

Phụ liệu

% Khối lượng

Trung bình

Hành lá

Hành tây

Hành tím

19,81*±0,58

19,81±0,58

19,81d

2,5

23,25±0,18

24,68±0,42

26,72±0,26

24,89c

24,18±0,47

24,81±0,62

27,91±0,34

25,63b

7,5

24,48±0,47

26,01±0,39

28,66±0,79

26,38a

22,45±0,44

24,98±0,4

26,47±0,50

24,63c

Trung bình

22,84c

24,06b

25,91a

Bảng 4.24 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến hàm lượng polyphenol (mg GAE/g d.w) trong tỏi lên men

Hành tím chứa nhiều dẫn xuất flavone và polyphenol như quercetin, quercetin 4’-glucoside, quercetin 7,4’-diglucoside, quercetin 3,4’-diglucoside và quercetinmono-D-glucose. Cyanidin là anthocyanin thuộc nhóm hợp chất phenol chiếm ưu thế trong hành tím và là nhóm các sắc tố tan trong nước lớn nhất trong vương quốc thực vật (Fattorusso et al., 2002). Lu et al. (2004) cũng báo cáo chiết xuất hành tím có hàm lượng polyphenol cao nhất trong số các giống hành khác nhau. Trong một nghiên cứu so sánh hàm lượng polyphenol cũng như khả năng chống oxy hóa của hành tây, hành lá và hành tím được thực hiện bởi Dima et al. (2014) cho kết quả hành tím có hàm lượng polyphenol cao nhất, do đó có khả năng chống oxy hóa cao nhất trong các loại nguyên liệu thí nghiệm. Ngoài ra, các loại thực vật chi Allium có nhiều hợp chất phenol có khả năng hòa tan trong dung môi phân cực do có khả năng hình thành liên kết hydro (Naczk, 2006).

109

Hàm lượng polyphenol trong tỏi sau khi kết thúc quá trình lên men có bổ sung các loại phụ liệu với các nồng độ khác nhau thể hiện sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê so với mẫu tỏi lên men không bổ sung hành tây, hành tím và hành lá. Kết quả phân tích thể hiện hàm lượng polyphenol tỏi lên men phụ thuộc vào loại phụ liệu và nồng độ bổ sung, giá trị trung bình nghiệm thức TPC cao nhất ở phụ liệu hành tím bổ sung với tỷ lệ 7,5 % (Hình 4.53).

Hành lá

Hành tím

Hành tây

)

w . d g / E A G g m

(

ố s g n ổ t l o n e h p y l o p g n ợ ư l

m à H

2.5

7.5

5 Tỷ lệ (%)

Hình 4.53 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến hàm lượng polyphenol

tổng số trong tỏi lên men

b Flavonoid tổng số

Hàm lượng flavonoid trong tỏi sau khi kết thúc quá trình lên men có bổ sung các loại phụ liệu với các nồng độ khác nhau thể hiện sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê so với mẫu tỏi lên men không bổ sung hành tây, hành tím và hành lá (Bảng 4.25).

Các loại rau bổ sung

Tỷ lệ (%)

Trung bình

Hành lá

Hành tây

Hành tím

7,21*±0,62

7,21±0,62

7,21d

2,5

8,14±0,63

8,89±0,44

8,44±0,60

8,49c

9,87±0,23

10,53±0,71

10,28±0,50

10,23b

7,5

9,80±0,39

12,23±0,78

10,89±0,72

10,97a

10,04±0,58

12,54±0,42

11,25±0,35

11,18a

Trung bình

9,01c

10,22a

9,61b

110

Bảng 4.25 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến hàm lượng flavonoid (mg QE/g d.w) trong tỏi lên men

Yang et al. (2004) đánh giá 10 giống hành tây và hành tím về hàm lượng polyphenol và flavonoid cho kết quả hành tím chứa hàm lượng polyphenol cao nhất, trong khi đó hành tây lại cho kết quả TFC cao nhất trong số các mẫu thử nghiệm. Trong hành tây, các hợp chất phenol được cấu thành chủ yếu bởi flavonoid như quercetin, isorhamnetin và kaempferol, trong đó quercetin chiếm ưu thế nhất (Singh et al., 2009). Chiết xuất hành lá cũng đã được báo cáo là giàu phenol. Tuy nhiên, một lượng nhỏ quercetin và kaempferol có trong lá hành nhưng không có trong các mô ở phần đầu hành, myricetin không được phát hiện trong bất kỳ mẫu hành lá nào (Bernaert et al., 2012; Stajner et al., 2003).

Hành lá

Hành tím

Hành tây

)

w d g / E Q g m

(

ố s g n ổ t d i o n o v a l f g n ợ ư l

m à H

2.5

7.5

5 Tỷ lệ (%)

Kết quả phân tích thể hiện hàm lượng flavonoid tỏi lên men phụ thuộc vào loại phụ liệu và nồng độ bổ sung, giá trị trung bình nghiệm thức TFC cao nhất ở phụ liệu hành tây bổ sung với nồng độ 7,5 hoặc 10% (không có sự khác biệt thống kê) (Hình 4.54).

Hình 4.54 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến hàm lượng flavonoid tổng

số trong tỏi lên men

c Thiosulfinate

111

Hàm lượng thiosulfinate trong tỏi sau khi kết thúc quá trình lên men có bổ sung các loại phụ liệu với các nồng độ khác nhau không thể hiện sự khác biệt ý nghĩa thống kê so với mẫu tỏi lên men không bổ sung hành tây, hành tím và hành lá (Bảng 4.26). Tỏi có hàm lượng thiosulfinate cao hơn một số thực vật chi Allium khác. Hàm lượng thiosulfinate trong tỏi cao nhất, kế đến là hành tím. Thiosulfinate trong hành tây và hành lá tương đương nhau và nhỏ hơn trong hành tím (Block et al., 1992). Ngoài ra, phần lớn các OSCs trong

thực vật chi Allium đều chỉ tan tốt trong chất béo (Noureddine and Virginia, 2007). Do đó, Hàm lượng thiosulfinate trong mẫu tỏi có bổ sung phụ liệu không thay đổi trong thời gian lên men.

% Tính theo khối lượng

Phụ liệu

Trung bình

2,5

7,5

18,63*±0,75 18,20±0,18 18,58±0,57 18,87 ±1,83 18,01±0,04 18,50a

Hành lá

18,63±0,75 18,08±0,14 18,30±0,61 17,77±1,21 18,13±0,37 18,05a

Hành tím

18,63±0,75 18,82±0,66 18,31±1,14 18,43±0,45 18,52±0,32 18,58a

Hành tây

18,63a

18,37a

18,39a

18,26a

18,22a

Trung bình

Bảng 4.26 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến hàm lượng thiosulfinate (μmol/g d.w) trong tỏi lên men

d Khả năng chống oxy hóa

112

Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của tỏi sau khi kết thúc quá trình lên men có bổ sung các loại phụ liệu với các nồng độ khác nhau thể hiện sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê so với mẫu tỏi lên men không bổ sung hành tây, hành tím và hành lá (Bảng 4.27). Hành tây, hành tím và hành lá đều có khả năng trung hòa gốc tự do DPPH cao, tuy nhiên hành tím có khả năng chống oxy hóa cao hơn so với hành lá và hành tây (Bernaert et al., 2012). Do đó, trong thời gian lên men, khả năng chống oxy hóa của các loại phụ liệu giúp bảo vệ các hợp chất sinh học trong tỏi. Mặt khác, một số chất có hoạt tính sinh học trong nguyên liệu phụ sẽ di chuyển vào dung dịch nước muối và có thể từ dung dịch nước muối ngấm vào trong các tép tỏi. Vì vậy, khả năng chống oxy hóa của tỏi được cải thiện sau 6 ngày lên men, thể hiện ở khả năng chống oxy hóa tăng cao hơn so với mẫu đối chứng không bổ sung phụ liệu. Trong các loại nguyên liệu phụ được bổ sung, khả năng chống oxy hóa của tỏi sau lên men đạt giá trị cao nhất ở mẫu tỏi bổ sung hành tím với nồng độ 7,5 hoặc 10%.

Các nguyên liệu phụ (hành lá, hành tây và hành tím) có ảnh hưởng tích cực đến khả năng duy trì và cải thiện hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi lên men lactic có bổ sung vi khuẩn L. Plantarum. Từ đó, 7,5% hành tím bổ sung vào dịch lên men có ảnh hưởng tích cực nhất đối với các chất có hoạt tính sinh học cũng như khả năng chống oxy hóa trong tỏi lên men.

% Tính theo khối lượng

Phụ

Trung bình

liệu

2,5

7,5

25,65*±0,39 29,00±1,04 31,48±0,17 33,06±1,67 31,97±0,92 30,23b

Hành lá

25,65±0,39 30,72±1,09 33,63±0,67 34,66±0,78 34,92±0,90 31,91a

Hành tím

25,65±0,39 29,24±0,51 31,92±0,43 33,84±0,04 33,05±0,38 30,74b

Hành tây

25,65d

29,65c

32,34b

33,85a

33,31a

Trung bình

Bảng 4.27 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu phụ đến khả năng trung hòa gốc tự do DPPH (%) của tỏi lên men

4.2.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến các hoạt chất sinh học

trong sản phẩm tỏi lên men lactic

a Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến các hoạt chất sinh học trong sản

phẩm tỏi lên men lactic

113

Sau 6 ngày lên men tỏi có bổ sung Lactobacillus plantarum và 7,5% hành tím trong dung dịch muối 1%, hành tím sẽ được loại bỏ, tỏi sau lên men được rửa sạch. Dịch lên men được thanh trùng ở 100°C trong thời gian 5 phút, sau đó rót nóng vào tỏi sau lên men ở 70oC. Các mẫu được bảo quản ở hai khoảng nhiệt độ khác nhau (30±2 và 5±1oC). Kết quả phân tích các hợp chất sinh học trong tỏi lên men được trình bày trong Bảng 4.28. Mẫu tỏi bảo quản ở nhiệt độ 30±2oC, TPC và TFC có khuynh hướng giảm dần từ tuần bảo quản thứ 5. Tuy nhiên hàm lượng thiosulfinate không có sự khác biệt thống kê từ tuần 1 đến tuần thứ 9. TPC, TFC và thiosulfinate trong mẫu tỏi bảo quản ở nhiệt độ 5±1oC không có sự khác biệt thống kê từ tuần 1 đến tuần thứ 9 của

quá trình bảo quản. Do đó khả năng chống oxy hóa của mẫu tỏi này cũng cao hơn mẫu tỏi bảo quản nhiệt độ phòng (30±2oC) sau 9 tuần.

TPC

TFC

Thiosulfinate

%DPPH

Thời gian (tuần)

Bảng 4.28 Hàm lượng polyphenol (mg GAE/g d.w), flavonoid (mg QE/g d.w), thiosulfinate (μmol/g d.w) và khả năng trung hòa gốc tự do DPPH (%) của tỏi lên men theo thời gian bảo quản

Tỏi bảo quản ở nhiệt độ 30±2oC

28,17a±0,52

11,64a±0,77

17,77a±1,69

34,36a±1,62

25,35ab±1,97

10,90a±1,82

17,62a±2,30

33,64a±0,70

25,33ab±3,87

7,90b±1,58

17,97a±1,10

34,43a±1,46

20,87b±0,65

7,30b±1,88

17,57a±0,37

28,92b±1,60

19,69b±5,60

5,40b±0,44

17,87a±0,83

26,28b±1,11

Tỏi bảo quản ở nhiệt độ 5±1oC

27,08a±0,95

12,10a±3,43

17,76a±0,87

34,64a±2,57

26,33a±1,53

10,50a±0,99

17,54a±0,61

33,78a±1,31

24,87a±4,43

10,33a±0,26

17,05a±0,99

33,40a±1,85

27,42a±1,34

9,27a±0,90

17,19a±1,22

33,86a±1,61

24,88a±4,43

9,28a±0,89

17,41a±0,99

33,66a±0,45

Ghi chú: Các số trung bình trong cùng một cột mang chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) theo phép thử LSD.

114

Mặt khác, cả hai mẫu tỏi bảo quản ở nhiệt độ 30±2 và 5±1oC không phát sinh về mặt vi sinh (kết quả phân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí là không phát hiện). Do đó, hàm lượng các chất sinh học cũng như khả năng chống oxy hóa của tỏi sau hơn 2 tháng bảo quản ở nhiệt độ lạnh 5±1oC ổn định hơn khi bảo quản ở nhiệt độ phòng. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Victor et al. (2012), kết hợp sử dụng quá trình lên men lactic với bảo quản ở nhiệt độ thấp cho kết quả là phương pháp tốt nhất để bảo tồn các hợp chất OSCs trong tỏi trong vòng một năm. Sayin and Alkan (2015) nghiên cứu hàm lượng

polyphenol và khả năng chống oxy hóa của tỏi vẫn được duy trì tốt sau hơn 30 ngày lên men.

b Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến giá trị cảm quan sản phẩm

Kết quả ở Hình 4.55 thể hiện kết quả đánh giá cảm quan hai mẫu tỏi bảo quản ở hai khoảng nhiệt độ (30±2 và 5±1oC) sau thời gian 9 tuần. Điểm đánh giá của các thành viên đánh giá cảm quan đối với hai mẫu tỏi là như nhau (không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê trong từng chỉ tiêu màu, mùi, vị và cấu trúc). Trong phạm vi nghiên cứu, tỏi lên men lactic vẫn duy trì chất lượng sản phẩm đến tuần thứ 9 trong điều kiện bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4-6C và giá trị cảm quan vẫn ở mức chấp nhận (Hình 4.56).

Hình 4.55 Kết quả đánh giá cảm quan tỏi lên men lactic bảo quản ở 30±2 và

5±1oC

115

Hình 4.56 Sản phẩm tỏi lên men lactic sau 9 tuần bảo quản

4.3 Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải thiện sinh khả dụng của các

hợp chất sinh học từ các sản phẩm tỏi chế biến

4.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các chất có hoạt tính

sinh học trong tỏi đen

4.3.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu tỏi đen/dung môi và loại dung môi đến các chất có hoạt tính sinh học và hoạt tính chống oxy hóa của tỏi đen

Hàm lượng polyphenol của các dịch trích thu được theo tỷ lệ nguyên liệu tỏi đen/dung môi và loại dung môi trích ly khác nhau cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) (Hình 4.57). Hàm lượng polyphenol cao nhất (7,94 mg GAE/g) thu được với dung môi ethanol 50%, tiếp theo là ethanol 100% và thấp nhất là nước (4,97 mg GAE/g) ở tỷ lệ trích ly 1/10. Hàm lượng polyphenol thu được trong dung dịch ethanol cao hơn so với nước. Điều này có thể do sự hiện diện của các tạp chất (acid hữu cơ, glucid, protein hòa tan). Tạp chất làm ảnh hưởng đến việc xác định các hợp chất phenolic. Chirinos et al. (2007) báo cáo rằng việc sử dụng nước cất như dung môi trích ly dẫn đến dịch trích ly có tỷ lệ tạp chất cao. Theo Sripad et al. (1982), hàm lượng phenolic thấp trong các loại dung môi có thể do độ hòa tan kém của polyphenol, lực liên kết hydro giữa polyphenol và protein mạnh. Türkmen et al. (2006) nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi khác nhau đến việc trích ly hợp chất phenolic từ trà đen báo cáo rằng hàm lượng polyphenol trích ly trong nước thấp hơn so với trích ly trong ethanol. Đối với cả 3 loại dung môi, tỷ lệ trích 1/5 cho thấy hàm lượng polyphenol thu được là thấp nhất; tỷ lệ trích 1/10 và 1/15 cho thấy không có sự khác biệt ý nghĩa (p>0,05).

116

Hàm lượng flavonoid tổng số thu được trong dịch trích theo tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và loại dung môi khác nhau được thể hiện trong Hình 4.58. Không có sự khác biệt ý nghĩa (p>0,05) giữa hàm lượng flavonoid thu được trong ethanol 100% và nước. Điều này có nghĩa thực vật chứa nhiều flavonoid heteroside hơn aglicone. Hàm lượng flavonoid thu được cao nhất (3,37 mg QE/g) trong dung dịch ethanol 50% ở tỷ lệ trích ly 1/10.

Nước

Ethanol 50%

Ethanol 100%

) g / E A G g m

(

l o n e h p y l o p g n ợ ư l

m à H

1/5

1/10

1/15

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Hình 4.57 Hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch tỏi đen được trích ly theo

Nước

Ethanol 50%

Ethanol 100%

) g / E Q g m

(

d i o n o v a l f g n ợ ư l

m à H

1/5

1/15

1/10 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và loại dung môi khác nhau

Hình 4.58 Hàm lượng flavonoid tổng số trong dịch tỏi đen được trích ly theo

tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và loại dung môi khác nhau

SAC là một hợp chất có hoạt tính sinh học tan trong nước được hình thành trong quá trình thủy phân γ-glutamyl-S-allylcysteine do enzyme γ- glutamyl transpeptidase. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở Hình 4.59 cho thấy hàm lượng SAC thu được trong dịch trích nước (76,0 mg/kg) cao hơn đáng kể so với so với dung dịch ethanol (50% và 100%) (62,6 mg/kg và 20,3 mg/kg, tương ứng) ở tỷ lệ trích 1/10. Dung môi ethanol không thích hợp để trích ly SAC. Tỷ lệ trích 1/5 cho thấy hàm lượng SAC thu được là thấp nhất; tỷ lệ trích 1/10 và 1/15 cho thấy không có sự khác biệt ý nghĩa (p>0,05) ở cả 3 loại dung môi.

117

Hoạt tính chống oxy hóa của dịch trích trong nước (25,2-47,4%) thấp hơn so với dung dịch ethanol (50% và 100%) (52,6-71,4% và 55,5-73,7%, tương ứng) (Hình 4.60). Tỷ lệ trích 1/5 cho thấy hoạt tính chống oxy hóa là

Nước

100

Ethanol 50%

) g k / g m

(

Ethanol 100%

C A S g n ợ ư l m à H

1/5

1/10

1/15

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

thấp nhất. Điều này có thể liên quan đến hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học có trong dịch trích tỏi đen. Tuy nhiên, mối quan hệ này không rõ ràng trong thí nghiệm này. Một số tác giả đã báo cáo rằng có mối quan hệ giữa hoạt động chống oxy hóa và hàm lượng polyphenol tổng số (Miliauskas et al., 2004; Djeridane et al., 2006), trong khi các tác giả khác không tìm thấy mối tương quan này (Bajpai et al., 2005; Ruanma et al., 2010). Hàm lượng polyphenol tổng số không đại diện cho tất cả các hợp chất chống oxy hóa trong dịch trích, điều này có thể giải thích mối liên hệ không rõ ràng giữa hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa (Tawaha et al., 2007). Khả năng chống oxy hóa phụ thuộc vào hàm lượng chất chống oxy hóa trong dịch trích, cấu trúc và sự tương tác giữa các hợp chất này (Rice-Evans et al., 1997; Bourgou et al., 2008).

Hình 4.59 Hàm lượng S-allyl cysteine trong dịch tỏi đen được trích ly theo tỷ

Nước

)

Ethanol 50%

100

Ethanol 100%

Acid gallic đối chứng

( a ó h y x o g n ố h c h n í t t ạ o H

1/5

1/10

1/15

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

lệ nguyên liệu/dung môi và loại dung môi khác nhau

Hình 4.60 Hoạt tính chống oxy hóa DPPH của dịch tỏi đen được trích ly theo

118

tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và loại dung môi khác nhau

Hàm lượng SAC được phân tích bằng phương pháp HPLC (Hình 4.61).

b. Hình 4.61 Sắc ký đồ của dung dịch SAC chuẩn (a) và SAC trong tỏi đen (b)

119

Theo nguyên tắc truyền khối mà trong đó động lực cho khối lượng chuyển khối được xem là một gradient nồng độ giữa chất rắn và dung môi. Lượng dung môi lớn có thể tạo ra một gradient nồng độ càng cao, dẫn đến tăng tốc độ khuếch tán, thúc đẩy nhanh quá trình trích ly chất rắn bằng dung môi (Cacace and Mazza, 2003; Al-Farsi and Chang, 2007). Hơn nữa, sự tiếp xúc giữa các hợp chất sinh học và dung môi càng nhiều khi gia tăng tỷ lệ dung môi làm tăng hiệu suất trích ly (Zhang et al., 2007). Tuy nhiên, hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học sẽ không tiếp tục tăng khi trạng thái cân bằng (hòa tan) diễn ra (Herodež et al., 2003).

Nhìn chung, hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi đen thu được cao theo tỷ lệ trích ly nguyên liệu/dung môi là 1/10 trong dung môi ethanol 50% (TPC và TFC lần lượt là 7,94 mg GAE/g và 3,37 mg QE/g, tương ứng).

4.3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly đến các chất có hoạt

tính sinh học trong tỏi đen

Từ các kết quả nghiên cứu thực nghiệm, các phương trình hồi quy được xây dựng dựa trên sự ảnh hưởng của nhiệt độ (X: 40-80oC) và thời gian (Y: 30-120 phút) trích ly đến hàm lượng polyphenol, flavonoid và SAC (phương trình 1, 2 và 3) với hệ số xác định R2 khá cao (R20,85). Các mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến TPC, TFC và hàm lượng SAC có thể giúp dự đoán các kết quả trong quá trình trích ly được thể hiện ở Hình 4.62, 4.63 và 4.64.

TPC (mg GAE/g) = -23,949 + 0,7 X + 0,325 Y – 0,0051 X2 – 0,0016 Y2 –

0,00106 XY (4.6) R2 = 0,85

TFC (mg QE/g) = -6,382 + 0,162 X + 0,151 Y – 0,001 X2 – 0,0007 Y2 –

0,0009 XY (4.7) R2 = 0,85

SAC = -99,151 + 2,759 X + 1,268 Y – 0,015 X2 – 0,0049 Y2 + 0,0002 XY

(4.8) R2 = 0,97

120

Theo Spigno et al. (2007), nhiệt độ trích ly ảnh hưởng đến khả năng hòa tan, tốc độ trích ly (hệ số khuếch tán) và sự ổn định của hợp chất phenol. Trong một giới hạn, nhiệt độ cao làm tăng hiệu quả trích ly do tăng cường cường độ khuếch tán và độ hòa tan của chất cần trích ly trong dung môi. Vượt quá giới hạn này, nhiệt độ trích ly cao sẽ làm giảm hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số (Ju and Howard, 2003). Gia nhiệt làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của các hợp chất; giảm độ nhớt dung dịch, tăng khả năng trích ly và thẩm thấu của dung môi vào trong tế bào (Al-Farsi and Lee, 2008). Ngoài ra, Mohamad et al. (2010) báo cáo rằng nhiệt độ cao có thể làm giảm các rào cản tế bào do sự suy yếu của thành và màng tế bào tạo điều kiện cho dung môi dễ dàng tiếp xúc với các hợp chất, làm tăng khả năng trích ly. Thời gian ảnh hưởng đến khả năng trích ly các hoạt chất. Thời gian trích ly ngắn, các hợp chất sinh học không được trích ly hoàn toàn. Ngược lại, thời gian quá dài, một số hợp chất sinh học sẽ bị oxy hóa, chất lượng và số lượng các hoạt chất sẽ giảm. Bởi vì hầu hết các hoạt chất sinh học nhạy cảm với nhiệt độ cao, giữ chúng trong thời gian dài sẽ dẫn đến sự phân hủy sẽ diễn ra.

Tóm lại, khả năng trích ly các hợp chất sinh học trong tỏi đen cao nhất ở

nhiệt độ 60oC trong khoảng 90 phút.

Hình 4.62 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hàm lượng

polyphenol trong dịch tỏi đen

Hình 4.63 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hàm lượng

flavonoid trong dịch tỏi đen

Hình 4.64 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hàm lượng SAC

121

trong dịch tỏi đen

4.3.2 Đặc trưng và tính chất của hệ nano tỏi đen

4.3.2.1 Hình thái và kích thước

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

Các ảnh FE-SEM cho thấy hạt nano tỏi đen được chế tạo ở các tỷ lệ khác nhau đều có hình dạng gần với hình cầu, kích thước nằm trong khoảng 60-80 nm và ít kết tụ (Hình 4.65). Riêng Hình 4.65a thể hiện hình thái của tỏi đen khi chưa được nano hóa, các hợp chất tạo thành khối không có hình dạng xác định và kích thước khá lớn. Kết quả trình bày trong Bảng 4.29 cho thấy sự phân bố kích thước của hệ nano tỏi đen cho thấy kích thước hạt trung bình là 109-178 nm, tất cả đều phân tán tốt (100%). Đường kính đo được trong DLS là đường kính thủy động lực học nên kết quả là kích thước lớn hơn hạt được đo bằng kính hiển vi điện tử quét. Kích thước hạt nhỏ (< 200 nm) có thể đảm bảo làm tăng tính thấm qua thành mạch, mức độ thấp hơn sự hấp thu của hệ thống lưới nội mô và nâng cao tỷ lệ sử dụng vật liệu bọc (Lu et al., 2014). Do đó, phạm vi kích thước của hệ nano tỏi đen được chuẩn bị trong nghiên cứu này là hoàn toàn phù hợp trong thử nghiệm in vivo.

Hình 4.65 Ảnh FE-SEM của hệ dịch tỏi đen (a) và hệ nano tỏi đen tỷ lệ dịch

trích/dung dịch alginate là 1/1 (b), 2/1 (c), 3/1 (d), 1/2 (e), 1/3 (f).

4.3.2.2 Sự phân bố hạt và điện thế zeta

122

Khi dấu điện tích của các hạt giống nhau có thể đẩy nhau, với alginate có kích thước đủ nhỏ và tỷ trọng thấp trong hệ treo, điện thế zeta cao sẽ làm ổn định bởi vì sự phân tán sẽ chống lại sự kết tụ (Sou, 2011). Sự phân bố điện thế

zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở các tỷ lệ (Hình 4.66, 4.67, 4.68, 4.69 và 4.70) cho thấy giá trị điện thế zeta trong khoảng 11,0-22,5 mV. Từ những kết quả này có thể suy luận rằng hệ treo hạt nano tỏi đen mang điện tích âm với kích thước hạt nhỏ và điện thế zeta khá cao là một sự phân tán tương đối ổn định.

Bảng 4.29 Sự phân bố cỡ hạt và điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate khác nhau

1/1 2/1 3/1 1/2 1/3

Tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate

100 100 100 100 100

Phân bố cỡ hạt bởi cường độ (%) (165nm) (109nm) (137nm) (178nm) (144nm)

100 100 100 100 100

Phân bố cỡ hạt bởi số lượng (%) (165nm) (109nm) (137nm) (178nm) (144nm)

100 100 100 100 100

Phân bố cỡ hạt bởi thể tích (%) (165nm) (109nm) (137nm) (178nm) (144nm)

-12,1 -22,5 -15,1 -11,0 -14,4 Điện thế zeta (mV)

Hình 4.66 Điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch

123

trích/dung dịch alginate là 1/1

Hình 4.67 Điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch

trích/dung dịch alginate là 2/1

Hình 4.68 Điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch

trích/dung dịch alginate là 3/1

Hình 4.69 Điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch

124

trích/dung dịch alginate là 1/2

Hình 4.70 Điện thế zeta của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch

trích/dung dịch alginate là 1/3

4.3.2.3 Phổ FT-IR

Việc xác định các hợp chất bằng cách sử dụng phổ hồng ngoại dựa trên sự tồn tại tần số đặc trưng của nhóm chức, chúng có cùng một giá trị gần như nhau bất kể hợp chất có nhóm chức năng nào khác xuất hiện trong đó. Sự khác biệt về quang phổ hồng ngoại của chúng chủ yếu do khác biệt về cường độ hấp thụ. Kết quả phổ hồng ngoại của tỏi đen, alginate và hệ nano tỏi đen được thể hiện ở Hình 4.71, 4.72 và 4.73. Dựa vào các đỉnh phổ cho thấy các liên kết mới được hình thành trong các hợp chất mới (hệ nano tỏi đen) đều là những liên kết có mặt trong các hợp chất ban đầu (tỏi đen và alginate). Do đó, quá trình nano hóa tạo hệ nano tỏi đen không làm xuất hiện các đỉnh dao động mới mà chỉ có sự dịch chuyển về số sóng liên quan đến các liên kết đặc trưng đó. Điều này minh chứng cho việc không có liên kết hóa học mới nào được hình thành, khẳng định hơn nữa rằng các hợp chất và vật liệu alginate được kết hợp thông qua các tương tác vật lý chứ không phải là các phản ứng hóa học.

125

Kết quả trình bày ở Hình 4.71, 4.72 và 4.73 cho thấy một dải rộng lớn các liên kết hydro trong nhóm –OH xuất hiện tại 3.200-3.500 cm-1. Các dải chính (như nhóm đại diện cho nhóm –OH) tại 3.395-3.417 cm-1 là do chức năng chứa oxy. Nhóm –CH được thể hiện tại đỉnh 2.927-2.936 cm-1. Các dải hấp thụ đặc trưng giữa 4.000 và 2.500 cm-1 là 3.480-3.440, 3.260-3270 và 2.960-2.878 cm-1 đặc trưng cho vùng mở rộng của nhóm –OH, -NH và –CH, tương ứng. Các dải hấp thụ xung quanh 1.636-1.640, 1.413-1.431, 1.153- 1.155, 1.048-1.080 và 1.013-1.024 cm-1 là sự góp mặt của các nhóm C=C, CH, CN, CO, C-O-C và nhóm C-C, tương ứng. Các dải hấp thụ đặc trưng khác xuất hiện ở 915-931, 852-859, 762-770 và 566-578 cm-1 là do sự dao động mở

trang

)

4 7 . 5 5 8

9 1 . 2 6 7

1 7 . 9 2 9

e c n a tt i

9 2 . 0 4 6 1

2 3 . 6 7 5

m s n a r T %

8 7 . 3 1 4 1

8 8 . 7 2 9 2

( n ề y u r t n ẫ d ộ Đ

9 7 . 3 5 1 61 1 . 9 7 0 1

7 8 . 6 1 4 3

1 4 . 4 2 0 1

15 4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

Wav enumbers ( cm- 1)

Số sóng (cm-1)

rộng của toàn bộ vòng anhydroglucose. Điều này cho thấy các melanoidin được hình thành trong tỏi đen gồm các nhóm –OH, -CH, amide I và amide III.

Alginate

)

7 3 6 3 6 1

9 7 2 5 8

7 8 5 1 7

2 9 7 2 5

5 2 5 1 9

0 9 0 7 7

6 6 9 0 2 1

1 4 4 3 3 1

5 7 1 0 9 2

6 1 6 6 5

1 8 1 3 4 1

7 4 5 7 3 1

3 4 6 3 9 2

( n ề e y c n u a tt r i m t s n n a ẫ r T d % ộ Đ

3 1 0 1 1 1

7 5 . 5 5 1 1

8 8 . 3 1 0 1

9 6 . 5 9 3 3

0 2 . 8 4 0 1

4000

3500

3000

2500

2000

1500

100 0

500

Wav enumber s (cm- 1)

Số sóng (cm-1)

Hình 4.71 Phổ FT-IR của tỏi đen

126

Hình 4.72 Phổ FT-IR của alginate

bot toi

105

4 1 1 0 4

100

)

8 3 9 5 8

8 9 8 0 7

8 3 3 6 7

0 1 8 7 5

6 6 1 3 9

e c n a tt i

0 8 6 3 6 1

m s n a r T %

3 3 9 1 4 1

( n ề y u r t n ẫ d ộ Đ

3 8 7 2 9 2

0 0 5 5 1 1

2 1 0 8 0 1

9 0 3 2 0 1

4 7 7 1 4 3

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

Wav enumber s (cm-1)

Số sóng (cm-1)

Hình 4.73 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen

mau bot toi 1

4 1 . 8 5 8

)

7 1 . 2 6 7

6 7 . 1 3 9

7 3 . 8 7 5

e c n a tt i

6 1 . 2 3 6 1

1 3 . 4 8 3 1

9 6 . 1 3 9 2

( n ề y u r t n ẫ d

m s n a r T %

ộ Đ

1 7 . 1 5 1 1

5 0 . 8 7 0 1

8 5 . 7 2 0 1

0 7 . 5 0 4 3

4000

3500

3000

2500

2000

150 0

100 0

500

Wav enumbers (cm-1)

Số sóng (cm-1)

Bên cạnh đó, phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate là 1/1, 2/1, 3/1, 1/2 và 1/3 (Hình 4.74, 4.75, 4.76, 4.77 và 4.78) không có sự khác biệt ý nghĩa và cũng không có sự hình thành các đỉnh lạ.

Hình 4.74 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung

127

dịch alginate là 1/1

mau bot toi 2

5 8 . 8 5 8

0 4 . 9 2 9

)

9 1 . 3 6 7

6 8 . 8 7 5

e c n a tt i

8 8 . 5 3 6 1

8 3 . 2 3 9 2

6 3 . 4 8 3 1

( n ề y u r t n ẫ d

m s n a r T %

ộ Đ

6 3 . 1 5 1 1

9 9 . 7 7 0 1

2 8 . 8 2 0 1

7 3 . 5 8 3 3

0 4000

350 0

3000

2500

2000

1500

1000

500

Wav enumbers (cm-1)

Số sóng (cm-1)

Hình 4.75 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung

mau bot toi s o 3

0 6 . 9 5 8

3 0 . 9 2 9

)

8 2 . 3 6 7

9 9 . 6 0 7

2 4 . 6 3 2 1

0 2 . 8 7 5

7 1 . 6 3 6 1

5 3 . 4 8 3 1

0 8 . 1 1 4 1

5 0 . 2 3 9 2

( n e ề c y n a u tt i m r t s n n a r ẫ T % d ộ Đ

0 6 . 1 5 1 1

5 0 . 8 7 0 1

3 0 . 8 2 0 1

3 5 . 5 8 3 3

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

Wav enumber s (cm- 1)

Số sóng (cm-1)

dịch alginate là 2/1

Hình 4.76 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung

128

dịch alginate là 3/1

mau bot toi 4

6 9 . 8 5 8

1 4 . 9 2 9

)

5 2 . 3 6 7

7 3 . 8 7 5

2 9 . 6 3 6 1

6 3 . 4 8 3 1

1 7 . 1 3 9 2

( n e ề c y n a u tt i m r t s n n a r ẫ T % d ộ Đ

1 7 . 1 5 1 1

8 0 . 8 7 0 1

2 3 . 8 2 0 1

6 8 . 5 8 3 3

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

Wav enumbers (cm- 1)

Số sóng (cm-1)

Hình 4.77 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung

mau bot toi 5

7 0 9 5 8

)

4 3 9 2 9

3 4 2 6 7

2 1 8 7 5

8 9 5 3 6 1

6 8 6 1 4 1

0 8 1 3 9 2

( n ề e c y n u a tt i r m t s n n a ẫ r T d % ộ Đ

0 2 2 5 1 1

7 2 8 7 0 1

0 8 . 6 2 0 1

4 5 . 5 0 4 3

10 4000

350 0

3000

1500

1000

500

2500

2000

Wav enu mbers (cm- 1)

Số sóng (cm-1)

dịch alginate là 1/2

Hình 4.78 Phổ FT-IR của hệ nano tỏi đen được chế tạo ở tỷ lệ dịch trích/dung

dịch alginate là 1/3

4.3.2.4 Hiệu suất bọc thuốc (EE%)

129

Dữ liệu được trình bày trong Bảng 4.30 cho thấy, hiệu suất bọc thuốc tăng từ 28,2-75,1% và 33,2-82,1% đối với TPC và SAC, tương ứng, khi tăng

tỷ lệ dịch alginate. Điều này có thể do SAC và đa số TPC đều là các hợp chất ưa nước nên chúng sẽ tương tác tốt với lõi ưa nước của alginate, dẫn đến lượng hợp chất được bọc trong lõi tăng và làm tăng hiệu suất. Ngược lại, tỏi đen chứa một số flavonoid kém tan trong nước (Kim et al., 2013) nên khi tăng tỷ lệ alginate sẽ ít ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid được mang (0,234- 0,298 mg QE/mL). Ngoài ra, hiệu suất bọc thuốc quá cao sẽ làm tăng kích thước hạt, hình thái hạt không gần với hình tròn và giá trị thế zeta của hệ nano tỏi đen bị giảm, điều này sẽ dẫn đến hệ nano dễ kết tập và mất ổn định. Do vậy, từ các dữ liệu và phân tích ở trên, tỷ lệ dịch trích/dịch alginate là 2/1 dùng để chế tạo hạt nano tỏi đen được xem là thích hợp nhất và sử dụng để đánh giá hoạt tính sinh học.

Hàm lượng chất được mang

EE (%)

TPC

TFC

SAC

Tỷ lệ dịch trích/dịch alginate

(mg GAE/mL)

(mg QE/mL)

(mg/L)

1/1

28,2

4,51

33,2

1,320,021

0,2340,021

11,21,04

2/1

30,5

5,12

35,9

1,400,015

0,2920,020

13,41,25

3/1

44,3

4,63

46,8

1,570,034

0,2450,015

17,51,56

1/2

67,6

5,01

73,4

2,780,098

0,2820,019

21,31,25

1/3

75,1

5,16

82,1

2,890,055

0,2980,021

27,91,34

Bảng 4.30 Hiệu suất bọc thuốc của hệ nano tỏi đen ở tỷ lệ dịch trích/dung dịch alginate khác nhau

4.4 Hoạt tính trong thử nghiệm in-vitro và in-vivo về khả năng hấp

thu và tác dụng của các hoạt chất sinh học của hệ nano tỏi đen

4.4.1 Thử nghiệm in-vitro

4.4.1.1 Tác dụng gây độc tế bào

130

Trị liệu sử dụng dạng hạt nano là một phương pháp đang nổi lên trong điều trị ung thư và các rối loạn viêm nhiễm khác. Viện ung thư quốc gia Mỹ (The National Cancer Institute) đã công nhận công nghệ nano là một lĩnh vực đang có tiềm năng trong cuộc cách mạng y học hiện đại nhằm phát hiện, điều trị và phòng ngừa ung thư (Nair et al., 2010). Kết quả thể hiện ở Bảng 4.31 cho thấy, cả hai hệ nano tỏi đen và tỏi đen đều dương tính với các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, ngoại trừ tế bào ung thư vú. Điều này cho thấy tác dụng tích cực của hệ nano tỏi đen và tỏi đen trong điều trị bệnh ung thư ở kỹ thuật

in-vitro. Bên cạnh đó, khi nano hóa, hạt thuốc dễ tiếp xúc để tiêu diệt tế bào ung thư. Tỷ lệ ức chế các tế bào ung thư biểu mô biểu bì miệng, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư biểu mô thận khỉ và ung thư da đều tăng lên rất nhiều khi thử nghiệm bởi hệ nano tỏi đen lần lượt là 5,43-42,4%, 16,7-85,6%, 8,50- 47,8%, 10,6-36,7% và 2,98-54,3%, tương ứng. Đặc biệt, hệ nano tỏi đen có tác dụng rất tốt trong việc ức chế tế bào ung thư gan lên đến 85,6%.

Bảng 4.31 Hoạt tính trên các dòng tế bào ung thư của các tác nhân thử

Giá trị ức chế (%) trên tế bào ung thư ở nồng độ pha loãng 20 lần

Chất thử

Gan

Phổi

Vú

Biểu mô thận khỉ

Hep G2

LU-1

MCF-7

SK-Mel 2

Vero

Biểu mô biểu bì miệng KB

42,43,1

85,64,5

47,82,7

36,75,7

54,38,4

Hệ nano tỏi đen

Tỏi đen

5,430,34 16,71,8

8,500,67

10,60,9 2,980,21

Ellipticine

98,3

95,6

93,2

90,2

94,7

94,6

4.4.1.2 Hoạt tính kháng sinh

Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của các chất thử là hệ nano tỏi đen và

tỏi đen được thể hiện ở Bảng 4.32.

Bảng 4.32 Hoạt tính kháng khuẩn và nấm của hệ nano tỏi đen và tỏi đen

Chất thử

Hệ nano tỏi đen

Tỏi đen

>64

>256

>4,0

>64

Vi khuẩn gram dương

>16

>64

>256

>4,0

>256

Nồng độ ức chế 50% (g/mL) sự phát triển của vi sinh vật kiểm định

Vi khuẩn gram âm

>16

>64

Nấm

>4,0

>256

Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Lactobacillus fermentum Enterococus faecium E. Coli Pseudomonas aeruginosa Candida albicans

131

Mẫu tỏi đen không thể hiện hoạt tính đối với các dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Enterococus faecium, E. Coli và nấm Candida albicans ở nồng độ  256 g/mL. Trong khi đó, hệ nano tỏi đen đều thể hiện hoạt tính trên tất cả 7 dòng vi sinh vật thử nghiệm. Ở nồng độ 256 g/mL, hệ

nano tỏi đen đã cho hoạt tính với Staphylococcus aureus và Enterococus faecium. Tiếp theo ở nồng độ 64 g/mL và 16 g/mL đã thể hiện hoạt tính lần lượt với Lactobacillus fermentum, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus subtilis, E. Coli, Candida albicans, tương ứng.

4.4.1.3 Hoạt tính ức chế enzyme gây bệnh tiểu đường (-glucosidase) và

bệnh Alzheimer (acetylcholinesterase)

a Enzyme -glucosidase

Tiểu đường là một hội chứng trao đổi chất liên tục ảnh hưởng đến hệ thống sinh lý của cơ thể con người liên quan đến enzyme -glucosidase. Bệnh này cũng là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới, và nếu không kiểm soát, có thể đe dọa hệ thống đa phủ tạng (Zakir et al., 2008). Glucose trong máu không thể kiểm soát được biết đến là những tính năng cốt lõi trong sự khởi phát của những khó khăn bệnh tiểu đường loại 1 cũng như loại 2. Bảng 4.33 cho thấy khả năng ức chế enzyme -glucosidase ở cả hai phương pháp thử (1) và (2). Đối với phương pháp (1), hệ nano tỏi đen ức chế 33,2% cao hơn so với tỏi đen 13,4%. Bên cạnh đó, ở phương pháp (2), tỏi đen không ức chế được enzyme -glucosidase ở nồng độ  256 g/mL. Song song đó, hệ nano tỏi đen đã ức chế được nó ở nồng độ ≥ 64 g/mL.

Phương pháp (1)

Phương pháp (2)

Chất thử

Độ ức chế (%)

Giá trị IC50 (g/mL)

Hệ nano tỏi đen

33,2

>16

Tỏi đen

13,4

>256

Acabose

97,3

180

Bảng 4.33 Hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase của hệ nano tỏi đen và tỏi đen

b Enzyme acetylcholinesterase

132

Sự suy giảm nhận thức, mất trí nhớ là sự khởi đầu của bệnh mất trí nhớ và hình thức phổ biến nhất dạng bệnh Alzheimer liên quan đến AChE, là những hình thức tàn phá của sự hư hại có thể xảy ra trong quá trình lão hóa. Bệnh Alzheimer chiếm hơn 70% tất cả nguyên nhân của bệnh mất trí nhớ (Seshadri et al., 2002). Trong một thập kỷ vừa qua, số lượng ngày càng tăng các dữ liệu cho thấy yếu tố mạch máu đóng vai trò quan trọng trong bệnh Alzheimer và những người có yếu tố nguy cơ mắc bệnh tim mạch và tiền sử đột quỵ có nguy cơ mắc cao trong cả hai lú lẫn não mạch (vascular dementia)

và bệnh Alzheimer (Kivipelto et al., 2001). Kết quả thể hiện ở Bảng 4.34 cho thấy cả hai hệ nano tỏi đen và tỏi đen đều không có khả năng ức chế AChE ở nồng độ  128 g/mL.

Chất thử

Giá trị IC50 (g/mL)

Hệ nano tỏi đen

>128

Tỏi đen

>128

Doneperil

0,038

Bảng 4.34 Hoạt tính ức chế AChE của chất thử hệ nano tỏi đen và tỏi đen

4.4.2 Thử nghiệm in-vivo

4.4.2.1 Ảnh hưởng của bột hệ nano tỏi đen và tỏi đen trên glucose huyết

và sự tăng trọng của chuột

Tỏi tươi chứa rất đa dạng các hợp chất có tác dụng có lợi đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu khác nhau liên quan đến người và mô hình động vật. Đường huyết của các con chuột thí nghiệm được thể hiện trong Bảng 4.35.

Bảng 4.35 Đường huyết (mg/dL) của chuột khi sử dụng tác nhân điều trị để thử độ an toàn trong 7 ngày.

Thời gian (ngày)

Tác nhân

điều trị

Đường huyết (mg/dL)

Đối chứng

1277

1298

1289

1256

Hệ nano tỏi đen

1198

1239

12111

12210

Tỏi đen

1286

1297

1257

12711

Trọng lượng (g)

Đối chứng

26,43,2

22,52,3

23,72,2

24,32,5

Hệ nano tỏi đen

23,52,8

23,61,5

24,42,4

23,23,9

Tỏi đen

24,31,4

25,31,6

24,93,3

26,22,7

133

Đa số các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỏi có thể giúp giảm lượng đường glucose trong máu ở chuột, thỏ, chó mắc bệnh tiểu đường và làm tăng tiết

insulin trong huyết tương ở chuột bị tiểu đường (Santhosha et al., 2013). Kết quả thử nghiệm cho thấy không có sự khác biệt ý nghĩa về đường huyết và trọng lượng chuột sau thời gian 1 tuần giữa chuột được sử dụng bột hệ nano tỏi đen/tỏi đen và chuột đối chứng (uống nước cất). Ngoài ra, quan sát bằng mắt thường cho thấy các con chuột thí nghiệm vẫn bình thường, không có các biểu hiện xấu như rụng lông nhiều, lông bị vón cục, di chuyển chậm hay chết. Điều này cho thấy tác nhân điều trị là bột hệ nano tỏi đen/tỏi đen không có ảnh hưởng xấu (gây độc tính cấp) đến đường huyết và sức khỏe của chuột ở liều sử dụng 250 mg/kg trọng lượng chuột trong 7 ngày.

4.4.2.2 Khả năng hạ đường huyết của bột hệ nano tỏi đen và tỏi đen ở

chuột bị tiểu đường

Sau khi tiêm alloxan monohydrate 135 mg/kg trọng lượng chuột khoảng 1 tuần, đường huyết của nhóm chuột thử nghiệm điều trị tăng lên đáng kể (từ 124-131 đến 421-445 mg/dL) so với nhóm chuột đối chứng (uống nước cất) (130 mg/dL) (Bảng 4.36).

Đường huyết (mg/dL)

Nhóm chuột thử nghiệm

Trước khi tiêm alloxan monohydrate

Sau khi tiêm alloxan monohydrate

Nhóm đối chứng sinh lý (chuột bình thường)

1283

1305

Nhóm uống thuốc điều trị Gliclazide

1252

44543

Nhóm uống bột nano tỏi đen

1314

42137

Nhóm uống bột tỏi đen

1242

43662

Nhóm chuột bệnh (không điều trị)

1273

44164

Bảng 4.36 Đường huyết (mg/dL) của các nhóm chuột thử nghiệm trước và sau khi tiêm alloxan monohydrate 135 mg/kg trọng lượng chuột

134

Kết thúc quá trình sau 21 ngày điều trị, kết quả đường huyết của các nhóm chuột được trình bày ở Bảng 4.37. Cụ thể, nhóm chuột không uống thuốc (đối chứng) vẫn giữ được đường huyết ổn định từ 130-137 mg/dL, sức khỏe vẫn duy trì tốt. Nhóm chuột sử dụng thuốc điều trị Gliclazide cho thấy hiệu quả làm giảm đường huyết là tốt nhất từ 445 mg/dL xuống còn 167 mg/dL. Theo sau đó là nhóm chuột uống bột nano tỏi đen (từ 421 mg/dL xuống còn 195 mg/dL) và bột tỏi đen (từ 436 mg/dL xuống còn 332 mg/dL). Mặt khác, nhóm chuột bệnh (không điều trị) có dấu hiệu di chuyển chậm,

không linh hoạt, bỏ ăn, chạy sảng, chết không đồng loạt ở giai đoạn đầu và chết hoàn toàn sau 7 ngày.

Đường huyết (mg/dL)

Nhóm chuột thử nghiệm

Trước điều trị

Sau điều trị

Nhóm đối chứng sinh lý (chuột bình thường) Nhóm uống thuốc điều trị Gliclazide Nhóm uống bột nano tỏi đen Nhóm uống bột tỏi đen Nhóm chuột bệnh (không điều trị)

1377 16710 19512 33229 -

1305 44543 42137 43662 44164

Ghi chú: - chuột chết (không đo được đường huyết ở ngày 21)

135

Bảng 4.37 Đường huyết (mg/dL) của các nhóm chuột thử nghiệm trước và sau 21 ngày điều trị bằng thuốc hoặc các hoạt chất

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

Thời gian thu hoạch tỏi phù hợp (tốt nhất) trong khoảng 130 đến 135 ngày sau khi gieo. Củ tỏi được bảo quản trong bao bì vải lưới ở nhiệt độ 0oC có khả năng duy trì tốt chất lượng khoảng 6 tháng.

Trong chế biến tỏi đen, tỏi được lạnh đông -18oC trong 36 giờ có khả năng thúc đẩy làm tăng các hợp chất sinh học trong tỏi. Nhiệt độ 70oC tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chế biến tỏi đen, cụ thể hàm lượng polyphenol tăng 6,5 lần so với tỏi tươi. Hàm lượng SAC tăng lên ở mức độ cao hơn ở nhiệt độ lão hóa tương đối thấp. Sản phẩm tỏi đen có khả năng tồn trữ tốt ở nhiệt độ mát (khoảng 5oC) trong bao bì nhôm.

Đối với sản phẩm tỏi lên men, tép tỏi được chần ở nhiệt độ 80oC trong 90 giây thể hiện sự ít tổn thất các hợp chất trên. Trong quá trình lên men acid lactic, hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số, hoạt tính chống oxy hóa của tỏi tăng lên đáng kể. Trong khi đó, hàm lượng thiosulfinate giảm dần sau 6 ngày lên men trong dung dịch có nồng độ muối NaCl 1% và mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum 106 CFU/mL. Sản phẩm tỏi lên men lactic vẫn duy trì được các hợp chất sinh học (polyphenol, flavonoid và thiosulfinate) và khả năng chống oxy hóa khi được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4-6oC trong dung dịch lên men thanh trùng trong thời gian 2 tháng.

Hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học thu được cao theo tỷ lệ trích ly nguyên liệu/dung môi là 1/10 trong dung môi ethanol 50%. Bên cạnh đó, khả năng trích ly các hợp chất sinh học cao nhất ở nhiệt độ 60oC trong khoảng 90 phút. Hệ nano tỏi đen được chế tạo bởi alginate có kích cỡ hạt trong khoảng 60-80 nm và phân bố trong nước với kích thước 109-178 nm. Các hạt nano tỏi đen phân tán khá ổn định với điện thế zeta -11-22,5 mV. Hình ảnh phổ FT-IR cũng cho thấy không có sự hình thành các hợp chất mới trong quá trình chế tạo hạt nano.

136

Hệ nano tỏi đen đều dương tính và có hoạt tính vượt trội so với tỏi đen trên tế bào ung thư biểu mô biểu bì miệng, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư biểu mô thận khỉ, tế bào ung thư da và âm tính với tế bào ung thư vú. Chúng đều thể hiện hoạt tính trên tất cả 7 dòng vi sinh vật thử nghiệm. Hệ nano tỏi đen có thể ức chế enzyme -glucosidase gây bệnh tiểu đường nhưng không có tác dụng đối với AChE gây bệnh Alzheimer. Thêm vào đó, hệ nano tỏi đen có khả năng hạ đường huyết ở chuột bệnh tiểu đường từ 421 xuống còn 195 mg/dL sau 21 ngày điều trị.

5.2 Đề nghị

- Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm trong quá trình chế biến tỏi đen.

- Thay đổi nhiệt độ trong chế biến tỏi đen theo gradient.

- Chế tạo hạt nano tỏi đen bằng các phức hợp polymer nhân tạo.

137

- Thử nghiệm ở kỹ thuật in-situ và ex-vivo về hoạt tính của hệ nano tỏi đen.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Abu-Ghannam, N. and A. Jaiswal, 2015. Blanching as a treatment process: Effect on polyphenols and antioxidant capacity of cabbage. In: Preedy V. (ed.), Processing and impact on active components in food (pp. 35-43). Elsevier/Academic Press, Amsterdam, Netherlands.

Acosta, E., 2009. Bioavailability of nanoparticles in nutrient and nutraceutical

delivery. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 14: 3-15.

Agarwal, R.K., H.A. Dewar, D.J. Newell and B. Das, 1977. Controlled trial of the effect of cycloalliin on the fibrinolytic activity of venous blood. Atherosclerosis, 27: 347–351.

food microstructure?. Journal of Food

Aguilera, J.M., 2005. Why Engineering, 67: 3-11.

Aguilera, J.M. and P.J. Lillford, 2008. Structure–property relationships in foods’, in Aguilera , J. and Lillford , P. J. (eds), Food Materials Science: Principles and Practice , New York: Springer, pp. 229-253.

Al-Farsi, M.A. and Y.L. Chang, 2007. Optimization of phenolics and dietary

fiber extraction from date seeds. Food Chemistry, 108: 977-985.

Amagase, H. 2006. Clarifying the real bioactive constituents of garlic. The

Journal of Nutrition. 136, 716s–725s.

Amagase, H. and J.A. Milner, 1993. Impact of various sources of garlic and their constituents on 7,12-dimethylbenz[a]anthracene binding to mammary cell DNA. Carcinogenesis, 14(8): 1627-1631.

Amagase, H., B.L. Petesch, H. Matsuura, S. Kasuga, and Y. Itakura, 2001. Intake of garlic and its bioactive components The Journal of Nutrition, 131(3s): 955S-962S.

Ankit P., P.B Nigel, and B. Francis, 2011. Stability and degradation kinetics of bioactive compounds and colour in strawberry jam during storage. Food and Bioprocess Technology, 4(7): 1245–1252.

Anonymous, 2009. Small is beautiful (global nanotechnology food market

forecast). Food and Drink International, February, 19-21.

138

Antonio, C., M. Alfredo, H.S. Antonio and R. Luis, 1998. Lactic acid fermentation and storage of blanched garlic. International Journal of Food Microbiology, 39: 205-211.

Arzanlou, M. and S. Bohlooli, 2010. Inhibition of streptolysin O by allicin–an active component of garlic. Journal of Medical Microbiology, 59: 1044- 1049.

Bae, S.E., S.Y. Cho, Y.D. Won, S.H. Lee, and H.J. Park, 2012. A comparative study of the different analytical methods for analysis of S-allyl cysteine in black garlic by HPLC. LWT - Food Science and Technology, 46: 532-535.

Bae, S.E., S.Y. Cho, Y.D. Won, S.H. Lee, and H.J. Park, 2014. Changes in S- allyl cysteine contents and physicochemical properties of black garlic during heat treatment. LWT - Food Science and Technology, 55(1): 397- 402.

Bajpai, M., A. Pande, S.K. Tewari, and D. Prakash, 2005. Phenolic contents and antioxidant activity of some food and medicinal plants. International Journal of Food Science, 56(4): 287–291.

Banerjee, S.K., P.K. Mukherjee, and S.K. Maulik, 2003. Garlic as an antioxidant: the good, the bad and the ugly. Phytotherapy Research, 17: 97-106.

Benavides, G.A., G.L. Squadrito, and R.W. Mills, 2007. Hydrogen sulfide mediates the vasoactivity of garlic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(46): 17977-82.

Bernaert, N., D. Paepe, C. Bouten, H. Clercq, D. Stewart, E. Bockstaele, M. Loose and B. Droogenbroeck, 2012. Antioxidant capacity, total phenolic and ascorbate content as a function of the genetic diversity of leek (Allium ampeloprasum var. porrum). Food Chemistry, 134: 669–677.

Block, E., 1985. The chemistry of garlic and onions. Scientific American

Journal, 252: 114–119.

Block, E., 1992. The organosulfur chemistry of the genus Allium: Implications

for the organic chemistry of sulfur. Food Chemistry, 31: 135-1178.

Block, E. 2010. Garlic and other Alliums: the lore and the science. Royal

Society of Chemistry. 1st Edition., UK. 480 pp.

Blois, M.S., 1958. Antioxidant determination by the use of a stable free

radical. Nature, 181:1199-1200.

Borek, C., 2001. Antioxidant health effects of aged garlic extract. Journal of

Nutrition, 131: 1010S-1015S.

Borek, C., 2006. Garlic reduces dementia and heartdisease risk. Journal of

139

Nutrition, 136: 810S-812S.

Bourgou, S., R. Ksouri, A. Bellila, I. Skandrani, H. Falleh, and B. Marzouk, 2008. Phenolic composition and biological activities of Tunisian Nigella sativa L. shoots and roots. Comptes Rendus Biologies, 331: 48–55.

Brand-Williams, W., M.E. Cuvelier, and C. Berset, 1995. Use of free radical method to evaluate antioxidant activity. The Journal of Science and Technology, 28: 25-30.

Breidt, F., K.A. Crowley and H.P. Fleming, 1995. Controlling cabbage fermentations with nisin and nisin resistant Leuconostoc mesenteroides. Food Microbiology, 12: 109–116.

Brennan, J.G. and A.S. Grandison, 2012. Food Processing Handbook-Vol.1-

2nd. Wiley-VCH Verlag and Co. KGaA, Germany. 789 pp.

Brewster, J.L. and H.D. Rabinowitch, 1990. Garlic agronomy.

In: Rabinowitch, H.D. and Brewster, J.L. (eds) Onions and Allied Crops, Vol. 3. CRC Press, Boca Raton, Florida, pp. 147–157.

Buckenhuskes, H., H.A. Jensen, R. Andersson, A.G. Fernandez, and M. Rodrigo, 1990. Fermented vegetables. In: Zeuthen, P., Cheftel, J.C., Eriksson, C., Gormley, T.R., Linko, P., Paulus, K. (Eds.), Processing and Quality of Foods, vol. 2. Food Biotechnology: Avenues to Healthy and Nutritious Products. Elsevier, London.

Cacace, J.E. and G. Mazza, 2003. Optimization of extraction of anthocyannins from black currants with aqueous ethanol. Journal of Food Science, 68(1): 240–248.

Cantwell, I.M., J. Kang, and G. Hong, 2003. Heat treatments control sprouting and rooting of garlic cloves. Postharvest Biology and Technology, 30: 57- 65.

Cardelle-Cobas, A., F.J. Moreno, N. Corzo, A. Olano, and M. Villamiel, 2005. Assessment of initial stages of Maillard reaction in dehydrated onion and garlic samples. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 9078- 9082.

Casado, F.J., A. Lopez, L. Rejano, A.H. Sanchez, and A. Montano, 2004. Nutritional composition of commercial pickled garlic. European Food Research and Technology, 219: 355-359.

140

Chandan, R., B. Sanchita, N. Nilima and B. Sauryya, 2015. Influence of blanching on antioxidant and antimicrobial activitives of raw garlic (Allium sativum L.). American Journal of Pharmaceutical Sciences, 2: 1071-1076.

Chaudhry, Q., M. Scotter, J. Blackburn, B. Ross, A. Boxall, L. Castle, R. Watkins, 2008. Applications and implications of nanotechnologies for the food sector. Food Additives and Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure and Risk Assessment, 25(3): 241- 258.

Chirinos, R., H. Rogez, D. Campos, R. Pedreschi, and Y. Larondelle, 2007. Optimization of extraction conditions of antioxidant phenolic compounds from mashua (Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pavon) tubers. Separation and Purification Technology, 55: 217–225.

Choi, D.J., S.J. Lee, M.J. Kang, H.S. Cho, N.J. Sung, and J.H. Shin, 2008. Physicochemical characteristics of black garlic (Allium sativum L.). Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, 37(4): 465- 471.

Choi, I.S., H.S. Cha, and Y.S. Lee, 2014. Physicochemical and Antioxidant

Properties of Black Garlic. Molecules, 19: 16811-16823.

Choi, S.T., R.N. Bae, D.S. Chung, and S.K. Lee, 2004. Effects of storage conditions on postharvest qualities in garlic bulbs (Allium sativum L.). Hort Science, 39(4): 805.

Choi, Y., S.M. Lee, J. Chun, H.B. Lee, and J. Lee, 2006. Influence of heat treatment on the antioxidant activities and polyphenolic compounds of shiitake (Lentinus edodes) mushroom. Food Chemistry, 99: 381-387.

Chumyama, A., K. Whangchai, J. Jungklang, B. Faiyue, and K. Saengnil, 2013. Effects of heat treatments on antioxidant capacity and total phenolic content of four cultivars of purple skin eggplants. Science Asia, 39: 246- 251.

Constantinescu, L. D. and D. Enescu, 1985. Cutremurele din Vrancea in cadu stiintific si technologic. Romanian Academy Publishing House, 226-230.

Corzo-Martinez, M., N. Corso, and M. Villamiel, 2007. Biological properties of onions and garlic. Trends in Food Science and Technology, 18: 609-625.

Cos, P., A.J. Vlietinc, B.D. Vanden, and L. Maes, 2006. Anti-infective potential of nature products: How to develop a stronger in vitro ‘proof-of- concept’. Journal of Ethnopharmacology, 106(3): 290-302.

141

Croci, C.A., J.A. Argüello, and G.A. Orioli, 1987. Effect of gamma rays on seed cloves of garlic (Allium sativum L.) at post-harvest: Reversion by exogenous growth regulators. Environmental and Experimental Botany, 27(1): 1-5.

applications foods, and in

Daeschel, M.A. and I.F. Nes, 1995. Lactobacillus plantarum: physiology, genetics in Food Biotechnology Microorganisms, Hui, Y.H. and Khachatourians, G.G., Eds., VCH Publishers, New York, 1995, chap. 21, pp. 721-743.

Damodaran, S., 1996. Functional properties’, in Nakai , S. and Modler , H. W. (eds), Food Proteins: Properties and Characterization , New York: Wiley- VCH, pp. 167-234.

D'Ayala, G.G., M. Malinconico, and P. Laurienzo, 2008. Marine derived polysaccharides for biomedical applications: chemical modification approaches. Molecules, 13: 2069–106.

De Castro, A., A. Montaño, A.H. Sánchez, and L. Rejano. 1998. Lactic acid fermentation and storage of blanched garlic. International Journal of Food Microbiology, 39(3): 205-211.

De Castro, C.L. and B. Mitchell, 2002. Nanoparticles from mechanical attrition’, in Baraton , M. -I. (ed.), Synthesis, Functionalization and Surface Treatment of Nanoparticles, Valencia, CA: American Scientific Publishers, pp. 1-15.

De La, C.M. and H.S. Garcia, 2007. Garlic: postharvest operations. Instituto and Food Engineering

Tecnologico de Veracruz. Agricultural Technologies Service.

Del Castillo, M.D., J.M. Ames, and M.H. Gordon, 2002a. Effects of roasting on the antioxidant activity of coffee brews. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: 3698-3703.

Delgado-Andrade, C., J.A. Rufian-Henares, and F.J. Morales, 2005. Assessing the antioxidant activity of melanoidins from coffee brews by different antioxidant methods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 7832-7836.

Dewanto, V., X. Wu, K.K. Adam, and R.H. Liu, 2002. Thermal processing enhances the nutritional value of tomatoes by increasing total antioxidant activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: 3010-3014.

142

Dima, M., F.T.S. Anne, P. Emmanuel, H. Tayssir, N. Nancy, F. Christine, F. Xavier and C. Farid, 2014. Chemical composition, antibacterial and antioxidant activities of six essentials oils from the Alliaceae family. Journal of Agricultural and Food Chemistry,19: 20034-20053.

Dimakuo, C.P., S.N. Kiokias, I.V. Tsaprouni, and V. Oreopoulou, 2007. Effect of processing and storage parameters on the oxidative deterioration of oil- in-water emulsions. Food Biophysics, 2: 38-45.

Djeridane, A., M. Yousfi, B. Nadjemi, D. Boutassouna, P. Stocker, and N. Vidal, 2006. Antioxidant activity of some Algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds. Food Chemistry, 97: 654–660.

Durak, İ.; K. Mustafa, A. Bilal, A. Aslıhan, D. Erdinç; Ö. Hanefi, and H. Serdar, 2004. Effects of garlic extract consumption on blood lipid and oxidant/antioxidant parameters in humans with high blood cholesterol. The Journal of Nutritional Biochemistry, 15(6): 373-377.

Đào Văn Minh, 2015. Nghiên cứu sản xuất tỏi đen từ nguồn tỏi tía Bắc Giang.

Đề tài cấp cơ sở Viện Nghiên cứu Phát triển Vùng.

Ellman, G.L., K.D. Courtney, V. Andres, and R.M. Featherstone, 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology, 7: 88-95.

Fante, L., C. Pelayo and N. Zapata, 2012. Enzyme inactivation kinetics and colour changes in garlic (Allium sativum L.) blanching under different conditions. Journal of Food Engineering, 108: 436-443.

Fante, L. and C.P.Z. Noreña, 2015. Quality of hot air dried and freeze-dried of garlic (Allium sativum L.). Journal of Food Science and Technology, 52(1): 211-220.

Farag, R.S., Y. Ghali, and M.M. Rashed, 1982. Linoleic acid oxidation catalyzed by Amadori compounds in aqueous media. Canadian Institute of Food Science and Technology Journal, 15: 174-179.

Farhang, B., 2007. Nanotechnology and lipids. Lipid Technology, 19: 132-135.

Farsi, M. A. and C. Y. Lee, 2008. Nutrition and functional properties of dates.

Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 10: 877-946.

Fattorusso, E., M. Iorizzi, V. Lanzotti and O.S. Taglialatela, 2002. Chemical composition of shallot (Allium ascalonicum Hort.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: 5686-5690.

Fellows, P. 2000. Food Processing Technology: Principles and Practice-2nd.

Woodhead Publishing Limited, England. 571 pp.

143

Francisco, M.L.L.D. and A.V.A. Resurreccion, 2009. Total phenolics and antioxidant capacity of heat-treated peanut skins. Journal of Food Composition and Analysis, 22: 16-24.

Franz, H. and H. Greger, 2000. Testing of antifungal natural products: and Assay Choice.

Methodologies, Comparability of Results Phytochemical analysis, 11: 137-147.

Friedman, M., 1996. Food browning and its prevention: An overview. Journal

of Agricultural and Food Chemistry, 44: 631-653.

Garro, A. and E. Gasull, 2010. Characterization of polyphenol oxidase from 2 peach (Prunus persica L.) varieties grown in Argentina. Food Science Biotechnology, 19(3): 627–632.

George, M. and T.E. Abraham, 2006. Polyionic hydrocolloids for the intestinal delivery of protein drugs: alginate and chitosan - a review. Journal of Controlled Release, 114: 1-14.

Geraldine, R.M., N.d.F.F. Soares, D.A. Botrel, and L. de Almeida Gonçalves, 2008. Characterization and effect of edible coatings on minimally processed garlic quality. Carbohydrate Polymers, 72(3): 403-409.

Gilliland, S.E. and M.L. Speck, 1977. Antagonistic action of Lactobacillus acidophilus towards intestinal and food-born pathogens in associative cultures. Journal of Food Protection, 40: 820-823.

Goh, C.H., P.W.S. Heng, and L.W. Chan, 2012. Alginates as a useful natural applications. for microencapsulation therapeutic and

polymer Carbohydrate Polymers, 88: 1–12.

Gombotz, W.R. and S.F. Wee, 1998. Protein release from alginate matrices.

Advanced Drug Delivery Reviews, 31: 267–85.

Gorinstein, S., H. Leontowicz, M. Leontowicz, J. Drzewiecki, K. Najman, E. Katrich, D. Barasch, K. Yamamoto, and S. Trakhtenberg, 2006. Raw and boiled garlic enhances plasma antioxidant activity and improves plasma lipid metabolism in cholesterol fed-rats. Life Sciences, 78: 655-663.

Guan, X. and H. Yao, 2008. Optimization of Viscozyme L. assisted extraction of oat bran protein using response surface methodology. Food Chemistry, 106: 345-351.

Guerard, F. and M.T. Suyama-Martinez, 2003. Antioxidant effect of protein hydrolysates in the reaction with glucose. Journal of the American Oil Chemists' Society, 80: 467-470.

144

Guihua, X., Y. Xingquian, C. Jiachu, and L. Donghong, 2007. Effect of heat treatment on the phenolic compounds and antioxidant capacity of citrus peel extract. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55: 330-335.

Haimin, C., X. Yan, W. Lin, L. Zheng, and W. Zhang, 2004. A New Method to Marine

for Screening a-Glucosidase Inhibitors and Application Microorganisms. Pharmaceutical Biology, 42(6): 416–421.

Hakamata, W., M. Kurihara, H. Okuda, T. Nishio, and T. Oku, 2009. Design and screening strategies for alpha-glucosidase inhibitors based on enzymological information. Current Topics in Medicinal Chemistry, 9(1): 3-12.

Hardenburg, R.E., A.E. Watada, and C.Y. Wang, 1986. The commercial storage of fruits, vegetables, and florist and nursery stocks. U.S. Dept. Agric. Hdbk. 66, Washington, D.C.

Herodež, Š.S., M. Hadolin, M. Škerget, and Z. Knez, 2003. Solvent extraction study of antioxidants from Melissa officinalis L. leaves. Food Chemistry, 80: 275-282.

Higami, M., S. Ueno, T. Segawa, K. Iwanami and K. Sato, 2003. Simultaneous synchrotron radiation X-ray diffraction – DSC analysis of melting and crystallization behaviour of trilauroylglycerol in nanoparticles of oil-in-water emulsion. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 80: 731-739.

Hồ Huy Cường (chủ nhiệm), 2013. Nghiên cứu phục tráng giống tỏi ở Lý Sơn. Cơ quan chủ trì đề tài: Viện KHKT Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ. Mã số: 05/2009/HĐ-ĐTKHCN.

Huang, R. Y., Wang, Y. J., Sheen, L. Y., and Chou, C. C., 2010. Storage temperature and packaging condition affect the total phenolic content and antioxidant activity of black soybeans and koji. International Journal of Food Sience and Technology, 45(3): 437-443.

Ichikawa, M., N. Ide, and K. Ono, 2006. Changes in organosulfur compounds in garlic cloves during storage. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(13): 4849-4854.

Idah, P.A., J.J. Musa, and S.T. Olaleye, 2010. Effect of temperature and drying time on some nutritional quality parameters of dried tomatoes. AU Journal of Technology, 14(1): 25-32.

145

Ide, N., H.S.L. Benjamin, R. Kenjiro, M. Hitomichi, and I. Yoichi, 1999. Antioxidant effects of fructosyl arginine, a Maillard reaction product in aged garlic extract. The Journal of Nutritional Biochemistry, 10: 372-376.

Iglesias-Enriquez, I. and R. Fraga, 1998. Envase y forma de almacenamiento adecuado para la conservacio´n poscosecha del ajo irradiado y sin irradiar. Alimentaria, 295: 91-96.

Imai, J., N. Ide, S. Nagae, T. Moriguchi, H. Matsuura, and Y. Itakura, 1994. Antioxidant and radical scavenging effects of aged garlic extract and its constituents. Planta Medica, 60: 417-420.

Jaiswal, A.K., 2012. Kinetic evaluation of colour, texture, polyphenols and antioxidant capacity of Irish York cabbage after blanching treatment. Food Chemistry, 131(1): 63-72.

Jang, E.K., J.H. Seo, and S.P. Lee, 2008. Physiological activity and antioxidative effects of aged black garlic (Allium sativum L.) extract. Korean Journal of Food Science and Technology, 40: 443-448.

Jani, P., G.W. Halbert, J. Langridge, and A.T. Florence, 1990. Nanoparticle uptake by the rat gastrointestinal mucosa: quantitation and particle size dependency. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 42: 821-826.

Jeong, S.M., S.Y. Kim, D.R. Kim, S.C. Jo, K.C. Nam, D.U. Ahn, and S.C. Lee, 2004. Effect of heat treatment on the antioxidant activity of extracts from citrus peels. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(11): 3389-3393.

Jones, W. and R.J. Goebel, 2001. Garlic and Health. In Watson RR. Vegetables, Fruits, and Herbs in Health Promotion. Boca Raton: CRC Press. 205-216.

Ju, Z.Y. and L.R. Howard, 2003. Effects of solvent and temperature on pressurized liquid extraction of anthocyanins and total phenolics from dried red grape skin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(18): 5207–5213.

Kang, M.J., S.J. Lee, J.H. Shin, S.K. Kang, J.G. Kim, and N.J. Sung, 2008. Effect of garlic with different processing on lipid metabolism in 1% cholesterol fed rats. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, 37: 162-169.

activity of enzyme

146

Karthikeyan, E., M.A. Ali, M. Elumalai, K. Eluri, and S. Srinivasan, 2015. Acetylcholinesterase some novel inhibitor pyrazinamide condensed 1,2,3,4-tetrahydropyrimidines. Biotechnology Reports, 5: 1-6.

Kasuga, S., N. Uda, E. Kyo, M. Ushijima, N. Morihara, and Y. Itakura, 2001. Pharmacologic activities of aged garlic extract in comparison with other garlic preparations. Journal of Nutrition, 131: 1080S-1084S.

Katsube, T., Y. Tsurunaga, Y. Sugiyama, M. Furuno, and T. Yamazaki, 2009. Effects of air-drying temperature on antioxidant capacity and stability of polyphenolic compounds in mulberry leaves. Food Chemistry, 113: 964- 969.

Kelley, E., S.M. Morris Jr., and T.R. Billiar, 1995. Nitric oxide, sepsis, and arginine metabolism. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, 19: 234- 238.

Khotimchenko, Y.S., V.V. Kovalev, O.V. Savchenko, and O.A. Ziganshina, 2001. Physical chemical properties, physiological activity, and usage of alginates, the polysaccharides of brown algae. Russian Journal of Marine Biology, 27: S53–64.

Kim, H.K., K.S. Jo, D.Y. Kwon, and M.H. Park, 1992. Effects of drying temperature and sulfiting on the qualities of dried garlic slices. Journal of the Korean Chemical Society, 35: 6-9.

Kim, J.H., S.H. Nam, C.W. Rico, and M.Y.A. Kang, 2012. A comparative study on the antioxidative and antiallergic activities of fresh and aged black garlic extracts. International Journal of Food Science and Technology, 47(6): 1176-1182.

Kim, J.S., O.J. Kang, and O.C. Gweon, 2013. Comparison of phenolic acids and flavonoids in black garlic at different thermal processing steps. Journal of Functional Foods, 5(1): 80-86.

Kim, M.R., J.H. Yun, and E.K. Mo, 1993. Change of pungency in pickled

garlic during storage. Food Quality and Preference, 4(1-2): 104-104.

Kim, S.H., E.Y. Jung, D.H. Kang, U.J. Chang, Y.H. Hong, and H.J. Suh, 2012. Physical stability, antioxidative properties, and photoprotective effects of a functionalized formulation containing black garlic extract. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 117: 104-110.

Kim, Y.M., M.H. Wang, and H.I. Rhee, 2004. A novel a-glucosidase inhibitor

from pine bark. Carbohydrate Research, 339: 715–717.

147

Kinalski, T. and C.P.Z. Norena, 2014. Effect of blanching treatments on antioxidant activity and thiosulfinate degradation of garlic (Allium sativum L.). Food and Bioprocess Technology, 7(7): 2152-2157.

Kivipelto, M., E.L. Helkala, T. Hanninen, M.P. Laakso, M. Hallikainen, K. Alhainen, H. Soininen, J. Tuomilehto, and A. Nissinen, 2001. Midlife vascular risk factors and Alzheimer’s disease in later life: Longitudinal, population based study. British Medical Journal, 322: 1447-1451.

Koch, H.P. and L.D. Lawson, 1996. Garlic: The science and therapeutic application of Allium sativum L. and relative species. Willinam & Wikins. pp. 135-212.

Kodera, Y., A. Suzuki, O. Imada, S. Kasuga, I. Sumioka, and A. Kanezawa, 2002. Physical, chemical and biological properties of S-allylcysteine, an amino acid derived from garlic. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 30: 622-632.

Kwon, O.C., K.S. Woo, T.M. Kim, D.J. Kim, J.T. Hong, and H.S. Jeong, 2006. Physicochemical characteristics of garlic (Allium sativum) on the high temperature and pressure treatment. Korean Journal of Food Science and Technology, 38: 331-336.

Lawless, H.T. and H. Heymann, 2010. Sensory Evaluation of Food: Principles

and Practices. 2003. Second Edition. Springer. 620 pp.

Lawson, L.D. and B.G. Hughes, 1992. Characterization of the formation of allicin and other thiosulfinates from garlic. Planta Medica, 58: 345-350.

Lawson, L.D., S.G. Wood, and B.G. Hughes, 1991. HPLC analysis of allicin and other thiosulfinates in garlic clove homogenates. Planta Medica, 57: 263-270.

Lee, H.Y., J.H. Park, S.H. Seok, M.W. Baek, D.J. Kim and K.E. Lee, 2006. Human originated bacteria, Lactobacillus rhamnosus PL60, produce conjugated linoleic acid and show anti-obesity effects in diet-induced obese mice. Biochimica et Biophysica Acta Molecular and Cell Biology of Lipids, 1761(7): 736-744.

Lee, K.Y. and D.J. Mooney, 2012. Alginate: properties and biomedical

applications. Progress in Polymer Science. Elsevier. UK. pp 106–26.

Leong, S.Y. and I. Oey, 2012. Effects of processing on anthocyanins, carotenoids and vitamin C in summer fruits and vegetables. Food Chemistry, 133(4), 1577-1587.

148

Lesmes, U., J. Barchechath, and E. Shimoni, 2008. Continuous dual feed homogenization for the production of starch inclusion complexes for

controlled release of nutrients. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 9: 507-515.

Lethuaut, L., F. Me Tro, and C. Genot, 2002. Effect of droplet size on lipid oxidation rates of oil-in-water emulsions stabilized by protein. Journal of the American Oil Chemists’ Society , 79: 425-430.

Li, J. and P. Yao, 2009. Self-assembly of ibuprofen and bovine serum albumin–dextran conjugates leading to efficient loading of the drug. Langmuir, 25(11): 6385-6391.

Li, J., S. Yu, P. Yao, and M. Jiang, 2008. Lysozyme–dextran core–shell

nanogels prepared by a green process. Langmuir, 24(7): 3486-3492.

Li, Y., S.Y. Xu, and D.W. Sun, 2007. Preparation of garlic powder with high allicin content by using combined microwave–vacuum and vacuum drying as well as microencapsulation. Journal of Food Engineering, 83: 76–83.

Lin, C.H. and C.Y. Chang, 2005. Textural change and antioxidant properties of broccoli under different cooking treatment. Food Chemistry Journal, 90: 9-15.

Linkov, I. and J. Steevens, 2008. Nanomaterials: Risks and Benefit – NATO Science for Peace and Security Series C: Environmental Security, Dordrecht, Netherlands: Springer.

Litaiem, J., T. Amira, C. Saber and Z. Fethi, 2013. Impact of Infra-red drying temperature on total phenolic andflavonoid contents, on ntioxidant and antibacterial activities of ginger. Journal of Environmental Science, 6: 2319-2399.

Lu, H.F., C.C. Sue, C.S. Yu, S.C. Chen, G.W. Chen and J.G. Chung, 2004. Diallyl disulfide (DADS) induced apoptosis undergo caspase-3 activity in human bladder cancer T24 cells. Food and Chemical Toxicology, 42: 1543-1552.

Lu, Q., P.M. Lu, J.H. Piao, X.L. Xu, J. Chen, L. Zhu, and J.G. Jiang, 2014. Preparation and physicochemical characteristics of an allicin nanoliposome and its release behavior. LWT - Food Science and Technology, 57(2): 686- 695.

149

Luciane, F. and C.P.Z. Cacciano, 2012. Enzyme inactivation kinetics and colour changes in garlic (Allium sativum L.) blanched under different conditions. Journal of Food Engineering, 108: 436–443.

Lyons, J.M., D. Graham, and J.K. Raison, 1979. Low-temperature stress in

crop plants: The role of the membrane, Elsevier, New York.

Majewski, M., 2014. Allium sativum: Facts and myths regarding human

health. Rocz Panstw Zakl Hig, 65(1): 1-8.

Malawista, S.E., R.R. Montgomery, and G. van Blaricom, 1992. Evidence for in killing staphylococci by human intermediates

reactive nitrogen neutrophil cytoplasts. Journal of Clinical Investigation, 90: 631-636.

Malone, M.E., I.A.M. Appelqvist, and I.T. Norton, 2003. Oral behaviour of food hydrocolloids and emulsions. Part 2. Taste and aroma release. Food Hydrocolloids, 17: 775-784.

Manzocco, L., S. Calligaris, D. Mastrocola, M.C. Nicoli, and C.R. Lerici, 2000. Review of non-enzymatic browning and antioxidant capacity in processed foods. Trends in Food Science and Technology, 11: 340-346. Mazza, G., 2002. Functional foods: biochemical and processing aspects. CRC

Press, Boca Raton.

McClements, D.J., 2009. Structural design principals for improved food performance: nanolaminated biopolymer structures in foods’, in Huang , Q. , Given , P. and Qian , M. (eds), Micro/Nanoencapsulation of Active Food Ingredients , Valencia, CA: American Chemical Society, pp. 3-34.

McClements, D.J., 2010. Design of nano-laminated coatings to control bioavailability of lipophilic food components. Journal of Food Science, 75(1): R30-R42.

Mehta, B.M., A. Kamal-Eldin, and R.Z. Iwanski, 2012. Fermentation effects

on food properties. Taylor & Francis Group, LLC, USA. 401 pp.

Miedema, P., 1994. Bulb dormancy in onion. I. The effects of temperature and cultivar on sprouting and rooting. Journal of Horticultural Science, 69: 29- 39.

Milad, F., M.R. Mozafari, and M. Mohebbi, 2012. Nanoencapsulation of food ingredients using lipid based delivery systems. Trends in Food Science and Technology, 23: 13-27.

150

Miliauskas, G., P.R. Vensjutonis, and T.A. Van Beek, 2004. Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts. Food Chemistry, 85: 23–237.

Minguez-Mosquera, M.I., J. Garrido-Fernandez, and B. Gandul-Rojas, 1989. Pigment changes in olives during fermentation and brine storage. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 37: 8-11.

Mizobutsi, G.P., F.L. Finger., R. Ribeiro, R. Uschmann, L. Neves and W. Mota, 2010. Effect of pH and temperature on peroxidase and polyphenol oxidase activities of litchi pericarp. Journal of the Science of Food and Agriculture, 67: 213-217.

Mohamad, M., M.W. Ali, and A. Ahmad, 2010. Modelling for extraction of major phytochemical components from Eurycoma longifolia. Journal of Applied Sciences, 10: 2572-2577.

Muhammad A., O. Mahmoudreza, S.S. Shyam, and R. Barbara, 2013. Predicting the quality of pasteurized vegetables using kinetic models: a review. International Journal of Food Science, Volume 2013: 29 pp.

Murtaza, G., A. Waseem, R. Nisar ur, and I. Hussain, 2011. Alginate microparticles for biodelivery: a review. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5: 2726–37.

Naczk, M. and F. Shahidi, 2006. Phenolics in cereals, fruits and vegetables: occurrence, extraction and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41: 1523–1542.

Nair, H.B., B. Sung, V.R. Yadav, R. Kannappan, M.M. Chaturvedi, and B.B. Aggarwal, 2010. Delivery of antiinflammatory nutraceuticals by nanoparticles for the prevention and treatment of cancer. Biochemical Pharmacology, 80(12): 1833-1843.

Narlikar, A.V. and Y.Y. Fu, 2010. The Oxford Handbook of Nanoscience and

Technology, New York: Oxford University Press.

National Research Council (NRC), 2006. A Matter of Size: Triennial Review of the National Nanotechnology Initiative, Washington: The National Academies Press.

Nayak, B., J.D.J. Berrios, J.R. Powers, J. Tang, and Y. Ji, 2011. Colored potatoes (Solanum Tuberosum) dried for antioxidant-rich value-added foods. Journal of Food Processing and Preservation, 35: 571-580.

151

Naznin, M.T., M. Akagawa, K. Okukawa, T. Maeda, and N. Morita, 2008. Characterization of E- and Z-Ajoene obtained from different varieties of garlics. Food Chemistry, 106: 1113-1119.

Nencini, C., A. Menchiari, and G.G. Franchi, 2011. In vitro antioxidant activity of aged extracts of some Italian Allium species. Plant Foods for Human Nutrition, 1: 11–16.

Neves, V.A., D.G. Picchi and M.A. Silva, 2009. Some biochemical properties of polyphenol oxidase from spearmint (Mentha arvensis). Brazilian Archives of Biology and Technology, 52: 1001–1010.

Ngan, N.T and D.T.A. Dao, 2015. Investigating the effect of ratio Lactobacilus acidophillus to the antioxidant of fermented eggplant (Solanum melongena). Journal of Food and Nutrition Sciences, 3(1-2): 140-142.

Nguyễn Đức Vượng, Lê Thị Bạch Liên, Trần Thị Bích Ngọc, Từ Thị Mỹ Hường, Đinh Xuân Lãm, 2015. Nghiên cứu lên men tỏi đen từ tỏi trắng xã Quảng Hòa – Quảng Trạch – Quảng Bình. Tạp chí Thông tin Khoa học và Công nghệ Quảng Bình, Số 1/2015: 56-59.

Nguyễn Đức Vượng, Nguyễn Mậu Thành, Nguyễn Đức Minh, 2017. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình lên men tỏi đen từ tỏi trắng. Tạp chí Thông tin Khoa học và Công nghệ Quảng Bình, Số 3/2017: 88-92.

Nguyễn Minh Thủy, Dương Thị Phượng Liên, Nhan Minh Trí, Nguyễn Chí Linh. 2013. Kỹ thuật sau thu hoạch nông sản. Nhà xuất bản Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Thị Lại Giang và Trần Thanh Hà, 2013. Giáo trình Thiết kế và sản xuất bao bì. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 318 trang.

Nguyễn Thị Tình, Đinh Thị Kim Hoa, Phạm Bằng Phương, Tạ Thị Lượng, Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Sinh Huỳnh, Kiều Thị Thu Hương, Ngô Xuân Bình, 2019. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tỏi đen từ giống tỏi bản địa Đồng Mu Cao Bằng. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên, 194(01): 67-74.

Nguyễn Trọng Tài và Nguyễn Viết Trung, 2014. Nghiên cứu tác dụng chống ung thư gan bởi dịch chiết tỏi đen và S-allyl-L-cystein phân lập từ tỏi đen. Y học Việt Nam, tháng 6 (2): 34-37.

Nicoli, M.C., M. Anes, M.T. Parpinel, and S. Franceschi, 1999. Influence of the antioxidant properties of fruits and vegetables.

152

processing on International Journal of Food Science and Technology, 10: 94-100.

Nicoli, M.C., M. Anese, L. Manzocco, and C.R. Lerici, 1997. Antioxidant properties of coffee brews in relation to the roasting degree. Food Science and Technology-Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie, 30: 292-297.

Noureddine, B. and Virginia, 2007. Allium Thiosulfinates: chemistry, biological properties and their potential utilization in food preservation. Food, 1(2): 193-201.

Nuevo, P.A. and O.K. Bautista, 2001. Morpho-anatomical features and postharvest changes in garlic (Allium sativum) harvested at different maturities. Acta Horticulturae, 555: 195–206.

Oakenfull, D., D. Pearce, and R.W. Burley, 1997. Protein gelation’, in Damodaran , S. and Paraf , A. (eds), Food Proteins and their Applications , New York: Marcel Dekker, pp. 111-142.

Oliver, C.M., R.A. Stanley, and L.D. Melton, 2006. Creating proteins with novel functionality via the Maillard reaction - a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 46: 337-350.

Olmsted, S.S., J.L. Padgett, A.I. Yudin, K.J. Whaley, T.R. Moench, and R.A. Cone, 2001. Diffusion of macromolecules and virus-like particles in human cervical mucus. Biophysical Journal, 81: 1930-1937.

Orlov, N.P., I.Y. Kutlina, and O.Y. Didenko, 1991. Changes in chemical composition of onion and garlic during fermentation. Tovarovedenie, 24: 27-29.

Pan, X., P. Yao, and M. Jiang, 2007. Simultaneous nanoparticle formation and encapsulation driven by hydrophobic interaction of casein- graft -dextran and β –carotene. Journal of Colloid and Interface Science, 315: 456-463.

Park, J.H., Y.K. Park, and E. Park, 2009. Antioxidative and antigenotoxic effects of garlic (Allium sativum L.) prepared by different processing methods. Plant Foods for Human Nutrition, 4: 244–249.

Park, S.H., S.H. Kim, H.S. Kim, Y.K. Jung, Y.R. Kim, and H.Y. Lee, 2010. Research of S-allyl-(L)-cysteine content changes in aged garlic. In Proceedings of the 2010 ASABE annual international meeting. Pittsburgh, USA. pp. 4506-4512.

153

Paul, C., M. Louis, S. Jean-Bosco, J.V. Arnold, and V.B. Dirk, 2005 . Bioassay for antibacterial and antifungal activities. Laboratory for Microbiology, Parasitology and Hygien, Faculty of Pharmaceutical,

Biomedical and Veterinary Sciences, University of Antwerp, Belgium: 1- 13.

Pawar, S.N. and K.J. Edgar, 2012. Alginate derivatization: a review of

chemistry, properties and applications. Biomaterials, 33: 3279–305.

Pederson, C.S. 1960. Sauerkraut. In: Chichester, C.O., E.M. Mrak and G.F. Stewart (Editors). Advances in Food research. Academic Press, NewYork, 233-291.

Phạm Xuân Phong, 2015. Tỏi đen có tác dụng dự phòng ung thư trên mô hình

ung thư gan người thực nghiệm. Y học Việt Nam, tháng 5 (2): 39-42.

Phạm Xuân Phong và Hồ Anh Sơn, 2015a. Nghiên cứu tác dụng gây chết tế bào theo chương trình của tỏi đen trên dòng tế bào ung thư đại tràng. Y học Việt Nam, tháng 4 (1): 4-8.

Phạm Xuân Phong và Hồ Anh Sơn, 2015b. Nghiên cứu tác dụng ức chế ung thư của tỏi đen trên chuột mang khối ung thư gan người. Y học Việt Nam, tháng 4 (2): 14-17.

Phan, V.A., Y.C. Liao, N. Antille, L. Sagalowicz, F. Robert, and N. Godinot, 2008. Delayed volatile compound release properties of self-assembly structures in emulsions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(3): 1072-1077.

Põldma, P., T. Tõnutare, A. Viitak, A. Luik, and U. Moor, 2011. Effect of selenium treatment on mineral nutrition, bulb size, and antioxidant properties of garlic (Allium sativum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(10): 5498–5503.

Polinati, R.M., A.L.K. Faller, and E. Fialho, 2010. The effect of freezing at - 18oC and -70oC with and without ascorbic acid on the stability of antioxidant in extracts of apple and orange fruits. International Journal of Food Science and Technology, 45(9): 1814-1820.

Prasad, K., V.A. Laxdal, M. Yu and B.L. Raney, 1996. Evaluation of hydroxyl

radical-scavenging property of garlic. Biochemistry, 154: 55–63.

Price, R.J. and J.S. Lee, 1970. Inhibition of Pseudomonas species by hydrogen peroxide producing lactobacilli. Journal of Milk and Food Technology, 33: 13-17.

154

Priecina, L. and D. Karlina, 2013. Total polyphenol, flavonoid content and antiradical activity of celery, dill, parsley. Onion and garlic dried in

convective and microwave-vacuum dryers. International Conference on Nutrition and Food Sciences IPCBEE.

Queiroz, Y.S., E.Y. Ishimoto, D.H.M. Bastos, G.R. Sampaio, and E.A.F.S. Torres, 2009. Garlic (Allium sativum L.) and ready-to-eat garlic products: In vitro antioxidant activity. Food Chemistry, 115(1): 371-374.

Rahman, K., 2003. Garlic and aging: New insights into an old remedy. Ageing

Research Reviews, 2: 39-56.

Rajesh Kumar, K.C. and S. Yu, 2010. Effects of harvesting stages on weight loss and sprouting of garlic bulbs stored at room-temperature. Horticulture NCHU, 35(3): 81-93.

Ramani, V. and U. Kant, 1989. Phenolics and enzymes involved in phenol metabolism of gall and normal tissues of Prosopis cineraria, Proceedings of the National Academy of Sciences, 5: 417-420.

Rejano, L., H. Antonio, A. Montano and A. Castro, 2007. Kinetics of heat penetration and textural changes in garlic during blanching. Journal of Food Engineering, 2: 465-471.

Rice-Evans, C.A., J. Sampson, P.M. BramLey, and D.E. Holloway, 1997. Why do we expect carotenoids to be antioxidants in vivo? Free Radical Research, 26: 381–398.

Ried, K., O.R. Frank, and N.P. Stocks, 2010. Aged garlic extract lowers blood treated but uncontrolled hypertension: a in patients with

pressure randomised controlled trial. Maturitas, 67(2): 144-150.

Rodríguez, H., J.A. Curiel, J.M. Landete, B. de las Rivas, F.L. de Felipe, C. Gomez-Cordoves, J.M. Mancheno, and R. Munoz, 2009. Food phenolics and lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, 132: 79-90.

Roy, M.K., L.R. Juneja, S. Isobe, and T. Tsushida, 2009. Steam processed broccoli (Brassica oleracea) has higher antioxidant activity in chemical and cellular assay systems. Food Chemistry, 114(1): 263-269.

Ruanma, K., L. Shank, and G. Chairote, 2010. Phenolic content and antioxidant properties of green chilli paste and its ingredients. Maejo International Journal of Science and Technology, 2: 193–200.

155

Rutherford, P.P. and R. Whittle, 1982. The carbohydrate composition of onions during long term cold storage. ournal of Horticultural Science, 57 (3): 349-356.

Ryu, K., N. Ide, H. Matsuura, and Y. Itakura, 2001. N--(1-Deoxy-D-Fructos- 1-yl)-L-Arginine, an antioxidant compound identified in aged garlic extract. Journal of Nutrition, 131(Suppl. 1): 972S-976S.

Salmah, Y. and V. Kalaivani, 1994. Effect of processing techniques on the quality and acceptability of young carambola (Averrhoa carambola) fruit pickle. Pertanika Journal of Tropical Agricultural Science, 17(3): 201- 208.

Saltzman, W.M., M.L. Radomsky, K.J. Whaley, and R.A. Cone, 1994. Antibody diffusion in human cervical mucus. Biophysical Journal, 66: 508–515.

Sanchez-Gomez, A.H., P. Garcia Garcia, and L. Rejano Navarro, 2006.

Elaboration of table olives. Grasas y Aceites, 57: 86-94.

Sanguansri, P. and M.A. Augustin, 2006. Nanoscale materials development - a foodindustry perspective. Trends in Food Science & Technology, 17: 547- 556.

Santhosha, S.G., P. Jamuna, and S.N. Prabhavathi, 2013. Bioactive components of garlic and their physiological role in health maintenance: A review. Food Bioscience, 3(0): 59-74.

Sariri, R., A. Aliakbar, G.B. Mesdarghi, and A. Rezazadeh, 2002. Spectrophotometer assay of allicin in Iranian garlic products. Asian Journal of Chemistry, 14(3-4): 1197-1202.

Sayin, F.K. and S.B. Alkan,2015. The effect of pickling on total phenolic contents and antioxidant activity of 10 vegetables. Journal of Food and Health Science, 1(3): 135-141.

Scudiero, D.A., R.H. Shoemaker, D.P. Kenneth, A. Monks, S. Tierney, T.H. Nofziger, M.J. Currens, D. Seniff, and M.R. Boyd, 1988. Evaluation of a soluable tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Reseach, 48: 4827- 4833.

Selen, A. and H. Nilgün, 2012. Effects of preharvest and postharvest treatments on the storage life and quality of garlic. GIDA, 37(4): 227-234.

156

Seshadri, S., A. Beiser, J. Selhub, P.F. Jacques, I.H. Rosenberg, R.B. D’Agostino, P.W. Wilson, and P.A. Wolf, 2002. Plasma homocysteine as a risk factor for dementia and Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine, 346: 476-483.

Shaikh, J., D.D. Ankola, V. Beniwal, D. Singh, and M.N. Kumar, 2009. Nanoparticle encapsulation improves oral bioavailability of curcumin by at least 9-fold when compared to curcumin administered with piperine as absorption enhancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 37: 223-230.

Shela, G., L. Hanna, L. Maria, J. Namiesnik, K. Najman, J. Drzewiecki, M. Cvikrová, L. Martincová, E. Katrich and S. Trakhtenberg, 2008. Comparison of the main bioactive compounds and antioxidant activities in garlic and white and red onions after treatment protocols. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56: 4418-4426.

Shi, J., C.T. Ho, and F. Shahidi, 2005. Asian functional foods. CRC Press,

Boca Raton.

Shilpa, A., S.S. Agrawal, and A.R. Ray, 2003. Controlled delivery of drugs from alginate matrix. Journal of Macromolecular Science: Part C: Polymer Reviews, 43: 187–221.

Shilpi, G., C. Sabrina and A. Nissreen, 2011. Effect of different drying temperatures on the moisture and phytochemical constituents of Edible Irish Brown Seaweed. Food Science and Technology, 5: 1266–1272.

Shimada, K., H. Okada, K. Matsuo, and S. Yoshioka, 1996. Involvement of chelating action and viscosity in the antioxidative effect of xanthan in an oil/water emulsion. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 60: 125- 127.

Shin, J.H., D.J. Choi, S.J. Lee, J.Y. Cha, J.G. Kim, and N.J. Sung, 2008. Changes of physicochemical components and antioxidant activity of garlic during its processing. Life Sciences, 18: 1123-1131.

Shivhare, U.S., M. Gupta, S. Basu and G.S.V. Raghavan, 2009. Optimization of blanching process for carrots. Journal of Food Process Engineering, 32(4): 587–605.

Shuford, J.A., J.M. Steckelberg, and R. Patel, 2005. Effects of fresh garlic extract on Candida albicans biofilms". Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49(1): 473.

Simonetti, G. and S. Schuler, ed, 1990. Simon and Schuster's Guide to Herbs

and Spices. Simon and Schuster, Inc. pp 256.

157

Singh, B.N., B.R. Singh, L. Singh, D. Prakash, D.P. Singh, B.K. Sarma, G. from various and B. Singh, 2009. Polyphenolics Upadhyay

extracts/fractions of red onion (Allium cepa) peel with potent antioxidant and antimutagenic activities. Food and Chemical Toxicology, 47: 1161– 1167.

Somoza, V., 2005. Review: Five years of research on health risks and benefits of Maillard reaction products: An update. Molecular Nutrition & Food Research, 49: 663-672.

Sripad, G., V. Prakash, and M.S.N. Rao, 1982. Extrability of polyphenols of sunflower seed in various solvents. Journal of Biosciences, 4: 145–152.

Somman, A. and S. Napa, 2015. Comparison of antioxidant activity and tyrosinase inhibition in fresh and processed white radish, garlic and ginger. Journal of Food Measurement and Characterization, 9(3): 369–374

Sou, K., 2011. Electrostatics of carboxylated anionic vesicles for improving entrapment capacity. Chemistry and Physics of Lipids, 164(3): 211-215.

Sovová, M. and P. Sova, 2004. Pharmaceutical importance of Allium sativum L. 5. Hypolipemic effects in vitro and in vivo. Ceska Slov Farm, 53(3): 117-23.

Sozer, N. and J.L. Kokini, 2009. Nanotechnology and its applications in the

food sector. Trends in Biotechnology, 27(2): 82-89.

Spigno, G., L. Tramelli, and D.M. De Faveri, 2007. Effects of extraction time, temperature, and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics. Journal of Food Engineering, 81: 200–208.

Stajner, D., M. Marino and J.B. Canadanovic, 2003. Screening for antioxidant properties of leeks, Allium sphaerocephalon L. Journal of Herbs Spices, 10: 75–82.

Stechell, K.D.R., 2000. Absorption and metabolism of soy isoflavones from food to dietary supplements and adults to infants. The Journal of Nutrition, 130: 654–655.

Suwannaporn, B., S. Sunisa, S.W Chutha and S. Pornpong, 2014. The antioxidant and anti-cadmium toxicity properties of garlic extracts. Food Science and Nutrition, 2(6): 792–801.

158

Tawaha, K., F.Q. Alali, M. Gharaibeh, M. Mohammad, and T. El-Elimat, 2007. Antioxidant activity and total phenolic content of selected Jordanian plant species. Food Chemistry, 104(4): 1372–1378.

Taylor, A., 2009. Measurement and simulation of flavour release from foods’, in McClements , D.J. and Decker , E.A. (eds), Designing Functional Foods , Boca Raton: Woodhead, pp. 294-313.

Tenisa, K. and P.Z.N Caciano, 2014. Effect of blanching treatments on antioxidant activity and thiosulfinate degradation of garlic (Allium sativum L.). Food Bioprocess Technology, 1: 194-182.

Tim, M., 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of

Application immunological methods, 65: 55-63.

Tomsone, L., and Z. Kruma, 2014. Influence of freezing and drying on the phenol content and antioxidant activity of horseradish and lovage. In 9th Baltic Conference on Food Science and Technology “Food for Consumer Well-Being”, FOODBALT Conference Proceedings, Jelgava, 192-197.

Tønnesen, H.H. and J. Karlsen, 2002. Alginate in drug delivery systems. Drug

Development and Industrial Pharmacy, 28: 621–30.

Trần Minh Tâm, 2004. Bảo quản và chế biến nông sản sau thu hoạch, Nhà

xuất bản Nông Nghiệp, 405 trang.

Trung tâm khuyến nông – khuyến ngư Ninh Thuận, 2012. Sổ tay trồng trọt. Sở

Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Ninh Thuận.

Türkmen, N., F. Sarı, and Y.S. Velioglu, 2006. Effects of extraction solvents on concentration and antioxidant activity of black and black mate tea polyphenols determined by ferrous tartrate and Folin–Ciocalteu methods. Food Chemistry, 99: 835–841.

Turkmen, N., F. Sari, and Y.S. Velioglu, 2005. The effect of cooking methods on total phenolics and antioxidant activity of selected green vegetables. Food Chemistry, 93: 713-8.

Van Aken, G.A., M.H. Vingerhoeds, and E.H.A. De hoog, 2007. Food colloids under oral conditions. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 12: 251-262.

159

Vázquez-Barrios, M.E., G. López-Echevarría, E. Mercado-Silva, E. Castaño- Tostado, and F. León-González, 2006. Study and prediction of quality changes in garlic cv. Perla (Allium sativum L.) stored at different temperatures. Scientia Horticulturae, 108(2): 127-132.

Vega, G.A., E. Lara, V. Flores, D.K. Scala and M. Lemus, 2012. Effect of selected pretreatments on convective drying process of blueberries. Food and Bioprocess Technology, 5: 2797-2804.

Victor, M., S.A. Higinio, C. Antonio and M. Alfredo, 2012. Effect of processing and storage time on the contents of organosulfur compounds in pickled blanched garlic. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60: 3485-3491.

Vũ Bình Dương và Hồ Anh Sơn, 2015. Nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế ung thư phổi không tế bào nhỏ người in vitro của bột cao khô tỏi đen. Y học Việt Nam, tháng 3 (1): 111-115.

Vũ Bình Dương và Hồ Anh Sơn, 2016. Nghiên cứu độc tính cấp của viên nang cứng tỏi đen trên động vật thực nghiệm. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 4(4): 52-54.

Vũ Bình Dương và Nguyễn Trọng Điệp, 2014. Nghiên cứu điều chế bột cao khô tỏi đen bằng phương pháp phun sấy. Tạp chí Y - Dược học quân sự, (5):13-19.

Vũ Bình Dương và Vũ Đình Tiến, 2016. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất

lượng bột cao khô tỏi đen. Tạp chí Y - Dược học quân sự, 6: 13-18.

Vũ Đình Tiến, Vũ Bình Dương, Nguyễn Trọng Điệp, Nguyễn Văn Bạch và Phan Đình Châu, 2014. Xây dựng quy trình chiết xuất SAC từ tỏi đen. Tạp chí Y - Dược học quân sự, (1): 57-62.

Wang, Z., H. Wei, L. Jia, L. Xu, C. Zou, and J. Xie, 2012. Water-soluble adsorbent β-cyclodextrin-grafted polyethyleneimine for removing bilirubin from plasma. Transfus Apher Sciences, 47(2): 159-65.

Wang, D., Y. Feng, J. Liu, J. Yan, M. Wang, J. Sasaki, 2010. Black garlic (Allium sativum) extracts enhance the immune system. Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology, 4: 37-40.

Wang, Y. and E. Forssberg, 2007. Enhancement of energy efficiency for mechanical production of fine and ultra-fine particles in comminution. China Particuology, 5: 193-201.

Watson, R.R. and V.R. Preedy, 2010. Bioactive foods in promoting health

fruits and vegetables. Elsevier Inc, USA. 725 pp.

160

Weel, K.G.C., A.E.M. Boelrijk, J.J. Burger, M.A. Jacobs, H. Gruppen, A.G.J. Voragen, and G. Smit, 2004. Effect of emulsion properties on release of esters under static headspace, in vivo, and artificial throat conditions in

relation to sensory intensity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 6572-6577.

Wilkinson, C., G.B. Dijksterhuis, and M. Minekus, 2000. From food structure

to texture. Trends in Food Science & Technology, 11(12): 442-450.

Willett, C.W, 1994. Diet and health: what should we eat? Science, 264: 532-

537.

Wiriya, P., T. Paiboon, and S. Somchart, 2009. Effect of drying air chemical pretreatments on quality of dried and

temperature chilli. International Food Research Journal, 16(3): 441-454.

Wolfe, K., X. Wu, and L.H. Liu., 2003. Antioxidant activity of apple peels.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51:609-614.

Wolfe, K.L. and R.H. Liu, 2003. Apple peels as a value-added food ingredient.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(6): 1676-1683.

Xiao, H. and K.L. Parkin, 2002. Antioxidant functions of selected allium of sulfoxides. and Salk(en)yl-L-cysteine Journal

thiosulfinates Agricultural and Food Chemistry, 50: 2488-2493.

Xu, G., X. Ye, J. Chen, and D. Liu, 2007. Effect of heat treatment on the phenolic compounds and antioxidant capacity of citrus peel extract. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55: 330-335.

Yamaki, K. And Y. Mori, 2006. Evaluation of α-glucosidase inhibitory activity in colored foods: a trial using slope factors of regression curves. Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi. 53: 229-231.

Yanagita, T., S.Y. Han, Y.M. Wang, Y. Tsuruta, Y. and T. Anno, 2003. Cycloalliin, a cyclic sulfur amino acid, reduces serum triacylglycerol in rats. Nutrition, 19: 140–143.

Yang, J., K.J. Meyers, J.V. Heide and R.H. Liu, 2004. Varietal differences in phenolic content and antioxidant and antiproliferative activities of onions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 6787-6793.

Yang, J.S., Y.J. Xie, and W. He, 2011. Research progress on chemical

modification of alginate: a review. Carbohydr Polym, 84: 33–9.

161

Yeh, Y.Y. and L. Liu, 2001. Cholesterol-lowering effect of garlic extracts and organosulfur compounds: human and animal studies. Journal of Nutrition, 131(3s): 989S-93S.

Yin, M.C. and W.S. Cheng, 1998. Antioxidant activity of several Allium

members. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 39: 563–569.

Yoo, M., S. Lee, S. Lee, H. Seog, and D. Shin, 2010. Validation of high liquid chromatography methods for determination of in garlic bulbs. Food Science and

performance bioactive sulfur compounds Biotechnology, 19(6): 1619-1626.

Yueqing, H., J. Zhang, O. Chandrashankra, C.F. Fanny C.F., and Y. Nancy, 2013. Design, synthesis and evaluation of novel heterodimers of donepezil and huperzine fragments as acetylcholinesterase inhibitors. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 21: 676-683.

Yun, H.M., J.O. Ban, K.R. Park, C.K. Lee, H.S. Jeong, S.B. Han, and J.T. Hong, 2014. Potential therapeutic effects of functionally active compounds isolated from garlic. Pharmacology & Therapeutics, 142(2): 183-195.

Zakarova, A., J.Y. Seo, H.Y. Kim, J.H. Kim, J.H. Shin, K.M. Cho, C.H. Lee, and J.S. Kim, 2014. Garlic sprouting is associated with increased antioxidant activity and concomitant changes in the metabolite profile. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 62(8): 1875-1880.

Zakir, S., M. Sarwar, J.C. Allen, M.S. Butt, M.U. Nisa, U. Arshad, A. Javaid, 2008. Impact of sweet potato cultivars on blood glucose level in diabetic and healthy participants. International Journal of Agriculture and Biology, 10: 316-320.

Zhang, D. and Y. Hamauzu, 2004. Phenolics, ascorbic acid, carotenoids and antioxidant activity of broccoli and their changes during conventional and microwave cooking. Food Chemistry, 88(4): 503–509.

Zhang, H.Y., C.X. Hu, C.P. Liu, H.F. Li, J.S. Wang, K.L. Yuan, J.W. Tang, and G.W. Xu, 2007. Screening and analysis of bioactive compounds in traditional Chinese medicines using cell extract and gas chromatography- mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(1): 151-7.

Zhao, X.Y., Q. AO, L.W. Yang, Y.F. Yang, J.C. Sun, and G.S. Gai, 2009. Application of superfine pulverization technology in biomaterial industry. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 40: 337-343.

Zhong, Q. and M. Jin, 2009a. Zein nanoparticles produced by liquid–liquid

162

dispersion. Food Hydrocolloids, 23: 2380-2387.

Zhu, H., Wang, Y., Liu, Y., Xia, Y., and T. Tang, 2010. Analysis of flavonoids in Portulaca oleracea L. by UV–vis spectrophotometry with comparative study on different extraction technologies. Food Analytical Methods, 3(2): 90-97.

Zimmermann, H., S.G. Shirley, and U. Zimmermann, 2007. Alginate-based encapsulation of cells: past, present, and future. Current Diabetes Reports, 7: 314–20.

Zimmermann, H., F. Ehrhart, D. Zimmermann, K. Muller, A. Katsen-Globa, and M. Behringer, 2007. Hydrogel-based encapsulation of biological, functional tissue: fundamentals, technologies and applications. Applied Physics A: Materials Science & Processing, 89: 909–22.

https://www.garlicfarm.ca/garlic-bulbils.htm

163

https://www.nguoidothi.vn/vn

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

1. Đề tài Cấp cơ sở: - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chế biến tỏi đen. Đề tài cấp Trường 2015 – Đại học Cần Thơ (chủ nhiệm: Nguyễn Ái Thạch) đã nghiệm thu đạt Loại tốt. - Nghiên cứu và kiểm soát tiến trình chế biến sản phẩm tỏi lên men lactic với hàm lượng cao các chất có hoạt tính sinh học. Đề tài cấp Trường 2016 - Đại học Cần Thơ (chủ nhiệm: Nguyễn Ái Thạch) đã nghiệm thu đạt Loại tốt. 2. Tạp chí Khoa học: Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Thị Mỹ Tuyền và Võ Thị Diệu. 2016. Thay đổi đặc tính lý hóa của củ tỏi trong quá trình thuần thục và tồn trữ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 45b: 16-24. ISSN 1859-2333.

Nguyễn Ái Thạch, Lê Thái Anh Thư và Nguyễn Minh Thủy. 2016. Ảnh hưởng của quá trình chần, mật độ Lactobacillus platarum và nồng độ muối đến các hoạt chất sinh học trong sản phẩm tỏi lên men muối chua. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Chuyên đề: Nông nghiệp xanh: 161- 166. ISSN 1859–4581.

Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy. 2017. Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến các đặc tính lý hóa của sản phẩm tỏi đen. Tạp chí Hóa học, 55(4E23): 130-134. ISSN: 0866-7144.

Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy. 2017. Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến hàm lượng các hợp chất sinh học trong tỏi đen. Tạp chí Hóa học, 55(4E23): 135-139. ISSN: 0866-7144.

Nguyen Ai Thach and Nguyen Minh Thuy. 2017. Effect of extraction conditions on polyphenols, flavonoids, S-Allyl cysteine content and antioxidant activity of black garlic extract. Vietnam Journal of Science and Technology, 55(5A), 18-25. ISSN: 0866-708X.

Nguyễn Ái Thạch và Nguyễn Minh Thủy. 2018. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến các hợp chất có hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa của sản phẩm tỏi đen. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 1(86): 59-63. ISSN: 1859-1558.

xvii

Nguyen Ai Thach and Nguyen Minh Thuy. 2019. Study of synthesis and characteristics of total polyphenols, total flavonoids and S-allyl cysteine- loaded alginate nanoparticles with various black garlic extracts and alginate ratios. International Journal of Engineering Sciences and Reasearch Technology, 8(6): 261-272. ISSN: 2277-9655.

Nguyen Ai Thach, Ha Phuong Thu and Nguyen Minh Thuy. 2019. In-vitro evaluation of cytotoxicity, antimicrobial, and enzyme inhibition activity of black garlic and its nanoparticles. International Journal of Engineering Sciences and Reasearch Technology, 8(10): 59-63. ISSN: 2277-9655.

3. Sách chuyên khảo

xviii

Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy, Dương Kim Thanh và Nguyễn Thị Mỹ Tuyền. 2016. Chương 10: Kỹ thuật thu hoạch và tồn trữ củ tỏi sau thu hoạch. Sách chuyên khảo của Nguyễn Minh Thủy (Chủ biên), Nguyễn Thị Mỹ Tuyền. 2016. Bảo quản và chế biến một số loại nông sản ở đồng bằng sông Cửu Long: Kết quả và ứng dụng. NXB Đại học Cần Thơ.

PHỤ LỤC

A. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO, PHÂN TÍCH VÀ THỬ NGHIỆM

1. Độ ẩm (%): cân một lượng mẫu nhất định cho vào cốc và đem sấy đến khi khối lượng mẫu không đổi ở 105oC. Độ ẩm được xác định theo công thức:

X (%) = [(G1 – G2)/G1] x 100

Trong đó, X (%) là độ ẩm của mẫu; G1 (g) là khối lượng mẫu trước khi sấy; G2 (g) là khối lượng mẫu sau khi sấy.

2. pH: cho dung dịch cần đo vào cốc thủy tinh và nhúng đầu cực vào

giữa phần dung dịch, sau đó đọc số hiển thị trên pH kế.

3. Hàm lượng chất khô hòa tan (oBrix): dùng đũa thủy tinh chấm và nhỏ một giọt dịch cần đo vào giữa lăng kính, áp 2 lăng kính vào nhau và nhìn vào thị kính đọc hàm lượng chất khô hòa tan theo phần trăm.

4. Hàm lượng polyphenol tổng số

Trích ly tỏi: Tỏi tươi được sấy ở 60oC trong 72 giờ. Nghiền mịn (có thể cho vào bao bì kín bảo quản ở 4oC cho đến khi sử dụng) sau đó cân 50 g bột tỏi mịn phối trộn với 1000 mL nước cất và đun sôi 10 phút ở 100oC. Sau đó để nguội và đem lọc.

Thuốc thử Folin-Ciocalteu được dùng để xác định hàm lượng phenol tổng số (Wolfe et al., 2003). Phối trộn 5 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% (thuốc thử Folin-Ciocalteu pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:10 v/v) với 1 mL dịch lọc tỏi và thêm vào 4 mL Na2CO3 7,5% (75 g trong 1 lít nước cất). Đem vortex hoặc lắc mạnh trong 15 giây và để yên 30 phút ở 40oC (hoặc 60 phút tại nhiệt độ phòng). Hút 4 mL mẫu và đem đo quang phổ ở bước sóng 765 nm. Mẫu đối chứng là nước cất. Các mẫu được đánh giá tại nồng độ cuối là 100 mg/L. Hàm lượng phenol tổng số (đơn vị là mg/L) được biểu diễn là mg/g acid gallic tương đương (GAE mg/g) sử dụng phương trình đường cong hiệu chỉnh: Y = 0,0108*X (R2 = 0,9982), trong đó X là độ hấp thu và Y là acid gallic tương đương (mg/g). Sử dụng acid gallic làm đường chuẩn.

Dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định hàm lượng polyphenol tổng số có trong mẫu. Hàm lượng polyphenol tổng số được tính bằng đương lượng acid gallic (GAE) (gallic acid equivalent) có trong 1 g mẫu thử đem định lượng, theo công thức:

xix

P =

Trong đó:

P: hàm lượng polyphenol tổng (mg GAE/g)

m: khối lượng mẫu đem định lượng (g)

C: nồng độ acid gallic quy ra từ phương trình đường chuẩn (mg/mL)

V: thể tích dung dịch mẫu (mL)

k: hệ số pha loãng

5. Cường độ hô hấp (mg CO2/kg.giờ): Cân mẫu tỏi và cho vào trong các bình chứa mẫu, chuẩn bị cho quá trình đo cường độ hô hấp, sau đó làm kín bình chứa mẫu bằng kẹp lò xo. Điền các thông số cần thiết vào phần mềm (được yêu cầu) theo các bước sau:

- Số bình chứa mẫu

- Tên thí nghiệm

- Chọn I (interval) để nhập khoảng thời gian giữa 2 lần đo (2 phút)

- Chọn P (parameter) để thiết lập thông số cho từng bình chứa mẫu (sau đó chọn bình cần thiết lập).

- L (lower): giới hạn %CO2 thấp nhất cho phép trong bình chứa mẫu.

- U (uper): giới hạn %CO2 cao nhất cho phép trong bình chứa mẫu.

- Chọn W (weight): điền trọng lượng mẫu cần đo (kg).

- Chọn V (volume): điền thể tích bình chứa mẫu (Vb = 4,7 lít).

- Chọn M, sau đó chọn P để xem lại các thông số vừa điền vào.

- Chọn M lần nữa, sau đó chọn B (begin) để bắt đầu quá trình đo.

Dừng quá trình đo trong khoảng thời gian nhất định (ví dụ: 1 giờ, 2 giờ, 1 ngày theo mục đích của nghiên cứu).

R (lít CO2/kg/giờ) = [%CO2 x (Vb – Vm)]/(W x h)

Trong đó, R (lít CO2/kg. giờ) là cường độ hô hấp; Vb (lít) là thể tích bình chứa mẫu; Vm (lít) là thể tích mẫu; W (kg) là khối lượng mẫu; h (giờ) là thời gian đo hô hấp; %CO2 là %CO2 trong bình chứa mẫu tăng theo thời gian.

6. Độ cứng (g lực): chuẩn bị các mẫu có hình dạng và kích thước giống nhau và sau đó đo bằng máy đo cấu trúc (đầu đo phù hợp) theo chương trình đã cài đặt sẵn.

7. Các kích thước: đường kính củ tỏi (mm), khối lượng củ tỏi (g), số lượng tép trong củ tỏi (tép/củ tỏi), chiều dài (L) tép tỏi (mm), chiều rộng (W)

tép tỏi (mm), chiều dày (T) tép tỏi (mm), khối lượng tép tỏi (g), đường kính trung bình hình học của tép tỏi (mm), độ cầu (sphericity) của tép tỏi: đo bằng thước kẹp điện tử Caliper (Guogen, Trung Quốc).

8. Khả năng chống oxy hóa:

Thử nghiệm loại bỏ gốc tự do DPPH: hoạt động loại bỏ gốc tự do của tỏi đen được phân tích thông qua thử nghiệm loại bỏ gốc 1,1-diphenyl-2-picryl- hydrazil (DPPH) bằng cách sử dụng phương pháp của Blois (1958) với một vài điều chỉnh. Dung dịch DPPH 1 mmol/L được chuẩn bị bằng ethanol, và thêm 2 mL dung dịch DPPH vừa pha vào 2 mL dịch chiết mẫu tỏi đen ở các nồng độ khác nhau (pha bằng nước cất). Các hỗn hợp được lắc mạnh và sau đó để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó đem đi đo độ hấp thu bằng máy quang phổ ở 517 nm. Acid ascorbic được sử dụng như là mẫu đối chứng dương tính (tác dụng xác nhận mẫu thử nghiệm có phải dương tính hay không). Dung dịch DPPH không chứa mẫu tỏi được dùng như là mẫu đối chứng. Hoạt động loại bỏ gốc tự do được tính theo công thức:

Hoạt động loại bỏ gốc tự do DPPH (%) = [1-(độ hấp thu của mẫu/độ hấp thu mẫu đối chứng)] x 100.

9. Màu sắc: sử dụng phần mềm Artweaver 1.0 để lấy giá trị R, G, B từ ảnh kỹ thuật số. Sử dụng phần mềm hiệu chỉnh và chuyển đổi giá trị R, G, B sang giá trị ∆L, ∆a, ∆b (∆L là sai khác giữa mẫu đo và mẫu chuẩn).

Xác định màu của sản phẩm dựa vào hệ thống màu L, a, b.

L: biểu thị màu trắng

a: có giá trị từ -a đến +a biểu thị màu từ xanh lá cây đến đỏ

b: có giá trị từ -b đến +b biểu thị màu từ xanh da trời đến vàng

Độ khác màu E (color different) dùng để so sánh màu tiện lợi hơn

Với màu chuẩn ban đầu là Lo; ao; bo (Màu chuẩn: Lo = 97,06; ao = 0,19; bo = 1,73). Màu sản phẩm ở những giá trị khác nhau là Lt; at; bt thì ta có:

(



)

 ( a

)

 (

)

L = Lo - Lt, a = ao - at, b = bo - bt

Độ khác màu là: E =

10. Hàm lượng thiosulfinate

xxi

Phương pháp phân tích hàm lượng thiosulfinate được thực hiện theo mô tả của Sariri et al. (2002); Li et al. (2007) và được điều chỉnh bởi Kinalski and Noreña (2014). Cụ thể như sau, 1 gram tỏi được nghiền mịn trong 5 mL dd

đệm Tris (50 mM, pH 7,5). Hỗn hợp được để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để đảm bảo quá trình chuyển hóa do enzyme diễn ra hoàn toàn thành thiosulfinate, và sau đó, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc, thu được dịch trích tỏi. Tại thời điểm phân tích, dd cysteine 20 mM được chuẩn bị trong dd đệm Tris (50 mM, pH 7,5), bằng cách thêm 5 mL dung dịch cysteine vừa pha vào 1 mL dịch trích tỏi, và tiếp theo để yên 15 phút. Sau đó, hút 1 mL hỗn hợp dung dịch này pha loãng trong 100 mL nước cất, và 4,5 mL dung dịch pha loãng này được thêm vào 0,5 mL dung dịch DTNB (1,5 mM). Sau 15 phút, đo độ hấp thu (A0) tại bước sóng 412 nm (Shimadzu-1240). Mẫu đối chứng (A), 5 mL dung dịch cysteine được thêm vào 1 mL nước cất, và 1 mL hỗn hợp này được pha loãng với 100 mL nước cất. Sau đó, 4,5 mL dung dịch đã pha loãng được thêm vào 0,5 mL dung dịch DTNB (1,5 mM). Kết quả được biểu diễn theo phương trình:

mmol/g = (412 x 100)/(2 x 14150)

Trong đó, 412 = A0 – A; 14150 là hằng số hấp thu hoặc hằng số tắt (molar extinction coefficient) của 2-nitro-5-thiobenzoate, và 2 là một nửa của số lượng cysteine bị giảm, chỉ ra hàm lượng thiosulfinate.

11. Hàm lượng flavonoid tổng số

Hàm lượng flavonoid tổng số được xác định theo mô tả của Zhu et al. (2010). 0,5 mL AlCl3 2% (pha bằng nước cất, cân 3,621 g AlCl3.6H2O rồi thêm nước đến 100 mL) được thêm vào 0,5 mL dịch lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ và đo độ hấp thu tại bước sóng 415 nm. Mẫu đối chứng là nước cất. Kết quả được biểu diễn là mg/g sử dụng phương trình: Y = 0,0255.X (R2 = 0,9812); trong đó X là độ hấp thu và Y là quercetin tương đương. Sử dụng quercetin làm đường chuẩn.

Dựa vào đường chuẩn quercetin để xác định hàm lượng flavonoid tổng có trong mẫu. Hàm lượng flavonoid tổng số được tính bằng đương lượng quercetin (QE) có trong 1 g mẫu thử đem định lượng, theo công thức:

P =

Trong đó:

P: hàm lượng flavonoid tổng (mg QE/g)

m: khối lượng mẫu đem định lượng (g)

C: nồng độ quercetin quy ra từ phương trình đường chuẩn (mg/mL)

xxii

V: thể tích dung dịch mẫu (mL)

k: hệ số pha loãng

12. Hàm lượng S-allyl cysteine được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC)

Chuẩn bị mẫu

Cân 10 g tỏi xay nhuyễn cho vào bình định mức 100 mL và định mức đến vạch bằng nước cất khử ion, để yên 1 giờ ở nhiệt độ 60oC trong bể điều nhiệt. Sau đó, hỗn hợp được vortex trong 10 giây và lọc qua giấy lọc Whatman No. 1 và màng lọc có kích thước 0,45 m, thu được dung dịch sử dụng phân tích. Đường chuẩn được xây dựng thông qua chất chuẩn S-allyl-L- cysteine ( 98%, Sigma-Aldrich Co. LLC) có dạng y = 22722,6 X – 2223,8 (R2 = 1,0), với y là diện tích peak (AU.min), x là nồng độ SAC (mg/L).

Điều kiện phân tích sắc ký

Hệ thống HPLC-UVD (Shimadzu, Shimadzu Corporation, Nhật Bản) sử dụng phân tích S-allyl cysteine trong mẫu tỏi bao gồm một bơm LC-10AD, đầu dò SPD-10A UV/Vis, bộ phận ổn nhiệt CTO-10AC, bơm thủ công. Các hợp chất được phân tách bằng cột LiChroCART ở nhiệt độ phòng (250 x 4 mm, 5m, Merck Millipore, Merck Millipore Corporation, Đức) và được phát hiện ở bước sóng 210 nm. Pha động gồm H3PO4 0,1% và acetonitrile với chế độ rửa giải đẳng dòng. Tốc độ dòng 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 10 L.

xxiii

Hình 1 Sắc ký đồ của dung dịch SAC chuẩn ở nồng độ 20 mg/L

Hình 2 Sắc ký đồ của dung dịch SAC chuẩn ở nồng độ 10 mg/L

xxiv

Hình 3 Sắc ký đồ của dung dịch SAC chuẩn ở nồng độ 5 mg/L

500000

y = 22722.6x - 2223.8 R2 = 1.0

400000

) n i m U A

300000

200000

100000

( k a e p h c í t n ệ i D

Nồng độ S-allyl cysteine (mg/L)

Hình 4 Đường chuẩn của dung dịch chuẩn SAC

13. Đánh giá cảm quan

a Phương pháp QDA (Quantitative Descriptive Analysis) (Lawless

and Heymann, 2010)

Thành lập hội đồng đánh giá cảm quan (6–8 thành viên) có am hiểu

chuyên môn về đánh giá chất lượng thực phẩm.

Mô tả từng chỉ tiêu của sản phẩm bao gồm : màu sắc, trạng thái, mùi, vị. Mỗi chỉ tiêu được xây dụng theo thang điểm mô tả. Đánh giá các mẫu theo thang điểm đã xây dựng. Các thuộc tính của tỏi được miêu tả gồm màu sắc, mùi, vị và cấu trúc. Mỗi thuộc tính được xây dựng theo thang điểm mô tả từ 1 đến 5. Phương pháp này chấm điểm theo thang điểm cường độ xuất hiện thuộc tính

Thang điểm các chỉ tiêu đánh giá cảm quan của tỏi chần và sản phẩm tỏi

lần lượt thể hiện ở Bảng 1, Bảng 2 và Bảng 3.

Bảng 1 Thang điểm các chỉ tiêu đánh giá cảm quan tỏi sau khi chần/lạnh đông

Chỉ tiêu

Điểm

Mức độ mô tả

Trắng và có màu lạ

Trắng vàng đục

Màu

Trắng hơi vàng

Trắng sáng

Trắng sáng và trong

xxv

Mùi hăng nồng rất mạnh

Mùi hăng nồng mạnh

Mùi

Mùi hăng nồng yếu

Mùi hăng nồng rất yếu

Không có mùi hăng nồng

Vị cay rất mạnh

Vị cay mạnh

Vị

Vị cay yếu

Vị cay rất yếu

Không có vị cay

Mềm và nhão

Mềm

Cấu trúc

Hơi giòn

Giòn

Rất giòn

Bảng 2 Thang điểm các chỉ tiêu đánh giá cảm quan sản phẩm tỏi đen

Chỉ tiêu

Điểm

Mức độ mô tả

Trắng đục

Hơi nâu

Màu

Nâu

Hơi đen

Đen

Mùi hăng nồng mạnh và mùi trái cây rất yếu

Mùi hăng nồng yếu và mùi trái cây yếu

Mùi

Mùi hăng nồng rất yếu và thoáng mùi trái cây

Không mùi hăng nồng, mùi trái cây mạnh

Không mùi hăng nồng, mùi trái cây rất mạnh

Còn cay nồng, ít chua ngọt

xxvi

Hơi cay và ít chua ngọt

Vị

Vị cay rất yếu và hơi chua ngọt

Ngọt và hơi chua

Vị chua ngọt hài hòa

Cứng và giòn

Cứng và hơi giòn

Hơi mềm và dai

Cấu trúc

Mềm và hơi dai

Mềm dẻo

Bảng 3 Thang điểm các chỉ tiêu đánh giá cảm quan sản phẩm tỏi lên men

Chỉ tiêu

Điểm

Mức độ mô tả

Trắng và có màu xanh green hoặc blue

Trắng và có ít màu xanh green hoặc blue

Màu

Trắng hơi vàng đục

Trắng sáng

Trắng sáng và trong

Mùi hăng nồng rất mạnh

Mùi hăng nồng mạnh

Mùi

Mùi hăng nồng yếu

Mùi hăng nồng rất yếu

Không có mùi hăng nồng

Vị cay rất mạnh và rất chua

Vị cay mạnh và chua

Vị

Vị cay yếu và hơi chua

Vị cay rất yếu và chua vừa phải

Không có vị cay và chua vừa phải

Mềm và nhão

Mềm

Cấu trúc

Hơi giòn

xxvii

Giòn

Rất giòn

b Phân tích hồi quy logistic (Lawless and Heymann, 2010)

Phương pháp đánh giá mẫu dựa trên cơ sở quyết định mẫu có khả năng chấp nhận hay không chấp nhận khi đứng trên phương diện người tiêu dùng. Với phương pháp này giá trị quan sát nằm giữa 0 (không thể chấp nhận) và 1 (chấp nhận)



  oe 1

Phương trình hồi quy logistic (phương trình 1) có thể được xây dựng với các giá trị 0 hoặc 1 được thu nhận từ kết quả đánh giá cảm quan của người tiêu dùng.

(1)

  xF    xF

Trong đó, đầu vào là giá trị o+1x và đầu ra là F(x). Trong phân tích hàm nhiều biến, o+1x có thể được sửa đổi thành o+1x1 +2x2 + … + mxm. Sau đó, khi được sử dụng trong các phương trình liên quan đến tỷ số odds với giá trị của các yếu tố dự báo, phương trình hồi quy tuyến tính sẽ trở thành hồi quy không tuyến tính với m biến, các thông số j cho tất cả j = 0, 1, 2,.., m được ước tính.

14. Hàm lượng acid tổng (%) (Theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN

4589:1988))

Chuẩn độ trực tiếp các acid có trong mẫu bằng dung dịch natri hydroxit

với chỉ thị phenolphtalein.

Tiến hành

a. Với mẫu là nước màu nhạt, hút 5-10 mL cho vào bình tam giác 100 mL, thêm 20 mL nước cất trung tính và 3 giọt dung dịch phenolphtalein 0,1% lắc đều rồi chuẩn độ bằng natri hydroxyde 0,1N đến dung dịch có màu hồng nhạt bền trong 30 giây.

xxviii

b. Với mẫu có lẫn cái nước hoặc chất rắn (quả nước đường, nước quả đặc, nguyên liệu…). Trộn đều mẫu đã chuẩn bị, cân 10-20 g chính xác đến 0,001 g, dùng nước cất chuyển toàn bộ lượng mẫu vào bình tam giác dung tích 250 mL, thêm nước đến khoảng 150 mL, đun trên bếp cách thủy ở 80oC trong 15 phút. Làm nguội, chuyển toàn bộ vào bình định mức 250 mL, thêm nước đến vạch, lắc kỹ, để lắng. Lọc mẫu thu dịch lọc vào cốc. Hút 25 mL dịch lọc vào bình tam giác dung tích 100 mL, thêm 3 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng natri hydroxyde 0,1N đến màu hồng nhạt bền vững trong 30 giây.

Tính kết quả

X 

KV . 100 . V 1

Hàm lượng acid tổng số của mẫu (a) tính bằng g/100 mL theo công thức:

Trong đó:

V (mL) - thể tích natri hydroxyde 0,1N

V1 (mL) - thể tích mẫu hút để chuẩn độ

m (g) - lượng cân mẫu

K - hệ số để tính ra loại acid tương ứng với:

Acid acetic K bằng 0,006

Acid citric K bằng 0,0064

Acid lắctic K bằng 0,0090

Acid tartric K bằng 0,0075

Acid malic K bằng 0,0067

Kết quả là trung bình cộng của kết quả 3 lần xác định song song. Tính chính xác đến 0,1%. Chênh lệch giữa kết quả 3 lần xác định song song không được lớn hơn 0,02%.

15. Hàm lượng đường khử () bằng phương pháp Lane-Eynon

Tiến hành

Cho 5 gram mẫu vào bình tam giác.

Cho vào bình chứa dịch thủy phân vài giọt phenolphtalein làm chỉ thị màu, trung hòa dịch thủy phân bằng NaOH với nồng độ giảm dần (pha loãng nhiều nồng độ NaOH để trung hòa được dễ dàng)

Sau khi trung hòa, khử tạp chất bằng 5-7 mL Pb(CH3COO)2. Để yên 5 phút đến khi thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt bên trên lớp cặn thì coi như đã khử tạp xong.

Kết tủa muối Pb dư bằng 18-20 mL Na2SO4 hoặc Na2HPO4.

Cho tất cả vào bình định mức 100 mL và thêm nước cất lên đến vạch.

xxix

Cho vào buret 25 mL dung dịch lọc, cho tiếp vào bình tam giác 100 mL: 5 mL fehling A + 5mL fehling B + 15 mL dịch lọc. Đem chuẩn độ trên bếp điện. Mỗi lần chuẩn nhỏ 1 mL dung dịch chuẩn trên buret đến màu đỏ gạch

không còn ánh xanh. Thử lại bằng cách nhỏ một giọt metyl xanh vào dd đang sôi thấy mất màu xanh trở về màu đỏ gạch. Đọc kết quả và tra bảng tính ra hàm luợng đường.

Tính kết quả

Bảng 4 Bảng xác định hàm lượng đường

mL dd đường yêu cầu mL dd đường yêu cầu mL dd đường yêu cầu mL dd đường yêu cầu

mg đường nghịch chuyển mg đường nghịch chuyển mg đường nghịch chuyển mg đường nghịch chuyển

15 156,06 42 124,2 336 24 213,3 33

16 152,2 43 121,4 316 25 204,8 34

17 147,09 44 118,7 298 26 197,4 35

18 143,9 45 116,1 282 27 190,4 36

19 140,2 46 113,7 267 28 183,7 37

20 136,6 47 111,4 254,5 29 177,6 38

21 133,3 48 109,2 242,9 30 171,7 39

22 130,1 49 107,1 231,8 31 166,3 40

23 127,1 50 105,1 222,2 32 161,2 41

16. Thử nghiệm tác dụng gây độc tế bào

Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng như DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Esental Medium with Eagle salt) có bổ sung 7-10% FBS (Fetal Bovine Serum) và một số thành phần thiết yếu khác. Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, độ ẩm 98%, nhiệt độ 37oC, vô trùng tuyệt đối) và được cấy chuyển 1-2 lần trước khi thí nghiệm. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.

xxx

Mẫu thử được hòa tan bằng dung môi DMSO với nồng độ ban đầu là 20 mg/mL. Tiến hành pha loãng 2 bước trên đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ từ cao xuống thấp lần lượt là 2564, 640, 160, 40 và 10 µg/mL. Nồng độ chất thử

trong đĩa thử nghiệm tương ứng là 128, 32, 8, 2 và 0,5 µg/mL. Chất tham chiếu Ellipticine pha trong DMSO với nồng độ 0,01mM.

Tiến hành thí nghiệm

Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm tế bào. Tiếp đó, pha tế bào bằng môi trường sạch và điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 3-5.104 tế bào/mL tùy theo từng dòng tế bào).

Lấy vào mỗi giếng 10 µL chất thử đã chuẩn bị ở trên và 190 µL dung dịch tế bào. Đối chứng dương của thí nghiệm là môi trường có chứa tế bào, đối chứng âm chỉ có môi trường nuôi cấy. Đĩa thí nghiệm được ủ ở điều kiện tiêu chuẩn trong 72 giờ.

Mỗi giếng thí nghiệm được tiếp tục ủ với 10 µL MTT (5 mg/ml) trong 4h. Sau khi loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 100 µL DMSO 100%.

Kết quả thí nghiệm được xác định bằng giá trị OD đo ở bước sóng 540

nm trên máy quang phổ Genios Tecan. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Xử lý kết quả

Giá trị IC50 được xác định thông qua giá trị % ức chế tế bào phát triển và

phần mềm máy tính Rawdata.

% ức chế = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)– ODchứng (-)) x 100

(Trong đó, HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử thấp ở nồng độ thấp; HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp ).

Giá trị IC50 ≤ 20 µL/ml (với dịch chiết thô) và IC50 ≤ 20 µM (với chất sạch) được đánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào đáng quan tâm, có khả năng ức chế hoặc diệt tế bào ung thư. Kết quả thí nghiệm là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm ± độ lệch chuẩn (SD).

17. Thử nghiệm hoạt tính kháng sinh

Môi trường nuôi cấy

MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vinh khuẩn; SAB, SA cho nấm mốc. Phương pháp pha loãng đa nồng độ.

xxxi

Pha loãng mẫu thử

Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu

và mục đích thử.

Các mẫu thử được pha thành dãy các nồng độ khác nhau, có thể dãy 5

nồng độ hoặc 10 nồng độ.

Mẫu ban đầu có nồng độ 40 mg/mL được pha loãng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng từ nồng độ 256 g/mL, 64 g/mL, 16 g/mL, 4 g/mL, 1 g/mL.

Thử hoạt tính

Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm mốc với nồng độ 5.105 CFU/mL

khi tiến hành thử.

Lấy 10 L dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng, thêm 200 L dung dịch vi khuẩn và nấm mốc, ủ ở 37oC. Sau 24 giờ, bổ sung 50 L MTT (1 mg/mL) vào các giếng thử và đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất không chuyển hóa MTT thành MTT formazan cho màu tím đậm. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm Raw data.

Chất tham khảo

Kháng sinh Ampicilin cho các chủng vi khuẩn gram dương và chủng vi

khuẩn Ec gram âm với giá trị IC50 trong khoảng 0,05-2 g/mL.

Hỗn hợp kháng sinh Pen/Step cho chủng vi khuẩn Pa gram âm với giá trị

IC50 trong khoảng 4-5 g/mL.

xxxii

Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5-1 g/mL.

B. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ

Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares 0.084 0.113333 0.197333

Df Mean Square F-Ratio P-Value 4 0.021 10 0.0113333 14

0.1955

1.85

Bảng 1 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến giá trị pH của tỏi

Bảng 2 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến giá trị pH của tỏi

Level Count Mean Homogeneous Groups 135 3 125 3 130 3 140 3 120 3

X 6.3 XX 6.4 XX 6.4 6.43333 XX 6.53333 X

Method: 95.0 percent LSD

Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares 28.16 14.5533 42.7133

Df Mean Square F-Ratio P-Value 4 7.04 10 1.45533 14

0.0197

4.84

Bảng 3 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến giá trị Brix của tỏi

XX X

35.1 35.6667 XX 36.6667 XX 37.4 39.0

Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups 140 3 120 3 125 3 135 3 130 3 Bảng 5 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến giá trị oBrix của tỏi

Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares 39.6522 5.6618 45.314

Df Mean Square F-Ratio P-Value 4 9.91306 10 0.56618 14

0.0002

17.51

xxxiii

Bảng 4 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến giá trị Brix của tỏi

Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups 120 3 125 3 130 3 140 3 135 3

62.83 X 63.6967 X 65.9367 X 66.2567 X 67.12 X

Bảng 6 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến giá trị oBrix của tỏi

0.075

Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares 0.3 4.3582 4.6582

Df Mean Square F-Ratio P-Value 4 10 0.43582 14

0.9477

0.17

Bảng 7 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến TPC của tỏi

Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups 125 3 130 3 140 3 120 3 135 3

2.32 X 2.43 X 2.54 X 2.66 X X 2.7

Bảng 8 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến TPC của tỏi

0.0708

Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares 0.2832 0.9862 1.2694

Df Mean Square F-Ratio P-Value 4 10 0.09862 14

0.5987

0.72

Bảng 9 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi

Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups X 7.6 140 3 7.67 X 125 3 7.72 X 135 3 X 7.9 120 3 7.96 X 130 3

Bảng 10 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi

xxxiv

Bảng 11 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi

0.47079

Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares 1.88316 4.15 6.03316

Df Mean Square F-Ratio P-Value 4 10 0.415 14

0.3943

1.13

Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous

Groups

7.71 X 7.83 X 8.11 X 8.32 X X 8.7

Bảng 12 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi

120 3 130 3 135 3 140 3 125 3

Source MAIN EFFECTS A:NHIET DO B:THOI GIAN INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED)

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 15.7122 10.2737 5.99189 3.67809 35.656

5.23742 2.05474 0.399459 0.076627

0.0000 0.0000 0.0000

68.35 26.81 5.21

3 5 15 48 71

Bảng 13 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chần đến TPC của tỏi

Method: 95.0 percent LSD

Homogeneous Groups X X X X

NHIET DO 90 70 80 30

Count 18 18 18 18

LS Mean 3.16428 3.70139 3.93172 4.46533

LS Sigma 0.0652461 0.0652461 0.0652461 0.0652461

Bảng 14 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian chần đến TPC của tỏi

Homogeneous Groups X X X X

Count 18 18 18 18

LS Mean 3.16428 3.70139 3.93172 4.46533

LS Sigma 0.0652461 0.0652461 0.0652461 0.0652461

Method: 95.0 percent LSD NHIET DO 90 70 80 30 Bảng 16 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chần đến TFC của tỏi Source MAIN EFFECTS A:NHIET DO

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 3.7451

1.24837

0.0000

141.57

xxxv

Bảng 15 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến TPC của tỏi

B:THOI GIAN INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED)

2.86662 1.38532 0.423277 8.42031

5 15 48 71

0.573324 0.0923544 0.00881828

65.02 10.47

0.0000 0.0000

Homogeneous Groups X X X X

Method: 95.0 percent LSD NHIET DO 90 70 80 30

Count 18 18 18 18

LS Mean 1.04322 1.2055 1.31128 1.665

LS Sigma 0.0221338 0.0221338 0.0221338 0.0221338

Bảng 17 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến TFC của tỏi

Homogeneous Groups X X X X X X

LS Mean 1.06442 1.13 1.22075 1.5341 1.48133 1.665

LS Sigma 0.0271082 0.0271082 0.0271082 0.0271082 0.0271082 0.0271082

Method: 95.0 percent LSD Count THOI GIAN 12 180 12 150 12 120 12 90 12 60 0 12 Bảng 19 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chần đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi Source MAIN EFFECTS A:NHIET DO B:THGIAN INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED)

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 530.67 253.561 233.283 25.3538 1042.87

176.89 50.7121 15.5522 0.528205

0.0000 0.0000 0.0000

334.89 96.01 29.44

3 5 15 48 71

Bảng 18 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian chần đến TFC của tỏi

Homogeneous Groups X X X X X X

Method: 95.0 percent LSD THGIAN 150 180 120 90 60 0

Count 12 12 12 12 12 12

LS Mean 13.2297 13.2572 15.955 16.6819 16.8546 18.2883

LS Sigma 0.209802 0.209802 0.209802 0.209802 0.209802 0.209802

Bảng 20 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian chần đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi

Homogeneous Groups X

Method: 95.0 percent LSD NHIET DO 90

Count 18

LS Mean 11.144

LS Sigma 0.171303

xxxvi

Bảng 21 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi

X X X

70 80 30

18 18 18

16.6836 16.7286 18.2883

0.171303 0.171303 0.171303

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 115.413 78.9285 60.8774 46.8611 302.08

38.4711 15.7857 4.05849 0.976273

0.0000 0.0000 0.0001

39.41 16.17 4.16

3 5 15 48 71

Homogeneous Groups X X X X

Bảng 22 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chần đến khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi Source MAIN EFFECTS A:NHIET DO B:THOI GIAN INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED)

LS Sigma 0.232889 0.232889 0.232889 0.232889

LS Mean 4.63768 5.94129 7.07584 8.02497

Count 18 18 18 18

Homogeneous Groups X X X X X X

LS Mean 5.21953 5.5254 5.52807 7.04042 7.18128 8.02497

LS Sigma 0.28523 0.28523 0.28523 0.28523 0.28523 0.28523

Bảng 23 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi Method: 95.0 percent LSD NHIET DO 90 70 80 30

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 531634. 1.5949E6 239236. 1.19618E6 76541.4 1.14812E6 113.097 5428.67 3.94463E6

P-Value 0.0000 0.0000 0.0000

4700.68 2115.32 676.77

3 5 15 48 71

Homogeneous Groups X X X X

Bảng 23 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian chần đến khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi Method: 95.0 percent LSD Count THOI GIAN 12 180 12 150 12 120 12 60 12 90 0 12 Bảng 24 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chần đến độ cứng của tỏi Source MAIN EFFECTS A:NHIET DO B:THOI GIAN INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED)

LS Sigma 2.50663 2.50663 2.50663 2.50663

LS Mean 604.389 632.833 913.5 917.667

Count 18 18 18 18

xxxvii

Bảng 25 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến độ cứng của tỏi Method: 95.0 percent LSD NHIET DO 90 80 70 30

Homogeneous Groups X X X X X X

LS Mean 627.167 641.833 650.917 854.167 910.833 917.667

LS Sigma 3.06998 3.06998 3.06998 3.06998 3.06998 3.06998

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 2827.44 2389.44 1106.22 71.3333 6394.44

942.481 477.889 73.7481 1.48611

0.0000 0.0000 0.0000

634.19 321.57 49.62

3 5 15 48 71

Homogeneous Groups X X X X

Bảng 26 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian chần đến độ cứng của tỏi Method: 95.0 percent LSD Count THOI GIAN 12 180 12 150 12 120 12 90 12 60 0 12 Bảng 27 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chần đến giá trị L của tỏi Source MAIN EFFECTS A:NHIET DO B:THOI GIAN INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED)

LS Sigma 0.287336 0.287336 0.287336 0.287336

LS Mean 65.3333 65.3030 78.3889 82.0556

Count 18 18 18 18

Homogeneous Groups X X X X X X

LS Mean 65.3333 71.75 75.5833 78.75 81.0 81.9167

LS Sigma 0.351913 0.351913 0.351913 0.351913 0.351913 0.351913

Bảng 28 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến giá trị L của tỏi Method: 95.0 percent LSD NHIET DO 30 70 80 90

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 2.375 3.79167 10.0417 220.667 236.875

0.791667 0.758333 0.669444 4.59722

0.9147 0.9742 0.9999

0.17 0.16 0.15

3 5 15 48 71

xxxviii

Bảng 29 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian chần đến giá trị L của tỏi Method: 95.0 percent LSD Count THOI GIAN 12 0 12 60 12 90 12 120 12 150 12 180 Bảng 30 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chần đến giá trị a của tỏi Source MAIN EFFECTS A:NHIET DO B:THOI GIAN INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED)

Homogeneous Groups X X X X

LS Sigma 0.505372 0.505372 0.505372 0.505372

LS Mean -2.33333 -2.0 -2.0 -1.83333

Count 18 18 18 18

Homogeneous Groups X X X X X X

LS Mean -2.33333 -2.25 -2.16667 -2.0 -1.75 -1.75

LS Sigma 0.618952 0.618952 0.618952 0.618952 0.618952 0.618952

Bảng 31 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến giá trị a của tỏi Method: 95.0 percent LSD NHIET DO 30 70 90 80

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 10.4179 14.5492 36.553 1630.4 1691.92

3.47263 2.90984 2.43686 33.9667

0.9583 0.9942 1.0000

0.10 0.09 0.07

3 5 15 48 71

Homogeneous Groups X X X X

Bảng 32 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian chần đến giá trị a của tỏi Method: 95.0 percent LSD Count THOI GIAN 12 0 12 90 12 180 12 60 12 150 120 12 Bảng 33 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chần đến giá trị b của tỏi Source MAIN EFFECTS A:NHIET DO B:THOI GIAN INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED)

LS Sigma 1.37369 1.37369 1.37369 1.37369

LS Mean 22.3339 22.4911 22.89 23.315

Count 18 18 18 18

Homogeneous Groups X X X X X X

LS Mean 22.3617 22.4725 22.57 22.6675 22.89 23.7225

LS Sigma 1.68243 1.68243 1.68243 1.68243 1.68243 1.68243

Bảng 34 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến giá trị b của tỏi Method: 95.0 percent LSD NHIET DO 70 90 30 80

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 1231.74 18.9565 0.0342 18.9907

9 2.10628 20 0.00171 29

P-Value 0.0000

xxxix

Bảng 35 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian chần đến giá trị b của tỏi Method: 95.0 percent LSD Count THOI GIAN 12 90 12 180 12 60 12 150 12 0 120 12 Bảng 36 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (Không bổ sung chủng lactic, NaCl 0,5%) Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Mean 3.28333 4.16667 4.21 4.21 4.23 4.36 5.15 5.25667 5.37 6.21

9 20 29

2.33733 0.00261

P-Value 0.0000

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 895.53 21.036 0.0522 21.0882

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X

Mean 3.06 3.95667 4.07333 4.08 4.25667 4.27 5.07667 5.17667 5.33 6.14667

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 2300.26 17.459 0.0168667 17.4758

9 1.93988 20 0.000843333 29

P-Value 0.0000

Homogeneous Groups X X X X X X

Mean 3.21667 4.18333 4.33 4.35 4.41667 4.57667

Count 3 3 3 3 3 3

Bảng 37 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (Không bổ sung chủng lactic, NaCl 0,5%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 8 7 9 6 5 10 4 3 2 1 Bảng 38 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (Không bổ sung chủng lactic, NaCl 1%) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 39 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (Không bổ sung chủng lactic, NaCl 1%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 8 7 5 9 6 10 4 3 2 1 Bảng 40 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (Không bổ sung chủng lactic, NaCl 1,5%) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 41 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (Không bổ sung chủng lactic, NaCl 1,5%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 8 7 5 9 6 10

X XX X X

3 3 3 3

5.17 5.21333 5.23333 6.19333

9 20 29

P-Value 0.0000

1.49712 0.00389333

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 384.54 13.4741 0.0778667 13.552

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Mean 3.92667 4.19333 4.37333 4.39 4.51 4.54333 5.09333 5.26333 5.29 6.32333

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 1184.65 22.07 0.0414 22.1114

9 2.45222 20 0.00207 29

P-Value 0.0000

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X

Mean 3.94333 4.12 4.12667 4.15333 4.3 5.42333 5.60333 5.68 5.82 6.35667

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

2 4 3 1 Bảng 42 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (Không bổ sung chủng lactic, NaCl 2%) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 43 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (Không bổ sung chủng lactic, NaCl 2%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 8 7 5 9 6 10 2 3 4 1 Bảng 44 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (105 CFU/mL chủng lactic, NaCl 0,5%) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 45 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (105 CFU/mL chủng lactic, NaCl 0,5%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 8 7 9 10 5 4 2 3 1 Bảng 46 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (105 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1%) Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 1027.16 24.5903 0.0532 24.6435

2.73225 9 20 0.00266 29

P-Value 0.0000

xli

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Mean 3.56333 3.94667 3.94667 4.12667 4.30667 5.24333 5.53667 5.63667 5.70333 6.34

9 20 29

P-Value 0.0000

2.70293 0.00318667

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 848.20 24.3263 0.0637333 24.3901

Homogeneous Groups X X XX X X X X X X X

Mean 3.61667 4.07 4.15333 4.21333 4.39 5.28667 5.66667 5.69667 5.73333 6.41333

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 877.90 23.598 0.0597333 23.6577

2.622 0.00298667

P-Value 0.0000

9 20 29

Homogeneous Groups X X X X X X

Mean 3.64667 4.03667 4.11 4.23 4.45 5.29

Count 3 3 3 3 3 3

xlii

Bảng 47 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (105 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 8 7 9 10 5 4 3 2 1 Bảng 48 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (105 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1,5%) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 49 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (105 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1,5%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 7 8 9 10 5 4 2 3 1 Bảng 50 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (105 CFU/mL chủng lactic, NaCl 2%) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 51 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (105 CFU/mL chủng lactic, NaCl 2%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 8 7 9 10 5

X XX X X

3 3 3 3

5.64667 5.72 5.75333 6.37333

9 20 29

3.04775 0.00586

P-Value 0.0000

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 520.09 27.4297 0.1172 27.5469

Homogeneous Groups X X X X X X X XX X X

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Mean 3.24333 3.38333 4.09 4.14 4.39667 4.43667 5.43 5.55667 5.58 6.25667

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 212.25 33.9894 0.355867 34.3453

P-Value 0.0000

3.7766 0.0177933

9 20 29

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X

Mean 3.17 3.35 3.47 4.10333 4.11667 4.42667 5.35333 5.44333 5.57667 6.19333

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

4 2 3 1 Bảng 52 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (106 CFU/mL chủng lactic, NaCl 0,5%) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 53 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (106 CFU/mL chủng lactic, NaCl 0,5%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 7 9 8 10 5 4 3 2 1 Bảng 54 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (106 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1%) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 55 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (106 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 7 8 9 5 10 4 3 2 1 Bảng 56 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (106 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1,5%) Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 2297.84 31.3655 0.0303333 31.3958

3.48506 9 20 0.00151667 29

P-Value 0.0000

xliii

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X

Mean 3.23667 3.25667 3.65 4.22 4.24 4.5 5.45667 5.54 5.60333 6.32667

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Df Mean

P-Value

F-Ratio

Sum of Squares 27.2925

Square 3.03251

805.09

0.0000

27.3679

20 0.00376667 29

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Mean 3.27333 3.67 3.94333 4.21333 4.55667 4.57333 5.57333 5.58333 5.63333 6.36

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 920.96 20.2519 0.0488667 20.3008

2.25021 0.00244333

P-Value 0.0000

9 20 29

Homogeneous Groups X X X X

Bảng 57 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (106 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1,5%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 7 8 5 9 10 4 3 2 1 Bảng 58 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (106 CFU/mL chủng lactic, NaCl 2%) Source

Between groups Within groups 0.0753333 Total (Corr.) Bảng 59 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (106 CFU/mL chủng lactic, NaCl 2%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 7 8 9 10 5 4 3 2 1 Bảng 60 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (107 CFU/mL chủng lactic, NaCl 0,5%) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 61 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (107 CFU/mL chủng lactic, NaCl 0,5%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 9 7 10

Mean 3.86 4.09667 4.27333 4.39667

Count 3 3 3 3

xliv

X X X X X X

3 3 3 3 3 3

4.91 5.29667 5.65333 5.83 5.86333 6.34667

P-Value 0.0000

9 2.41959 20 0.00168667 29

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 1434.54 21.7763 0.0337333 21.8101

Homogeneous Groups X X XX XX X X X X X X

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Mean 3.66333 4.09333 4.11667 4.16333 4.18667 5.2 5.62 5.62333 5.64333 6.22333

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 1224.68 22.6688 0.0411333 22.7099

9 2.51876 20 0.00205667 29

P-Value 0.0000

Homogeneous Groups X X X X X X X XX X X

Mean 3.72333 4.17333 4.32 4.32667 4.36 5.36 5.71 5.72333 5.79333 6.46

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

8 5 2 4 3 1 Bảng 62 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (107 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1%) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 63 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (107 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 8 9 10 7 5 2 4 3 1 Bảng 64 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (107 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1,5%) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 65 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (107 CFU/mL chủng lactic, NaCl 1,5%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 9 7 8 10 5 4 2 3 1 Bảng 66 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (107 CFU/mL chủng lactic, NaCl 2%) Source Between groups

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 1937.08 21.9665

P-Value 0.0000

2.44073

xlv

0.0252 21.9917

20 0.00126 29

Homogeneous Groups X X X X X X X XX X X

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Mean 3.85 4.2 4.20667 4.37667 4.59333 5.37 5.77 5.81 5.86 6.44

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 816.252 219.675 4314.15 12.829 46.3109 14.9133 21.4854 112.517 5558.13

0.0000 773.81 208.25 0.0000 1363.27 0.0000 4.05 4.88 1.57 0.75

272.084 73.2251 479.35 1.42544 1.71522 0.552344 0.265252 0.351617

0.0001 0.0000 0.0380 0.9357

3 3 9 9 27 27 81 320 479

Standard Error 2.94198 0.115602 0.96168 0.633766 0.015937 0.149628 0.0792959 0.00514565 0.0821533 0.0232802

Estimate -95.7241 3.79346 32.5986 7.00893 -0.0853126 -2.31532 -2.69345 -0.215436 -0.317016 0.00965697

T Statistic -32.5373 32.8148 33.8976 11.0592 -5.35311 -15.4738 -33.9671 -41.8677 -3.85883 0.414815

Sum of Squares 4265.92 175.306 4441.23

Mean Square 473.992 0.502309

P-Value 0.0000

F-Ratio 943.63

Df 9 349 358

Within groups Total (Corr.) Bảng 67 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian lên men đến giá trị pH của tỏi lên men lactic (107 CFU/mL chủng lactic, NaCl 2%) Method: 95.0 percent LSD thoi gian 6 9 7 10 8 5 4 2 3 1 Bảng 68 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mật số vi khuẩn L. Plantarum, nồng độ NaCl và thời gian lên men đến TPC của tỏi lên men lactic Source MAIN EFFECTS A:MSVK B:NaCl C:THOI GIAN INTERACTIONS AB AC BC ABC RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Bảng 69 Phân tích hồi quy ảnh hưởng của mật số vi khuẩn L. Plantarum, nồng độ NaCl và thời gian lên men đến TPC của tỏi lên men lactic P-Value Parameter 0.0000 CONSTANT 0.0000 times 0.0000 msvk 0.0000 NaCl 0.0000 timesmsvk 0.0000 NaClNaCl 0.0000 msvkmsvk 0.0000 timestimes 0.0001 msvkNaCl 0.6785 timesNaCl Source Model Residual Total (Corr.) R-squared = 96.0528 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 95.951 percent

xlvi

3 3 9 9 27 27 81 320 479

0.0001 0.0000 0.0380 0.9357

28.4957 8.97007 63.8545 0.174617 0.694501 0.0676621 0.0324934 0.043073

0.0000 661.57 208.25 0.0000 1482.47 0.0000 4.05 16.12 1.57 0.75

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 85.487 26.9102 574.691 1.57155 18.7515 1.82688 2.63197 13.7834 725.653

Estimate -28.8541 0.95321 10.0423 2.45346 0.0186121 -0.810168 -0.842636 -0.0643982 -0.111131 0.00340127

Standard Error 1.32495 0.0520626 0.433102 0.285423 0.0071774 0.0673867 0.0357117 0.0023174 0.0369986 0.0104845

T Statistic -21.7774 18.3089 23.187 8.59586 2.59316 -12.0227 -23.5955 -27.789 -3.00367 0.32441

Sum of Squares 546.414 35.5563 581.97

Mean Square 60.7127 0.101881

P-Value 0.0000

F-Ratio 595.92

Df 9 349 358

Standard Error of Est. = 0.708737 Mean absolute error = 0.458163 Durbin-Watson statistic = 1.71164 (P=0.0031) Lag 1 residual autocorrelation = 0.140658 The StatAdvisor The output shows the results of fitting a multiple linear regression model to describe the relationship between TPC and 9 independent variables. The equation of the fitted model is TPC = -95.7241 + 3.79346times + 32.5986 msvk + 7.00893* NaCl - 0.0853126* timesmsvk - 2.31532 NaClNaCl - 2.69345 msvkmsvk - 0.215436 timestimes - 0.317016 msvkNaCl + 0.00965697 timesNaCl Bảng 70 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mật số vi khuẩn L. Plantarum, nồng độ NaCl và thời gian lên men đến TFC của tỏi lên men lactic Source MAIN EFFECTS A:MSVK B:NaCl C:THOI GIAN INTERACTIONS AB AC BC ABC RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Bảng 71 Phân tích hồi quy ảnh hưởng của mật số vi khuẩn L. Plantarum, nồng độ NaCl và thời gian lên men đến TFC của tỏi lên men lactic P-Value Parameter 0.0000 CONSTANT 0.0000 times 0.0000 msvk 0.0000 NaCl 0.0099 timesmsvk 0.0000 NaClNaCl 0.0000 msvkmsvk 0.0000 timestimes 0.0029 msvkNaCl times*NaCl 0.7458 Source Model Residual Total (Corr.) R-squared = 93.8904 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 93.7328 percent Standard Error of Est. = 0.319187 Mean absolute error = 0.211984 Durbin-Watson statistic = 1.11152 (P=0.0000) Lag 1 residual autocorrelation = 0.442771 The StatAdvisor The output shows the results of fitting a multiple linear regression model to describe the relationship between tfc and 9 independent variables. The equation of the fitted model is

xlvii

9 3 3 27 27 9 81 320 479

0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0002 0.0000 0.0000

187.10 52.43 48.78 38.98 2.42 14.43 2.56

231.297 64.8096 60.3061 48.1913 2.99102 17.8442 3.16969 1.23621

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 2081.68 194.429 180.918 1301.17 80.7575 160.598 256.745 395.586 4651.87

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 1716.17 461.867 9070.5 26.9729 97.3687 31.3552 45.1731 236.568 11686.0

0.0000 773.81 208.25 0.0000 1363.27 0.0000 4.05 4.88 1.57 0.75

572.057 153.956 1007.83 2.99699 3.60625 1.1613 0.557693 0.739274

0.0001 0.0000 0.0380 0.9357

3 3 9 9 27 27 81 320 479

TFC = -28.8541 + 0.95321*times + 10.0423*msvk + 2.45346*NaCl + 0.0186121*times*msvk - 0.810168*NaCl*NaCl - 0.842636*msvk*msvk - 0.0643982*times*times - 0.111131*msvk*NaCl + 0.00340127*times*NaCl -28.8541 + 0.95321*6 + 10.0423*x + 2.45346*y+ 0.0186121*6*x- 0.810168*y*y- 0.842636*x*x - 0.0643982*6*6 - 0.111131*x*y -28.8541 + 0.95321*x+ 10.0423*6 + 2.45346*y+ 0.0186121*x*6- 0.810168*y*y - 0.842636*6*6- 0.0643982*x*x - 0.111131*6*y -28.8541 + 0.95321*x + 10.0423*y + 2.45346*1.25 + 0.0186121*x*y - 0.810168*1.25*1.25 - 0.842636*y*y - 0.0643982*x*x - 0.111131*y*1.25 Bảng 72 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mật số vi khuẩn L. Plantarum, nồng độ NaCl và thời gian lên men đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi lên men lactic Source MAIN EFFECTS A:THOI GIAN B:MSVK C:NaCl INTERACTIONS AB AC BC ABC RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Bảng 73 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mật số vi khuẩn L. Plantarum, nồng độ NaCl và thời gian lên men đến khả năng loại bỏ DPPH của tỏi lên men Source MAIN EFFECTS A:MSVK B:NaCl C:THOI GIAN INTERACTIONS AB AC BC ABC RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Bảng 74 Phân tích hồi quy ảnh hưởng của mật số vi khuẩn L. Plantarum, nồng độ NaCl và thời gian lên men đến khả năng loại bỏ DPPH của tỏi lên men Standard Error Parameter 4.26587 CONSTANT 0.167623 times 1.39444 msvk 0.918961 NaCl 0.0231087 times*msvk 0.216961 NaCl*NaCl 0.114979 msvk*msvk 0.00746119 times*times

Estimate -138.9 5.50051 47.268 10.1629 -0.123703 -3.35722 -3.90551 -0.312383

T Statistic -32.5607 32.8148 33.8976 11.0592 -5.35311 -15.4738 -33.9671 -41.8677

P-Value 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000

xlviii

0.0001 0.6785

-3.85883 0.414815

0.119122 0.0337563

-0.459673 0.0140026

Df 9 349 358

F-Ratio 943.63

P-Value 0.0000

Mean Square 996.567 1.0561

Sum of Squares 8969.11 368.58 9337.69

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 18.3136 1.24485 19.5585

1.22091 0.0401565

0.0000

30.40

15 31 46

Homogeneous Groups X XX XX XX XX XXX XX XX XX X X X X X X X

LS Sigma 0.200391 0.200391 0.200391 0.141698 0.100195 0.200391 0.100195 0.100195 0.100195 0.100195 0.100195 0.100195 0.100195 0.100195 0.100195 0.200391

LS Mean 2.11 2.31 2.36 2.47 2.53 2.56 2.5925 2.6675 2.6925 2.86 3.6925 3.7775 3.8325 3.86 3.89 4.11

Count 1 1 1 2 4 1 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1

msvkNaCl timesNaCl Source Model Residual Total (Corr.) R-squared = 96.0528 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 95.951 percent Standard Error of Est. = 1.02767 Mean absolute error = 0.664336 Durbin-Watson statistic = 1.71164 (P=0.0031) Lag 1 residual autocorrelation = 0.140658 The StatAdvisor The output shows the results of fitting a multiple linear regression model to describe the relationship between DPPH and 9 independent variables. The equation of the fitted model is DPPH = -138.9 + 5.50051times + 47.268msvk + 10.1629NaCl - 0.123703timesmsvk - 3.35722NaClNaCl - 3.90551msvkmsvk - 0.312383timestimes - 0.459673msvkNaCl + 0.0140026times*NaCl Bảng 75 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến màu sắc của tỏi lên men Source MAIN EFFECTS A:MAU RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Bảng 76 Kiểm định LSD ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến màu sắc của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD MAU 3 5 1 6 8 2 7 10 9 11 16 13 12 14 15 4 Bảng 77 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến mùi của tỏi lên men Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 1.0116 0.436225 1.44782

P-Value 0.0001

0.0674398 0.0140718

4.79

15 31 46

xlix

Homogeneous Groups X X XX XX X XX XX XX XX XXXX XXXX XXXX XXX XXX XX X

Count 1 1 1 1 2 4 4 4 4 1 4 4 4 4 4 4

Mean 2.31 2.33 2.41 2.44 2.445 2.5275 2.53 2.53 2.5575 2.56 2.58 2.67 2.7475 2.75 2.8075 2.8875

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 1.291 0.747025 2.03802

P-Value 0.0013

3.57

15 31 46

Homogeneous Groups X XX XXXX XXXXX XXXXX XX XXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXX XXXX XXX XXX XX X

Mean 2.335 2.385 2.39 2.42 2.44 2.445 2.4975 2.5 2.53 2.56 2.5825 2.585 2.6925 2.7225 2.7475 2.945

Count 4 2 1 1 1 4 4 1 4 1 4 4 4 4 4 4

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 1.58804 0.291525

P-Value 0.0000

0.105869 0.00940403

11.26

15 31

Bảng 78 Kiểm định LSD ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến mùi của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD MAU TOI LEN MEN 1 3 5 4 6 8 10 9 7 2 11 15 13 12 14 16 Bảng 79 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến vị của tỏi lên men Source 0.0860664 Between groups 0.0240976 Within groups Total (Corr.) Bảng 80 Kiểm định LSD ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến vị của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD MAU TOI LEN MEN 7 6 3 1 4 10 9 5 8 2 11 12 15 13 16 14 Bảng 81 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến cấu trúc của tỏi lên men Source Between groups Within groups

1.87957

Homogeneous Groups X XX XXX XXX XXX XXXX XX XXX XXX XXX XXX XXX XX X X X

Count 1 1 1 1 2 1 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

Mean 2.81 3.0 3.06 3.06 3.22 3.22 3.2775 3.28 3.3425 3.4005 3.4425 3.4425 3.5275 3.5825 3.61 3.64

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 72.0765 240.512 21.6148 7.27555 341.479

36.0382 60.1279 2.70185 0.242518

0.0000 0.0000 0.0000

148.60 247.93 11.14

2 4 8 30 44

Homogeneous Groups X X X

LS Sigma 0.127153 0.127153 0.127153

LS Mean 22.8347 24.0599 25.9135

Count 15 15 15

Homogeneous Groups X X X X X

LS Sigma 0.164154 0.164154 0.164154 0.164154 0.164154

LS Mean 19.8107 24.6328 24.8864 25.6333 26.3837

Count 9 9 9 9 9

Total (Corr.) Bảng 82 Kiểm định LSD ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến cấu trúc của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD MAU TOI LEN MEN 3 1 4 5 6 2 10 8 7 11 9 16 13 12 14 15 Bảng 83 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của loại và tỷ lệ phụ liệu đến TPC của tỏi lên men Source MAIN EFFECTS A: PHU LIEU B:% INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Bảng 84 Kiểm định LSD ảnh hưởng của loại phụ liệu đến TPC của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD PHU LIEU HANH LA HANH TAY HANH TIM Bảng 85 Kiểm định LSD ảnh hưởng của tỷ lệ phụ liệu đến TPC của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD % 0 10 2.5 5 7.5 Bảng 86 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của loại và tỷ lệ phụ liệu đến TFC của tỏi lên men Source MAIN EFFECTS A: PHU LIEU

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 11.0148

5.50739

0.0000

19.00

4 8 30 44

91.05 2.93

0.0000 0.0153

105.584 6.79075 8.69679 132.087

26.3961 0.848844 0.289893

Homogeneous Groups X X X

Count 15 15 15

LS Mean 9.01087 9.61333 10.2227

LS Sigma 0.139019 0.139019 0.139019

Homogeneous Groups X X X X X

Count 9 9 9 9 9

LS Mean 7.20767 8.48978 10.2269 10.9739 11.18

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 2.46252 0.926587 2.76715 19.8341 25.9904

1.23126 0.231647 0.345893 0.661137

1.86 0.35 0.52

2 4 8 30 44

Homogeneous Groups X X X X X

LS Sigma 0.271034 0.271034 0.271034 0.271034 0.271034

LS Mean 18.2208 18.259 18.3668 18.3944 18.6305

Count 9 9 9 9 9

Homogeneous Groups X X X

LS Sigma 0.209942 0.209942 0.209942

LS Mean 18.0471 18.4959 18.58

B:% INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Bảng 87 Kiểm định LSD ảnh hưởng của loại phụ liệu đến TFC của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD PHU LIEU HANH LA HANH TIM HANH TAY Bảng 88 Kiểm định LSD ảnh hưởng của tỷ lệ phụ liệu đến TFC của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD LS Sigma % 0.179472 0 0.179472 2.5 0.179472 5 0.179472 7.5 10 0.179472 Bảng 89 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của loại và tỷ lệ phụ liệu đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi lên men Source MAIN EFFECTS 0.1728 A:PHU LIEU 0.8417 B:% INTERACTIONS 0.8295 AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Bảng 90 Kiểm định LSD ảnh hưởng của tỷ lệ phụ liệu đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD % 10 7.5 2.5 5 0 Bảng 91 Kiểm định LSD ảnh hưởng của loại phụ liệu đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD Count PHU LIEU 15 HANH TIM 15 HANH LA HANH TAY 15 Bảng 92 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của loại và tỷ lệ phụ liệu đến khả năng loại bỏ DPPH của tỏi lên men Source MAIN EFFECTS

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

lii

4 2 8 30 44

174.37 18.88 1.64

0.0000 0.0000 0.1562

412.108 22.3057 7.73474 17.7254 459.874

103.027 11.1528 0.966842 0.590848

Homogeneous Groups X X X

LS Mean 30.2318 30.7415 31.9134

LS Sigma 0.198469 0.198469 0.198469

Homogeneous Groups X X X X X

Count 9 9 9 9 9

LS Mean 25.645 29.6541 32.3432 33.3144 33.8546

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 17.2355 88.4081 105.644

P-Value 0.7452

0.49

4 10 14

Homogeneous Groups X X X X X

Mean 24.8767 24.8767 26.33 27.0833 27.4167

Count 3 3 3 3 3

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 16.243 28.9599 45.2029

P-Value 0.3019

1.40

4 10 14

Homogeneous Groups X X X

A:% B:PHU LIEU INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Bảng 93 Kiểm định LSD ảnh hưởng của loại phụ liệu đến khả năng loại bỏ DPPH của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD Count PHU LIEU 15 HANH LA 15 HANH TAY 15 HANH TIM Bảng 94 Kiểm định LSD ảnh hưởng của tỷ lệ phụ liệu đến khả năng loại bỏ DPPH của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD LS Sigma % 0.256222 0 0.256222 2.5 0.256222 5 0.256222 10 7.5 0.256222 Bảng 95 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến TPC của tỏi lên men ở nhiệt độ mát (5oC) Source 4.30887 Between groups 8.84081 Within groups Total (Corr.) Bảng 96 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến TPC của tỏi lên men ở nhiệt độ mát (5oC) Method: 95.0 percent LSD TUAN 9 5 3 1 7 Bảng 97 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến TFC của tỏi lên men ở nhiệt độ mát (5oC) Source 4.06075 Between groups 2.89599 Within groups Total (Corr.) Bảng 98 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến TFC của tỏi lên men ở nhiệt độ mát (5oC) Method: 95.0 percent LSD TUAN 9 7 5

Mean 9.28038 9.26648 10.3336

Count 3 3 3

liii

X X

3 3

10.4995 12.0993

4 10 14

0.25

P-Value 0.9001

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 0.932128 9.13954 10.0717

Homogeneous Groups X X X X X

Count 3 3 3 3 3

Mean 17.0531 17.1913 17.4072 17.541 17.7569

4 10 14

0.13

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 2.61961 48.8287 51.4483

P-Value 0.9661

Homogeneous Groups X X X X X

Mean 33.3951 33.6558 33.7803 33.8644 34.6406

Count 3 3 3 3 3

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 147.75 101.961 249.711

P-Value 0.0449

36.9375 10.1961

3.62

4 10 14

Homogeneous Groups X X XX XX X

Mean 19.6923 20.868 25.3304 25.3527 28.1659

Count 3 3 3 3 3

3 1 Bảng 99 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi lên men ở nhiệt độ mát (5oC) Source 0.233032 Between groups 0.913954 Within groups Total (Corr.) Bảng 100 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi lên men ở nhiệt độ mát (5oC) Method: 95.0 percent LSD THIO 5 7 9 3 1 Bảng 101 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng loại bỏ DPPH của tỏi lên men ở nhiệt độ mát (5oC) Source 0.654901 Between groups 4.88287 Within groups Total (Corr.) Bảng 102 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng loại bỏ DPPH của tỏi lên men ở nhiệt độ mát (5oC) Method: 95.0 percent LSD TUAN 5 9 3 7 1 Bảng 103 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến TPC của tỏi lên men ở nhiệt độ phòng (302oC) Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 104 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến TPC của tỏi lên men ở nhiệt độ phòng (302oC) Method: 95.0 percent LSD TUAN 9 7 5 3 1 Bảng 105 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến TFC của tỏi lên men ở nhiệt độ phòng (302oC) Source

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

liv

4 10 14

9.93

0.0016

20.1936 2.03448

80.7744 20.3448 101.119

Homogeneous Groups X X X X X

Count 3 3 3 3 3

LS Mean 5.40114 7.3037 7.90392 10.9039 11.637

LS Sigma 0.823505 0.823505 0.823505 0.823505 0.823505

4 10 14

0.04

P-Value 0.9964

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 0.329099 20.3581 20.6872

Homogeneous Groups X X X X X

Mean 17.57 17.6238 17.7699 17.8728 17.9655

Count 3 3 3 3 3

P-Value 0.0002

15.95

4 10 14

Homogeneous Groups X X X X X

Mean 26.2779 28.9182 33.6409 34.3607 34.431

Count 3 3 3 3 3

MAIN EFFECTS A:TUAN RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Bảng 106 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến TFC của tỏi lên men ở nhiệt độ mát phòng (302oC) Method: 95.0 percent LSD TUAN 9 7 5 3 1 Bảng 107 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi lên men ở nhiệt độ phòng (302oC) Source 0.0822748 Between groups 2.03581 Within groups Total (Corr.) Bảng 108 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hàm lượng thiosulfinate của tỏi lên men ở nhiệt độ phòng (302oC) Method: 95.0 percent LSD TUAN 7 3 1 9 5 Bảng 109 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng loại bỏ DPPH của tỏi lên men ở nhiệt độ phòng (302oC) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Source 41.468 165.872 Between groups 2.59961 25.9961 Within groups Total (Corr.) 191.868 Bảng 110 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng loại bỏ DPPH của tỏi lên men ở nhiệt độ phòng (302oC) Method: 95.0 percent LSD TUAN 9 7 3 1 5 Bảng 111 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến màu sắc của tỏi lên men Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 0.0955082 0.401117 0.496625

P-Value 0.3844

0.0955082 0.100279

0.95

1 4 5

Homogeneous Groups X X

Count 3 3

Mean 4.42933 4.68167

1 4 5

0.11

P-Value 0.7539

0.00601667 0.0533378

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 0.00601667 0.213351 0.219368

Homogeneous Groups X X

Count 3 3

Mean 3.19533 3.25867

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 0.131424 0.268629 0.400053

P-Value 0.2344

1.96

1 4 5

Homogeneous Groups X X

Mean 3.22733 3.52333

Count 3 3

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 0.0055815 0.133412 0.138994

P-Value 0.7034

0.0055815 0.033353

0.17

1 4 5

Homogeneous Groups X X

Count 3 3

Mean 4.467 4.528

lvi

Bảng 112 Kiểm định LSD ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến màu sắc của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD MAU TOI 1 2 Bảng 113 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến mùi của tỏi lên men Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 114 Kiểm định LSD ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến mùi của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD MAU TOI 2 1 Bảng 115 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến vị của tỏi lên men Source 0.131424 Between groups 0.0671573 Within groups Total (Corr.) Bảng 116 Kiểm định LSD ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến vị của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD MAU TOI 2 1 Bảng 117 Phân tích ANOVA ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến cấu trúc của tỏi lên men Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng 118 Kiểm định LSD ảnh hưởng của mẫu tỏi lên men đến cấu trúc của tỏi lên men Method: 95.0 percent LSD MAU TOI 2 1