ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG PHÁT TRIỂN CÂY DƯỢC LIỆU
CNSH & Cây dược liệu
1. Nhân nhanh giống, tái sinh cây, Nhân sinh khối 2. Cải biến di truyền trao đổi chất 3. Sử dụng chuyển hóa tế bào 4. Chuyển gene 5. Chọn giống cây dược liệu 6. Bảo tồn, phân loại loài chính xác, truy xuất nguồn gốc
PHẦN 1
GIỚI THIỆU CHUNG
Xu hướng khai thác các hợp chất tự nhiên
• Tách chiết từ các nguồn tự nhiên
• Tổng hợp hóa học
• Tìm các nguồn hợp chất mới
• Cải biến hóa học
• Cải biến bằng xúc tác enzyme
• Sử dụng hệ thống xúc tác tế bào để chuyển hóa
• Sử dụng các sinh vật chuyển gene
Nguồn hợp chất tự nhiên
• Mô thực vật • Sinh vật biển (rong, tảo) • Động vật (trên cạn, biển) • Nọc độc • Nấm/vi nấm • Vi sinh vật
Những khó khăn trong khai thác các hợp chất tự nhiên
• Chỉ có mặt ở một số loài sinh vật nhất định • Chỉ có hoạt tính trong điều kiện nuôi trồng tự
nhiên
• Chỉ có hoạt tính khi ở dạng cấu trúc nhất định, các dạng đồng phân khác không có hoạt tính hoặc hoạt tính thấp
• Cải biến đặc hiệu vị trí bằng con đường hóa học
rất khó khăn (gắn các nhóm chức).
• Hàm lượng thấp, khó tinh sạch
Khai thác hợp chất tự nhiên
Lên men vi sinh vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi vi tảo Khó khăn: hoạt tính thấp hoặc không có hoạt tính
Tách chiết từ thực vật, vi sinh vật, nấm Khó khăn: tinh sạch và triển khai ở quy mô lớn, chi phí cao
Natural compounds
Chuyển hóa bằng enzyme Khó khăn: hiệu quả cao nhưng rất đắt
Tổng hợp hóa học Khó khăn: sản phẩm phụ, độc, các đồng phân không mong muốn
Các hợp chất tự nhiên
Hợp chất tự nhiên
Định nghĩa
•
Là hợp chất hóa học được tạo ra một cách tự nhiên bởi sinh vật
có hoạt tính sinh dược học sử dụng để sản xuất dược phẩm,
• Hợp chất tự nhiên cũng bao gồm các hợp chất được tổng hợp
thuốc…
hoàn toàn bằng con đường hóa học với các đặc điểm và tính
chất giống với các hợp chất được tổng hợp bởi sinh vật.
Những nhóm hợp chất tự nhiên quan trọng
• Terpenoid: tổng hợp từ Acetyl-CoA theo con đường
mevalonic (sesquiterpene và các dẫn xuất)
được tổng hợp theo con đường acid shikimic hoặc acid
• Phenol/polyphenol: những hợp chất chứa vòng thơm
malonic (flavonoid)
• Hợp chất chứa nitơ: từ các amino acid (alkaloid)
Ứng dụng hợp chất tự nhiên
• Thuốc chữa bệnh (ung thư, trợ tim, thần kinh) • Kháng sinh, kháng viêm • Chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch • Diệt côn trùng, ký sinh • Hương liệu • Chất màu bổ sung thực phẩm
Ví dụ: Hợp chất tự nhiên ức chế ung thư
• Gắn với tubulin • Ức chế topoisomerase • Ức chế telomerase
Tubulin và chất gắn với tubulin
• Vi ống là những protein dạng sợi được cấu
tạo từ tubulin. Trong quá trình phân bào, các
NST gắn vào vi ống để di chuyển về phía
trung tử.
• Các tế bào ung thư phân chia rất mạnh. Nếu
can thiệp vào quá trình gắn của các vi ống với
NST sẽ ức chế quá trình nhân lên của tế bào
ung thư.
• Gắn với tubulin sẽ ức chế được tế bào ung
thư.
Tương tác của các chất gắn tubulin sẽ dẫn đến thay đổi cấu trúc và ảnh hưởng đến chức năng của tế bào
Topoisomerase
Topoisomerase
• Topoisomerase tham gia vào quá trình sao chép
và sửa chữa DNA.
• Topoisomerase kiểm soát trạng thái xoắn của liên kết
phân tử DNA bằng cách cắt và nối phosphodiester của phân tử DNA.
Topoisomerase inhibitors
• Là những chất ức chế hoạt động của enzyme
Topoisomerase.
• Topoisomerase đang được coi là đích để phát triển các chất chống ung thư. Ức chế hoạt động của Topoisomerase các phân tử DNA sợi đơn ngắn hoặc các đoạn DNA mạch kép bị cắt thay đổi tính toàn vẹn của genome.
• Nhưng tế bào bị đứt gãy DNA sẽ bị chết theo cơ
chế apoptosis.
PHẦN 2
• ỨNG DỤNG CNSH TRONG PHÁT TRIỂN CÂY DƯỢC LIỆU
Nhân nhanh giống, tái sinh cây, Nhân sinh khối
Nhân nhanh giống, tái sinh cây, Nhân sinh khối
Cải biến di truyền trao đổi chất (metabolic engineering)
Ứng dụng CNSH để khai thác các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học
Con đường trao đổi chất
Con đường tổng hợp các hợp chất tự nhiên
Sinh vật
Các con đường tổng hợp
Vi khuẩn
MVA hoặc MEP
Vi khuẩn cổ
MVA
Tảo lục
MEP
Thực vật
Shikimic, MVA, MEP
Động vật
MVA
Nấm
MVA
MVA và MEP
Chuyển hóa sinh học
Quá trình chuyển hóa sinh học tạo ra nhiều hợp chất có đặc tính hóa học, sinh dược học
Tiền chất
Tế bào
Tế bào bình thường Tế bào cải biến di truyền
Chuyển hóa sinh học
Sản phẩm
Tiền chất
Nhà máy tế bào
Giá trị cao Hoạt tính mạnh Bền vững
Giá trị thấp Hoạt tính thấp Khó cải biến bằng con đường hóa học
Làm thế nào để có tiền chất?
Microalgae
Plants
Microbe
Non-mevalonate pathway (MVA) Sikimic acid pathway Mevalonate pathway (MEP)
Tế bào có nhiều con đường trao đổi chất có thể thu được tiền chất
Chuyển hóa sinh học
Sản phẩm
Tiền chất
Nhà máy tế bào
Giá trị cao Hoạt tính mạnh Bền vững
Giá trị thấp Hoạt tính thấp Khó cải biến bằng con đường hóa học
Làm thế nào để có tiền chất?
Microalgae
Plants
Microbe
Non-mevalonate pathway (MVA) Sikimic acid pathway Mevalonate pathway (MEP)
Tế bào có nhiều con đường trao đổi chất có thể thu được tiền chất
Chuyển gene mong muốn
Tiền chất
Nguồn gene Khai thác dữ liệu Các con đường trao đổi chất
Tế bào chủ
Kiểm tra hoạt tính Phân tích
Chuyển hóa
• Ức chế ung thư • Chống oxy hóa • Diệt côn trùng • Bệnh cây
Sản phẩm cuối cùng
• UV-vis • HPLC • Spectrofluorometer • NMR • MALDI MS
Phát triển sản phẩm
Nâng quy mô lớn
Công nghệ sinh học
• Khai thác sinh khối hoặc hệ thống xúc tác
tế bào – Thực vật: photobioreactor – Vi sinh vật (nấm, vi tảo): lên men
• Chuyển gene
– Thực vật: photobioreactor – Vi sinh vật (nấm, vi tảo): lên men
Reference data, Martin et al., 2001; Jackson et al., 2003; Martin et al., 2003; Ro et al., 2006; Takahashi et al., 2007, Asadollahi et al., 2008; Wang et al., 2011a; Albertsen et al., 2011; Peralta-Yahya et al., 2011; Westfall et al., 2012
Ví dụ
Artemisinin
Paclitaxel
Artemisia annua
Taxus brevifolia
Chất chống sốt rét
•
Sử dụng dưới dạng paclitaxel (Taxol) để chống ung thư hiệu quả trong nhiều năm
Tế bào nấm men được dùng, biểu hiện gene mã hóa enzyme amorphadiene synthase và cytochrome P450 monooxygenase (CYP71AV1)
Chuyển hóa thông qua con đường tổng hợp terpen. Toàn bộ cụm gene chuyển hóa đã được đưa vào E.coli và nấm men.
Món ngon
Ví dụ: Sản xuất axit glutamic
Model of induction of l-glutamate production in C. glutamicum.
Nakamura J et al. Appl. Environ. Microbiol. 2007;73:4491-4498
Nắm được các con đường trao đổi chất (khai thác các CSDL)
Sản xuất terpen ở E. coli: Nguồn FPP của tế bào chủ
Mevalonate vector
MEP pathway
MVA pathway Acetyl-CoA
Pyruvate
Cmr
Glyceraldehyde-3-phosphate
Acetyl-CoA
Acetyl-CoA acetyltransferase
DXP synthase
P15A ori
NADPH
DXP
CoA Acetoacetyl-CoA
Ptac
pAC-Mev 10.6 kbp
Acetyl-CoA
DXP reductoisomerase
MVA kinase
HMG-CoA synthase
NADP+
TrrnB
CoA
MEP
CTP
HMG-CoA
IPP isomerase
HMG CoA synthase
PMVA kinase
HMG CoA reductase
MEP cytidyl transferase
2NADPH
Pi
HMG-CoA reductase
ATP
2NADP- CoA
DPMVA decarboxylase
CDP-ME kinase
MVA
ATP
ADP
MVA kinase
CDP-ME Mevalonolacto CDP-ME-2-phosphate ne
ADP
MEcPP synthase
Removal of the HMG-CoA reductase and HMG-CoA synthase genes
PMVA
ATP
MEcPP
PMVA kinase
HMB-PP synthase
ADP
Cmr
DPMVA
HMB-PP
ATP
P15A ori
DPMVA decarboxylase
HMB-PP reductase
ADP, Pi, CO2
pAC-Mv 8.5 kbp
IPP
DMAPP
IPP
TrrnB
IPP isomerase
GPP synthase
Ptac
IPP isomerase
DPMVA decarboxylase
PMVA kinase
MVA kinase
GPP IPP FPP synthase
Sesquiterpene cyclase
FPP
MCS
quinone and cell wall biosynthesis
Sesquiterpene
Chuyển gene cải biến trao đổi chất
• Khai thác quá mức dẫn đến cạn kiệt nguồn dược liệu
Bảo tồn
• Nhận diện, phân loại loài chính xác: Kết hợp mô tả
hình thái với phân tích DNA barcode, finger printing
• Bảo tồn in-situ & ex-situ • Ví dụ: Các cây quý như sâm ngọc linh, xáo tam phân
Các hướng cải biến di truyền
1. Loại bỏ chất ức chế enzyme (ức chế dị lập thể) để tăng hoạt động của enzyme dẫn đến tăng sản phẩm tạo thành 2. Loại bỏ hoặc ức chế hoạt động của các enzyme hoặc con đường nhánh để giảm sự cạnh tranh cơ chất hoặc sản phẩm cuối cùng bị chuyển hóa tiếp hoặc tạo ra sản phẩm gây độc tế bào (gene knock out/RNAi)
4. Đưa gene có nguồn gốc bên ngoài hoặc tái tổ hợp để cải
3. Cải biến các đặc tính enzyme (đột biến định hướng) để tạo ra các đặc tính mới hoặc tăng phạm vi sử dụng cơ chất tạo ra sản phẩm mới
thiện khả năng tổng hợp sản phẩm
5. Cung cấp con đường để loại bỏ các sản phẩm phụ hoặc
tích lũy chất độc
Loại bỏ chất ức chế enzyme (ức chế dị lập thể) để tăng hoạt động của enzyme dẫn đến tăng sản phẩm tạo thành
Loại bỏ hoặc ức chế hoạt động của các enzyme hoặc con đường nhánh để giảm sự cạnh tranh cơ chất hoặc sản phẩm cuối cùng bị chuyển hóa tiếp hoặc tạo ra sản phẩm gây độc tế bào (gene knock out/RNAi)
Phương pháp tác động gene đích
RNAi
Cải biến các đặc tính enzyme (đột biến định hướng) để tạo ra các đặc tính mới hoặc tăng phạm vi sử dụng cơ chất tạo ra sản phẩm mới
Một số hướng ứng dụng kỹ thuật di truyền trao đổi chất và ví dụ minh họa
1. Loại bỏ chất ức chế enzyme (ức chế dị lập thể) để tăng hoạt động của enzyme dẫn đến tăng sản phẩm tạo thành
• Vị trí dị lập thể bị biến đổi dẫn đến phân tử điều hòa không thể gắn được vào.
• Phản ứng không bị
ức chế.
Ví dụ tổng hợp Lysine ở quy mô công nghiệp
• Con đường tổng hợp Lysine từ oxaloacetat và pyruvate ở C. gluamicum xảy ra thông qua một con đường phân nhánh. Enzyme chuyển hóa Aspartate kinase điều khiển tổng hợp tiền chất Aspartylphosphate. Enzyme này sẽ bị ức chế khi nồng độ L-Lysine và L-threonin tăng cao trong tế bào.
• Bằng cách gây đột biến gene tổng hợp
enzyme Aspartate kinase mất đi vị trí dị lập thể dẫn đến nồng độ L-Lysine và L-threonin tăng những enzyme vẫn khoạt động. Kết quả chuỗi chuyển hóa được diễn ra liên tục mà không chịu ảnh hưởng bởi nồng độ của 2 amino acid trên.
• Đây chính là cơ chế tổng hợp Lysine ở quy mô công nghiệp sử dụng các chủng đột biến Aspartate kinase.
2. Cải biến các đặc tính enzyme (đột biến định hướng) để tạo ra các đặc tính mới hoặc tăng phạm vi sử dụng cơ chất tạo ra sản phẩm mới
Cải biến enzyme protein
• Thay đổi cấu trúc, đặc điểm xúc tác (cơ chất) • Thay đổi đặc điểm hóa sinh (bền nhiệt, pH…)
3. Loại bỏ hoặc ức chế hoạt động của các enzyme hoặc con đường nhánh để giảm sự cạnh tranh cơ chất hoặc sản phẩm cuối cùng bị chuyển hóa tiếp hoặc tạo ra sản phẩm gây độc tế bào (gene knock out/RNAi).
Tổng hợp các hợp chất trao đổi
Fatty acid synthase
Fatty acid synthase
Công nghệ RNAi
Tổng hợp L-DOPA
• L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) được sử dụng làm thuốc điều trị Parkinson rất hiệu quả.
Chuyển hóa L-DOPA từ Tyrosine
Ức chế tyrR Ức chế trpD
http://2013.igem.org/Team:UT-Tokyo/Project#rBackground
4. Đưa gene có nguồn gốc bên ngoài hoặc tái tổ hợp để cải thiện khả năng tổng hợp sản phẩm
Điều hòa tích lũy b-caroten
Wild types
Không xảy ra ở thực vật
Transplastomic
Plant Physiology April 2011vol. 155no. 41501-1510
Ví dụ: Chuyển gene vào plasmid hoặc gắn trực tiếp vào NST của vật chủ để nâng cao hoạt tính chuyển hóa trong một con đường chuyển hóa
Ví dụ Chuyển hóa terpenoids
Cải biến hóa học Chuyển hóa bằng enzyme
Terpenes
Terpenoids
Bổ sung các nhóm chức năng Oxy hóa hoặc sắp xếp lại khung C
Terpene cyclase Là một enzyme vòng hóa, xúc tác phản ứng tạo vòng trong hóa học
Valencene nootkatone
Valencene là một sesquiterpene (hợp chất vòng thơm ở cam) rất rẻ. Được tổng hợp từ FPP (farnesyl pyrophosphate) bởi enzyme terpene cyclase.
Terpene cyclase
FPP Valencene
Nootkatone là hợp chất hữu cơ tự nhiên và có phạm vi ứng dụng rất lớn. Giá thành rất cao. Đó là một dạng sesquiterpene và ketone.
Cytochrome P450
Valencene
Nootkatone
Ví dụ: Ứng dụng của nootkatone
• Nootkatone được sử dụng ở dạng phun xịt để xua đuổi, diệt muỗi, gián, côn trùng
Deer tick
• Thân thiện với môi trường, không
độc cho người
• Sử dụng phổ biến làm chất bổ sung thức ăn, mỹ phẩm, thuốc, dược phẩm.
Application of biotransformation
Vector mang cả con đường chuyển hóa
Mevalonate vector
Cmr
P15A ori
Ptac
pAC-Mev 10.6 kbp
MVA kinase
TrrnB
IPP isomerase
HMG CoA synthase
PMVA kinase
HMG CoA reductase
DPMVA decarboxylase
Removal of the HMG-CoA reductase and HMG-CoA synthase genes
Cmr
P15A ori
pAC-Mv 8.5 kbp
TrrnB
Ptac
IPP isomerase
DPMVA decarboxylase
PMVA kinase
MVA kinase
Gene mong muốn: Tách dòng từ các nguồn tự nhiên Đặt tổng hợp từ các công ty (synthesized genes)
MCS
Sử dụng các hệ thống vector biểu hiện tương ứng ở các tế bào chủ khác nhau.
Ưu điểm khi sử dụng hệ thống chuyển hóa bằng tế bào
• Ưu tiên dùng các dạng đơn bào
• Có chứa các con đường chuyển hóa và tiền chất
• Sinh trưởng nhanh, ít lẫn tạp
• Môi trường nuôi cấy rẻ
• Dễ dàng mở rộng ở quy mô lớn
• Sử dụng các photobioreactor
Chuyển gene vào vi sinh vật
• Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản • Tốc độ sinh trưởng nhanh • Dễ dàng chuyển cả cụm gene điều khiển bởi 1
promoter (multicistronic)
• Dễ dàng tiết ra ngoài môi trường • Khó khăn: Dễ lẫn tạp, môi trường nuôi cấy chi phí cao. Các con đường chuyển hóa hạn chế. Cần phải cung cấp tiền chất
Chuyển gene vào nấm men
• Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản • Có thể chuyển nhiều gene xen nhập vào
genome thông qua trao đổi chéo các đoạn tương đồng
• Tốc độ sinh trưởng nhanh • Dễ dàng tiết ra ngoài môi trường • Khó khăn: Dễ lẫn tạp, môi trường nuôi cấy chi phí cao. Các con đường chuyển hóa hạn chế, cần phải cung cấp tiền chất
Chuyển gene vào thực vật
•
Sự phức tạp của hệ thống biểu hiện gene ở thực vật
•
• Mỗi gene chịu sự kiểm soát của 1
promoter Kết hợp sử dụng hệ thống tái tổ hợp ở nấm men để chuyển nhiều gene vào 1 vector
• Ưu điểm: Con đường trao đổi
chất rất phong phú
Mục đích
• Sử dụng hệ thống tế bào để chuyển hóa các hợp chất ít giá trị thành các hợp chất có giá trị cao hơn nhiều.
• Ứng dụng để tạo ra các hợp chất mới có hoạt tính
sinh học cao hơn, giá thành rẻ hơn.
• Phát triển các sản phẩm ứng dụng trong nông nghiệp, bảo vệ thực vật, thuốc, mỹ phẩm…
Hướng tiếp cận
• Khai thác cơ sở dữ liệu các hợp chất và các gene chuyển hóa cũng
như con đường chuyển hóa các chất đó.
• Sàng lọc tiền chất phù hợp • Sử dụng các tế bào chủ
• Sử dụng các tế bào chuyển gene
– Vi sinh vật (E.coli, Bacillus sp., S. pombe and yeasts…) – Vi tảo (nước ngọt và nước mặn) – Tế bào thực vật
– Tách dòng gene hoặc cụm gene mong muốn từ các nguồn tự
nhiên hoặc tổng hợp gene
phương pháp khác nhau
– Chuyển các gene vào vector và đưa vào tế bào chủ bằng nhiều
• Các tế bào chủ: E.coli, S. pombe, cerevisiae, D. salina, C. vulgaris
Bảo tồn, phân loại loài chính xác, truy xuất nguồn gốc
• Khai thác quá mức dẫn đến cạn kiệt nguồn dược liệu
Bảo tồn
• Nhận diện, phân loại loài chính xác: Kết hợp mô tả
hình thái với phân tích DNA barcode, finger printing
• Bảo tồn in-situ & ex-situ • Ví dụ: Các cây quý như sâm ngọc linh, xáo tam phân
Nông nghiệp công nghệ cao
• Nông nghiệp công nghệ cao sử dung phương pháp canh tác hiện đại, trong đó hướng tới giảm chi phí đầu vào và tăng giá trị sản phẩm nông nghiệp đầu ra theo định hướng phát triển bền vững, an toàn và thân thiện với môi trường.
• Nông nghiệp công nghệ cao hướng tới không đòi hỏi nhiều đất canh tác, dễ dàng mở rộng quy mô, điều khiển tự động, giá trị gia tăng/đơn vị diện tích)
• 4 tiêu chí: Công nghệ, kinh tế, xã hội và môi trường là phương
châm hướng tới của nông nghiệp công nghệ cao.
Những đặc thù riêng của CNSH vi tảo
1.
2.
Phù hợp và gắn với phát triển nông nghiệp công nghệ cao (không đòi hỏi đất canh tác, dễ dàng mở rộng quy mô, điều khiển tự động, giá trị gia tăng/đơn vị diện tích), không ảnh hưởng đến quỹ đất nông nghiệp và không phụ thuộc vào thời vụ. Phạm vi ứng dụng rộng: Thực phẩm chức năng, hoạt chất sinh học, thức ăn thủy hải sản, mỹ phẩm, thuốc
3. Dễ dàng triển khai mô hình và áp dụng tại các địa phương 4.
Trong hướng nghiên cứu ứng dụng, con đường dẫn đến sản phẩm tương đối nhanh
Những lĩnh vực ứng dụng triển vọng của CNSH vi tảo
Sản xuất nhiên liệu sinh học: Biodiesel
• Nuôi sinh khối tảo ở quy mô lớn làm nguồn thức ăn • Axit béo và axit béo không no • Các hoạt chất có hoạt tính sinh dược học • Xử lý ô nhiễm môi trường • • Vật chủ để chuyển gene
Các sản phẩm từ vi tảo
SẢN XUẤT ASTAXANTHIN TỪ VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS
Astaxanthin
Từ phòng thí nghiệm đến sản xuất
Bộ sưu tập chủng giống vi tảo
