Các bước cơ bản của
phương pháp tách dòng
Quá trình thực hiện có thể thay đổi phụ thuộc vào nhân tố tham gia và mục
đích của quá trình tách dòng. Tuy nhiên để tạo dòng, cần phải thực hiện các
bước sau:
1. Tách lập các DNA lạ cần tạo dòng
Chọn và cắt DNA lạ của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế (RE). Phân
lập đoạn DNA (gen quí) phù hợp với vector và mục đích cần tạo dòng.
Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa biết, người nghiên cứu
có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng khi dự đoán cấu trúc protein
do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA.
Tạo đầu dính khi cần thiết.
2. Chọn và xử lí vector
Chọn vector cần phải chú ý những yêu cầu sau: độ lớn của gen lạ (đoạn cài),
loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phương pháp ứng dụng.
Xử lí vector: cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế cùng loại với enzyme đã cắt
DNA nói trên (để tạo những vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép
sau này). Khử nhóm phosphat bằng enzyme alkanline phosphotase để tránh
hai đầu vector đóng kín trở lại.
3. Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp)
Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng
một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại
với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.
Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của E.
Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai.
4. Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp
hoặc tải nạp
Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép
vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao. Việc chuyển DNA tái tổ
hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến, nghĩa là
có khả năng thấm vector tái tổ hợp. Sự thấm này có thể xảy ra một cách tự
nhiên hoặc được cảm ứng. Tuy nhiên, nó sẽ phụ thuộc vào loại plasmid sử
dụng làm vector và phụ thuộc vào sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong
vector mà người nghiên cứu sẽ chọn phương pháp biến nạp hoặc tải nạp.
Biến nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D
(Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần sự tiếp xúc giữa hai tế
bào hoặc nhân tố trung gian là phage hoặc virus. Biến nạp được thực hiện với
vector chuyển gen là plasmid. Có nhiều phương pháp biến nạp như hóa biến
nạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phương pháp bắn gen và phương
pháp vi tiêm.
Tải nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D
(Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception) qua nhân tố trung gian là virus.
Tải nạp được thực hiện với vector chuyển gen có nguồn gốc là virus như
phage, cosmid,
...
5. Phát hiện dòng cần tìm
Công việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn. Việc chọn
lựa những chủng như ý muốn là không đơn giản, vì cách tiến hành thí nghiệm
trong một hỗn hợp không đồng nhất nên các dòng vi khuẩn có thể mọc lên
theo ba khả năng:
- Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp,
- Tế bào nhận plasmid nhưng không có gen lạ,
- Tế bào vi khuẩn nhận được plasmid tái tổ hợp.
Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà người ta có các phương pháp khác
nhau để xác định dòng cần tìm. Nếu mục đích là nghiên cứu đoạn gen chưa
biết, người ta thường dùng đầu dò. Nếu đoạn DNA đã biết (cDNA), công
việc sẽ đơn giản và nhanh chóng.
6. Kiểm tra và thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợp
Tùy từng trường hợp cụ thể mà người nghiên cứu đưa ra những phương pháp
kiểm tra thu hồi sản phẩm của gen tái tổ hợp. Nếu là mục đích thiết lập ngân
hàng cDNA, ta phải tiến hành các bước sau: Đầu tiên người ta phải tách
plasmid tái tổ hợp ra khỏi dịch nuôi cấy, sau đó, cắt plasmid tái tổ hợp bằng
enzyme RE loại II và thu được hai băng DNA, một có độ dài bằng khung
vector, còn băng khác có độ dài tương ứng đúng bằng cDNA. Cách kiểm tra
lại cDNA đã được cắt bằng cách điện di trên gel agaroza 0,8% và kiểm tra lại
độ dài của những băng cDNA thu được. Những đoạn có kích thước khác
nhau sẽ di chuyển những khoảng cách khác nhau trên gel.
Nếu sản phẩm của gen tái tổ hợp là protein, enzyme, hormone, vaccine,
kháng sinh,... người ta có thể thu nhận sản phẩm bằng phương pháp chiết tách
lắng lọc ly tâm kết tủa phân đoạn hoặc trao đổi ion.