Các bước cơ bản của phương pháp tách dòng

Chia sẻ: Nguyen AAA | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

129
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Quá trình thực hiện có thể thay đổi phụ thuộc vào nhân tố tham gia và mục đích của quá trình tách dòng. Tuy nhiên để tạo dòng, cần phải thực hiện các bước sau: 1. Tách lập các DNA lạ cần tạo dòng Chọn và cắt DNA lạ của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế (RE). Phân lập đoạn DNA (gen quí) phù hợp với vector và mục đích cần tạo dòng. Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Các bước cơ bản của phương pháp tách dòng

Các bước cơ bản của phương pháp tách dòng Quá trình thực hiện có thể thay đổi phụ thuộc vào nhân tố tham gia và mục đích của quá trình tách dòng. Tuy nhiên để tạo dòng, cần phải thực hiện các bước sau: 1. Tách lập các DNA lạ cần tạo dòng Chọn và cắt DNA lạ của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế (RE). Phân lập đoạn DNA (gen quí) phù hợp với vector và mục đích cần tạo dòng. Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng khi dự đoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA. Tạo đầu dính khi cần thiết.
2. Chọn và xử lí vector Chọn vector cần phải chú ý những yêu cầu sau: độ lớn của gen lạ (đoạn cài), loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phương pháp ứng dụng. Xử lí vector: cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế cùng loại với enzyme đã cắt DNA nói trên (để tạo những vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này). Khử nhóm phosphat bằng enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector đóng kín trở lại. 3. Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp) Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung. Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của E. Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai. 4. Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao. Việc chuyển DNA tái tổ
hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến, nghĩa là có khả năng thấm vector tái tổ hợp. Sự thấm này có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc được cảm ứng. Tuy nhiên, nó sẽ phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector và phụ thuộc vào sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong vector mà người nghiên cứu sẽ chọn phương pháp biến nạp hoặc tải nạp. Biến nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần sự tiếp xúc giữa hai tế bào hoặc nhân tố trung gian là phage hoặc virus. Biến nạp được thực hiện với vector chuyển gen là plasmid. Có nhiều phương pháp biến nạp như hóa biến nạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phương pháp bắn gen và phương pháp vi tiêm. Tải nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception) qua nhân tố trung gian là virus. Tải nạp được thực hiện với vector chuyển gen có nguồn gốc là virus như phage, cosmid, ... 5. Phát hiện dòng cần tìm Công việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn. Việc chọn lựa những chủng như ý muốn là không đơn giản, vì cách tiến hành thí nghiệm trong một hỗn hợp không đồng nhất nên các dòng vi khuẩn có thể mọc lên theo ba khả năng:
- Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp, - Tế bào nhận plasmid nhưng không có gen lạ, - Tế bào vi khuẩn nhận được plasmid tái tổ hợp. Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà người ta có các phương pháp khác nhau để xác định dòng cần tìm. Nếu mục đích là nghiên cứu đoạn gen chưa biết, người ta thường dùng đầu dò. Nếu đoạn DNA đã biết (cDNA), công việc sẽ đơn giản và nhanh chóng. 6. Kiểm tra và thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợp Tùy từng trường hợp cụ thể mà người nghiên cứu đưa ra những phương pháp kiểm tra thu hồi sản phẩm của gen tái tổ hợp. Nếu là mục đích thiết lập ngân hàng cDNA, ta phải tiến hành các bước sau: Đầu tiên người ta phải tách plasmid tái tổ hợp ra khỏi dịch nuôi cấy, sau đó, cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme RE loại II và thu được hai băng DNA, một có độ dài bằng khung vector, còn băng khác có độ dài tương ứng đúng bằng cDNA. Cách kiểm tra lại cDNA đã được cắt bằng cách điện di trên gel agaroza 0,8% và kiểm tra lại độ dài của những băng cDNA thu được. Những đoạn có kích thước khác nhau sẽ di chuyển những khoảng cách khác nhau trên gel.
Nếu sản phẩm của gen tái tổ hợp là protein, enzyme, hormone, vaccine, kháng sinh,... người ta có thể thu nhận sản phẩm bằng phương pháp chiết tách lắng lọc ly tâm kết tủa phân đoạn hoặc trao đổi ion.