CHƯƠNG II CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ & TẾ BÀO THỰC

Chia sẻ: Nguyễn Thị Phương Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:14

Thêm vào BST

Báo xấu

551
lượt xem 200
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Lịch sử phát triển • Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể. • Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua. • Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. • Năm 1960 – 1964, Morel nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CHƯƠNG II CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ & TẾ BÀO THỰC

2/28/2011 Nguồn gốc sự sống? • Các nhà khoa học theo thuyết tự sinh: đất ẩm  cỏ dại, bùn  lươn,…  Sự sống tự sinh (ngẫu nhiên) CHƢƠNG II CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ & TẾ BÀO THỰC VẬT Nguồn gốc sự sống? • Pasteur: sữa để lâu  chua  sinh vật có nguồn gốc từ sinh vật Sinh vật duy trì nòi giống Tính toàn thế như thế nào? Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Lịch sử phát triển • Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể. • Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua. = Thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật trong • Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi ống nghiệm có chứa môi trường dinh trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong dưỡng thích hợp trong điều kiện vô kỹ thuật nuôi cấy mô. trùng. • Năm 1960 – 1964, Morel nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng  thương mại hóa. 1
2/28/2011 Các bƣớc nhân giống in vitro Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật • Về mặt lý luận sinh học cơ bản B1 B2 • Về mặt thực tiễn sản xuất 1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy 2. Tạo thể nhân giống B3 3. Nhân giống in vitro 4. Tái sinh cây hoàn chỉnh 5. Chuyển cây con ra vườn ươm B4 B5 2. Tạo thể nhân giống in vitro 1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy • Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng • Khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro. của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy • Có 2 thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vị trí lấy mẫu đó. vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây • Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà trồng. phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử • Đối với những loài không có khả năng nhân trùng hóa học như calcium hypochloride, giống, người ta thường nhân giống bằng cách chlorur thủy ngân,... tạo cụm chồi từ mô sẹo. 3. Nhân giống in vitro 4. Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh • Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường • Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. sống khi ra môi trường bình thường. • Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình • Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro thay vào đó là các chất kích thích quá trình ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự gian dài. nhiên bên ngoài. 2
2/28/2011 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình 5. Chuyển cây con ra vƣờn ƣơm nuôi cấy mô thực vật • Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,... Độ thoáng khí Ánh sáng • Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do Môi trường nuôi cấy Mẫu cấy sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. 1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy 1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy  Kiểu di truyền:  Tuổi sinh lý của cây: • Những cây hai lá mầm thông thường có khả • Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao. năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây • Các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn, khi hạt trần rất khó tái sinh. cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng • Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên thì chúng hầu như dễ tái sinh giảm theo. in vitro. • Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mẫu cấy già • Trong một số cây hai lá mầm thì Solanaceae, từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae và sinh và phân chia tế bào. Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh nhất. 1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy 1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy  Tuổi của mô và cơ quan:  Tình trạng sinh lý: • Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy • Thông thường các bộ phận của cây trong giai hơn những mô cứng nhưng cũng có nhiều trường đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn hợp ngoại lệ. sinh sản. • Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt • Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông khó hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân vượt qua được giai đoạn này. chia tế bào giảm. 3
2/28/2011 1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy 1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy  Vị trí của mẫu cấy trên cây:  Kích thước mẫu cấy: • Những chồi ban đầu được tách từ vị trí thấp • Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô trên cây phát triển trong môi trường in vitro phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. chồi nách. • Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh • Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn những cơ những mẫu cấy có nguồn gốc từ những phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có quan ít chất dự trữ. phản ứng in vitro giống nhau. 1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy 1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy  Vết thương:  Phương pháp cấy: • Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai • Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường trò quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy. theo nhiều cách khác nhau: có cực hoặc không có cự c. • Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các chất điều hòa đồng • Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu thời ethylene được tạo ra nhiều hơn. được cấy không cực. 2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng 1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy  Kiểu di truyền  Khoáng đa lượng:  Tuổi sinh lý của cây • Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách  Tuổi của mô và cơ quan rời không khác nhiều so với cây trồng trong  Tình trạng sinh lý điều kiện tự nhiên.  Vị trí của mẫu cấy trên cây • Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N,  Kích thước mẫu cấy P, K, Ca, Mg  Vết thương  Phương pháp cấy 4
2/28/2011 2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng 2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng  Khoáng vi lượng:  Carbon và nguồn năng lượng: • Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, • Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi sucrose. lượng vào môi trường nuôi cấy. • Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến • Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào hành thử nghiệm như lactose, galactose, là: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo… maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose. 2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng 2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng  Vitamin:  Chất điều hòa tăng trưởng thực vật: • Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin • Có 5 nhóm chất điều hoà quan trọng trong nuôi cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của cấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, chúng. acid abscisic và ethylen. • Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất • Tỉ lệ auxin/cytokinin (A/C) xác định dạng phân trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy: A/C nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol. cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi. Auxin Cytokinin • Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng • Kích thích tế bào phân chia (với điều kiện có trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô auxin). phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. • Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự • Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. khởi rễ, nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng • Kinetin, zeatin, BA, TDZ của các sơ khởi này. • IAA, IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T, phenoxyacetic acid 5
2/28/2011 2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng 2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng  Các chất hữu cơ không xác định:  Nguồn cung cấp nitrogen: • Bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào • Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô. amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. • Các chất bổ sung này là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa • Các nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng là hỗn mạch, chuối, nước cam, nước cà chua... hợp amino acid như casein hydrolysate, L- glutamine, L-asparine và adenine. 2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng 2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng  Than hoạt tính:  Yếu tố làm đặc môi trường: • Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường • Agar là chất thường sử dụng để tạo môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật. • Ảnh hưởng của than hoạt tính: kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt • Agar không phản ứng với các chất trong môi tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô trường. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy. độ agar sử dụng và pH của môi trường. 2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng  Khoáng đa lượng Một số công thức môi trường thường được sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô và tế bào thực vật  Khoáng vi lượng như môi trường MS (Murashige và Skoog), B5  Carbon và nguồn năng lượng (Gamborg và cộng sự), SH (Schenk và  Vitamin Hilderbrandt) có hàm lượng khoáng đa lượng cao  Chất điều hòa tăng trưởng thực vật và một số môi trường khác được mô tả bởi White, Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm lượng  Các chất hữu cơ không xác định, nguồn cung khoáng đa lượng thấp hơn. cấp nitrogen, than hoạt tính, yếu tố làm đặc môi trường 6
2/28/2011 Khoáng đa lƣợng mg l-1 NH4NO3 1650 KNO3 1900 Stock 1 x 50 (20ml/l) KH2PO4 170 MgSO4.7H2O 370 NH4NO3 82,5 g/l CaCl2.2H2O 440 Khoáng đa lƣợng Khoáng vi lƣợng mg l-1 Thành KNO3 95 g/l KI 0.83 NH4NO3 1650 mg/l phần H3BO3 6.2 KH2PO4 8,5 g/l KNO3 1900 mg/l MnSO4.4H2O 22.3 môi ZnSO4.7H2O 8.6 Stock 2 x 100 (10ml/l) KH2PO4 170 mg/l trường Na2MoO4.2H2O 0.25 CaCl2.2H2O 440 mg/l MS CuSO4.5H2O 0.025 CaCl2.2H2O 44 g/l CoCl2.6H2O 0.025 MgSO4.7H2O 370 mg/l Stock 3 x 100 (10ml/l) Na2.EDTA 37.3 FeSO4.7H2O 27.8 MgSO4.7H2O 37 g/l Vitamin và các chất hữu cơ khác mg l-1 Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0.5 Pyridoxine HCl 0.5 Thiamine HCl 0.1 Glycine 2.0 Stock 4 x 50 (20ml/l) Khoáng vi lƣợng KI 41,5 mg/l KI 0,83 mg/l Vitamin H3BO3 310 mg/l Stock 6 x 200 (5ml/l) H3BO3 6,2 mg/l MnSO4.4H2O 1115 mg/l Myo-Inositol 100 mg/l Myo-Inositol 20 g/l MnSO4.4H2O 22,3 mg/l ZnSO4.7H2O 430 mg/l Nicotinic acid 0,5 mg/l Nicotinic acid 100 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l Na2MoO4.2H2O 12,5 mg/l Pyridoxine HCl 100 mg/l Pyridoxine HCl 0,5 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 1,25 mg/l Thiamine HCl 20 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l Thiamine HCl 0,1 mg/l CoCl2.6H2O 1,25 mg/l Glycine 400 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l Stock 5 x 100 (10ml/l) Glycine 2,0 mg/l Na2.EDTA 37,3 mg/l Na2.EDTA 3,73 g/l FeSO4.7H2O 27,8 mg/l FeSO4.7H2O 2,78 g/l Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi Nuôi cấy nốt đơn thân cấy mô thực vật  Phương pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân Độ thoáng khí ngắn. Chồi này sẽ được kích thích cho tăng Ánh sáng trưởng, ra rễ để tạo thành cây nguyên vẹn. Môi trường nuôi cấy Mẫu cấy  Một số mô hình và hệ thống nuôi cấy mới 7
2/28/2011 Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng  Virus thực vật là một trong những tác nhân gây  Năm 1949, Limasset và Cornuet nhận thấy thiệt hại nặng nề cho nền nông nghiệp. trong cây bị nhiễm, mật độ virus giảm dần khi  Virus lây lan nhờ côn trùng, tuyến trung, ve rận đến gần điểm phát triển sinh dưỡng. hoặc thông qua con đường cơ học.  Năm 1952, Morel và Martin khẳng định có thể  Virus lan truyền trong cơ thể thực vật qua các tách mô phân sinh chồi đỉnh của cây trồng bị bó mạch. Đa số các loài virus không truyền nhiễm virus in vitro để thu được cây sạch bệnh. nhiễm qua hạt.  Xử lý nhiệt, hóa chất,… Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng  Mô phân sinh là một đỉnh tròn gồm các tế bào  Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch bệnh virus làm nguồn mẫu cho nuôi cấy in vitro, trước phân chia tích cực, có đường kính khoảng 0,1 mm và dài khoảng 0,25 mm. tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau đó thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này.  Sử dụng khối mô bao gồm cả đỉnh sinh trưởng và 1 hoặc 2 sơ khởi lá có kích thước 0,5-1 mm. Nuôi cấy bao phấn • Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn  các cây đơn bội và đơn bội kép  biểu hiện tất cả các tính trạng  ứng dụng trong việc chọn giống Quy trình nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng • Được áp dụng thành công ở trên 250 loài thực vật, gồm các cây thuộc họ Liliaceae. 8
2/28/2011 Nuôi cấy bao phấn Nuôi cấy bao phấn • Vật liệu • Phƣơng pháp Nụ hoa 3,5 – 5 cm chứa hạt phấn ở giai đoạn • Khử trùng với etanol 70 1 phút và đơn nhân muộn. hypoclorid calcium 8% 15 phút • Nuôi cấy trên MS có picloram 2mg/l, zeatin 2mg/l và sacaroz 6% • Trong tối, ở 25°C  mô sẹo • Sau 2 tháng, mô sẹo  MS có picloram 0,1mg/l, BA 0,01mg/l và sacaroz 3%  cụm chồi • Cây con  môi trường MS  tăng trưởng và tạo rễ (ở 25oC, 1600  100 lux) Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật Sau 14 ngày GĐ 2 tế bào Độ thoáng khí Ánh sáng Hạt phấn GĐ 4 tế bào Quy trình nuôi cấy bao phấn Môi trường nuôi cấy Mẫu cấy  Một số mô hình và hệ thống Cây con GĐ 8 tế bào nuôi cấy mới Cụm chồi Mô sẹo (sau 2 tháng) Hệ thống nuôi cấy Bioreactor Môi trƣờng rắn: - Lãng phí - Tích tụ phenol gây độc cho mẫu cấy Môi trƣờng lỏng: - Trao đổi khí hạn chế - Dễ xảy ra hiện tượng thủy tinh thể 9
2/28/2011 Môi trƣờng lỏng lắc: - Gây tổn thương cho mẫu cấy Môi trƣờng lỏng có sục khí: (Bioreactor) Hệ thống nuôi cấy Bioreactor tự tạo Bioreactor = bình phản ứng có những tính chất: • Điều kiện vô trùng • Môi trường lỏng có sục khí • Số lượng mẫu cấy nhiều • Có khả năng tự động hóa Hệ thống nuôi cấy Bioreactor tự động 10
2/28/2011 Các thông số ảnh hƣởng đến hiệu quả của Quy trình nhân sinh khối thực vật bằng hệ hệ thống Bioreactor thống Bioreactor: • B1. Thiết lập môi trường nuôi cấy vô trùng • Sự vận chuyển khí oxy và khả năng hòa tan oxy • B2. Nhân sinh khối vào môi trường • B3. Tạo rễ cho cây con trước khi ra vườn ươm • Môi trường dinh dưỡng Hệ thống ngập chìm tạm thời Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 11
2/28/2011 Hệ thống ngập chìm tạm thời Các thông số ảnh hƣởng đến hiệu quả của hệ thống ngập chìm tạm thời • Thời gian ngập chìm, tần số ngập chìm • Thể tích môi trường dinh dưỡng, thể tích bình nuôi cấy • Sự thoáng khí tự nhiên và sự thoáng khí cưỡng bức Hệ thống nuôi cấy quang tự dƣỡng Vai trò của ánh sáng đối với thực vật Ánh sáng khả kiến Bƣớc sóng ánh sáng quang hợp 12
2/28/2011 Những nguồn sáng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật Nuôi cấy quang tự dƣỡng Nuôi cấy quang tự dƣỡng • Chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường • Không sử dụng đường và các chất hữu cơ, tạo điều nuôi cấy như ion, cường độ ánh sáng, thời gian kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng chiếu sáng, thành phần không khí, ẩm độ,… thay khí CO2 có sẵn trong không khí làm nguồn carbon vì chỉ nghiên cứu thành phần hóa học của môi chính cho quá trình tăng trưởng và phát triển trường nuôi cấy như nồng độ đường, vitamin hay của cây  Giảm chi phí, giảm tỉ lệ nhiễm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Nuôi cấy quang tự dƣỡng • Hộp nuôi cấy quang tự dưỡng = nhà kính thu nhỏ  tạo điều kiện cho cây in vitro thích nghi dần với điều kiện ex vitro trước khi chuyển ra vườn ươm 13
2/28/2011 14