CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
• Tách chiết phân tách AND ngoại lai từ sinh vật đích • Phản ứng nối AND – vector tạo phân tử AND TTH • Chuyển AND TTH vào tế bào chủ • Chọn lọc các tế bào mang AND TTH • Sản xuất, tinh sạch protein
Các bước cơ bản tạo ADNtái tổ hợp
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
• Endonuclease giới hạn (RE)
CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
Vector nhân dòng
•Vector plasmid •Vector thực khuẩn thể lambda •Cosmid •BAC •YAC
1. Vector plasmid
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
Biểu hiện gen ở các promoter mạnh và có thể điều
chỉnh
thường xuyên
• Tối ưu hóa sự biểu hiện của gen nhân dòng • Khó khăn: Kiệt quệ năng lượng của tế bào chủsuy yếu các chức năng cần thiết o Promoter có thể điều chỉnh • Chỉ biểu hiện gen nhân dòng trong giai đoạn sinh trưởng đặc biệt của tế
bào chủ
• Chỉ biểu hiện trong một thời gian xác định
o Promoter mạnh • Có ái lực cao với ARN – pol vùng nằm ngay sau nó được phiên mã
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
Một số promoter phổ biến o Promoter lac o Promoter trp o Promoter tac o Promoter trc o Promoter pL o Promoter gen 10 từ thực khuẩn thể T7
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
o Promoter lac
Vùng promoter – operator lac
N ng ồ đ ộ AMPv
M c đ ộ ứ phiên mã
N ng ồ đ ộ glucos e
N ng ồ đ ộ lactos e
cao
Th pấ
Th pấ
Th pấ
AMPv CA P promoter
gen
cao
Th pấ
Th pấ
Th pấ
promoter
Th c ể ứ ch lacế operator Th c ể ứ ch lacế operator
gen
cao
cao
Th pấ
Th pấ
operator
gen
cao
cao
cao
Th pấ
promoter AMPv CA P promoter
operator
gen
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
o Promoter trp • Điều hòa âm: nồng độ trp tăng đóng promoter ức chế
• Hiện tượng “rò rỉ”: phiên mã vẫn diễn ra ngay cả khi gen
phiên mã
đã đóng lại
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
o Promoter tac và trc: • Chứa vùng 35 của promoter trp và vùng 10 của promoter lac • khác nhau một cặp base duy nhất: Promoter tac: vùng 35 của trp và 10 của lac cách nhau 16 base Promoter trc: vùng 35 của trp và 10 của lac cách nhau 17 base • Đều được cảm ứng khi bổ sung IPTG vào môi trường • Mạnh hơn promoter trp 3 lần, hơn promoter lac 10 lần
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
o Promoter Pl • Được kiểm soát bởi protein ức chế cI của thực khuẩn
thể lambda
• Được kiểm soát nhờ sự nhạy nhiệt độ: ở 30oC, thể ức chế cI được tổng hợp liên tục liên kết với
operator của promoter Pl ngăn cản dịch mã tổng hợp protein đích
ở 42oC, thể ức chế bị bất hoạt promoter hoạt động protein
đích
Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ
o Promoter gen 10 của thực khuẩn thể T7 • Gen T7 ARN – pol – kiểm soát phiên mã của gen đích được chèn vào NST của E.coli trên một thể tiềm tan của thực khuẩn thể lambda dưới sự kiểm soát của promoter lac của E. coli • Khi không có lactose hoặc IPTG, thể ức chế lac được tổng hợp, ức chế o – lac và p – lacức chế tổng hợp T7 ARN – pol gen đích không được phiên mã
• Khi có lactose hoặc IPTG liên kết với thể ức chế lac ngăn cản sự ức chế phiên mã T7 ARN – pol gen đích được phiên mã
PROTEIN DUNG HỢP
Protein dung hợp= protein đích liên kết protein tế bào chủ bảo vệ protein đích khỏi sự phân hủy của protease tế bào chủ
Gắn nối phần mã hóa của hai hay nhiều gen với nhau Sự có mặt của protein chủ protein dung hợp không thích
hợp cho ứng dụng lâm sàng
Protein chủ có thể ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của
protein đích
Cắt protein dung hợp: • Nối gen protein đích và protein chủ bằng một đoạn
oligonucleitide mã hóa cho các aa được nhận biết bởi protease không phải của vi khuẩn
PROTEIN DUNG HỢP
ứng dụng của protein dung hợp
Protein dung hợp và vấn đề cuộn gập protein • Một số protein không tan thể vùi
o Sử dụng làm kháng nguyên,
không có hoạt tính sinh học • Khắc phục: tạo protein dung hợp • Protein dung hợp protein đích –
thioredoxin – được tổng hợp và tích tụ ở vùng nhạy thẩm thấu
kháng thể
tiết vào môi trường nuôi cấy dạng
hòa tan
tinh sạch bằng ủ ở nhiệt độ cao – nhờ tính bền nhiệt (80oC của thioredoxin)
o Được dùng để đơn giản hóa quá quá trình tinh sạch protein
Xếp liên tiếp các gen theo một hướng
VẤN ĐỀ: o Để tăng lượng protein gen nhân dòng tăng
CC G
TA A
TC A
số bản sao plasmid
CC C
AG T
AT T
Cạn kiệt nguồn năng lượng tế bào KHẮC PHỤC: o Sắp xếp liên tiếp các trình tự của gen theo
CC G
hướng có thể phiên mã và dịch mã
TC A AG T
CC C
TA A AT T
o Yêu cầu trình tự nucleotide: •
hai đầu 5’ kéo dài của mỗi đoạn gen có 3 nucleotide khác nhau, mỗi đầu chỉ bổ sung cho một đầu kéo dài khác trên một gen khác • Các đầu 5’ kéo dài bổ sung cho đầu 5’ của
CC G GG C
TC A AG T
GG G CC C
một vector
TA A AT T
Plasmid
• Các đầu kéo dài ba nu được tạo thành nhờ PCR với các cặp mồi có một vùng nhận biết của RE ở đầu 5’
Các vector biểu hiện dịch mã
Cơ sở phân tử
• Cơ sở phân tử của sự dịch mã khác nhau là sự có mặt của tín hiệu khởi động dịch mã – vùng liên kết ribosome trên phân tử mARN (Ribosome Binding Site – RBS)
• RBS: trình tự 6 – 8 nu bắt cặp bổ sung với trình tự nu trên ARN ribosome • RBS phải đặt trước codon khởi đầu dịch mã của gen nhân dòng một
khoảng xác định
Codon khởi đầu dịch mã: ở mức độ ARN: bộ ba AUG ở mức độ ADN: bộ ba ATG • RBS và một vài codon đầu tiên của gen quan tâm không chứa các trình tự gây cuộn xoắn nội phân tử sau phiên mã làm cản trở tương tác RBS – ribosome
Các vector biểu hiện dịch mã
Vector biểu hiện pKK233 2
• Gen đánh dấu chọn lọc: gen kháng ampicillin • Promoter tac • Vị trí đa điểm tách dòng: NotI, PstI, HindIII • Vùng liên kết ribosome lacZ • Codon khởi đầu ATG cách RBS 8 nu theo chiều xuôi • Các yếu tố kết thúc phiên mã T1, T2 từ thực khuẩn thể
lambda.
Các vector biểu hiện dịch mã
Vấn đề
• Gen nhân dòng có các codon hiếm được sử dụng trong tế bào chủ hiện tượng không tương hợp tế bào tế bào chủ không tổng hợp đủ tARN nhận biết các codon hiếm giảm hiệu suất tổng hợp protein.
hệ thống tế bào nhân chuẩn
Tổng hợp hóa học một phiên bản mới của gen đích chứa các codon được tế bào sử dụng thường xuyên hơn – dựa vào tính thoái hóa của mã di truyền
Cải biến tế bào chủ để biểu hiện vượt mức
• khắc phục: Nếu gen đích là của sinh vật nhân chuẩn nhân dòng và biểu hiện trong
Làm tăng độ bền protein Chu kỳ bán hủy của các protein khác nhau dao động từ vài phút đến vài giờ Cở sở của độ bền khác nhau: o Phạm vi hình thành cầu disulfua ở E.coli và các G, cầu disulfua được hình thành ở khoang chu chất Đòi hỏi sự tham gia của 2 enzyme chu chất hòa tan (DsbA, C) và hai enzyme
màng (Dsb B,D)
Các protein ngoại lai chứa từ 3 cầu disulfua trở lên thường cuộn gập không
chính xác và tạo các thể vùi khắc phục:
Đồng biểu hiện với enzyme hỗ trợ cuộn gập (ví dụ: disulfua isomerase) Đồng biểu hiện với sự biểu hiện vượt mức của enzyme chu chất hòa tan tạo liên
kết disulfua (DsbC)
o Sự có mặt của aa ở đầu N bền với sự phân hủy của protease o Trình tự nhạy với protease: • Trình tự PEST – prolin (P), acid glutamic (E), serine (S), threonine (T) • Thường bị chặn hai dầu bởi các cụm aa tích điện dương (lysine, arginine) tín
hiệu phân hủy cho protease
Thay đổi vùng PEST tăng độ bền protein
Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ
Hai phương pháp chủ yếu: 1. Nuôi tế bào trong môi trường có kháng sinh hoặc chất đồng hóa bắt buộc chọn lọc tế bào mang plasmid có khả năng kháng kháng sinh giá thành cao
Khắc phục
2. Đưa ADN nhân dòng trực tiếp vào ADN nhiễm sắc thể một phần của tế bào chủ tồn tại bền qua nhiều thế hệ không cần hóa chất chọn lọc
Vấn đề • Số lượng bản sao plasmid cao gánh nặng trao đổi chất cho tế bào chủ hiện tượng mất plasmid trong quá trình sinh trưởnggiảm hiệu suất sản phẩm gen nhân dòng
Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ
• Vị trí cài nhập là vị trí không mang
gen cần thiết của NST
• Được kiểm soát bởi một promoter có
Quy trình cài nhập: 1. Nhận dạng vị trí cài nhập 2. Phân lập và nhân dòng một phần hoặc
thể điều khiển
tất cả vùng cài nhập NST 3. Gắn nối gen nhân dòng và một
promoter có thể điều khiển vào đúng hoặc lân cận vị trí cài nhập
• AND đích phải có độ tương đồng trình tự nhất định (ít nhất là 50nu) với ADN NST trao đổi vật lý (tái tổ hợp) giữa hai phân tử AND
4. Chuyển bản thiết kế đoạn cài nhập
NST – gen nhân dòng vào tế bào chủ như một phần plasmid mà không sao chép trong tế bào chủ cần thiết để xảy ra trao đổi chéo xúc tác bởi enzyme tế bào chủ
5. Chọn lọc và duy trì các tế bào có biểu
hiện gen nhân dòng
Phương pháp cài nhập AND vào nhiễm sắc thể
Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ
Loại bỏ gen đánh dấu chọn lọc: o Thiết kế gen đánh dấu chọn lọc chặn hai đầu bởi trình tự AND đặc hiệu được nhận biết cắt bởi enzyme đặc hiệu khi bổ sung chất cảm ứng vào môi trường
Việc cài nhập AND đích vào NST có thể thực hiện nhờ trao đổi chéo Trao đổi chéo kép ưu điểm: chỉ mình gen nhân dòng được cài nhập vào NST, chỉ áp dụng khi nhận dạng được một vị trí không cần thiết trên NST
Trao đổi chéo đơn: khi trên NST không có một vị trí không cần thiết nào cài nhập toàn bộ plasmid ngoại lai cài nhập cả gen đánh dấu chọn lọc hiệu quả không mong muốnloại bỏ gen đánh dấu chọn lọc
Sự tiết protein ở E.coli
Peptid tín hiệu: o Trình tự aa khu trú ở đầu N
protein
o Làm tăng khả năng qua • Sự tiết protein: kết quả sự đi qua màng tế bào vào vùng chu chất, hoặc qua màng ngoài vào môi trường của protein màng của protein
Tinh sạch protein dễ dàng o Tuy nhiên sự có mặt của hơn
Tăng đô bền protein
peptid tín hiệu không đảm bảo chắc chắn sẽ có tỷ lệ tiết cao
o E.coli và các G tiết protein vào môi trường nhờ sự có mặt của màng ngoài
Sự tiết protein ở E.coli
Cách giải quyết: o Sử dụng G+ hoặc tế bào nhân chuẩn đều thiếu màng ngoài tiết protein
trực tiếp vào môi trường
o Sử dụng cải biến gen tạo G tiết protein vào môi trường Vi khuẩn dạng L: o Biến thể của vi khuẩn thông thường o Tồn tại ở dạng thiếu thành tế bào – kết quả của đột biến tự phát khi xử lý
các vk nhạy cảm với chất cảm ứng dạng L: penicillin, lysozyme
o Hiệu quả: biểu hiên mức độ cao protein ngoại lai + tiết hoàn toàn protein
đích
o Đặc tính kháng nhiều kháng sinh không được sử dụng làm dấu chuẩn
kháng ks trong các thí nghiệm nhân dòng khắc phục: sử dụng gen đánh dấu không mã hóa cho khả năng kháng ks.
Gánh nặng trao đổi chất Nguyên nhân gánh nặng trao đổi chất
1. Tăng số bản sao và/ hoặc kích thước plasmid tăng nhu cầu tế
bào cho việc sao chép và duy trì plasmid
2. Giới hạn hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy 3. Biểu hiện cao cả protein đích và protein đánh dấu làm cạn kiệt nguồn aminoacyl – tARN, nguồn aa và nguồn năng lượng của tế bào chủ
4. Sự biểu hiện vượt mức protein ngoại lai vận chuyển vào khoang chu chất tắc nghẽn vùng tiết xuấtngăn cản sự định vị đúng protein tế bào chủ cần thiết
5. Một số tế bào chủ vốn có đặc tính trao đổi chất bất thường dễ bị
ảnh hưởng bởi trạng thái gánh nặng trao đổi chất
6. Protein ngoại lai xen vào chức năng tế bào chủ tạo ra sản phẩm
độc hại đối với tế bào chủ
Gánh nặng trao đổi chất
Hệ quả của gánh nặng trao đổi chất
1. Giảm tốc độ sinh trưởng của tế bào sau khi đưa AND ngoại
lai vào
2. Mất plasmid tái tổ hợp 3. Thay đổi hình dạng kích thước tế bào chủ 4. Tăng hàm lượng polysaccharide ngoại bào do vi khuẩn chủ
tổng hợp gây kết dính tế bào khó khăn cho việc thu nhận tinh sạch protein
SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO NHÂN CHUẨN
Nhược điểm của hệ thống biểu hiện nhân sơ
Không tạo ra phiên bản protein đích thực của nhân chuẩn –
không bền hoặc không có hoạt tính sinh học nguyên nhân do:
Cuôn gập protein không chính xác Không có cơ chế cải biến sau dịch mã Quá trình tinh sạch phức tạp, không loại bỏ hết yếu tố vi khuẩn
gây độc
SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO NHÂN CHUẨN
Sự tham gia của enzyme nhân chuẩn protein disulfua isomerase (PDI)
Sự hình thành liên kết disulfua: o Sự glycosyl hóa: o Gắn các đường đặc hiệu vào các aa xác định tạo tính bền và tính liên
kết riêng biệt cho protein
Phosphoryl hóa Acetyl hóa Sulphat hóa Acyl hóa Carbocyl hóa …
Một số cải biến sau dịch mã chủ yếu
SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO NHÂN CHUẨN
Vector biểu hiện nhân chuẩn
Cấu trúc vector giống như hệ thống biểu hiện nhân sơ o Promoter nhân chuẩn ddiieuf khiển phiên mã gen nhân dòng o Tín hiệu kết thúc phiên mã và dịch mã nhân chuẩn: • Tín hiệu kết thúc phiên mã: vị trí poly (A) • Tín hiệu kết thúc dịch mã: một trong ba codon kết thúc: UAA,
UAG, UGA
o Trình tự giúp poly A hóa mARN o Gen đánh dấu chọn lọc nhân chuẩn
SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO NHÂN CHUẨN
Vector biểu hiện nhân chuẩn
Hệ vector thường được sử dụng ở hệ thống biểu hiện nhân
chuẩn: vector con thoi
o Hai vùng khởi đầu sao chép: 1. Vùng khởi đầu sao chép nhân chuẩn 2. Vùng khởi đầu sao chép E.coli CHÚ Ý:
Sự gắn thêm AND ngoại lai gây biến đổi di truyền
1. ở vi khuẩn, nấm men: dgl biến nạp 2. ở động vật: đgl: chuyển nhiễm
SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO NHÂN CHUẨN
Các hệ thống biểu hiện trong tế bào động vật có vú
Dòng tế bào được sử dụng: o Biểu hiện tạm thời: tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS), thận
chuột Hamster non (BHK), thận phôi người (HEK – 239) o Biểu hiện lâu dài: tế bào trứng chuột hamster Trung Quốc
(CHO)
SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO NHÂN CHUẨN
Vector biểu hiện động vật có
p
p SMG pa TT
vú:
I MCS pa T T
o Vùng khởi đầu sao chép nhân chuẩn – thường là từ virus động vật
o Promoter điều khiển gen nhân dòng và gen đánh dấu chọn lọc
o Trình tự kết thúc phiên mã: tín
hiệu polyA
Eu - ori
E.coli ori
AmpR
o Trình tự điều hòa dịch mã o Vị trí đa điểm tách dòng o Một intron lai – chứa vị trí cắt – nối cho và nhận từ hai gen khác nhau – nằm giữa promoter và MCS tăng cường năng suất protein tái tổ hợp
•P: các promoter điều khiển gen nhân dòng • và gen đánh dấu chọn lọc •I: intron •MCS: vị trí đa điểm tách dòng •Pa: tín hiệu polyA •TT: tín hiệ kết thúc phiên mã •Eu – ori: vị trí khởi đầu sao chép nhân chuẩn •E – ori: vị trí khởi đầu sao chép E.coli •ampR: gen kháng amp
Các hệ thống biểu hiện trong tế bào động vật có vú
SC
Gen đích
T P
S
K
SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO NHÂN CHUẨN
3’ - UTR
• Trình tự chứa các vùng không được dịch mã đầu 5’ và 3’ – 5’UTR và 3’ UTR (untranslated region tăng hiệu quả dịch mã và góp phần làm tăng độ bền mARN • Trình tự Kozak (K): Trình tự nu đặc biệt bao quanh codon mở đầu:CCA(G)CCAUGG • Trình tự tín hiệu (S): theo sau trình tự K tạo điều kiện cho việc tiết • Trình tự đuôi ái lực protein (T): tăng khả năng tinh sạch protein tái tổ hợp • Trình tự cắt của protease (P): cắt bỏ đuôi ra khỏi protein tái tổ hợp được đạ
vào đầu 5’ của gen đích
• Codon kết thúc (SC): đảm bảo kết thúc quá trình dịch mã tại vị trí chính
xác
Các yếu tố điều hòa dịch mã ở sinh vật nhân chuẩn 5’ - UTR
• Dạng hoạt động của protein động vật có vú thường chứa hai chuỗi protein
khác nhau
Thiết kế hệ thống biểu hiện hai vector: Mỗi vector mang một gen hay cADN của một trong các tiểu phần protein
và một gen đánh dấu chọn lọc khác nhau
Đồng chuyển nhiễm vào tế bào chủ Nhược điểm: Hiện tượng mất một trong hai vector Số lượng bản sao của hai vector không luôn được duy trì bằng nhau một tiểu phần được tạo ra nhiều hơn giảm hiệu suất tổng hợp sp cuối cùng
Khắc phục: Hệ thống một vector duy nhất mang hai gen nhân dòng
SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO NHÂN CHUẨN Hệ thống biểu hiện hai vector
IRES: internal ribosomal entry site – vị trí gắn trong ribosome
SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO NHÂN CHUẨN
từ một mARN polycistron.
• Một promoter, một tín hiệu polyA, một tín hiệu kết thúc phiên mã • Phiên mã cho một bản mARN hai gen duy nhất • Dịch mã từ đầu 5’ của mARN để tổng hợp chuỗi α, và ở bên trong từ yếu
tố IRES đê tổng hợp chuỗi β
• Các tiểu phần α, β được tổng hợp và lắp ghép để tạo thành protein dimer
αβ có chức năng.
Hệ thống một vector duy nhất mang hai gen nhân dòng • Cấu trúc vector: gen α – IRES – gen β – hình thành một đơn vị phiên mã. • Được tìm thấy trong hệ gen virus của động vật có vú Sau khi phiên mã chúng cho phép đồng thời dịch mã các protein khác nhau
Hệ thống đánh dấu chọn lọc cho vector biểu hiện động vật có vú
SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO NHÂN CHUẨN
• Hệ thống biểu hiện chọn lọc các tế bào chuyển nhiễm ở động
vật có vú tương tự như các hệ thống tế bào chủ khác • ở động vật có vú, các hệ thống chọn lọc DHFR – MTX
(dihydrofolat reductase – methotrexat) cho phép chọn lọc các tế bào có số lượng lớn bản sao của vector biểu hiện tăng sản lượng protein tái tổ hợp
Đột biến định hướng
• Gây đột biến định hướng: thay đổi aa đặc hiệu mã hóa bởi gen nhân dòng tạo ra
các aa phù hợp hơn cho quy trình công nghiệp
• Các kỹ thuật gây đột biến định hướng: Thay đổi hằng số Michaelis thay đổi mức độ liên kết enzyme – cơ chất, tốc độ
phản ứng.
Thay đổi chính chịu nhiệt hay độ bền pH, hoặc cả hai của một protein protein
cải biến được sử dụng trong điều kiện làm bất hoạt protein tự nhiên.
Biến đổi hoạt tính enzyme trong dung môi không phải là nước puhh được thực
hiện trong điều kiện phi sinh lý
Thay đổi enzyme sao cho không cần một đồng nhân tố phải được bô sung theo chu
kỳ
Thay đổi vị trí liên kết enzyme – cơ chất tăng tính đặc hiệu giảm các phản ứng
phụ không mong muốn
Tăng tính chống chịu của protein với các protease nội bào dễ tinh sạch Thay đổi điều hòa dị lập thể giảm ảnh hưởng của sự kìm hãm ngược
ĐỘT BIẾN ĐỊNH HƯỚNG VÀ KỸ THUẬT PROTEIN
Các quy trình đột biến định hướng
Là phương pháp đột biến điểm đặc hiệu tạo các đột biến điểm xác định trong gen nhân dòng
Yêu cầu: xác định được: o Trình tự nu chính xác trong vùng AND mã hóa
cho mARN cần biến đổi
o Các thay đổi các aa cần thực hiện
Đột biến định hướng oligonucleotide với AND M13
Pp đột biến định hướng với AND M13 : o Gen nhân dòng được chèn vào dạng sợi kép của vector thực khuẩn
thể M13
o Phân lập dạng sợi đơn (sợi M13+ mang một gen nhân dòng) của
vector tái tổ hợptrộn với oligonucleotide tổng hợp
o Đoạn oligonucleotide tổng hợp có trình tự bổ sung chính xác với gen nhân dòng trừ duy nhất 1 nu bắt cặp sai – ăn khớp chính xác với nu của codon mARN cần thay đổi
Oligonu lai với vùng bổ sung của gen nhân dòng (trong điều kiện
lượng oligonu dư so với AND M13, vị trí bắt cặp sai ở gần trung tâm oligonu, phản ứng thực hiện ở nhiệt độ thấp, nồng độ muối cao) phân tử M13 xoắn kép hoàn chỉnh chứa nu bắt cặp sai
Biến nạp vào E.coli Sản xuất các hạt virus M13 Phân giải tế bào vết tan
Đột biến định hướng oligonucleotide với AND M13
Đột biến định hướng oligonucleotide với AND plasmid
o AND đích được chèn vào vị trí MCS của plasmid mang gen kháng tetracyclin hoạt động và gen kháng amp không hoạt động do sự thay thế một nu ở gen amp
o Biến nạp vào E.coli o Tách chiết AND plasmid sợi kép xử lý kiềm tạo dạng sợi
đơn vòng ủ với 3 oligonu:
• Một oligonu làm thay đổi AND đích • Một oligonu sửa chữa nu bị thay thế ở gen kháng amp • Một oligonu làm thay đổi gen tet bất hoạt gen • Tổng hợp AND mới • Chọn lọc tính kháng amp và tính nhạy tet
Cải biến protein
Bổ sung cầu disulfua Dùng các aa khác thay thế cho asparagin Sự mất nhóm amid asparagin trở thành acid aspactic thay
đổi xoắn cục bộ mất hoạt tính.
Giảm số gốc sulfuahyride tự do Tăng hoạt tính enzyme Thay đổi nhu cầu về đồng nhân tố kim loại Giảm sự nhạy cảm với protease Thay đổi tính đặc hiệu của protein Tăng độ bền và tính đặc hiệu của enzyme Thay đổi nhiều tính chất
CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC HỆ THỐNG VI SINH VẬT
CÁC QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH
Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (Enzyme linked
immunosorbent assay – ELISA)
1. Gắn mẫu cần xét nghiệm lên phiến rắn 2. Bổ sung kháng thể sơ cấp – kháng thể đặc hiệu chất chỉ thị tấn công trực tiếp kháng nguyên đích rửa loại bỏ kháng thể sơ cấp không được gắn 3. Bổ sung kháng thể thứ cấp liên kết đặc hiệu với kháng thể sơ cấp. Kháng thể sơ cấp được liên kết với một enzyme xúc tác phản ứng chuyển cơ chất không màu thành có màu rửa loại bỏ các kháng thể thứ cấp không liên kết
4. Cho cơ chất không màu 5. Quan sát hoặc đo số lượng sản phẩm có màu
Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme
CÁC QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH
• Trong đáp ứng miễn dịch, mỗi tế bào sinh kháng thể tổng hợp một kháng thể đơn nhận biết với một epitop (quyết định kháng nguyên) trên kháng nguyên miễn dịch
• Mỗi kháng nguyên có vài epitop khác nhau có vài loại tế bào khác nhau sinh ra một kháng thể khác nhau chống lại một trong nhiều epitop của kháng nguyên
Bộ các kháng thể mà tất cả đều phản ứng với cùng một kháng nguyên
kháng thể đa dòng hiệu quả thấp với epitop chính
• Kháng thể đơn dòng: dạng đơn của phân tử kháng thể, do một dòng tế bào
tạo ra, có ái lực cao với kháng nguyên đích đặc hiệu
Kháng thể đơn dòng
Gây miễn dịch chuột
Tế bào u tủy
Tách tế bào lách
Tạo kháng thể đơn dòng: o Nguồn: tế bào lympho bình thường + tế bào u tủy xương
Tế bào lách không dung hợp (S) Tế bào u tủy không dung hợp (M) Tế bào dung hợp lá lách – lá lách (S – S) Tế bào dung hợp u tủy – u tủy (M – M) Tế bào dung hợp lá lách – u tủy (S – M)
Môi trường HAT
S – M mọc và phân chia
M và M – M không mọc S và S – S không thể phân chia
Kháng thể đơn dòng
CẢI BIẾN GEN THỰC VẬT Biến nạp thực vật với plasmid Ti của A. tumerfaciens
A. tumerfaciens • Vi khuẩn Gram âm • Biến nạp di truyền vào tế bào thực vật hai lá mầm khối u
ảnh hưởng đến sinh trưởng thực vật
• Plasmid Ti – yếu tố gây khối u (Tumor inducing) chứa thành phần T – DNA là yếu tố thực sự gây khối u thông qua việc chuyển, cài nhập và biểu hiện các gen trên T – DNA.
