intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Công nghệ sinh học phân tử

Chia sẻ: Hoàng Lan Lan | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:45

Thêm vào BST
Báo xấu
563
lượt xem 124
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Các bước cơ bản tạo ADN tái tổ hợp: • Tách chiết phân tách AND ngoại lai từ sinh vật đích • Phản ứng nối AND – vector tạo phân tử AND TTH • Chuyển AND TTH vào tế bào chủ • Chọn lọc các tế bào mang AND TTH • Sản xuất, tinh sạch protein

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Công nghệ sinh học phân tử

  1. CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ
  2. CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP  Các bước cơ bản tạo ADNtái tổ hợp Tách chiết phân tách AND ngoại lai từ sinh vật đích • Phản ứng nối AND – vector tạo phân tử AND TTH • Chuyển AND TTH vào tế bào chủ • Chọn lọc các tế bào mang AND TTH • Sản xuất, tinh sạch protein •
  3. CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP • Endonuclease giới hạn (RE)
  4. CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP Vector nhân dòng 1. Vector plasmid •Vector plasmid •Vector thực khuẩn thể  lambda •Cosmid •BAC •YAC
  5. Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ  Biểu hiện gen ở các promoter mạnh và có thể điều  chỉnh o Promoter mạnh Có ái lực cao với ARN – pol vùng nằm ngay sau nó được phiên mã  • thường xuyên Tối ưu hóa sự biểu hiện của gen nhân dòng • Khó khăn: •  Kiệt quệ năng lượng của tế bào chủsuy yếu các chức năng cần thiết o Promoter có thể điều chỉnh Chỉ biểu hiện gen nhân dòng trong giai đoạn sinh trưởng đặc biệt của tế  • bào chủ Chỉ biểu hiện trong một thời gian xác định •
  6. Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ Một số promoter phổ biến Promoter lac o Promoter trp o Promoter tac o Promoter trc o Promoter pL o Promoter gen 10 từ thực khuẩn thể T7 o
  7. Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ o Promoter lac Nồng Nồng Nồng Mức độ Vùng promoter – operator lac độ độ độ phiên glucos lactos AMPv mã e e AMPv Thể ức CA chế lac Thấp Thấp Thấp cao P operator gen promoter Thể ức Thấp Thấp Thấp cao chế lac operator gen promoter Thấp Thấp cao cao promoter operator gen AMPv CA Thấp cao cao cao P promoter operator gen
  8. Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ o Promoter trp • Điều hòa âm: nồng độ trp tăng đóng promoter ức chế  phiên mã • Hiện tượng “rò rỉ”: phiên mã vẫn diễn ra ngay cả khi gen  đã đóng lại
  9. Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ o Promoter tac và trc: • Chứa vùng ­35 của promoter trp và vùng ­10 của promoter lac • khác nhau một cặp base duy nhất:  Promoter tac: vùng ­35 của trp và ­10 của lac cách nhau 16 base  Promoter trc: vùng ­35 của trp và ­10 của lac cách nhau 17 base • Đều được cảm ứng khi bổ sung IPTG vào môi trường • Mạnh hơn promoter trp 3 lần, hơn promoter lac 10 lần
  10. Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ o Promoter Pl • Được kiểm soát bởi protein ức chế cI của thực khuẩn  thể lambda • Được kiểm soát nhờ sự nhạy nhiệt độ:  ở 30oC, thể ức chế cI được tổng hợp liên tục liên kết với  operator của promoter Pl ngăn cản dịch mã tổng hợp protein  đích  ở 42oC, thể ức chế bị bất hoạt promoter hoạt động protein  đích
  11. Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ o Promoter gen 10 của thực khuẩn thể T7 • Gen T7 ARN – pol – kiểm soát phiên mã của gen đích ­ được  chèn vào NST của E.coli trên một thể tiềm tan của thực khuẩn  thể lambda dưới sự kiểm soát của promoter lac của E. coli • Khi không có lactose hoặc IPTG, thể ức chế lac được tổng hợp,  ức chế o – lac và p – lacức chế tổng hợp T7 ARN – pol  gen đích không được phiên mã • Khi có lactose hoặc IPTG liên kết với thể ức chế lac ngăn  cản sự ức chế phiên mã T7 ARN – pol gen đích được phiên  mã
  12. PROTEIN DUNG HỢP  Protein dung hợp= protein đích liên kết protein tế bào chủ  bảo vệ protein đích khỏi sự phân hủy của protease tế bào chủ  Gắn nối phần mã hóa của hai hay nhiều gen với nhau  Sự có mặt của protein chủ  protein dung hợp không thích  hợp cho ứng dụng lâm sàng  Protein chủ có thể ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của  protein đích  Cắt protein dung hợp: • Nối gen protein đích và protein chủ bằng một đoạn  oligonucleitide mã hóa cho các aa được nhận biết bởi protease  không phải của vi khuẩn
  13. PROTEIN DUNG HỢP Protein dung hợp và vấn đề cuộn  ứng dụng của protein dung hợp gập protein o Sử dụng làm kháng nguyên,  Một số protein không tan  thể vùi  • không có hoạt tính sinh học kháng thể • Khắc phục: tạo protein dung hợp o Được dùng để đơn giản hóa  • Protein dung hợp protein đích –  quá quá trình tinh sạch  thioredoxin – được tổng hợp và tích  protein   tụ ở vùng nhạy thẩm thấu  tiết vào môi trường nuôi cấy dạng  hòa tan  tinh sạch bằng ủ ở nhiệt độ cao –  nhờ tính bền nhiệt (80oC của  thioredoxin)
  14. Xếp liên tiếp các gen theo một hướng  VẤN ĐỀ: o Để tăng lượng protein gen nhân dòng  tăng  CC TA TC số bản sao plasmid G A A  Cạn kiệt nguồn năng lượng tế bào CC AT AG C T T  KHẮC PHỤC: o Sắp  xếp  liên  tiếp  các  trình  tự  của  gen  theo  CC TC hướng có thể phiên mã và dịch mã TA G A A AG CC o Yêu cầu trình tự nucleotide:  AT T C T • hai  đầu  5’  kéo  dài  của  mỗi  đoạn  gen  có  3  nucleotide  khác  nhau,  mỗi  đầu  chỉ  bổ  sung  cho một đầu kéo dài khác trên một gen khác  CC TA TC GG • Các  đầu  5’  kéo  dài  bổ  sung  cho  đầu  5’  của  G G A A AT AG CC GG một vector C T C T • Các  đầu  kéo  dài  ba  nu  được  tạo  thành  nhờ  PCR với các cặp mồi có một vùng nhận biết  Plasmid của RE ở đầu 5’
  15. Các vector biểu hiện dịch mã Cơ sở phân tử Cơ sở phân tử của sự dịch mã khác nhau là sự có mặt của tín hiệu khởi  • động dịch mã – vùng liên kết ribosome trên phân tử mARN (Ribosome  Binding Site – RBS) • RBS: trình tự 6 – 8 nu bắt cặp bổ sung với trình tự nu trên ARN ribosome • RBS phải đặt trước codon khởi đầu dịch mã của gen nhân dòng một  khoảng xác định   Codon khởi đầu dịch mã:  ở mức độ ARN: bộ ba AUG  ở mức độ ADN: bộ ba ATG • RBS và một vài codon đầu tiên của gen quan tâm không chứa các trình tự  gây cuộn xoắn nội phân tử sau phiên mã làm cản trở tương tác RBS –  ribosome
  16. Các vector biểu hiện dịch mã Vector biểu hiện pKK233 ­ 2 Gen đánh dấu chọn lọc: gen kháng ampicillin • Promoter tac • Vị trí đa điểm tách dòng: NotI, PstI, HindIII • Vùng liên kết ribosome lacZ • Codon khởi đầu ATG cách RBS 8 nu theo chiều xuôi • Các yếu tố kết thúc phiên mã T1, T2 từ thực khuẩn thể  • lambda.
  17. Các vector biểu hiện dịch mã Vấn đề • Gen nhân dòng có các codon hiếm được sử dụng trong tế bào  chủ ­ hiện tượng không tương hợp tế bào tế bào chủ không  tổng hợp đủ tARN nhận biết các codon hiếm giảm hiệu suất  tổng hợp protein. •  khắc phục:  Nếu gen đích là của sinh vật nhân chuẩn nhân dòng và biểu hiện trong  hệ thống tế bào nhân chuẩn  Tổng hợp hóa học một phiên bản mới của gen đích chứa các codon được tế  bào sử dụng thường xuyên hơn – dựa vào tính thoái hóa của mã di truyền  Cải biến tế bào chủ để biểu hiện vượt mức
  18. Làm tăng độ bền protein Chu kỳ bán hủy của các protein khác nhau dao động từ vài phút đến vài giờ  Cở sở của độ bền khác nhau:   Phạm vi hình thành cầu disulfua o ở E.coli và các G­, cầu disulfua được hình thành ở khoang chu chất  Đòi hỏi sự tham gia của 2 enzyme chu chất hòa tan (DsbA, C) và hai enzyme   màng (Dsb B,D)  Các protein ngoại lai chứa từ 3 cầu disulfua trở lên thường cuộn gập không  chính xác và tạo các thể vùi khắc phục:  Đồng biểu hiện với enzyme hỗ trợ cuộn gập (ví dụ: disulfua isomerase)  Đồng biểu hiện với sự biểu hiện vượt mức của enzyme chu chất hòa tan tạo liên  kết disulfua (DsbC) o Sự có mặt của aa ở đầu N bền với sự phân hủy của protease o Trình tự nhạy với protease: • Trình tự PEST – prolin (P), acid glutamic (E), serine (S), threonine (T) • Thường bị chặn hai dầu bởi các cụm aa tích điện dương (lysine, arginine) tín  hiệu phân hủy cho protease  Thay đổi vùng PEST tăng độ bền protein
  19. Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ Vấn đề Khắc phục  Hai phương pháp chủ yếu: • Số lượng bản sao plasmid  1. Nuôi tế bào trong môi trường có  cao gánh nặng trao đổi  kháng sinh hoặc chất đồng hóa  chất cho tế bào chủ hiện  bắt buộc chọn lọc tế bào mang  tượng mất plasmid trong quá  plasmid có khả năng kháng kháng  sinh giá thành cao trình sinh trưởnggiảm  2. Đưa ADN nhân dòng trực tiếp  hiệu suất sản phẩm gen  vào ADN nhiễm sắc thể một  nhân dòng phần của tế bào chủ tồn tại bền  qua nhiều thế hệ không cần hóa  chất chọn lọc
  20. Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể chủ Phương pháp cài nhập AND vào nhiễm sắc thể  Vị  trí  cài  nhập  là  vị  trí  không  mang   Quy trình cài nhập: • gen cần thiết của NST 1. Nhận dạng vị trí cài nhập Được kiểm soát bởi một promoter có  • 2. Phân lập và nhân dòng một phần hoặc  thể điều khiển tất cả vùng cài nhập NST AND  đích  phải  có  độ  tương  đồng  • 3. Gắn nối gen nhân dòng và một  trình tự nhất định (ít nhất là 50nu) với  promoter có thể điều khiển vào đúng  ADN  NST  trao  đổi  vật  lý  (tái  tổ  hoặc lân cận vị trí cài nhập hợp) giữa hai phân tử AND 4. Chuyển bản thiết kế đoạn cài nhập  NST – gen nhân dòng vào tế bào chủ  như một phần plasmid mà không sao  chép trong tế bào chủ ­ cần thiết để  xảy ra trao đổi chéo xúc tác bởi  enzyme tế bào chủ 5. Chọn lọc và duy trì các tế bào có biểu  hiện gen nhân dòng
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2