ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ------
TÔ MINH NGỌC
CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT LOÀI SA SÂM NAM (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun)
THU HÁI Ở THANH HÓA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
HÀ NỘI – 2022
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ------ TÔ MINH NGỌC
CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT LOÀI SA SÂM NAM (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun)
THU HÁI Ở THANH HÓA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2017Y
Người hướng dẫn: 1. ThS. NGUYỄN THỊ THU 2. ThS. LÊ HƯƠNG GIANG
HÀ NỘI – 2022
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này là kết quả của quá trình học tập, rèn luyện của em tại Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu. Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các Thầy Cô của Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và đội ngũ nghiên cứu viên của Viện Dược liệu cùng gia đình và bạn bè.
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS. Đỗ Thị Hà, PGS.TS. Vũ Đức Lợi cùng ThS. Nguyễn Thị Thu, ThS. Lê Hương Giang- những người Thầy đã hết lòng tận tình, chỉ bảo em trong quá trình làm khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cám ơn chân thành đến ThS. Vũ Thị Diệp, DS. Nguyễn Trà My và các cán bộ nghiên cứu tại Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã giúp đỡ và hướng dẫn em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Y Dược, Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền và các Thầy Cô trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được học tập và rèn luyện trong suốt 5 năm học, đồng thời có thể trực tiếp tham gia thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học loài Sa sâm nam (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun)”- Đề tài nghiên cứu cấp cơ sở, Viện Dược liệu, Bộ Y tế đã tạo điều kiện và hỗ trợ kinh phí để em thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ
em trong quá trình học tập cũng như làm đề tài tốt nghiệp.
Do vốn kiến thức còn hạn chế cũng như ảnh hưởng của dịch bệnh Covid-19, quá trình làm khóa luận của em không tránh khỏi thiếu sót. Em rất mong nhận được những lời nhận xét, góp ý của các Thầy Cô để khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 02 tháng 06 năm 2022
Sinh viên
Tô Minh Ngọc
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT
DANH MỤC HỈNH ẢNH
DANH MỤC BẢNG BIỂU
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về chi Launaea .......................................................................... 2
1.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................... 2
1.1.2. Một số loài thuộc chi Launaea được tìm thấy trên thế giới ............. 2
1.1.3. Phân bố ............................................................................................... 3
1.2. Tổng quan về loài Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun ............. 4
1.2.1. Danh pháp .......................................................................................... 4
1.2.2. Đặc điểm thực vật ............................................................................... 4
1.2.3. Phân bố và sinh thái ........................................................................... 5
1.2.4. Thành phần hóa học .......................................................................... 5
1.2.5. Tác dụng dược lý ................................................................................ 6
1.2.6. Công dụng ........................................................................................... 8
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 9
2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 9
2.2. Hóa chất, thiết bị .......................................................................................... 9
2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 9
2.2.2. Thiết bị .............................................................................................. 10
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 10
2.3.1. Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp ....................... 10
2.3.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập ............................................... 14
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất ................................ 14
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ................................................... 16
3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp .......................................... 16
3.2. Chiết xuất và phân lập các chất ............................................................... 17
3.2.1. Chiết xuất cao toàn phần ................................................................. 17
3.2.2. Chiết xuất và phân lập hợp chất ...................................................... 18
3.3. Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được ............................................. 20
3.3.1. Hợp chất SS-1C ................................................................................ 20
3.3.2. Hợp chất SS-3B ................................................................................ 24
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ...................................................................................... 25
4.1. Về định tính ................................................................................................ 25
4.2. Về chiết xuất ............................................................................................... 25
4.3. Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất ...................................... 25
4.3.1. Hỗn hợp của Stigmasterol và β-sitosterol ....................................... 25
4.3.2. Hợp chất Esculetin ........................................................................... 28
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 32
Kết luận ................................................................................................................ 32
Đề xuất .................................................................................................................. 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT
Ký hiệu, STT Chữ viết đầy đủ viết tắt
13C-NMR
1 Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13)
1H-NMR
2 Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)
3 ABCA1 ATP Binding Cassette transporter A1 (Kênh vận chuyển
A1 gắn ATP)
4 ABCG1 ATP Binding Cassette transporter G1 (Kênh vận chuyển
G1 gắn ATP)
5 AMPK Adenosine Monophosphate (AMP)-activated Protein
Kinase (AMP hoạt hóa protein kinase)
6 BuOH Butanol
Deuterated methanol 7 CD3OD
8 DCM Dicloromethane
9 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
10 DMSO Dimethyl sulfoxid
11 DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
12 DTH Delayed-type hypersensitivity (Mô hình quá mẫn kiểu
chậm)
13 EtOAc Ethyl acetate
14 EtOH Ethanol
15 GOT Glutamic oxalacetic transaminase
16 GPT Glutamic pyruvic transaminase
17 HAEC Human aortic endothelial cell (Tế bào nội mô động mạch
chủ người)
18 HDL High Density Lipoprotein (Lipoprotein tỉ trọng cao)
19 50% Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế 50%)
IC50
20 LDL Low Density Lipoprotein (Lipoprotein tỉ trọng thấp)
21 Ls-ME L. sarmentosa methanolic extract (Cao chiết methanol từ
L. sarmentosa)
22 MeOH Methanol
23 MMP-9 Matrix Metalloproteinase-9
24 ROS Reactive Oxygen Species (Các gốc oxy hóa hoạt động)
50% Stimulation Concentration (Nồng độ kích thích 50%) 25 SC50
Standard deviation (Độ lệch chuẩn) 26 SD
27 TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
28 TNF-α Tumor Necrosis Factor-α (Yếu tố hoại tử khối u alpha)
29 v/v Volume by volume (Thể tích/ thể tích)
30 v/v/v Volume by volume by volume (Thể tích/ thể tích/thể tích)
31 VSMCs Vascular smooth muscle cells (Các tế bào cơ trơn mạch
máu)
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Bản vẽ thực vật Launaea sarmentosa vào thế kỷ XIX ............................... 4
Hình 1.2: Hình ảnh thực tế của Launaea sarmentosa ................................................. 4
Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ rễ L. sarmentosa ....................... 6
Hình 2.1: Dược liệu Sa sâm nam khô. ........................................................................ 9
Hình 3.1: Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ phần trên mặt đất
của Sa sâm nam ......................................................................................................... 18
Hình 3.2: Quy trình phân lập các hợp chất từ cao EtOAc từ cao chiết Sa sâm nam 20
Hình 3.3: Cấu trúc của hợp chất SS-1C .................................................................... 21
Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất SS-3B .................................................................... 24
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Launaea trên thế giới ............................................... 2
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong Sa sâm nam . 16
Bảng 3.2: Dữ liệu phổ của chất SS-1C và hợp chất tham khảo ................................ 22
Bảng 3.3: Dữ liệu phổ của chất SS-3B và hợp chất tham khảo ................................ 24
MỞ ĐẦU
Nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa cùng vị trí địa lý trải dài trên
15 vĩ tuyến, Việt Nam sở hữu nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo ước tính nước ta có trên 12.000 loài thực vật bậc cao, chiếm khoảng 4 -
5% tổng số loài thực vật bậc cao đã biết trên thế giới. Trong số đó, có khoảng 5.000
loài thực vật và nấm, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc
[4]. Từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng những bài thuốc cổ truyền từ các loại cây để chữa trị một số bệnh thường gặp cũng như nâng cao sức khỏe. Những bài thuốc này
được sử dụng rất rộng rãi và cho thấy tính hiệu quả tốt, tuy nhiên đa số chỉ dựa trên
kinh nghiệm dân gian mà chưa có cơ sở khoa học vững chắc.
Ngày nay, sự xuất hiện của các bệnh truyền nhiễm mới và sự gia tăng các bệnh
rối loạn chuyển hóa đã thúc đẩy sự quan tâm mới trong việc nghiên cứu và phát hiện ra các hợp chất tiềm năng từ thảo dược. Các nhà khoa học, các tập đoàn dược phẩm
lớn hiện đang chú trọng vào sàng lọc từ thiên nhiên để tìm ra các hoạt chất sinh học
mới có dược tính mạnh hơn, ít độc hơn và với chi phí cho nghiên cứu phát triển thấp hơn so với tổng hợp hóa học.
Sa sâm nam (Launaea sarmentosa (Willd.)) được biết đến với nhiều công dụng
như hạ sốt, giảm ho, long đờm, lợi sữa, nhuận tràng, lợi tiểu [1]. Các tác dụng sinh
học bao gồm: chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ gan, tác dụng lên hệ thần kinh trung
ương,… đã được chứng minh bằng thử nghiệm in vitro.
Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu cụ thể về thành phần hóa học và tác
dụng sinh học của Sa sâm nam trên thế giới và ở Việt Nam còn rất hạn chế. Do vậy,
để góp phần xây dựng cơ sở khoa học nhận biết loài, về thành phần hóa học của loài,
ứng dụng cây Sa sâm nam nhiều hơn nữa trong việc chăm sóc sức khỏe, đề tài: “Chiết
xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phần trên mặt đất loài Sa
sâm nam (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun) thu hái ở Thanh Hóa” đã
được thực hiện với những mục tiêu sau:
1. Định tính được các nhóm chất có trong phần trên mặt đất của Sa sâm nam.
2. Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất từ phần
trên mặt đất loài Sa sâm nam.
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Launaea 1.1.1. Vị trí phân loại
Vị trí phân loại của chi Launaea trong giới thực vật [1] theo “Cây thuốc và
động vật làm thuốc ở Việt Nam” như sau:
Giới: Thực vật (Plantea)
Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Bộ: Cúc (Asterales)
Họ: Cúc (Asteraceae)
Chi: Launaea
1.1.2. Một số loài thuộc chi Launaea được tìm thấy trên thế giới
Hiện nay người ta đã tìm thấy và định danh khoảng 50 loài thuộc chi Launaea.
Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Launaea trên thế giới
Các loài thuộc chi thực vật này được liệt kê theo Bảng 1.1 dưới đây.
STT Tên khoa học Tên khoa học STT
Launaea acaulis (Roxb.) Babc. Launaea mucronata (Forssk.) 1. 20. ex Kerr Muschl.
2. Launaea amal-aminiae N.Kilian 21. Launaea nana (Baker) Chiov.
Launaea angustifolia (Desf.) Launaea nudicaulis (L.) Hook.f. 3. 22. Kuntze.
Launaea arborescens (Batt.) Launaea petitiana (A.Rich.) 4. 23. Murb. N.Kilian
Launaea benadirensis Chiov. 5. 24. Launaea picridioides (Webb) B.L.Rob.
6. 25. Launaea bornmuelleri (Hausskn. ex Bornm.) Bornm. Launaea piestocarpa (Boiss.) Rech.f.
Launaea popovii Krasch. 7. 26. Launaea brunneri (Webb) Amin ex Boulos
2
Launaea cabrae (De Wild.) Launaea procumbens (Roxb.) 8. 27. N.Kilian Ramayya & Rajagopal
9. 28. Launaea capitata (Spreng.) Dandy. Launaea pseudoabyssinica (Chiov.) N.Kilian
Launaea cervicornis (Boiss.) Launaea pumila (Cav.) Kuntze 10. 29. Font Quer & Rothm
11. 30. Launaea cornuta (Hochst. ex Oliv. & Hiern) C.Jeffrey Launaea quercifolia (Desf.) Pamp.
Launaea crassifolia (Balf.f.) Launaea rarifolia (Oliv. & 12. 31. C.Jeffrey Hiern) Boulos
Launaea fragilis (Asso) Pau 13. 32. Launaea rogersii (Humbert) Humbert & Boulos
Launaea gorgadensis (Bolle) Launaea rueppellii (Sch.Bip. ex 14. 33. N.Kilian Oliv. & Hiern) Amin ex Boulos
Launaea hafunensis Chiov. Launaea sarmentosa (Willd.) 15. 34. Merr. et Chun*
Launaea intybacea (Jacq.) Launaea secunda (C.B.Clarke) 16. 35. Beauverd Hook.f.
Launaea lackii N.Kilian 17. 36. Launaea spinosa (Forssk.) Kuntze
Launaea lanifera Pau Launaea taraxacifolia (Willd.) 18. 37. Amin ex C.Jeffrey
19. Launaea microcephala Hook.f. 38. Launaea viminea (Batt.) Batt.
1.1.3. Phân bố
Launaea là một chi nhỏ của họ Cúc (Asteraceae) gồm khoảng 50 loài, hầu hết đều thích nghi với môi trường sống khô, mặn và cát [36]. Chi Launaea phân bố chủ yếu ở Nam Địa Trung Hải, Châu Phi và Tây Nam Á và đặc biệt, rất phổ biến ở các
khu vực Bắc Phi [20].
Ở Việt Nam có một số loài thuộc chi này, phân bố ở vùng ven biển và các đảo
lớn, từ Quảng Ninh, Hải Phòng vào đến Đồng Nai, Bến Tre.
3
1.2. Tổng quan về loài Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun 1.2.1. Danh pháp
Danh pháp của Sa sâm nam theo “Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt
Nam” [1] như sau:
• Tên tiếng Việt: Sa sâm nam, Cỏ chân vịt, Hải cúc
• Tên khoa học: Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun
• Họ thực vật: Cúc (Asteraceae)
• Tên đồng nghĩa: Launaea sarmentosa (Willd.) Sch. Bip. Ex Kuntze,
Launaea pinnatifida Cass
1.2.2. Đặc điểm thực vật
Launaea sarmentosa (L. sarmentosa) hay còn được biết đến với cái tên Sa sâm
nam là cây thảo, sống lâu năm. Cây thân leo có rễ bên mang chồi kéo dài, mỗi rễ có
từ 2-3 thân. Thân mọc bò, cao khoảng 20-90 cm, phân nhánh [1, 32].
Lá mọc thành chùm, kích thước 3-8 × 0,6-1 cm, hình răng cưa thành thùy hình
chùy, nhỏ dần về phía gốc, có răng cưa rõ rệt, đỉnh nhọn, tù hoặc tròn. Tận cùng lá
thứ cấp xếp hình hoa thị dọc theo thân, thường có 14-18 bông hoa; với cánh hoa dài
khoảng 1-3 cm. Quả sa sâm nam có rìa vảy màu trắng rõ rệt, đỉnh nhọn đến tù; bên
Hình 1.2: Bản vẽ thực vật Launaea sarmentosa vào thế kỷ XIX
Hình 1.1: Hình ảnh thực tế của Launaea sarmentosa
ngoài hình con thoi hoặc hình trứng đến hình mũi mác [1, 32].
4
Rễ của L. sarmentosa có màu vàng nhạt, khi trưởng thành có màu nâu nhạt.
Rễ có mùi thơm, hơi tròn, hình trụ, xốp, ít rễ con, không có mấu và được nghiên cứu
rằng có chứa alkaloid, acid amin, glycosid, tanin, cacbohydrat và steroid [32, 48]. 1.2.3. Phân bố và sinh thái
Ở Việt Nam, L. sarmentosa tìm thấy ở vùng ven biển và các đảo lớn từ Quảng
Ninh, Hải Phòng vào đến Bến Tre. Cây cũng phân bố ở vùng ven biển phía nam Trung
Quốc, Ấn Độ, Ai Cập và một số nơi ở châu Phi [1].
L. sarmentosa có phần trên mặt đất thường lụi vào mùa đông. Toàn bộ phần
rễ và phần gốc sẽ mọc lên chồi mới vào mùa xuân hoặc đầu mùa hè năm sau. Cây ưa
sáng, chịu được mặn; thường mọc trên bãi cát ven biển, thành từng đám hoặc rải rác
thành khóm riêng rẽ. Cây ra hoa quả hàng năm; quả có túm lông thuận lợi cho việc phát tán nhờ gió [1]. 1.2.4. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của L. sarmentosa được thực hiện chủ
yếu trên lá và rễ của loài thực vật này [12]. Kiểm tra sơ bộ hóa thực vật cho thấy rễ
cây L. sarmentosa có mặt các hợp chất thuộc nhóm alkaloid, flavonoid, triterpenoid,
saponin [14]; lá có chứa steroid, alkaloid, terpenoid, đường khử, flavonoid, saponin
và tannin [51] …
Trong báo cáo bước đầu về thành phần hóa học của Sa sâm nam trồng tại trang
trại của công ty Sa sâm việt, huyện Thạnh Phú, tỉnh Bến Tre, nhóm tác giả Lê Tiến
Dũng và cộng sự đã tiến hành định lượng các thành phần hóa học từ lá cây L.
sarmentosa. Kết quả định lượng cho thấy, polyphenol chiếm 290,90 mg/g cao chiết,
flavonoid 85,47 mg/g cao chiết và saponin 10,8%/trên dược liệu lá khô [12]. Hàm
lượng các chất này trong Sa sâm nam ở Ấn Độ tương ứng là 179,46 mg/g và 87,46
mg/g [33]. Đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu sâu về mặt hóa học của cây Sa sâm nam, mới chỉ có một số hợp chất được phân lập từ dược liệu này, gồm: α-amyrin
acetat (1), β-amyrin acetat (2), lupeol acetat (3), Ψ-taraksasterol acetat (4), luteolin (5), 4-allyl-2,6-dimethoxyphenol glucopyranosid (6), scorzosid (7), ixerisosid D (8),
9α-hydroxypinoresinol (9) từ rễ; taraxasterol (10) được phân lập từ lá, glutenol (11),
3-O-L-rhamnopyranosyl-(13)-O-L-arabinopyranosyl(13)-O-D-galactopyranosyl spergulatriol (12) và hopenol-b (13) từ hạt [56].
5
1. α-Amyrin acetat
2. β-Amyrin acetat
3. Lupeol acetat
4. ψ-Taraksasterol acetat
5. Luteolin
6. 4-Allyl-2,6-
dimethoxyphenol glucopyranosid
7. Scorzosid
8. Ixerisosid D
Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ rễ L. sarmentosa
9. 9α-Hydroxypinoresinol
1.2.5. Tác dụng dược lý 1.2.5.1. Chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa của L. sarmentosa đã được nghiên cứu bằng cách đánh giá tác dụng của nó với các gốc tự do DPPH, OH•, Fe3+. Khả năng ức chế gốc DPPH của cao chiết ethanol (liều 200 μg) là 71,22%, của mẫu chứng dương BHA là 89,1%. Khả năng ức chế gốc OH• của cao chiết ethanol và nước (liều 200 μg) là 72,46% và 71,23%, cao hơn nhiều so với BHA (% ức chế là 24,26%) [33].
Trong một nghiên cứu khác, giá trị SC50 trong việc dọn gốc DPPH của cao chiết methanol của L. sarmentosa (Ls-ME), tương ứng với nồng độ cần thiết để dọn
50% các gốc tự do trong mẫu là 26,7 µg/mL (tương đương với 5,5 µg/mL vitamin
C). Những kết quả này đã chứng minh rằng Ls-ME thể hiện khả năng chống oxy hóa
một cách hiệu quả [35].
1.2.5.2. Tan huyết khối, ổn định màng
Ảnh hưởng của L. sarmentosa đối với quá trình ly giải cục máu đông trên lâm sàng được chứng minh trong một nghiên cứu vào năm 2016. Người ta quan sát thấy tỷ lệ ly giải cục máu đông là 45,49% khi sử dụng 100 µl Streptokinase (30.000 I.U.) làm đối chứng dương tính. Mặt khác, nếu sử dụng nước là đối chứng âm, tỷ lệ ly giải
6
cục máu đông là không đáng kể (6,03%). Vì vậy, phần trăm ly giải cục máu đông phụ
thuộc vào liều lượng và nồng độ. Trong đó, tại nồng độ 10mg/ml cho thấy mức ý
nghĩa (p <0,001) ly giải cục máu đông cao nhất (22,57%). [31]
Hoạt động ổn định màng của dịch chiết methanol của L. sarmentosa (Ls-ME)
cũng được thực hiện trong nghiên cứu này. Nồng độ cao hơn (10 mg/ml) của dịch
chiết methanol của L. sarmentosa tạo ra % ức chế đáng kể quá trình tan máu tương
ứng bằng dung dịch nhược trương (12,11 ± 0,037) và nhiệt (20,55 ± 0,87). [31] Trong khi đó, ASA (dung dịch chứa hoạt chất ethanol natri salicylat và acid acetylsalicylic)
được sử dụng làm tiêu chuẩn (0,10 mg/ml) trong ổn định màng, cho thấy khả năng
ức chế tan máu do dung dịch nhược trương là 70,01 ± 0,017% và ức chế tan máu do
nhiệt tương ứng là 56,32 ± 0,228% [31].
1.2.5.3. Chống viêm, giảm đau, hạ sốt
Cao chiết methanol của L. sarmentosa ở các mức liều 100 - 400 mg/kg đều thể
hiện tác dụng hạ sốt, giảm đau và chống viêm, tác dụng mạnh nhất ở liều 400 mg/kg.
Nhiệt độ cơ thể chuột từ 38,4℃ giảm còn 36,38℃ sau 5h khi dùng Sa sâm nam ở liều 400 mg/kg, còn 35,89℃ khi dùng aspirin liều 30 mg/kg. Thời gian phản ứng đau
của chuột trong thử nghiệm ngâm đuôi trong nước nóng tăng khi dùng Sa sâm nam,
thời gian phản ứng khi dùng liều 400 mg/kg là 6,93 giây (khi dùng pentazocine 30
mg/kg là 7,62 giây). Trong thử nghiệm gây đau quặn bằng acid acetic, Sa sâm nam
(400 mg/kg) làm giảm số cơn đau quặn, tỉ lệ ức chế đau là 63,10% (tỉ lệ ức chế của
aspirin (30 mg/kg) là 69,23%). Sa sâm nam (400 mg/kg) ức chế 32,48% độ phù chân
chuột và ức chế 34,7% sự hình thành u hạt, tỉ lệ ức chế tương ứng của indomethacin
là 40,13% và 63,22%. Các kết quả này cho thấy, Sa sâm nam có tác dụng hạ sốt, giảm
đau, chống viêm cấp hiệu quả, gần như tương đương với các thuốc chứng dương [46].
1.2.5.4. Kháng khuẩn
Một số thí nghiệm cho thấy rằng các cao chiết methanol của L. sarmentosa thể
hiện hoạt tính kháng khuẩn, chống lại cả vi khuẩn gram âm (Salmonella typhi ở nồng độ 100 µg/ml) và vi khuẩn gram dương (Escherichia coli ở nồng độ 50-100 µL, và Pseudomonas aeruginosa ở nồng độ 100 µL). Cao chiết ethanol của cây Sa sâm nam kháng trực khuẩn lao ở nồng độ 50 µg/ml [30]
Nhiều bộ phận của L. sarmentosa, đặc biệt là lá, có đặc tính kháng khuẩn do
sự hiện diện của tannin và flavonoid [9, 49]. Có thể đó là lý do tại sao các cao chiết
7
thô của L. sarmentosa có hoạt động kháng khuẩn đáng kể, chống lại cả vi khuẩn gram
âm và gram dương một cách đáng ngạc nhiên [45].
1.2.5.5. Các tác dụng khác
Ngoài các tác dụng chính đã liệt kê ở trên, L. sarmentosa còn được nghiên cứu
có tác dụng bảo vệ gan. Cao chiết ethanol 70% lá Sa sâm nam (i.p., 0,66 g/kg/ngày) khi sử dụng trong 7 ngày, các chỉ số chức năng gan bao gồm GOT, GPT, alkalin
phosphat, glucose máu, cholesterol máu và protein tổng số của chuột bị nhiễm độc
CCl4 được duy trì ở mức gần như bình thường. Khả năng hạ men GOT, GPT, alkalin
phosphat, glucose máu và protein tổng số của cao chiết này hiệu quả hơn so với thuốc
chứng dương Silymarin [40].
Sa sâm nam thể hiện tác dụng ức chế enzym α-glucosidase với IC50 = 67,09 μg/ml, tốt hơn so với thuốc chứng dương acarbose (IC50 = 138,2 μg/ml). Cùng với khả năng bảo vệ gan, L. sarmentosa được cho là cây thuốc hiệu quả trong điều trị tiểu
đường type 2 và các biến chứng liên quan đến bệnh tiểu đường, hạn chế tác dụng phụ
của các thuốc ức chế α-glucosidase [12].
Ngoài ra, hợp chất saponin triterpen phân lập từ hạt của cây Sa sâm nam thể
hiện tác dụng ức chế với nhiều chủng nấm khác nhau, bao gồm Penicillium notatum,
Aspergillus fumigatus, Fusarium oxysporum và Trichoderma viride [56].
1.2.6. Công dụng
Theo y học cổ truyền, Sa sâm nam có vị ngọt, nhạt, hơi đắng, tính mát, vào
kinh phế, có tác dụng bổ, mát phổi, giảm ho, long đờm, lợi sữa, nhuận tràng, lợi tiểu. Do thuộc tính galactagogue, Sa sâm nam thường được sử dụng như một thức
uống giúp lợi sữa sau khi sinh cho cả người và động vật [57]. Loại cây này chủ yếu
được biết đến nhiều trong điều trị về rối loạn tiêu hóa và nhiễm trùng đường tiết niệu.
Toàn cây có hiệu quả trong bệnh viêm khớp dạng thấp, các vấn đề về khớp và bệnh
gút [48]. Các chế phẩm từ lá được dân gian sử dụng để làm dịu các vết thương ngoài
da. Lá tươi giã nát uống trị tiêu chảy [53]. Rễ cây phơi khô sao vàng chữa sốt, ho khan, ho có đờm [1]. Nước ép quả dùng trị thấp khớp, giúp dễ ngủ ở trẻ em [20].
8
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Sa sâm nam (Hình 2.1) thu hái tại phường Quảng Thành, thành phố Thanh Hóa, tỉnh Thanh Hóa vào ngày
05/02/2022. Tên khoa học của mẫu nghiên cứu được ThS. Nguyễn Quỳnh Nga và
ThS. Phan Văn Trường, Viện Dược liệu giám định là Launaea sarmentosa (Willd.)
Merr. et Chun, họ Cúc (Asteraceae), tên Việt Nam là Sa sâm nam. Mẫu được lưu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu với số hiệu: DV-
050222. Dược liệu được sấy khô và bảo quản trong túi nilon để nơi khô ráo, tránh
Hình 2.1: Dược liệu Sa sâm nam khô.
ẩm.
2.2. Hóa chất, thiết bị 2.2.1. Hóa chất
- Hóa chất dùng trong định tính: Thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat, diazo, FeCl3 5%, gelatin 1%, chì acetat 5%, n-hexan, dicloromethan (DCM),
ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), ethanol (EtOH), n-butanol (BuOH), NaOH, HCl, cloroform, ….
- Dung môi dùng trong chiết xuất và phân lập: EtOH, EtOAc, MeOH, DCM,
aceton, n-hexan, ... đạt tiêu chuẩn công nghiệp
- Dung môi đo phổ: DMSO-d6, CDCl3 - Dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96% để phát hiện vết chất trên bản mỏng.
9
- Silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), silica gel đảo (75 μm, YMC
Co., Ltd, Nhật)..
- Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản
mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm).
2.2.2. Thiết bị
- Cân kĩ thuật Ohaus PA2102 (Mỹ), cân phân tích Precisa XT 220A (Precisa,
Thụy Sỹ).
- Bếp cách thủy Memmert WNB14 (Đức). - Bể siêu âm Vevor Ultrasonic Cleaner 10L (Ruianshisuikangxieyeshanghang). - Máy cất quay Rotavapor R-124, Rotavapor R-210 (Buchi, Swichzerland, Thụy
Sỹ).
- Máy cất quay chân không Rotavapor R-220 Pro 20L (Buchi, Thụy Sỹ). - Tủ sấy Binder FD 115 (Đức), Memmert UF110 (Đức). - Đèn tử ngoại VL-6.LC hai bước sóng 254 nm và 366 nm (Vilber, Pháp) - Bộ dụng cụ chiết hồi lưu gồm bếp đun bình cầu (Daihan), bình cầu 5L, sinh
hàn thẳng.
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer
(Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ).
- Sắc ký cột: Các loại cột sắc kí có kích cỡ khác nhau. - Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: Ống nghiệm, bình nón, bình gạn, phễu
thủy tinh, cốc có mỏ, pipet…
- Các thiết bị khác: Tủ hút, bếp điện, máy chụp ảnh UV…
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp
Một số nhóm chất thường gặp trong dược liệu được định tính bằng các phản
ứng hóa học theo các tài liệu [2, 3].
2.3.1.1. Định tính các thành phần trong dịch chiết n-hexan
Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet. Chiết bằng n-hexan
đến khi dung môi trong bình chiết không màu. Dịch chiết đem cất thu hồi bớt dung môi. Dịch chiết đậm đặc thu được dùng làm các phản ứng định tính chất béo, tinh dầu, phytosterol và carotenoid.
(1) Định tính chất béo
Nhỏ vài giọt dịch chiết ethanol lên giấy lọc. Phản ứng dương tính khi hơ khô
thấy để lại vết mờ trên giấy.
10
(2) Định tính carotenoid
Cô 5 ml dịch chiết tới cắn. Thêm 1-2 giọt acid sulfuric đặc, thấy xuất hiện màu
xanh ve thì phản ứng dương tính.
(3) Định tính phytosterol
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết n-hexan. Bốc hơi dung môi đến khô. Cho
vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ. Để ống nghiệm nghiêng 45°, thêm từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm. Kết quả dương tính cho thấy mặt phân cách có vòng màu tím đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh.
2.3.1.2. Định tính các thành phần trong dịch chiết cồn
Bã dược liệu sau khi chiết bằng n-hexan để bay hơi dung môi đến khô. Chiết
hồi lưu với 50 ml cồn 90º trong 30 phút. Dịch chiết được lọc và cô còn 10 ml để làm các phản ứng định tính flavonoid, coumarin, saponin, acid hữu cơ, acid amin và
đường khử tự do.
(4) Định tính saponin
Phản ứng tạo bọt: Cho 0,5 g bột dược liệu vào ống nghiệm có dung tích 20
ml, thêm vào đó 5 ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc nóng qua bông vào ống nghiệm có
dung tích 20 ml, thêm 2 ml nước cất. Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh
ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát. Phản ứng dương tính khi bọt
bền sau 10 phút.
Phản ứng Salkowski: Cho vào bình nón 2 g dược liệu, thêm 20 ml ethanol
90%, đun sôi cách thủy. Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, bốc hơi dịch
lọc đến cắn. Hòa tan một ít cắn trong 1 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml cloroform. Dùng pipet nhỏ từ từ 1-2 ml H2SO4 vào thành ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách.
Phân biệt saponin steroid và saponin triterpenoid: Lấy khoảng 1g bột dược liệu, chiết bằng EtOH 90% trên nồi cách thủy trong 10 phút, lọc nóng được dịch chiết cồn. Cho dịch chiết cồn vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 5 giọt
+ Ống 1: thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,1 N.
+ Ống 2: thêm 5 ml dung dịch HCl 0,1 N.
11
Lắc mạnh đồng thời 2 ống trong 1 phút và quan sát. Nếu cột bọt ống 1 cao hơn
ống 2, sơ bộ xác định là saponin steroid. Nếu cột bọt trong 2 ống cao ngang nhau thì
sơ bộ xác định là saponin triterpenoid.
(5) Định tính coumarin
Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch
chiết cồn, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Sau đó đun cả
2 ống nghiệm trên cách thủy sôi trong vài phút. Ống thứ nhất có màu vàng xuất hiện. Sau đó cho thêm vào mỗi ống 2 ml nước cất thấy ống thứ nhất trong hơn ống thứ 2,
nhưng sau khi acid hóa thì cả 2 ống đều đục như nhau (phản ứng dương tính).
Quan sát huỳnh quang: Nhỏ 1 giọt dung dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên
đó 1 giọt dung dịch NaOH 5%, sấy nhẹ. Che ½ vết bằng đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút, sau đó cất đồng xu đi, quán sát thấy nửa hình tròn không che và nửa
hình tròn bị che sáng như nhau.
Phản ứng với thuốc thử diazo: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm
vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt
thuốc thử diazo (mới pha), thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch (phản ứng dương tính).
(6) Định tính flavonoid
Phản ứng cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít
bột magie kim loại, rồi thêm vài giọt HCl đặc. Đun nóng trên cách thủy sau vài phút
thấy xuất hiện màu tím đỏ (phản ứng dương tính).
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống
nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh sẫm.
Phản ứng với kiềm: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung
dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng thêm.
(7) Định tính acid hữu cơ
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn và cô tới cắn. Hòa cắn trong 1 ml
nước và thêm vài tinh thể Na2CO3 thấy có bọt khí nổi lên.
(8) Định tính acid amin
Lấy 3 ml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm. Thêm 1-3 mảnh ninhydrin, đun
sôi 2 phút, phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu tím.
2.3.1.3. Định tính các thành phần trong dịch chiết nước
12
Cho 10 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 30 ml nước cất,
đun sôi trực tiếp 5 phút. Lọc lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
(9) Định tính tannin
Ống 1: 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt FeCl3 5%. Phản ứng dương tính khi xuất
hiện tủa xanh đen hoặc xanh nâu nhạt.
Ống 2: 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10%. Phản ứng dương tính khi
xuất hiện tủa bông.
Ống 3: 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%. Phản ứng dương tính
khi xuất hiện tủa bông trắng.
(10) Định tính đường khử tự do
Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào ống nghiệm. Thêm vào đó 0,5 ml TT Fehling A và 0,5 ml TT Fehling B. Đun sôi cách thủy vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch
(phản ứng dương tính).
(11) Định tính polysarcharid
Cho vào 2 ống nghiệm: ống 1: 4 ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol, ống 2:
4 ml dịch chiết nước + 5 giọt thuốc thử Lugol. Quan sát màu ống 2 đậm hơn ống 1
thì phản ứng dương tính.
2.3.1.4. Định tính các nhóm chất khác
(12) Định tính alcaloid
Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 15ml dung dịch H2SO4 2%, đun sôi vài phút. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6 N đến pH kiềm. Chiết alcaloid bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml. Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc với H2SO4 2%. Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml để làm các phản ứng sau:
Với thuốc thử Mayer (tủa trắng hay vàng nhạt)
Với thuốc thử Bouchardat (tủa nâu)
Với thuốc thử Dragendorff (tủa vàng cam hoặc đỏ)
(13) Định tính anthranoid (Phản ứng Borntraeger)
Cho vào ống nghiệm 5 g bột dược liệu, thêm dung dịch H2SO4 25% tới ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút. Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với
13
5 ml ether. Lấy 1 ml dịch ether cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml KOH 10%, quan sát
màu của lớp dung dịch KOH (đỏ).
2.3.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập 2.3.2.1. Phương pháp chiết xuất
Phần mặt đất của Sa sâm nam được chiết xuất với EtOH 80% bằng phương
pháp ngâm lạnh ở nhiệt độ phòng sau đó lọc loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và
cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao toàn phần.
Cao toàn phần được phân tán trong nước nóng và chiết phân đoạn lần lượt với
dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, EtOAc và BuOH (mỗi dung môi 3 lần
với tỉ lệ 1:1, v/v) thu được các phân đoạn tương ứng. 2.3.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica
gel (0,040-0,063 mm, Merck) kết hợp với sắc ký lớp mỏng.
+ Khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau,
chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt nhất để làm dung môi chạy cột.
+ Chuẩn bị cột: Cột sắc ký khô, sạch, lắp thẳng đứng trên giá cố định. Nhồi
một lớp bông xuống đáy cột. Thực hiện với chất hấp phụ là silicagel pha thường và
pha đảo. Silicagel pha thường cỡ hạt là 0,063 - 0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040 -
0,063 mm (Merck); pha đảo RP-18 cỡ hạt 0,03 – 0,05 mm (Merck). Sau đó, tiếp tục
cho dung môi chảy liên tục qua cột đến khi cột ổn định.
+ Nạp mẫu: Dùng pipet đưa mẫu vào cột. Sau đó, sử dụng dung môi rửa giải
chạy qua cột cho đến khi ổn định, đặt một miếng bông lên để bảo vệ bề mặt cột.
+ Khai triển cột: Sử dụng hệ dung môi thích hợp để khai triển cột, với độ phân
cực tăng dần.
+ Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng. Thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60G F254, độ dày 0,2 mm và RP-18 F254 (Merck), độ dày 0,25 mm. Sau khi triển khai sắc ký, phát hiện các chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 366 nm và quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phu thuốc thử H2SO4
10% trong EtOH 96% và hơ nóng.
+ Thu gom các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau. + Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các
hệ dung môi phù hợp. 2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT). Thiết lập bộ dữ liệu của chất phân
14
lập được. Sau đó so sánh dữ liệu thu được từ các chất đã phân lập với dữ liệu phổ các
chất đã công bố trong các tài liệu tham khảo.
15
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ có trong phần trên mặt đất của Sa sâm
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong Sa sâm nam.
nam được trình bày trong Bảng 3.1.
STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận
1 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy (++) Có
2 Carotenoid (+) Có Phản ứng với H2SO4 đặc
3 Phytosterol Phản ứng Liebermann (+) Có
4 Saponin Phản ứng tạo bọt (+)
Có (Saponin Phản ứng Salkowski (+++) steroid)
5 Coumarin Phản ứng mở - đóng vòng lacton (++) Có
Quan sát huỳnh quang (+)
Phản ứng với thuốc thử diazo (–)
6 Flavonoid Phản ứng Cyanidin Có (++)
(++) Phản ứng với FeCl3 5%
Phản ứng với kiềm (++)
7 Acid hữu cơ Không có (–) Phản ứng với Na2CO3
8 Acid amin Phản ứng với Ninhydrin Có (+)
9 Tannin Không có (+) Phản ứng với dd FeCl3 5%
Phản ứng với dd chì acetat 10% (+++)
Phản ứng với dd gelatin 1% (–)
10 Đường khử Có (+)
Phản ứng với thuốc thử Fehling A và thuốc thử Fehling B
11 Polysaccharid Phản ứng với thuốc thử Lugol Có (++)
12 Alcaloid Phản ứng với thuốc thử Mayer Có (+)
16
Phản ứng với thuốc thử (+)
Bouchardat
(++)
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff
13 Anthranoid Phản ứng Borntraeger (–) Không có
Ghi chú: (+): Dương tính, (++): Dương tính rõ, (+++): Dương tính mạnh,
(–): Âm tính
Nhận xét: Qua các phản ứng định tính, sơ bộ thấy trong phần trên mặt đất của Sa sâm nam có chứa các hợp chất của: chất béo, carotenoid, phytosterol, saponin, coumarin, flavonoid, acid amin, đường khử, polysaccharid và alcaloid.
3.2. Chiết xuất và phân lập các chất 3.2.1. Chiết xuất cao toàn phần
Sa sâm nam (3,0 kg) sau khi thái nhỏ được ngâm lạnh ở nhiệt độ phòng với
dung môi EtOH 80%, 3 lần x 3 ngày. Lọc loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất
thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 1,0 kg cao tổng EtOH 80%. Phân tán cao tổng trong nước nóng và chiết phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng
dần: n-hexan, EtOAc và BuOH. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các
cao phân đoạn tương ứng: Cao n-hexan (76,47 g), cao EtOAc (131,96 g), cao BuOH
(53,35 g) và cắn nước (583,87 g).
Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ phần trên mặt đất của
Sa sâm nam được tóm tắt ở sơ đồ Hình 3.2.
17
Phần trên mặt đất
1. Chiết EtOH 80%, 3 lần x 3 ngày 2. Loại bã dược liệu, gộp dịch chiết 3. Cất thu hồi dung môi
Sa sâm nam (3 kg)
1. Phân tán trong nước nóng 2. Chiết với n-hexan
Cao tổng (1 kg)
Cất thu hồi dung môi
Dịch chiết n-hexan
Dịch chiết nước
Chiết với EtOAt
Cao n-hexan (76,47 g)
Cất thu hồi dung môi
Dịch chiết EtOAt
Dịch chiết nước
Chiết với BuOH
Cao EtOAc (131,96 g)
Cất thu hồi dung môi
Dịch chiết EtOAt
Cắn nước (583,87 g)
Hình 3.1: Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ phần trên mặt đất của Sa sâm nam
Cao BuOH (53,35 g)
3.2.2. Chiết xuất và phân lập hợp chất
18
Tiến hành phân tách cao phân đoạn EtOAc (131,61 g) bằng sắc ký cột silicagel
(Φ 70 mm x 70 mm) với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexan :
aceton (20:1 → 1:1, v/v), DCM : aceton (9:1 → 1:1, v/v) và DCM : MeOH (8:2 →
1:1, v/v) thu được 8 phân đoạn ký hiệu là 1A ~ 1H.
Tinh chế phân đoạn 1C (1,54 g) bằng chạy sắc ký cột silicagel với hệ dung
môi rửa giải n-hexan : DCM : Aceton (9:1:1, v/v/v) thu được hợp chất SS-1C (21,09
mg).
Phân tách phân đoạn 1H (4,81 g) bằng sắc ký cột silicagel (Φ 30 mm x 30 mm)
với hệ pha động DCM : MeOH (20:1; 10:1; 5:1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn
là 2A ~ 2E. Phân đoạn 2B (1,56 g) được phân tách bằng sắc ký cột pha thường với
hệ dung môi n-hexan : DCM : aceton (9:1:1, 6:4:1, v/v/v) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn 3A ~ 3C. Tinh chế phân đoạn nhỏ 3B (172 mg) bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi aceton : H2O (1:1, v/v) thu được hợp chất SS-3B (31,0 mg).
Quy trình phân lập các hợp chất từ cao EtOAc được tóm tắt ở Hình 3.3.
19
Cao EtOAc
Sắc ký cột n-hexan : Aceton (20:1 → 1:1) DCM : Aceton (9:1 → 1:1) DCM : MeOH (8:2 → 1:1)
(131,61 g)
1A - 1B
1D - 1G
1C (1,54 g)
1H (4,81 g)
Sắc ký cột DCM : MeOH (20:1 → 1:1) )
Sắc ký cột HDA (9:1:1)
SS-1C (21,09 mg)
2A
1D - 1G
2B (1,56 g)
Sắc ký cột HDA (9:1:1 → 4:6:1)
3A
3C
3B (172 mg)
Sắc ký cột Aceton : H2O (1:1) SS-3B (31 mg)
Hình 3.2: Quy trình phân lập các hợp chất từ cao EtOAc từ cao chiết Sa sâm nam
3.3. Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được 3.3.1. Hợp chất SS-1C
Hợp chất SS-1C phân lập được dưới dạng bột màu trắng; 1H-NMR (500 Hz,
CD3OD) và 13C-NMR (125 Hz, CD3OD): Bảng 3.2.
Phổ 1H-NMR chỉ ra sự có mặt của nhóm hydroxymethin tại δH 3,51 (1H, m, H-3). Tín hiệu tại δH 5,35 (1H, m) đặc trưng cho proton olefin tại H-6 của sterol. Các
20
cặp tín hiệu singlet của nhóm methyl tại δH 0,68/ 0,70 (s, H-18) và 1,01 (s, H-19) cùng với các cặp tín hiệu doublet và triplet trong vùng 0,78 - 1,03 ppm của các nhóm methyl bậc 1, 2 và bậc 3 cùng với các tín hiệu nằm trong vùng trường cao (δH 0.78 - 2,31) gợi ý SS-1C là một hỗn hợp các sterol. Tín hiệu tại δH 5,02 (1H, dd, J = 15,0; 8,0 Hz) và 5,15 (1H, dd, J = 15,0; 8,0) tương ứng với 1 nối đôi có cấu hình trans trong cấu trúc của SS-1C. Phổ 13C-NMR cũng cho thấy tín hiệu của các nối đôi tại δC 121,7, 129,3, 138,3 và 140,9; 1 nhóm hydroxymethin tại δC 71,8. Ngoài ra, trên phổ DEPT còn cho thấy sự có mặt của 12 CH, 14 CH2 và 9 CH3, trong đó có các tín hiệu có cường độ lớn, điều này cũng gợi ý sự tồn tại của hỗn hợp 2 sterol trong cấu trúc
của SS-1C.
Dựa trên các dữ liệu phổ thu được, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo
[44], SS-1C được xác định là hỗn hợp của stigmasterol (cấu trúc A) và β-sitosterol
Hình 3.3: Cấu trúc của hợp chất SS-1C
(cấu trúc B) (Hình 3.4).
21
Bảng 3.2: Dữ liệu phổ của chất SS-1C và hợp chất tham khảo
ab
ab
ab
ab
ac
(ppm)
(ppm)
(ppm)
(ppm)
ac
ac
ac
Cấu trúc A Stigmasterol Cấu trúc B β-Sitosterol Vị δC δH δH δH δH δC δC δC trí (ppm) (ppm) (ppm) (ppm)
1 37,3 37,4 37,4
2 37,3 31,7 31,9 32,0 32,1
3 3,52 (1H, m) 71,8 3,52 (1H, m) 71,9 3,52 (1H, m) 71,8 3,52 (1H, m) 71,9
4 42,2 42,3 42,4 42,4
5 140,9 140,9 140,9 140,9
6 5,35 (1H, m) 121,7 5,36 (1H, t) 121,8 5,35 (1H, m) 121,7 5,36 (1H, t) 121,9
7 31,9 31,9 31,8 31,8
8 31,9 31,9 32,1 32,1
9 50,2 50,2 50,3 50,3
10 36,5 36,5 36,6 36,6
11 21,1 21,1 21,2 21,2
12 39,7 39,8 39,8 39,9
13 42,3 42,3 42,4 42,5
14 56,9 56,8 57,0 56,9
15 24,3 24,4 24,5 24,5
22
16 28,9 28,3 28,4 29,1
17 56,0 56,1 56,2 56,1
18 0,70 (3H, s) 12,0 0,85 (3H, s) 12,1 0,68 (3H, s) 11,9 0,85 (3H, s) 12,0
19 1,01 (3H, s) 19,4 1,01 (3H, s) 19,5 1,01 (3H, s) 19,4 0,82 (3H, s) 19,2
20 40,5 36,2 36,3 40,7
21 1,02 (3H, d, 7,0) 21,1 1,03 (3H, d, 7,2) 21,2 0,85 (3H, d, 6,0) 18,8 0,92 (3H, d, 5,1) 18,9
5,02 (1H, dd, 15,0; 22 138,3 5,00 (1H, dd) 138,5 34,0 34,1 8,0)
5,15 (1H, dd, 15,0; 23 129,3 5,15 (1H, dd) 129,4 26,1 26,2 8,0)
24 51,3 45,9 46,0 51,4
25 31,7 29,2 29,3 32,0
26 21,4 0,92 (3H, d, 6,5) 21,1 1,02 (3H, d) 21,2 0,82 (3H, d, 6,0) 21,2 0,83 (3H, d)
27 19,1 0,84 (3H, br s) 19,8 0,84 (3H, br s) 20,0 0,84 (3H, br s) 19,1 0,84 (3H, br s)
28 25,4 23,1 23,2 25,6
a đo trong 500 MHz, b CDCl3, c 125 MHz
29 12,2 0,80 (3H, t, 7,0) 12,2 0,81 (3H, t) 12,4 0,80 (3H, t, 7,0) 12,1 0,85 (3H, t)
23
3.3.2. Hợp chất SS-3B
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6): Bảng 3.3.
Hợp chất SS-3B phân lập được dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt;
Phổ 1H-NMR cho thấy SS-3B có 4 proton gắn vào vòng thơm trong đó 2 proton doublet tại δH 7,85 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-3) và 6,15 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-4) và 2 proton ở dạng singlet tại δH 6,97 (1H, s, H-5) và 6,73 (1H, s, H-8). Phổ 13C-NMR cho biết SS-3B có 9 carbon, trong đó có 8 carbon của nhân thơm hay của liên kết đôi nằm trong vùng từ 102,6 đến 150,4 ppm. Tín hiệu tại 160,8 ppm kết hợp với UV 366
nm cho thấy SS-3B có vòng lacton trong phân tử.
Từ những dữ liệu phổ thu được, có thể dự đoán SS-3B là 1 Esculetin; so sánh
Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất SS-3B
Bảng 3.3: Dữ liệu phổ của chất SS-3B và hợp chất tham khảo
với tài liệu [5] có thể khẳng định SS-3B là esculetin. (Hình 3.5)
ab
ad
ac (ppm)
ae (ppm)
(ppm)
(ppm)
SS3B Esculetin Vị trí δH δC δH δC
161,3 2 160,8
110,8 7,85 (1H, d, 9,6) 111,4 7,90 (1H, d, 9,5) 3
144,6 6,15 (1H, d, 9,6) 144,4 6,20 (1H, d, 9,5) 4
112,3 6,97 (1H, s) 112,3 7,10 (1H, s) 5
148,4 6 148,5
150,3 7 150,4
102,5 6,73 (1H, s) 102,6 6,79 (1H, s) 8
142,8 9 142,9
a DMSO-d6, b 600 MHz, c 150 MHz, d 500 MHz, e 125 MHz
110,8 10 110,7
24
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1. Về định tính
Phương pháp định tính 14 nhóm chất hữu cơ thường gặp (trừ glycosid tim) trong dược liệu nhằm đánh giá sơ bộ các nhóm chất có thể có trong mẫu nghiên cứu.
Từ đó có thể lựa chọn các phương pháp chiết xuất và phân lập phù hợp. Phương pháp này đơn giản, dễ thao tác, phù hợp với nhiều mẫu nghiên cứu. Kết quả định tính cho
thấy phần trên mặt đất của Sa sâm nam có chứa các nhóm chất tương tự như trong
các tài liệu tham khảo đã được công bố trước đó như: chất béo, carotenoid,
phytosterol, saponin, coumarin, flavonoid, acid amin, đường khử, polysaccharid và
alcaloid.
4.2. Về chiết xuất
Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngâm chiết với dung môi là
EtOH 80%. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với quy mô phòng
thí nghiệm. EtOH là dung môi chiết được nhiều nhóm hoạt chất, an toàn với môi
trường và giá thành rẻ. Cao chiết tổng sau đó được phân tán trong nước nóng và chiết
thành các cao phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc,
BuOH để phân tách các hợp chất một cách thuận lợi.
4.3. Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất
Quá trình phân lập các chất hóa học sử dụng phương pháp sắc ký cột thường
quy, phương pháp này dễ thực hiện, chi phí thấp và phù hợp với quy mô phòng thí
nghiệm. Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để lựa chọn phân đoạn, thăm dò hệ dung môi rửa giải, định tính các chất trong phân đoạn và theo dõi các chất trong quá
trình phân lập.
Với phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải thích
hợp, kết quả là đã phân lập được 2 hợp chất SS-1C và SS-3B. Dựa vào dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, và đối chiếu với các tài liệu đã được công bố, đã xác định cấu trúc của các chất trên lần lượt là: hỗn hợp của stigmasterol (cấu trúc A) và
β-sitosterol (cấu trúc B) (SS-1C) và esculetin (SS-3B). Hai hợp chất trên được phân lập lần đầu tiên từ phần trên mặt đất của L. sarmentosa và chi Launaea. Một số loài thực vật khác cũng cho thấy sự xuất hiện của hai hợp chất này với các tác dụng dược lý khác nhau đã được nghiên cứu. 4.3.1. Hỗn hợp của Stigmasterol và β-sitosterol
Trong một số nghiên cứu được công bố vào năm 2014, β-sitosterol chưa được tổng hợp và phân lập một cách tinh khiết hoàn toàn cho đến nay, nhưng nó đã được
25
tổng hợp từ stigmasterol tinh khiết thông qua hai cách. Trong cách đầu tiên, chuỗi bên C22-23 được hydro hóa chọn lọc để tạo ra β-sitosterol cùng với các nồng độ stigmasterol khác nhau và stigmastanol bão hòa hoàn toàn. Trong khi đó có thể hydro hóa stigmasterol (đồng thời bảo vệ C5-6-anken) thành cyclopropylcarbinyl ete ở cách sản xuất thứ hai. Quá trình này phải theo sau đó là hyđro hóa liên kết đôi C22-23 và đồng thời phân ly cyclopropan để tạo ra C3-ancol và C5–6-anken một lần nữa. Trên thực tế, tổng hợp và phân lập β-sitosterol vẫn còn là một thách thức vì thường tạo ra các sản phẩm phụ và việc loại bỏ chúng rất khó khăn. Do vậy, hợp chất thu được là
hỗn hợp của 2 phytosterol có cấu tạo gần tương tự nhau là: Stigmasterol và β-
sitosterol.
Sự kết hợp của 2 chất này tạo nên nhiều tác dụng dược lý khác nhau, trở thành
tiềm năng trong hỗ trợ điều trị bệnh và tăng cường sức khỏe cho con người. 4.3.1.1. Chống viêm, giảm đau, giảm phù nề
Tác dụng in vivo của β-sitosterol trên một mô hình quá mẫn kiểu chậm (DTH)
đã được báo cáo vào đầu năm 2006 [43]. Hợp chất này có thể làm giảm phù nề qua
trung gian tế bào nhưng nó không ức chế sự thâm nhập bạch cầu như hoạt động của
myeloperoxidase trong khi sinh thiết. Stigmasterol đã được đánh giá, tập trung vào
chứng phù não do 12-O-tetradecanoylphorbol acetat (TPA), bằng cách sử dụng một
lần và nhiều lần tác nhân phlogistic và được chứng minh là làm giảm phù nề. Nó cũng
có tác dụng chống viêm đáng kể [34].
Trong một nghiên cứu khác, hoạt tính của β-sitosterol (liều dao động: 0,1- 200
µM) được xác định trên sự biểu hiện của kết dính mạch máu và phân tử kết dính nội
bào 1 sử dụng ELISA, cùng với sự gắn kết monocyte (tế bào U937) kích thích TNF-
α trong tế bào nội mô động mạch chủ ở người (HAEC) bằng cách sử dụng xét nghiệm
bám dính [29].
Sự kết hợp của β-sitosterol và stigmasterol có thể ức chế cả kết dính mạch máu và kết dính nội bào phân tử biểu hiện khi HAEC được kích thích bởi TNF-α. Hơn
nữa, hợp chất này hoạt động như một chất ức chế quá trình phosphoryl hóa NFκB Trên thực tế, β-sitosterol làm giảm hoạt động của yếu tố phiên mã NFκB trong tế bào
đại thực bào [29].
4.3.1.2. Giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp
Hoạt động hạ cholesterol máu của β-sitosterol và stigmasterol được thực hiện
trên chuột đực. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tác động của hỗn hợp trên tới nồng độ
26
cholesterol và triglycerid ở gan là tương tự nhau. Các tác giả kết luận rằng hydro hóa
nhóm phytosterol thực vật là một tiềm năng mới, bởi vì nó sẽ cải thiện hoạt động hạ
cholesterol máu của chúng mà không ảnh hưởng đến sterol ban đầu [20]. Chế độ ăn
bổ sung có chứa phytosterol ở 28 bệnh nhân tăng lipid máu nguyên phát đã làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết tương và HDL, tiếp theo là nồng độ theapolipoprotein
B (apo-B) trong LDL [21].
Stigmasterol có tác dụng đáng kể trên cholesterol huyết thanh tương đương với hoạt tính chống tăng huyết áp của β-sitosterol. Vì vậy, sự bão hòa của chuỗi bên, tại ít nhất C22 là quan trọng đối với hoạt động chống tăng huyết áp [7]. Hơn nữa, sterol đã được chứng minh là có thể cạnh tranh với cholesterol để hấp thu ở ruột và do đó
làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết tương.
4.3.1.3. Hạ đường huyết
Hỗn hợp của 2 hợp chất trên được dùng đường uống cho chuột mắc bệnh tiểu
đường do alloxan gây ra và nó được phát hiện làm giảm đáng kể mức đường huyết.
β-sitosterol và stigmasterol khi nghiên cứu riêng lẻ không cho thấy tác dụng hạ đường
huyết trên chuột mắc bệnh tiểu đường do alloxan gây ra, trong khi hỗn hợp của chúng
tạo ra hiệu quả chữa bệnh đáng kinh ngạc [17]. Hơn nữa, việc sử dụng stigmasterol
cho chuột trong 20 ngày làm giảm triodothyronine huyết thanh (T3), thyroxin (T4),
nồng độ glucose và hoạt động của glucose-6-phosphate ở gan đồng thời gia tăng đáng
kể insulin, điều đó cho thấy hoạt tính ức chế tuyến giáp và hạ đường huyết [39].
4.3.1.4. Chống oxy hóa
Kết quả của một nghiên cứu cho thấy việc sử dụng β-sitosterol trong ung thư
ruột kết do 1,2-dimethylhydrazine gây ra làm tăng sinh các chất chống oxy hóa, điều
này cho phép các nhà khoa học khuyến nghị hợp chất này như một loại thuốc ngăn
ngừa hóa học hiệu quả đối với quá trình điều trị ung thư ruột kết [6]. β-sitosterol kích thích các enzym chống oxy hóa bằng cách kích hoạt thụ thể estrogen/con đường phụ
thuộc PI3- kinase. Tỷ lệ GSH và GSH/tổng glutathione được phục hồi sau khi điều trị bằng β-sitosterol, điều đó cho thấy phytosterol này có thể là chất xác định ROS [55]. Stigmasterol được nghiên cứu rằng có thể làm giảm quá trình peroxy hóa lipid
ở gan và tăng hoạt động của catalase, superoxide dismutase và glutathione, do đó cho thấy đặc tính chống oxy hóa của nó [39].
4.3.1.5. Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương
27
Cao chiết eter dầu hỏa từ các bộ phận trên mặt đất của Celesia coromandeliane
có chứa hợp chất có cấu trúc tương tự với các dẫn xuất stigmasterol có tác động giảm
đau đáng kể vì nó làm giảm số lần tái phát cơn đau đầu kinh niên và do căng thẳng
gây ra trên chuột bằng dung dịch acid acetic 1,2%. Tiền xử lý với các hợp chất này tạo ra sự bảo vệ đáng kể chống lại các cơn đau do strychnine và leptazol gây ra.
Tương tự như vậy, cao chiết từ lá của cây tía tô đất cho thấy hoạt động an thần như
một kết quả của tác dụng hiệp đồng giữa stigmasterol và β-sitosterol [37]. Stress oxy hóa do glucose oxidase gây ra và quá trình peroxy hóa lipid có thể được ngăn chặn
bằng cách kết hợp β-sitosterol vào màng tế bào, điều này cho thấy tiềm năng của hợp
chất này trong việc điều trị rối loạn thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer [50].
4.3.2. Hợp chất Esculetin
Esculetin được biết đến là một trong những coumarin đơn giản nhất với hai
nhóm hydroxyl ở nguyên tử carbon 6 và 7. Hiện nay, với hàng loạt các nghiên cứu về esculetin được báo cáo, ngày càng có nhiều sự chú ý hơn đối tiềm năng điều trị
của hợp chất này. Liên kết 6,7-biphenolic hydroxyl và 3,4-không bão hòa của cấu
trúc là các vị trí phản ứng quan trọng trong tổng hợp, dẫn đến thu được các dẫn xuất
esculetin mới để sàng lọc về mặt dược lý [27, 58].
4.3.2.1. Chất chống đông máu
Các dẫn xuất coumarin tự nhiên như esculetin, fraxetin và warfarin được sử
dụng trên lâm sàng như chất chống đông máu [18], esculetin cũng có thể có tiềm năng
dược phẩm để điều trị đột quỵ. Sự tăng sinh của các tế bào cơ trơn mạch máu
(VSMCs) gây ra bởi tổn thương các nội mạc của động mạch là một trong những yếu
tố gây bệnh quan trọng làm phát sinh các rối loạn tăng sinh mạch máu, chẳng hạn
như xơ vữa và tái hẹp động mạch. Esculetin có thể ức chế hiệu quả sự tăng sinh của
VSMCs trong ống nghiệm phụ thuộc vào liều lượng và thời gian. Cơ chế của tác dụng chống tăng sinh được tiết lộ bởi esculetin ức chế sự kích hoạt các con đường tín hiệu Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK và Ras-PI3K-Akt [10]. Cụ thể, esculetin ngăn chặn sự
tăng sinh tế bào thông qua trung gian của cả ảnh hưởng ngược dòng và các sự kiện xuôi dòng của tín hiệu Ras, chẳng hạn như kích hoạt p42/44 MAPK, PI3K và biểu
hiện gen sớm, cũng như kích hoạt NF-kB và AP-1. Esculetin cũng ngăn ngừa tăng sinh nội mạc trong các mô hình tổn thương mạch máu ở chuột, cho thấy tiềm năng của esculetin trong điều trị chứng tái hẹp sau chấn thương động mạch [38]. Một thí nghiệm khác tiết lộ rằng esculetin có thể kích hoạt thụ thể hormone hạt nhân PPAR-
28
γ và thúc đẩy sự biểu hiện ABCA1 và ABCG1; sau đó, nó ức chế sự hình thành các
tế bào có nguồn gốc từ cơ trơn [16].
4.3.2.2. Chống oxy hóa
Esculetin thể hiện hoạt tính chống lại các gốc DPPH mạnh mẽ và khả năng dọn các gốc tự do phụ thuộc vào thời gian và nồng độ [22]. Esculetin cũng là một tác
nhân mạnh trong việc bảo vệ tế bào khỏi tác hại của Abeta qua trung gian ROS [19].
Trong một nghiên cứu khác, esculetin có hiệu quả trong việc bảo vệ tế bào chống lại tổn thương DNA do stress oxy hóa gây ra [27].
4.3.2.3. Bảo vệ gan
Trong các bệnh về gan, việc tăng ROS và quá trình peroxy hóa lipid có thể
tăng cường sản xuất chất nền ngoại bào, được đặc trưng bởi sự tăng sinh mạnh của tế bào hình sao ở gan và làm tăng tốc độ tổn thương mô gan [13]. Một chất tương tự
chuỗi ngắn của lipid hydroperoxide, t-butyl hydroperoxide (t-BHP), có thể được
chuyển hóa thành chất trung gian và gốc tự do bởi cytochrome P-450 trong tế bào
gan, ngược lại có thể bắt đầu quá trình peroxy hóa lipid, ảnh hưởng đến tính toàn vẹn
của tế bào và dẫn đến tổn thương tế bào [28]. Tế bào không nhu mô là một trong
những vấn đề quan trọng trong tổn thương gan, trong đó ROS đóng một vai trò quan
trọng trong việc tăng yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu trong suốt quá trình
tạo xơ gan. Các loại thuốc cổ truyền của Trung Quốc như Cichorium intybus [15] và
Bougainvllra spectabillis có chứa esculetin được sử dụng trong dân gian để điều trị
tổn thương gan trong một thời gian dài. Việc sử dụng lâu dài này mang lại hiệu quả
điều trị tích cực và chứng minh rằng esculetin có hoạt tính chống độc gan sự trên các
nghiên cứu trên động vật [8]. Đánh giá mô bệnh học cho thấy rằng esculetin làm giảm
stress oxy hóa trong t-BHP gây ra mô hình tổn thương gan chuột, có thể được đặc
trưng bởi giảm sưng tế bào gan, giảm thâm nhiễm bạch cầu và hoại tử [24]. Do đó, esculetin có thể đóng một vai trò phòng ngừa ung thư gan thông qua việc kết hợp sử dụng với các tác nhân thứ cấp để thải độc gan.
4.3.2.4. Kháng khuẩn
Vi khuẩn gây bệnh cho người Escherichia coli O157: H7 là một trong những
loại vi khuẩn E. coli sinh ra độc tố Shiga, được cho là lây lan khi tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với động vật hoặc phân người bị nhiễm bệnh. E. coli O157: H7 là tác
nhân gây bệnh viêm đại tràng xuất huyết phổ biến nhất và cho đến nay vẫn chưa có
liệu pháp điều trị hiệu quả nào được phát hiện đối với nhiễm trùng E. coli O157: H7.
29
Esculetin được chứng minh rằng có tác động đối với sự sống sót của vi khuẩn E. coli
O157 khi bị nhiễm trong điều kiện môi trường đường ruột. Mầm bệnh được phát hiện
giảm đáng kể trong các mẫu phân sau khi cấy thí nghiệm so với mẫu đối chứng không
được cho ăn esculin (18% so với 37%). Việc bổ sung esculetin vào phân người và mô hình in vitro mô phỏng các điều kiện trong dạ con và ruột kết của con người, gây ra
sự giảm đáng kể khả năng sống sót của chủng E. coli O157 được đưa vào [11]. Một
thí nghiệm khác đã chứng minh rằng esculetin có thể ức chế gen độc tố tương tự Shiga stx2 ở E. coli O157: H7 và làm suy yếu độc lực của nó trong nghiên cứu in vivo ở
giun tròn Caenorhabditis elegans [23].
Esculetin được chứng minh có thể làm ảnh hưởng đến các gen liên quan đến
việc kiểm soát sự hình thành màng sinh học, phá vỡ cấu trúc của màng tế bào, và ức chế sự phát triển của vi khuẩn, do đó tăng cường lượng esculetin đưa vào cơ thể có
tác dụng kháng khuẩn đáng kể.
4.3.2.5. Hỗ trợ điều trị tiểu đường và các biến chứng của nó
Các coumarin tự nhiên và các dẫn xuất của nó đã được báo cáo là có tiềm năng
trong điều trị hiệu quả đối với bệnh tiểu đường và các biến chứng liên quan [26]. Một
nghiên cứu trước đây cho thấy rằng esculetin có tác dụng làm tăng insulin và nồng
độ hemoglobin cũng như điều hòa giảm lượng glucose trong huyết tương và nồng độ
hemoglobin glycosyl hóa (HbA1c) ở liều 40 mg/kg [41]. Điều trị bằng esculetin có
tác dụng bảo vệ bệnh tiểu đường bằng cách làm giảm căng thẳng oxy hóa qua trung
gian tăng đường huyết thông qua khả năng chống oxy hóa ở cả mô gan và mô thận
[42]. Trong một thí nghiệm khác, esculetin có tác dụng chống tăng đường huyết rõ
rệt đối với chuột mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin gây ra [41].
4.3.2.6. Tác dụng trên tim mạch
Các nghiên cứu in vitro cho thấy rằng esculetin từ 12,5 đến 100 μM làm giảm sự tích tụ lipid trong 3 tế bào mỡ T3-L1 theo cách phụ thuộc vào nồng độ bằng cách
giảm các dấu hiệu biệt hóa tế bào mỡ quan trọng PPARγ, CCAAT / (C / EBPα), cũng như tế bào mỡ protein liên kết với axit béo thông qua việc tăng quá trình phosphoryl hóa AMPK và mục tiêu của nó, acetyl-CoA carboxylase (ACC) [21]. Esculetin khôi
phục nồng độ cholesterol lipoprotein mật độ cao (HDL-C) trong huyết thanh ở chuột với liều 35 mg/kg, có lợi cho việc làm giảm chứng tăng lipid máu phụ thuộc vào tổn
thương gan [52].
30
Hơn nữa, esculetin được chứng minh là một hoạt chất tiềm năng để điều trị
chứng xơ vữa động mạch. Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng sự tăng sinh và di
chuyển của các tế bào cơ trơn mạch máu (VSMC) có liên quan đến quá trình tái tạo
mạch máu, đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của các tổn thương thứ phát trong xơ vữa động mạch [47, 54]. Một nghiên cứu sâu hơn cho thấy rằng esculetin ở
nồng độ giữa 12,5 và 25 μg/mL ngăn chặn sự biểu hiện TNF-α do MMP-9 gây ra
trong VSMC phụ thuộc vào nồng độ [25].
31
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Kết luận
Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, khóa luận đã thu được một số kết quả
như sau:
- Đã định tính và xác định được một số nhóm chất có trong phần trên mặt đất của Sa sâm nam là: chất béo, carotenoid, phytosterol, saponin, coumarin,
flavonoid, acid amin, đường khử, polysaccharid và alcaloid.
- Đã chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của 2 hợp chất là: hỗn hợp của stigmasterol (cấu trúc A) và β-sitosterol (cấu trúc B) (SS-1C) và
esculetin (SS-3B).
Đề xuất
- Tiếp tục phân lập các hợp chất khác từ cao EtOAc và cao phân đoạn còn lại từ
loài Sa sâm nam (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun).
32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích và các cộng sự (2006), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt
Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tập II, tr. 650-651.
2. Bộ môn Dược liệu (2010), Thực tập Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội.
3. Bộ Y Tế (2011), Dược liệu học, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội. Tập 1 và 2.
4. Viện dược liệu (2020), "Thực trạng và giải pháp phát triển dược liệu giai đoạn
2020-2030", Bộ Y tế, tr. 1.
Tài liệu tiếng Anh
5. Awaad, A. S., Soliman, G. A., El-Sayed, D. F., El-Gindi, O. D., & Alqasoumi,
S. I (2012), "Hepatoprotective activity of Cyperus alternifolius on carbon tetrachloride–induced hepatotoxicity in rats", Pharmaceutical Biology. 50(2),
pp. 155-161.
6. Baskar, A. A., Al Numair, K. S., Gabriel Paulraj, M., Alsaif, M. A., Muamar,
M. A., & Ignacimuthu, S (2012), "β-sitosterol prevents lipid peroxidation and improves antioxidant status and histoarchitecture in rats with 1, 2-
dimethylhydrazine-induced colon cancer", Journal of Medicinal Food. 15(4),
pp. 335-343.
7. Chandler, R. F., Hooper, S. N., & Ismail, H. A (1979),
"Antihypercholesterolemic studies with sterols: β-sitosterol and stigmasterol",
Journal of Pharmaceutical Sciences. 68(2), pp. 245-247.
8. Choi, R. Y., Ham, J. R., & Lee, M. K (2016), "Esculetin prevents non-
alcoholic fatty liver in diabetic mice fed high-fat diet", Chemico-biological
Interactions. 260, pp. 13-21.
9. Chung, K. T., Wong, T. Y., Wei, C. I., Huang, Y. W., & Lin, Y (1998),
"Tannins and human health: a review", Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 38(6), pp. 421-464.
10. Dai Rong, Z. Q., & Quansheng, X (2009), "Inhibitory effects of esculetin on proliferation of rat vascular smooth muscle cells in vitro and the underlying
mechanism", Acta Medicinae Universitatis Scientiae et Technologiae
Huazhong. 2, pp. 028.
11. Duncan, S. H., Leitch, E. C. M., Stanley, K. N., Richardson, A. J., Laven, R.
A., Flint, H. J., & Stewart, C. S (2004), "Effects of esculin and esculetin on
the survival of Escherichia coli O157 in human faecal slurries, continuous-
flow simulations of the rumen and colon and in calves", British Journal of Nutrition. 91(5), pp. 749-755.
12. Phu Tuong Nguyen Dung et al (2019), "Saponin, Polyphenol, Flavonoid
content and α-glucosidase Inhibitory Activity, Antioxidant Potential of Launaea sarmentosa Leaves grown in Ben Tre province, Vietnam", IOP
Conference Series: Materials Science and Engineering, IOP Publishing, pp.
012036.
13. Gilani, A. H., Janbaz, K. H., & Shah, B. H (1998), "Esculetin prevents liver damage induced by paracetamol and CCl4", Pharmacological Research. 37(1), pp. 31-35.
14. Le Hong Hanh et al. (2020), "Chemical constituents of Launaea sarmentosa
roots", Vietnam Journal of Chemistry. 58(5), tr. 637-642.
15. Hassan, H. A., & Yousef, M. I (2010), "Ameliorating effect of chicory
(Cichorium intybus L.)-supplemented diet against nitrosamine precursors-
induced liver injury and oxidative stress in male rats", Food and Chemical
Toxicology. 48(8-9), pp. 2163-2169.
16. He, C., Huang, Y., Li, B. S., Zhou, J. J., Hu, L., & Guo, X. M (2012), "Effect
of the esculetin on the cholesterol transport protein ABCA1 and ABCG1 in
smooth muscle-derived foam cells", Guangdong Medical Journal. 33, pp.
3368-3371.
17. Jamaluddin, F., Mohamed, S., & Lajis, M. N (1994), "Hypoglycaemic effect
of Parkia speciosa seeds due to the synergistic action of β-sitosterol and stigmasterol", Food Chemistry. 49(4), pp. 339-345.
18.
Ji, J., Wang, L. C., Wu, H., & Luan, H. M (2011), "Bio-function summary of marine oligosaccharides", International Journal of Biology. 3(1), pp. 74-86.
19. Kaneko, T., Tahara, S., & Takabayashi, F (2003), "Suppression of lipid
hydroperoxide-induced oxidative damage to cellular DNA by esculetin",
Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26(6), pp. 840-844.
20. Kilian, N (1997), Revision of Launaea Cass.(Compositae, Lactuceae,
Sonchinae), Botanischer Garten und Botanisches Museum Berlin-Dahlem.
21. Kim, Y., & Lee, J (2015), "Esculetin, a coumarin derivative, suppresses
adipogenesis through modulation of the AMPK pathway in 3T3-L1 adipocytes", Journal of Functional Foods. 12, pp. 509-515.
22. Lee, B. C., Lee, S. Y., Lee, H. J., Sim, G. S., Kim, J. H., Kim, J. H et al (2007),
"Anti-oxidative and photo-protective effects of coumarins isolated fromFraxinus chinensis", Archives of Pharmacal Research. 30(10), pp. 1293-
1301.
23. Lee, J. H., Kim, Y. G., Cho, H. S., Ryu, S. Y., Cho, M. H., & Lee, J (2014),
"Coumarins reduce biofilm formation and the virulence of Escherichia coli O157: H7", Phytomedicine. 21(8-9), pp. 1037-1042.
24. Lee, M. J., Chou, F. P., Tseng, T. H., Hsieh, M. H., Lin, M. C., & Wang, C. J
(2002), "Hibiscus protocatechuic acid or esculetin can inhibit oxidative LDL
induced by either copper ion or nitric oxide donor", Journal of Agricultural
and Food Chemistry. 50(7), pp. 2130-2136.
25. Lee, S. J., Lee, U. S., Kim, W. J., & Moon, S. K (2011), "Inhibitory effect of
esculetin on migration, invasion and matrix metalloproteinase-9 expression in
TNF-α-induced vascular smooth muscle cells", Molecular Medicine Reports.
4(2), pp. 337-341.
26. Li, H., Yao, Y., & Li, L (2017), "Coumarins as potential antidiabetic agents",
Journal of Pharmacy and Pharmacology. 69(10), pp. 1253-1264.
27. Liang, C., Ju, W., Pei, S., Tang, Y., & Xiao, Y (2017), "Pharmacological
activities and synthesis of esculetin and its derivatives: a mini-review",
Molecules. 22(3), pp. 387.
28. Lin, W. L., Wang, C. J., Tsai, Y. Y., Liu, C. L., Hwang, J. M., & Tseng, T. H
(2000), "Inhibitory effect of esculetin on oxidative damage induced by t-butyl hydroperoxide in rat liver", Archives of Toxicology. 74(8), pp. 467-472.
29. Loizou, S., Lekakis, I., Chrousos, G. P., & Moutsatsou, P (2010), "β‐Sitosterol
exhibits anti‐inflammatory activity in human aortic endothelial cells",
Molecular Nutrition & Food Research. 54(4), pp. 551-558.
30. Millat, M. S., Islam, S., Hussain, M. S., Moghal, M. M. R., & Islam, T (2017),
"Antibacterial profiling of Launaea sarmentosa (Willd.) and Bruguiera
cylindrica (L.): Two distinct ethno medicinal plants of Bangladesh", European
Journal of Experimental Biology. 7(6).
31. Moghal, M. M. R., Millat, M. S., Hussain, M. S., & Islam, M. R (2016),
"Thrombolytic and membrane stabilizing activities of Launaea sarmentosa",
International Journal of Pharmacognosy. 3(8), pp. 354-358.
32. Nadkarni, A (1954), "Nadkarni's Indian Materia Medica", Nadkarni's Indian
Materia Medica.
33. Nagalapur, S. K., & Paramjyothi, S (2010), "In vitro antioxidant activity of
Launaea pinnatifida cass leaves", Biogeosciences. 5(1), pp. 105-108.
34. Navarro, A., De Las Heras, B., & Villar, A (2001), "Anti-inflammatory and
immunomodulating properties of a sterol fraction from Sideritis foetens
Clem", Biological and Pharmaceutical Bulletin. 24(5), pp. 470-473.
35. Nguyen, T. Q., Binh, T. D., Kusunoki, R., Pham, T. L., Nguyen, Y. D.,
Nguyen, T. T et al. (2020), "Effects of Launaea sarmentosa extract on
lipopolysaccharide-induced inflammation via suppression of NF-κB/MAPK
signaling and Nrf2 activation", Nutrients. 12(9), pp. 2586.
36. Ozenda, P (1992), Flore et végétation du Sahara, Elsevier Masson.
37. Pal, D., & Nandi, M (2005), "CNS activities of Celesia coromandeliane Vahl.
in mice", Acta Poloniae Pharmaceutica. 62(5), pp. 355-61.
38. Pan, S. L., Huang, Y. W., Guh, J. H., Chang, Y. L., Peng, C. Y., & Teng, C.
M (2003), "Esculetin inhibits Ras-mediated cell proliferation and attenuates
vascular restenosis following angioplasty in rats", Biochemical
Pharmacology. 65(11), pp. 1897-1905.
39.
Panda, S., Jafri, M., Kar, A., & Meheta, B. K (2009), "Thyroid inhibitory, antiperoxidative and hypoglycemic effects of stigmasterol isolated from Butea monosperma", Fitoterapia. 80(2), pp. 123-126.
40.
Pokharkar, R. D., Takate, S. B., Deshmukh, R. D., & Gite, V. N (2007), "Hepatoprotective activity of Launaea pinnatifida against CCl4 induced hepatic injury in rats", Pharmacologyonline. 2, pp. 128-133.
41. Prabakaran, D., & Ashokkumar, N (2012), "Antihyperglycemic effect of
esculetin modulated carbohydrate metabolic enzymes activities in
streptozotocin induced diabetic rats", Journal of Functional Foods. 4(4), pp.
776-783.
42. Prabakaran, D., & Ashokkumar, N (2013), "Protective effect of esculetin on
hyperglycemia-mediated oxidative damage in the hepatic and renal tissues of
experimental diabetic rats", Biochimie. 95(2), pp. 366-373.
43. Prieto, J. M., Recio, M. C., & Giner, R. M (2006), "Anti-inflammatory activity
of β-sitosterol in a model of oxazoloneinduced contact-delayed-type
hypersensitivity", Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas
Medicinales y Aromáticas. 5(3), pp. 57-62.
44. Pusparohmana, W. R., Safitry, R. D., Marliana, E., & Kusuma, I. W (2020),
"Isolation and characterization of stigmasterol and β-sitosterol from wood
bark extract of Baccaurea macrocarpa Miq. Mull. Arg".
45. Rahman, M. A., Hussain, M. S., Millat, M. S., Ray, M. C., Amin, M. T., &
Moghal, M. M. R (2016), "Screenings of In-vitro antimicrobial, cytotoxic and
anti-inflammatory activity of crude methanolic extracts of Crinum latifolium
(Leaves)", Journal of Medicinal Plants Research. 10(37), pp. 649-655.
46. Raju, G. S., RahmanMoghal, M. M., Hossain, M. S., Hassan, M. M., Billah,
M. M., Ahamed, S. K., & Rana, S. M (2014), "Assessment of pharmacological
activities of two medicinal plant of Bangladesh: Launaea sarmentosa and
Aegialitis rotundifolia roxb in the management of pain, pyrexia and
inflammation", Biological Research. 47(1), pp. 1-11.
47. Ross, R (1993), "The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the
1990s", Nature. 362(6423), pp. 801-809.
48. Salih, Y., Harisha, C. R., Shukla, V. J., & Acharya, R (2013),
"Pharmacognostical evaluation of Launaea sarmentosa (Willd.) schultz-bip. ex Kuntze root", Ayu. 34(1), pp. 90.
49. Scalbert, A (1991), "Antimicrobial properties of tannins", Phytochemistry.
30(12), pp. 3875-3883.
50. Shi, C., Wu, F., Zhu, X., & Xu, J (2013), "Incorporation of β-sitosterol into
the membrane increases resistance to oxidative stress and lipid peroxidation
via estrogen receptor-mediated PI3K/GSK3β signaling", Biochimica et
Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1830(3), pp. 2538-2544.
51. Talele, C. D., & Patil, S. V (2017), "Phytochemical screeening of Launaea
pinnatifitida leaves extract", International Journal of Pharmacology and Biological Sciences. 11(2), pp. 21.
52. Taşdemir, E., Atmaca, M., Yıldırım, Y., Bilgin, H. M., Demirtaş, B., Obay, B.
D et al. (2017), "Influence of coumarin and some coumarin derivatives on in carbontetrachloride-exposed rats", Human & serum lipid profiles
Experimental Toxicology. 36(3), pp. 295-301.
53. Tetali, P., Waghchaure, C., Daswani, P. G., Antia, N. H., & Birdi, T. J (2009),
"Ethnobotanical survey of antidiarrhoeal plants of Parinche valley, Pune district, Maharashtra, India", Journal of Ethnopharmacology. 123(2), pp. 229-
236.
54. Visse, R., & Nagase, H (2003), "Matrix metalloproteinases and tissue
inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry",
Circulation Research. 92(8), pp. 827-839.
55. Vivancos, M., & Moreno, J. J (2005), "β-Sitosterol modulates antioxidant
enzyme response in RAW 264.7 macrophages", Free Radical Biology and
Medicine. 39(1), pp. 91-97.
56. Yadava, R. N., & Chakravarti, N (2009), "New antifungal triterpenoid saponin
from Launaea pinnatifida Cass".
57. Yusriya, S., Harisha, C. R., Shukla, V. J., & Acharya, R. N (2011), "A
pharmacognostical and pharmacological evaluation of a folklore medicinal
plant “Kulhafila” Launaea sarmentosa (Willd) Schultz Bip. ex Kuntze)", MD
(Ayu) Dissertation, IPGT and RA, Gujarat Ayurved University, Jamnagar.
58. Zhang, L., Xie, Q., & Li, X (2022), "Esculetin: A review of its pharmacology
and pharmacokinetics", Phytotherapy Research. 36(1), pp. 279-298.
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
PHỤ LỤC 2. DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT
Phụ lục 2.1. Dữ liệu phổ của hợp chất SS-1C
Phụ lục 2.2. Dữ liệu phổ của hợp chất SS-3B
PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
PHỤ LỤC 2. DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC CHẤT
Phụ lục 2.1. Dữ liệu phổ của hợp chất SS-1C
Phụ lục 2.2. Dữ liệu phổ của hợp chất SS-3B
PHỤ LỤC 2.1. DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT SS-1C
Cấu trúc hóa học của hợp chất SS-1C
Phụ lục 2.1.1. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất SS-1C
Phụ lục 2.1.2. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất SS-1C
Phụ lục 2.1.3. Phổ DEPT của hợp chất SS-1C
Phụ lục 2.1.1. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất SS-1C (1)
Phụ lục 2.1.1. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất SS-1C (2)
Phụ lục 2.1.1. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất SS-1C (3)
Phụ lục 2.1.2. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất SS-1C (1)
Phụ lục 2.1.2. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất SS-1C (2)
Phụ lục 2.1.2. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) của hợp chất SS-1C (3)
Phụ lục 2.1.3. Phổ DEPT của hợp chất SS-1C (1)
Phụ lục 2.1.3. Phổ DEPT của hợp chất SS-1C (2)
Phụ lục 2.2. Dữ liệu phổ của hợp chất SS-3B
Cấu trúc hóa học của hợp chất SS-3B
Phụ lục 2.2.1. Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) của hợp chất SS-3B
Phụ lục 2.2.2. Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) của hợp chất SS-3B
Phụ lục 2.2.1. Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) của hợp chất SS-3B (1)
Phụ lục 2.2.1. Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) của hợp chất SS-3B (2)
Phụ lục 2.2.2. Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) của hợp chất SS-3B (1)
Phụ lục 2.2.2. Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) của hợp chất SS-3B (2)
