Kỹ thuật chuyển gien trên thục vật

Chia sẻ: Lan Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

71
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thuật ngữ ‘chuyển gien’ (Transgenic) dùng để chỉ việc đưa gien vào 1 đối tượng SV nào đó bằng KT ADN tai tổ hợp. Gien được chuyển từ các loài khác hay trong cùng 1 loài. Từ đồng nghĩa (Synonym): Genetically modified organism (GMO) Genetically engineered organism (GEO)

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Kỹ thuật chuyển gien trên thục vật

Valued Gateway Customer Kỹ thuật chuyển gien trên thục vật Cây trồng chuyển gien (GMO) Hiện nay, diện tích GMO trên thế giới khoảng 215 triệu acres Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Gien là 1 đoạn ADN mã hóa 1 loại protein chuyen biệt biểu hiện 1 tính trạng. mRNA protein trait translation transcription expression Cây trồng chuyển gien là gì ? • Thuật ngữ ‘chuyển gien’ (Transgenic) dùng để chỉ việc đưa gien vào 1 đối tượng SV nào đó bằng KT ADN tai tổ hợp. Gien được chuyển từ các loài khác hay trong cùng 1 loài. • Từ đồng nghĩa (Synonym): Genetically modified organism (GMO) Genetically engineered organism (GEO) Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Những cây trồng nào được phát triển từ các loài này ? Những cây trồng nào được phát triển từ các loài này ? Bắp (corn) Cà rốt (carrot) cải salade (lettuce) Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Teosinte Bắp (maize) Sinapis Cabbage Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Từloài hoang dại trở thành loài trồng • Mất khả năng phát tán hạt tự nhiên (rụng, lông, gai...) • Nảy mầm nhanh • Hạt lớn • Chín đồng loạt • Mất khả nang tự baro vệ trong môi trường tự nhiên • Màu sắc thay đổi • Không còn chất độc hoặc vị đắng Thuần hóa (Domestication) Source: Damania, 2008 Quá trình chọn giống gồm 2 bước cơ bản I. Tạo ra (hoặc nhận diện) các dạng biến dị. • Thu thập từ nơi hoang dại hay ruộng nông dân • Lai tạo (lai giữa 2 hay nhiều cây) • Gây đột biến, hoặc đa bội II. Chọn lựa các tính trạng mong muốn. Các đặc tính đầu tiên được nhà chọn giống quan tâm trong quá trình thuần hóa là: hạt to, không bị ngủ đông, và không bị rụng hạt. Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Công tác lai tạo có thể thực hiện từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau Nguồn gien sơ cấp (trong cùng loài) • Các giống ưu việt • Giống địa phương (primitive cultivars) • Giống hoang dại của cùng loài Nguồn gien thứ cấp (khác loài) • Giống trồng, giống địa phương, hoặc cây hoang dại của các loài khác (species) hoặc giống khác (genera) lai xa Lai xa và xử lý đột biến không được sử dụng phổ biến • Cây ngũ cốc triticale là sản phNm lai xa giữa lúa mì (Triticum) và lúa mạch đen (Secale). • TAM107, giống lúa mì có chứa 1 cánh N ST của lúa mạch đen, à giống chống chịu stress được trồng phổ biến ở Colorado (Mỹ). • Giống lúa mì ‘Clearfield’, mang gien kháng thuốc trừ cỏ, được tạo ra do xử lý đột biến, sắp được đưa ra thị trường. Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer KT chuyển gien có phải là bước mở rộng của PP chọn giống truyền thống hay là sự phát triển nhảy vọt hoàn toàn mới ? • KT chuyển gien cho phép khai thác các biến dị di truyền trong thế giới SV, thay vì chỉ giưới hạn trong cùng loài hay cùng giống trong hệ thống phân loại. • Gien được chuyển với mức độ chính xác rất cao so với các PP trước đây. • N hưng 2 bước cơ bản của qui trình chọn giống vẫn phải đảm bảo: tạo biến dị và chọn lựa tính trạng mong muốn. Qui trình tạo cây chuyển gien • Phân lập và nhân dòng (cloning) gien cần chuyển • Gắn thêm vào gien các đoạn khởi động và điều hòa hoạt động của gien • Gắm thêm marker chọn lọc (selectable marker) • Đưa cấu trúc được thiết kế (cassette) và TB của cây (chuyển gien - transformation) • Chọn lọc các Tb hay mô mang gien chuyển • Tái tạo lại Regenerate whole plants Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Bước 1: Xác định và nhân dòng (cloning) gien cần chuyển • Đây là bước đàu tiên, và cũng là giới hạn của thành tự về chuyển gien. • Các phòng thí nghiệm quốc gia cũng như tư nhân đang tập trung rất nhiều công sức vào việc xác định , định vị, kháo sát tính chất và nhân dòng những gien kiểm soát các tính trạng nông học quan trọng (chiều cao, trổ hoa, số trái, số hạt, năng suất...). Arabidopsis thaliana • Việc giải mã trình tự bô gien hoàn tất vào tháng 12/2000: bộ gien chứa khoảng ~120 Mb (ADN ), và có khoảng 25.000 gien. • ‘Dự đoán’ chức năng của gien được thực hiện cho khoảng 70% các gien. • N hững vùng lặp chiếm khoảng 58% bộ gien, dường như do sự nhân đôi của toàn bộ gien xảy ra vào khoảng 100 triệu năm về trước. Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Thông tin có được từ nghiên cứu trên Arabidopsis • Có nhiều loại gien huộc nhom Protein-kinase hơn dự đoán. Điều này co thấy tầm quan trọng trong cơ chế truyền phát tín hiệu trong TB. • N hũng gien kiểm soát các hoạt động cơ bản của TB được bảo tồn trong quá trình tiến hóa (có tỉ lệ giống nhau cao giữa người và Arabidopsis). N gược lại, các gien kiểm soát sự trao đổi thông tin của TB thì rất thay đổi, bao gồm: ♦ Các gien kiểm soát các chức năng cơ bản của TB tồn tại ừ thời tổ tiên. ♦ N hưng khi đến giai đoạn đa bào thì tiến hóa theo hướng khác nhau giữa ĐV và TV. Các dạng đột biến trên Arabidopsis được tạo ra bằng KT chuyển gien (Đột biến “knock-out”) cho phép phát hiện chức năng của các gien. (Cá (Các độ đột biế biến liên quan đến đến cấu tạ tạo hoa) Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Mục tiêu tương lai trong nghiên cứu bộ gien TV • Xác định chức năng của tất cả các gien trên Arabidopsis (2010) • Giải mã trình tự bộ gien của cây lúa (bộ gien nhỏ nhất trong nhóm ngũ cốc). • Giải mã trình tự của cây cỏ 3 lá (Medicago truncatula) (đại diện cho nhóm cây họ đậu). • Giải mã trình tự nhũng vùng mang nhiều gien (gene-rich regions) của nhóm cây ngũ cốc với bộ gien lớn, VD: bắp, lúa mì... Bước 2: Gien Bt • Bào tử của csc VK đất Bacillus thuringiensis (Bt) có chứa các tinh thể (crystalline - Cry) protein. Tromg hệ thống tiêu hóa của côn trùng, các tinh thể này bị phá vở và giải phóng ra các độc tố để liên kết và làm thủng đường ruột của côn trùng. • 1 đoạn của gien Cry được sử dụng trong chuyển gien để tạo ra các giống cây trồng Bt. Đoạn không cần thiết cho độc tính Đoạn mã hóa cho độc tố Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Bước 2: gắn thêm các đoạn ADN để kiểm soát biểu hiện của gien Promoter Bt coding Terminator sequence • Promoter = điểm bắt đầu của quá trình sao mã; có tính chuyên biệt cho thời điểm, vị trí mô, mức độ biểu hiện của giean. • Termination sequence = điểm kế thúc của quá trình sao mã. Transgene promoters • Thường được sử dụng là CaMV 35S promoter của víu gây bệnh khảm trên cây bông cải. Đây là promoter mạnh và biểu hiện ở mọi nơi, mọi lúc (constitutive promoter) ở TV. • Các Promoter có tính chuyên biệt hơn đang được nghiên cứu: đặc trưng cho cơ quan, giai đoạn phát triển của TV hay trong các đ/kiện đặc biệt khác. Transgene Terminator • Thường được sử dụng nhất là nopaline synthase (nos) transcription terminator của VK Agrobacterium tumefaciens. Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Bước 3: Gắn thêm các marker chọn lọc (Selectable markers • Bởi vì hiệu quả chuyển gien rất thấp (từ 1 - 5% TB nhận được gien chuyển), do đó cần phải có PP để nhận diện các TB đã nhận được gien chuyển để tiếp tục. • Hiện nay, các gien kháng vói kháng sinh (antibiotic) hoặc với thuốc trừ cỏ thường được sử dung làm marker nhận diện. Thiết kế gien Bt (cassete) cho chuyển gien Antibiotic or herbicide resistance gene Bt gene Promoter Termination sequence Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Bước 4: Chuyển thiết kế gien vào TB TV (chuyển gien - Transformation) • Súng bắn gien (Gene gun = biolistics, microprojectile bombardment) • Chuyển gien bằng VK Agrobacterium Các loại mô TV được sử dụng trong chuyển gien Việc chọn lựa các mô TV để chuyển gien tùy thuộc vào từng loại cây trồng, thường là các phôi chưa trưởng thành (immature embryos), dĩa lá (leaf disks) và mô phân sinh ngọn (apical meristems). Các mô được chọn phải có khả năng tạo callus (undifferentiated tissue), từ đó tái tạo lại cây. Trên Arabidopsis, PP chuyển gien có thể thực hiện đơn giản bằng cách phun ddịch có chứ gien cần chuyển + vector lên trên các chồi.. Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer PP sử dụng súng bắn gien (“Gene gun” method) DN A pellets TB TV Gien cần chuyển N ST của TV Source: Monsanto PP sử dụng súng bắn gien (“Gene gun” method) Đây là PP vật lý: • Các hạt kim loại (vàng hoặc titan) rất nhỏ có ADN bám xung quanh, nằm trong ddịch huyền phù, được sử dụng thành giọt nhỏ trong súng bắn gien. • Các hạt được bắn ra do áp lực từ buồng nén khí của súng bắn gien. • Các hạt lớn bị giữ lại ở màng ngăn (stopping plate), nhưng các hạt nhỏ tiếp tục di chuyển và đi vào các TB TV phía dưới. • Kết quả là ADN cần chuyển sẽ được đưa vào TB TV. Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Mô hình vận hành của súng bắn gien Súng bắn gien được sử dụng thành công trên bắp. lúa. lúa mì, lúa mạch và nhiều loại hoa màu khác. Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Súng bắn gien sử dụng khí Helium (Helios Gene Gun) Sử dụng áp lực tạo ra do khí Helium để đưa các hạt vàng được bọc xung quanh bởi DN A hoặc ARN từ vách trong của ngăn nhựa bên trong úng đi thẳng đến TB TV. http://www.bio-rad.com VK Agrobacterium tumefaciens chuyển 1 phần ADN của chúng vào TB TV. Hiejn tượng này được ghi nhận trên nhiều loại cây kiểng, cây ăn trái tạo ra khối u trên cây. Source: Ohio State Univ. Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer bacterial chromosome T-DN A border region Ti plasmid T-DN A vir genes Khi bị kích thích bởi hóa chất, gien vir được kích hoạt và điều khiển chuỗi tiến trình chuyển T-DN A (của VK) vào TB TV.. PP chuyển gien sử dụng Agrobacterium T-DN A (mang gien chuyển) Agrobacterium tumefaciens N ST của VK (Ti) plasmid mang gien chuyển Chuyển gien vào TB Gien chuyển TV N ST của TV Source: Monsanto Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Cơ chế chuyển gien bằng Agrobacterium Trong cơ chế chuyển gien bằng Agrobacterium, cần tác động của nhiều gien vir (nằm trên T-DN A): + N hân bản sao T-DN A. + Gắn 1 sản phNm vào bản sao T-DN A như là yếu tố dẫn đường (leader) + Gắn protein dọc theo chiều dài sợi T-DN A tác động bảo vệ + Mở kênh vận chuyển trên màng TB VK để chuyển T-DN A ra khỏi TB VK Cơ chế chuyển gien bằng Agrobacterium + T-DN A đi vào bên trong TB TV qua vết thương, sau đó di chuyển vào nhân và gắn vào bộ gien của TB TV. + Một giả thuyết cho rằng, khi vào được bên trong TB TV, T- DN A sẽ đợi đến khi DN A của TB TV nhân đôi, hoặc sao mã mới gắn vào bộ gien của TB TV. Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Dòng mang chuyển gien (Transgenic “event”) Event = Là những dòng nhận gien chuyển một cách thành công. Các dòng mang chuyển gien sẽ khác nhau ở thành phần gien chuyển nhận được và ở vị trí mà gien gắn vào trên bộ gien của TB nhận. Bắp có 10 N ST, bất cứ N ST nào cũng có thể nhận gien chuyển có thể có nhiều dòng mang chuyển gien khác nhau. Bước 5: N hận diện các TB/mô đã nhận được gien chuyển bằng cách sử dụng môi trường chọn lọc. Cá thể đã nhận Môi trường chọn được gien chuyển lọc (chứa kháng sinh, thuốc trừ cỏ...) Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer Bước 6: Tái tạo lại cây bằng phương pháp nuôi cấy mô (in vitro). Nguồn: USDA Tương lai của KT chuyển gien trên thực vật N hững kỹ thuật mới sẽ được ngày càn hoàn thiện để nâng cao hiệu quả chuyển gien và khắc phục các ảnh hưởng có thể có đối với sức khỏe và môi trường, cụ thể là: • Định hướng chính xác vị trí gắn của gien chuyển • Sử dụng các marker chọn lọc mới tay cho các gien kháng với kháng sinh đang được sử dụng phổ biến hiện nay • Kiểm soát tốt hơn biểu hiện của gien chuyển trong cơ thể nhận (định hướng được thời gian và vị trí biểu hiện của gien chuyển) • Có tể chuyển gien vào lục lạp (chloroplasts) thay vì chuyển gien vào trong nhân Producing Transgenic Plants