Valued Gateway Customer
Kỹ thuật chuyển gien trên thục vật
Cây trồng chuyển gien (GMO)
Producing Transgenic Plants
Hiện nay, diện tích GMO trên thế giới khoảng 215 triệu acres
Valued Gateway Customer
Gien là 1 đoạn ADN mã hóa 1 loại protein chuyen biệt (cid:1) biểu hiện 1 tính trạng.
mRNA
protein
trait
translation
expression
transcription
Cây trồng chuyển gien là gì ?
• Thuật ngữ ‘chuyển gien’ (Transgenic) dùng để chỉ việc đưa gien vào 1 đối tượng SV nào đó bằng KT ADN tai tổ hợp. Gien được chuyển từ các loài khác hay trong cùng 1 loài.
• Từ đồng nghĩa (Synonym):
Genetically modified organism (GMO)
Producing Transgenic Plants
Genetically engineered organism (GEO)
Valued Gateway Customer
Những cây trồng nào được phát triển từ các loài này ?
Những cây trồng nào được phát triển từ các loài này ?
cải salade (lettuce)
Bắp (corn)
Cà rốt (carrot)
Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer
Sinapis
Cabbage
Producing Transgenic Plants
Teosinte Bắp (maize)
Valued Gateway Customer
Từloài hoang dại trở thành loài trồng
Thuần hóa
(Domestication)
• Mất khả năng phát tán hạt tự nhiên (rụng, lông, gai...) • Nảy mầm nhanh • Hạt lớn • Chín đồng loạt • Mất khả nang tự baro vệ trong môi trường tự nhiên • Màu sắc thay đổi • Không còn chất độc hoặc vị đắng
Source: Damania, 2008
Quá trình chọn giống gồm 2 bước cơ bản
• Thu thập từ nơi hoang dại hay ruộng nông dân • Lai tạo (lai giữa 2 hay nhiều cây) • Gây đột biến, hoặc đa bội
I. Tạo ra (hoặc nhận diện) các dạng biến dị.
II. Chọn lựa các tính trạng mong muốn.
Producing Transgenic Plants
Các đặc tính đầu tiên được nhà chọn giống quan tâm trong quá trình thuần hóa là: hạt to, không bị ngủ đông, và không bị rụng hạt.
Valued Gateway Customer
Công tác lai tạo có thể thực hiện từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau
• Các giống ưu việt • Giống địa phương (primitive cultivars) • Giống hoang dại của cùng loài
Nguồn gien sơ cấp (trong cùng loài)
• Giống trồng, giống địa phương, hoặc cây hoang dại của các
Nguồn gien thứ cấp (khác loài)
loài khác (species) hoặc giống khác (genera)
(cid:2) lai xa
Lai xa và xử lý đột biến không được sử dụng phổ biến
• Cây ngũ cốc triticale là sản phNm lai xa giữa lúa mì (Triticum) và
• TAM107, giống lúa mì có chứa 1 cánh N ST của lúa mạch đen, à giống chống chịu stress được trồng phổ biến ở Colorado (Mỹ).
• Giống lúa mì ‘Clearfield’, mang gien kháng thuốc trừ cỏ, được tạo
lúa mạch đen (Secale).
Producing Transgenic Plants
ra do xử lý đột biến, sắp được đưa ra thị trường.
Valued Gateway Customer
KT chuyển gien có phải là bước mở rộng của PP chọn giống truyền thống hay là sự phát triển nhảy vọt hoàn toàn mới ?
• KT chuyển gien cho phép khai thác các biến dị di truyền trong thế giới SV, thay vì chỉ giưới hạn trong cùng loài hay cùng giống trong hệ thống phân loại.
• Gien được chuyển với mức độ chính xác rất cao so với các PP
• N hưng 2 bước cơ bản của qui trình chọn giống vẫn phải đảm bảo:
trước đây.
tạo biến dị và chọn lựa tính trạng mong muốn.
Qui trình tạo cây chuyển gien
• Phân lập và nhân dòng (cloning) gien cần chuyển • Gắn thêm vào gien các đoạn khởi động và điều hòa hoạt động
• Gắm thêm marker chọn lọc (selectable marker) • Đưa cấu trúc được thiết kế (cassette) và TB của cây (chuyển
của gien
• Chọn lọc các Tb hay mô mang gien chuyển • Tái tạo lại Regenerate whole plants
Producing Transgenic Plants
gien - transformation)
Valued Gateway Customer
Bước 1:
Xác định và nhân dòng (cloning) gien cần chuyển • Đây là bước đàu tiên, và cũng là giới hạn của thành tự về chuyển
• Các phòng thí nghiệm quốc gia cũng như tư nhân đang tập trung rất nhiều công sức vào việc xác định , định vị, kháo sát tính chất và nhân dòng những gien kiểm soát các tính trạng nông học quan trọng (chiều cao, trổ hoa, số trái, số hạt, năng suất...).
gien.
Arabidopsis thaliana
• Việc giải mã trình tự bô gien hoàn tất vào tháng 12/2000: bộ gien chứa khoảng ~120 Mb (ADN ), và có khoảng 25.000 gien. • ‘Dự đoán’ chức năng của gien được thực
hiện cho khoảng 70% các gien.
• N hững vùng lặp chiếm khoảng 58% bộ gien, dường như do sự nhân đôi của toàn bộ gien xảy ra vào khoảng 100 triệu năm về trước.
Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer
Thông tin có được từ nghiên cứu trên Arabidopsis
• Có nhiều loại gien huộc nhom Protein-kinase hơn dự đoán. Điều này co thấy tầm quan trọng trong cơ chế truyền phát tín hiệu trong TB. • N hũng gien kiểm soát các hoạt động cơ bản của TB được bảo tồn trong quá trình tiến hóa (có tỉ lệ giống nhau cao giữa người và Arabidopsis). N gược lại, các gien kiểm soát sự trao đổi thông tin của TB thì rất thay đổi, bao gồm:
♦ Các gien kiểm soát các chức năng cơ bản của TB tồn tại ừ thời tổ tiên.
♦ N hưng khi đến giai đoạn đa bào thì tiến hóa theo hướng khác nhau giữa ĐV và TV.
Các dạng đột biến trên Arabidopsis được tạo ra bằng KT chuyển gien (Đột biến “knock-out”) cho phép phát hiện chức năng của các gien.
Producing Transgenic Plants
t biếến liên quan n liên quan đếđến n (C(Cáác đc độột bi o hoa) ccấấu tu tạạo hoa)
Valued Gateway Customer
Mục tiêu tương lai trong nghiên cứu bộ gien TV
• Xác định chức năng của tất cả các gien trên Arabidopsis (2010) • Giải mã trình tự bộ gien của cây lúa (bộ gien nhỏ nhất trong nhóm ngũ
cốc).
• Giải mã trình tự của cây cỏ 3 lá (Medicago truncatula) (đại diện cho
nhóm cây họ đậu).
• Giải mã trình tự nhũng vùng mang nhiều gien (gene-rich regions) của
nhóm cây ngũ cốc với bộ gien lớn, VD: bắp, lúa mì...
Gien Bt
• Bào tử của csc VK đất Bacillus thuringiensis (Bt) có chứa các tinh thể (crystalline - Cry) protein. Tromg hệ thống tiêu hóa của côn trùng, các tinh thể này bị phá vở và giải phóng ra các độc tố để liên kết và làm thủng đường ruột của côn trùng.
• 1 đoạn của gien Cry được sử dụng trong chuyển gien để tạo ra các
Bước 2:
giống cây trồng Bt.
Đoạn không cần thiết cho độc tính
Producing Transgenic Plants
Đoạn mã hóa cho độc tố
Valued Gateway Customer
gắn thêm các đoạn ADN để kiểm soát biểu hiện của gien
Bước 2:
• Promoter = điểm bắt đầu của quá trình sao mã; có tính
Terminator Promoter Bt coding sequence
• Termination sequence = điểm kế thúc của quá trình sao mã.
chuyên biệt cho thời điểm, vị trí mô, mức độ biểu hiện của giean.
• Thường được sử dụng là CaMV 35S promoter của víu gây bệnh
Transgene promoters
• Các Promoter có tính chuyên biệt hơn đang được nghiên cứu: đặc
khảm trên cây bông cải. Đây là promoter mạnh và biểu hiện ở mọi nơi, mọi lúc (constitutive promoter) ở TV.
trưng cho cơ quan, giai đoạn phát triển của TV hay trong các đ/kiện đặc biệt khác.
• Thường được sử dụng nhất là nopaline synthase (nos) transcription
Transgene Terminator
Producing Transgenic Plants
terminator của VK Agrobacterium tumefaciens.
Valued Gateway Customer
Gắn thêm các marker chọn lọc (Selectable markers
• Bởi vì hiệu quả chuyển gien rất thấp (từ 1 - 5% TB nhận được gien chuyển), do đó cần phải có PP để nhận diện các TB đã nhận được gien chuyển để tiếp tục.
• Hiện nay, các gien kháng vói kháng sinh (antibiotic) hoặc với thuốc trừ cỏ thường được sử dung làm marker nhận diện.
Bước 3:
Thiết kế gien Bt (cassete) cho chuyển gien
Antibiotic or herbicide resistance gene Bt gene
Producing Transgenic Plants
Promoter Termination sequence
Valued Gateway Customer
Bước 4:
Chuyển thiết kế gien vào TB TV (chuyển gien - Transformation)
• Súng bắn gien (Gene gun = biolistics, microprojectile
• Chuyển gien bằng VK Agrobacterium
bombardment)
Các loại mô TV được sử dụng trong chuyển gien
Việc chọn lựa các mô TV để chuyển gien tùy thuộc vào từng loại cây trồng, thường là các phôi chưa trưởng thành (immature embryos), dĩa lá (leaf disks) và mô phân sinh ngọn (apical meristems).
Các mô được chọn phải có khả năng tạo callus (undifferentiated tissue), từ đó tái tạo lại cây.
Producing Transgenic Plants
Trên Arabidopsis, PP chuyển gien có thể thực hiện đơn giản bằng cách phun ddịch có chứ gien cần chuyển + vector lên trên các chồi..
Valued Gateway Customer
PP sử dụng súng bắn gien (“Gene gun” method)
DN A
pellets
TB TV
Gien cần chuyển
N ST của TV
Source: Monsanto
PP sử dụng súng bắn gien (“Gene gun” method)
Đây là PP vật lý:
• Các hạt kim loại (vàng hoặc titan) rất nhỏ có ADN bám xung quanh, nằm trong ddịch huyền phù, được sử dụng thành giọt nhỏ trong súng bắn gien.
• Các hạt được bắn ra do áp lực từ buồng nén khí của súng bắn gien.
• Các hạt lớn bị giữ lại ở màng ngăn (stopping plate), nhưng các hạt nhỏ tiếp tục di chuyển và đi vào các TB TV phía dưới.
Producing Transgenic Plants
• Kết quả là ADN cần chuyển sẽ được đưa vào TB TV.
Valued Gateway Customer
n gien Mô hMô hìình vnh vậận hn hàành cnh củủa sa súúng bng bắắn gien
Producing Transgenic Plants
Súng bắn gien được sử dụng thành công trên bắp. lúa. lúa mì, lúa mạch và nhiều loại hoa màu khác.
Valued Gateway Customer
Súng bắn gien sử dụng khí Helium (Helios Gene Gun)
http://www.bio-rad.com
VK Agrobacterium tumefaciens chuyển 1 phần ADN của chúng vào TB TV. Hiejn tượng này được ghi nhận trên nhiều loại cây kiểng, cây ăn trái (cid:1)tạo ra khối u trên cây.
Sử dụng áp lực tạo ra do khí Helium để đưa các hạt vàng được bọc xung quanh bởi DN A hoặc ARN từ vách trong của ngăn nhựa bên trong úng đi thẳng đến TB TV.
Producing Transgenic Plants
Source: Ohio State Univ.
Valued Gateway Customer
T-DN A border region
bacterial chromosome
Ti plasmid
T-DN A
vir genes
Khi bị kích thích bởi hóa chất, gien vir được kích hoạt và điều khiển chuỗi tiến trình chuyển T-DN A (của VK) vào TB TV..
PP chuyển gien sử dụng Agrobacterium
T-DN A (mang gien chuyển)
Agrobacterium tumefaciens
(Ti) plasmid mang gien chuyển
N ST của VK
Gien chuyển
Chuyển gien vào TB TV
N ST của TV
Producing Transgenic Plants
Source: Monsanto
Valued Gateway Customer
Cơ chế chuyển gien bằng Agrobacterium
Trong cơ chế chuyển gien bằng Agrobacterium, cần tác động của nhiều gien vir (nằm trên T-DN A):
+ N hân bản sao T-DN A.
+ Gắn 1 sản phNm vào bản sao T-DN A như là yếu tố dẫn đường (leader)
+ Gắn protein dọc theo chiều dài sợi T-DN A (cid:1) tác động bảo vệ
+ Mở kênh vận chuyển trên màng TB VK để chuyển T-DN A ra khỏi TB VK
Cơ chế chuyển gien bằng Agrobacterium
+ T-DN A đi vào bên trong TB TV qua vết thương, sau đó di chuyển vào nhân và gắn vào bộ gien của TB TV.
Producing Transgenic Plants
+ Một giả thuyết cho rằng, khi vào được bên trong TB TV, T- DN A sẽ đợi đến khi DN A của TB TV nhân đôi, hoặc sao mã mới gắn vào bộ gien của TB TV.
Valued Gateway Customer
Dòng mang chuyển gien (Transgenic “event”)
Event = Là những dòng nhận gien chuyển một cách thành công.
Các dòng mang chuyển gien sẽ khác nhau ở thành phần gien chuyển nhận được và ở vị trí mà gien gắn vào trên bộ gien của TB nhận.
Bắp có 10 N ST, bất cứ N ST nào cũng có thể nhận gien chuyển (cid:1) có thể có nhiều dòng mang chuyển gien khác nhau.
Bước 5:
N hận diện các TB/mô đã nhận được gien chuyển bằng cách sử dụng môi trường chọn lọc.
Cá thể đã nhận được gien chuyển
Môi trường chọn lọc (chứa kháng sinh, thuốc trừ cỏ...)
Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer
Tái tạo lại cây bằng phương pháp nuôi cấy mô (in vitro).
Bước 6:
Tương lai của KT chuyển gien trên thực vật
Nguồn: USDA
• Định hướng chính xác vị trí gắn của gien chuyển • Sử dụng các marker chọn lọc mới tay cho các gien kháng với
N hững kỹ thuật mới sẽ được ngày càn hoàn thiện để nâng cao hiệu quả chuyển gien và khắc phục các ảnh hưởng có thể có đối với sức khỏe và môi trường, cụ thể là:
• Kiểm soát tốt hơn biểu hiện của gien chuyển trong cơ thể nhận (định hướng được thời gian và vị trí biểu hiện của gien chuyển)
• Có tể chuyển gien vào lục lạp (chloroplasts) thay vì chuyển
kháng sinh đang được sử dụng phổ biến hiện nay
Producing Transgenic Plants
gien vào trong nhân
Valued Gateway Customer
Bước 7:
Đánh giá biểu hiện của cây chuyển gien
• Kiểm tra sự hiện diện của gien chuyển và hoạt động của
• Khảo sát ảnh hưởng của gien chuyển trên sự sinh trưởng
chúng
• Khảo sát ảnh hưởng của gien chuyển đến môi trường
• Khảo sát tính an toàn của gien chuyern khi được sử dụng
phát triển của cây nhận
làm thứ ăn cho người hay gia súc
Kiểm tra sự hiện diện và hoạt động của gien chuyển trên cây nhận (cây chuyển gien)
• KT lai Southern (Southern blot) (cid:1) xác đinh xem gien chuyển
có nằm trên bộ gien của cây nhận ?
• KT lai N orthern (N orthern blot) (cid:1) xác định xem gien chuyển
co sao mã thành ARN m trong cây nhận ?
• KT lai Western (Western blot) (cid:1) xác định xem protein có
được tổng hợp từ gien chuyển, bên trong cây nhận ?
• Cây nhận có biểu hiện ra tính trạng mong muốn hay không ?
Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer
Sử dụng PP hồi giao (Backcross) để đưa gien chuyển từ các cây chuyển gien vào các giống ưu tú đang phổ biến trong SX
• Đối với hầu hết các loài TV, chỉ có 1 vài dòng/giống cho hiệu quả chuyển gien cao, tuy nhiên các dòng/giống này thường mang các đặc tính nông học và chất lượng không cao.
• Vì vậy, sau khi tạo được các cây chuyển gien đầu tiên, cần sử dụng PP hồi giao nhiều lần để đưa gien chuyển từ các cây chuyển gien vào các giống ưu tú đang được sử dụng phổ biến trong SX.
Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer
Các ứng dụng trên thực vật đang được áp dụng KT chuyển gien
• Kháng thuốc trừ cỏ
• Kháng côn trùng
• Gia tăng năng suất và phNm chất
• Thực phNm chức năng
• Sử dụng cây trồng như ‘lò P/ứ sinh học’ (bioreactors)
• N ăng lượng sinh học (Biofuels)
• Gia tăng chất lượng gỗ
Producing Transgenic Plants
• Liệu pháp sinh học dùng trong y học (Bioremediation)
Valued Gateway Customer
Hết seminar 3
Producing Transgenic Plants
