Lai ADN – Phần 3
Lai trong môi trường dịch thể:
Phản ứng lai trong môi trường dịch thể xảy ra nhanh hơn nhiều so với môi
trường có chất mang pha rắn (soild). Do cả phân tử ADN đích và mẫu dò đều có
thể di động tự do trong môi trường do đó phản ứng đạt kết quả cao nhất. Nói
chung với phép lai thực hiện trong dịch thể thì thời gian kết thúc nhanh hơn từ 5-
10 lần so với trong điều kiện là chất mang (Bryan, et al., 1986). Tuy nhiên, cũng
có thể bổ sung thêm chất mang làm tăng phản ứng lai. Cần thêm bước cuối cùng là
tách phức hợp mẫu dò-sợi ADN đích. Hạn chế ở đây là mẫu trong dịch cho nên có
thể tạo lên các nền kém đặc hiệu, do vậy cần các giải pháp làm hạn chế mức độ
nhiễu của nền cho thích hợp.
Hình 1.5. Minh hoạ kỹ thuật lai trong môi trường dịch thể.
Trên thực tế hầu hết các KIT thương phẩm dùng cho vi sinh vật đều tiến
hành trong môi trường dịch thể. Vi sinh vật trong mẫu đầu tiên được phân giải
trong điều kiện thích hợp để ADN đích lai với mẫu dò. Sau đó là bước lai và tách
phức hệ mẫu dò và ADN đích dựa vào các thông số của phép lai theo kiểu kẹp díp
cụ thể. Các phép lai theo kiểu kẹp díp (hình 1.9) cần có hai đoạn ADN có trình tự
khác nhau; một đoạn để bám giữ ADN đích gắn vào chất mang và một đoạn là
mẫu dò. Điều quan trọng là hai đoạn ADN này phải có trình tự khác nhau cho dù
chúng đều gắn với hai vùng khác nhau trên đoạn ADN đích theo nguyên tắc bổ
sung. Mẫu dò đánh dấu được bổ sung vào trong dung dịch có các đoạn ADN đích
nghiên cứu. Như vậy theo hình vẽ phức hợp ADN mẫu dò đánh dấu để phát hiện
gắn với ADN đích và phức hợp mẫu dò- ADN đích gắn vào chất mang đã được
hình thành. Phức hợp này được tách ra khỏi dung dịch và khi có mặt cơ chất thích
hợp để phát hiện được mẫu dò đánh dấu. Khi dùng hệ thống phát hiện dựa vào các
hoá chất huỳnh quang hay tạo màu có thể dùng thiết bị phát hiện kết quả một cách
tự động.
+ Kỹ thuật lai dựa vào màng:
Tác giả đầu tiên giới thiệu kỹ thuật cố định ADN trên màng là Nygaard và
Hall (1963, 1964). Sau đó chính Southern (1975) là người mô tả việc tách ADN
khỏi gel sau khi điện di và chuyển chúng lên màng nitrocellulose. Các đoạn ADN
đích được phát hiện bằng kỹ thuật lai và đây là bước tiến quan trọng của sinh học
phân tử. Từ năm 1977 đến nay đã có nhiều cải tiến về phép lai cũng như bước
chuyển ADN lên màng của các tác giả khác nhau như: Meinkoth và Wahl (1984).
Người ta cũng đã sử dụng một số màng nynol, màng nitrocellulose hoạt hoá hay
có độ bền cho các phép lai. Đối với công việc định loại vi sinh vật với kỹ thuật cố
định trên màng cho phép lai ADN thì cần chấm mẫu (là ADN sạch, hay tế bào vi
sinh vật hoặc sinh phẩm có vi sinh vật nghiên cứu) lên màng thích hợp. Mẫu được
ly giải và ADN bị biến tính, sau đó ADN được cố định trên màng khi đưa vào tủ
xấy tại 80oC trong 2 giờ hoặc đưa vào xử lý với tia UV trong trường hợp sử dụng
màng lynon. Mẫu dò đánh dấu sau đó được đưa vào dung dịch. Bước tiền lai được
thực hiện để hạn chế các mẫu bám vào nhau không đặc hiệu. Sau đó là bước lai,
màng sau khi lai được rửa để loại các mẫu dò còn dư. Bước rửa tiếp theo để đánh
giá mức độ bám đặc hiệu của phép lai. Sau đó các mẫu dò đánh dấu lai với vị trí
ADN mẫu trên màng được phát hiện bằng các hệ thống phát hiện tương thích.
Toàn bộ quá trình lai trên màng đã được Meinkoth và Wahl (1984) mô tả chi tiết.
Khi phát hiện typ vi sinh vật, chúng ta phải sử dụng kỹ thuật Southern.
Trong phương pháp này ADN của nhiễm sắc thể được tinh sạch và được xử lý với
enzym cắt hạn chế thích hợp, sau đó mẫu lại được điện di trên gel agarose và tạo
ra dấu vân (finger print) của nhiễm sắc thể. Sau khi điện di gel được đặt dưới
màng nitrocellulose hay màng nylon nằm giữa một số lớp giấy. Lớp giấy lọc phía
trên được đặt trên cùng phần gel và màng kẹp giữa giấy lọc như trong hình 1.6.
Hình 1.6. Mô tả phương pháp chuyển ADN lên màng cho kỹ thuật Southern Blot.
Kết quả là đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên trên. Điều đó
giúp cho việc chuyển các mảnh ADN từ gel lên màng và bám chặt vào màng với
kích thước và phiên bản đúng như trên gel sau khi điện di (mô tả chi tiết theo
Sambrook 1989).
Phương pháp truyền thống này cũng được cải tiến khi dùng màng nylon để
chuyển ADN trong điều kiện biến tính (Read và Mann 1985). Thời gian chuyển có
thể vài giờ hoặc qua đêm. Việc cố định ADN trên màng được thực hiện sau đó
bằng cách xử lý nhiệt hay tia UV như đã trình bày ở trên. Tuy nhiên, nhiều
phương pháp cải tiến được thực hiện nhanh như chuyển bằng điện di (Bittner,
Kupfere, Morris, 1980) hay sử dụng bơm chân không (Medveczky, 1987;
Olszewsk, 1988).
Trong nhiều trường hợp dùng điện để chuyển ADN từ gel agarose lên màng
thì trước tiên gel phải được xử lý biến tính và được làm trung hoà trở lại. Gel được
đặt giữa hai bản điện có các bản giấy thấm (hình 1.7).