CH NG HAIƯƠ
K THU T RFLPỸ Ậ
(Restriction Fragment Length Polymorphisms)
I. Gi i thi u ớ ệ
K thu t RFLP là k thu t nghiên c u tính đa hình chi u dài c a các phân đo nỹ ậ ỹ ậ ứ ề ủ ạ
DNA d a trên đi m c t các enzim gi i h n (Restriction Enzyme, RE). Khi ự ể ắ ớ ạ ủ
DNA v i enzim gi i h n dung d ch đm thích h p pH, nhi t đ thích h pớ ớ ạ ở ị ệ ợ ở ệ ộ ợ
s s t o ra nh ng phân đo n DNA v i kích th c khác nhau, tẽ ẽ ạ ữ ạ ớ ướ đó l p nênừ ậ
các b n đ gen. K thu t này đc s d ng ph bi n t th p niên 80 đn nay.ả ồ ỹ ậ ượ ử ụ ổ ế ừ ậ ế
II. Nguyên t c chungắ
Nguyên t c c a k thu t này d a trên đ đc hi u c a các enzim c t gi i h nắ ủ ỹ ậ ự ộ ặ ệ ủ ắ ớ ạ
(restriction enzim-RE) đi v i v trí nh n bi t c a chúng trên DNA b gen. Số ớ ị ậ ế ủ ộ ự
khác bi t v trí c t gi a hai cá th s t o ra nh ng phân đo n c t khác nhau.ệ ị ắ ữ ể ẽ ạ ữ ạ ắ
III. Các enzim gi i h n (RE)ớ ạ
1. Gi i thi uớ ệ
Enzim gi i h n đc ớ ạ ượ Werner Arber tìm th y vi khu n vào năm 1962.ấ ở ẩ
Ông cho r ng các RE có kh năng r t đc bi t đó là kh năng nh n bi t DNAằ ả ấ ặ ệ ả ậ ế
ch và DNA l . Enzim này h n ch s nhân lên c a DNA l khi chúng xâmủ ạ ạ ế ự ủ ạ
nh p vào t bào vi khu n b ng cách c t chúng ra thành t ng đo n m t cách đcậ ế ẩ ằ ắ ừ ạ ộ ặ
hi u, vì th ông g i là restriction có nghĩa là h n ch . V i phát minh này ôngệ ế ọ ạ ế ớ
cùng các c ng s (ộ ự Daniel Nathans và Hamilton O. Smith) đã giành gi i th ngả ưở
Nobel vào năm 1978.
Các RE h p thành h th ng b o v t bào s h ch (procaryote), m tợ ệ ố ả ệ ở ế ơ ạ ộ
câu h i đt ra là vì sao các RE ch c t DNA c a các phage mà không c t DNAỏ ặ ỉ ắ ủ ắ
c a t bào vi khu n? Câu tr l i là nh Methylase đây là enzim giúp vi khu n cóủ ế ẩ ả ờ ờ ẩ
kh năng này, chính enzim này ch u trách nhi m g n nhóm metyl (CHả ị ệ ắ 3) vào các
nucleotides v trí c t c a các RE trên DNA c a vi khu n vì th b o v DNAở ị ắ ủ ủ ẩ ế ả ệ
c a vi khu n kh i s phân c t c a RE. Tuy v y đôi lúc methylase l i g n nh mủ ẩ ỏ ự ắ ủ ậ ạ ắ ằ
c nhóm metyl vào chính DNA c a phage, đi u này gi i thích vì sao đi v i cácả ủ ề ả ố ớ
dòng vi khu n kháng phage v n có các t bào b phân h y.ẩ ẫ ế ị ủ
Enzim c t gi i h n đu tiên đc phân l p vào năm 1968, cho đn nayắ ớ ạ ầ ượ ậ ế
có kho ng 3.400 RE đc khám phá. Trong s này có kho ng 540 RE đã đcả ượ ố ả ượ
th ng m i hóa. ươ ạ
2. Tên g i c a enzim c t gi i h nọ ủ ắ ớ ạ
Ch đu vi t hoa là ch đu tên vi khu n t đó RE đc ly trích.ữ ầ ế ữ ầ ẩ ừ ượ
Hai ch k không vi t hoa t ng đng v i tên loài c a vi khu n. C 3 chữ ế ế ươ ươ ớ ủ ẩ ả ữ
n y đu vi t in nghiêng. K đn là ch s la mã ch th t RE đc phát hi nầ ề ế ế ế ữ ố ỉ ứ ự ượ ệ
trong tr ng h p nhi u RE đc tìm th y trong cùng m t vi khu n.ườ ợ ề ượ ấ ộ ẩ
Đôi khi còn có thêm ch vi t hoa (vi t th ng) đ ch ch ng vi khu n s d ngữ ế ế ẳ ể ỉ ủ ẩ ử ụ
VD : Escherichia coli Ry13
chi loài ch ngủ
EcoRI: là enzym đu tiên tìm th y trên vi khu n ầ ấ ẩ E. coli
EcoRV: enzym th 5 tìm th y trên vi khu n ứ ấ ẩ E.coli
3. Các lo i enzim c t gi i h nạ ắ ớ ạ
Lo i I:ạ khi enzym nh n bi t trình t nó s di chuy n trên phân t DNA cách đóậ ế ự ẽ ể ử
1000-5000 nu và gi i phóng đ vài ch c nu.ả ộ ụ
Lo i IIạ: enzym nh n bi t trình t và c t ngay v trí đó.ậ ế ự ắ ị
Lo i IIIạ: enzym nh n bi t trình t và c t DNA v trí cách đó 20 nu.ậ ế ự ắ ở ị
III. Quy trình th c hi n RFLP bao g m các b c:ự ệ ồ ướ
+Tách chi t và tinh s ch DNAế ạ
+C t các m u DNA c n phân tích b i REắ ẫ ầ ở
+Phân tách DNA trên gel agarose
+Southern Blotting
Chuy n DNA sang màng nylonể
Ch n đo n dò (probes), đánh d u đo n dòọ ạ ấ ạ
Lai ghép gen (Hybridization)
L p b n đ gen (phân tích đa hình)ậ ả ồ
1. Trích DNA
a. Nguyên t cắ: Thành t bào b phá v b ng bi n pháp c h c và các ch t t yế ị ỡ ằ ệ ơ ọ ấ ẩ
m nh. DNA đc gi i phóng và làm s ch t p ch t Rnase. DNA đc k t t a trongạ ượ ả ạ ạ ấ ượ ế ủ
Ethanol 100% và thu l i nh ly tâm.ạ ờ
b. Quy trình: Th c hi n theo qui trình đc mô t b i Rogers và Bendichự ệ ượ ả ở
(1988) (qui trình CTAB) g m các b c sau: ồ ướ
- L y lá c a đi t ng c n nghiên c u.ấ ủ ố ượ ầ ứ
- Kh trùng b m t lá b ng c n 70%, sau đó dùng kéo và k p (đã đc khử ề ặ ằ ồ ẹ ượ ử
trùng) c t lá thành t ng m nh nh r i cho riêng vào các tuýp (m i m u riêngắ ừ ả ỏ ồ ỗ ẫ
m t tuýp kho ng 0,1g).ộ ả
- Ngâm các tuýp và d ng c nghi n m u vào nit l ng trong 10 phút.ụ ụ ề ẫ ơ ỏ
- Cho m u vào máy nghi n, có t n s 27l n/giây, l p l i kho ng 3 l n.ẫ ề ầ ố ầ ậ ạ ả ầ
- Cho thêm 1.000µl Extraction buffer (10ml EB +7µl -Mercaptoethanol).β
- Cho thêm 50µl SDS 10%.
- trong n c 65Ủ ướ oC trong 30 phút. Sau 5 phút tr m t m u m t l n.ở ặ ẫ ộ ầ
- Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút.
- L y 800µl d ch trong trên cho vào tuýp m i (b ph n c n)ấ ị ở ớ ỏ ầ ặ
- Cho 800µl Isopropanol vào m i ỗtuýp, l c đu.ắ ề
- m u -20Ủ ẫ ở oC trong 2 gi .ờ
- Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, b n c, l y c n.ỏ ướ ấ ặ
- Cho thêm 400µl TE 0,1 vào, thêm 10µl RNase, 20 phút 37ủ ở oC.
- Cho 400µl CTAB vào, 15 phút 65ủ ở oC.
- Cho 800µl Chloroform/Isoamylalcohol, đo nh ả ẹ
(12ml Chloroform: 0,5ml Isoamylalcohol)
- Ly tâm 13.000rpm trong 5 phút.
- L y 700µl ph n trong chuy n sang tuýp m i.ấ ầ ể ớ
- Cho 1,4ml Ethanol 96% làm l nh vào, l c nh , đ 15 phút nhi t đ phòng.ạ ắ ẹ ể ở ệ ộ
- Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, b n c, l y c n.ỏ ướ ấ ặ
- Cho 700µl Ethanol 70% làm l nh vào, l c nh .ạ ắ ẹ
- Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, b n c, l y c n.ỏ ướ ấ ặ
- L p l i l n n a v i Ethanol 70% làm l nh, th m mi ng tuýp trên gi y.ặ ạ ầ ữ ớ ạ ấ ệ ấ
- S y chân không 45ấ ở oC trong 10 phút.
- Cho 200µl TE 0,1 vào, tr m u -20ữ ẫ ở oC.