Vector chuyển gen là NST nhân tạo của nấm men và động vật có vú
Các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC
Do nhu cầu tạo dòng với những trình tự DNA ngày càng lớn, các nhà nghiên
cứu tìm tòi phát triển những vector ngày càng mới. Ngày nay người ta đã tạo
ra YAC cho phép tạo dòng với những đoạn DNA dài 150 - 1.000kb, trung
bình là 350kb. Bằng nghiên cứu cho thấy ở nấm men
(Saccharomyces Cerevisiae), nhiễm sắc thể muốn nhân đôi và phân ly tốt cần
ba trình tự:
- 2 TEL (telomere): Trình tự đầu cuối của NST
- CEN (centrmere - tâm động): Trình tự trung tâm của NST, đảm
bảo sự chia đôi và đi về 2 cực của tế bào
- ARS (autonomously replicating sequence): Trình tự sao chép tự
chủ tương tự như ori ở plasmid
Dựa vào đó người ta đã cấu tạo NST nhân tạo có đủ ba trình tự nói trên với
cấu tạo gồm 2 cánh tay, giữa 2 cánh tay người ta có thể cài đặt một đoạn
DNA cần tạo dòng với kích thước khoảng 150 đến 1.000kb. Trên mỗi cánh
tay gồm các gen đánh dấu di truyền để chọn lọc các tế bào nấm men có chứa
YAC và các chuỗi tận cùng có chức năng telomer đoạn cuối của NST. Một
trong hai cánh tay mang một mảnh DNA hoạt động như một tâm động và một
nguồn tái bản ori. Việc cài DNA lạ vào gen mã hóa chất ức chế tRNA vận
chuyển tyrsine sẽ làm biến đổi màu sắc khuẩn lạc tế bào gốc có mang gen hổ
phách (khuẩn lạc từ trắng sang đỏ) khi có mặt của DNA lạ. Đây là dấu hiệu
về sự hiện diện của YAC tái tổ hợp trong tế bào nấm men.
Các nhiễm sắc thể này được đưa vào tế bào chủ (nấm men), nó được nhân lên
như NST khác ở trong tế bào nấm men và ta có được những gen mong muốn.
Các nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú
- Cấu tạo: Tương tự như YAC và bao gồm:
- Trình tự TEL
- Trình tự CEN
- Trình tự ARS
Nhưng khác với YAC là trình tự TEL và CEN có nguồn gốc từ người. Điều
này cho phép MAC (Mammalian Artificiel Chromosomes) vào tế bào động
vật có vú và giữ được ổn định trong tế bào.
- Mục đích sử dụng:
Chủ yếu sử dụng nghiên cứu cho các tế bào bậc cao mà chúng ta không sử
dụng được với tế bào nấm men. Khi đưa NST vào tế bào chủ, nó cũng tồn tại
được và nhân lên trong tế bào chủ.
Vector chuyển gen là cosmid
Các cosmid là những vector lai nhân tạo từ một plasmid với các trình tự cos
của phage λ (được sử dụng từ năm 1978). Các trình tự cos này điều khiển sự
đóng gói DNA tái tổ hợp vào đầu của phage.
Khi bao gói các vùng cos đều bị cắt, chỉ còn một phần DNA của cosmid được
giới hạn bởi các đầu dính với đoạn cài DNA lạ được bao gói. Trong phản ứng
bao gói in vitro, các protein cần thiết cho sự tạo thành đầu và đuôi phải được
thêm vào để cho các phage có thể tự hợp thành.
Cosmid là những plasmid có các vùng giới hạn mà tại đây, người ta có thể cài
lắp DNA lạ và một gen chống chịu ampicilline. Kích thước cosmid ≈ 5kb do
đó, nó có thể nhận được đoạn cài 35÷45kb và có thể tới 47kb (như chúng ta
đã thấy ở Mục 5.5.2.2, đầu của phage λ có thể bao gói được 52kb).
Vào thời điểm gây nhiễm E. Coli, DNA tái tổ hợp được phóng vào vi khuẩn.
Trong vi khuẩn các đầu dính sẽ bắt cặp tạo ra cosmid tái tổ hợp khép kín
dạng vòng và tái bản như một plasmid.
Ưu điểm và ứng dụng của cosmid:
Cũng như phage, cosmid cho khả năng xâm nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhận
đoạn cài có kích thước lớn.
Cấu tạo cosmid
Trong tế bào chủ, nó tự nhân bản như plasmid. Cho nên người ta nhận được
những khuẩn lạc, chứ không phải đĩa phân giải trên mặt thạch, thuận lợi cho
việc quan sát.
Với những tiện lợi trên, người ta dùng cosmid để tách dòng từ những gen lớn
để tạo ngân hàng genom (bộ gen). Những vi khuẩn mang vector này có khả
năng chống chịu với môi trường có ampiciline.
