Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây ngải tiên ( Hedychium coronarium Koenig)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----------

NGUYỄN THỊ MAI PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG CÂY NGẢI TIÊN HEDYCHIUM CORONARIUM KOENIG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI, 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Mai Phƣơng

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG CÂY NGẢI TIÊN HEDYCHIUM CORONARIUM KOENIG

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Văn Ngọc Hƣớng Chân thành cảm ơn sự tài trợ của đề tài CNHD – ĐT – 018/10 – 11 Thuộc chương trình trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược Hà Nội, 2011 MỤC LỤC

MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................... 2

1.1. Khái quát về chi Hedychium ................................................................................. 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật học ..................................................................................... 2

1.1.2. Thành phần hóa học của chi Hedychium ........................................................ 4

1.1.3. Hoạt chất sinh học trong thân rễ các loài của chi Hedychium ....................... 7

1.1.4. Ứng dụng của các loài thuộc chi Hedychium ................................................. 9

1.2. Tổng quan về cây ngải tiên .................................................................................. 10

1.2.1. Xuất xứ........................................................................................................... 10

1.2.2. Một số đặc điểm thực vật .............................................................................. 11

1.2.3. Thành phần hóa học của cây ngải tiên ( Hedychium coronarium Koenig) .. 13

1. 2.3.1.Tecpenoid và tinh dầu ngải tiên ............................................................. 13

1. 2.3.2. Sesquiterpenoid và diterpenoid ............................................................. 17

1.2.3.3. Các hợp chất C6 – C3 ............................................................................. 26

1.2.3.4. Các hợp chất C6 – C3 – C6 ..................................................................... 27

1.2.3.5. Các hợp chất Steroids ............................................................................ 28

1. 2.4. Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây ngải tiên .............................. 29

1.2.4.1. Hoạt tính sinh học và tác dụng của tinh dầu ........................................ 29

1.2.4.2. Hoạt tính sinh học của các chất được chiết từ thân rễ .......................... 30

1. 2.5. Tình hình nghiên cứu về cây Hedychium coronarium tại Việt Nam ............ 33

1.2.6. Ứng dụng của cây ngải tiên Hedychium coronarium Koenig. ..................... 35

CHƢƠNG 2: ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ..... 37

2.1. Đề tài, mục tiêu và nhiệm vụ ............................................................................... 37

2.1.1. Tên đề tài ....................................................................................................... 37

2.1.2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 37

2.1.3. Nhiệm vụ của đề tài ....................................................................................... 37

2.2. Các phương tiện nghiên cứu ................................................................................ 38

2.2.1. Thiết bị nghiên cứu ........................................................................................ 38

2.2.2. Dụng cụ ......................................................................................................... 38

2.2.3. Các hóa chất .................................................................................................. 39

2.3. THỰC NGHIỆM ................................................................................................. 39

2.3.1. Mẫu thực vật và phương pháp xử lí: ............................................................. 39

2.3.3. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên....................41

2.3.2. Điều chế tinh dầu thân rễ ngải tiên. .............................................................. 40

2.3.4. Chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong củ ngải tiên ........................ 41

2.3.5. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity) ............. 42

2.3.6. Khảo sát các cặn chiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) ................................ 42

2.3.7. Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của các chất trong các cặn chiết .... 43

2.3.8. Các hằng số vật lí và các số liệu phổ của các chất thu được………………..45

2.3.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được: ........... 46

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................... 47

3.1. Đối tượng và đề tài nghiên cứu............................................................................ 48

3.2. Nghiên cứu tinh dầu của thân rễ cây ngải tiên..................................................... 48

3.2.1. Điều chế tinh dầu .......................................................................................... 48

3.2.2. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên ........ 49

3.3. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong củ cây Ngải tiên

(Hedychium coronarium Koenig). .............................................................................. 51

3.3.1. Chiết chọn lọc các chất có hoạt tính sinh học trong củ ngải tiên…............51

3.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu và cặn chiết của

củ ngải tiên .............................................................................................................. 52

3.3.3. Phân lập các hợp chất trong cặn chiết H và E của thân rễ ngải tiên. .......... 53

3.3.3.1. Khảo sát các cặn chiết H và E bằng SKLM. .......................................... 53

3.3.3.2. Phân lập các chất tinh khiết trong các cặn chiết E và H ....................... 55

3.3.4. Xác định cấu trúc phân tử của các chất phân lập được................................ 56

3.3.4.1. Xác định cấu tạo phân tử của hợp chất P7 ............................................ 56

3.3.4.2. Xác định cấu trúc phân tử của hợp chất P5 .......................................... 58

3.3.4.3. Xác định cấu trúc phân tử H6 ................................................................ 61

3.3.5. Khảo sát hoạt tính chống ung thư của các chất phân lập được từ thân rễ

ngải tiên. .................................................................................................................. 63

KẾT LUẬN ................................................................................................................... 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 67

LỜI MỞ ĐẦU

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên hệ thực vật vô cùng đa

dạng và phong phú đặc biệt là cây có tinh dầu và cây làm thuốc.

Theo thống kê bước đầu, nước ta có hơn 600 loài cây có tinh dầu, nhưng phần lớn chưa

được nghiên cứu đầy đủ, hệ thống và triệt để. Hệ thực vật phong phú và đa dạng của

mỗi vùng, mỗi quốc gia được xem là một trong những nguồn tài nguyên quí giá, có

quan hệ trực tiếp tới đời sống con người.

Hóa học các hợp chất thiên nhiên với vai trò nghiên cứu thành phần hóa học và

tìm hiểu hoạt tính sinh học của cây thuốc mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Việc

nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây thuốc dân tộc là vấn đề không

những hấp dẫn về khoa học mà còn đóng góp cho việc sử dụng cây thuốc có hiệu quả

hơn, chính xác hơn.

Góp phần phong phú cho hệ thực vật Việt Nam, lại rất gần gũi với đời sống

nhân dân phải kể đến họ gừng (Zingiberaceae). Nhu cầu sử dụng các sản phẩm từ các

cây họ gừng làm thuốc và hương liệu trên thế giới và trong nước ngày càng tăng. Các

nghiên cứu về các cây họ gừng đến nay là rất nhiều nhưng nó luôn là điều hấp dẫn với

các nhà nghiên cứu. Trong họ gừng có một chi mà ở Việt Nam chưa được nghiên cứu

rộng rãi đó là chi ngải Hedychium. Trong khi đó thế giới với rất nhiều các nghiên cứu

báo cáo rằng đây là một chi rất hấp dẫn bởi hương thơm của hoa và những hợp chất có

hoạt tính sinh học thú vị thuộc dãy các  - lacton diterpen ,  không no. Đây là những

hợp chất có hoạt tính chống ung thư, chống viêm rất mạnh đang được các nhà khoa học

thế giới quan tâm một cách đặc biệt. Với định hướng như vậy chúng tôi đã chọn đề tài:

“ Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây ngải tiên ( Hedychium

coronarium Koenig) ‖

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Khái quát về chi Hedychium

1.1.1 Đặc điểm thực vật học

Hedychium (chi ngải) là một chi thuộc họ gừng (Zingiberaceae) gồm những cây

lâu năm phổ biến với chiều cao khi phát triển khoảng 120 – 180 cm. Chi này thường

được gọi với cái tên là chi của những cây hoa loa kèn gừng và chi của các loại cây thân

thảo, thân rễ mập và phân nhánh. Chi này có nguồn gốc từ những vùng đất nhiệt đới ở

Châu Á và dãy Himalaya. Các loài của chi này thường có hoa rất đẹp, rực rỡ và hấp

dẫn bởi mùi hương. Tại Nam Á, chi Hedychium đã có hơn 80 loài. Các nghiên cứu gần

đây báo cáo có 41 loài ở Ấn Độ, trong đó có 17 loài đặc hữu của Ấn Độ [29].

Ba loài mới của chi Hedychium từ Thái Lan mới được nhận dạng và phân lập

năm 1995 là H. samuiense, H. tomentosum và H. biflorum.[30]

Theo cuốn ―Cây cỏ Việt Nam‖ của Phạm Hoàng Hộ thì ở Việt Nam chi

Hedychium có 12 loài, phân bố ở hầu hết các tỉnh từ Bắc chí Nam [4]

1) Hedychium coronarium Koen. Thường gọi là ngải tiên.

Địa thực vật: Dạng giống gừng, lá thơm, phiến to, không lông, mép cao 2-3 cm.

Phát hoa ở chót thân, có nhiều lá hoa xanh, hoa trắng rất thơm. Đài là ống dài; vành có

3 tai hẹp, dài ; tiểu nhụy lép dạng cánh hoa to; 1 tiểu nhụy thụ; môi to, 2 thùy. Nang

cao 2,5 cm; mảnh vàng; hột đỏ. Phân bố ở Lào Cai, Đà Lạt, Hà Giang.

2) Hedychium coronarium var. flavescens (Lodd.) Hook. Gọi là ngải tiên vàng vàng.

Cành ngắn, có sợi; thân cao đến 2m, đáy đo đỏ. Lá có phiến thon dài, mặt trên

láng, mặt dưới có lông; mép cao 3-4 cm. Phát hoa hơi thông; đài có ống có lông; vành

có ống dài đến 10 cm; phiến vàng lợt; môi có bớt vàng sẫm. Hoa thơm ngọt, màu vàng.

3) Hedychium coronarium var. flavum K.Schum. Gọi là ngải tiên vàng.

Thân cỏ cao, cành ngắn; thân đo đỏ ở dưới. Lá có phiến thon, chót có đuôi dài

4- 6 cm; mép cao đến 5cm. Phát hoa hình bắp cao đến 15cm, lá hoa có lông ở chót,

mang 3 – 4 hoa; hoa vàng; ống vành dài 5 cm, môi to, chẻ ở chót.

4) Hedychium bousigoniamun Pierre ex Gagn. Gọi là Ngải tiên Bousigon.

Thân cỏ, cao 1-1,2 m. Căn hành to 6 – 7 mm. Lá có phiến thon hẹp, nhọn, dài 30

– 50 cm, rộng 7 cm, không lông. Gié thưa, dài 20 cm; lá hoa có lông, dài 2,5 cm; hoa

to, vàng; tiểu nhụy lép hẹp, dài 4cm; môi xoan, chẻ đến ½; noãn sào có lông. Thường

mọc trong rừng ở Đà Lạt.

5) Hedychium coccineum Hamilt. Ngải tiên đỏ.

Địa thực vật: cao 1,5 – 2m. Lá có phiến dài 25 – 50 cm, rộng 3- 5 cm, đáy tà, có

khi hình tim; mép cao 1- 2,5 cm; hoa đỏ; đài dài 3 cm, cánh hoa 3 cm; môi 2 thùy,

noãn sao có lông. Thường mọc ở những nơi đất ẩm lầy, vùng núi cao.

6) Hedychium ellipticum Sm. , Ngải tiên bầu dục.

Cỏ cao 1 m. Lá có phiến bầu dục, to 20 – 40 x 10-15 cm, mỏng, có điểm trong;

mép nâu, cao 1 cm; bẹ không lông. Phát hoa nghiên, dày, to 12x3-4 cm; lá hoa không

lông, cao 3 cm; hoa trắng, cao 8 cm; vành có lông nhung; noãn sào có lông. Mọc ở

những nơi triền núi.

7) Hedychium gardnerianum Roscoe. Ngải tiên Gardner. Kanili Ginger, Ginger Lily

Địa thực vật: Cao đến 1 m, dạng như gừng. Lá có phiến bầu dục, không cuống;

mép cao. Phát hoa đứng cao; lá hoa xanh, 2x1 cm; đài là 2 vảy; hoa vàng bua; ống hoa

dài 5-6 cm; cánh hoa hẹp, dài 3 cm, rộng 3 – 4 mm; tiểu nhụy lép dẹp, vàng tươi; môi

vàng chanh, xoan có 2 thùy; tiểu nhụy thụ màu cam đậm, chi tía, chứa nuốm ở giữa,

lục; noãn sào không lông. Thích hợp với đất cầm thủy: Đà Lạt.

8) Hedychium forresti Diels var. latebracteatum K. Lars. Ngải tiên lá hoa rộng.

Địa thực vật: cao 1,2 m, thơm. Lá có phiến thon nhọn, to 40 x 10 cm; mép cao

2,5 – 3 cm; bẹ không lông. Phát hoa cao 15 cm; lá hoa dài 3 -4 cm; hoa vàng tươi; môi

tam giác, có 2 thùy xoan thon. (sống ở những nơi cao 1500 m, Sapa)

9) Hedychium poilanei K. lars. Ngải tiên Poilane

Địa thực vật: Thân cỏ cao 1,3 m. Lá có phiến thon he ̣p nho ̣n , to 40x12 cm; mép

cao 1 – 1,5 cm, ria nâu. Phát hoa dài 12 cm; lá hoa to 4-5 x 2- 3 cm, hoa thanh, thơm

dịu; ống vành dài đến 10 cm. Cánh hoa trắng hay ngà. Phân bố ở Bảo Lô ̣c.

10) Hedychium stenopetalum Lodd. Ngải tiên Cánh hoa hẹp

Địa thực vật: cao hơn 1 m, lá có phiến to , đến 60x10 cm, mặt trên không

lông,mă ̣t dưới có lông dài, nằm; mép mỏng, cao 1-2 cm, phát hoa chót thân, to, dài đến

35 cm có lá hoa to , gắn thẳng góc vào trục ; hoa trắng hoa thơm ngào ngạt ; cánh hoa

hẹp; bao phấn dài 7 mm, môi bầu dục, có 2 thùy, noãn sào có lông phú n . Thường mọc ở Quảng Trị vào tháng 6.

11) Hedychium villosum Wall. Ngải tiên lông

Địa thực vật cao 1,5 m. Lá có phiến tròn dài, thon hẹp; mép cao 2-3cm. Phát hoa

dài 10 – 15 cm, dày; lá hoa có lông nhung , nâu hoe, dài 2- 2,5 cm, rộng 1 cm; lá hoa

phụ ngắn hơn , hoa trắng, ống đài 2 cm; ống vành dài 4 cm cánh hoa và tiểu nhụy lép

dài 3 cm; môi hẹp, thùy sâu; tiểu nhụy cao 4,5 cm bao phấn không dài. Có ở Đèo Btian

12) Hedychium yunnanensis Gagn., Ngải tiên Vân nam

Địa thực vật: Lá có phiến thon, to 30x8 -13 cm; mép mỏng,cao 3-6 cm, nâu.

Phát hoa dài 20 cm, thưa; lá hoa nhỏ, không lông; hoa trắng hay vàng, thơm; ống đài

không lông; ống vành 2 cm, cánh hoa và tiểu nhụy lép hẹp, dài 2 cm; chỉ tiểu nhụy dài

5,5 cm, bao phấn cam; môi hình tam giác hẹp, chẻ hai. Phân bố ở Đà Lạt.

1.1.2. Thành phần hóa học của chi Hedychium

Trong thiên nhiên có các loại hợp chất : Terpenoit, Steroit, Flavonoit, ancaloit,

cacbohidrat, lipit, protit… Nhưng không phải loài thực vật nào cũng có chứa đủ các

loại trên mà tùy loài thực vật mà hợp chất này là chủ yếu mà lại không có loại hợp chất

kia. Trong mỗi loại thực vật, các bộ phận khác nhau cũng có thành phần hóa học khác

nhau. Đối với các loài thuộc chi Ngải (Hedychium) đều có đặc điểm chung là các bộ

phận thân rễ và hoa có mùi thơm đặc biệt. Vì vậy người ta chú ý trước tiên là các chất

dễ bay hơi, các chất có mùi, đó chính là thành phần của tinh dầu hai bộ phận này.

Tinh dầu là hỗn hợp của các chất thu được bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước, vì

vậy chúng là các chất không phân cực hay kém phân cực, không tan trong nước hay

kém tan trong nước. Vì nhiệt độ sôi thấp nên dễ bay hơi, có mùi, và thành phần chủ

yếu là Hemiterpen (C5), monoterpen (C10), sesquiterpen (C15), điterpen(C20)… và các

dẫn xuất oxi của chúng.

Thành phần của tinh dầu không những phụ thuộc vào loài, vào bộ phận mà còn

phụ thuộc vào phương pháp điều chế nữa. Quả vậy, khi nghiên cứu tinh dầu của một số

loài thuộc chi Ngải H. ellipticum, H. aurantiacum, H.coronarium, và H. spicatum,

Sushil Joshi và các cộng sự đã chỉ ra các kết quả như sau: [12]

Tinh dầu của H.coronarium chứa trans-meta- metha-2,8-diene (25,2%), linalool

(21,7%), - tecpineol (10,9%), Terpin-4-ol (4,1%), - pinen (4,0%),- terpinene

(3,6%), và camphene (3,1%), tổng đóng góp 83,1% được xác định trong tinh dầu thân

rễ.

H. ellipticum chứa hơn 30 hợp chất, trong đó có 28 thành phần đóng góp chiếm

97,8% tổng hàm lượng tinh dầu, hợp chất chính là 1,8 -cineole (33,0%), sabinene

(22,2%), Terpin-4-ol (14,3%), -terpinene (5,3%), và -caryophyllene (5,6%).

Trong tinh dầu thân rễ của H. aurantiacum, Terpin-4-ol (24,8%) đã được xác định là

thành phần quan trọng duy nhất, cùng với para-cymene (8,2%), bornyl acetate (7,6%),

borneol (3,3%), -pinen ( 3,1%), - pinen (2,8%), -tecpineol (2,4%), germacrene D

(2,1%), và sabinene (2.0%).

Trong tinh dầu thân rễ của H. Spicatum được lấy mẫu ở Jageshwar thì hợp chất

chính là 1,8 –cineole(42,8%); 10 – epi -  - Eudesmol (12,4%);  - Selinene(6,8%); -

pinen (4%);  - cadinol (2,9%) trong tổng đóng góp là 87,5% được xác định trong

thành phần thân rễ. .

Bảng 1. 1: Công thức hóa học các chất được nhận dạng trong tinh dầu

các cây thuộc chi Hedychium

1. Sabinene; 2. trans-meta- metha-2,8-diene; 3. - Myrcene; 4. para – cymene; 5. 1,8 –

cineole; 6. linalool; 7. Terpin-4-ol; 8. -tecpineol; 9. bornyl acetate ; 10. 10 – epi -  -

Eudesmol; 11.  - thujene; 12. - pinen ; 13. -pinen ; 14. - terpinene ; 15. limonene;

16. - terpinene ; 17. -caryophyllene ; 18.  - humulene; 19. germacrene D ; 20.  -

Selinene; 21.  - Selinene ; 22. - curcumene; 23. germacrene D – 4 – ol ; 24.  -

cadinol.

Sabulal và các cộng tác cũng nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu từ

thân rễ của 4 loài Hedychium từ miền Nam Ấn Độ: Hedychium venustum, Hedychium

spicatum var. acuminatum, Hedychium coronarium, Hedychium flavescens [29]. Kết

quả cho thấy: Các thành phần chính trong các tinh dầu thân rễ của bốn loài Hedychium

Nam Ấn Độ có chứa các monoterpenes: 1,8-cineole, β-pinen, linalool. Ba thành phần

này chiếm 70-75% của những loại tinh dầu này. 1,8-Cineole là thành phần quan trọng

trong các tinh dầu thân rễ H. venustum (45,4%), H. spicatum var. acuminatum (44,3%)

và H. coronarium (48,7%). β-pinen là thành phần chính trong tinh dầu thân rễ H.

flavescens (43,6%). Trong số ba monoterpenes, β-pinen có hàm lượng là thấp nhất

trong H. spicatum var. acuminatum (1,3%) và H. venustum (5,2%). Tương tự như vậy,

linalool hàm lượng là thấp nhất trong H. coronarium (1,2%) và H. flavescens (11,0%).

Tỷ lệ sesquiterpenes cao nhất trong dầu thân rễ của H. venustum (24,0%) theo sau là H.

spicatum var. acuminatum (22,2%), H. flavescens (0,6%) và H. coronarium (0,5%).

Sự trình bày trên cho thấy thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ của các loài

thuộc chi Hedychium rất phức tạp, có nhiều thành phần. Nhưng đặc điểm chung nhất là

thành phần chính – thành phần có hàm lượng cao nhất trong tinh dầu củ của các loài

thuộc chi này là 1,8 – cineol, sau đó là α, β – pinen.

1.1.3. Hoạt chất sinh học trong thân rễ các loài của chi Hedychium

Vì thân rễ các loài hedychium đều có tinh dầu, nên nghiên cứu hoạt chất sinh

học của các chất trong thân rễ trước hết là nghiên cứu hoạt tính sinh học của tinh dầu.

Sabulal và các cộng sự có những bước tiên phong trong vấn đề này. Các hoạt động

kháng khuẩn của tất cả các loại dầu thân rễ của bốn loài Hedychium từ miền Nam Ấn

Độ: Hedychium venustum, Hedychium spicatum var. acuminatum, Hedychium

coronarium, Hedychium flavescens đã được thử nghiệm theo phương pháp khuếch tán

đĩa chống lại ba vi khuẩn Gram(+) và Gram(-) và hai loại nấm. Kết quả cho thấy tinh

dầu từ H. flavescens, đặc biệt là có hoạt tính kháng khuẩn mạnh thể hiện ở đường kính

dòng kháng khuẩn đối với vi khuẩn Salmonella typhi là 23 mm, Escherichia coli (18

mm), Proteus vulgaris (15 mm) và nấm Candida albicans (13 mm) và C. glabrata (14

mm).

Các nghiên cứu của Ditxit và Varma đã khẳng định một số tinh dầu của một số

loài trong chi Hedychium có tác dụng an thần và đặc biệt có tác dụng tiêu diệt các loài

giun sán kí sinh nguy hiểm như sán dây, sán lá, giun đốt [13].

Tuy vậy tinh dầu chỉ là một phần nhỏ của thành phần thân rễ các loài

Hedychium, vì tinh dầu là phần có nhiệt độ sôi thấp, ít phân cực, hàm lượng trong thân

rễ không lớn từ 0,1 – 0,3% theo nguyên liệu mẫu tươi. Vì vậy, người ta chú ý nghiên

cứu các thành phần khác đặc biệt là các  - lacton α, β không no khung labdan diterpen,

đó là những hợp chất sinh học nổi tiếng. Theo hướng này, Sharma và cộng sự đã phân

lập cặn etanol của thân rễ khô của H. spicatum , mang lại hedychenone, một diterpene

furanoid, dẫn xuất dihydro của nó và diterpene khác được xác định là 6-oxo-labda-

7,11,14-triene-16-oic axit lacton (Sharma et al, năm 1975, 1976; Sharma và Tandon,

1983)... Cặn chiết ethanolic của thân rễ có thể kháng viêm, giảm đau và hạ đường

huyết (Dhar et al, 1973; Dhawan et al, 1977).

Bảy loại labdane diterpenes, coronarin E, coronarin A, yunnancoronarin A,

yunnancoronarin B, hedyforrestin B, villosin, và hedyforrestin C được phân lập từ thân

rễ Hedychium gardnerianum và được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào đối với tế bào

ung thư phổi (NCI-H187) và không gây độc tế bào Vero. Kết quả cho thấy rằng

villosin thể hiện hoạt động mạnh gây độc tế bào với IC50 0,40 M, cao hơn so với các

thuốc ellipticine (IC50 1,79 M). Hơn nữa, ellipticine rất độc hại đối với tế bào Vero

(IC50 7,47 M) trong khi các độc tính của villosin không thể phát hiện ở nồng độ thấp

hơn 166,42 M. Kết quả đã chỉ ra rằng các vòng lacton là cơ sở cần thiết cho hoạt động

gây độc tế bào cao và sự hiện diện của một nhóm hydroxyl ở vị trí 6 hoặc 7 là nguyên

nhân gây giảm hoạt động. Yếu tố gây độc tế bào rất cao trên tế bào ung thư phổi NCI-

H187 cho thấy villosin có thể là một tác nhân có nhiều tiềm năng cho sự phát triển

thuốc điều trị ung thư rất hiệu quả [16].

Các nghiên cứu trước đây về chi Hedychium cho kết quả về một số loại labdane

diterpenoids có các hoạt động quan trọng gây độc tế bào chống lại V-79 và tế bào KB.

Các nghiên cứu về chi tiếp tục với thành phần hóa học của Hedychium forrestii cũng

cho hai diterpenoids labdane phân lập từ thân rễ là: labda-8 (17), 11, 13-trien-7-

hydroxyl-15 (16) olide (hedyforrestin B) và labda 8 (17), 11, 13-trien-7,16-dihydroxyl

16 (15)-olide ( hedyforrestin C)[28].

hedyforrestin B hedyforrestin C

1.1.4. Ứng dụng của các loài thuộc chi Hedychium

Đã có nhiều nghiên cứu về chi Hedychium trên thế giới vì các loài khác nhau

của chi được sử dụng trong thuốc y học cổ truyền để điều trị các bệnh về hen suyễn,

viêm phế quản, thanh lọc máu, bệnh dạ dày, và chống-emetics, bệnh mắt ở

Nagaland[12].

Hedychium spicatum được sử dụng như là một thuốc diệt khuẩn và thuốc diệt

nấm và trong điều trị đau, bệnh dạ dày và viêm trong y học truyền thống Ấn Độ [29].

Hedychium coronarium được sử dụng để điều trị sưng, viêm amidan, viêm họng và

khối u [29]. Thân rễ Hedychium spicatum được sử dụng làm nước hoa trong khu vực

châu Á nhiệt đới. Chi Hedychium được trồng rộng rãi cho các mục đích trang trí, đặc

biệt là hoa của chúng có mùi thơm ngọt ngào [21].

1.2. Tổng quan về cây ngải tiên

Cây ngải tiên còn gọi là cây Bạch Yến, Ngãi diệp tiên, gừng lily trắng, tên khoa

học là Hedychium coronarium Koenig, thuộc họ Gừng( Zingiberaceae).

Ở một số nước khác nhau, ngải tiên được gọi với những tên khác nhau. Tên

tiếng anh là Common ginger lily, white butterfly lily, ginger lily, garland flower. Ở

Malaysia là Gandasuli, suli; ở Indonesia là Gondasuli, ở Philippines là Kamia, Thái

Lan là Mahaahong [11]t

số nước.

Ảnh 1.1: Thân, lá và hoa ngải tiên (http://www.stuartxchange.org/Kamia.html)

1.2.1. Xuất xứ:

Hedychium coronarium Koenig (gừng lily trắng) có nguồn gốc là từ vùng

Himalayas của Nepal và Ấn Độ sau đó phát tán tới khu vực Nam châu Phi và Nam

Mỹ. Loài còn phân bố ở Nam Trung Quốc, Malaixia, Úc và Việt Nam. Cây mọc ở

những vùng có khí hậu mát lạnh. Ở Việt Nam Ngải tiên phân bố tự nhiên ở một số

vùng núi có độ cao 1400 - 1800m tại một số tỉnh Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang và ngày

nay được trồng rộng rãi khắp nơi mục đích làm cảnh, lấy tinh dầu thân rễ làm thuốc và

nước hoa [5].

Ở Cuba, đó là Hoa Quốc gia, được gọi là "Mariposa blanca" nghĩa là "hoa bướm

trắng", do nó trông giống như một con bướm trắng bay. Loài này có một điều đặc biệt

là cực kỳ thơm và những phụ nữ đã dùng trang điểm cho bản thân với những bông hoa

cài trên tóc trong thời kì còn là thuộc địa của Tây Ban Nha, và cũng bởi cấu trúc phức

tạp của cụm hoa, phụ nữ giấu và mang thông điệp bí mật quan trọng vào dưới nó.

Người ta nói rằng một gia đình người nông dân mà không có một cây gừng trắng trong

khu vườn của mình có nghĩa là khu vườn đó chưa hoàn chỉnh [12]. Hedychium

coronarium Koenig được biết đến như gandasuli của Ấn Độ, đây là tiếng Phạn nó có

nghĩa là ―hương thơm của nàng công chúa‖ hoặc ―nước hoa của nữ hoàng‖[14].

H. coronarium được trồng trong nhà kính nước Anh sớm nhất là cuối những

năm 1700 và đã được ghi nhận là "rất hiếm" trên tạp chí thực vật Curtis năm 1803 [9].

1.2.2. Một số đặc điểm thực vật

Ngải tiên Hedychium coronarium Koenig là cây ưa ẩm, hơi chịu bóng, ưa khí

hậu mát mẻ, là một loại thân thảo sống trên mặt đất sâu nặng bia, chiều cao khi phát

triển có thể lên tới 1 đến 2,5 mét [34] . Đường kính thân trung bình là 1,7 cm. Thân

nhẵn. Lá mọc so le, không cuống, hình dải hẹp - mũi mác, nhọn 2 đầu, mặt trên nhẵn

màu lục sẫm bóng, mặt dưới nhạt có lông dễ rụng. Bẹ lá to, có khía màng, lưỡi bẹ 2 - 3

cm, nguyên. Kích thước trung bình của lá là 31,6 x 6,8 cm. Cây ra hoa vào trung tuần

tháng 8 hàng năm. Cụm hoa hình trứng dạng nón mọc ở ngọn thân, dài 5 -7 cm gồm

nhiều lá bắc lợp lên nhau, lá bắc và lá bắc con có màu lục ở đầu. Hoa to, màu trắng rất

thơm. Thân rễ mập, ít phân nhánh, có nhiều ngấn ngang, dài trung bình 38,5 cm, đường

kính 2,8 cm [12]. Đài là ống dài không có răng; vành có 3 tai hẹp, dài ; nhị có chỉ nhị

trắng, tiểu nhụy lép dạng cánh hoa to; 1 tiểu nhụy thụ; môi to, chẻ đến tận giữa thành 2

thuỳ tròn . Nang cao 2,5 cm; mảnh vàng; hột đỏ [4].;

Ảnh 1.2: Bụi cây ngải tiên Ảnh 1.3: Hạt của cây ngải tiên

Ảnh 1.4: Thân rễ cây ngải tiên

1.2.3. Thành phần hóa học của cây ngải tiên (Hedychium coronarium

Koenig)

Cho đến nay người ta mới tìm thấy bốn loại hợp chất chính trong cây ngải tiên,

đó là các tecpenoid, steroid, các hợp chất C6 – C3 và các hợp chất C6 – C3 – C6.

1. 2.3.1.Tecpenoid và tinh dầu ngải tiên:

Các hidrocacbon của tecpen, mono và sesquitecpen chủ yếu nằm trong phần tinh

dầu cùng các dẫn xuất của hemi và monotecpen. Còn các dẫn xuất của oxi của

sesquitecpen, các đitecpen và tritecpen thường nằm trong phần cặn chiết.

Tinh dầu của cây ngải tiên chủ yếu nằm trong hoa và thân rễ. Tinh dầu hoa có

mùi thơm đặc biệt, êm dịu, quý phái nên có giá trị cao và được quan tâm trước tiên.

Bằng phương pháp phân tích không gian đầu (headspace) thành phần mùi của hoa do

Matsumoto và cộng sự thực hiện trên máy GC / MS và GC cho thấy có đến 175 hợp

chất được xác định, trong đó có linalool, methyl benzonate ;cis-jasmone,eugenol, (E)

isoeugenol, lacton Jasmin, methyl epi-jasmonate, indole, nitriles và oximes đã đóng

góp lớn cho hương thơm của hoa [13].

Khi phân tích tinh dầu của hoa ngải tiên bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước

người ta thấy tổng cộng 29 thành phần được xác định và các thành phần chính bao

gồm: o- cimenone (28,05%), linalool (18,52%), 1,8-cineole (11,35%), Tecpineol

(7,11%), 10-epi-eudesmol (6,06%), sabinene (4,59%) và terpinen-4-ol (3,17%) [20].

Những bông hoa phát ra một mùi hương mạnh mẽ bao gồm một hỗn hợp tương

đối đơn giản của các hợp chất monoterpeniod và benzoid, và thành phần chính trong

cánh hoa là L-linalool; 1,8-cineole và 3,7-dimethyl-octatriene-1,3,7. Vì vậy, loài này

dường như là một nguồn lý tưởng cho sự cô lập của các monoterpene synthase liên

quan đến gen. Trong nghiên cứu của Ruihong Li & Yanping Fan [18], một terpene gen

synthase được phân lập từ H.Coronarium, HcTPS2 (Hedychium coronarium terpene

synthases 2) bằng cách sử dụng tiếp cận chức năng gen và biểu đồ phân tích những

bông hoa khác nhau trong từng giai đoạn phát triển khác nhau. HcTPS2 được phân lập

từ hoa của H. Coronarium bằng cách sử dụng RT-PCR (Reverse transcription PCR)

kết hợp với công nghệ RACE (Rapid amplification of cDNAs ends), cho thấy rằng

HcTPS2 chủ yếu thể hiện trong các mô hoa, đặc biệt là trong nhị hoa, cánh hoa và đài

hoa. HcTPS2 là phần quan trọng trong các enzym tổng hợp monoterpene, có thể được

dự đoán là một monoterpene synthase, chứ không phải là một synthase sesquiterpene.

Việc cô lập và phân tích biểu hiện của HcTPS2 sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc nhân

bản gen bổ sung của TPS trong H. coronarium, và có thể là sự đánh dấu trong phát

triển phân tử để hỗ trợ chăn nuôi và cải thiện giống với hương thơm cao cấp và bản sắc

đặc biệt của H. coronarium.

Ngoài tinh dầu của hoa, tinh dầu thân rễ cây ngải tiên cũng rất được quan tâm vì

nó có hoạt tính sinh học lí thú.

Bằng phương pháp cất cuốn hơi nước, Beena Joy và cộng sự, năm 2007 đã

nghiên cứu chi tiết thành phần hóa học của tinh dầu Hedychium coronarium dạng thân

rễ tươi và thân rễ khô. Kết quả cho thấy: tinh dầu chiếm hàm lượng 0,4% ở dạng tươi

và 0,6% trong thân rễ khô. Phân tích tinh dầu thân rễ tươi đã xác định được 44 thành

phần, trong đó trong tinh dầu thân rễ khô là 38 thành phần. Có sự khác biệt này có thể

là do trong quá trình gia nhiệt để sấy khô có sự biến đổi về thành phần và số lượng.

Tuy vậy về thành phần chính không có nhiều thay đổi. Kết quả được chỉ ra ở bảng 1.2

và bảng 1.3[14].

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ khô của cây ngải tiên

Hedychium coronarium Koenig

HỢP CHẤT RT % Hợp chất RT %

8.591 0.25 17.859 0.70 -Phellandrene -Phellandrene

epoxide

8.823 6.73 Isomenthol 19.396 0.33 -Pinene

Camphene 9.338 0.55 Isobornyl acetate 20.342 0.9

Carvacro 20.740 0.27 ß-Pinene 10.375 17.40

ß-Myrecene 10.943 0.48 trans-2-Caren-4-ol 23.367 0.6

3-Carene 11.574 0.23 24.031 0.20 -Thujone

Cymene 12.073 3.95 Caryophyllene oxide 28.091 0.44

Limonene 12.242 3.17 Aromadendrene 29.144 0.42

epoxide

17-AcetyloxyKauran- 32.898 0.47 1,8-Cineole 12.359 37.44

18-al

14.592 0.32 Iso cyclo citral 36.616 0.3 -Pinene epoxide

Linalool 14.664 0.47 9-cis-retinal 39.204 2.21

Caranol 15.349 0.23 Unknown 54.875 0.20

15.481 0.70 (1-Propyl heptadecyl) 60.017 0.35 -Campholenal

benzene

trans-Pinocarveol 15.900 0.46 Glucose penta acetate 63.250 0.46

cis-Verbenol 16.103 0.9 Myrtenol 64.579 0.33

3–Thujene 16.642 0.35

Borneol 16.761 1.63

Terpinen-4-ol 17.124 3.4

17.544 6.70 -Terpineol

Bảng 1.3: Thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ tƣơi của cây

Hedychium coronarium

Hợp chất RT % Hợp chất RT %

ß-Phellandrene-8-ol 20.243 0.23 8.814 4.06 -Pinene

Camphene 9.330 0.30 Perilla alcohol 20.691 0.29

ß-Pinene 10.368 10.39 Carvacrol 20.745 0.34

Cymene 12.074 4.08 p-Menthen-9-a 20.809 0.21

Ethanone Limonene 12.249 2.14 20.850 0.25 1-(3 thylcyclobutane)

20.938 1.33 1,8-Cineole 12.378 41.42 Nerolidol

2- -Pinene 14.580 0.30 21.169 0.31 Acetylcyclopentanone epoxide

Linalool 14.659 0.79 Unknown 21.375 0.91

Fenchyl alcohol 15.083 0.22 22.091 0.57 -Terpinyl acetate

2-Cyclohexen-1- 15.344 0.26 Caren-2-ol 22.832 0.33 ol

15.474 0.20 Citronellal 22.939 0.21 -Campholenal

Limonene oxide 15.730 0.60 Unknown 23.184 0.25

Norionone 15.819 0.31 ß-Thujone 24.039 0.47

Trans- 15.897 0.96 Pinane diol 25.415 0.41 Pinocarveol

3-Thujene 16.637 0.74 Unknown 27.975 0.26

Borneol 16.765 2.04 Patchoulane 28.091 0.77

Aromadendrene Terpinen-4-ol 17.127 3.55 29.143 0.37 epoxide

p-Cymene-8-ol 17.346 0.26 Unknown 31.781 0.20

Iso cyclo citral 32.894 0.65 17.563 8.80 -Terpineol

Myrtenol 17.709 1.52 Oleic acid 35.951 0.38

6-Methyl-5- 18.489 0.47 Unknown 36.612 0.53 hepten-2-one

Ledane 20.165 0.9 9-cis-retinal 39.197 0.33

1. 2.3.2. Sesquiterpenoid và diterpenoid:

Bằng các phương pháp chiết và sắc kí, cho đến nay người ta đã phân lập được

ba dẫn xuất chứa oxi của sesquiterpen và rất nhiều dẫn xuất chứa oxi của diterpen từ

thân rễ cây ngải tiên. Các sesquiterpen đều ở dạng mạch thẳng, còn các diterpen đều có

nhân labdan và phần lớn dạng vòng - lacton , không no. Tất cả được chỉ ra ở bảng

1.4. Đáng chú ý nhất là coronarin D và Villosin là những hợp chất có hoạt tính sinh

học lí thú.

Bảng 1.4: Các terpennoid đã đƣợc phân lập từ cây ngải tiên

(Hedychium coronarium Koenig)

1. hedychiol A [23]

2. hedychiol B 8,9 – diacetate [23]

3. nerolidol

4. coronarin A (2S,4R,4aS,8aS)-4-

[(E)-2-(furan-3-yl)ethenyl]-4a,8,

8-trimethyl-3-methylidene-

2,4,5,6,7,8a-hexahydro-1H-

naphthalen-2-ol

5. Coronarin B C20H30O4

3H-1,2-Dioxepin-5-carboxaldehyde,7-

(decahydro-5,5,8a-trimethyl-2-

methylene-1-naphthalenyl)-4,7-

dihydro-3-hydroxy-

6. coronarin C[17]

7. isocoronarin D [8]

8. R = H coronarin D[8]

9. R= CH3 coronarin D methyl ether

10. R= CH3CH2 coronarin D ethyl ether

11. coronarin E [22]

12. coronarin G

13. Coronarin H

14. Coronarin I

15.

7-hydroxycoronarin B.[25]

16. Hedychenone [32]

17.

7 – hydroxyhedychenone (R=OH)

18. Hedychilactone A [23]

19. Hedychilactone B [23]

20. Hedychilactone C [23]

21. coronalactosides I [24]

22. coronalactosides II [24]

23. coronadiene

24. Villosin

(E)-labda-8(17),12,14-trien-15(16)-olide

[7]

25.

(E)-labda-8(17),12-dien-15,16-

olide

26. (E)-labda-8(17),12-diene – 15,16-

dial

27. ester của labda-8( 17),11,13-trien-1

S-al- 16-oic acid and isocoronarin

D[24]

28. labda-8(17),11,13-trien-15,16-olide[8]

29.

16-hydroxylabda-8(17),11,13-trien-

15,16-olide

[8]

30.

15 -hydroxylabda-8(17),

11,13-trien-16,15-olide [E]

[24]

31.

16-formyllabda-8(17),12-dien-15,11-olide

[24]

32.

6-oxo-7,11,13-labdatrien-17-al-15,16-

olide.

[32]

33.

7,17-dihydroxy-6-oxo-7,11,13-labdatrien-

16,15-olide [32]

34. Cryptomeridiol [32]

35.

6-oxo-7,11,13-labdatriene-16,15-olide

[32]

36. pacovatinin A[32]

37.

Labda – 8(17),13(14) – dien – 15,16 –

olide

Hỗn hợp epime:

Cặn Dicloromethane chiết từ thân rễ của H. coronarium ức chế 86% với 5-

lipoxygenase, ở nồng độ 19 mg / ml, cho thấy một hoạt động tiềm năng chống hen

suyễn (Braga et al, 1999). Căn cứ vào kết quả này, F.N. Taveira và cộng sự đã cô lập

được C-14 epimers diterpene labdane isocoronarin D và C-15 epimers phát sinh

ethoxyl từ coronarin D . Cả hai diterpen là đặc trưng của loài này nhưng chúng còn

xuất hiện dưới dạng hỗn hợp epimer [33].

1.2.3.3. Các hợp chất C6 – C3: Xuất xứ của dãy các hợp chất C6 – C3 (phenylpropanoid) là axit Shikimic – rất phổ

biến trong thiên nhiên như eugenol, safrol… Do đó việc tìm thấy các hợp chất loại này

trong cây ngải tiên cũng là điều dễ hiểu.

F.N. Taveira và cộng sự đã cô lập được eugenol benzoyl trong cặn

Dichloromethane chiết xuất từ thân rễ của H. coronarium [33]

4-hydroxy - 3-methoxy cinnamaldehyde[32]

4-hydroxy-3-methoxy ethyl cinnamate[32]

1.2.3.4. Các hợp chất C6 – C3 – C6 :

Các hợp chất loại này có khung cơ bản của các flavonoid. Vào năm 2002,

Hisashi Matsuda và các cộng sự công bố việc tìm ra các đitecpen loại labdan và 1 hợp

chất Flavonoid đó là: 5 – hydroxy – 3,7,4’ – trimethoxyflavone[22]

Năm 2008, Nakamura và cộng sự tìm thấy một Flavonoid loại kaempferol [24].

kaempferol 3-O-(2‖--L-rhamnopyranosyl)--D-

glucuronopyranoside

Rha:  - L – rhamnopyranosyl

GlcA: - D- Glucuronopyranosyl

1.2.3.5. Các hợp chất Steroids:

Daucosterol [15]

 - sitosterol [15]

Stigmasterol [15]

1. 2.4. Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây ngải tiên

1.2.4.1. Hoạt tính sinh học và tác dụng của tinh dầu:

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ và hoa của H.

coronarium cho kết quả về sự cô lập của một số loại labdane diterpenes và farnesane

loại sesquiterpenes (Itokawa et al, 1988, Nakatani et al, Năm 1994; Yoshikawa et al,

1994, 1998;. Yamahara et al, Năm 1995; Matsuda et al, 1998, 2001, 2002; Muraoka et

al, 2001; Morikawa et al, 2002; Shrotriya et al, 2007). Đồng thời, trong quá trình

nghiên cứu hóa dược của các thuốc tự nhiên, nó đã được báo cáo có các hoạt động

giảm đau và chống viêm trong động vật mô hình (Seikou et al, 2008) và các hoạt động

gây độc tế bào V-79 trên chuột (Itokawa et al, 1988), cho thấy tác dụng ức chế tính

thấm thành mạch gây ra bởi axit axetic (AcOH) ở chuột và oxit nitric (NO) sản xuất

trong lipopolysaccharide (LPS) kích hoạt chuột phúc mạc đại thực bào, cũng như sự ức

chế của việc phát triển của -hexosaminidase trên bệnh bạch cầu (RBL-2H3) (Matsuda

et al, 2002; Morikawa et al., 2002) và đại diện bảo vệ cho gan có hiệu lực trên D-

galactosamine (D-GalN) gây ra độc tế bào trong tế bào gan chuột nuôi chính (Shrotriya

et al, 2007; Yoshikawa et al, 2008), đã kiểm tra kháng sinh và sắc ký khí phân tích của

các monoterpenes tinh khiết và hoá chất với cột chiral và achiral (Jirovetz med et al,

2005; Schmidt et al, 2005 ) [20]

Tinh dầu từ thân rễ tươi và khô đã được chứng minh là có tác dụng kháng nấm

và kháng khuẩn. Tác dụng kháng khuẩn trong mẫu tươi cao hơn trong mẫu sấy khô,

đều cho thấy có hoạt tính kháng Trichoderma sp. và C.albicans, B.subtilis và P.

aeruginosa. Những vi khuẩn này là những sinh vật gây các bệnh ngoài da thông

thường. Tinh dầu thường được sử dụng tạo mùi thơm trong các mỹ phẩm và tác dụng

kháng khuẩn. Người ta khuyên bạn nên sử dụng trong thuốc mỡ, xà phòng làm đẹp và

sát trùng các vết đau. Các thành phần chính là 1,8-cineole mẫu tươi (41,42%) và khô

(37,44%). Trong đó có α-tecpineol 8,8% và 6,7% kết hợp với 1,8-cineol nên tinh dầu

đã được sử dụng chữa các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp (Silvestre et al., 1999).

Achillea fragrantissima đã được báo cáo có terpinen-4-ol là một trong những hợp chất

chính có tác dụng chống lại các vi sinh vật. (Barel et al, 1991). Bộ khung phân tử của

các monoterpenes có nhiều hoạt động kháng sinh, đặc biệt là kháng khuẩn và kháng

nấm. Nghiên cứu gần đây cho thấy hợp chất chính trong tinh dầu của H.coronarium là

1,8-cineol hoạt động chống lại vi khuẩn Gram(+) và nấm men Candida albicans

(Jirovetz et al, 2005).

Tóm lại sự có mặt của các thành phần kháng khuẩn hoạt động trong các loại tinh

dầu từ Hedychium coronarium là phù hợp với việc sử dụng của các bột thân rễ như một

vị thuốc sắc giải nhiệt và thuốc bổ. Sự hiện diện của 1,8 – cineole có một loạt các hoạt

động sinh học và các monoterpenes chứa trong tinh dầu, đặc biệt là β-pinen và α-

tecpineol cung cấp một lý do dược hóa học cho việc sử dụng vị thuốc dân gian của

Hedychium coronarium. Tinh dầu được sử dụng nhiều để tạo mùi hương của chất tẩy

rửa, xà phòng làm đẹp, mỹ phẩm và nước hoa do hương thơm đặc biệt và hấp dẫn của

nó, đồng thời thường xuyên sử dụng các sản phẩm này có thể ngăn ngừa các bệnh về

da do Trichoderma sp. và Candida albicans.[14]

1.2.4.2. Hoạt tính sinh học của các chất được chiết từ thân rễ.

Gần đây, trên thế giới đã có rất nhiều sự chú ý tập trung vào chi Hedychium để

nghiên cứu hoạt động sinh học đa dạng của chúng như khả năng chống viêm, chống

khối u, giảm đau, chống dị ứng, antihelmintic và quan trọng nhất là gây độc tế bào.

Những cây thuộc chi Hedychium là nguồn giàu sesquiterpenes, diterpenes với khả

năng hoạt động rộng trong sinh học và dược học. Đặc điểm cấu trúc của chúng bao

gồm một nửa là bộ khung cơ bản của decalone với nhiều nhóm thế khác nhau, có thể

được phân loại khác nhau như furanolabdanes, labdanes prefuranoid bao gồm

hemiacetals / spiroethers và vòng lacton. Nhìn chung, bộ khung labdane được hiển thị

bởi hedychenone là một dấu hiệu điển hình trong chi Hedychium [32]. Hedychenone là

chất kháng viêm.

Các cặn chiết khác nhau của H. coronarium cho thấy các hoạt động quan trọng

trong giảm đau và chống viêm. Các hiệu ứng có thể là do sự ức chế tổng hợp

prostaglandin, ức chế histamin và hoặc serotonin. Nghiên cứu cặn chiết từ methanol và

các chất từ cặn chiết dichlomethane biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại Gram

dương (S. aureus, B. subtilis, B. megaterium, Sarcina lutea) và vi khuẩn Gram âm (E

coli, S. sonnei, Shiga S, P. aeruginosa và S. typhi) [6]

Tác dụng giảm đau:

Sự đáp ứng co thắt bất thường gây ra bởi acic acetic là 1 quá trình nhạy cảm để

xác định hoạt tính giảm đau. Để kiểm tra có hay không khả năng giảm đau của H.

coronarium thì Sangeeta Shrotriya và cộng sự, năm 2007 đã sử dụng test heat tail-flick.

Cả hai phần chiết trong chloroform và Methanol đều gây tăng khả năng đối phó với

stress của chuột thí nghiệm. Cặn chiết chloroform và methanol ở liều là 400 mg / kg

trọng lượng cơ thể gây ra tương ứng 27,23 và 40,59% ức chế các phản xạ đau. Cả hai

cặn chiết chloroform và methanol cho thấy tỉ lệ phần trăm kéo dài của tail flick time

tương ứng 41,15% và 61,32% ở mức 400 mg / kg trọng lượng cơ thể. [31]

Về tác dụng kháng viêm:

Model sử dụng carrageenan gây phù ở chân cho chuột cống được sử dụng để

đánh giá hiệu quả của 1 chất kháng viêm non-steroid, chất ức chế COX trong con

đường tổng hợp Prostagladin (Seibert, 1994). .

Cặn chiết chloroform và methanol ở một liều lượng của trọng lượng cơ thể 400 mg /

kg cho thấy ý nghĩa thống kê (P <0,01) ức chế phù nề chân 27,46 và 32,48%, tương

ứng tại giờ thứ ba sau khi tiêm carrageenan. Do đó, có thể chỉ ra tác dụng ức chế của

các dịch chiết khác nhau của H. coronarium trên phản ứng viêm gây ra bởi carrageenan

có thể là do sự ức chế enzyme COX từ đó ức chế con đường tổng hợp Prostaglandin.

Sự ức chế có ý nghĩa thống kê phù chân ở những giờ đầu của nghiên cứu bởi H.

coronarium có thể là do ức chế histamine (Hirasawa 1991) hoặc serotonin.[31]

Một số labdane loại diterpenes (coronarin A, B, C, D, E, F) đã được phân lập từ

thân rễ của H. coronarium [10, 12], nhưng có ít thông tin về những coronarins. Các

nghiên cứu cho thấy rằng coronarin A ức chế sự gia tăng của các tế bào tĩnh mạch rốn

của nội mô con người [26]. Coronarin D được biết là ức chế sự sản sinh của β-

hexosaminidase từ tế bào RBL-2H3 và tính thấm do axit acetic mạch máu ở chuột [22].

Trong khi coronarin D và E đã được báo cáo để ngăn chặn sự sản xuất oxit nitric trong

lipopolysaccharide (LPS) do các đại thực bào chuột phúc mạc, coronarin A đã được

chứng minh là gây độc tế bào trong các tế bào khối u [11]. Tuy nhiên, con đường mà

những diterpenes phát huy tác dụng chống viêm và gây độc tế bào của các báo cáo còn

chưa rõ ràng. Một trong những con đường chính liên kết với viêm nhiễm và điều chế

tăng trưởng là yếu tố-κB trong con đường hạt nhân (NF-κB). Coronarin D, một loại

diterpene labdane tách ra từ Hedychium coronarium và đã được phân định cơ chế hoạt

động của nó. Coronarin D ức chế con đường kích hoạt NF-B, dẫn đến sự ức chế của

phản ứng viêm, xâm lược, và sinh hủy cốt bào, cũng như có hiệu lực với quá trình

apoptosis. NF-B là chìa khóa trung gian của sự viêm nhiễm, apoptosis, sự xâm nhập

và ức chế gen trực cốt bào. NF-B hoạt động là nguyên nhân của nhiều loại bệnh tật,

đặc biệt là các bệnh ung thư và các loại viêm nhiễm [17].

Các hoạt động sinh học khác nhau của diterpenes labdane từ H. coronarium đã

được mô tả, bao gồm hoạt động gây độc tế bào chống lại các tế bào V-79, chống viêm

hoạt động, ức chế hoạt động tăng tính thấm thành mạch và sản xuất oxit nitric, và tác

dụng ức chế về việc phát hành -hexosaminidase từ tế bào RBL- 2H3. Các hợp chất

Coronarin D và Coronarin D etyl ether đã được khảo nghiệm cho các hoạt động gây

độc tế bào bằng cách sử dụng một phương pháp thử chống lại các dòng tế bào khác

nhau. Coronarin D epimers cho thấy hoạt động vừa phải chống lại NCI-H187 và S-102,

và hoạt động yếu khi chống lại KB, BL, HuCCA1, HepG2 và dòng tế bào A549, trong

khi coronarin D ethyl ether cho thấy tác dụng gây độc tế bào chống lại HuCCA1,

HepG2, và dòng tế bào A549 [8].

G. Suresh và cộng sự, năm 2010 tiến hành kiểm tra các hợp chất phân lập được

về tính chất ức chế sự tăng trưởng chống lại A-549 (ung thư phổi), SK-N-SH (u

nguyên bào thần kinh ở người), MCF-7 (ung thư vú) và các dòng tế bào ung thư HeLa

(ung thư cổ tử cung). Trong số các hợp chất thử nghiệm, 4-hydroxy- 3-methoxy ethyl

cinnamate, 4-hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde, hedychenone, coronarin C và

coranarin D được hiển thị hoạt động mạnh gây độc tế bào chống lại A-549 dòng tế bào

LC50 giá trị từ 1,26 đến 8,0 M, tương ứng [32].

Cặn chiết methanol từ thân rễ Hedychium coronarium đã được tìm thấy về ức

chế sự gia tăng tính thấm thành mạch gây ra bởi axit acetic ở chuột và sản xuất nitric

oxide trong các đại thực bào chuột phúc mạc lipopolysaccharide kích hoạt. Từ cặn

methanolic, ba diterpenes labdane được phát hiện ra là hedychilactones A, B, C. [22]

1. 2.5. Tình hình nghiên cứu về cây Hedychium coronarium tại Việt Nam

Về thành phần tinh dầu mới chỉ có một công trình của Nguyễn Thị Thủy và

cộng sự nghiên cứu thân rễ cây Ngải tiên. Cây Ngải tiên (Hedychium coronarium

Koenig) mọc tự nhiên tại huyện Sapa, tỉnh Lào Cai, được đem về trồng tại trại Thực

nghiệm của viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh Vật (Cổ Nhuế, Từ Liêm, Hà Nội) từ

năm 2000 và thu hoạch cuối năm 2002 để nghiên cứu. Thành phần hoá học của tinh

dầu được biết gồm các thành phần chính là 1,8 - Cineol - 43,32%,  - Pinen - 25,45%,

 - Pinen - 10,32%, 3- Cyclohexen- 1-methanol - 5,29%. [5]

Mới đây, vào tháng 11 năm 2011, trên tạp chí Bioorganic & Medicinal

Chemistry Letters, Phan văn Kiệm và các cộng sự đã công bố nghiên cứu mới nhất về

các hợp chất được phân lập từ thân rễ ngải tiên ở Sapa – Việt Nam. Trong báo cáo này,

họ đã phận lập được ba labdane loại diterpenes mới, đặt tên là coronarins G,H,I và 7

hợp chất đã được biết đến là: coronarin D, coronarin D methyl ether, hedyforrestin C,

(E)-nerolidol, -sitosterol, daucosterol, và stigmasterol. Các hợp chất từ cây có tác

dụng ức chế sản xuất các cytokine của tế bào đuôi gai có nguồn gốc từ tủy xương là

các tác nhân gây viêm hoặc tiền gây viêm được giải phóng ra khi bị kích thích bởi LPS

(lypopolysacchride). Trong số các hợp chất này, các hợp chất coronarins D,G,H là chất

ức chế đáng kể tới LPS kích thích TNF-, IL-6 và IL-12 p40 sản xuất với IC50 khác

nhau, từ 0,19 ± 0,11 ; 10,38 ± 2,34 M.[15]

Ba hợp chất mới đƣợc phân lập (1-3 : coronarins G,H,I)

1.2.6. Ứng dụng của cây ngải tiên Hedychium coronarium Koenig.

Cây Ngải tiên ngày nay được trồng nhiều nơi trên thế giới với mục đích làm

cảnh và lấy tinh dầu thân rễ để làm nước hoa và làm thuốc [1]. Thân rễ và quả có vị

cay, mùi thơm, tính ấm, có tác dụng khu phong trừ thấp, ôn trung tán hàn, thường được

dùng chữa đau bụng lạnh, bụng đầy trướng, tiêu hoá kém, đau mình mẩy phong thấp,

nhức mỏi gân xương, cảm sốt, chữa rắn cắn. Tinh dầu thân rễ có tính gây trung tiện, trừ

giun. Tinh dầu của hoa là một loại hương liệu cao cấp [3]. Giá trị làm thuốc của Ngải

tiên đã có một số công trình ghi nhận [1,3]. Các thân rễ được sử dụng như một thuốc

giải nhiệt, thuốc bổ và đặc trị các bệnh về thấp khớp. Các phần chiết từ thân cây được

sử dụng trị các bệnh sưng, đau.[20] Các thân rễ của H. coronarium ("Tuqianghuo"

trong tiếng Trung Quốc) đã được sử dụng điều trị nhức đầu, tiểu đường cấp và rất tốt

cho bệnh thấp khớp theo y học cổ truyền Trung Quốc , trong khi nó cũng được sử dụng

như giải nhiê ̣t, thuốc bổ, phấn khích và chống thấp khớp trong hệ thống Ayurvedic của

y học cổ truyền Ấn Độ (Jain et al, 1995) . [22]

Một số bài thuốc dân gian từ Hedychium coronarium

Nụ non và hoa ăn được. Được sử dụng trong hương liệu. Trong hoa chứa 0,05-

0,07% một chất sánh với mùi thơm gia vị, cho ra 50-57,8% một chất dầu đặc. Nếu

chưng cất bằng hơi nước, chất đông đặc và chất dầu này sẽ cho tinh dầu (hàm lượng

19%) có giá trị cao trong hương liệu. Tinh dầu thường được dùng chữa đau bụng. Thân

rễ khô 6-12g sắc uống hoặc tán bột uống. Cũng dùng chữa rắn cắn: Lấy thân rễ tươi giã

lấy nước uống, bã đắp.

Ở Hawaii cây được dùng làm thuốc trị thối mũi.

Rễ cây tán bột được dùng làm thuốc hạ nhiệt ở Ấn Độ.

Ở Môluyc, người ta dùng làm thuốc súc miệng; cũng dùng làm thuốc trị tê thấp.

Ở Ấn Độ, tinh dầu cũng được sử dụng làm thuốc trị giun.

Trong y học Trung Quốc, được sử dụng cho nhức đầu, đau viêm, thấp khớp. Ở

Vân Nam (Trung Quốc), thân rễ trị đòn ngã tổn thương, phong thấp gân cốt nhức mỏi,

cảm mạo đau mình mẩy, bạch đới nóng lạnh. Quả dùng trị dạ dày bụng đầy trướng, ăn

uống không tiêu.

Dùng phần nước sắc uống của thân cây gần thân rễ được sử dụng như một súc miệng

cho viêm amiđan, hoặc viêm răng lợi. .

Nước ép của thân cây được áp dụng bên ngoài cho những vết sưng đau.

Tại Ấn Độ, được gọi là Gulbakawali Ark, được sử dụng như là thuốc bổ mắt và để

ngăn chặn đục thủy tinh thể ở mắt.

Tại Thái Lan, lá luộc được áp dụng để giảm các khớp cứng và đau.

Ở khắp nơi, những bông hoa thơm phổ biến trong việc tạo ra vòng hoa và bó hoa cô

dâu.[27]

CHƢƠNG 2: ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ

THỰC NGHIỆM

2.1. Đề tài, mục tiêu và nhiệm vụ

2.1.1. Tên đề tài:

Các loài trong chi Hedychium rất hấp dẫn bởi hương thơm của hoa và những

hợp chất có hoạt tính sinh học thú vị thuộc dãy các  - lacton diterpen ,  không no.

Đây là những hợp chất có hoạt tính chống ung thư, chống viêm rất mạnh đang được

các nhà khoa học thế giới quan tâm một cách đặc biệt. Ở Việt Nam, cây ngải tiên

(Hedychium coronarium Koenig) được trồng rộng rãi nhằm mục đích làm cảnh và làm

thuốc nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của cây. Với định hướng

như vậy chúng tôi đã chọn đề tài: “ Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học

trong cây ngải tiên ( Hedychium coronarium Koenig) ‖.

2.1.2. Mục tiêu của đề tài

a. Nghiên cứu thành phần hóa học của thân rễ cây ngải tiên.

b. Nghiên cứu, phân lập, xác định cấu trúc phân tử và hoạt tính chống ung thư của

các  - lacton ,  không no dãy labdan diterpene trong thân rễ ngải tiên.

2.1.3. Nhiệm vụ của đề tài

1. Nghiên cứu tinh dầu của thân rễ cây ngải tiên.

2. Nghiên cứu qui trình chiết chọn lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trong

thân rễ cây ngải tiên.

3. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu và các sản phẩm

chiết được.

4. Nghiên cứu phân lập các  - lacton ,  không no trong các cặn chiết từ thân rễ

cây ngải tiên.

5. Xác định cấu trúc phân tử của các chất phân lập được và khảo sát hoạt tính

chống ung thư của chúng.

2.2. Các phương tiện nghiên cứu

2.2.1. Thiết bị nghiên cứu

- Sắc kí lớp mỏng: dùng bản mỏng tráng sẵn của MERCK: 60 F254.

- GC-MS đo bằng máy GC-6890 MS-5973.

- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy impact 410 –Nicolet 760 FT-IR (theo phương

pháp ép viên KBr).

- Phổ khối lượng (MS) ghi trên máy Hewlett Packard HP5890, Serie II. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, 13C-NMR-DEPT- 135, 13C-NMR-DEPT-90, COSY, HMQC, HMBC, được ghi trên máy Brucker

Advance-500 MHz, chuẩn nội TMS (tetrametyl silan), độ chuyển dịch hóa học (δ)

được biểu thị bằng ppm, hằng số J tính theo Hz.

. Các phổ được thực hiện tại Viện hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam và Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên.

2.2.2. Dụng cụ

- Cột chiết nhồi silica gel

- Bộ chưng cất tinh dầu

- Sắc kí cột nhồi silica gel ( Hãng Merk, kích thước hạt 60 đến 100m). Hệ

dung môi rửa giải là n-Hexan: Etylaxetat tăng dần độ phân cực.

- Sắc kí lớp mỏng dùng silica gel tráng trên các tấm kính 3 x 10 cm, dùng silica gel G5-20, hoạt hóa ở 1100C trong 2h hoặc dùng bản mỏng nhôm tráng silica gel

60F.254. Hệ dung môi dùng cho sắc kí lớp mỏng là: n-Hexan: EtOAc với tỉ lệ phù hợp

để khả năng tách là tốt nhất.

2.2.3. Các hóa chất

Các dung môi, thuốc thử và các hóa chất khác đều dùng của hãng MERCK hay

của Trung Quốc loại RA. Nếu là dung môi công nghiệp thì phải xử lý như sau:

- Dung môi etylaxetat kỹ thuật được rửa axit 3 lần với dung dịch Na2CO3 5%, sau

đó được rửa bằng nước cất đến pH = 7. Làm khô bằng Na2SO4 khan, CaSO4 khan, cất lấy etylaxetat ở phân đoạn có nhiệt độ sôi 76-780C.

- Dung môi n-hexan kỹ thuật được rửa bằng axit H2SO4 đậm đặc, sau đó bằng

nước cất đến pH= 7, làm khô bằng Na2SO4 khan và cất lấy ở phân đoạn có nhiệt độ sôi 67-680C.

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được chạy trên những bản nhôm tráng sẵn silica gel

60F254 độ dày 0,2mm của hãng Merck.

Các sắc kí đồ lớp mỏng nhận biết bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 1% (dùng để

nhận biết các nhóm chất như steroit, tecpenoit, các chất màu, chất sáp…). Thuốc thử

được điều chế như sau: cho 0,2g vanillin vào 10ml H2SO4 đặc 98% khuấy đến tan hết,

thu được dung dịch thuốc thử. Thuốc hiện màu FeCl3 1M (pH=4) (dùng để nhận biết

các loại hợp chất flavonoid, phenolic, axit, este…)

Chất hấp phụ dùng trong quá trình sắc kí cột là silica gel cỡ hạt 0,040-0,063 mm

của hãng Merck.

2.3. THỰC NGHIỆM

2.3.1. Mẫu thực vật và phương pháp xử lí:

Nguyên liệu thân rễ cây ngải tiên Hedychium Coronarium Koening được Tiến sĩ

Nguyễn Quốc Bình ở Bảo Tàng thiên nhiên Việt Nam cung cấp và giám định. Mẫu

thân rễ ngải tiên được lấy tại huyện Sapa tỉnh Lào Cai vào tháng 1 năm 2011. Sau khi

thu mua về, mẫu được rửa sạch đất cát, loại bỏ phần thối rữa, hư hỏng và thái ngang

thân rễ thành lát dày 1- 3 mm, rồi nghiền thành bột cỡ hạt 1 – 2 mm và bảo quản trong

tủ lạnh để tiến hành nghiên cứu.

- Từ 1,5 kg nguyên liệu tươi đã chuẩn bị dành cho nghiên cứu phần tinh dầu:

- Từ 4 kg nguyên liệu đã chuẩn bị dành cho nghiên cứu các hoạt chất sinh học..

2.3.2. Điều chế tinh dầu thân rễ ngải tiên.

a/ Cho 1,5 kg nguyên liệu (đã chuẩn bị ở phần 2.3.1) cùng 3,5 lít dung dịch NaCl

10% cho vào bình cất A của thiết bị chưng cất đặc biệt (hình 1) có bẫy tinh dầu D bằng

A: Bình cất

B: Ống nối

C: Sinh hàn

D: Bẫy tinh dầu

E: Khóa

60ml dung môi toluen

Hình 2.1. Thiết bị cất cuốn hơi nước hồi lưu

Đun hồi lưu 03 giờ, lấy toluen trong bẫy ra và cất lấy dịch dầu-nước cho đến khi

dịch cất âm tính với KMnO4 0,2% .

b/Bão hòa dịch dầu-nước cất được bằng NaCl rồi chiết 03 lần bằng toluen, mỗi

lần 100ml.

c/ Gộp lượng toluen lấy trong bẫy chiết với lượng dịch chiết toluen từ dịch dầu

nước, làm khô bằng Na2SO4, cất loại dung môi, thu hồi tinh dầu, giữ trong lọ kín và

bảo quản trong tủ lạnh trước khi xác định thành phần hoá học và các nghiên cứu khác.

Hàm lượng tinh dầu được tính bằng tỉ lệ phần trăm khối lượng tinh dầu trên khối lượng

mẫu tươi (gam). Kết quả được 1,75 g tinh dầu. Tính hiệu suất là 0,12%. Tinh dầu có

màu vàng chanh nhạt, mùi thơm dễ chịu, hấp dẫn.

2.3.3. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên:

Mẫu tinh dầu củ ngải tiên được phân tích trên thiết bị GC-MS (HP-6890), cột tách

HP-5 (Cross-linked 5% ME Siloxane) 30m 0,25mm 0,25m Film thickness, khí mang He, tốc độ dòng 20ml/phút, Detector MSD-HP-5973, nhiệt độ 250oC, chế độ phân tích Split Ratio 150/l; chạy theo chương trình nhiệt độ: nhiệt độ đầu 90oC trong 5 phút, tốc độ tăng nhiệt 5oC/phút, nhiệt độ cuối 280oC cho đến lúc đường nền phẳng.

Thành phần các hợp chất trong tinh dầu được xác định bằng cách so sánh phổ

khối của chúng với phổ chuẩn trong thư viện máy với độ trùng lặp trên 90%.

Hàm lượng các thành phần được tính toán dựa trên mối liên hệ giữa diện tích

pic và lượng chất, kết hợp việc so sánh diện tích pic của các chất trong mẫu. Kết quả

phân tích được chỉ ra trên bảng 3.1 phần kết quả thảo luận ( trang 50).

2.3.4. Chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong củ ngải tiên:

a/ Từ 4 kg nguyên liệu tươi đã chuẩn bị ở phần 2.3.1, ngâm vào 4 lít etanol 96%

trong ba ngày, lọc Busne, ngâm tiếp 2 lần nữa, mỗi lần 1,5 lít EtOH 96% lọc Busne.

Gộp dịch chiết etanol, thu được 6,5 lít dịch lọc.

b/ Cô dịch lọc bằng cách đun cách thủy đến còn 1/6 thể tích . Thêm vào 4 thể

tích nước bão hòa muối và chiết 3 lần bằng n – hexan.

Lần 1 : 150 ml

Lần 2: 150 ml

Lần 3: 150 ml.

Gộp dịch chiết n – hexan, làm khô bằng Na2SO4, cất loại dung môi bằng cách thủy thu

được cặn H, 2 gam. Hiệu suất 0,05% tính theo nguyên liệu tươi.

c/ Sau khi chiết bằng n – hexan, dịch được chiết tiếp bằng etyl axetat, cũng tiến

hành 3 lần, mỗi lần 100 ml, thu được dịch etylaxetat. Làm khô bằng Na2SO4 khan, cất

cách thủy để loại dung môi thu được cặn E khối lượng 11 gam, hiệu suất 0,27% tính

theo nguyên liệu tươi.

2.3.5. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity)

Theo phương pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlink (1994) tiến hành

trên phiến vi lượng 96 giếng, kháng sinh kiểm định bao gồm: Ampixilin, Tetracylin,

- Vi khuẩn Gr (+): Escherichia coli (ATCC 25922);Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923).

- Vi khuẩn Gr (-) : Bacillus subtillis (ATCC 27212); Staphylococcus aureus (ATCC 12222)

- Nấm mốc : Aspergillus niger (439); Fusarium oxysporum (M42).

- Nấm men : Candida albicans (ATCC 7754); Saccharomyces cerevisiae (SH20)

Amphoterilin B và Nystatin.Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm các nhóm:

Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng: Trupcase soya

borth (TBS) cho vi khuẩn, Saboruaud dextrose borth cho nấm. Các chủng kiểm

định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng

dịch thể (24h đối với vi khuẩn; 48h đối với nấm ).

Mẫu thử được hòa tan hoàn toàn trong dung dịch DMSO 100%; 4 – 10

thang nồng độ sẽ được pha loãng ra từ dịch gốc rồi nhỏ vào phiến vi lượng. Vi sinh

vật kiểm định sau khi hoạt hóa được hòa loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho có nồng độ 0 đơn vị McLand (khoảng 108 vi sinh vật/ml ), ủ ấm 370C/24h cho vi khuẩn; 300C/48h cho nấm.

Các thử nghiệm được tiến hành tại Phòng sinh học thực nghiệm, Viện

Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viên Khoa học và Công nghệ Quốc gia.

Kết quả được chỉ ra trên bảng 3.3 ; Phần thảo luận – kết quả trang 53.

2.3.6. Khảo sát các cặn chiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)

- Chuẩn bị bản mỏng: hòa tan hoàn toàn chất nghiên cứu bằng dung môi dùng để

chiết sao cho dung dịch thu được không quá loãng hay quá đặc. Dùng capilla thủy tinh

lấy chất rối chấm lên bản mỏng sao cho vệt chất phải tròn, gọn, cách mép bên của bản

mỏng 0,5cm, cách chân bản mỏng 0,7cm. Chiều dài bản mỏng 7cm

- Chuẩn bị dung môi: Pha hệ dung môi thích hợp cho vào bình sắc kí có nút nhám

và lắc kĩ. Lượng dung môi lấy sao cho khi triển khai sắc kí lớp mỏng không để cho

dung môi ngập vết chất.

- Triển khai sắc ký bản mỏng: cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng được đặt nghiêng một góc 150. Bình sắc kí phải để yên trong suốt quá trình triển khai.

Khi tiền tuyến dung môi cách mép trên 0,1 cm thì lấy bản mỏng ra. Làm khô bản

mỏng, sau đó hiện vệt chất bằng các thuốc hiện thích hợp.

Tiến hành SKLM cặn H trên bản 60F254 (Merk) với hệ dung môi n-

hexan/EtOAc tỉ lệ 9:1,v/v, hiện sắc phổ bằng vanilin/H2SO4 1%, bằng dung dịch FeCl3

1M (pH 4) nguội và hơ nóng.

Thực hiện tương tự với cặn E với hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 7/3,

kết quả cho ở bảng 3.4 và 3.5 phần kết quả và thảo luận trang 54,55.

2.3.7. Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của các chất trong các cặn chiết

2.3.7.1. Phân lập các chất trong cặn chiết Etyl axetat

Để phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat chúng tôi sử dụng phương pháp sắc

kí cột .

a) Chuẩn bị mẫu chất phân tách:

Hòa 2 gam cặn chiết từ etyl axetat ( cặn E) vào một lượng EtOAc đủ để tan hết,

cho thêm 3 gam silica gel cỡ hạt 40-60 m, trộn kỹ, làm khô hết dung môi.

b) Chuẩn bị cột:

Cột thủy tinh có  = 3 cm, l = 70 cm, có khoá và nút thuỷ tinh ở đầu và cuối cột

được rửa sạch bằng axit sunfocromic, nước, axeton, sấy khô. Cho 170g silica gel cỡ

hạt 40 – 60 m vào 200 ml n- hexan, khuấy đều và đổ vào cột, gõ cột đến khi không

còn bọt khí. Để ổn định cột đến hơn 4 tiếng mới sử dụng.

c) Tiến hành sắc kí cột:

Mở khóa để dung môi trong cột xuống ngang mặt chất hấp phụ, cho hỗn hợp

chất phân tách đã chuẩn bị (phần a) lên cột rồi cho dung môi rửa cột đến ngập chất, xử

lí để loại bỏ hết bọt khí, cho một lớp bông Silica gel mỏng để giữ yên bề mặt cột.

Rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ 7/3 theo thể tích với tốc độ 20

giọt /phút và lấy thành các phân đoạn, mỗi phân đoạn 6 ml. Kiểm tra các phân đoạn

bằng SKLM và thu gom các phân đoạn chỉ cho một vệt giống hệt nhau, về Rf và màu

sắc phổ với cả 2 thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH 4), các phân đoạn có

thành phần giống nhau được gộp lại với nhau và đem cất đuổi dung môi để thu chất.

- Với các phân đoạn chỉ cho một vệt chất được coi là chất sạch, nếu là chất rắn thì kết

tinh lại để thu được chất tinh khiết, nếu là chất lỏng thì cất lại để thu chất tinh khiết.

- Với các phân đoạn có 1 – 3 vệt và ∆Rf nhỏ thì khảo sát lại bằng SKLM để tìm hệ

dung môi thích hợp và tiến hành sắc kí cột lại để phân lập các chất tinh khiết. Bằng

cách này, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm và được kết quả như sau:

 Từ phân đoạn 128 đến phân đoạn 160 thu được một vệt tinh khiết, cô đuổi dung

môi được chất rắn kí hiệu là P5, khối lượng 0,30 g, Rf = 0,79 (hệ dung môi n-

hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 3/7) hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4. Với

thuốc thử FeCl3 khi để nguội không màu còn khi hơ nóng có màu xanh đen.

 Từ phân đoạn 82 đến phân đoạn 88 với hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích

7/3, chấm trên bản mỏng cho 2 vệt rất gần nhau có Rf = 0,82 và 0,85. Cô đuổi hết

dung môi thu được dạng tinh thể lẫn dầu (bẩn). Tiếp tục tiến hành chạy cột tinh

với phân đoạn này. Trộn cặn của phân đoạn 3 với 1 lượng silica gel vừa đủ, sấy

dưới ánh sáng tử ngoại đến khô kiệt.

Cột tinh loại nhỏ  = 1 cm, l = 40 cm được nhồi ướt với 14 gam silica gel hòa trong

hexan. Cho chất lên cột và hệ dung môi chạy cột hexan: EtOAc là 9,5:0,5. Thử SKLM

với hệ dung môi triển khai 9:1. Thuốc hiện màu là vanilin thu được 4 phân đoạn có sắc

phổ giống nhau.

Phân đoạn 22 đến phân đoạn 25 (Rf = 0,7 màu vàng sáng). Kí hiệu P6, 120 mg.

Phân đoạn 31 đến phân đoạn 40 (Rf = 0,65, màu tím xanh). Kí hiệu P7, 150 mg.

Phân đoạn 44 đến phân đoạn 55 (Rf ≈ 0,45 màu vàng). Kí hiệu P8, 50 mg.

Phân đoạn 67 đến phân đoạn 87 (Rf = 0,25 màu vàng nhạt). Kí hiệu P9

Cô đuổi dung môi các phân đoạn thu được tinh thể P7, P8; chất dầu là P6,P9.

Kiểm tra lại SKLM, thuốc thử FeCl3 với tinh thể P7 cho màu xanh đen khi hơ nóng.

2.3.7.2. Phân lập các chất trong cặn chiết bằng n- hexan:

Làm tương tự như phần 2.3.7.1 đối với 2 g cặn H.

Rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan /EtOAc tỉ lệ 9/1 theo thể tích với tốc độ 20

giọt /phút và lấy thành các phân đoạn, mỗi phân đoạn 6 ml. Kiểm tra các phân đoạn

bằng SKLM và thu gom các phân đoạn chỉ cho một vệt giống hệt nhau, về Rf và màu

sắc phổ với cả 2 thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH= 4).

Phân đoạn từ 103 đến phân đoạn 124 sau khi hứng dung môi từ cột, thử SKLM với

thuốc thử vanilin/H2SO4 1% trên bản mỏng thấy xuất hiện các chấm tròn màu hồng

giống nhau Rf = 0,5 trong hệ dung môi triển khai 9:1, tiến hành cất đuổi dung môi thu

được chất dầu không màu. Kí hiệu là H6.

Kiểm tra SKLM với thuốc hiện FeCl3 1M không có màu ở nguội nhưng có màu xanh

đen khi hơ nóng.

2.3.8. Các hằng số vật lí và các số liệu phổ của các chất thu được.

P5 là chất rắn, không màu, khối lượng 300 mg, Rf = 0,79 (hệ dung môi n-

hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 3/7) hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%. Với

thuốc thử FeCl3 khi để nguội không màu còn khi hơ nóng có màu xanh đen. Phổ IR: 3636, 3083, 2932, 2855, 1758, 1674, 948, 892. EIMS (m/z) [M+]: 318. Số liệu phổ 1H (500MHz) và 13C-NMR(125MHz) với chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3. Số liệu được

ghi trên bảng 3.7 (trang 60).

P7 là tinh thể vô định hình, kết tinh lại trong n-hexan, điểm nóng chảy 1240C,

Rf= 0,65 (dung môi n-hexan/EtOAc,7/3,v/v), hiện với FeCl31M (pH=4) không màu lúc

nguội, màu xanh đen khi hơ nóng, khối lượng 150mg.

Phổ IR (KBr), max,cm-1 3090; 2935; 2865; 1751, 1643, 948 ; 900; 925. EIMS, m/z, M+ 300. 1H&13C-NMR(500 MHz, 250 MHz), chuẩn nội TMS, CDCl3 .

Số liệu được ghi trên bảng 3.6 (trang 58).

Hợp chất H6, dạng dầu không màu, Rf =0,5 (n- hexan/EtOAc 9/1, v/v), hiện màu

xanh đen với FeCl3 1M (pH=4) khi nóng. Phổ IR của H6 max,cm-1 3086, 1681, 954 và 860 EIMS , m/z = 346,4 (M+). 13C-NMR (500 MHz,250 MHz), chuẩn nội TMS, CDCl3.

Số liệu được ghi trên bảng 3.8 (trang 62).

2.3.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được:

Theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS(1993)

hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường

đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.

Dòng tế bào

Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma - Ung thư gan)

Lu (Lung cancer - Ung thư phổi)

Dòng RD (ung thư cơ vân tim - Rhabdosarcoma) từ Viện VSDT TƯ

Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc

MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) Có bổ xung L- glutamine,

Sodium piruvat, NaHCO3, PSF(Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA

(Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)

Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro Acetic acid); Tris

Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.

Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur,

các đầu tuýp cho micropipet…

Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipithine,

Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO

- Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515nm

Tính kết quả:

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính

theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO

10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo công thức:

OD (mẫu) – OD (ngày 0)

CS% = x 100

OD (DMSO) – OD (ngày 0)

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, được đưa vào tính toán Excel để

tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức

của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn 

 (xi - x )2

 =

n - 1

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp

để tìm giá trị IC50

Giá trị IC50 : dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình

Table curve theo thang gía trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất

thử để tính giá trị IC50. Công thức: 1/y=a+blnX

Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%). Đồ thị tính giá trị IC50 của mẫu

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đối tượng và đề tài nghiên cứu:

Trong những năm đầu thế kỉ 21 này, các nhà khoa học thế giới quan tâm đặc

biệt đến hoạt tính sinh học của các hợp chất lacton dãy labdan đitecpen; đặc biệt là hoạt

tính chống ung thư và chống viêm của loại hợp chất này. Đây cũng là hướng nghiên

cứu của chúng tôi.

Vài năm trở lại đây, người ta phát hiện thấy các loài thuộc chi Ngải

(Hedychium) của họ gừng ( Zingiberaceae) là nguồn nguyên liệu quí cho loại hợp chất

lacton dãy labdan đitecpen… Ví dụ như Hedychium gardnerianum [16] và ngải tiên

Hedychium coronarium [17]. Hơn nữa, ngải tiên là cây thuốc dân tộc đã nổi tiếng từ

lâu đời ở nước ta. Nhân dân sử dụng cây này để điều trị các bệnh về hen suyễn, viêm

phế quản, các bệnh về đường ruột, dạ dày…[12].

Thế nhưng những nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây ngải tiên

của Việt nam còn rất ít; mới có 1 công trình nghiên cứu tinh dầu của thân rễ ngải tiên

của Nguyễn Thị Thủy và cộng sự công bố năm 2003 [5] và một công trình mới đây của

Phan Văn Kiệm và cộng sự công bố cuối năm 2011 [15]. Vì vậy việc “ Nghiên cứu

các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây ngải tiên ( Hedychium coronarium

Koenig) ‖ là điều cần thiết và bổ ích.

Đối tượng chúng tôi nghiên cứu là thân rễ của cây ngải tiên được thu mua vào

tháng 1/2011 tại Sapa . Mẫu cây do chính TS. Nguyễn Quốc Bình – cán bộ của Bảo

tàng thiên nhiên Việt Nam, người có bề dày thâm niên nghiên cứu họ gừng

(Zingiberaceae) thu mua mẫu, giám định và cung cấp.

3.2. Nghiên cứu tinh dầu của thân rễ cây ngải tiên:

3.2.1. Điều chế tinh dầu:

Tinh dầu là phần cất cuốn hơi nước từ nguyên liệu. Như trong phần tổng quan

đã trình bày, tinh dầu của các loài thuộc chi Hedychium bao gồm chủ yếu các dẫn xuất

oxi của mono và sesquitecpen, do đó chúng có nhiệt độ sôi tương đối cao; hơn nữa

chúng phân bố trong thân rễ của loài này dưới dạng liên kết với các cơ chất là cellulose

và tinh bột, không phải dưới dạng túi tinh dầu như một số nguyên liệu khác. Chính vì

vậy, với phương pháp cất cuốn hơi nước thông thường không thể cho phép thu tinh dầu

của củ các loài thuộc chi này cho hiệu suất cao.

Chúng tôi tiến hành cất cuốn hơi nước tinh dầu trong thân rễ ngải tiên trong một

thiết bị đặc biệt (xem phần thực nghiệm trang 40). Thiết bị này cho phép đun hồi lưu

bột củ tươi của cây ngải tiên với nước muối 10% để phá vỡ liên kết của tinh dầu với cơ chất và nâng nhiệt độ bình cất trên 1100C, do đó cất được cả thành phần sôi thấp và

thành phần sôi cao. Có bộ phận bẫy tinh dầu bằng dung môi trong quá trình đun hồi lưu

để thu gom tinh dầu, tránh được sự biến chất vì nhiệt của những cấu tử mẫn cảm với

nhiệt trong tinh dầu. Với các ưu điểm này của thiết bị chúng tôi thu được tinh dầu củ

cây ngải tiên với hiệu suất khá cao (0,12%) và chất lượng tốt, màu vàng chanh, mùi

thơm dễ chịu, hấp dẫn. Trong khi đó Nguyễn Thị Thủy và cộng sự thu được tinh dầu củ

cây ngải tiên trồng ở Từ Liêm chỉ được 0,09%[5].

3.2.2. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên:

Đối với chất lỏng dễ bay hơi và nhiệt độ sôi thấp như tinh dầu thì phương pháp

hiện đại nhất để phân tích và nhận biết các thành phần là phương pháp sắc kí khí kết

hợp với khối phổ. Theo phương pháp này, chạy theo chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ đầu 900C, gia nhiệt 50C /phút đến 2800C trên máy GC-6890 MS-5973, chúng tôi xác

định trong tinh dầu củ ngải tiên tươi có 27 thành phần (xem phụ lục số 1, trang 73),

chúng tôi đã nhận dạng được 11 thành phần là những thành phần có độ trùng lặp về

phổ khối trên 90% so với phổ khối các chất trong thư viện máy (xem bảng 3.1).

Bảng 3.1: Các thành phần chính của Tinh dầu củ Ngải tiên vùng Sapa

Thời Hàm STT Tên chất Độ trùng lặp(%) gian lƣu lƣợng (%)

1 6.62 β-pinen 0.55 97

2 8.12 1,8- cineole 2.23 99

3 10.29 90 Linalool 23.44

4 12.42 Borneol 1.33 91

5 12.79 Terpinen-4-ol 2.12 94

6 13.26 91 α-Terpineol 12.14

7 24.26 93 12-nor-caryophyll-5-en- 0.83

2-on

8 25.01 91 Nerolidol 11.86

9 26.64 Eudesmol 1.76 99

10 27.51 β-eudesmol 1.28 97

11 27.57 Valerianol 1.92 91

Cộng 59,44

Kết quả trên cho thấy số thành phần xác định được mới chiếm 59,44%; còn

40,56% trong tinh dầu chưa xác định được thành phần. Đây là một điều thú vị đối với

tinh dầu ngải tiên, cần được nghiên cứu tiếp tục vì nó chiếm trên 1/3 lượng tinh dầu.

Khi so sánh thành phần chính của tinh dầu thân rễ cây ngải tiên này với thành

phần chính của tinh dầu ngải tiên trồng tại Từ Liêm mà Nguyễn Thị Thủy và cộng sự

đã công bố [5], chúng tôi thấy có sự khác biệt khá lớn vì thành phần và hàm lượng các

thành phần. Điều này được thể hiện trên bảng 3.2.

Linalool

α-

terpinen-

 và β-

Nerollidol

1,8-cineole

Terpineol

4-ol

pinen

Bảng 3.2: So sánh một số thành phần của tinh dầu củ ngải tiên Sapa và Từ Liêm

Thành phần Loại (%) Tinh dầu Tinh dầu ngải 23,44 12,14 2,12 11,86 0,55 2,23 tiên SaPa

Tinh dầu ngải - - - 35,77 43,32 - tiên Từ Liêm

Sự khác biệt này có thể do phương pháp điều chế, cũng có thể do thổ nhưỡng và

khí hậu, mùa lấy mẫu.

3.3. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong củ cây Ngải tiên

(Hedychium coronarium Koenig).

3.3.1. Chiết chọn lọc các chất có hoạt tính sinh học trong củ ngải tiên.

Như trong phần tổng quan cũng như mục tiêu của đề tài đã trình bày, loại hợp

chất mà chúng tôi quan tâm nhất trong củ cây ngải tiên là các các  - lacton diterpen ,

 không no có khung của vòng labdan – điterpen. Chúng là những hợp chất có hoạt

tính chống ung thư mạnh, chống oxi hóa và chống viêm. Chúng là những chất có độ

phân cực trung bình và vì vậy chúng tôi chiết chọn lọc chúng trong dung môi có độ

phân cực trung bình Etyl axetat theo qui trình chiết trên sơ đồ 3.1

Sơ đồ 3.1: Qui trình chiết các hoạt chất sinh học trong bột củ ngải tiên

Kết quả trên cho thấy trong củ cây Ngải tiên hàm lượng các chất không phân

cực hay kém phân cực rất thấp, 0,05% tính theo nguyên liệu tươi; trong khi đó hàm

lượng các chất có độ phân cực trung bình rất cao: 0,275% tính theo nguyên liệu mẫu

tươi. Đây cũng là điều mong ước của chúng tôi.

3.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu và cặn chiết

của củ ngải tiên

Kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh đang là vấn đề của y dược học hiện đại.

Vì sự tồn vong của mình, vi khuẩn luôn luôn biến đổi để kháng thuốc, thích nghi với

kháng sinh. Và cũng vì sự tồn vong của mình, con người luôn luôn tìm kiếm thuốc mới

để chống lại vi khuẩn gây bệnh để bảo vệ mình. Vì vậy cuộc chiến giữa con người và

vi khuẩn là cuộc chiến khốc liệt, lâu dài và không có hồi kết. Để nhanh chóng đạt kết

quả trong việc nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn trong củ ngải tiên, con đường tốt

nhất là theo phép thử sinh học (bioassay guided test) đối với tinh dầu và các cặn chiết

chọn lọc H và E thu được từ củ cây này.

Chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của mẫu tinh dầu và các cặn

chiết H,E từ thân rễ ngải tiên đối với 8 loại vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) thuộc 4

nhóm khác nhau: Gram (+), Gram (-), nấm mốc, nấm men theo phương pháp thử hiện

đại Vanden Bergher và Vliethin Gah. Kết quả thử được chỉ ra trên bảng 3.3.

Bảng 3.3 : Hoạt tính kháng VSVKĐ của các sản phẩm của củ ngải tiên

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: g/ml)

Asp.

Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men VSV- KĐ

coli

aruginosa

subtillis

aureus

niger

oxysporum

albicans

cerevisiae

Mẫu

Tinh dầu 200

( - ) ( - ) ( - ) 100 100 ( - ) ( - )

Cặn H ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) 200 ( - ) ( - )

Cặn E ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) 200 ( - ) ( - )

Dấu (-) : không có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.

Kết quả trên cho thấy hoạt tính kháng VSVKĐ trong củ ngải tiên tương đối kém,

chỉ cho tác dụng đáng kể đối với nấm mốc F. Oxysporum với cường độ không mạnh.

Do đó chúng tôi quan tâm các loại hợp chất có hoạt tính chống ung thư, chống oxi hóa,

chống viêm trong củ cây ngải tiên.

3.3.3. Phân lập các hợp chất trong cặn chiết H và E của thân rễ ngải tiên.

3.3.3.1. Khảo sát các cặn chiết H và E bằng SKLM.

Vì hoạt tính chống ung thư mạnh, chống oxi hóa và chống viêm của các hợp chất

 - lacton ,  không no thuộc dãy labdan – điterpen mà chúng tôi đặc biệt quan tâm và

tìm kiếm mà thân rễ cây ngải tiên là nguồn nguyên liệu giàu loại hợp chất này. Trong

phần 3.3.1.chúng tôi đã nghiên cứu qui trình chiết chọn lọc các hợp chất này trong thân

rễ tươi của cây ngải tiên. Để phát hiện các hợp chất này trong cặn chiết, chúng tôi dùng

SKLM với thuốc hiện FeCl3 1M (pH = 4) khi hơ nóng. Vì khi hơ nóng trong môi

trường axit, các  - lacton dễ bị thủy phân thành các  - hydroxi axit tương ứng, nên

chúng tạo với FeCl3 thành hợp chất màu xanh đen đặc trưng. Hơn nữa phương pháp

SKLM còn cho phép chọn được hệ dung môi thích hợp cho việc phân lập các chất có

trong cặn chiết và đánh giá độ phức tạp cũng như sơ bộ nhận dạng các hợp chất trong

cặn chiết bằng thuốc thử đặc trưng.

Theo cách này, chúng tôi tiến hành khảo sát cặn chiết H bằng SKLM với hệ dung

môi n – hexan/EtOAc, 9/1,v/v; cặn E với hệ dung môi n – hexan/EtOAc, 7/3,v/v và hai

thuốc hiện vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH = 4). Kết quả được chỉ ra trong bảng

3.4 và 3.5.

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát cặn H bằng SKLM

Vanilin/H2SO4 FeCl3 1M TT Rf Nguội Nóng Nguội Nóng

1 0,07 Nâu Nâu sẫm Không màu Không màu

2 0,27 Xanh sẫm Không màu Không màu Đen

3 0,33 Xanh sẫm Không màu Không màu Đen

4 0,37 Xanh sẫm Không màu Không màu Đen

5 0,50 Nâu nhạt Hồng tím Không màu Xanh đen

6 0,62 Hồng Vàng Không màu Không màu

7 0,70 Hồng Không màu Không màu Tím

8 0,78 Xanh Không màu Không màu Đen

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát cặn E bằng SKLM

Vanilin/H2SO4 FeCl3 TT Rf Nóng Nguội Nóng Nguội

Hồng đậm Không màu Không màu Hồng 0,15 1

Tím hồng Không màu Tím 0,42 2 Xanh đen

Xanh mờ Không màu Không màu Nâu 0,56 3

4 0,75 Không màu Xám Không màu Xanh đen

5 0,85 Hồng Hồng tím Không màu Xanh đen

Kết quả trên cho thấy cặn chiết H rất phức tạp, có trên 8 thành phần nhưng chỉ có

1 thành phần là lacton dạng este có Rf = 0,5 và hiện màu hồng tím với vanillin và xanh

đen với FeCl3 1M (pH =4) khi nóng. Còn cặn E thì ít phức tạp hơn, chỉ có 5 thành phần

nhưng đáng chú ý là có tới 3 thành phần hiện màu xanh đen với FeCl3 khi đun nóng,

không màu khi ở nguội, các thành phần này có thể là lacton hoặc este.

Kết quả này cũng cho thấy qui trình chiết rất chọn lọc vì không những cho hiệu

suất cặn chiết E cao mà hợp chất lacton mà chúng tôi mong đợi tập trung trong cặn

này.

3.3.3.2. Phân lập các chất tinh khiết trong các cặn chiết E và H

Đối với hợp chất có nhiệt độ sôi cao, phương pháp phân lập tốt nhất là phương

pháp sắc kí cột. Hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tỉ lệ các

chất cần phân tách trên chất hấp phụ, hoạt tính của các chất hấp phụ, kích thước cột,

phương pháp rửa cột và dung môi rửa cột… Chúng tôi phân lập các chất lacton trong

cặn E chiết từ thân rễ cây ngải tiên, kích thước cột 2,5 x 70 cm và dung môi rửa cột là

n- hexan/EtOAc 7/3, v/v, tốc độ rửa 2 ml/phút. Kiểm tra và thu gom sản phẩm bằng

SKLM. Kết quả chúng tôi phân lập được 4 chất sạch kí hiệu P5, P6, P7, P8 và P9. Chu

trình phân lập được thể hiện trên sơ đồ 3.2.

Sơ đồ 3.2. Các phân đoạn phân lập các chất tinh khiết trong cặn E bằng sắc kí cột.

Tương tự như trên nhưng với dung môi rửa cột là n – hexan/EtOAc, 9/1,v/v từ

cặn chiết H chúng tôi phân lập được một chất H6, có Rf = 0,5 hiện màu xanh đen với

FeCl3 1M (pH=4) khi hơ nóng.

Như vậy chúng tôi đã phân lập được 6 chất tinh khiết từ các cặn chiết từ thân rễ cây

ngải tiên.

3.3.4. Xác định cấu trúc phân tử của các chất phân lập được.

3.3.4.1. Xác định cấu tạo phân tử của hợp chất P7

Hợp chất P7 là tinh thể hình kim, màu trắng, điểm nóng chảy 124oC và Rf=

0,65 ( n- hexan/EtOAc, 7/3,v/v), hiện màu xanh đen với FeCl3 1M (pH = 4) khi đun

nóng. Phổ IR của P7 (xem phụ lục số 4 trang 76 ) cho thấy có vòng - lacton , không

no (C=O 1751 cm-1, và liên kết đôi 3 nhóm thế có C=C 1643 cm-1, C-H =829 cm-1); có liên kết đôi 2 nhóm thế dạng E ( exo – metylen) với C=C 1603 cm-1, C-H 900 cm-1.

Trên phổ 13 C – NMR và DEPT ( xem phụ lục số 7,8 trang 79,80) cho thấy rõ

phân tử P7 có 20 nguyên tử C, trong đó có 3 nhóm metin olefin vùng trường yếu 120 –

145 ppm, 2 nhóm metin của Cacbon bậc 3 no vùng 55 – 65 ppm, 6 nhóm metylen và

đặc biệt nhóm exo metylen có C = 108,40 ppm.

Khối phổ của P7 cho pic M+ = 300,6 (xem phụ lục số 5 trang 77). Từ các số liệu

trên suy ra công thức phân tử của P7 là C20H28O2 và độ bội liên kết là 7. Vì phân tử hợp

chất P7 có 20 nguyên tử cacbon, có vòng - lacton , không no, nhóm exo – metylen

vì 3 nhóm metyl ở vùng trường mạnh nên có thể suy ra đây là diterpen và dựa vào qui

luật đầu đuôi và đặc điểm các phổ chúng tôi xây dựng khung labdan. Những dữ kiện trên cho phép khẳng định P7 là Villosin có công thức như hình 3.1. Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR được chỉ ra trong bảng 3.6. Số liệu phổ cũng như điểm chảy của P7 tương

ứng với số liệu phổ và điểm chảy của villosin công bố trong tài liệu 25.

Hình 3.1 . Công thức cấu tạo của P7 - Villosin

Bảng 3.6. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất P7

Vị trí C Độ bội, J(Hz) của P7 C (ppm) của P7

C (ppm) của villosin [25] 40,9 H (ppm) của P7 1,00; 1,40 m H (ppm) của villosin [25] 1,00; 1,45 1 40,83

2 19,11 19,1 1,49; 1,46 m 1,40; 1,51

3 42,30 42,3 1,51; 1,21 m 1,18; 1,40

4 33,57 33,6

5 54,75 54,8 1,09 dd(2,68; 2,68) 1,09

6 23,38 23,4 1,71; 1,38 m 1,71; 1,39

7 36,75 36,8 2,45; 2,08 m 2,08; 2,44

8 149,40 149,4

9 62,22 62,2 2,37 m 2,37

10 39,29 39,3

11 136,87 136,9 dd(10,13; 10,13) 6,90 6,89

12 120,66 120,7 d (15,84) 6,11 6,10

13 129,55 129,6

14 142,34 142,3 br_s 7,15 7,14

15 69,56 69,6 d(1,6) 4,80; 4,8

16 172,31 172,3

17 108,40 108,4 4,5; 4,76 d(1,7); d(1,7) 4,51; 4,76

18 33,38 33,6 0,89 0,89 s

19 21,93 22,0 0,84 0,84 s

20 15,05 15,1 0,87 0,87 s

3.3.4.2. Xác định cấu trúc phân tử của hợp chất P5

Hợp chất P5 là chất rắn vô định hình, không màu. Phổ IR (xem phụ lục 11 trang 83) cho thấy nhóm - OH (OH 3636 cm-1), vòng - lacton (C=O 1758 cm-1), nhóm exo -

metylen (3088, 1674 và 948 cm-1) và liên kết đôi 3 nhóm thế (1674, 948 cm-1). Phổ 13C-NMR (xem phụ lục 14 trang 86)cho thấy có 20 nguyên tử cacbon trong phân tử,

trong đó có nhóm cacbonyl (170,50 ppm), 4 cacbon olefinic (148,25, 143,48, 124,44 và

108,07 ppm), 3 nhóm metin, 8 nhóm metylen và 3 nhóm metyl. MS cho pic phân tử

lượng 318(xem phụ lục 12 trang 84). Các số liệu trên cho phép xác định công thức phân tử P5 là C20H30O3. Phổ 1H-NMR một lần nữa khẳng định có nhóm vinyliden

trong phân tử P5 thể hiện ở 2 proton geminal ở 4,83 ppm (1H, d, J 18.1) và 4,37 (1H, d,

C = 143,48 ppm. Từ các số liệu trên chúng ta có công thức cấu tạo của P5 (hình 3.2) và các số liệu 1H và 13C-NMR trong bảng 3.7

J 18.2). (xem phụ lục 13 trang 85) Kết luận này dựa trên sự tương tác của các proton lên cacbon có C =108,07 ppm qua phổ HSQC (xem phụ lục 16 trang 88). Phổ 1H& 13C-NMR cho thấy có một liên kết đôi 3 nhóm thế thể hiện H = 6,72 ppm (1H,br_s) và

Hình 3.2 . Công thức cấu tạo của P5 – Coronarin D

Bảng 3.7: Số liệu 1H&13C-NMR của hợp chất P5

Độ bội, J(Hz) của P5

Vị trí C C (ppm) của P5

H (ppm) của P5

C (ppm) của coronarin D [11] 39,12

H (ppm) của coronarin D [11]

1 39,46 1,55; 1,15 m

2 19,25 19,21 1,49; 1,55 m

3 41,93 41,90 1,50; 1,2 m

4 33,61 33,57

5 55,25 55,21 dd(2,36; 2,36) 1,13 1,16

6 24,62 24,42 1,32 m

7 37,72 37,68 1,73 m

148,25 148,01 8

9 56,07 56,02 3,01 1H 2,99

10 39,66 39,94

11 24,00 23,99 2,36-2,39 m,(2H) 2,36-2,40

12 143,48 143,45 6,72 br s,1H 6,69

13 124,44 124,48

14 25,42 25,58 2,71 s,1H 2,71

15 96,42 96,46 5,94 br_s,1H 5,94

16 170,57 170,65

17 108,07 107,52 4,83; 4,37 4,81; 4,36

18 20,98 21,62 0,88 s,3H 0,89

19 19,25 19,21 0,81 s,3H 0,82

20 14,02 14,23 0,71 s,3H 0,71

Ghi chú: Số liệu phổ trên bảng 3.7 phù hợp với tài liệu (11,17)

Như vậy P5 có tên hóa học là 15-hydroxy-8(17),12-labdadien-15(16)-olide và

có tên khác là coronarin D. Sự định hướng của các proton H9, H5, C20 được khẳng

định nhờ xét sự tương tác của chúng qua phổ NOESY( xem phụ lục 18 trang 90)

3.3.4.3. Xác định cấu trúc phân tử H6

Hợp chất H6, dạng dầu không màu, Rf =0,5 (n- hexan/EtOAc 9/1, v/v), hiện

màu xanh đen với FeCl3 1M (pH=4).

Phổ IR của H6 (xem phụ lục 19 trang 91) cho thấy phân tử có một vòng -

lactone có vị trí , - chưa no có C=O 1762 cm-1 và C=C 1681 cm-1; nhóm exo- methylene C=C 1641 cm-1 , C-H 954 cm-1 và nhóm ete C –O-C = 1118cm-1

Phổ 1HNMR ( phụ lục 21 trang 93) cho thấy sự hiện diện của 2 nhóm Etoxy,

hiển thị bởi hai cụm triplet (H = 1,12 ppm và H = 1,15 ppm ) và pic multiplets (H

=3,59 ppm; H =3,86ppm) tín hiệu của các nhóm methyl (H = 0,68 ppm; 0,78ppm; và

0,85ppm) và H của exo-methylene (H = 4,32ppm; 4,37ppm và 4,77ppm).

Quan sát những phổ 13C – NMR (xem phụ lục số 22a trang 94) cho thấy 8

Cacbon olefin vùng 107 – 147 ppm là 4 cặp đôi cacbon olefin liền kề có cùng cường

độ. Tổng số cacbon của hai đồng phân này là 44. Trong đó có 8 nhón CH, 16 nhóm

CH2, 8 nhóm CH3 (xem phổ DEPT, phụ lục 23 trang 97). Đặc điểm phổ nêu trên gần

với phổ của Coronarin D như đã xác định ở 3.3.4.2.

Tất cả các dữ kiện trên cho phép nghĩ đến đây là cặp đồng phân epime của etyl

coronarin D ete.

Điều này được khẳng định thêm nhờ trên phổ khối của H6 (xem phụ lục 20 trang 92) có pic ion phân tử tại m/z = 346,4 (M+) , cùng với 1 phân mảnh có điểm ion m/z = 300,6 (M+ – C2H5OH). Tất cả thỏa mãn với công thức phân tử C22H34O3.

Số liệu phổ của H6 được ghi trên bảng 3.8 và công thức cấu tạo của H6 được

chỉ ra trên hình.

Hình 3.3. Công thức cấu tạo của H6 – etyl coronarin D ete

Bảng 3.8. Số liệu phổ 13C của hợp chất H6

Số liệu phổ 13C của Số liệu phổ 13C của epimer Etyl

hợp chất H6 coronarin D ete[33] Nguyên tử C

H6/a

3a

3b

H6/b

39,19 39,2 39,3 39,35 1

19,231 19,3 19,3 19,231 2

41,919 42,0 42,0 41,919 3

32,844 33,6 33,6 32,798 4

55,300 55,3 55,4 55,253 5

24,020 24,1 24,1 23,999 6

37,704 37,8 37,8 37,704 7

147,732 147,975 147,8 148,1 8

56,056 56,1 56,1 56,056 9

39,348 39,4 39,4 39,197 10

25,327 25,4 25,4 25,327 11

142,572 142,700 142,9 143,0 12

124,148 124,079 124,1 124,1 13

32,844 32,798 32,9 32,9 14

100,934 100,934 101,0 101,0 15

169,604 169,604 169,8 169,8 16

107,249 107,560 107,3 107,7 17

33,308 33,458 33,6 33,6 18

21,630 21,540 21,7 21,7 19

14,003 14,230 14,3 14,4

20

65 65 65,1 65,1

21

14,260 14,849 15,0 15,0

22

Để khẳng định thêm độ chính xác dự đoán cấu tạo là hỗn hợp epime của etyl

coronarium D, chúng tôi kết hợp so sánh dữ liệu phổ 13C của H6 với tài liệu 33. Bảng số liệu trên cho thấy sự phù hợp của phổ 13C- NMR của cặp epimer của etyl coronarin

D ete mà Taveira và cộng sự, năm 2005 đã phân lập và xác định cấu trúc từ thân rễ cây

ngải tiên ( Hedychium coronarium J. Koening) của Braxin[33].

3.3.5. Khảo sát hoạt tính chống ung thư của các chất phân lập được từ thân rễ

ngải tiên.

Như trên đã trình bày ở trên, chúng tôi đã phân lập được 6 chất tinh khiết trong

thân rễ cây ngải tiên vùng Sapa. Ba trong số đó đã được xác định cấu trúc phân tử một

cách chặt chẽ bằng các phương pháp phổ hiện đại, đó là: Villosin; Coronarin D và

epimer của Etyl coronarin D ete.

Villosin là một chất có hoạt tính chống ung thư phổi rất mạnh. Các nghiên cứu

của Kumrit I và cộng sự đã khẳng định Villosin chống ung thư phổi mạnh hơn so với

thuốc chống ung thư phổi nổi tiếng ellipticine. Cường độ IC50 của villosin là 0,40 M,

cao hơn so với các thuốc ellipticine (IC50 1,79 microM). Hơn nữa, villosin không độc

với tế bào Vero trong khi ellipticine rất độc hại đối với tế bào này. Chính vì vậy mà

villosin có triển vọng trong sự phát triển thuốc điều trị ung thư [16].

Coronarin D và etyl coronarin D đã có nhiều công trình nghiên cứu hoạt tính

chống ung thư. Các loại ung thư như: ung thư gan Hep-G2, ung thư phổi A 549, ung

thư thần kinh SK – N – SH, ung thư vú MCF – 7, ung thư cổ tử cung HeLa [17, 32] đã

được thử nghiệm. Nhưng các dòng ung thư phổi Lu, ung thư cơ vân tim RD chưa được

thử nghiệm. Chúng tôi khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của Coronarin D phân

lập được từ thân rễ cây ngải tiên vùng Sapa với 3 dòng tế bào ung thư: ung thư gan

(Hep-G2), ung thư phổi (Lu) và ung thư cơ vân tim (RD) theo phương pháp của

Skehan và cộng sự (1993), Likhiwitayawuid và cộng sự (1993); các phương pháp này

hiện nay đang được áp dụng tại viện ung thư quốc gia của Mỹ (NCI). Kết quả được chỉ

ra trong bảng 3.8 và bảng 3.9.

Bảng 3.8. Hàm lƣợng tế bào ung thƣ sống sót sau khi thử

Các tế bào còn sống sót CS (%) Ký hiệu TT Kết luận mẫu Hep-G2 Lu RD

1 DMSO 100,0±0,0 100,0±0,0 100,0±0,0 P5 dương

2 Chứng (+) 2,2±0,0 1,8±0,04 0,30±0,03 tính tính cả

3 dòng 3 P5 0,0±0,0 19,4±0,10 0,00±0,00

Bảng 3.9. Cƣờng độ gây độc tế bào ung thƣ

Ký hiệu Nồng độ gây độc IC50 (g/ml) TT Kết luận mẫu Hep-G2 Lu RD

1 Chứng (+) 0,257 0,312 0,188 P5 dương

tính cả 3 2 P5 0,788 0,969 0,675

dòng

Từ kết quả bảng trên cho thấy, mẫu P5 (Coronarin D) mà chúng tôi phân lập

được có tác dụng gây độc tế bào ung thư mạnh đối với cả 3 dòng ung thư người là ung

thư gan Hep-G2 ( IC50 0,78 microgam/ml), ung thư phổi Lu(IC50 0,96 microgam/ml) và

ung thư cơ vân tim RD ( IC500,67 microgam/ml).

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên

(Hedychium coronarium Koenig), chúng tôi đã có kết luận sau:

1. Đã xây dựng phương pháp và thiết bị điều chế tinh dầu thân rễ cây ngải tiên

vùng Sapa cho hiệu suất cao (0,12% so với mẫu tươi) trong khi tinh dầu thu từ

củ cây ngải tiên trồng ở Từ Liêm cho hiệu suất 0,09% so với mẫu tươi .

2. Bằng phương pháp GC - MS đã xác định thành phần hóa học có hàm lượng cao

trong tinh dầu ngải tiên là: Linalool: 23,44%; α-Terpineol: 12,14%; Nerolidol :

11,86%; 1,8- cineole 2.23%; Terpinen-4-ol: 2.12%. Kết quả phân tích cho thấy

thành phần tinh dầu ngải tiên Sapa khác tinh dầu ngải tiên trồng thực nghiệm tại

Từ Liêm nhiều.

3. Xây dựng quy trình chiết chọn lọc các hợp chất  - lacton ,  không no thuộc

dãy labdan – điterpen trong thân rễ cây ngải tiên cho hiệu quả tốt.

4. Chúng tôi đã phân lập được 5 hợp chất tinh khiết từ cặn EtOAc và 1 chất từ cặn

n – hexan của thân rễ ngải tiên và đã xác định cấu trúc phân tử của 3 hợp chất.

Đó là: Villosin; Coronarin D và epimer của ete etyl coronarin D.

5. Chúng tôi đã khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 3 mẫu: tinh dầu,

cặn H và cặn E. Kết quả cho thấy tinh dầu kháng được ba loại vi khuẩn: Ecoli và

2 loại vi khuẩn nấm mốc: Asp.niger và F.oxysporum; còn cặn H và cặn E đều

cho kháng F.oxysporum.

6. Chúng tôi cũng đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của Coronarin D phân lập từ thân rễ cây ngải tiên Sapa đối với 3 dòng tế bào ung thư người: ung

thư gan Hep-G2, ung thư phổi Lu và ung thư cơ vân tim RD và nhận thấy

Coronarin D có hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với cả 3 dòng ung thư trên.

Chúng tôi đã công bố một phần kết quả của luận án trong bài báo

trên tạp chí Dược Học, năm 2012, số 429, trang 48 - 52.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong,

Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim

Mãn et al. (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, Nxb

KH&KT Hà Nội, tr. 141-143.

2. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam, Nxb. Y học, Hà Nội, tr. 141.

3. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, TP HCM, tr. 821.

4. Phạm Hoàng Hộ (1993) Cây cỏ Việt Nam, NXB Montreal, tâ ̣p 3, tr. 558 – 562.

5. Nguyễn Thị Thuỷ, Nguyễn Thị Phương Thảo, Trương Anh Thư, Bùi Văn Thanh

(2003)― Thành phần hoá học của tinh dầu Ngải tiên (Hedychium coronarium

Koenig)‖, Viện Sinh thái & Tài nguyên Sinh vật, Viện KH& CNVN.

TIẾNG ANH

6. Aziz M. A., Habib M. R., Karim M. R., (2009) ― Antibacterial and Cytotoxic

Activities of Hedychium coronarium J. Koenig‖ , Research Journal of

Agriculture and Biological Sciences, 5(6), pp. 969-972.

7. Boukouvalas J., Wang Jian-Xin and Marion O., (2007) ― Expedient synthesis of

villosin and its isomer (E)-labda-8(17),12,14-trien-15(16)-olide‖,

Tetrahedron Letters,48, pp. 7747–7750.

8. Chimnoi N, Pisutjaroenpong S, Ngiwsara L, Dechtrirut D, Chokchaichamnankit

D, Khunnawutmanotham N, Mahidol C, Techasakul S., (2008) ― Labdane

diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium‖, Natural Product

Research, 22(14),pp. 1249–1256.

9. Csurhes, S., Jones M.N, (2008) Pest plant risk assessment, Biosecurity

Queensland Department of Primary Industries and Fisheries, Queensland ,

pp. 8.

10. Itokawa H, Morita H, Katou I, et al. (1987) ― Cytotoxic diterpenes from the

rhizomes of Hedychium coronarium‖, Planta Med,54, pp. 311.

11. Itokawa H, Morita H, Takeya K, Motidome M.(1988) ― Diterpenes from

rhizomes of Hedychium coronarium‖, Chem Pharm Bull Tokyo,36, pp.

2682–4,54, pp. 311–5.

12. Joshi S, Chanotiya CS, Agarwal G, Prakash O, Pant AK, Mathela CS, (2008)

― Terpenoid Compositions, and Antioxidant and Antimicrobial Properties of

the Rhizome Essential Oils of Different Hedychium Species‖, Chemistry &

Biodiversity, 5, p. 299.

13. Joy, P. P., Thomas J., Mathew, S., and Skaria, B. P., (1998), Zingiberaceous

Medicinal and Aromatic Plants, Aromatic and Medicinal Plants Research

Station, Odakkali, Asamannoor P.O.,Kerala, India, pp. 23 – 24.

14. Joy B, Rajan A, Abraham E., (2007) ― Antimicrobial activity and chemical

composition of essential oil from Hedychium coronarium‖, Phytother Res,

21(5), pp. 439 – 443.

15. Phan Van Kiem , Nguyen Thi Kim Thuy , Hoang Le Tuan Anh , Nguyen Xuan

Nhiem , Chau Van Minh , Pham Hai Yen , Ninh Khac Ban , Dan Thuy

Hang, Bui Huu Tai, Nguyen Van Tuyen , Vivek Bhakta Mathema , Young-

Sang Koh , Young Ho Kim, (2011) ― Chemical constituents of the rhizomes

of Hedychium coronarium and their inhibitory effect on the pro-

inflammatory cytokines production LPS- stimulated in bone marrow-derived

dendritic cells‖ , Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,21 pp. 7460–

7465

16. Kumrit I, Suksamrarn A, Meepawpan P, Songsri S, Nuntawong N., (2010)

―Labdane-type diterpenes from Hedychium gardnerianum with potent

cytotoxicity against human small cell lung cancer cells‖, Phytother Res ,

24(7), pp. 1009-13.

17. Kunnumakkara AB, Ichikawa H, Anand P, Mohankumar CJ, Hema PS, Nair

MS, Aggarwal BB., (2008) ―Coronarin D, a labdane diterpene, inhibits both

constitutive and inducible nuclear factor-kappa B pathway activation,

leading to potentiation of apoptosis, inhibition of invasion, and suppression

of osteoclastogenesis‖, Mol Cancer Ther,7 (10), pp. 3306-17.

18. Li R. and Fan Y., (2011) ―Molecular Cloning and Expression Analysis of a

Terpene Synthase Gene, HcTPS2, in Hedychium coronarium‖, Plant

Molecular Biology Reporter, 29, pp. 35–42.

19. Liu X.H., Zhao D.B., Yang C.R., Wang H.Q., (2000) ―New Sesquiterpenoids

from Hedychium yunnanense Gagne‖,Chinese Chemical Letters,11(11), pp.

1009−1012.

20. Lu Y., Zhong C. X., Wang L., Lu C., Li X. L. and Wang P. J., (2009), ―Anti-

inflammation activity and chemical composition of flower essential oil from

Hedychium coronarium‖, African Journal of Biotechnology,8 (20), pp 5373-

5377.

21. Mabbertey D.J., (1998), The Plant-Book: A Portable Dictionary of the Higher

Plants, Cambridge University Press, Cambridge

22. Matsuda H., Morikawa T., Sakamoto Y., Toguchida I. and Yoshikawa M.,

(2002) ― Labdane-type Diterpenes with Inhibitory Effects on Increase in

Vascular Permeability and Nitric Oxide Production from Hedychium

coronarium‖, Bioorganic & Medicinal Chemistry,10, pp. 2527–2534.

23. Morikawa T, Matsuda H, Sakamoto Y, Ueda K, Yoshikawa M., (2002) ―New

Farnesane-Type Sesquiterpenes, Hedychiols A and B 8,9-Diacetate, and

Inhibitors of Degranulation in RBL-2H3 Cells from the Rhizome of

Hedychium coronarium‖, Chem. Pharm. Bull,50(8), pp. 1045—1049

24. Nakamura S, Okazaki Y, Ninomiya K, Morikawa T, Matsuda H, Yoshikawa M,

(2008) ―Medicinal flowers. XXIV. Chemical structures and hepatoprotective

effects of constituents from flowers of Hedychium coronarium‖, Chem.

Pharm. Bull,56(12), pp. 1704—1709.

25. Nakatani N., Kikuzaki H., Yamaji H., Yoshio K., Kitora C., Okada K., Padolina

W.G., (1994) ―Labdane diterpenes from rhizomes of Hedychium

coronarium‖ Phyrochmustry,37(5), pp. 1383-1388.

26. Oh S, Jeong IH, Shin WS, Lee SA.(2003) ―Study on the synthesis of

antiangiogenic (+)-coronarin A and congeners from (+)-sclareolide‖, Bioorg

Med Chem Lett, 13, pp. 2009 –12.

27. Phillipine Medicinal Plants www.stuartxchange.org/Kamia.html

28. Qing Z., Xin H., Yun S.W, Cheng Z., HAO X.J., (2003) ―Two New

Diterpenoids from Hedychium forrestii‖, Chinese Chemical Letters,14(11),

pp. 1141 – 1143.

29. Sabulal, B. George, V., Dan, M., Pradeep, N.S. (2007), ―Chemical composition

and antimicrobial activities of the essential oils from the rhizomes of four

Hedychium species from South India‖, Journal of essential oil research,19,

pp. 1-5.

30. Sirirugsa, P. & Larsen K. (1995), ―The genus Hedychium (Zingiberaceae) in

Thailand‖ , Nordic Journal of Botany,15(3), pp. 301–304.

31. Shrotriya S, Ali MS, Saha A, Bachar SC, Islam M.S., (2007) ―Anti-

inflammatory and analgesic effects of Hedychium coronarium Koen‖, Pak.

J. Pharm. Sci., 20(1), pp. 42-47.

32. Suresh G., Reddy P. P., Babu K.S., Shaik T B, Kalivendi S. V., (2010), ―Two

new cytotoxic labdane diterpenes from the rhizomes of Hedychium

coronarium‖, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20, pp. 7544–7548

33. Taveira F.N., Oliveira1 A.B., Souza Filho J.D., Braga F.C, (2005) ―Epimers of

labdane diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium J. Koenig‖,

Revista Brasileira de Farmacognosia, Brazilian Journal of Pharmacognosy,

15(1), pp. 55-59.

34. Valkenburg J. L. C. H. van & Bunyapraphatsara N,(2002) ―Plant resource of

South – east asia‖, Medicinal and poisonous plants ,12(2).

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ GC – MS của tinh dầu thân rễ ngải tiên…………………………73

Phụ lục 2. Kết quả thử hoạt tính kháng VSVKĐ

của tinh dầu, cặn E và cặn H…………………………………………………......74

Phụ lục 3. Kết quả thử hoạt tính chống ung thư của P5 (Coronarin D)……..…....75

Phụ lục 4. Phổ IR của hợp chất P7………………………………………………..76

Phụ lục 5: Phổ khối của hợp chất P7………………………………………….......77 Phụ lục 6. Phổ 1H - NMR của hợp chất P7………………………………….…….78 Phụ lục 7: Phổ 13C - NMR của hợp chất P7………………………………….…....79 Phụ lục 8. Phổ DEPT của hợp chất P7………………………………………….…80

Phụ lục 9: Phổ HSQC của hợp chất P7………………………………………….…81

Phụ lục 10. Phổ HMBC của hợp chất P7………………………………………….82

Phụ lục 11. Phổ IR của hợp chất P5……………………………………………….83

Phụ lục 12: Phổ khối của hợp chất P5……………………………………….…...84 Phụ lục 13. Phổ 1H - NMR của hợp chất P5…………………………………….85 Phụ lục 14: Phổ 13C - NMR của hợp chất P5…………………………………....86 Phụ lục 15. Phổ DEPT của hợp chất P5………………………………………....87

Phụ lục 16: Phổ HSQC của hợp chất P5…………………………………….…..88

Phụ lục 17. Phổ HMBC của hợp chất P5………………………………………..89

Phụ lục 18. Phổ NOESY của hợp chất P5…………………………………….…90

Phụ lục 19. Phổ IR của hợp chất H6………….………………………………....91

Phụ lục 20: Phổ khối của hợp chất H6…………………………………………..92 Phụ lục 21. Phổ 1H - NMR của hợp chất H6……………………………………93 Phụ lục 22a: Phổ 13C - NMR của hợp chất H6………………………………….94 Phụ lục 22b: Phổ 13C - NMR của hợp chất H6……………………………...….95 Phụ lục 22c: Phổ 13C - NMR của hợp chất H6………………………………….96 Phụ lục 23. Phổ DEPT của hợp chất H6………………………………………..97

Phụ lục 24: Phổ HSQC của hợp chất H6……………………………………….98

Phụ lục 25. Phổ HMBC của hợp chất H6…………………………….……...…99

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây ngải tiên ( Hedychium coronarium Koenig)

Nội dung chính của luận văn được trình bày nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây ngải tiên ( Hedychium coronarium Koenig). Để hiểu rõ hơn, mời các bạn tham khảo chi tiết nội dung luận văn này.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----------

NGUYỄN THỊ MAI PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG CÂY NGẢI TIÊN HEDYCHIUM CORONARIUM KOENIG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI, 2011

Nguyễn Thị Mai Phƣơng

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG CÂY NGẢI TIÊN HEDYCHIUM CORONARIUM KOENIG

MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1

LỜI MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Khái quát về chi Hedychium

1.1.1 Đặc điểm thực vật học

1.1.2. Thành phần hóa học của chi Hedychium

1.1.3. Hoạt chất sinh học trong thân rễ các loài của chi Hedychium

1.1.4. Ứng dụng của các loài thuộc chi Hedychium

1.2. Tổng quan về cây ngải tiên

1.2.1. Xuất xứ:

1.2.2. Một số đặc điểm thực vật

1.2.3. Thành phần hóa học của cây ngải tiên (Hedychium coronarium

Koenig)

1. 2.3.1.Tecpenoid và tinh dầu ngải tiên:

1. 2.3.2. Sesquiterpenoid và diterpenoid:

4. coronarin A (2S,4R,4aS,8aS)-4-

5. Coronarin B C20H30O4

1.2.3.3. Các hợp chất C6 – C3: Xuất xứ của dãy các hợp chất C6 – C3 (phenylpropanoid) là axit Shikimic – rất phổ

1.2.3.4. Các hợp chất C6 – C3 – C6 :

1.2.3.5. Các hợp chất Steroids:

1. 2.4. Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây ngải tiên

1.2.4.1. Hoạt tính sinh học và tác dụng của tinh dầu:

1.2.4.2. Hoạt tính sinh học của các chất được chiết từ thân rễ.

1. 2.5. Tình hình nghiên cứu về cây Hedychium coronarium tại Việt Nam

1.2.6. Ứng dụng của cây ngải tiên Hedychium coronarium Koenig.

CHƢƠNG 2: ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ

THỰC NGHIỆM

2.1. Đề tài, mục tiêu và nhiệm vụ

2.1.1. Tên đề tài:

2.1.2. Mục tiêu của đề tài

2.1.3. Nhiệm vụ của đề tài

2.2. Các phương tiện nghiên cứu

2.2.1. Thiết bị nghiên cứu

2.2.2. Dụng cụ

2.2.3. Các hóa chất

2.3. THỰC NGHIỆM

2.3.1. Mẫu thực vật và phương pháp xử lí:

2.3.2. Điều chế tinh dầu thân rễ ngải tiên.

2.3.3. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên:

2.3.4. Chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong củ ngải tiên:

2.3.5. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity)

2.3.6. Khảo sát các cặn chiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)

2.3.7. Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của các chất trong các cặn chiết

2.3.7.1. Phân lập các chất trong cặn chiết Etyl axetat

2.3.7.2. Phân lập các chất trong cặn chiết bằng n- hexan:

2.3.8. Các hằng số vật lí và các số liệu phổ của các chất thu được.

2.3.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được:

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đối tượng và đề tài nghiên cứu:

3.2. Nghiên cứu tinh dầu của thân rễ cây ngải tiên:

3.2.1. Điều chế tinh dầu:

3.2.2. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên:

3.3. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong củ cây Ngải tiên

(Hedychium coronarium Koenig).

3.3.1. Chiết chọn lọc các chất có hoạt tính sinh học trong củ ngải tiên.

3.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu và cặn chiết

của củ ngải tiên

Tinh dầu 200

3.3.3. Phân lập các hợp chất trong cặn chiết H và E của thân rễ ngải tiên.

3.3.3.1. Khảo sát các cặn chiết H và E bằng SKLM.

3.3.3.2. Phân lập các chất tinh khiết trong các cặn chiết E và H

3.3.4. Xác định cấu trúc phân tử của các chất phân lập được.

3.3.4.1. Xác định cấu tạo phân tử của hợp chất P7

3.3.4.2. Xác định cấu trúc phân tử của hợp chất P5

Độ bội, J(Hz) của P5

Vị trí C C (ppm) của P5

H (ppm) của P5

C (ppm) của coronarin D [11] 39,12

H (ppm) của coronarin D [11]

3.3.4.3. Xác định cấu trúc phân tử H6

H6/a

3a