Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - - - -  - - - - - ĐÀO THU TRANG

TÁCH DÒNG, THIẾT KẾ VECTOR VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TÍCH LŨY ASEN VÀO CÂY THUỐC LÁ Chuyên ngành sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Lê Thị Bích Thủy

HÀ NỘI, 12/2015

Công trình được hoàn thành tại: - Phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Bích Thủy

Viện CNSH, Viện HL KHCN VN

Viện Hóa sinh biển, Viện HL KHCN VN

Phản biện 1: PGS. TS. Lê Văn Sơn Viện CNSH, Viện HL KHCN VN Phản biện 2: TS. Hồ Quỳnh Liên Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn họp tại: Nhà A11, tầng 2, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vào hồi 08 giờ30 ngày 22 tháng 12 năm 2015 Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên - Thư viện Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Bích Thủy, trưởng

phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình và tạo mọi

điều kiện về hóa chất cũng như trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành quá trình học

tập và nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn tập thể các cán bộ phòng Di truyền tế bào thực vật đã nhiệt tình

giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học và hoàn

thành luận văn.

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo cùng cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và tài

nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giảng dạy và

tạo điều kiện cho tôi được học tập tại đây.

Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn tới gia đình và bạn bè đã quan tâm, động viên

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Hà Nội, tháng 12, năm 2015

Học viên

Đào Thu Trang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3

1. Tổng quan về tình hình ô nhiễm KLN ............................................................ 3

1.1. Tình hình ô nhiễm KLN trên thế giới ........................................................ 3

1.2. Tình hình ô nhiễm kim loại nặng ở Việt Nam .......................................... 3

2. Tổng quan chung về Asen ................................................................................ 5

2.1. Asen và độc tính của asen .......................................................................... 5

2.2. Sự phơi nhiễm Asen ................................................................................... 6

2.3. Tác động của nhiễm độc Asen đến sức khỏe con người .......................... 8

2.4. Điều trị nhiễm độc Asen ở người ............................................................... 8

3. Các phương pháp xử lý ô nhiễm KLN ............................................................ 8

3.1. Phương pháp truyền thống ........................................................................ 8

3.1.1. Phương pháp cơ học ............................................................................ 9

3.1.2. Phương pháp vật lý và hoá học ............................................................ 9

3.2. Công nghệ xử lý KLN trong đất bằng thực vật ....................................... 10

3.3. Các nghiên cứu về biện pháp xử lý KLN bằng thực vật sử dụng công

nghệ gen ........................................................................................................... 13

3.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 13

3.3.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................... 15

4. Chuyển gen ở thực vật .................................................................................... 18

4.1. Cơ sở khoa học của chuyển gen thực vật ................................................ 18

4.2. Giới thiệu chung về vector sử dụng trong chuyển gen thực vật ............ 19

4.2.1. Các hệ thống vector sử dụng trong chuyển gen thực vật ................... 19

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 23 2.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 23

2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 23

2.2.1. Nguyên vật liệu ...................................................................................... 23

2.2.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................ 23

2.2.2.1. Hóa chất .......................................................................................... 23

2.2.2.2. Thiết bị............................................................................................. 24

2.2.3. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 24

2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 25

2.3.1. Nuôi cấy và lưu giữ chủng khuẩn ........................................................ 25

2.3.2. Phương pháp tách ARN ........................................................................ 25

2.3.3. Phương pháp tổng hợp cDNA .............................................................. 26

2.3.4. Phương pháp xử lý với enzym giới hạn ................................................ 26

2.3.5. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli .................. 27

2.3.6. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmid của vi khuẩn

E.coli................................................................................................................. 28

2.3.7. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens

bằng xung điện ................................................................................................ 29

2.3.8. Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens

(theo Topping, 1998 ) ....................................................................................... 29

2.3.9. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thuốc lá ............................... 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................. 32

3.1. Tách dòng gen arsC từ RNA của cây dương xỉ Pityrogramma

calomelanos .......................................................................................................... 32

3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số ............................................................ 32

3.1.2. Phản ứng RT-PCR ................................................................................ 32

3.1.3. Biến nạp cấu trúc gen arsC vào vector tách dòng pBT ....................... 33

3.1.4. Kiểm tra vector pBT-arsC...................................................................... 34

3.1.5. Xác định trình tự gen trình tự gen arsC ............................................... 36

3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen arsC ................................ 38

3.2.1. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCambia 1301 .............................. 38

3.2.2. Kết quả kiểm tra vector pCambia 1301-arsC........................................ 40

3.3. Biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301-arsC vào chủng vi khuẩn A.

tumefaciens C58. .................................................................................................. 42

3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen arsC ............................................. 43

3.5. Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR .......................................................... 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 50 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

As Asen

Amp Ampicillin

BAP 6-benzenladenine

Bp Base pair

DNA Deoxyribonucleic Acid

dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate

EDTA Ethylene Diamine tetra- acetate Acid

Gus Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase

Kb Kilo base

LB Môi trường theo Luria và Bertani

MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog

NAA Naphthalene Acetic Acid

OD Optical density

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic Acid

SDS Sodium dodecyl sulfate

TAE Tris bazơ – Axit acetic – EDTA

Taq Thermus aquaticus

TBKB Tế bào khả biến

T-DNA Transferred-DNA

Ti-plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u

UV Ultraviolet (light)

Vir Virulence region = vùng gây độc

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh về Asen ........................................................................................ 5

Hình 1.2: Mô hình xâm nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật ................... 19

Hình 3.1. RNA tổng số tách từ lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos chưa xử lý Dnase ..................................................................................................................... 32

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR. .......................................... 33

Hình 3.3. Kết quả tách chiết plasmid pBT- arsC ...................................................... 34 Hình 3.4. Kết quả PCR pBT-arsC với cặp mồi đặc hiệu .......................................... 35

Hình 3.5. Kết quả cắt pBT-arsC bằng BamHI, M: Marker Fermentas 1kb,1-4: Sản

phẩm cắt pBT-ArsC bằng BamHI. ............................................................................ 35

Hình 3.6. Kết quả cắt pBT-arsC bằng NcoI và Eco72I ........................................... 36

Hình 3.7. So sánh trình tự đoạn gen phân lập từ lá cây dương xỉ Pityrogramma

calomelanos với trình tự được công bố trên ngân hàng gen NCBI (X80057.1). ................ 37

Hình 3.8. Độ tương đồng các axit amin khi so sánh 2 trình tự ................................. 38

Hình 3.9. Sơ đồ cấu trúc vector pCambia 1301-arsC ............................................... 38

Hình 3.10. Sản phẩm cắt plasmid pCambia1301 và pBT-arsC ................................ 39

Hình 3.11. Sản phẩm tinh sạch pCambia1301 và gen arsC sau khi cắt bằng enzyme

NcoI và Eco72I .......................................................................................................... 40

Hình 3.12: Kết quả tách chiết plasmid pCambia1301–arsC ..................................... 41

Hình 3.13: Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen arsC ....................................... 41

Hình 3.14. Sản phẩm cắt pCambia1301-arsC bằng enzyme NcoI và Eco72I .................. 42

Hình 3.15. Kết quả phản ứng Colony- PCR của 10 khuẩn lạc A.tumefaciens C58 được biến nạp pCambia1301- arsC ......................................................................... 43

Hình 3.16. Hình ảnh chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen .................. 45

Hình 3.17. Hình ảnh chồi thuốc lá trong môi trường đa chồi bổ sung hygromycin

10mg/l và cefotaxime 500mg/l.................................................................................. 45

Hình 3.18. Khả năng ra rễ của các chồi trên môi trường RM hygromycin 10mg/l sau

3 tuần nuôi cấy. ......................................................................................................... 46 Hình 3.19. Cây thuốc lá hoàn chỉnh được trồng trong bầu đất: trấu: cát .................. 47 Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng thuốc lá chuyển gen .............. 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Danh mục thiết bị...................................................................................... 24

Bảng 2.2. Phản ứng tổng hợp cDNA ........................................................................ 26

Bảng 2.3. Phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn ................................................... 27

Bảng 2.4. Phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector ................................................... 27

Bảng 3.1: Tỉ lệ tái sinh của các mẫu qua các giai đoạn ............................................ 44

MỞ ĐẦU

Tình hình ô nhiễm môi trường nói chung và ô nhiễm kim loại nặng nói riêng

đang trở thành vấn đề hết sức cấp bách của xã hội hiện đại. Công nghiệp ngày càng

phát triển dẫn tới các chất thải độc hại không được xử lý hay xử lý không đạt yêu

cầu giải phóng vào môi trường là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tình trạng ô nhiễm

kim loại nặng nghiêm trọng. Kim loại nặng (KLN) có Hg, Cd, Pb, As, Sb, Cr, Cu,

Zn, Mn, v.v... thường không tham gia hoặc ít tham gia vào quá trình sinh hoá của

các thể sinh vật và thường tích luỹ trong cơ thể chúng. Vì vậy, KLN thường là các

nguyên tố độc hại với sinh vật. Ở Mỹ, hiện có trên 43.000 vùng công nghiệp trọng

điểm đang trong tình trạng ô nhiễm, trong đó trên 40% là ô nhiễm KLN như: Chì

(Pb), Cadmium (Cd), Crôm (Cr), Asen (As). Theo số liệu của tổ chức y tế thế giới

về ô nhiễm Asen trong nguồn nước, nồng độ Asen trong khu vực nam Iowa và tây

Missouri của Mỹ dao động từ 0,034- 0,490 mg/l, Mexico từ 0,008-0,624 mg/l, có

tới 50% số mẫu có nồng độ Asen >0,050mg/l. Bệnh nhiễm độc Asen mãn tính do sử

dụng nguồn nước bị ô nhiễm Asen (Arsenicosis) xảy ra ở nhiều nước trên thế giới

và mang tính dịch tễ địa phương rõ rệt.

Gần đây tình trạng nhiễm độc Asen đã được báo động, không chỉ ở các quốc

gia trên thế giới như Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc…mà ở Việt Nam cũng đã gia tăng

ngày càng nhiều. Điển hình như khu vực Quỳnh Lôi, Hai Bà Trưng (Hà Nội) đã có

nhiều gia đình phải chịu hậu quả và di chứng nặng nề do nhiễm độc Asen, nhiều

trường hợp đã tử vong. Với tình trạng khoan giếng bừa bãi như hiện nay, đa số

nguồn nước sau khi khoan lên sẽ được sử dụng trực tiếp mà không qua xử lý triệt

để, thường chỉ sử dụng biện pháp thô sơ như: lắng, lọc để lấy nước trong…Các biện

pháp này không thể loại bỏ được các kim loại nặng còn lẫn trong nước, lại thiếu sự

kiểm soát và hướng dẫn của các cơ quan chức năng nên chất lượng nước làm ảnh

hưởng đến sức khỏe người dân là điều khó tránh khỏi. Ở Hà Nội 40% giếng khoan

có hàm lượng As lớn hơn mức an toàn nhiều lần.

As hay còn gọi là thạch tím là chất rất độc. Các hợp chất As vô cơ được xếp

vào nhóm A các chất gây ung thư ở người và gây ung thư da, phổi, thận và gan, phá

hủy hệ thần kinh. Ngoài ra, As còn gây các bệnh về tim mạch, tiểu đường và thiếu

1

máu, ảnh hưởng đến hệ sinh sản và miễn dịch. Chính vì thế, giải quyết được vấn đề

ô nhiễm As đang là vấn đề thời sự rất cấp thiết hiện nay.

Xử lý ô nhiễm KLN là một quá trình đòi hỏi công nghệ phức tạp và vốn đầu tư

cao. Để xử lý đất ô nhiễm người ta thường sử dụng các phương pháp truyền thống

như: rửa đất, cố định các chất ô nhiễm bằng hoá học hoặc vật lý, xử lý nhiệt, trao

đổi ion, ôxi hoá hoặc khử các chất ô nhiễm, đào đất bị ô nhiễm để chuyển đi đến

những nơi chôn lấp thích hợp,...Hầu hết các phương pháp đó rất tốn kém về kinh

phí, giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích...Gần đây, nhờ những hiểu biết về

cơ chế hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu và loại bỏ KLN của một số loài thực vật,

người ta đã bắt đầu chú ý đến khả năng sử dụng thực vật để xử lý môi trường như

một công nghệ đặc biệt. Khả năng làm sạch môi trường của thực vật đã được biết từ

thế kỷ XVIII, tuy nhiên đến những năm 1990 phương pháp này mới được nhắc đến

như một loại công nghệ mới dùng để xử lý môi trường đất và nước bị ô nhiễm bởi

các kim loại, các hợp chất hữu cơ, thuốc súng và các chất phóng xạ.

Việc nghiên cứu một số gen liên quan đến hấp thụ KLN nói chung và As nói

riêng trên thế giới đã thu được những kết quả nhất định, mở ra triển vọng áp dụng

công nghệ gen vào tạo thực vật có khả năng hấp thụ và tích lũy KLN cao để phát

triển công nghệ xử lý chất thải KLN bằng thực vật. So với những nghiên cứu tại

các nước tiên tiến, ở Việt Nam chưa có công trình nào sử dụng công nghệ gen để

tạo thực vật có khả năng hấp thụ và tích lũy KLN. Hầu hết các nghiên cứu tập

trung đánh giá và sử dụng các loài cây sẵn có khả năng tích lũy KLN trong tự

nhiên cho mục đích cải tạo môi trường bằng thực vật hoặc bằng phương pháp xử

lý truyền thống. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Tách dòng, thiết kế vector và

chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá”. Đây là một hướng

nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn với mục đích cải tạo môi trường

bằng thực vật ở Việt Nam.

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Tổng quan về tình hình ô nhiễm KLN

1.1. Tình hình ô nhiễm KLN trên thế giới

Thế giới đang ngày càng phát triển làm con người phải đối mặt với nạn ô

nhiễm môi trường trong đó ô nhiễm KLN đang là vấn đề đáng báo động hiện nay.

Nguyên nhân chủ yếu là do hoạt động của con người như: khai khoáng, nấu kim

loại, mạ điện, sản xuất nhiên liệu chất cháy nổ, sử dụng phân bón và chất thải từ các

vùng dân cư và các khu công nghiệp . Trong mười năm qua, các nhà khoa học thế

giới đã nhận thấy rằng nhiều nước gặp phải vấn đề nghiêm trọng cho sức khỏe cộng

đồng do ô nhiễm Asen trong môi trường ngày càng tăng. Các quốc gia này bao gồm

Ấn Độ, Đài Loan, Arhentina, Thái Lan, Mông Cổ, Mexico, Chile, Trung Quốc và

Bangladesh (Willard Chappell 1999).

Ở Mỹ, hiện có trên 43.000 vùng công nghiệp trọng điểm đang trong tình trạng

ô nhiễm, trong đó trên 40% là ô nhiễm KLN như: Pb, Cd, Cr, As. Mỗi năm ngân

sách nước Mỹ phải tốn 1,5 tỷ USD cho việc xử lý và ngăn chặn ô nhiễm. Trong

năm 2005, ước tính lượng nước thải của Trung Quốc lên tới 31 tỷ tấn, kim loại nặng

lên tới 15 triệu tấn, khoảng 20% đất nông nghiệp của Trung Quốc bị nhiễm kim loại

nặng làm mất 10 triệu tấn hoa màu mỗi năm. Viện hàn lâm khoa học Trung Quốc,

đã phát hiện đất ở nhiều khu vực có chứa As ở mức cao (Liao X 2004).

Theo số liệu của tổ chức y tế thế giới về ô nhiễm As trong nguồn nước, nồng

độ As trong khu vực nam Iowa và tây Missouri của Mỹ dao động từ 0,034- 0,490

mg/l, Mexico từ 0,008-0,624 mg/l, có tới 50% số mẫu có nồng độ As >0,050mg/l.

Bệnh nhiễm độc As mãn tính do sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm As xảy ra ở nhiều

nước trên thế giới và mang tính dịch tễ địa phương rõ rệt.

1.2. Tình hình ô nhiễm kim loại nặng ở Việt Nam

Ở Việt Nam việc phát triển kinh tế và mức độ đô thị hoá cao cũng là nguyên

nhân dẫn đến sự xuống cấp nghiêm trọng của hệ sinh thái. Ô nhiễm môi trường nhất

là KLN ở nước ta đang là một vấn đề đáng lo ngại. KLN xuất phát từ rất nhiều

nguồn khác nhau như: các khu công nghiệp, mỏ khai thác kim loại, bãi rác, làng

nghề, hoạt động sản xuất nông nghiệp. Hầu hết các KLN như As, Cd, Zn, Cu, Pb,

3

Hg ... đều tìm thấy trong các chất thải. Trong đó As và Cd là phổ biến. Kết quả phân

tích đất trồng ở khu vực mỏ thiếc Sơn Dương, Tuyên Quang có hàm lượng As là

642mg/kg và Cu là 235mg/kg (Bùi Thị Kim Anh 2011), trong khi tiêu chuẩn đặt ra

tương ứng là 12 mg/kg và 50mg/kg (QCVN 03:2008/BTNMT).

Đầu những năm 1990, vấn đề ô nhiễm As được biết đến qua các nghiên cứu

của Viện Địa Chất và các liên đoàn địa chất về đặc điểm địa chất thủy văn và đặc

điểm phân bố As trong tự nhiên. Theo nghiên cứu khảo sát phân tích nước bề mặt

và các nguồn nước đổ ra sông Mã ở khu vực Đông Nam bản Phúng, hàm lượng As

trong các mẫu nước đều vượt quá 0,05 mg/l. Kết hợp với điều tra của trường đại học

Y Hà Nội cho thấy, sự ô nhiễm này có khả năng ảnh hưởng đến sức khỏe dân cư

sống ở khu vực đó. Từ những năm 1995-2000, nhiều công trình nghiên cứu điều tra

về nguồn gốc As có trong nước ngầm, mức độ ô nhiễm, chu trình vận chuyển… đã

tìm thấy nồng độ As trong các mẫu nước khảo sát ở khu vực thượng lưu sông Mã,

Sơn La, Phú Thọ, Bắc Giang, Hưng Yên, Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Thanh

Hóa… đều vược tiêu chuẩn cho phép đối với nước sinh hoạt của Quốc Tế và Việt

Nam (Đặng Đình Kim 2010).

Trước tình hình đó, trong hơn 2 năm (2003-2005), chính phủ Việt Nam và

UNICEF đã khảo sát về nồng độ As trong nước của 71.000 giếng khoan thuộc 17 tỉnh

từ đồng bằng miền Bắc, Trung, Nam. Kết quả phân tích cho thấy nguồn nước giếng

khoan ở các tỉnh vùng lưu vực Sông Hồng như : Hà Nam, Nam Định, Hà Tây, Hưng

Yên, Hải Dương và các tỉnh thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long như : An Giang, Đồng

Tháp đều bị nhiễm As rất cao. Tỷ lệ các giếng có nồng độ As từ 0,1 mg/l đến > 0,5

mg/l (cao hơn tiêu chuẩn cho phép của Việt Nam và tổ chức Y Tế Thế Giới 10-50

lần) của các xã dao động từ 59,6-80%. Có thể thấy tình trạng ô nhiễm As trong nguồn

nước của các giếng khoan tại các xã là rất nghiêm trọng. Tỷ lệ các giếng có nồng độ

As cao > 0,1 mg/l (gấp hơn 10 lần tiêu chuẩn cho phép) ở hầu hết các xã chiếm từ

70%- 96% trừ Mai Động có tỷ lệ thấp hơn (46%)(Nguyễn Khắc Hải 2006) .

Hiện nay, chính phủ đã có kế hoạch hành động quốc gia về giảm thiểu ô

nhiễm As ở Việt Nam với các nội dung tiến hành khảo sát toàn quốc để xác định

mức độ ô nhiễm As ở nguồn nước ngầm các khu vực khác nhau, xây dựng bản đồ ô

nhiễm As ở Việt Nam, đánh giá thực trạng ảnh hưởng của ô nhiễm As trong nguồn

4

nước sinh hoạt tới sức khỏe của cộng đồng và xây dựng các biện pháp phòng chống,

nghiên cứu và áp dụng các giải pháp làm giảm thiểu ô nhiễm As trong nguồn nước,

tăng cường thông tin tuyên truyền nâng cao nhận thức của cộng đồng về vệ sinh

nguồn nước, phòng chống bệnh tật do sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm nói chung và

ô nhiễm As nói riêng.

2. Tổng quan chung về Asen

2.1. Asen và độc tính của asen

Asen hay còn gọi là thạch tín, một nguyên tố hóa học có ký hiệu As và số

nguyên tử 33. Khối lượng nguyên tử của nó bằng 74,92.

Nguyên tố As Arsenic

Hình 1.1: Hình ảnh về Asen

As là một á kim gây ngộ độc khét tiếng và có nhiều dạng thù hình: màu vàng

(phân tử phi kim) và một vài dạng màu đen và xám (á kim). Ba dạng có tính kim

loại của As với cấu trúc tinh thể khác nhau cũng được tìm thấy trong tự nhiên (các

khoáng vật asen sensu stricto và hiếm hơn là asenolamprit, parasenolamprit). As

hay tồn tại dưới dạng các hợp chất asenua và asenat. Trạng thái oxy hóa phổ biến

nhất của nó là -3 (asenua: thông thường trong các hợp chất liên kim loại tương tự

như hợp kim), +3 (asenat (III) hay asenit và phần lớn các hợp chất asen hữu cơ), +5

(asenat (V): phần lớn các hợp chất vô cơ chứa oxy của asen ổn định). As cũng dễ tự

liên kết với chính nó, chẳng hạn tạo thành các cặp As-As trong sulfua đỏ (α-As4S4) 3- vuông trong khoáng coban asenua có tên skutterudit. Ở trạng thái và các ion As4

ôxi hóa +3, tính chất hóa học lập thể của As chịu ảnh hưởng bởi sự có mặt của cặp

electron không liên kết.

5

As về tính chất hóa học rất giống với nguyên tố đứng trên nó là phốt pho.

Tương tự như phốt pho, nó tạo thành các oxit kết tinh, không màu, không mùi như

As2O3và As2O5 là những chất hút ẩm và dễ dàng hòa tan trong nước để tạo thành

các dung dịch có tính axit. Tương tự như phốtpho, As tạo thành hidrua dạng khí và

không ổn định, đó là arsin (AsH3). Do vậy, As sẽ thay thế phần nào cho phốt pho

trong các phản ứng hóa sinh học và vì thế nó gây ra ngộ độc.

Theo nghiên cứu của Thomas và cộng sự, As vô cơ ở trạng thái hóa trị ba có

độc tính cao hơn nhiều so với As vô cơ ở trạng thái hóa trị năm. Ý tưởng này xuất

phát từ các thí nghiệm về liều tử vong cấp tính trên động vật (Thomas D. J. et al

2001). As hóa trị năm bị khử trong cơ thể thành As hóa trị ba (mà sau đó bị methyl

hóa) nên nó tác động giống như As hóa trị ba, với giả thiết rằng phản ứng khử đủ

nhanh so với thời gian bán hủy. Thông thường giai đoạn methyl hóa trong quá trình

trao đổi chất thường được cho là bước giải độc. Gần đây hai nhóm nghiên cứu của

Aposhian và cộng sự, Styblo và cộng sự đã công bố rằng, trạng thái As hóa trị ba

của monomethyl arsenic độc hơn nhiều so với các dạng vô cơ, các dạng hóa trị năm

của monomethyl và dimethyl arsenic thì kém độc hơn (Aposhian H.V et al 2001,

Styblo M. and Lin S. 2001). Việc phát triển các phương pháp phân tích trạng thái

hóa trị ba của monomethyl arsenic sẽ cho phép tiến hành các nghiên cứu này.

2.2. Sự phơi nhiễm Asen

Sự phơi nhiễm có thể xảy ra qua nước và không khí. Sự phơi nhiễm cũng có

thể là từ việc sử dụng thực phẩm và các thuốc cổ truyền cũng như từ các chất thải

độc hại như phế thải khai thác mỏ. Ở Tây Bengal và Bangladesh xảy ra phơi nhiễm

từ việc uống nước ngầm được bơm lên từ các “giếng khoan” (Chowdhurry T.R.

1997, Chowdhurry T.R. et al 1999). Các nhà nghiên cứu ở Nội Mông đã nghiên cứu

về các tác hại đến sức khỏe từ việc sử dụng nước ngầm với nồng độ As cao. Ở các

nước này As hòa tan trong nước ngầm có thể có nguồn gốc tự nhiên. Tuy nhiên một

vài nghiên cứu cho thấy rằng ở Tây Bengal và Bangladesh, As liên kết với đá gốc

được giải phóng vào nước do việc bơm hút quá nhiều nước phục vụ cho thủy lợi

trong những năm gần đây.

Nước bề mặt cũng có thể chứa As với nồng độ cao. Hàm lượng As cao trong

nước bề mặt ở Thái lan và Chile đã gây ra các triệu chứng nhiễm độc As

6

(Choprapawon C. ; Ajjimangkul S. 1999, Sancha A.M. 1999) . Ở Thái Lan mức As

tăng cao là do các chất thải từ các hoạt động khai thác mỏ thiếc.

Nồng độ As gia tăng trong không khí có thể do việc đốt than có chứa As cao,

như ở Slovakia (Bencko V. 1997) và Trung Quốc (Sun G.F. 1999) dùng than cho

nhà máy nhiệt điện. Ở tỉnh Guizhou, Trung Quốc, nhiều gia đình dùng loại than có

chứa hàm lượng As cao để sấy khô các nông phẩm được treo trên trần nhà. Họ đốt

than trong một cái hố dưới nền nhà hoặc trong một cái lò không có ống khói hoặc

ống xả. Điều này dẫn tới nồng độ As rất cao trong không khí và thấm sâu vào thực

phẩm.

Đất cũng là một nguồn phơi nhiễm As. Sự ô nhiễm đất có thể xảy ra do tiếp xúc

với các chất thải rắn như chất thải hầm mỏ, hay với bùn cống có As nồng độ cao. Đất

bị nhiễm As cũng có thể do sử dụng tưới tiêu bằng nước có chứa nhiều As, hay từ việc

sử dụng các thuốc trừ sâu hay diệt cỏ chứa As (Folks D. J. 2001). Các loại đất này có

thể gây ô nhiễm cho các loại cây lương thực mà con người hay vật nuôi ăn phải và làm

giảm năng suất mùa màng.

As là một nguyên tố tồn tại trong tự nhiên và có thể được tìm thấy trong bất kỳ

mẫu vật chất nào nếu như sử dụng một phương pháp phân tích đủ nhạy. Thông thường

As dạng vô cơ có độc tính cao gấp rất nhiều lần so với dạng hữu cơ. Trong thực phẩm,

phần lớn As ở dạng hữu cơ và chỉ một lượng nhỏ As ở dạng vô cơ. Hàm lượng As vô

cơ cao nhất được phát hiện trong lúa, bột mì, nước nho và rau spinach (Borum D.R. ;

Abernathy C.O. 1994).

Dược phẩm cũng có thể là một nguồn phơi nhiễm As. Năm 1969 các bệnh nhân ở

Anh được cho dùng dung dịch Fowler (potassium arsenite) để điều trị một số loại bệnh

về da (Sasieni P. ; Evans S. ; Cuzick J. 1994). Một số bệnh nhân sử dụng các liều tích

lũy nhiều tới 10g As hoặc hơn dưới dạng vô cơ. Năm 1970, 142 bệnh nhân đã được

khám vào để tìm các dấu hiệu của nhiễm độc As (tăng sừng hóa, sậm màu da hay ung

thư da) cho thấy: 45% có ít nhất một dấu hiệu, 45% bị tăng sừng hóa và 10% bị ung

thư da vào thời điểm tiến hành khám. Theo Choprapawon và Rodeline (1997), hơn 100

ca nhiễm độc As mãn tính có liên quan đến việc sử dụng các loại thuốc cổ truyền ở

Thái Lan (Choprapawon C. ; Rodcline A. 1997).

7

2.3. Tác động của nhiễm độc Asen đến sức khỏe con người

Các triệu chứng cổ điển của nhiễm độc As như sậm màu da, tăng sừng hóa và

ung thư da đã được biết đến từ lâu. Từ những năm 1970 và đặc biệt trong thập kỷ

qua, tình trạng phơi nhiễm As gia tăng gây ra nhiều tác động tiêu cực ảnh hưởng

xấu tới sức khỏe con người, tiêu biểu là các bệnh về hệ mạch máu ngoại biên (chân

đen) (Guo H. R. and Greene H. L 1994) và các tác động đến hệ thần kinh ngoại biên

(Kilburn K. H. 1997), to chướng gan, các tác động tới hệ thần kinh trung ương,

bệnh đái đường, cao huyết áp, bệnh tim, bệnh xơ gan, bệnh viêm cuống phổi và các

bệnh hô hấp khác (Abernathy C. O.; Calderon R. L. and Chappell W.R. 1997,

Chappell W.R.;Abernathy C.O. and Calderon R.L. 1999). Nhiễm độc As còn gây ra

các bệnh ung thư nghiêm trọng. Trước đây các nghiên cứu chỉ cho thấy As có liên

quan đến bệnh ung thư da, nay có rất nhiều bệnh ung thư nghiêm trọng đều do As

gây ra như: ung thư phổi, ung thư bàng quang, ung thư thận, ung thư mũi, ung thư

ruột kết.

2.4. Điều trị nhiễm độc Asen ở người

Sự phát triển các phương pháp điều trị bệnh nhân nhiễm độc As vẫn còn chậm

chạp. Một trong các hướng tích cực là sử dụng các chất tạo chelat mà đã được

nghiên cứu là có hiệu quả trong điều trị nhiễm độc chì. Vì As không lưu quá lâu

trong cơ thể, nhiều người không cho rằng quá trình tạo chelat là việc điều trị thành

công. Các nghiên cứu ban đầu sử dụng chất tạo chelat DMSA (một dẫn xuất tan

trong nước của dimecaprol) đã không thành công (Guha Mazumder D. N. et al

2001). Tuy nhiên, gần đây Aposhian và cộng sự, Cebrian và cộng sự đã công bố

rằng, 40% đến 60% As lưu giữ trong cơ thể tiêu hóa được bằng việc sử dụng DMPS

(một dẫn xuất tan trong nước của dimecaprol) (Aposhian H. V. 2001, Cebrian M.E.

; Aposhian H.V. 2001). Các nhà nghiên cứu này đã cho biết không có tác động tiêu

cực nào của điều trị bằng DMPS. Họ đã thấy sự cải thiện đáng kể các triệu chứng

của bệnh nhân so với nhóm đối chứng.

3. Các phương pháp xử lý ô nhiễm KLN

3.1. Phương pháp truyền thống

Làm sạch đất ô nhiễm là một quá trình đòi hỏi công nghệ phức tạp và vốn đầu

tư cao. Để xử lý đất ô nhiễm người ta thường sử dụng các phương pháp truyền

8

thống như: rửa đất, cố định các chất ô nhiễm bằng hoá học hoặc vật lý, xử lý nhiệt,

kết tủa hoặc sa lắng thụ động với sắt nguồn tự nhiên, đông tụ, sa lắng, lọc, hấp phụ,

trao đổi ion, oxy hoá hoặc khử các chất ô nhiễm, đào đất bị ô nhiễm để chuyển đi

đến những nơi chôn lấp thích hợp (Murcott S. 2001).

3.1.1. Phương pháp cơ học

Trên thực tế, phương pháp này không có khả năng loại bỏ hoàn toàn KLN.

Tuy nhiên, nó làm hạn chế khả năng thấm ngấm của KLN vào hệ thống nước

ngầm. Phương pháp chôn lấp tại chỗ được đánh giá là an toàn nhất bằng cách xây

đập bê tông chặn xung quanh. Đối với khu vực gần dân cư và đất canh tác thì đất ô

nhiễm phải được đào và vận chuyển đến nơi chôn lấp tập trung. Phương pháp này

có nhược điểm là không những chi phí cao, cần diện tích lớn, đất không được tái sử

dụng mà nó còn gây nguy hiểm trong suốt quá trình vận chuyển.

3.1.2. Phương pháp vật lý và hoá học

Nhóm phương pháp này đang được sử dụng rộng rãi trong việc kiểm soát

và làm giảm bớt mức độ ô nhiễm KLN trong đất. Các phương pháp thường dùng là

(Đặng Đình Kim 2010):

Điện động học: Điện động học liên quan đến sự di chuyển KLN thông qua

một điện trường được phát sinh từ các điện cực trong đất. Kỹ thuật này có hiệu quả

xử lý đất sét bị ô nhiễm KLN: Pb, Cr, Cu, Zn và thường kết hợp với phương pháp

sinh học.

Rửa đất: Phương pháp này được dùng phổ biến ở Đan Mạch, Đức, Hà

Lan… Đất được phân loại sau đó được rửa bằng nước có thể bổ sung thêm axit hoặc

bazơ. KLN được giải phóng từ bề mặt đất vào nước cùng với các hợp chất hữu cơ

cao phân tử. Kỹ thuật này phù hợp để xử lý đất chứa nhiều cát và sỏi. Sau xử lý vẫn

còn một lượng KLN tồn dư trong đất.

Xử lý nhiệt: Phương pháp này dựa vào phản ứng đốt cháy các hợp chất để tạo thành CO2 và nước. Đất được đào lên và đốt ở nhiệt độ cao thường từ 6000C- 17000C, KLN sẽ bị tách khỏi liên kết với đất, thu hồi KLN với tro và đem chôn.

Phương pháp này cũng hữu hiệu trong việc xử lý các KLN dễ bay hơi như thủy

ngân.

9

Cố định các chất ô nhiễm: Phương pháp này dựa vào các phản ứng oxy

hoá khử, phản ứng tạo kết tủa, phản ứng trung hoà, keo tụ hay phân huỷ các chất

độc hại. Có thể sử dụng thuốc thử Dichloromethane để nhận biết sự kết thúc của

phản ứng hoá học. Phương pháp này được dùng để xử lý đất ô nhiễm natri (Na),

nhôm(Al), kẽm (Zn) nhưng thường gây ảnh hưởng đến môi trường do lượng thuốc

thử dư tồn tại trong đất.

Hầu hết các phương pháp truyền thống đều rất tốn kém về kinh phí, giới hạn

về kỹ thuật và hạn chế về diện tích,... Đất sau xử lý vẫn còn chứa một lượng kim

loại nhất định và có thể ảnh hưởng tới môi trường. Hơn nữa phương pháp này còn

tỏ ra kém hiệu quả khi nồng độ kim loại trong đất thấp và mức độ phân tán của kim

loại lớn. Gần đây, nhờ những hiểu biết về cơ chế hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu

và loại bỏ KLN của một số loài thực vật, người ta đã bắt đầu chú ý đến khả năng sử

dụng thực vật để xử lý môi trường như một công nghệ môi trường đặc biệt.

3.2. Công nghệ xử lý KLN trong đất bằng thực vật

Khả năng làm sạch môi trường của thực vật đã được biết từ thế kỷ XVIII bằng

các thí nghiệm của Joseph Priestley, Antoine Lavoissier, Karl Scheele và Jan

Ingenhousz. Tuy nhiên, mãi đến những năm 1990 phương pháp này mới được nhắc

đến như một loại công nghệ mới dùng đề xử lý môi trường đất và nước bị ô nhiễm

bởi các kim loại, các hợp chất hữu cơ, thuốc súng và các chất phóng xạ.

Thực vật có nhiều cách phản ứng khác nhau đối với sự có mặt của các ion kim

loại trong môi trường. Hầu hết, các loài thực vật rất nhạy cảm với sự có mặt của các

ion kim loại, thậm chí ở nồng độ rất thấp. Tuy nhiên, vẫn có một số loài thực vật

không chỉ có khả năng sống được trong môi trường bị ô nhiễm bởi các kim loại độc

hại mà còn có khả năng hấp thụ và tích các kim loại này trong các bộ phận khác

nhau của chúng (Barcelos J. ; Poschenrieder C. 2003).

Trong thực tế, công nghệ xử lý ô nhiễm bằng thực vật đòi hỏi phải đáp ứng

một số điều kiện cơ bản như dễ trồng, có khả năng vận chuyển các chất ô nhiễm từ

đất lên thân nhanh, chống chịu được với nồng độ các chất ô nhiễm cao và cho sinh

khối nhanh (Timothy Oppelt E. 2000, Jerald L. Schnoor 2002, Barcelos J. ;

Poschenrieder C. 2003). Tuy nhiên, hầu hết các loài thực vật có khả năng tích luỹ

10

KLN cao là những loài phát triển chậm và có sinh khối thấp, trong khi các thực vật

cho sinh khối nhanh thường rất nhạy cảm với môi trường có nồng độ kim loại cao.

Xử lý KLN trong đất bằng thực vật có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp

khác nhau phụ thuộc vào từng cơ chế loại bỏ các KLN (Pilon-Smits E. 2005):

Phytodegradation (phân hủy): Các chất ô nhiễm hữu cơ bị phân hủy (chuyển

hóa) hoặc bị khoáng hóa bởi các enzyme chuyên biệt trong tế bào thực vật:

nitroreductases, dehalogenases (phân giải dung môi và thuốc trừ sâu gốc Cl) và

laccases (phân giải anilines). Loài họ Liễu (Populus sp.) và họ rong xương cá

(Myriophyllium spicatum) là những cây có hệ thống enzyme này.

Phytostabilization (cố định): Các chất ô nhiễm hữu cơ hoặc vô cơ, được kết

hợp vào lignin của thành tế bào rễ hoặc vào mùn. Kim loại bị kết tủa do rễ cây tiết

dịch và sau đó chúng bị giữ lại trong đất. Mục tiêu chính của cơ chế này là hạn chế

sự di chuyển và khuếch tán của chất gây ô nhiễm. Loài chi Haumaniastrum (họ

húng), Eragrostis (họ Hòa thảo), Ascolepis (họ Cói), Lay ơn và Alyssum (họ Cải có

hoa) là ví dụ về cây trồng cho mục đích này.

Phytovolatilization (bay hơi): Một số loài cây có khả năng hấp thu và bay hơi

một số kim loại hoặc á kim. Một số nguyên tố của nhóm IIB, VA và VIA của bảng

tuần hoàn (đặc biệt là Hg, Se và As) được hấp thu bởi rễ, được chuyển đổi thành các

dạng không độc hại, và sau đó thải vào khí quyển. Ví dụ: Astragalus bisulcatus

(loài có hoa Họ Đậu) và Stanleya pinnata (họ Cải có hoa) xử lý Se. Loài Nicotiana

tabacum (thuốc lá), Liriodendron tulipifera hoặc Brassica napus (cải dầu) xử lý Hg.

Kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng cho các hợp chất hữu cơ.

Phytoextraction (tách chiết): Rễ hấp thu chất ô nhiễm sau đó chuyển vị và

tích lũy trong các bộ phận bên trên (thân, lá). Cơ chế này chủ yếu được áp dụng cho

việc loại bỏ kim loại (Cd, Ni, Cu, Zn, Pb) hay yếu tố khác (Se, As) và các hợp chất

hữu cơ.

Phytofiltration (lọc): Thực vật hấp thu, tổng hợp và kết tủa các chất ô nhiễm,

đặc biệt là KLN, các yếu tố phóng xạ từ môi trường nước thông qua hệ thống rễ

hoặc cơ quan ngập nước khác của cây. Các thực vật được trồng trong hệ thống thủy

canh, theo đó nước thải đi qua và được "lọc" bởi rễ (Rhizofiltration). Những loài

thực vật có diện tích tiếp xúc lớn, loài thủy sinh có khả năng siêu tích lũy, hấp thu

11

và chịu được điều kiện chất ô nhiễm sẽ cho kết quả xử lý tốt nhất. Loài tiềm năng:

Helianthus annus (hướng dương), Brassica juncea (Cải bẹ xanh), Phragmites

australis, Fontinalis antipyretica và một số loài Salix (liễu), Populus, Lemna và

phân nhánh Callitriche.

Rhizodegradation (phân giải vùng rễ): Rễ phát triển thúc đẩy sự gia tăng vi

sinh vật vùng rễ (chúng sử dụng dịch tiết và các chất chuyển hóa của cây là nguồn

cacbon và năng lượng). Ngoài ra, cây có thể tiết ra các enzymes phân giải sinh

học.Việc áp dụng phytostimulation bị giới hạn đối với chất ô nhiễm hữu cơ.

Những hình thức khác xử lý KLN bằng thực vật là kết hợp hay biến thể của

các hình thức trên bao gồm:

Rào cản thủy lực: Một số loài cây lớn, đặc biệt là những cây có gốc rễ sâu

(Populus sp.), hút nhiều nước ngầm qua quá trình bốc thoát hơi nước. Chất ô nhiễm

trong nước này được chuyển hóa bởi các enzymes và bốc hơi cùng với nước hoặc

đơn giản là cô lập trong mô thực vật.

Thảm thực vật: Các loại thảo mộc, cây bụi hoặc cây lớn, trồng trên các bãi

chôn lấp chất thải, được sử dụng để hạn chế sự xâm nhập của nước mưa, và sự lan

truyền chất ô nhiễm. Rễ tăng thông khí, thúc đẩy phân hủy sinh học, bốc thoát hơi

nước. Những khó khăn của kỹ thuật này là chất thải hạn chế sự phát triển của rễ

cây.

Có nhiều giải thuyết đã được đưa ra để giải thích cơ chế và triển vọng của

công nghệ xử lý KLN bằng thực vật.

Giả thuyết sự hình thành phức hợp: cơ chế loại bỏ các kim loại độc của các

loài thực vậtbằng cách hình thành một phức hợp. Phức hợp này có thể là chất hoà

tan, chất không độc hoặc là phức hợp hữu cơ - kim loại được chuyển đến các bộ

phận của tế bào có các hoạt động trao đổi chất thấp (thành tế bào, không bào), ở đây

chúng được tích luỹ ở dạng các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ bền vững (Saxena PK.

et al 1999, Barcelos J. ; Poschenrieder C. 2003).

Giả thuyết về sự lắng đọng: các loài thực vật tách kim loại ra khỏi đất, tích luỹ

trong các bộ phận của cây, sau đó được loại bỏ qua lá khô, rửa trôi qua biểu bì hoặc bị

đốt cháy.

12

Giả thuyết hấp thụ thụ động: sự tích luỹ kim loại là một sản phẩm phụ của cơ

chế thích nghi đối với điều kiện bất lợi của đất.

Sự tích luỹ kim loại là cơ chế chống lại các điều kiện stress vô sinh hoặc hữu

sinh: hiệu lực của kim loại chống lại các loài vi khuẩn, nấm ký sinh và các loài sinh

vật ăn lá đã được nghiên cứu (Saxena PK. 1999, Schat H. et al 1999, Barcelos J. ;

Poschenrieder C. 2003) .

Trong những năm gần đây, người ta quan tâm rất nhiều về công nghệ sử dụng

thực vật để xử lý môi trường bởi nhiều lý do: diện tích đất bị ô nhiễm ngày càng

tăng, các kiến thức khoa học về cơ chế, chức năng của sinh vật và hệ sinh thái, áp

lực của cộng đồng, sự quan tâm về kinh tế và chính trị... Hai mươi năm trước đây,

các nghiên cứu về lĩnh vực này còn rất ít, nhưng ngày nay, nhiều nhà khoa học đặc

biệt là ở Mỹ và châu Âu đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu cơ bản và ứng dụng công

nghệ này như một công nghệ mang tính chất thương mại. Công nghệ này cũng có

những hạn chế là không thể xem như một công nghệ xử lý tức thời và phổ biến ở

mọi nơi. Tuy nhiên, chiến lược phát triển các chương trình nghiên cứu cơ bản có thể

cung cấp được các giải pháp xử lý đất một cách thân thiện với môi trường và bền

vững. Năm 1998, Cục môi trường Châu Âu (EEA) đánh giá hiệu quả kinh tế của

các phương pháp xử lý KLN trong đất bằng phương pháp truyền thống và phương

pháp sử dụng thực vật tại 1.400.000 vị trí bị ô nhiễm ở Tây Âu. Kết quả cho thấy

chi phí trung bình của phương pháp truyền thống trên 1 hecta đất từ 0,27 đến 1,6

triệu USD, trong khi phương pháp sử dụng thực vật chi phí thấp hơn 10 đến 1000

lần (Barcelos J. ; Poschenrieder C. 2003) .

3.3. Các nghiên cứu về biện pháp xử lý KLN bằng thực vật sử dụng công nghệ

gen

3.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Việc nghiên cứu cơ chế chịu KLN ở thực vật bao gồm quá trình hấp thụ, tích

lũy và vận chuyển đã đạt được nhiều tiến bộ trên thế giới, vì thế việc ứng dụng công

nghệ gen đã thành công trong việc làm tăng tính chống chịu và tích lũy KLN. Để

đạt được điều này, có thể tạo ra nhiều phân tử trung hòa kim loại (De la Fuente

J.M.;Ramirez-Rodriguez V.;Carbera-Ponce J.L. 1997), các chất phytochelatin (Zhu

Y.;Pilon-Smits E.A.H.; Jouanin L.; and Terry N. 1999), metallothionein (Hasegawa

13

I.; Terada E.; Sunairi M.; wakita H.; Shinmachi F.; Noguchi A.; Nakajima M.;

Yazaki J. 1997) hoặc các protein tham gia vào vận chuyển kim loại (Van de Zaal

B.J.; Neuteboom L.W.; Pinas J.E.; Chardonnens S.; Schat H.; Verkleij J.A.;

Hooykaas.C. 1999, Curie C.; Alonso J.M.; Le Jean M.; Rcker J.R.; Briat J.F. 2000).

Đã có nhiều nghiên cứu về gen liên quan đến hấp thụ và vận chuyển KLN như các

gen (ZIP 1, ZIP 2, IRT1 (ion-regulated transporter), AtNramp, AtNramp 3 (metal

transpoter gene family), liên quan đến cácphytochelatin (PC) – CAD1, GmPCS1

(phytochelatin synthase) và metallotionein (MT) – MT1, MT2. Các gen này được

thông báo có liên quan đến tích lũy KLN và khá phổ biến ở thực vật. Các gen CAX

1 và CAX 2 (Cation exchanger) ở Arabidopsis cũng đã được nghiên cứu và được

xác định tham gia vào vận chuyển KLN (Hirschi K.D.;Zhent R.; Cunningham K.W.

1996). Hiện nay, tại Hàn Quốc đã chuyển được nhiều gen có khả năng hấp thụ KLN

tập trung vào một dòng cây Dương (Poplar) có khả năng sinh trưởng nhanh, sinh

khối lớn. Dòng Dương này không có hoa và hiện đang trong quá trình thử nghiệm

trong nhà kính và trên đồng ruộng (Yadav R.; Arora P.; Kumar S. 2010).

Đối với As, gen ars1 mã hóa cho enzyme arsenate reductase tham gia vào

chuyển hóa As ở dạng arsenate độc hại thành arsenit không độc đã được tách từ

dòng Arabidopsis đột biến. Việc chuyển gen arsC với gen khởi động rubisco từ đậu

tương (SRS1p) và gen ECS với gen khởi động actin của nấm men (ACT2p) vào

Arabidopsis đã tạo được cây chuyển gen kháng As hơn cây đối chứng (Dhankher

O.P.; Li Y.; Rosen B.P.; Shi J.; Salt D.; Senecoff J.F.; Sashti N.A.; Meagher R.B.

2002). Một gen cho arsenate reductase khác là PvACR2 đã tách được từ cây dương

xỉ Pteris vitta, đây là cây có khả năng siêu tích lũy (Ellis D.R.; Gumaelius L.;

Indriolo E.; Pickering I.J.; Bank J.A.; Salt D.E. 2006). Mới đây, một nghiên cứu của

chương trình Sinh học tế bào và Phân tử thực vật tại đại học Florida, Gainesville-

Mỹ khi chuyển gen PvGRX5 của cây dương xỉ Trung quốc Pteris vittata siêu tích

lũy As trong lá vào hai dòng Arabidopsis. Tuy nhiên so sánh cho thấy các dòng

Arabidopsis chuyển gen có khả năng chống chịu As cao hơn đáng kể so với với các

dòng đối chứng trong môi trường thử nghiệm, nhưng cho thấy một nghịch lý là sự

tích lũy As giảm kể cả ở mầm, rễ và toàn bộ cây. Kết quả chỉ ra rằng có thể sử dụng

gen PvGRX5 của cây dương xỉ Pteris vittata trong giải pháp công nghệ sinh học

14

hiện đại để làm giảm lượng As ở cây trồng (Sabarrinath S.; Shan W.; Lena Q. M.;

Bala R. 2009).

Nghiên cứu về các loài thực vật tích lũy KLN cho thấy, loài dương xỉ Pteris

vittata và Dennstaedtia scabra, không những có khả năng tích lũy cao As mà còn

có khả năng hấp thu đồng thời các kim loại khác như Mn, Cu, Fe, Zn và Pb. Khi

trong đất bị ô nhiễm có hàm lượng As là 3.528 mg/kg, thì hàm lượng As trong rễ và

thân D. scabra tương ứng là 965,47 mg/kg và 2.241,63 mg/kg (Raskin I.; Smith

R.D.; Salt D.E. 1997). Loài dương xỉ Pteris Vittata có khả năng tích luỹ 14.500

ppm As mà chưa có triệu chứng tổn thương. Loài này sinh trưởng nhanh, có sức

chống chịu cao với As trong đất (As > 1.500 ppm) và chỉ bị độc ở nồng độ 22.630

ppm qua 6 tuần (Prasad M.N.V.; Freitas H.O. 2003). Theo các nhà khoa học Mỹ,

loài Pteris Vittata có thể chứa tới 22 g As/kg lá. Họ cũng đã chứng minh rằng trong

vòng 24 giờ, loài dương xỉ này giảm mức As trong nước từ 200 g/l xuống gần 100

lần, dưới mức cho phép của Mỹ (10 g/l) (Ma J. Q. ; Komar M. ; Zhang T.W .; Cai

Y. ; Kenelley E.D. 2001). Một công bố mới nhất về thực vật tích lũy As là ở cây

dưa chuột (Cucumis sativus) của khoa Kỹ thuật và khoa học môi trường thuộc

trường đại học Ewha Woman - Hàn quốc. Khi so sánh với các cây ngô, lúa mỳ và

lúa miến cho thấy khả năng tích lũy As cao hơn nhiều lần so với 3 loài còn lại (Sun

H. H.; Sun A.C.; Hyeon Y; Kyung-Suk C. 2011).

Từ những công trình nêu trên cho thấy, các nhà khoa học trên thế giới đã

nghiên cứu về sự tích lũy KLN ở thực vật và sử dụng chúng cho cải tạo môi trường

từ những năm cuối thập niên 80. Cho đến nay, Phytoremediation đã phát triển thành

một hướng cải tạo môi trường hiệu quả, an toàn và tiết kiệm. Tuy nhiên, những

công trình đã nghiên cứu mới sử dụng các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn và mới

bước đầu sử dụng gen từ thực vật để đưa vào một số cây mô hình như Arabidopsis,

cải dầu…

3.3.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam vấn đề nghiên cứu về ô nhiễm KLN cũng đã được quan tâm. Viện

Công nghệ môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, và một

số cơ sở nghiên cứu của các trường đại học như Khoa Môi trường, Đại học Khoa

học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Tài nguyên môi trường, Đại học Quốc

15

gia TP Hồ Chí Minh... đã bước đầu điều tra và nghiên cứu xử lý ô nhiễm KLN. Các

nghiên cứu tập trung vào thống kê mức độ ô nhiễm KLN và khả năng hấp thu KLN

ở một số cây như dương xỉ, bèo tây, cỏ Vetiver …(Vũ Quyết Thắng 1998, Phạm

Văn Khang; Nguyễn Ngọc Minh; Nguyễn Xuân Huân 2004, Nguyễn Đình Tuấn

2005, Lâm Minh Triết ; Lê Huy Bá 2006, Diệp Thị Mỹ Hạnh 2007, Hoàng Thị

Thanh Thủy ; Từ Thị Cẩm Loan ; Nguyễn Như Hà Vy 2007, Đồng Thị Minh Hậu ;

Hoàng Thị Thanh Thủy ; Đào Phú Quốc 2008).

Đặng Đình Kim và các cộng sự đã tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về khả

năng chống chịu và hấp thu KLN của cây dương xỉ Pteris vittata và Pityrogramma

calomelanos, cỏ Mần Trầu và Vetiver cho thấy: Dương xỉ Pteris vittata có khả năng

chống chịu As đến 1.500ppm, Pb đến 5.000ppm và Cd đến 1.200ppm. Đặc biệt, khả

năng tích lũy As của loài dương xỉ này là rất lớn, trong khoảng nồng độ mà cây

chống chịu được, Pteris vittata tích lũy lượng As từ 307 – 6.042ppm trong thân,

131-3.756 ppm trong rễ. Còn dương xỉ Pityrogramma calomelanos có khả năng

chống chịu trên đất có bổ sung As đến 900ppm, Pb đến 4.000 ppm và Cd đến

300ppm. Đây là cây dương xỉ có thể phát triển tốt trên đất ô nhiễm KLN ở Hà

Thượng. Trong khoảng nồng độ mà cây chống chịu được, Pityrogramma

calomelanos đã tích lũy được lượng As là 885 – 4.034ppm trong thân và 483 –

2.256ppm trong rễ. Cỏ Mần trầu có khả năng chống chịu Pb và Zn cao (5.000 ppm

Pb và 1.000 ppm Zn). Kết quả thí nghiệm hấp thu Pb cho thấy, khi nồng độ Pb

trong đất 5.000ppm thì trong rễ và phần trên mặt đất tương ứng có chứa 3.613,0

ppm và 268,57ppm. Trong khi đó, cỏ Vetiver có khả năng chống chịu Pb cao. Hàm

lượng Pb trong đất từ 1.400,50 ppm đến 2.530,10 ppm cỏ vẫn phát triển bình

thường. Khả năng tách chiết Pb trong đất ô nhiễm của cỏ từ 87% – 92,56% sau 90

ngày thí nghiệm (Đặng Đình Kim 2012).

Những nghiên cứu khả năng hấp thụ KLN của thực vật với mục đích sử dụng

trong xử lý ô nhiễm môi trường đã bắt đầu được thực hiện. Kết quả cho thấy, cây

thơm ổi Lantana camara có thể chịu được hàm lượng Pb trong đất lên tới 10.000

ppm thậm chí 20.000 ppm. Cây cải xoong Nasturtium officinale có khả năng làm

giảm 60 - 80 % Cr và 70 - 80 % Ni từ nước thải mạ điện có nồng độ Cr và Ni tương

ứng 58,396 mg/l và 5,77 mg/l. Nghiên cứu loại bỏ Cr và Ni trong nước ô nhiễm

16

cũng được thử nghiệm với cây cỏ Vetiver Vetiveria zizanioides và cây sậy

Phragmites australistheo “phương pháp vùng rễ”, kết quả thu được cũng rất khả

quan (Nguyễn Tiến Cư ; Trần Văn Tựa ; Đặng Đình Kim ; Đỗ Tuấn Anh ; Lê Thu

Thủy 2007, Trần Văn Tựa ; Nguyễn Đức Thọ ; Đỗ Tuấn Anh ; Nguyễn Trung Kiên

; Đặng Đình Kim 2007).

Ở Việt Nam, tại Viện Công nghệ sinh học cũng đã có công trình nghiên cứu

chuyển gen tích lũy KLN vào cây Xoan ta và đã thu được các kết quả nhất định.

Tuy nhiên có thể nhận thấy, hầu hết các nghiên cứu trong nước theo hướng cải tạo

môi trường bằng thực vật chủ yếu nghiên cứu về mức độ tích lũy KLN của thực vật.

Các nghiên cứu tập trung đánh giá và sử dụng các loài cây sẵn có khả năng tích lũy

KLN trong tự nhiên cho mục đích cải tạo môi trường bằng thực vật hoặc bằng

phương pháp xử lý truyền thống. Trong khi đó, việc sử dụng công nghệ gen có ưu

việt là có thể chuyển gen hấp thụ và tích lũy KLN vào loài cây phù hợp cho các

vùng ô nhiễm khác nhau (các loài cây sống phổ biến trên vùng bị ô nhiễm mà không

có khả năng hấp thụ và tích lũy). Đây là biện pháp xử lý môi trường với hiệu quả

tốt, chi phí thấp, đặc biệt phù hợp với các nước đang phát triển như nước ta và đã

được triển khai rộng rãi ở một số nước. Cục Môi trường châu Âu đã so sánh hiệu

quả của phương pháp sử dụng thực vật cho thấy chi phí thấp hơn 1000 lần so với

phương pháp truyền thống khi nghiên cứu tại 1,4 triệu điểm ô nhiễm (Barcelos J. ;

Poschenrieder C. 2003).

Việc nghiên cứu phát triển một số loài thực vật hấp thụ KLN phải đáp ứng

được yêu cầu là giống dễ trồng, có khả năng vận chuyển KLN từ đất lên nhanh, chịu

được nồng độ ô nhiễm cao, phát triển nhanh (trong khi ở thực tế, cây tích lũy KLN

thường phát triển chậm, những loài phát triển nhanh lại mẫn cảm với hàm lượng

KLN cao). Một vấn đề khác là nếu dùng cây xuất xứ nơi khác với các cây nơi cải

tạo đất sẽ làm ảnh hưởng đến đa dạng sinh học của các cây địa phương. Vì vậy,

cách tốt nhất là tạo các cây địa phương có khả năng cải tạo đất để hạn chế nguy cơ

bị ảnh hưởng. Để thực hiện được điều này, cần có các hiểu biết sâu hơn về các

tương tác hóa sinh học cùng với các thay đổi của thực vật hấp thụ KLN bản địa và

phát triển các công trình nghiên cứu cơ bản có thể cung cấp được các giải pháp xử

lý đất một cách thân thiện với môi trường. Những kiến thức này làm cho việc ứng

17

dụng Phytoremediation an toàn hơn và đặc biệt cần thiết nếu muốn phát triển rộng

khắp và hiệu quả. Để góp phần giải quyết vấn đề trên, đề tài tập trung vào sử dụng

gen tách được từ một số cây hoang dại sống ở các vùng ô nhiễm để chuyển vào cây

thuốc lá là cây mô hình rất tốt để nghiên cứu gen hấp thụ As.

4. Chuyển gen ở thực vật

4.1. Cơ sở khoa học của chuyển gen thực vật

Thành tựu kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp ADN cho phép người ta

thực hiện chuyển gen trên thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới.

Cây được chuyển nạp gen mục tiêu được gọi là cây “transgenic”, với hai phương

pháp chuyển nạp gen: (1) chuyển nạp gen gián tiếp nhờ sự cải tiến không ngừng hệ

thống Ti-plasmid trên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, và (2) chuyển gen trực

tiếp theo phương pháp PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm

(microinjection), phương pháp bắn gen (biolistic), phương pháp chuyển qua ống hạt

phấn (pollen tube pathway) và một số kỹ thuật khác.

Trong đó ba phương pháp được ứng dụng rộng rãi là chuyển gen gián tiếp

bằng A.tumefaciens, tế bào trần và phi sinh học.

Trong đề tài này chúng tôi chọn phương pháp chuyển gen bằng A.tumefaciens

(Yoshihiro Narusaka ; Mari Narusaka ; Satoshi Yamasaki ; Masaki Iwabuchi 2012).

18

Hình 1.2: Mô hình xâm nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật

Phương pháp chuyển DNA của A.tumefaciens được sử dụng phổ biến trong

công nghệ gen hiện đại.

4.2. Giới thiệu chung về vector sử dụng trong chuyển gen thực vật

4.2.1. Các hệ thống vector sử dụng trong chuyển gen thực vật

Để có thể chuyển gen vào thực vật thông qua A.tumefaciens người ta phải sử

dụng một hệ thống vector chuyển gen. Có hai loại vector chuyển gen đó là vector

liên hợp và vector nhị thể.

4.2.1.1. Vector liên hợp (cointegrate)

Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn. Giải

pháp cho việc này là chuyển vùng T-DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là

hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống

này gọi là hệ thống vector liên kết. Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở

dạng T-DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh).

Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần

thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững của

plasmid trong A. tumefaciens.

Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của

một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những phần sau: Một vị

trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI),

thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli. Gen chỉ thị có tính

kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens. Gen

chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật. Đoạn khởi đầu của E. coli, không hoạt

động ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho

GOI đi vào trong tế bào thực vật (Lê Trần Bình ; Phan Văn Chi ; Nông Văn Hải ;

Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003).

4.2.1.2. Vector nhị thể (binary vector)

Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng

biệt: Ti plasmid và vector T-DNA.

Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A.tumefaciens, loại vector nhị thể được

thiết kế bao gồm các phần như sau: Vị trí ghép nối đa điểm, đoạn khởi đầu tái bản hoạt

19

động cả ở E. coli và A.tumefaciens, gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực

vật, gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông

qua A.tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp, đoạn T-DNA ngoại biên

(border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành

phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T-DNA (Lê Trần Bình ; Phan Văn

Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003, Hanif M. 2004).

Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận

tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T-DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm

nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các

Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển

thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật (Lê Trần Bình ;

Phan Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003).

Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành chuyển gen gián tiếp

thông qua Agrobacterium vào nhiều loài thực vật khác nhau (Lê Trần Bình ; Phan

Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003, Michielse B. C

; Hooykaas P. J. J. 2008).

4.2.1.3. Giới thiệu về vector pCambia 1301

Các vector chỉ thực hiện được chức năng của mình khi chúng có một số đặc

tính như: có khả năng tự sao chép độc lập và tích cực trong tế bào vật chủ; có kích

thước nhỏ, dễ nhận gen quan tâm, dễ xâm nhập và được sao chép; mang một số dấu

hiệu chọn lọc giúp phân biệt các tế bào mang plasmid tái tổ hợp với các tế bào

không có plasmid tái tổ hợp, tồn tại bền vững trong tế bào vật chủ. Các đặc tính này

là cơ sở quyết định các thành phần chính của plasmid với: Gen quan tâm được gắn

thêm đoạn khởi động và đoạn kết thúc; gen chỉ thị chọn lọc; các thành phần khác

như vùng khởi đầu sao chép và vùng trình tự nhân dòng đa điểm cắt (MCS) (Lê

Thanh Hòa 2003). Vector pCambia 1301 có kích thước khoảng 11,8 Kb có chứa

promoter CaMV 35S là một promoter mạnh dùng để biểu hiện trong tế bào thực vật

với các thành phần chính như sau:

Đoạn khởi động gen (promoter)

Promoter 35S là một dạng chuỗi khởi động xây dựng được tách từ virus khảm

súp lơ (Cauliflower Mosaic virus 35S promoter CaMV35S-P), loại promoter nos

20

(Lê Thị Thu Hiền 2003). Trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật, CaMV35S-P

được sử dụng rộng rãi nhờ khả năng hoạt động mạnh ở nhiều loại mô của cây hai lá

mầm, tuy nhiên nó lại ít hoạt động ở cây một là mầm. Để khắc phục nhược điểm

này, CaMV35S-P được sử dụng kết hợp với các thành phần khởi động khác,

chẳng hạn vector pEmu chứa nhiều bản sao của các tiểu phần phản ứng kị khí của

gen Adh1 từ ngô và các tiểu phần của gen tổng hợp octopin từA. tumefaciens đã làm

gia tăng sự biểu hiện của gen trong cây một là mầm lên hàng chục lần (Nguyễn Đức

Thành 2003).

Promoter 35S dài 350bp, gồm 3 thành phần: Hộp TATA ( ở vị trí từ - 46 đến +

8), vùng tăng cường A (enhancer) từ vị trí -90 đến -46, làm tăng biểu hiện gen ngoại

lai ở rễ, vùng tăng cường B (enhancer) từ vị trí -343 đến -90, làm tăng biểu hiện

gen chuyển ở lá. Trong vùng B gồm 5 phần nhỏ từ B1- B5 phân chia theo mức độ

phản ứng của mỗi vùng đối với các yếu tố dịch mã khác nhau (Chilton M.D. 1993).

Nếu xảy ra sự thay đổi trong vùng tăng cường từ vị trí -207 đến -56 có thể

dẫn đến mất khả năng gây nhiễm của virus. Lợi dụng tính chất này, có thể gắn gen

ngoại lại vào vùng enhancer sẽ làm mất khả năng gây nhiễm của virus khảm súp lơ

(Chilton M.D. 1993).

Đoạn kết thúc

Các đoạn kết thúc thường chứa đuôi polyA như AATTAA, hoặc AACCAA

giúp bảo vệ các phân tử ARN thông tin được bền vững hơn và tránh được sự phân

huỷ. Hai đoạn kết thúc được sử dụng nhiều trong công nghệ gen thực vật là đoạn

kết thúc của CaMV35S (có mặt trong 7 sản phẩm chuyển gen hiện nay) và đoạn kết

thúc NOS có mặt trong ít nhất 16 - 28 sản phẩm (Lê Thị Thu Hiền 2003).

Gen chỉ thị

Các chỉ thị chọn lọc di truyền sử dụng trong biến nạp thực vật thường có

nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc thực vật, gồm 2 loại chính:

Chỉ thị chọn lọc (selectable marker): Kết cấu gen mang đoạn khởi động

NOS(nopaline synthase promoter-terminater) điều khiển sự biểu hiện gen kháng

npt2 (neomycin phospho transferase gene), chỉ có những thể biến nạp sống được

trên môi trường có kháng sinh kanamycin (Lê Thanh Hòa 2003).

21

Chỉ thị sàng lọc (screenable marker): Gen chỉ thị sàng lọc cần có một số đặc

điểm sau: sản phẩm của nó là độc nhất và không độc đối với tế bào thực vật, các

enzym chỉ thị phải có khả năng dịch mã ổn định cao, phương pháp phân tích thuận

tiện, rẻ tiền, độ nhạy cao và có khả năng phản ứng với các polypeptit ngoài mà

không ảnh hưởng hoạt tính enzym (Lê Thị Thu Hiền 2003).

Vùng khởi động sao chép và MCS

Vùng pUC ori: vùng khởi động sao chép trong E. coli, có nguồn gốc từ

vectorpUC9.

RK 2 ori V: vùng khởi động sao chép trong A. tumefaciens, có nguồn gốc từ

plasmid RK2.

Vùng MCS có chứa trình tự điểm cắt của rất nhiều loại enzym. Trong đó

chúng ta quan tâm đến hai loại enzym là Eco72I và NcoI, trình tự điểm cắt của

chúng ở hai đầu của gen GUS. Vì vậy khi cắt pCambia 1301 bằng hai loại enzym

trên sau đó điện di chúng ta sẽ thu được hai băng tương ứng với kích thước

khoảng 9,8 Kb (vector) và 2 Kb (gen GUS). Nếu gắn vào đoạn gen ngoại lai mà ta

mong muốn thì gen GUS không được biểu hiện. Điều này rất có ý nghĩa trong việc

chọn lọc thể biến nạp (Lê Thanh Hòa 2003).

Trong tương lai, việc tối ưu hoá hệ thống vector và cải tiến các vector trên cơ

sở nghiên cứu tỉ mỉ các yếu tố tham gia vào quá trình chuyển nạp ổn định, các yếu

tố đa gen chuyển nạp vào vị trí nhất định trong genome thực vật và các điều kiện

nuôi cấy tái sinh cây chuyển gen vẫn là những vấn đề cần thiết trong nghiên cứu

chuyển gen ở thực vật.

22

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu

- Tách và nhân dòng gen arsC (từ cây dương xỉ Pytirogramma calomelanos)

- Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC.

- Chuyển gen arsC vào cây thuốc lá và tái sinh cây chuyển gen.

- Chứng minh sự có mặt của các gen chuyển nạp trong cây chuyển gen bằng

PCR

2.2. Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Nguyên vật liệu

Các chủng vi khuẩn, vector, dòng thuốc lá do Phòng Di truyền tế bào thực vật,

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp

- Chủng vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) DH5α và A. tumefaciens C58

- Vector tách dòng pBT

- Vector biểu hiện pCambia 1301, kích thước 11838 bp.

- Dòng thuốc lá K326 được sử dụng làm vật liệu để chuyển gen. Giống thuốc lá

K326 là giống thuốc lá nhập nội và đã được công nhận giống quốc gia, có một số đặc

điểm chính như sau: Chiều cao trung bình 160 - 175cm; thời gian sinh trưởng 120

ngày, thời gian ra nụ 10% là 53 ngày; năng suất khô: 1,8 - 2,3 tấn/ha, chất lượng tốt.

Hiện nay diện tích thuốc lá giống K326 chiếm khoảng 40% diện tích cây trồng thuốc lá

trên cả nước

Mẫu cây dương xỉ Pytirogramma calomelanos được lấy từ làng Hích thuộc

vùng mỏ than Đại Từ, Thái Nguyên. Đây là mỏ than khoáng sản có trữ lượng lớn,

nguồn đất và nước có hàm lượng Asen cao.

2.2.2. Hóa chất và thiết bị

2.2.2.1. Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử được cung cấp bởi các hãng có

uy tín như Affymetrix, Fermentas, Sigma,…

Các hóa chất dùng trong tách chiết ADN và plasmid được sử dụng của

hãng Merck – Đức.

- Kit tinh sạch Gene JETTM Gel Extraction KIT của hãng Fermentas - Mỹ.

- Bộ hóa chất sử dụng trong PCR (Affymetrix - Mỹ)

23

- Bộ kit tổng hợp cDNA của Affymetrix – Mỹ - Các hóa chất sử dụng trong điện di DNA: TAE 1X, DNA ladder 1kb của 1st base

của hãng Fermentas, Agarose và Ethidium Bromide được sử dụng của hãng Sigma – Mỹ

- Các enzym cắt giới hạn NcoI, Eco72I và BamHI và enzym nối T4 DNA

ligase (Fermentas – Mỹ)

- Các loại kháng sinh kanamycin, cefotaxime, rifamycin và hygromycin.

- Các hóa chất khác của phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ

Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

2.2.2.2. Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công

nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

Bảng 2.1. Danh mục thiết bị

Tên thiết bị Nguồn gốc , xuất xứ

Máy PCR system 9700 Applied Biosystem, Mỹ

Máy điện di Powerpac 300 Bio-Rad, Mỹ

Máy soi DNA Bio-Rad, Mỹ

Máy chụp gel CLS – Microdoc Cleaver Scientific Ltd, Mỹ

Máy Voltex IKA, Đức

Máy ly tâm Đức

Đức Nhật Bản

Nhật Bản

Nhật Bản

Bể ổn nhiệt Nồi hấp khử trùng Tủ lạnh 40 Tủ lạnh âm -200C Box cấy Singapore

Và các thiết bị khác….

2.2.3. Môi trường nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn :

Môi trường LB (Luria and Betani ) đặc: Yeast extract 5 g/l; Trypton 10 g/l;

NaCl 10 g/l; agar 16 g/l, pH = 7,0

Môi trường LB lỏng: Yeast extract 5 g/l; Trypton 10 g/l; NaCl 10 g/l; pH = 7,0

- Môi trường nuôi cấy mô thực vật MS theo Murashige và Skoog (1962)

24

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nuôi cấy và lưu giữ chủng khuẩn

Phương pháp nuôi cấy: Chủng khuẩn giữ trong glycerol được lấy ra cấy lỏng

trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc thích hợp. Nuôi lắc 200vòng/phút ở 37oC qua đêm. Sau đó cấy ria trên đĩa petri chứa LB đặc có chứa

kháng sinh, nuôi ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.

Giữ chủng: Bổ sung glycerol vô trùng đến nồng độ cuối cùng là 30% vào 0,5 -

1ml dịch vi khuẩn lỏng mới nuôi qua đêm, trộn đều và bỏ nhanh vào nitơ lỏng và giữ chủng ở điều kiện -20oC.

2.3.2. Phương pháp tách ARN

Mẫu được nghiền trong dung dịch Nito lỏng, sau đó được bổ sung tác nhân

gây biến tính protein mạnh và hiệu quả là 2-mercaptoethanol. Chất này có tác dụng

ức chế hoạt động của các RNase nội bào và tách các protein liên kết ra khỏi RNA.

Loại bỏ các protein ra khỏi mẫu bằng cách xử lý phenol-chloroform-isoamyl

alcohol rồi li tâm, để kết tủa protein và cặn bã còn nucleic axit sẽ hòa tan ở phần

trên. Kết tủa nucleic axit bằng cách thêm lượng ethanol dư thừa. Tránh sự phân hủy

RNA bằng cách dùng 3M LiCl và DEPC – H2O. Vì phương pháp sử dụng Trizol

không thu được ARN đối với cây dương xỉ vì vậy phương pháp thủ công bắt buộc

phải sử dụng trong công đoạn này.

Quy trình:

Nghiền 100mg lá trong Nito lỏng bằng cối sứ để phá vỡ vách tế bào. Bột đã

nghiền cho vào ống ly tâm 1,5ml.

Bổ sung 500 µl Extraction Buffer, 100 µl 2-mercapethanol và 500 µl phenol-

chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1)

Voltex 5 phút, ly tâm 8.000 vòng/ phút trong 10 phút

Thu dịch nổi sang ống mới. Bổ sung lượng phenol-chloroform-isoamyl

alcohol (25:24:1) với tỉ lệ 1:1. Lắc ống nhẹ nhàng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 8.000

vòng/ phút trong 10 phút.

Chuyển lớp trên sang ống eppendorf 1.5 ml rồi bổ sung isopropanol với tỉ lệ

1:1, 25 µl NaCl 5M, sau đó lắc nhẹ nhàng.

Ủ 3 phút ở -20oC, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu phần tủa

25

Bổ sung 900 µl DEPC – H2O và 200 µl LiCl 3M Ủ 30 phút ở -20oC, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu phần tủa

Bổ sung 500 µl Ethanol 70%. Voltex nhẹ

Thu phần tủa. Bổ sung 200 µl DEPC – H2O và 200 µl LiCl 3M, 20 µl 3M

Sodium acetate, 500 µl Ethanol 100%. Voltex nhẹ

Ủ 30 phút ở -20 oC, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa

Bổ sung 500 µl Ethanol 70%. Voltex. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút

ở 4oC, thu tủa

Bổ sung 30 µl DEPC – H2O. Ủ 55-60oC trong 5 phút để RNA tan hoàn toàn.

2.3.3. Phương pháp tổng hợp cDNA

Tổng hợp cDNA theo bộ kit Two-step RT PCR Kit của Affymetrix – Mỹ

Bảng 2.2. Phản ứng tổng hợp cDNA

Thành phần Thể tích

RNA khuôn 10µl

Reverse Primer ( Stocks: gene specific primer 10 µM, oligo dT 25 µM) 1 µl

Nước (Rnase – Free) 9 µl

Mix nhẹ, ủ trong 5 phút ở 75oC

RT Buffer 5X 5 µl

Rnase Inhibitor (4units/ µl) 1 µl

PCR Nucleotide Mix (10mM) 1.25 µl

M-MLV RT (25X) 1 µl

Nước (Rnase – Free)

6.75 µl Ủ 42oC trong 30 phút, 95oC trong 5 phút. Giữ ở 4oC Sản phẩm của phản ứng Reverse Transcriptase được tiến hành phản ứng

PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen arsC theo thành phần và chu trình Phụ lục 4.

2.3.4. Phương pháp xử lý với enzym giới hạn

Đoạn ADN và vector được xử lý với cùng enzym giới hạn để tạo đầu cắt

tương ứng. Để hiệu suất phản ứng cao cần tinh sạch DNA và plasmid trước khi tiến

hành. Phản ứng cắt được thực hiện theo các thành phần như sau:

26

Bảng 2.3. Phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn

Thành phần

+ Với một enzym H2O Đệm 10X riêng của enzyme DNA/plasmid Enzym (10 U/l) Tổng thể tích phản ứng + Với hai enzym H2O Đệm 10X chung tối ưu cho hai enzyme DNA/plasmid Enzym (10 U/l) Enzym (10 U/l) Tổng thể tích phản ứng Thể tích (µl ) 5.8 1.0 3.0 0.2 10.0 5.7 1.0 3.0 0.1 0.2 10.0

Phản ứng được ủ ở 37oC trong 2-5 giờ. Sản phẩm cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.

+ Phản ứng ghép nối đoạn gen với vector

Đoạn DNA cần nối ghép và vector đã được mở vòng được trộn lẫn với nhau

theo tỷ lệ 3 : 1. Bổ sung enzym T4 ligase vào hỗn hợp. Hỗn hợp phản ứng được trộn

theo tỉ lệ Bảng 2.6.

Bảng 2.4. Phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector

Thành phần

H2O Đệm T4 ligase 10X Đoạn gen cần gắn Vector đã mở vòng T4 ligase Tổng thể tích phản ứng Thể tích (µl ) 4.5 1.0 3.0 1.0 0.5 10.0

Phản ứng được ủ qua đêm ở 16oC.

2.3.5. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α được tiến hành

bằng phương pháp sốc nhiệt theo Cohen và cộng sự (1972).Vi khuẩn dưới tác dụng

của hoá chất hoặc điện trường trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ cho các phân tử

ADN có thể chui vào.

Tạo tế bào E.coli khả biến sử dụng CaCl2 Lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa khuẩn nuôi lắc trong môi trường LB ở 37oC qua đêm. Hút 1ml dịch khuẩn rồi cấy chuyển vào bình chứa 100ml môi trường LB lắc ở 37oC

trong khoảng 2- 3giờ sao cho OD600 từ 0,4-0,6. Chuyển dịch khuẩn sang ống

27

fancol 50ml đã khử trùng, làm lạnh vi khuẩn xuống 0oC bằng cách cắm đá trong 10

phút, sau đó chia ra các ống eppendorf. Thu tế bào bằng ly tâm 6.000 vòng/phút, 5

phút. Hòa tan vào CaCl2- MgCl2 (CaCl2 20mM- MgCl2 80mM). Ly tâm 6.000

vòng/phút trong vòng 5 phút. Loại dịch thu tế bào. Hòa tan tế bào trong 50µl CaCl2

0,1M

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli

Trộn 5µl sản phẩm (DNA,plasmid) + 50µl TBKB. Đặt trên đá 30 phút. Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút. Cắm đá 2- 5phút . Bổ sung LB lỏng rồi lắc 37oC, 1giờ.

Trải lên đĩa chứa môi trường kháng sinh chọn lọc thích hợp + X-gal 40mM (nếu có) và nuôi ở 37oC

2.3.6. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmid của vi khuẩn E.coli

Hoá chất sử dụng

Dung dịch I: 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8

Dung dịch II: 0,2 N NaOH, 1% SDS

Dung dịch III: 60 ml kali acetate 5M, 28,5 ml H2O

Dung môi loại protein: Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25:24:1),

chloroform : isoamyl alchohol (24:1), TE 0,01M pH 8,0

Quy trình

Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli vào 3 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc qua đêm ở 37oC, 200 vòng/phút. Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào các ống Eppendorf và đem ly tâm 8.000 vòng/phút, 5phút, 4oC để thu tế bào. Tủa thu được

hoà trong 100 µl dung dịch sol I. Bổ sung ngay 200 µl dung dịch II, đảo nhẹ nhàng.

Sau đó bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III. Thêm 550 µl dung dịch chloroform : isoamyl alchohol ( 24 : 1), đảo nhẹ nhàng. Ly tâm 12.000 vòng/phút, 4oC, 15 phút. Chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf mới và tủa bằng isopropanol. Để lạnh -20oC

trong 20 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút để thu plasmid. Rửa cặn

bằng 0,5 ml cồn 70%, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, làm khô và hoà cặn trong 30 µl nước đề ion, giữ ở -20oC. Bổ sung RNase nồng độ 100 µg/ml vào mẫu. Ủ mẫu ở 37oC trong 2 giờ. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra DNA.

Tinh sạch DNA

Tinh sạch đoạn gel bằng kít tinh sạch của Thermoscientific

28

Điện di trên gel agarose, nhuộm, soi trên bàn soi UV và cắt lấy đoạn gel chứa

đoạn DNA quan tâm cho vào ống eppendorf. Bổ sung dịch gắn kết DNA (Gel

Binding) vào ống chứa mảnh gel, Với phương pháp thôi gel: tỉ lệ Vmẫu : VGB = 1 : 5, đối với phương pháp tinh sạch Vmẫu : VGB = 1 : 1. Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút

và cứ 2 - 3 phút đảo nhẹ một lần cho đến khi gel tan hoàn toàn. Chuyển hỗn hợp

dung dịch lên cột liên kết DNA (Binding column) và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1

phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 400 µl đệm rửa Washing Buffer lên cột liên

kết DNA. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Có thể ly

tâm 2 lần để loại bỏ hoàn toàn đệm rửa Washing Buffer. Để khô 5 phút bay cồn. Chuyển

cột sang ống Eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung 30-50 µl dung dịch hòa tan DNA

(Elution Buffer) (hoặc nước khử ion đã khử trùng) vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ

phòng 5 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA. Bỏ cột và bảo quản DNA vừa tinh sạch ở -20oC.

2.3.7. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng

xung điện

Chuẩn bị vi khuẩn A.tumefaciens khả biến

Nuôi phục hồi và thu tế bào vi khuẩn ở pha tế bào phát triển mạnh bằng cách hút 1 ml vi khuẩn A.tumefaciens C58 (Nuôi lắc qua đêm ở 28o C) +10ml LB có bổ sung kháng sinh rifamycin (50µg/ml) nuôi lắc ở 28o C trong 3-4 giờ. Cắm đá 20-30

phút rồi chia ra các ống eppendorf 1,5ml. Ly tâm 6.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa và rửa bằng buffer HEPES 1mM 2 lần. Rửa lại bằng glyxerol lạnh 10%, ly tâm 6000 vòng/phút, 15 phút, 4oC, thu cặn. Hòa tan cặn trong glyxerol 10%

Biến nạp vào Agrobacterium bằng xung điện

Trộn 1µl plasmid tinh sạch với 50 µl tế bào A.tumefaciens C58 khả biến. Chuyển toàn bộ vào cuvette, để lạnh ở -20oC trong 20 phút. Biến nạp ở hiệu điện thế 2.2 kV. Nuôi phục hồi trong môi trường LB lỏng (1ml) ở 28o C trong khoảng 2-

3 giờ. Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc thích hợp

với rifamycin (50 µg/ml) và kanamycin (50µg/ml))

2.3.8. Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens (theo

Topping, 1998 )

Tạo dịch huyền phù vi khuẩn

29

Dòng khuẩn lạc A.tumefaciens được kiểm tra là mang plasmid tái tổ hợp được bảo quản trong glyxerol ở -20oC sẽ được nuôi cấy trên môi trưởng LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc kana 50mg/l + rifa 50mg/l nuôi tối ở 28oC. Chọn một khuẩn lạc

tròn đều, đứng độc lập nuôi trong 10ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc qua đêm (khoảng 16 giờ) ở 28oC, lắc 250 vòng/phút. Sau đó nuôi phục hồi dịch

khuẩn trên trong LB lỏng với tỉ lệ 1:10 trong khoảng 4 giờ phục vụ cho biến nạp. Giữ lạnh khuẩn trên đá. Đo OD550 = 0.6-0.8. Sau đó li tâm lạnh ở nhiệt độ 4oC hòa

tan tủa trong môi trường ½ MS để tạo dịch huyền phù vi khuẩn dùng cho biến nạp

vào các mảnh thuốc lá.

Lây nhiễm

Mảnh lá được ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn để tạo điều kiện cho vi

khuẩn xâm nhập vào mô lá. Sau 30 phút lây nhiễm, chuyển các mảnh lá lên giấy

thấm đã khử trùng, thấm khô và cấy lên môi trường tạo đa chồi GM không có kháng

sinh chọn lọc để tạo điều kiện cho mô lá và vi khuẩn phát triển đồng thời, nuôi

trong điều kiện tối.

Chọn lọc mảnh lá và tái sinh đa chồi sau chuyển gen

Sau 2 ngày đồng nuôi cấy các mảnh lá được chuyển sang môi trường chọn lọc

chồi GM có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500mg/l và hygromycin 5mg/l (Phụ lục

7) để loại bỏ các vi khuẩn còn ở bên ngoài mô lá không xâm nhập được và chọn lọc

những mảnh lá có mang vi khuẩn chuyển gen. Sau 2-3 tuần, các mảnh lá bắt đầu

được cảm ứng tạo mô sẹo được tách ra và cấy chuyển sang môi trường chọn lọc

chồi 1. Từ những cụm chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc, chọn những cụm chồi phân hoá mạnh, tách các cụm chồi có kích thước khoảng 0,5 - 1cm2 để tiếp tục chọn

lọc chồi tái sinh. Đến khi các chồi thật phát triển từ các cụm chồi thì tiến hành tách

từng chồi riêng rẽ và cấy lên môi trường chọn lọc chồi 2 có bổ sung hygromycin với

nồng độ cao hơn (10mg/l) để tăng áp lực chọn lọc (Phụ lục 7).

Tái sinh cây hoàn chỉnh

Từ những cụm chồi phân hoá mạnh, chọn tách những chồi độc lập, có 2 - 3 lá

phân hoá rõ ràng, dài từ 2 - 3 cm cấy sang môi trường ra rễ chọn lọc (môi trường

RM có bổ sung hygromycin 10mg/l, cefotaxime 500mg/l) để tạo cây hoàn chỉnh.

30

Thí nghiệm được đặt trong điều kiện ánh sáng điện 2000 Lux, 16 giờ sáng/8 giờ tối, nhiệt độ trong phòng duy trì ở mức 260C.

Ra cây trên giá thể trấu cát

Từ những dòng trên môi trường ra rễ chọn lọc những dòng sinh trưởng phát

triển mạnh, cao 5 - 7 cm để ra cây vào giá thể trấu : cát (tỉ lệ 1:1). Sau 14 ngày

chuyển các dòng vào chậu đất trong nhà lưới.

Sau khi trồng vào bầu đất, cây hồi phục và ra lá mới thì tiến hành lấy mẫu lá

để phân tích cây chuyển gen.

2.3.9. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thuốc lá

Phương pháp tách DNA tổng số (Phương pháp CTAB) (Cetyl threemethyl

Amomnium Bromide do Gawel và cộng sự đưa ra năm 1991, có cải tiến)

Mẫu được nghiền trong nito lỏng, thu lấy bột rồi cho vào ống eppendorf. Thêm 0.75ml đệm CTAB đã làm ấm ở 65oC trong 10 phút. Ủ trong bể ổn nhiệt 65oC trong 2 giờ, lắc nhẹ nhàng 15 phút/ lần. Sau đó chuyển hỗn hợp ra để ở nhiệt

độ phòng trong 5 phút. Thêm 0,75ml dung dịch Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1

lắc nhẹ trong 10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút. Tủa DNA bằngisopropanol tỉ lệ 1: 1, xoay nhẹ nhàng vài phút rồi giữ ở -20oC trong 1h. Ly

tâm 10.000 vòng/ phút, 10 phút, bỏ dịch trên thu tủa. Hòa tan tủa trong 0.5ml TE pH: 8 để ở tủ 4oC qua đêm.

Thêm 15 µl Rnase, ủ ở 37oC trong 90-120 phút để loại bỏ hoàn toàn Rnase.

Thêm dung dịch phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, lắc nhẹ trong 15

phút, ly tâm 10000 vòng/phút, 10 phút. Hút dịch sang ống effendorf mới sau đó

thêm Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 tỷ lệ 1: 1, lắc nhẹ trong 15 phút. Và ly tâm

10.000 vòng/phút, 10 phút. Hút dịch nổi sang ống eppendorf mới và tủa trong isopropanol tỉ lệ 1:1, để hỗn hợp ở -20oC trong 1h. Ly tâm 10.000 vòng/phút , 7

phút. Loại bỏ dịch nổi phía trên, thu tủa và rửa bằng cồn 70% lạnh. Thổi khô trong 20 phút ở trong box. Hòa tan tủa bằng TE và giữ trong tủ 4oC.

31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Tách dòng gen arsC từ RNA của cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos

3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số

Lá bánh tẻ cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos lấy từ vùng mỏ than Đại

Từ, Thái Nguyên được sử dụng để tách RNA tổng số. Đây là loài dương xỉ đã đươc

Viện Công nghệ môi trường xác định là có khả năng hấp thụ và tích lũy Asen cao.

RNA thu được lưu giữ trong nước cất khử trùng có bổ sung 0,01% DEPC. Kết quả

kiểm tra RNA tổng số bằng điện di trên gen agarose được thể hiện trên hình 3.1.

1 2 M

Hình 3.1. RNA tổng số tách từ lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos chưa

xử lý Dnase, M: Marker Fermentas 1kb và 1,2: RNA tổng số chưa xử lý Dnase

Hình 3.1 cho thấy các mẫu RNA từ lá dương xỉ có hàm lượng cao. Sau đó mẫu

được xử lý Dnase cho đủ độ tinh sạch để tiến hành phản ứng RT-PCR.

3.1.2. Phản ứng RT-PCR

Phản ứng RT-PCR được tiến hành theo bộ kit tổng hợp cDNA 2 bước của

Affymetrix (Mỹ). Cặp mồi khuếch đại gen được thiết kế từ trình tự gen arsC số hiệu

X80057.1 trên ngân hàng gen:

Mồi xuôi arsC- NcoI/F được thiết kế với vị trí cắt của enzyme NcoI, mồi

ngược arsC- Eco72I/R với vị trí cắt của enzyme Eco72I. Đây là hai enzyme chỉ có

32

M 1 2

duy nhất một vị trí cắt trên vector pCambia 1301 và không có điểm cắt nào trên

đoạn gen mục tiêu để thuận tiện khi nối ghép đoạn gen arsC vào vector chuyển gen

trong các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả phản ứng RT-PCR sau khi điện di kiểm tra

trên gel agarose 1% được thể hiện trên hình 3.2.

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR, M: Marker Fermentas

1Kb, ĐC: Phản ứng RT-PCR với mẫu nước cất, 1,2: Phản ứng RT-PCR với mẫu

RNA.

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm trên hình 3.2 cho thấy xuất hiện đoạn gen

đúng với kích thước của gen arsC theo lý thuyết (khoảng gần 500bp). Băng gọn,

không có băng, vạch lạ và đủ độ tinh sạch. Như vậy, chúng tôi đã thành công trong

việc tách gen arsC từ RNA tổng số của lá cây dương xỉ Pityrogramma

calomelanos.

3.1.3. Biến nạp cấu trúc gen arsC vào vector tách dòng pBT

Vector pBT là vector tách dòng TA-Cloning với 2 Thyminde ở 2 đầu thuận lợi

cho việc gắn gen theo cơ chế tách dòng T-A. Taq DNA polymerase trong phản ứng

PCR có xu hướng gắn Adenin vào mạch mới tổng hợp và không phụ thuộc vào

khuôn, do vậy sản phẩm PCR do Taq polymerase tạo ra không có đầu bằng mà có

một nucleotide A nhô ra ở đầu 3’. Gen arsC sau khi PCR được gắn trực tiếp vào

plasmid theo cơ chế bổ sung A ở sản phẩm PCR với T ở đầu của vector pBT, hình

thành liên kết T-A. Vector có chứa gen chọn lọc kháng sinh kháng ampicilin để

chọn lọc các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp đồng thời loại trừ các vi khuẩn nhiễm

tạp khác.

33

Gen arsC sau khi được khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu arsC- NcoI/F và arsC- Eco72I/R được gắn vào vector pBT bằng phản ứng ligate ở 22oC qua đêm,

biến nạp sản phẩm vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Tế bào vi khuẩn biến nạp được

nuôi phục hồi trên môi trường LB lỏng trong vòng 2 giờ. Sau đó cấy trải trên môi

trường LB đặc có bổ sung chất kháng sinh Amp (100µg/ml) để kiểm tra các chủng biến nạp. Nuôi qua đêm ở 37oC. Chọn 10 khuẩn lạc nuôi lắc trong môi trường LB

lỏng có chứa kháng sinh chọn lọc Amp (100µg/ml) qua đêm. Sau đó tiến hành tách

chiết plasmid kiểm tra sự có mặt của pBT, đồng thời tiếp tục nuôi lỏng các dòng vi

khuẩn này. Sau khi tách chiết plasmid, xử lý plasmid với Rnase, tinh sạch rồi điện

di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả cho các băng rõ và đúng với kích thước

của plasmid pBT đã biến nạp thêm gen arsC (~3.2 kb).

Hình 3.3. Kết quả tách chiết plasmid pBT- arsC, M: Marker Fermentas 1kb, 1-

10: Plasmid tách được từ các dòng khuẩn nạp sau khi biến nạp, ĐC: Mẫu đối chứng

là plasmid tách từ khuẩn lạc không biến nạp

3.1.4. Kiểm tra vector pBT-arsC

Để chắc chắn sự có mặt của gen arsC trong vector tách dòng pBT chúng tôi

tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR và cắt bằng enzyme giới hạn.

Kiểm tra vector pBT-arsC bằng phản ứng PCR

Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi arsC-NcoI/F và arsC-EcoR72I/R. Mẫu

đối chứng là plasmid pBT không mang gen arsC. Kết quả phản ứng PCR được điện

di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.4).

34

Hình 3.4. Kết quả PCR pBT-arsC với cặp mồi đặc hiệu, M: Marker Fermentas

1kb, ĐC: Sản phẩm PCR vector pBT không mang gen arsC, 1-9: Sản phẩm PCR

vector pBT- arsC

Kết quả phản ứng PCR cho các băng đúng với kích thước gen arsC theo tính

toán lý thuyết (gần 500bp). Để khẳng định thêm nữa sự có mặt của gen arsC trong

vector pBT chúng tôi tiến hành kiểm tra đồng thời bằng các enzyme cắt giới hạn.

Kiểm tra vector pBT-arsC bằng enzyme cắt giới hạn BamHI

Vector tách dòng pBT có chứa 2 điểm cắt của enzyme BamHI ở 2 đầu gắn

gen, thuận tiện cho việc kiểm tra gen gắn. Theo tính toán lý thuyết thì sản phẩm của

phản ứng cắt enzyme sẽ cho hai đoạn có kích thước đoạn 1 là gen arsC và đoạn còn

lại bằng với kích thước chiều dài vector pBT. Kết quả điện di sản phẩm cắt pBT-

arsC bằng enzyme BamHI (Hình 3.5) cho thấy cả 4 plasmid đều thu được các phân

đoạn có các kích thước tương ứng với dự tính, chứng tỏ đã thành công trong việc

nối ghép gen arsC vào vector nhân dòng pBT .

Hình 3.5. Kết quả cắt pBT-arsC bằng BamHI, M: Marker Fermentas 1kb,1-4:

Sản phẩm cắt pBT-arsC bằng BamHI.

Kiểm tra vector pBT-arsC bằng enzyme NcoI và Eco72I

35

Còn một cách kiểm tra bằng enzyme NcoI và Eco72I cũng được chúng tôi tiến

hành. Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại gen arsC được thiết kế với 2 điểm cắt

của 2 enzyme giới hạn NcoI và Eco72I ở 2 đầu. Do vậy dễ dàng cắt pBT-arsC bằng

các enzyme giới hạn NcoI và Eco72I để kiểm tra sự có mặt của gen arsC. Kết quả

phản ứng cắt cho ra 2 vạch băng tương ứng với vector pBT ( khoảng 2.7kb) và gen

arsC (khoảng gần 500bp) (Hình 3.6). Như vậy hoàn toàn có thể khẳng định vector

pBT-arsC đã được thiết kế.

Hình 3.6. Kết quả cắt pBT-arsC bằng NcoI và Eco72I, M: Marker Fermentas

1kb, 1-4: Sản phẩm cắt pBT- arsC bằng NcoI và Eco72I

3.1.5. Xác định trình tự gen trình tự gen arsC

Để khẳng định chính xác đoạn DNA nhân bản và nhân dòng vào vector pBT

đúng là đoạn gen mục tiêu, vector tái tổ hợp pBT-arsC được gửi đi giải trình tự tại

hãng Macrogen (Hàn Quốc) bằng cặp mồi arsC- NcoI/F và arsC- Eco72I/R. Sau

GGCCGGAAGGGGTGCAGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCACTCTTTACATGGACTGATATGAGCAACATTACCATTTATCA

CAACCCGGTCTGCGGCACGTCGCGTGGAGATGATCCGCAACAGCGGCACAGAACCGACTATTATCCATTATCTGGAAACT

CCGCCAACGCGCGATGAACTGGTCAAACTCATTGCCGATATGGGGATTTCCGTACGCGCGCTGCTGCGTAAAAACGTCGA

ACCGTATGAGGAGCTGGGCCTTGCGGAAGATAAATTTACTGACGATCGGTTAATCGACTTTATGCTTCAGCACCCGATTC

TGATTAATCGCCCGATTTGGTGACGCCGCTGGGAACTCGCCTGTGCCGCCCTTCAGAAGTGGTGCTGGAAATTGCCAGAT

GCGCAAAAAGGCGCATTCTCCAAGGAAGATGGCGAGAAAGTGGTTGATGAAGCGGGTAAGCGCCTGAAATAA

GCTAGCTAAAGCTTGGATCCCCGGGTACCGAGCTAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC

GCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACA

TTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCG

GGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGA

GCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAA

AAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCA

TCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGC

TCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTT

đây là kết quả giải trình tự chúng tôi nhận được:

36

CTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTC

AGCCCGACCGCTGGGCCTTATCCGGGAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACCCGACTATCGCCACTGGCAGCAG

CCACTGGTAACAGGATTACCAAACCGGGG

So sánh trình tự nucleotide đoạn gen thu được với trình tự gen gốc mang mã

số X80057.1 trên Gene Bank bằng phần mềm DNAstar và BioEdit cho kết quả độ

tương đồng về trình tự nucleotide là 99%, độ che phủ 100% (hình 3.7). Số

nucleotide sai khác là 1/426 nu (nucleotide số 32 thay C bằng T). Điều này chứng tỏ

đã phân lập được chính xác đoạn gen arsC mong muốn ở cây dương xỉ

Pityrogramma calomelanos.

Accession

Description

Max score

Total score

Query coverage

E value

Max ident

Links

59375

782

782

100%

0.0

99%

>lcl|59375 Length=426 Score = 782 bits (423), Expect = 0.0 Identities = 425/426 (99%), Gaps = 0/426 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 ATGAGCAACATTACCATTTATCACAACCCGGTCTGCGGCACGTCGCGTAATACGCTGGAG 60 ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1 ATGAGCAACATTACCATTTATCACAACCCGGCCTGCGGCACGTCGCGTAATACGCTGGAG 60 Query 61 ATGATCCGCAACAGCGGCACAGAACCGACTATTATCCATTATCTGGAAACTCCGCCAACG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 ATGATCCGCAACAGCGGCACAGAACCGACTATTATCCATTATCTGGAAACTCCGCCAACG 120 Query 121 CGCGATGAACTGGTCAAACTCATTGCCGATATGGGGATTTCCGTACGCGCGCTGCTGCGT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 CGCGATGAACTGGTCAAACTCATTGCCGATATGGGGATTTCCGTACGCGCGCTGCTGCGT 180 Query 181 AAAAACGTCGAACCGTATGAGGAGCTGGGCCTTGCGGAAGATAAATTTACTGACGATCGG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 AAAAACGTCGAACCGTATGAGGAGCTGGGCCTTGCGGAAGATAAATTTACTGACGATCGG 240 Query 241 TTAATCGACTTTATGCTTCAGCACCCGATTCTGATTAATCGCCCGATTGTGGTGACGCCG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 TTAATCGACTTTATGCTTCAGCACCCGATTCTGATTAATCGCCCGATTGTGGTGACGCCG 300 Query 301 CTGGGAACTCGCCTGTGCCGCCCTTCAGAAGTGGTGCTGGAAATTCTGCCAGATGCGCAA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 CTGGGAACTCGCCTGTGCCGCCCTTCAGAAGTGGTGCTGGAAATTCTGCCAGATGCGCAA 360 Query 361 AAAGGCGCATTCTCCAAGGAAGATGGCGAGAAAGTGGTTGATGAAGCGGGTAAGCGCCTG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 361 AAAGGCGCATTCTCCAAGGAAGATGGCGAGAAAGTGGTTGATGAAGCGGGTAAGCGCCTG 420 Query 421 AAATAA 426 |||||| Sbjct 421 AAATAA 426

Hình 3.7. So sánh trình tự đoạn gen phân lập từ lá cây dương xỉ Pityrogramma

calomelanos với trình tự được công bố trên ngân hàng gen NCBI (X80057.1).

37

Tiếp tục so sánh trình tự axit amin suy diễn của đoạn gen arsC phân lập được

với trình tự axit amin của gen gốc (Hình 3.8) cho thấy có một sự thay đổi ở axit

amin số 11 trong đó A (alanin) được thay bằng V(valin).

Hình 3.8. Độ tương đồng các axit amin khi so sánh 2 trình tự

Như vậy, có thể sử dụng đoạn gen arsC trong vector nhân dòng pBT-arsC

cho nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector chuyển gen.

3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen arsC

3.2.1. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCambia 1301

Vector biểu hiện pCambia 1301 có chứa promoter CaMV 35S là một promoter

mạnh dùng để biểu hiện trong tế bào thực vật. Do vậy chúng tôi chọn promotor

CaMV 35S để điều khiển gen arsC phục vụ cho quá trình chuyển gen vào cây thuốc

lá (Hình 3.9).

Hình 3.9. Sơ đồ cấu trúc vector pCambia 1301-arsC

38

Vector pCambia1301 và pBT- arsC đều chứa điểm cắt của enzyme cắt giới

hạn Eco72I và NcoI. Thực hiện đồng thời phản ứng cắt pCambia1301 và pBT-arsC

với hai enzyme giới hạn trên. pCambia 1301 sau khi cắt với enzyme Eco72I và NcoI

sẽ loại bỏ gen GUS, còn pBT-arsC sẽ cho ra 2 vạch băng tương ứng với vector pBT

và gen arsC. Một enzyme có đầu bằng còn một enzyme có so le, như vậy đoạn gen

sẽ được gắn thuận chiều với promoter trên vector tái tổ hợp. Kết quả sản phẩm cắt

được điện di trên gel agarose 1% được thể hiện trên hình 3.10.

Hình 3.10. Sản phẩm cắt plasmid pCambia1301 và pBT-arsC, M: Marker

Fermentas 1kb, 1: pCAMBIA1301 được cắt bởi NcoI và Eco72I, 2: pBT-arsC được

cắt bởi NcoI và Eco72I

Điện di sản phẩm cắt cho thấy plasmid pCambia1301 có kích thước khoảng

11,8 kb. Plasmid này đã được cắt bằng hai enzyme NcoI và Eco72I cho 2 vạch

(giếng 1), 1 vạch khoảng 9,8 kb là của vector pCambia 1301 có chứa promoter

CaMV 35S, gen kháng kháng sinh hygromycin và vạch còn lại cho kích thước

khoảng 2 kb tương ứng với đoạn gen GUS; PBT- arsC sau khi cắt cho 2 vạch băng,

1 vạch khoảng 2.7kb là vector pBT và 1 vạch khoảng gần 500 bp là gen arsC (giếng

2).

Gen arsC và vector pCambia1301 sau khi cắt được tiến hành tinh sạch nhằm

thu lại gen mục tiêu đồng thời loại bỏ các tạp chất để cho quá trình thiết kế vector

có hiệu quả cao. Khi dung dịch qua cột tinh sạch, DNA sẽ được gắn vào các phân

tử có ái lực cao với chúng cố định trên màng lọc của cột. Dịch đệm cùng agarose

39

được loại bỏ nhờ ly tâm với tốc độ cao. DNA được thu lại bằng nước khử ion.

Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra trên gel agarose 1 % thể hiện trên hình 3.11

Hình 3.11. Sản phẩm tinh sạch pCambia1301 và gen arsC sau khi cắt bằng

enzyme NcoI và Eco72I, M: Marker 1 kb, 1: Phân mảnh của pCambia1301 cắt

bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch), 2: gen arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I

(sau tinh sạch)

Kết quả sản phẩm tinh sạch (Hình 3.11) có hàm lượng cao, không bị đứt gẫy,

đúng với kích thước như tính toán lý thuyết của gen arsC và vector pCambia1301

đã loại bỏ gen GUS. Chứng tỏ quá trình tinh sạch đủ điều kiện để thực hiện phản

ứng lai nhờ T4 ligase tạo vector tái tổ hợp pCambia 1301-arsC.

Thực hiện phản ứng ligate đoạn gen arsC vào vector pCambia1301 (ligate qua đêm ở 22oC), sau đó biến nạp vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt và trải trên môi trường chứa chất kháng sinh kanamycin 50mg/l, nuôi ở 37oC để kiểm tra

các khuẩn lạc mang cấu trúc biến nạp.

3.2.2. Kết quả kiểm tra vector pCambia 1301- arsC

Kiểm tra vector pCambia 1301- arsC bằng PCR

Các khuẩn lạc mọc trên môi trường chứa kháng sinh kanamycin 50mg/l. Do

vậy theo lý thuyết thì các chủng khuẩn này phải mang vector pCambia1301 chứa

gen kháng kanamycin. Tuy nhiên, chúng có thể mang các vector tự đóng vòng hoặc

các gen đích bị đứt gãy vì vậy chưa chắc các khuẩn lạc này đã mang gen arsC. Để

kiểm tra các khuẩn lạc mang gen arsC, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid để

kiểm tra sự có mặt của vector pCambia1301. Tiếp theo tiến hành phản ứng PCR với

40

cặp mồi đặc hiệu và đồng thời cắt vector pCambia1301-arsC bằng enzyme NcoI,

Eco72I để kiểm tra sự có mặt của gen arsC.

Kết quả tách chiết plasmid từ các chủng biến nạp được thể hiện trên hình 3.12.

Hình 3.12: Kết quả tách chiết plasmid pCambia1301-arsC, M: Marker

Fermentas 1kb, 1-4: plasmid tách từ khuẩn lạc sau khi biến nạp

Tiến hành phản ứng PCR pCambia1301-arsC với cặp mồi đặc hiệu để kiểm

tra sự có mặt của gen chuyển nạp. Đối chứng âm là plasmid pCambia1301 không

mang gen arsC. Kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%.

Hình 3.13: Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen arsC, M:Marker Fermentas

1kb, ĐC: Sản phẩm PCR với khuôn là pCambia 1301, 1-4: Sản phẩm PCR với

khuôn là pCambia 1301 - arsC sau biến nạp

Hình 3.13 cho thấy các mẫu 2, 3, 4 cho kết quả dương tính. Vạch băng có kích

thước khoảng gần 500bp đúng với kích thước của gen arsC. Mẫu 1 cho kết quả âm

tính.

41

Kiểm tra vector pCambia 1301-arsC bằng enzyme cắt giới hạn

Để khẳng định thêm sự có mặt của gen arsC chúng tôi tiến hành phản ứng cắt

pCambia1301- arsC với enzyme NcoI và Eco72I. Kết quả của phản ứng cắt như sau:

Hình 3.14. Sản phẩm cắt pCambia1301-arsC bằng enzyme NcoI và Eco72I, M:

Marker Fermentas 1kb, 1-3: Sản phẩm cắt pCambia 1301 - arsC bằng enzyme NcoI

và Eco72I.

Kết quả điện di của phản ứng cắt cho văng ra 2 vạch băng tương ứng với

plasmid pCambia1301 đã loại bỏ gen GUS (kích thước khoảng 9.8 kb) và gen arsC

(khoảng gần 500bp) theo như tính toán lý thuyết. Như vậy, kết luận được gen arsC

đã được biến nạp thành công vào vector biểu hiện pCambia1301.

Từ kết quả kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen arsC

và phản ứng cắt bằng 2 enzyme NcoI và Eco72I, chúng tôi có thể khẳng định vector

pCambia1301 - arsC đã được thiết kế thành công.

3.3. Biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301-arsC vào chủng vi khuẩn A.

tumefaciens C58.

Tiến hành biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301- arsC vào chủng vi

khuẩn A.tumefaciens C58. Chuẩn bị 50µl tế bào A.tumefaciens khả biến và trộn vào

5µl plasmid pCambia1301-arsC đã tinh sạch. Thực hiện phản ứng biến nạp plasmid

vào tế bào A.tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Đây là một phương pháp

khá hiệu quả trong một thời gian ngắn. Sau đó nuôi phục hồi tế bào và cấy trải trên

môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50µg/ml và rifamycin 50µg/ml ở 28o C trong 2 ngày.

42

Các khuẩn lạc có thể phát triển trên môi trường kháng sinh chọn lọc nên có

thể kết luận chúng mang gen kháng kanamycin. Tuy nhiên, chúng chưa chắc đã

mang gen đích như mong muốn vì có thể chứa các plasmid tự đóng vòng. Do đó

chúng tôi sử dụng phương pháp Colony- PCR với khuôn là khuẩn lạc để chọn lọc

các dòng mang gen mong muốn. Chọn 10 dòng khuẩn lạc tròn, nằm riêng rẽ thực

hiện phản ứng Colony – PCR. Kết quả điện di kiểm tra được biểu hiện ở hình 3.15.

Hình 3.15. Kết quả phản ứng Colony- PCR của 10 khuẩn lạc A.tumefaciens C58 được biến nạp pCambia1301- arsC, M: Marker Fermentas 1Kb, 1-10: Sản phẩm Colony - PCR các dòng khuẩn lạc A. Tumefaciens sau biến nạp, ĐC: Sản phẩm Colony -PCR dòng khuẩn lạc A.Tumefaciens chưa biến nạp gen arsC. Kết quả trên cho thấy, cả 10 dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính và cho

cùng kích thước là khoảng gần 500 bp đúng với kích thước của gen arsC. Đối

chứng âm là khuẩn lạc A.Tumefaciens không mang gen arsC không cho vạch băng

nào. Như vậy, vector pCambia1301-arsC đã được chuyển vào vi khuẩn A.

tumefaciens. Tiếp theo, 10 dòng khuẩn lạc A. tumefaciens này được chúng tôi sử

dụng làm nguồn nguyên liệu để chuyển gen arsC vào cây thuốc lá.

3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen arsC

Sau khi tham khảo các công trình để tìm hiểu sự ảnh hưởng của vật liệu biến

nạp (cuống hay mảnh lá), kích thước mảnh lá, tuổi cây thuốc lá, mật độ tế bào vi

khuẩn đến hiệu quả chuyển gen, chúng tôi tiến hành biến nạp chủng vi khuẩn

A.tumefaciens C58 đã mang vector chuyển gen pCambia1301- arsC vào mảnh lá

cây thuốc lá. Trong quá trình chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens, đoạn

gen ngoại lai sẽ sát nhập vào một ví trí bất kỳ trong genome của cây trồng. Ở mỗi vị

trí khác nhau thì hiệu quả mà gen được đưa vào sẽ có biểu hiện khác nhau.

Giai đoạn tái sinh chồi

43

Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành chuyển gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens theo phương pháp Topping (1998) có cải tiến với 3 lần

bố trí thí nghiệm. Kết quả theo dõi quá trình tái sinh của các dòng thuốc lá qua các

lần thí nghiệm và các giai đoạn chọn lọc khác nhau được thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Tỉ lệ tái sinh của các mẫu qua các giai đoạn

Đối tượng nghiên cứu

Chọn lọc mảnh lá

Chọn lọc cụm chồi

Chọn lọc ra rễ (lần 1)

Chọn lọc ra rễ (lần 2)

Chọn lọc ra rễ (lần 3)

Lần chuyển gen

1

2

3

55/60 (91,67%) 53/58 (91,38%) 61/65 (93,85%)

85/105 (80,95%) 79/95 (83,16%) 82/97 (84,54%)

48/85 (56,47%) 32/79 (40,51%) 49/82 (59,76%)

30/48 (62,50%) 21/32 (65,62%) 31/49 (63,27%)

22/30 (73,33%) 15/21 (71,43%) 25/31 (80,65%)

Mảnh lá được biến nạp Agrobacterum C58 mang pCambia1301- arsC

TB

92,3%

82,88%

52,25%

63,80%

75,14%

1

-

-

2

-

-

ĐC (+)

3

-

-

TB

20/20 (100%) 12/12 (100%) 15/15 (100%) 100%

32/35 (91,43%) 29/29 (100%) 31/31 (100%) 97,14%

10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 100%

-

-

1

-

-

-

-

2

-

-

-

-

ĐC (-)

3

-

-

-

-

0/15 (0%) 0/15 (0%) 0/15 (0%)

TB

0%

-

-

-

-

ĐC (+): Mẫu không chuyển gen trên môi trường không bổ sung kháng sinh. ĐC (-) : Mẫu không chuyển gen trên môi trường có bổ sung kháng sinh Cấu trúc gen chuyển pCambia1301- arsC được chuyển đồng thời với gen

kháng hygromycin có khả năng tạo ra sản phẩm ức chế tác động của hygromycin

được bổ sung trong môi trường chọn lọc. Do đó trong môi trường GM hygromycin

5 mg/l hoặc 10 mg/l, những mảnh lá, cụm chồi, cây không mang cấu trúc gen

chuyển pCambia1301- arsC đồng thời không mang gen kháng hygromycin thì sẽ

không thể tái sinh và phát triển được. Hygromycin gây ức chế quá trình sinh tổng

hợp protein và các con đường sinh tổng hợp khác liên quan, trong đó có hoạt động

44

của lục lạp. Mảnh lá, cụm chồi, cây bị mất khả năng hấp thụ dinh dưỡng, hoạt động

của lục lạp bị rối loạn dẫn đến vàng và chết dần.

Giai đoạn chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen

Theo kết quả tỉ lệ tái sinh của các mẫu (Bảng 3.1), các mảnh thuốc lá sau

chuyển gen tái sinh đa chồi trên môi trường chọn lọc hygromycin 5mg/l là khá cao

(92,3%/) so với đối chứng trên môi trường không bổ sung kháng sinh (100%).

Trong khi đó các mảnh lá đối chứng không chuyển gen không sống sót được trên

môi trường chọn lọc, vàng và chết dần.

A B C

Hình 3.16. Hình ảnh chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen

(A): Mảnh lá đối chứng trên môi trường đa chồi có bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l và kháng sinh cefotaxime 500mg/l, (B): Mảnh lá đối chứng trên môi trường không bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l và kháng sinh cefotaxime 500mg/l, (C): Mảnh lá mang cấu trúc gen chuyển arsC trên môi trường đa chồi có bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l và kháng sinh cefotaxime 500mg/l.

Giai đoạn chọn lọc cụm chồi sau chuyển gen

Những cụm chồi từ mảnh lá tái sinh đa chồi tốt được chuyển sang môi

trường chọn lọc GM hygromycin 10mg/l để tăng áp lực chọn lọc, sàng lọc các cụm

chồi đã có gen kháng hygromycin chuyển vào nhưng không hoạt động phiên mã,

dịch mã (Hình 3.17).

Hình 3.17. Hình ảnh chồi thuốc lá trong môi trường đa chồi bổ sung

hygromycin 10mg/l và cefotaxime 500mg/l

45

Trong môi trường tái sinh đa chồi tăng nồng độ kháng sinh hygromycin lên

10mg/l, những chồi thuốc lá không có gen chuyển vào sẽ vàng dần, không phát triển

và chết. Các chồi mang gen chuyển thành công sẽ phát triển xanh tốt.

Giai đoạn chọn lọc cây tái sinh hoàn chỉnh

Dòng mang cấu trúc chuyển gen hoàn chỉnh phải có khả năng ra rễ trên môi

trường chọn lọc để tạo thành cây hoàn chỉnh trong khi những chồi không chuyển

gen sẽ không có khả năng ra rễ. Những chồi phát triển tốt được chuyển sang môi

trường chọn lọc ra rễ (RM + hygromycin 10mg/l). Đối với thuốc lá, chồi cũng có

thể ra rễ ngay trên môi trường MS nhưng tỉ lệ ra rễ ít hơn nhiều so với môi trường

RM có bổ sung IBA 0,1 mg/l. Tỉ lệ ra rễ của chồi qua 3 lần chọn lọc trên môi

trường RM hygromycin 10mg/l là khá cao (tỉ lệ chọn lọc lần 3 trung bình qua 3 đợt

thí nghiệm là 75,14%).

A B C

Hình 3.18. Khả năng ra rễ của các chồi trên môi trường RM hygromycin 10mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, (A):Cây thuốc lá chuyển gen tái sinh hoàn chỉnh trên môi trường ra rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l. (B): Rễ cây thuốc lá chuyển gen tái sinh hoàn chỉnh trên môi trường ra rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l, (C): Cây đối chứng và cây chuyển gen cấy trên môi trường ra rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l.

Như vậy có thể kết luận đã hoàn thành việc chuyển gen và chọn lọc cây in

vitro sau chuyển gen. Qua các giai đoạn chọn lọc từ 183 mảnh lá trong 3 lô thí

nghiệm thu được 28 dòng chuyển gen phát triển tốt, lá xanh đậm, chồi mập, rễ dài.

Những dòng này sẽ được ra cây trong môi trường tự nhiên.

46

Giai đoạn ra cây vào giá thể đất: trấu : cát

Chọn mỗi dòng 3 cây sinh trưởng và phát triển tốt trong in vitro sau 1 tháng

nuôi cấy được rửa rễ và đưa trồng trong nhà lưới trên giá thể trấu: đất: cát (tỷ lệ

1:1:1). Để cây thích nghi dần với môi trường đất và tránh mất nước đột ngột dẫn

đến cây chết, sau khi đã ra cây vào bầu đất, cho vào túi ni lông sạch, ghim giữ ở phần trên túi và cho lại vào phòng nuôi cây điều khiển nhiệt độ 25-28o C, cường độ

ánh sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày để cây phát triển ổn định. Sau

7 ngày đưa cây ra nhà lưới để cây thích nghi với điều kiện ánh sáng tự nhiên. Trong

tổng số 28 dòng có 20 dòng cây thuốc lá phát triển tốt. Với đặc điểm là hệ rễ phụ

của cây thuốc lá phát triển mạnh, có thể phát triển những đốt thân gần gốc nên tỷ lệ

sống của các dòng khi vào giá thể khá cao (>71%), chứng tỏ cây thích nghi với điều

kiện ngoại cảnh khá tốt (Hình 3.19).

Hình 3.19. Cây thuốc lá hoàn chỉnh được trồng trong bầu đất: trấu: cát

Như vậy, việc chuyển gen arsC vào cây thuốc lá, chọn lọc sau chuyển gen, tái sinh

thành cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc và trồng cây vào bầu đất đã đạt được

kết quả bước đầu. Các dòng thuốc lá chuyển gen đã sẵn sàng cho việc đánh giá tiếp

theo.

3.5. Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR

Các dòng thuốc lá chuyển gen quan tâm được tiến hành kiểm tra sự có mặt của

gen chuyển trong cây bằng phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu arsC-NcoI/F và

arsC-Eco72I/R. Nếu kết quả nhận được gen đặc hiệu với kích thước đúng như tính

toán ban đầu thì có thể kết luận cây có mang gen chuyển. Sản phẩm điện di DNA

tổng số của các cây thuốc lá chuyển gen cho các băng đều và rõ nét, đủ điều kiện cho

phản ứng PCR. Kết quả nhân gen arsC thể hiện trên hình 3.20.

47

Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng thuốc lá chuyển gen, 1

– 24: Sản phẩm PCR của các dòng thuốc lá chuyển gen 1-20, M: Marker Fermentas

1kb

Kết quả cho thấy trong số 20 dòng thuốc lá chuyển gen arsC sau 1 tháng trồng

ngoài tự nhiên kiểm tra bằng phản ứng PCR thu được 15 dòng có kết quả dương

tính với vạch băng kích thước khoảng gần 500bp phù hợp với kích thước lý thuyết

của gen arsC. Bước đầu chứng tỏ được gen arsC đã được chuyển thành công vào 15

dòng thuốc lá trên.

48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

- Đã tách và nhân dòng thành công gen arsC từ cây dương xỉ Pytirogramma

calomelanos .

- Thiết kế được vector chuyển gen pCambia 1301-arsC mang gen gen arsC.

- Đã tạo được 20 dòng thuốc lá chuyển gen mang gen arsC sống sót trên môi

trường chứa kháng sinh chọn lọc Cefotaxime và Hygromycin.

- Nhận được 15 cây dương tính trong tổng số 20 cây thuốc lá nhận được sau

chuyển gen khi kiểm tra sự có mặt của gen arsC bằng PCR.

Kiến nghị

- Cần đánh giá cây thuốc lá chuyển gen bằng một số phương pháp khác để

khẳng định chắc chắn sự có mặt của gen arsC trong cây chuyển gen (lai Southern

Blot, khả năng tích lũy As…)

- Cần đánh giá tính ổn định di truyền ở các thế hệ sau của các dòng thuốc lá

mang gen arsC thu được.

- Dựa trên những kết quả nghiên cứu của đề tài và điều kiện của từng vùng ô

nhiễm cụ thể có thể tiếp tục tạo những cây trồng chuyển gen khác nhằm mục đích cải

tạo môi trường.

49

1.Abernathy C. O.;Calderon R. L. and Chappell W.R. (1997). "Arsenic Exposure

and Health Effects." Chapman and Hall, London, England.

2. Aposhian H. V. (2001). "DMPS increases the urinary excretion of arsenic in humans." Arsenic Exposure and Health Effects. Proceedings of the 2000 Conference. Elsevier, Amsterdam.

3. Aposhian H.V et al (2001). "Methyllarsonous acid (MMA), the most toxic and neglected biotransformant of inorganic arsenic. Arsenic Exposure and Health Effects." Proceedings of the 2000 Conference.

4. Barcelos J. ; Poschenrieder C. (2003). "Phytoremediation: principles and

perspectives." Contributions to Science: 333 – 344.

5. Bencko V. (1997). "Health aspects of burning coal with a high arsenic content:

the central Slovakia experience." Arsenic Exposure and Health Effects.

6. Borum D.R. ; Abernathy C.O. (1994). "Human oral exposure to inorganic arsenic." Arsenic Exposure and Health Effects. Science and Technology Letters, Northwood, England.

7. Thị Kim Anh (2011). "Nghiên cứu sử dụng thực vật (dương xỉ) để xử lý ô nhiễm Asen trong đất vùng khai thác khoáng sản, Luận án Tiến sĩ Môi trường đất và nước, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội."

8. Burns R. G; Rogers S.; McGhee I (1996). "In Contaminants and the Soil

Environment in the Australia Pacific Region." Kluwer Academic Publishers: 361-410

9. Cebrian M.E. ; Aposhian H.V. (2001). "Assesment of arsenic body burden. The role of the DMPS challenge test." Arsenic Exposure and Health Effects. Proceedings of the 2000 Conference. Elsevier, Amsterdam.

10. Chappell W.R.;Abernathy C.O. and Calderon R.L. (1999). "Arsenic Exposure

and Health Effects." Elsevier, Amsterdam.

11. Chilton M.D. (1993). "Agrobacterium gene transfer." Progress on a poor man's

vector 90: 3119-3210.

12. Choprapawon C. ; Ajjimangkul S. (1999). "Major interventions on chronic arsenic poisoning in Ronpibool District, Thailand- review and long-term follow-up " Arsenic Exposure and Health Effects.

13. Choprapawon C. ; Rodcline A. (1997). "Chronic arsenic poisoning in Ronpibool Nakhon Sri Thammarat, the southern province of Thailand." Arsenic Exposure and Health Effectts.

14. Chowdhurry T.R. (1997). " Arsenic in groundwater in six districts of West

Bengal." Arsenic Exposure and Health Effects.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

50

15. Chowdhurry T.R. et al (1999). "Groundwater arsenic contamination and the

suffering of people in Bangladesh." Arsenic Exposure and Health Effects.

16. Curie C.; Alonso J.M.; Le Jean M.; Rcker J.R.; Briat J.F. (2000). "Involvement

of Nramp1 from Arabidopsis thaliana in ion transport." Biochem J 347: 749-755.

17. Đặng Đình Kim (2010). "Báo cáo tổng kết kết quả khoa học công nghệ đề tài nghiên cứu sử dụng thực vật để cải tạo đất bị ô nhiễm kim loại nặng tại các vùng khai thác khoáng sản, Chương trình KHNC cấp Nhà Nước KC08, Bộ Khoa học và Công nghệ.".

18. Đặng Đình Kim (2012). "Nghiên cứu sử dụng thực vật để xử lý một số kim loại nặng trong đất tại các vùng khai thác mỏ." Chuyên đề bảo vệ môi trường trong khai thác khoáng sản.

19. De la Fuente J.M.;Ramirez-Rodriguez V.;Carbera-Ponce J.L. (1997). " Aluminum tolerance in transgenic plants by alteration of citrate synthesis." (Science 276): 1566-1568.

20. Dhankher O.P.; Li Y.; Rosen B.P.; Shi J.; Salt D.; Senecoff J.F.; Sashti N.A.; Meagher R.B. (2002). "Engineering tolerance and hyperaccummulation of Arsenic in plants by combining Arsenate reductase and g-glutamylcysteine synthase expression." Nature Biotechnology(20): 1140-1145.

21. Diệp Thị Mỹ Hạnh (2007). "Thực vật có khả năng hấp thu Pb trong đất để giải

ô nhiễm." Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ (1).

23. Đồng Thị Minh Hậu ; Hoàng Thị Thanh Thủy ; Đào Phú Quốc (2008). "Nghiên cứu và lựa chọn một số thực vật có khả năng hấp thu các kim loại nặng (Cr, Cu, Zn) trong bùn nạo vét kênh Tân hóa- Lò gốm." Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ(4).

24. Ellis D.R.; Gumaelius L.; Indriolo E.; Pickering I.J.; Bank J.A.; Salt D.E. (2006). "A novel arenas reductase from the Arsenic hyperaccummulating fern Pteris vittata." Plant Physol (141): 1544-1554.

25. Folks D. J. (2001). "Impacts of historic arsenical pesticide use on residential soils in Denver, Colorado." Arsenic Exposure and Health Effects. Proceedings of the 2000 Conference.

26.Guha Mazumder D. N. et al (2001). "Treatment of chronic arsenic toxicity." Arsenic Exposure and Health Effects. Proceedings of the 2000 Conference. Elsevier, Amsterdam.

27. Guo H. R. and Greene H. L (1994). " Arsenic in drinking water and cancers: a brief descriptive review of Taiwan Studies." Arsenic Exposure and Health Effects.Science and Technology Letters. Northwood, England.

28. Hanif M. (2004). "Chracterization of small GTPase Cdc42 from the ectomycorrhizal fungus Suillus bovinus and Agrobacterium tumefaciens " University of Helsinki.

51

29. Hasegawa I.; Terada E.; Sunairi M.; wakita H.; Shinmachi F.; Noguchi A.; Nakajima M.; Yazaki J. (1997). "Genetic improvement of heavy metal tolerance in plants by transfer of the yeast metallothionein gene (CUP1)." Plant Soil 277-281. Hirschi K.D.;Zhent R.; Cunningham K.W. (1996). "CAX1, an HI/Ca2+ antiporter from Arabidopsis." 8782-8786.

30. Hoàng Thị Thanh Thủy ; Từ Thị Cẩm Loan ; Nguyễn Như Hà Vy (2007). "Nghiên cứu địa hóa môi trường một số kim loại nặng trong trầm tích sông rạch Tp Hồ Chí Minh." Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ(1).

31. Jerald L. Schnoor (2002). "Phytoremediation Of Soil And Groundwater." Center for Global and Regional Environmental Research and Dept. of Civil and Environmental Engineering.

32. Kilburn K. H. (1997). "Neurobehavioral impairment from long-term residential

arsenic exposures." Arsenic Exposure and Health Effects.

33. Lâm Minh Triết ; Lê Huy Bá (2006). "Sinh thái môi trường học cơ bản." Nxb

Đại học Quốc gia TPHCM 576.

34. Lê Thanh Hòa (2003). "Sinh học phân tử virus Gumboro, nghiên cứu ứng dụng

tại Việt Nam." Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

35. Lê Thị Thu Hiền (2003). "Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumfaciences mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng." Luận án tiến sĩ, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

36. Lê Trần Bình ; Phan Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn (2003). "Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam." Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

37. Liao X (2004). "Root distributions and elemental accumulations of Chinese

brake (Pteris vittata L.) from As-contaminated soils." Plant and Soil 109–116.

38. Ma J. Q. ; Komar M. ; Zhang T.W .; Cai Y. ; Kenelley E.D. (2001). "A fern

that hyperaccumulaters Arsenic." Nature: 509.

39. Michielse B. C ; Hooykaas P. J. J. (2008). "Agrobacterium – mediated

transformation of the filamentous fungus Aspergillus awamori."

40. Murcott S. (2001). "A comprehensive review of low-cost, well-water treatmen

technologies for arsenic removal " Proceedings of the 2000 Conference.

41. Nguyễn Đình Tuấn (2005). "Chất lượng nước kênh rạch tại Tp Hồ Chí Minh - Hiện trạng và thách thức." Báo cáo hội thảo “Phát triển bền vững thành phố xanh trên lưu vực sông”: 8 - 9.

42. Nguyễn Đức Thành (2003). "Chuyển gen ở thực vật." Nxb Khoa học và Kĩ

thuật, Hà Nội.

52

43. Nguyễn Khắc Hải (2006). "Ảnh hưởng của ô nhiễm asen trong nguồn nước sinh

hoạt đến sức khỏe con người." Thông tin KHCN.

44. Nguyễn Tiến Cư ; Trần Văn Tựa ; Đặng Đình Kim ; Đỗ Tuấn Anh ; Lê Thu Thủy (2007). "Nghiên cứu khả năng xử lý chì (Pb) trong đất ô nhiễm bằng cây cỏ Vetiver zizannioides." Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường.: 308- 312.

45. Phạm Văn Khang; Nguyễn Ngọc Minh; Nguyễn Xuân Huân (2004). "Một số

nghiên cứu về kim loại nặng trên thế giới." Tạp chí khoa học đất(20): 157- 161.

46. Pilon-Smits E. (2005). "Phytoremediation." Annu. Rev. Plant Biol 56: 15-39.

47. Prasad M.N.V.; Freitas H.O. (2003). "Metal hyper accumulation in plant –

Biodiversity prospecting for phytoremendiation technology." J of Biotech(3): 285-321

48. Raskin I.; Smith R.D.; Salt D.E. (1997). "Phytoremediation of metals: Using

plants to remove pollutants from the environment." Curr. Opin. Biotechnol(2): 221-226.

the

in

49. Sabarrinath S.; Shan W.; Lena Q. M.; Bala R. (2009). "Expression of a Pteris vittata glutaredoxin PvGRX5 in transgenic Arabidopsis thaliana increases plant arsenic tolerance and decreases arsenic accumulation leaves." Plant, Cell and Environment(32): 851–858.

50. Sancha A.M. (1999). "Full-scale application of coagulation processes for

arsenic removal in Chile: a successful case study." Arsenic Exposure and Health Effects.

51. Sasieni P. ; Evans S. ; Cuzick J. (1994). "Long term follow-up of patients treated with medicinal arsenic." Arsenic Exposure and Health Effects. Science and Technology Letters, Northwood, England.

52. Saxena PK. (1999). "Phytoremediation of heavy metal contaminated and polluted soils." MNV prasad & J Hagemayr (eds) Heavy metal stress on plants, From molecules to ecosystems, Springer Verlag, Berlin: 305-329.

53. Saxena PK. et al (1999). "Phytoremediation of heavy metal contaminated and polluted soils." MNV prasad & J Hagemayr (eds) Heavy metal stress on plants, From molecules to ecosystems, Springer Verlag, Berlin: 305-329.

54. Schat H. et al (1999). "Metal specific patterns of tolenrance, uptake, and in hyperaccumulating and non-hyperaccumulating

transport of heavy metals metallophytes." Phytoremediation of contaminated soils and waters: 171-188.

55. Styblo M. and Lin S. (2001). "Toxic consequences of the metabolism of

arsenic. Arsenic Exposure and Health Effects." Proceedings of the 2000 Conference.

56. Sun G.F. (1999). "The present situation of chronic arsenism and research in

China." Arsenic Exposure and Health Effects.

53

57. Sun H. H.; Sun A.C.; Hyeon Y; Kyung-Suk C. (2011). "Screening of Cucumis sativus as a new arsenic-accumulating plant and its arsenic accumulation in hydroponic culture." Environ Geochem Health: 143–149.

58. Thomas D. J. et al (2001). "Dore-response relations for the excretion of methylated arsenicals in urine by individuals chronically exposed to inorganic arsenic." Proceedings of the 2000 Conference.

59. Timothy Oppelt E. (2000). " Introduction to Phytoremediation." National Risk Management Research Laboratory, Office of Research and Development, U.S. Environmental Protection Agency.

60. Trần Văn Tựa ; Nguyễn Đức Thọ ; Đỗ Tuấn Anh ; Nguyễn Trung Kiên ; Đặng Đình Kim (2007). "Sử dụng cây sậy và cỏ vetiver trong xử lý nước thải chứa Cr và Ni theo phương pháp vùng rễ." Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường.: 29.

61. Van de Zaal B.J.; Neuteboom L.W.; Pinas J.E.; Chardonnens S.; Schat H.; Verkleij J.A.; Hooykaas.C. (1999). "Over expression of a novel Arabidopsis gene related to putative zinc transporter genes from animal can lead to enhanced zinc resistance and accumulation." Plant Physiol: 1047-1055.

62. Vũ Quyết Thắng (1998). "Hàm lượng kim loại nặng trong đất và rau muống

Thanh Trì." Tạp chí hoạt động khoa học: 31-32.

63. Willard Chappell (1999). "Arsenic Exposure and Health Effects V." Gulf

Professional Publishing 5.

64. Yadav R.; Arora P.; Kumar S. (2010). "Perspectives for genetic engineering of

poplars for enhanced phytoremediation abilities." Ecotoxicology(19): 1574–1588.

65. Yoshihiro Narusaka ; Mari Narusaka ; Satoshi Yamasaki ; Masaki Iwabuchi (2012). "Transgenic Plants - Advances and Limitations." Agricultural and Biological Sciences(9).

66. Zhu Y.;Pilon-Smits E.A.H.; Jouanin L.; and Terry N. (1999). "Over expression tolerance and

juncea enhances Cadmium

in Brassica

of glutathione synthetase accumulation." Plat Physiol 119: 73-79.

54

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Sơ đồ vector tách dòng pBT

Phụ lục 2: Cấu trúc vector pCambia 1301

Phụ lục 3: Danh mục hóa chất và nồng độ sử dụng trong tách chiết ADN và

plasmid

Hóa chất

Tris-HCl EDTA Glucose NaOH SDS Potassium acetat Acetic acid Ethanol Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Nồng độ 25 mM 10 mM 50 mM 0,2 N 1 % 3M 11,5% 70 %

Phụ lục 4: Thành phần và chu trình phản ứng PCR

Chu kì nhiệt Thành phần Thể tích 1 phản ứng

Thời gian 10.5 H2O

2 5 phút Dream Taq Buffer

4 50 giây Nhiệt độ 94 oC 94 oC dNTP

1 50 giây 55 oC Reverse Primer 35 chu kì

1 1 phút 30giây Forward Primer

0.5 10 phút 72oC 72 oC Taq

1 Sample

20 Tổng thể tích

Phụ lục 5: Quy trình điện di DNA trên gel agarose

Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di

chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường độ

thích hợp

Chuẩn bị gel agarose: cho 1g agarose vào 100 ml dung dịch TBE 1X, lắc đều và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội đến khoảng 50 – 60oC, đổ dung dịch

vào khay điện di có cài sẵn răng lược, để gel đông cứng, rút lược và đặt bản gel vào

bể điện di, đổ dung dịch TBE ngập bản gel từ 1 - 2 mm. Tra mẫu và chạy điện di:

mẫu DNA được trộn với đệm tra mẫu, mix đều và tra vào giếng, chạy điện di với

thang DNA chuẩn để xác định trọng lượng phân tử DNA.

Nhuộm bản gel: bản gel được lấy ra khỏi khuôn, ngâm 15 - 20 phút trong

dung dịch Ethidium Bromide, rửa lại bằng nước và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại

254 nm trên máy soi DNA, ảnh được chụp bằng máy soi gel.

Phụ lục 6: Quy trình chuyển gen quan tâm vào thuốc lá cải tiến

(Toopping, 1998)

1. Chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa gen quan tâm được bảo quản trong glycerol -80oC được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc, nuôi tối ở 28oC trong 2 ngày.

2. Cây con in vitro phát triển 3-4 lá thật, chọn các lá bánh tẻ để tiến hành biến nạp. Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1 cm2 trong môi trường ½ MS

lỏng và đặt lên môi trường cảm ứng GM (MS + 1mg/l BAP).

3. Một ngày trước khi biến nạp, chọn khuẩn lạc tròn đều, đứng độc lập nuôi

lỏng trong 10 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi qua đêm (16 giờ). Sau đó

nuôi phục hồi thêm 4 giờ trong 50 ml LB không bổ sung kháng sinh chọn lọc.

4. Biến nạp:

- Khuẩn sau khi nuôi được đem đo OD600= 0,6-1 thì sử dụng để biến nạp.

- Đem ly tâm lạnh thu cặn khuẩn, cặn khuẩn được hòa tan với dung dịch ½

MS để tạo dịch huyển phù vi khuẩn.

- Các mảnh lá sau 2 ngày nuôi cấy cảm ứng trên môi trường GM được chuyển

sang b ình tam giác có chứa dung dịch ½ MS lỏng và dịch huyền phù vi khuẩn.

5. Sau 30 phút chuyển các mảnh lá lên giấy thấm tiệt trùng, thấm khô và cấy

lên môi trường GM không có kháng sinh, đồng nuôi cấy 2 ngày.

6. Sau 2 ngày, cấy chuyển các mảnh lá sang môi trường chọn lọc chồi 1 GM

có bổ sung Cefotaxime 500mg/l và Hygromycin 5mg/l.

7. Sau 2-3 tuần, các mảnh lá bắt đầu được cảm ứng tạo mô sẹo tiếp tục được

chuyển sang môi trường chọn lọc chồi 1 GM có bổ sung Cefotaxime 500mg/l +

Hygromycin 5mg/l.

8. Sau 4 tuần, các mảnh lá đã tạo chồi được chuyển sang môi trường chọn lọc

chồi 2 GM có bổ sung 500 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hygromycin.

9. Sau khi tạo đa chồi, các chồi phát triển tốt được chuyển sang môi trường tạo

rễ RM có bổ sung 500 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hygromycin.

10. Cây con ra rễ nhiều, cao 5-7 cm thì được đua ra bầu chứa giá thể đất : trấu

: cát (1:1:1).

11. Sau 2 tuần, cây phát triển ổn định, tiến hành kiểm tra cây sau chuyển gen.

Phụ lục 7: Thành phần môi trường nuôi và chọn lọc cây thuốc lá chuyển gen

Thành phần môi trường Môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) MS + 1 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar, pH = 5,8 MS + 0.1 mg/l NAA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar, pH = 5,8 MS + 1 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 500 mg/l Cefotaxime + 5 mg/l Hygromycin, pH = 5,8

MS + 1 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 500 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hygromycin, pH = 5,8

Tên môi trường MS Tái sinh chồi (GM) Ra rễ (RM) Chọn lọc chồi chuyển gen 1 (GM Hygromycin 5) Chọn lọc chồi chuyển gen 2 (GM Hygromycin 10) Chọn lọc cây hoàn chỉnh (RM)

MS + 0,1 mg/l NAA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 500 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hygromycin, pH = 5,8