Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm carbapenem bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------

Lê Đức Dũng

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM

CARBAPENEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

(CE-C4D)

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

Hà Nội, năm 2020

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------

Lê Đức Dũng

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM

CARBAPENEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

(CE-C4D)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hường

Hướng dẫn 2: PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Mai

Hà Nội, năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số

liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong

bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2020

Tác giá luận văn

Lê Đức Dũng

III

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực hiện đề tài, em tỏ lòng biết ơn chân thành của mình

tới những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em trong thời gian qua.

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hường

và PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Mai đã giao để tài, nhiệt tình hướng dẫn, và tạo

mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này.

Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện

Khoa học và Công nghệ, các thầy cô giáo giảng dạy tại bộ môn hóa phân tích,

khoa hóa học của Học viện Khoa học và Công nghệ cùng trường đại học

Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi giúp

tôi hoàn thành khóa học và có những đóng góp quý báu cho em trong thời

gian nghiên cứu.

Em xin chân thành cảm ơn NCS. Lê Thái Bình tại bộ môn Hóa phân

tích Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà

Nội đã tạo điều kiện, tư vấn và phối hợp trong quá trình thực hiện đề tài.

Luận văn được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài mã số

104.04-2018.305 của quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia

(NAFOSTED).

Cuối cùng, em xin cảm ơn công ty 3Sanalysis đã cung cấp thiết bị CE-

C4D để thực hiện nghiên cứu này, cảm ơn các anh chị trong nhóm nghiên cứu

sử dụng thiết bị CE-C4D của bộ môn Hóa phân tích, Khoa Hóa học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giúp đỡ, hướng dẫn

tận tình trong thời gian qua.

Hà Nội, ngày 28 tháng 05 năm 2020

Học viên

Lê Đức Dũng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. ii

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. iv

DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... x

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ xii

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................. 2

1.1. Giới thiệu chung về nhóm carbapenem ....................................... 3

1.1.1. Giới thiệu về nhóm carbapenem ........................................... 3

1.1.2. Cơ chế tác dụng và đặc điểm dược động học........................ 7

1.2. Các phương pháp xác định carbapenem ...................................... 9

1.2.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis ................ 9

1.2.2. Phương pháp điện hóa ......................................................... 10

1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............... 11

1.3. Phương pháp điện di mao quản .................................................. 19

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1. Mục tiêu nghiên cứu ................... Error! Bookmark not defined.

2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................. 33

2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................ 33

2.3.1.Phương pháp phân tích CE-C4D .......................................... 33

2.3.1.Thiết bị và hóa chất .............................................................. 34

2.4. Phương pháp xử lý mẫu ............................................................. 36

2.4.1.Mẫu dược phẩm .................................................................... 36

2.4.2. Xử lý mẫu dược phẩm ......................................................... 36

2.5. Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích .. 37

2.5.1.Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ........................... 37

2.5.2.Độ chụm (độ lặp lại của phương pháp) ................................ 37

2.5.3.Độ đúng, độ thu hồi của phương pháp ................................. 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 39

3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu trong việc tách và xác định bốn kháng

sinh nhóm carbapenem bằng phương pháp CE-C4D ........................ 39

3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm ............................. 39

3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu ....................... 49

3.1.4. Khảo sát chiều cao bơm mẫu .............................................. 51

3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thế tách ......................................... 53

3.2. Đánh giá phương pháp phân tích ............................................... 55

3.2.1. Xây dựng đường chuẩn các carbapenem ............................ 56

3.2.2. Giới hạn định lượng (LOD) và giới hạn phát hiện của

phương pháp (LOQ) ...................................................................... 59

3.2.3. Độ chụm của phương pháp ................................................. 60

3.2.4. Độ đúng của phương pháp .................................................. 61

3.3. Phân tích mẫu thực tế và đối chứng phương pháp tiêu chuẩn

HPLC ........................................................................................................... 62

3.3.1. Phân tích một số mẫu thuốc kháng sinh carbapenem ......... 62

3.3.2. Phân tích đối chứnghàm lượng các carbapenem trong mẫu

dược phẩm với phân pháp tiêu chuẩn HPLC-PDA ....................... 65

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 68

Danh mục bài báo công bố liên quan đến nội dung luận văn ......................... 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 71

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 76

VII

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

Ace Acetic Acid Axit axetic

Arg Arginine Arginin

Capacitively coupled Detector độ dẫn không tiếp C4D contactless conductivity xúc detector

Phương pháp điện di mao CE Capillary electrophoresis quản

Capillary zone Phương pháp điện di mao CZE electrophoresis quản vùng

Electro osmotic flow Dòng điện di thẩm thấu EOF

Histidine Histidin His

High performance liquid Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC chromatography

Inner diameter Đường kính trong I.D

limit of detection Giới hạn phát hiện LOD

limit of quantitation Giới hạn định lượng LOQ

mass spectrometry Khối phổ MS

Photo Diode Array Detector mảng diot quang PDA

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

VIII

Micellar electrokinetic Điện di mao quản điện

MEKC chromatography động học Mixen

Tris (hydroxymethyl) Tris (hydroxymetyl) Tris aminomethane aminometan

UV-Vis Ultra violet - Visible Phổ phấp thụ phân tử

SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodecyl sulfat

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số nghiên cứu tách và xác định các carbapenem bằng

phương pháp quang phổ, điện hóa và sắc ký .................................. 14

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu tách và xác định các carbapenem bằng điện

di mao quản..................................................................................... 29

Bảng 3.1: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Ace . 41

Bảng 3.2: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Asc . 41

Bảng 3.3: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Lactic

........................................................................................................ 43

Bảng 3.4: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Tris/Lactic

........................................................................................................ 44

Bảng 3.5: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Tris/Ace . 46

Bảng 3.6: Độ phân giải của các cặp carbapenem ở các nồng độ đệm khác

nhau ................................................................................................. 48

Bảng 3.7: Độ phân giải của các cặp carbapenem ở các nồng độ đệm khác

nhau ................................................................................................. 50

Bảng 3.8: Độ phân giải của các cặp carbapenem khi thay đổi chiều cao

bơm mẫu ......................................................................................... 52

Bảng 3.9: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng các thế điện di

khác nhau ........................................................................................ 53

Bảng 3.10: Điều kiện tối ưu xác định bốn kháng sinh nhóm carbapenem 55

Bảng 3.11: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất của các

carbapenem ..................................................................................... 56

Bảng 3.12: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình

đường chuẩn doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem .... 58

Bảng 3.13: Giới hạn phát hiện của doripenem, meropenem, imipenem và

ertapenem bằng phương pháp điện di mao quản ............................ 59

Bảng 3.14: Phương trình đường chuẩn, giới hạn phát hiện (LOD) và giới

hạn định lượng (LOQ) của các carbapenem ................................... 59

Bảng 3.15: Độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng

doripenem và meropenem .............................................................. 60

Bảng 3.16: Độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng

imipenem và ertapenem .................................................................. 60

Bảng 3.17: Độ thu hồi phương pháp CE-C4D xác định ba kháng sinh

nhóm carbapenem ........................................................................... 62

Bảng 3.18: Kết quả phân tích các kháng sinh nhóm carbapenem bằng

phương pháp CE-C4D ..................................................................... 63

Bảng 3.19: Kết quả phân tích các kháng sinh nhóm carbapenem bằng

phương pháp CE-C4D và phương pháp tiêu chuẩn HPLC-PDA.... 65

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản của carbapenem ................................................ 3

Hình 1.2: Công thức cấu tạo doripenem ..................................................... 4

Hình 1.3: Công thức cấu tạo meropenem ................................................... 5

Hình 1.4: Công thức cấu tạo imipenem ...................................................... 6

Hình 1.5: Công thức cấu tạo ertapenem ...................................................... 7

Hình 1.6: Cấu tạo hệ CE cơ bản ................................................................ 21

Hình 1.7: Mô hình dòng EOF trong phương pháp điện di mao quản ....... 21

Hình 1.8: Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc. 24

Hình 1.9: A) Sơ đồ biểu diễn cấu trúc của detector C4D .......................... 24

Hình 1.10: Biểu diễn mối liên hệ giữa tín hiệu đầu ra và độ lớn (điện thế

và tần số) của nguồn kích thích xoay chiều .................................... 25

Hình 1.11: Sơ đồ thiết kế của C4D ............................................................ 26

Hình 1.12: Các kĩ thuật bơm mẫu ............................................................. 27

Hình 2.1: Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D sử dụng trong nghiên cứu ......... 34

Hình 3.1: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng

hệ đệm Arg 10mM/Ace ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-

C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm,

chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm

mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm ................................................ 40

Hình 3.2: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng

hệ đệm Arg 10mM/Asc ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-C4D

khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm,

XII

chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm

mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm ................................................ 42

Hình 3.3: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng

hệ đệm Arg 10mM/Lactic ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-

C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm,

chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm

mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm ................................................ 43

Hình 3.4: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng

hệ đệm Tris 10mM/Lactic ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-

C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm,

chiều dài mao quản 60cm ( độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm

mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm ................................................ 44

Hình 3.5: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng

hệ đệm Tris 10mM/Ace ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-

C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm,

chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm

mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm ................................................ 45

Hình 3.6: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng

tại pH=8 của các hệ đệm điện di khác nhau. Các điều kiện CE-C4D

khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm,

chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm

mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm ................................................ 46

Hình 3.7: Điện di đồ của các carbapenem (nồng độ 50ppm) khi thay đổi

nồng độ đệm. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV, mao

quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ

XIII

dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu

10cm ............................................................................................... 48

Hình 3.8: Điện di đồ của các carbapenem (nồng độ 50ppm) khi thay đổi

thời gian bơm mẫu. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV,

mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm

(độ dài hiệu dụng 50cm), chiều cao bơm mẫu 10cm ..................... 50

Hình 3.9: Điện di đồ của các carbapenem (nồng độ 50ppm) khi thay đổi

chiều cao bơm mẫu. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV,

mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm

(độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 20s .......................... 52

Hình 3.10: Điện di đồ của các carbapenem (nồng độ 50ppm) khi thay đổi

thế áp 2 đầu mao quản. Các điều kiện CE-C4D khác: mao quản

silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài

hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 20s chiều cao bơm mẫu 20cm

........................................................................................................ 54

Hình 3.11: Điện di đồ phân tách đồng thời bốn kháng sinh ở điều kiện tối

ưu như bảng 3.10 ............................................................................ 55

Hình 3.12: Đường chuẩn của các carbapenem .......................................... 57

Hình 3.13: Kết quả phân tích giữa nhãn công bố và CE-C4D .................. 64

Hình 3.14: Kết quả phân tích một số mẫu dược phẩm trên thị trường. Điều

kiện CE-C4D như hình 3.11 ............................................................ 64

Hình 3.15: Sự tương quan giữa kết quả phân tích HPLC và CE-C4D ...... 66

XIV

MỞ ĐẦU

Thuốc kháng sinh được nhà khoa học Scottland, Alexander Fleming [1]

sáng chế vào năm 1928. Kháng sinh là những hợp chất hóa học, có tác động

chuyên biệt trên một giai đoạn chuyển hóa thiết yếu của vi sinh vật. Thuốc

kháng sinh có thể kìm hãm hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh ngăn cho

chúng phát triển và lây lan. Với những nước đang phát triển như Việt Nam,

đây là một nhóm thuốc quan trọng vì bệnh lý nhiễm khuẩn nằm trong số

những bệnh đứng hàng đầu cả về tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong.

Hiện nay, kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong điều trị vấn đề liên

quan đến nhiễm khuẩn. Trong đó, phải kể đến các kháng sinh thuộc nhóm

carbapenem. Carbapenem là phân nhóm kháng sinh thuộc họ beta-lactam có

phổ rộng, tác dụng trên hầu hết các vi khuẩn Gram dương và Gram âm [2], kể

cả các chủng vi khuẩn tiết betalactamase hoạt phổ rộng thường được sử dụng

để điều trị các bệnh nhiễm trùng nặng do vi khuẩn có nguy cơ tử vong cao.

Doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem là các kháng sinh đại diện

của nhóm carbapenem được sử dụng hiệu quả trong bệnh viện và các cơ sở y

tế, cũng là đối tượng được lựa chọn trong nghiên cứu này.

Hiện nay có nhiều phương pháp định tính, định lượng các hoạt chất

trong thuốc như: phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) [3, 4],

phương pháp điện hóa [5], sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [6, 7, 8, 9, 10,

11],...Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi hệ thiết bị đắt tiền, quá trình xử

lý tốn nhiều thời gian. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ

dẫn không tiếp xúc CE-C4D có nhiều ưu điểm như thiết bị đơn giản, sử dụng

ít hóa chất, thời gian phân tích phù hợp với điều kiện nghiên cứu ở Việt Nam.

Do vậy, đề tài “Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm carbapenem

bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp

xúc (CE-C4D)” được lựa với các mục tiêu sau:

- Khảo sát tối ưu quy trình phân tích đồng thời bốn kháng sinh nhóm

carbapenem gồm: doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem

bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không

tiếp xúc (CE-C4D)

- Thẩm định và đánh giá phương pháp trên nền mẫu dược phẩm nhằm

hướng áp dụng quy trình phân tích trong kiểm soát chất lượng

nguyên liệu, bán thành phẩm trong các nhà máy sản xuất các sản

phẩm có chứa hoạt chất này, cũng như áp dụng trong phân tích sàng

lọc (áp dụng cho các đội quản lý thị trường với ưu thế thiết bị CE-

C4D đơn giản, nhỏ gọn, linh động và chi phí thấp) đối với chất

lượng thuốc trên thị trường trước khi gửi mẫu phân tích theo các

phương pháp chuẩn theo dược điển.

TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung về nhóm carbapenem

1.1.1. Giới thiệu về nhóm carbapenem

Carbapenem thuộc nhóm kháng sinh beta-lactam bán tổng hợp, có cấu

trúc khác các kháng sinh penicillin là sản phẩm được cấu tạo bởi một nguyên

tử carbon thay thế cho nguyên tử lưu huỳnh trong cấu trúc vòng thiazollidin

và có liên kết đôi giữa C-2 và C-3. Thêm vào đó, với việc có nhóm

etylhydroxyl liên kết với vòng beta-lactam làm cấu trúc nó khác với các

cephalosporin và penicillin, đồng thời còn khác các kháng sinh cephalosporin

và penicillin là nhóm acylamino. Dưới đây là công thức phân tử chung của

nhóm carbapenem [12].

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản của carbapenem

Trong nhóm carbapenem có bốn chất cơ bản được sử dụng phổ biến tại

Việt Nam là doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem.

1.1.1.1. Doripenem

- Tên IUPAC: (4R,5S,6S)-6-[(1R)-1.hydroxyethyl]-4.methyl-7-oxo-

3.[(3S,5S)-5-[(sulfamoylamino)methyl]pyrrolidin-3.yl]sulfanyl- 1.azabicyclo [3.2.0] hept-2.ene-2.carboxylic acid [12, 13, 14].

- Khối lượng phân tử: 420,532 g.mol-1

- Công thức phân tử: C15H24N4O6S2

- Hằng số phân ly: pKa= 4,37; pKb= 9,39.

- Meropenem chất bột màu trắng, tan ít trong nước và đimetyl sulfoxide

[15].

Hình 1.2: Công thức cấu tạo doripenem

Doripenem bền vững với tác dụng thủy phân của dehydropeptidase-I

(DHP-1) có ở vi nhung mao của tế bào ống lượn gần của thận hơn so với

imipenem, vì vậy không cần dùng cùng với chất ức chế DHP-1 như cilastatin.

Doripenem ức chế sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn bằng cách gắn với

protein liên kết penicilin (PBP) để làm bất hoạt các protein này, từ đó có tác

dụng diệt khuẩn.

1.1.1.2. Meropenem

- Tên IUPAC: (4R,5S,6S)-3.(((3S,5S)-5-(Dimethylcarbamoyl)pyrrolidin-

3.yl)thio)-6-((R)-1.hydroxyethyl)-4.methyl-7-oxo- 1.azabicyclo[3.2.0]hept-2.ene-2.carboxylic acid [12, 13, 14].

- Khối lượng phân tử: 383,464 g.mol-1

- Công thức phân tử: C17H25N3O5S

- Hằng số phân ly: pKa= 3,47; pKb= 9,39.

- Meropenem có dạng bột, tinh thể màu trắng đến vàng nhạt, ít tan trong nước, hầu như không tan trong etanol, không tan trong ete, axeton [15].

Hình 1.3: Công thức cấu tạo meropenem

Meropenem có phổ hoạt tính rộng phần lớn với vi khuẩn Gram dương,

Gram âm, vi khuẩn hiếu khí và kị khí; nằm trong danh sách các loại thuốc

thiết yếu của Tổ chức Y tế Thế Giới

Meropenem không hấp thụ được qua đường tiêu hóa, được chỉ định để

điều trị các nhiễm khuẩn ở người lớn và trẻ em trên 3 tháng tuổi gây ra bởi

một hay nhiều vi khuẩn nhạy cảm với meropenem như viêm phổi và viêm

phổi bệnh viện; nhiễm khuẩn đường niệu; nhiễm khuẩn trong ổ bụng;

nhiễm khuẩn da và cấu trúc da; nhiễm khuẩn huyết; nhiễm khuẩn phụ

khoa; các bệnh lý vùng chậu; đặc biệt meropenem là kháng sinh duy nhất

trong nhóm carbapenem được chấp thuận điều trị viêm màng não. Không

khuyến cáo dùng trong trường hợp nhiễm trùng do các Stapylococcus đề

kháng với meticilin [12, 13, 14].

1.1.1.3. Imipenem

- Tên IUPAC: (5R, 6S) -3. [2. (aminomethylideneamino) ethylsulfanyl] - 6 - [(1R) -1.hydroxyethyl] -7-oxo-1.azabicyclo [3.2.0] hept-2.ene- Axit 2.carboxylic [12, 13, 14].

- Khối lượng phân tử: 299,347 g.mol-1

- Công thức phân tử: C12H17N3O4S

- Hằng số phân ly: pKa= 3,63; pKb= 10,88.

Imipenem có dạng bột, tinh thể màu trắng, hút ẩm. Độ hòa tan của imipenem: 1g/1000ml H2O hoặc 1g/2000ml metanol, không tan trong etanol, đimetylformamide và đimetylsulfoxide [15].

Hình 1.4: Công thức cấu tạo imipenem

Imipenem là một loại kháng sinh carbapenem có phổ kháng khuẩn rộng

hơn và lớn hơn hiệu lực hơn các kháng sinh beta-lactam khác. Nó thường

được sử dụng kết hợp với cilastatin - chất ức chế sự phân huỷ của imipenem

bởi emzym dehdropeptidase có trong ống thận. Imipenem/cilastatin thường

được dùng tiêm tĩnh mạch.

Imipenem được chỉ định để điều trị các bệnh nhiễm trùng nặng đặc biệt

với các vi khuẩn kháng cephalosporin. Imipenem được sử dụng riêng hoặc kết

hợp với một aminoglycoside, nó có thể được sử dụng cho nhiễm trùng

nghiêm trọng bao gồm nhiễm trùng phổi, trong ổ bụng và mô mềm [12].

1.1.1.4. Ertapenem

- Tên IUPAC: (4R, 5S, 6S) -3 - [(3S, 5S) - 5 - [(3.carboxyphenyl) carbamoyl] pyrrolidin-3.yl] sulfanyl-6 - [(1R) -1. hydroxyethyl] - 4.methyl-7-oxo-1.azabicyclo [3.2.0] axit hept-2.ene-2.carboxylic.

- Khối lượng phân tử: 475,516 g.mol-1

- Công thức phân tử: C22H25N3O7S

- Hằng số phân ly: pKa= 3,22; pKb= 9,03.

- Ertapenem có dạng bột, tinh thể màu trắng, hút ẩm, tan trong nước,

không tan trong etanol, isopropyl acetate và tetrahydrofuran [15].

Hình 1.5: Công thức cấu tạo ertapenem

Ertapenem là một kháng sinh phổ rộng carbapenem với phổ hoạt động

hẹp hơn so với imipenem. Thuốc này có tác dụng với hầu hết các vi khuẩn

đường ruột và vi khuẩn kị khí nhưng hiệu quả thấp hơn các carbapenem khác

khi điều trị các vi khuẩn Gram(+), đặc biệt là các vi khuẩn ruột và phế cầu

kháng penicilin.

Ertapenem có tác dụng điều trị nhiễn khuẩn ổ bụng, đường tiết niệu và

da, và nhiễm trùng cấu trúc da, cấp tính nhiễm trùng vùng chậu và viêm phổi.

1.1.2. Cơ chế tác dụng và đặc điểm dược động học

1.1.2.1. Cơ chế tác dụng

Với đặc điểm có liên kết ái cao với các protein liên kết penicillin (PBP)

của vi khuẩn Gram âm và Gram dương [2, 16] thì các kháng sinh nhóm

carbapenem có thể làm gián đoạn quá trình sinh tổng hợp vách tế bào dẫn đến

vi khuẩn không có vách tế bào che chở sẽ bị tiêu diệt bởi vì khả năng gây ức

chế giai đoạn cuối của quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn [2].

Thông thường, kháng sinh nhóm carbapenem có phổ kháng khuẩn rộng

và không bị ảnh hưởng chéo với các thuốc khác trong họ beta-lactam do

carbapenem có khả năng thấm tốt qua màng tế bào và bền vững với nhóm

beta-lactmase [16].

1.1.2.2. Đặc điểm dược động học

Do không có khả năng hấp thụ qua đường uống nên các kháng sinh

carbapenem đều được sử dụng ở dạng truyền tĩnh mạch [16, 17].

Với 2 kháng sinh imipenem và meropenem liều được sử dụng thông

thường là 500mg và 1000mg. Sau khi truyền vào tĩnh mạch thì nồng độ đạt

đỉnh trong huyết tương (Cmax) của imipenem 30-35mg/l và 60-70mg/l với liều

dùng lần lượt là 500mg và 1000mg [15], còn sau 4-6 giờ thì nồng độ còn lại

trong huyết tương lần lượt là 0,5mg/l và 2mg/l. Cùng liều truyền đó với

meropenem có giá trị Cmax lần lượt là 26 mg/l và 50-60mg/l [2].

Nhờ có khả năng liên kết với protein trong huyết tương lên đến 92,95%

của ertapenem cho nên khác với các kháng sinh khác dùng một ngày ít nhất

ba lần như imipenem 20% và meropenem 2% ( khả năng liên kết với protein)

thì ertapenem có thể dùng 1 lần/ ngày [2].

Do khả năng phân bố tốt trong dịch cơ thể nên nồng độ Imipenem trong

các dịch tuyến tiền liệt, cơ quan sinh dục nữ, phổi, nước bọt, vỏ thận, tủy thận

và tủy đều vượt trên nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của hầu hết các vi khuẩn

hiếu khí; còn meropenem thì phân bố chủ yếu ở dịch kẽ [18]. Với meropenem

nồng độ thuốc sau khi truyền từ 1,5-2 giờ với liều truyền 1000mg đo được tại

một số cơ quan: tại phổi là 1,43-8,32mg/kg; tại túi mật là 4,21-5,95mg/kg; tại

da là 4,21-5,95mg/kg và 0,65-4,52 mg/kg tại đại tràng [18]. Ngoài ra, với khả

năng xâm nhập được dịch não tủy ở bệnh nhân viêm não với nồng độ 0,1-

2,8mg/l với liều dùng 20mg/kg và nồng độ 0,3-6,5mg/l với liều dùng

40mg/kg thì meropenem là kháng sinh duy nhất được chỉ định điều trị viêm

màng não trong nhóm dược FDA.

Để tránh bị mất hoạt tính và hình thành dẫn chất chuyển hóa gây độc

cho thận do bị thủy phân bởi dehydropeptidase (DHP-I) thì imipenem luôn

được phối hợp với cilastatin theo tỷ lệ khối lượng 1:1 để ức chế DHP-I [19,

20].

Ngược lại với imipenem thì các kháng sinh carbapenem khác như

meropenem, ertapenem và doripenem lại bền vững với DHP-1 do đó không

cần chất gây ức chế DHP-1 khi sử dụng [20]. Khác với meropenem chủ yếu

được bài tiết qua thận dưới dạng chưa chuyển hóa (khoảng 70%) thì

ertapenem được thải trừ qua lọc ở cầu thận và bài tiết tại ống thận. Các nghiên

cứu trước đây đã xác định được khoảng 80% lượng ertapenem được tìm thấy

trong nước tiểu dưới dạng chưa chuyển hóa, còn sản phẩm chuyển hóa chính

của ertapenem tạo thành là do DHP-1 mở vòng beta-lactam [21].

1.2. Các phương pháp xác định carbapenem

1.2.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử là phương pháp trắc quang

dùng để phân tích định lượng dựa trên mối hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân

tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Vùng bức xạ thông thường được sử

dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần 200÷400nm hay vùng khả

kiến ứng với bước sóng khoảng từ 400÷900nm (tùy thiết bị của mỗi hãng).

Nguyên tắc hoạt động của phương pháp tuân theo định luật Bouger – Lambert

– Beer. Với nguyên tắc đơn giản thì phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

UV-Vis được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.

Với ưu điểm như thế, Sharma Shalvi, Agrawal Nitasha, Singh Jaskaran

and Shukla S.K sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis xác

định meropenem (bước sóng hấp thụ cực đại 305nm trong chloroform) và

imipenem (bước sóng hấp thụ cực đại 295nm trong etanol) trong nước tiểu

với việc sử dụng dung môi chiết chloroform/axeton với meropenem và

chloroform/dietyl ete/ etanol với imipenem. Kết quả thu được với meropenem

là 73,85% và imipenem là 93,81 % với mẫu nước tiểu tự tạo [3].

Trong một nghiên cứu khác, với việc không bị ảnh hưởng bởi phổ hấp

thụ của chất ức chế cilastatin tại bước sóng 318nm như 243nm (hai đỉnh hấp

thụ cực đại của imipenem) thì 318nm được R.J. Forsyth và các cộng sự sử

dụng để xác định để xác định hàm lượng imipenem trong mẫu dược phẩm

bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis. Kết quả thu được

đường chuẩn của Imipenem nằm trong khoảng từ 14 - 42ppm với hệ số tương

quan R2>0,99 [4]. Các kết quả sau đó được đối chứng với phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao thì thấy độ sai khác giữa hai phương pháp đều nhỏ hơn

10%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác cao.

Tuy là phương pháp dễ thực hiện, chi phí sử dụng thấp nhưng phương

pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử lại bị hạn chế ở một số đối tượng mẫu nhất

định, dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố có trong nền mẫu nên nền mẫu thường

đơn giản ít thành phần, độ chính xác và độ chọn lọc thấp, ngoài ra, khoảng

tuyến tính thông thường hẹp và độ nhạy của phương pháp thấp nên rất khó sử

dụng để định lượng các carbapenem.

1.2.2. Phương pháp điện hóa

Phương pháp vôn-ampe là phương pháp quan trọng của phân tích điện

hóa. Đây là phương pháp phân tích dựa vào việc nghiên cứu đường cong vôn-

ampe, là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ dòng điện vào thế

khi tiến hành điện phân chất phân tích.

Với ưu điểm như thế, Abdelilah Hilali và các cộng sự tiến hành nghiên

cứu xác định imipenem trong nước tiểu sử dụng phương pháp cực phổ xung

vi phân và vôn-ampe vòng với giới hạn lần lượt là 4x10-7 M và 1,05x10-9 M

sử dụng đệm photphat với pH=7,0 trên hai tình nguyện viên sử dụng thuốc có

chứa thành phần imipenem. Kết quả này là bước đầu giúp các bác sĩ có thể

đưa ra phác đồ điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân [5].

Với độ nhạy cao thì phương pháp điện hóa nên được ứng dụng rộng rãi

nhưng cũng giống như phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử là với các nền

mẫu đơn giản như nền mẫu thuốc hay các nền mẫu tự tạo hoặc trên những

tình nguyện viên có sức khỏe thuốc khi sử dụng thuốc, đôi khi lại không xuất

hiện các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả dẫn đến kết quả thiếu chính xác và có

thể gây nhầm lẫn cho các bác sĩ với liều dùng và phác đồ điều trị cho bệnh

nhân.

1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng là quá trình xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và

pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng- rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột

tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được

phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích,

do cấu trúc phân tử và tính chất lý hoá của các chất khác nhau nên khả năng

tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy chúng di

chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Hiện nay, sắc ký lỏng được

sử dụng để xác định các hoạt chất trong thuốc và có rất nhiều công trình

nghiên cứu của các tác giả khác nhau sử dụng phương pháp này. Trong

phương pháp sắc ký lỏng có rất nhiều detector được sử dụng nhưng phổ biến

nhất với là detector UV, DAD và detector khối phổ MS.

Với đặc điểm có bước sóng hấp thụ cực đại trong vùng Vis nên rất

nhiều tác giả đã sử dụng như công cụ định lượng hàm lượng các carbapenem

và có thể kể đến như L. Hakobyan, J. Pla Tolos, Y. Moliner-Martinez, C.

Molins-Legua, Jesus Ruiz Ramos, M. Gordon, Paula ´ Ramirez-Galleymore,

P. Campins-Falco [6] đã có thể định lượng hàm lượng meropenem trong ống

nội khí quản khi kết hợp thêm với kỹ thuật sử dụng vi chiết pha rắn. Kết quả

thu được rất khả quan khi có giới hạn phát hiện được chất ở nồng độ 3 ng/mL

và có độ chính xác cao (RSD<12%) tại bước sóng hấp thụ cực đại 300nm;

hay Kayo Ikeda và các cộng sự [7] đã có thể giúp các bác sĩ theo dõi nồng độ

meropenem có trong huyết tương với việc sử dụng đệm MOPs để ổn định và

tránh quá trình phân hủy của meropenem trong thời gian chưa kip xử lý. Ở

nghiên cứu này, các tác giả cũng sử dụng bước sóng hấp thụ cực đại là 300nm

làm bước sóng nghiên cứu và cũng thu được kết quả rất khả quan như có thể

đạt được giới hạn phát hiện 0,1g/mL; cũng giống như hai nhóm tác giả trên

thì Mehnam Soltani và nhóm nghiên cứu của ông [8] cũng sử dụng bước sóng

hấp thụ cực đại là 300nm để xác định hàm lượng huyết thanh người, tất cả các

hiệu suất thu hồi tại các mức nồng độ khác nhau trong nghiên cứu này đều đạt

trên 76,5% với độ chính xác trong khoảng từ 0,1%-9,6%, kết quả này giúp

bác sĩ có thể đưa ra phác đồ điều trị cho mỗi bệnh nhân sao cho phù hợp nhất;

không giống như các tác giả ở trên, nhóm nghiên cứu gồm Nadine Pinder,

Thorsten Brenner, Stefanie Swoboda, Markus A. Weigand, Torsten Hoppe-

Tichy [22] đã nghiên cứu độ bền của thuốc sau khi pha chế với 4 kháng sinh

ceftazidime (bước sóng hấp thụ cực đại 260 nm), meropenem (bước sóng hấp

thụ cực đại 304 nm), piperacillin and flucloxacillin (cùng ở bước sóng hấp thụ

cực đại 260 nm) với nội chuẩn là ertapenem thì thấy rằng ngoại trừ

piperacillin chỉ bền trong 8 giờ sau khi pha còn các kháng sinh khác đều có độ

bền là 24 giờ sau khi pha; ở một thí nghiệm khác, cũng là xác định định đồng

thời các kháng sinh và piperacillin nhưng Raphael Denooz và Corinne

Charlier đã tìm ra quy trình định lượng 5 kháng sinh cefepim, ceftazidim,

cefuroxim, meropenem trong huyết tương. Kết quả thu được rất tốt khi cùng

quy trình xử lý mẫu nhưng tất cả hiệu suất thu hồi đều đạt trên 70% với mức

nồng độ 5ug/mL cũng với các bước sóng hấp thụ cực đại 256 nm đối với

cefepim và ceftazidim, 270 nm đối với cefuroxim và ceforanide, 300 nm đối

với meropenem và 220 nm đối với piperacilline; còn với Yuji Kurihara, Junko

Kizu và Seiji Hori [9] thì có thể xác định đồng thời 5 kháng sinh nhóm

carbapenem là imipenem, biapenem, panipenem, doripenem và meropenem

với giới hạn phát hiện từ 20 đến 40 ng/ml tại bước sóng hấp thụ cực đại tại

300nm; còn nghiên cứu gần đây thì Le Zou và các cộng sự [10] đã xác định

được đồng thời nồng độ imipenem và meropenem tại bước sóng hấp thụ cực

đại là 300nm có trong huyết tương người kể từ lúc tiêm đến lúc 12 tiếng sau

truyền để giúp bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị cho các bác sĩ với các bệnh nhân.

Ở nghiên cứu này các hệ số CV đều nhỏ hơn 8% và tất các hiệu suất thu hồi

của phương pháp đều lớn hơn 91,5%.

Ngoài detector UV, DAD thì gần đây detector phổ khối MS có giới hạn

phát hiện tốt và độ chọn lọc cao được sử dụng nhiều trong định lượng các

carbapenem, điển hình như Therese Koal và các cộng sự [11] đã tìm ra quy

trình định lượng ertapenem trong mẫu huyết thanh bằng detector phố khối MS

với mảnh phổ đặc trưng của ertapenem là m/z 491,9, các kết quả thu được rất

tốt với giới hạn phát hiện LOD 0,1 ug/mL với hệ số tương quan R2=0,9999,

hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu tại các mức nồng độ đều đạt trên

90%, hệ số RSD đều nhỏ hơn 7,4% và độ chính xác đều trên 90%; và trong

nghiên cứu khác nhóm tác giả M. Paal, M. Zoller, C. Schuster, M. Vogeser,

G. Schützea [23] đưa ra được quy trình phân tích 6 kháng sinh cefepime,

meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid và piperacillin trong huyết

thanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector khối

phổ 2 lần MS/MS với khoảng tuyến tính từ 0,05 mg/l đến 400 mg/l cùng các

mảnh ion m/z lần lượt là 481,0; 384,1; 332,0; 402,0; 338,0 và 518,0.

Với đặc điểm độ nhạy cao, độ chọn lọc tốt và quy trình xử lý mẫu đơn

giản thì phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao rất được hay sử dụng trong

định lượng nhóm kháng sinh carbapenem; tuy nhiên, chi phí đầu tư cho thiết

bị còn lớn, cần thêm các phụ kiện phụ trợ và hóa chất đắt tiền thì khó có thể

sử dụng rộng rãi và phổ biến tại Việt Nam.

Kết quả các nghiên cứu xác định carbapenem bằng bằng phương pháp

quang phổ, điện hóa và sắc ký được tổng hợp trong bảng 1.1 dưới đây.

Bảng 1.1: Một số nghiên cứu tách và xác định các carbapenem bằng phương pháp quang phổ, điện hóa và sắc ký

Tác giả Điều kiện Kết quả Mục đích nghiên cứu Phương pháp

Sharma và các cộng sự [3] Xác định meropenem và imipenem trong nước tiểu Dung dịch đệm: meropenem trong chlorform và imipenem trong etanol UV-Vis ở 305nm với meropenem và 295nm với imipenem Hiệu suất thu hồi trong khoảng từ 73,85%- 93,81%

Dung dịch đệm MOPS pH=7,0 UV-Vis ở 318 nm Khoảng tuyến tính 14-42ppm Xác định hàm lượng imipenem trong mẫu dược phẩm R.J. Forsyth và các cộng sự [4]

Dung dịch đệm: phốtphát pH=7,0

Abdelila h và các cộng sự [5] Có giới hạn phát hiện: 1,05 x 10-9 M và 4 x 10-7 Vonampe vòng và cực phổ xung vi phân Xác định hàm lượng imipenem trong mẫu huyết tương ở hai bệnh nhân tình nguyện

HPLC - UV ở 300 nm Kayo Ikeda và các cộng sự. [7] Xác định Meropenem trong huyết tương người

Pha động: Đệm phosphate (pH=7,4) và acetonitril (90:10, v/v), tốc độ dòng 1ml/minCột: Bondasphere C18 5µm(3.9 mm × 150 mm)

Khoảng tuyến tính: 0,05 đến 100 g / mL. RSD< 7,17% và hiệu suất thu hồi trong khoảng 97,7% - 106,3%.

LOD = 0,01 g/ml

HPLC - UV trong khoảng 200-400nm Raphael Denooz, Corinne Charlier [10]

Xác định 5 chất nhóm β-lactam (cefepim, ceftazidim, cefuroxim, meropenem và piperacillin) trong huyết tương người Khoảng tuyến tính 2,5-60 g / mL với mỗi loại kháng sinh. Độ chính xác từ 93,2 đến 107,1%

HPLC - UV tại 300nm Xác định ertapenem trong huyết thanh người Mehnam Soltani và các cộng sự [8] Khoảng tuyến tính 1-100 mg/l, độ thu hồi 84%

Pha động: (A) acetonitril, (B) phosphate (pH=7,4). Chế độ gradient 5 phút đầu (A:B 5:95, v/v); 20 phút (A:B 50:50, v/v), 5 phút (A:B 5:95, v/v). Tốc độ dòng 1ml/min Cột: Symmetry® C8 (250 mm × 4,6 mm i.d.) Pha động: Nước, methanol và orthophosphoric acid (64:35:1, v/v/v), tốc độ dòng 1ml/min Cột Hypersil (5 µm, 100 mm × 4,6 mm)

Nadine Pinder và các cộng sự [22]

HPLC - UV tại 210nm; 230nm; 260nm; 306nm Xác định Piperacillin, meropenem, ceftazidime flucloxacillin trong huyết thanh người

Khoảng tuyến tính thu được cho meropenem 2-200ppm, R2 >0,999, độ thu hồi 108,8%

HPLC – MS/MS

M. Paal, M. Zoller, C.Schust, M.Voges er, G.Schütz e [23] Khoảng tuyến tính thu được với meropenem là 0,25- 120mg/l, R2>0,997 Xác định cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid và piperacillin trong huyết thanh người

Pha động: (A) 0.2% phosphoric acid (pH 2.2), (B) acetonitrile. chế độ gradient: 1 phút (A:B 95: 5, v/v); 5 phút (A:B 80:20, v/v); 5 phút (A:B 30:70, v/v); 4 phút (A:B 95: 5, v/v). Tốc độ dòng 1ml/min Cột Gemini C18, 150 × 4,6 mm, 5 μm Pha động: (A) 10 mM ammonium formiate:formic acid (99,9:0,1, v/v); (B) methanol. Chế độ gradient: 0,1 phút (A:B 93:7, v/v); 0,5 phút (A:B 35:65, v/v); 1,5 phút (A:B 5:95, v/v); 2 phút (A:B 93:7, v/v) Cột Fortis C8 3µm (100 mm x 2,1 mm)

HPLC –MS

Khoảng tuyến tính 0,04- 25mg/l, R2 >0,999 Yuji Kurihara, Junko Kizu, Seiji Hori [9]

Xác định Imipenem, panipenem, meropenem, biapenem, doripenem trong huyết thanh chuột

LC - MS

Xác định ertapenem trong huyết tương người

Therese Koal, Michael Deters, Klaus Resch, Volkhard Kaever [11]

LOD 0,1µg/ml, LOQ 1µg/ml, khoảng tuyến tính 0,1-50 µg/ml, độ thu hồi >90%, RSD<10%

LC – DAD tại 300nm LOD= 3 µg/ml, RSD< 10% Xác định meropenem trong ống nội khí quản L. Hakobya n và các cộng sự [6]

Pha động: 0,1M phosphat (ph=7,8): methanol 92:8, v/v, tốc độ dòng 1ml/min Cột: Luna 5µm C18(2) 100 A (250 x 4,6 mm) Pha động: (A) 2 mM NH4Oac, 0,1% acetic acid, pH= 3,8). (B) methanol (A) 5 phút (A:B 10:90 v/v), 3 phút (A:B 100:0 v/v) tốc độ dòng 0,5ml/min Cột: Synergi 4µ A Polar-RP 80A Mercury (10 x 2,0 mm) Pha động: (A) Acetonitril: (B) H2O. Chế độ gardient: 10 phút (A:B 10:90, v/v), 3 phút (A:B 15:85, v/v), 2 phút (A:B 10:90, v/v) Cột: Zorbax SB- C18 (150 mm x 0,5 mm i.d, 5 μm)

RP-HPLC - UV tại 298nm meropenem, imipenem, trong huyết tương người

Le Zou, Fanqi Meng, Lin Hu, Qi Huang, Min Liu, Tao Yin [5] Khoảng tuyến tính 0,1- 100µg/ml, R2 >0,999, LOD <0,1µg/ml, độ thu hồi > 91%

HPLC - UV tại 295nm E. Dailly và các cộng sự [19] Khoảng tuyến tính 6-100mg/l, R2 >0,995

Xác định doripenem, ertapenem, imipenem, meropenem trong huyết tương người

HPLC-UV tại 300nm USP 40 [24] Xác định meropenem trong thuốc tiêm Khoảng được chấp nhận 90- 120%

Pha động: (A) H2O, (B) acetonitril. Chế độ gradient: 10 phút (A:B 98:2, v/v), 12 phút (A:B 65:35, v/v) Cột: Diamonsil® C18 (250 * 4,6 mm, 5µm) Pha động: (A) metanol, (B) natri phosphat (pH=7). Chế độ gradient: từ thời điểm 0 phút (A:B 0:100, v/v), 5 phút (A:B 30:70, v/v), 2 phút (A:B 0:100, v/v). Cột: 2,6µm PentaFluoroPhe nyl (100 mm × 4,6 mm ID) Pha động: acetonitril, metanol và đệm tetrabutylammo nium pH=7,5 (w/w 150:100:750). Cột C18, kích thước 4,6mm x 25cm x 5µm

USP 40 [25] HPLC-UV tại 254nm Xác định imipenem trong thuốc tiêm Khoảng được chấp nhận 90- 115%

Pha động: natri 1-hexansulfonat pH=6,8, kích thước cột: 4,6mm x 30 cm cột C18

1.3. Phương pháp điện di mao quản

1.3.1. Nguyên tắc phân tách các chất trong điện di mao quản

Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) là một phương pháp

tách và phân tích các chất dựa trên cơ sở sựu di chuyển khác nhau của các ion

mang điện tích trong dung dịch chất điện ly dưới tác dụng của điện trường

sinh ra từ nguồn thế cao áp vào hai đầu mao quản. Thời gian di chuyển các

ion được dung để định tính, định lượng sẽ dựa vào diện tích pic thu được sau

quá trình phân tích.

Phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả

tách cao, thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Hiện nay, phương

pháp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: y dược, sinh học,....

1.3.2. Phân loại

Điện di mao quản gồm nhiều các kỹ thuật tách khác nhau, mỗi kỹ thuật có

một cơ chế riêng [26, 27]:

- Điện di mao quản vùng (CZE)

- Sắc ký mao quản Gel (CGE)

- Sắc ký mao quản điện động học mixen (MECC)

- Điện di mao quản điểm đẳng điện (IEF)

- Điện di mao quản đẳng tốc độ (ITP)

- Sắc kí điện di mao quản (CEC)

Trong đó kỹ thuật điện di mao quản vùng (CZE) được sửu dụng nhiều bởi

đặc tính đơn giản và hiệu quả

1.3.3. Cơ sở lý thuyết

Độ điện di (µ) là hằng số đặc trưng cho hạt tích điện trong một điều kiện

điện di xác định:

µ = q/(6...r.)

Từ công thức trên có thể thấy [26, 27]:, độ điện di tỷ lệ thuận với điện

tích của hạt mang điện (q) và tỷ lệ nghịch với độ nhớt của dung dịch đệm điện

di (), bán kính hyddrat của hạt mang điện (r). Nghĩa là, trong một điện

trường E nhất định, chất nào có điện tích lớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển

nhanh; với các chất mang điện có cùng điện tích, chất nào có kích thước nhỏ

sẽ di chuyển nhanh hơn; với các chất mang điện có cùng bán kính, chất nào

có điện tích lớn sẽ di chuyển nhanh hơn.

1.3.4. Cấu tạo hệ CE cơ bản

Sau đây là cấu tạo của hệ điện di cơ bản:

- Dung dịch đệm điện ly: dùng để tạo môi trường cho quá trình điện di

khi áp thế cao vào đầu hai mao quản. Trong quá trình điện di, hai đầu

mao quản được đặt trong hai bình chứ dung dịch đệm.

- Nguồn thế cao: thường dao động từ 5-30kV, dùng để áp vào đầu hai

mao quản nhằm sinh ra điện trường lớn cho quá trình điện di xảy ra.

- Detector: bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích sau

quá trình tách điện di. Các loại detector thông dụng: hấp thụ phân tử

(UV-VIS), huỳnh quang phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối

phổ, đo dòng, đo thế, đo độ dẫn.

- Bộ phận điều khiển: thường là máy tính sử dụng phần mềm chuyên

dụng phù hợp, để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả.

Hình 1.6: Cấu tạo hệ CE cơ bản

1.3.5. Dòng điện di thẩm thấu EOF

Dòng điện di thẩm thấu (ElectroOsmotic Flow - EOF) là một đặc trưng

riêng có của phương pháp điện di mao quản sử dụng mao quản silica. Đây là

dòng chuyển động của khối dung dịch di chuyển trong mao quản từ cực

dương sang âm (với mao quản silica có bề mặt trong tích điện âm SiO-) xuất

hiện khi áp một điện thế cao vào hai đầu mao quản chứa đầy dung dịch đệm.

Tốc độ của dòng EOF bằng đúng tốc độ của các ion không mang điện trong

quá trình điện di.

Hình 1.7: Mô hình dòng EOF trong phương pháp điện di mao quản

Trong quá trình di chuyển của mình, EOF sẽ cuốn theo các ion có mặt

trong mao quản. Với cột mao quản silica, cations dịch chuyển cùng chiều

EOF, còn anions dịch chuyển ngược chiều EOF.

1.3.6. Các detector thông dụng

Trong phương pháp điện di mao quản, sự phát hiện các chất trong quá

trình có thể được thực hiện trực tiếp hoặc gián tiếp tùy vào bản chất các chất

phân tích. Còn việc định lượng dựa trên mối quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng

độ các chất phân tích. Việc phát hiện và đo định lượng được thực hiện nhờ

các detector. Các detector được đặt ở gần cuối của mao quản. Tùy thuộc vào

mục đích phát hiện cũng như định lượng và đặc tính của các chất mà sử dụng

các detector tương ứng như: detector quang học, detector khối phổ, detector

điện hoa, detector độ dẫn [26].,....

1.3.6.1. Detector quang học

Detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS) hoặc huỳnh quang được

sử dụng trong hầu hết các thiết bị CE thương phẩm. Detector quang phổ hấp

thụ phân tử (UV-VIS) là detector phổ biến nhất, đáp ứng được những chất

phân tích có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS. Đối với các chất

không hấp thụ ánh sáng UV-VIS như ion vô cơ, các amino acid... cần có thêm

thuốc thử để tạo các hợp chất màu trung gian.

Detector huỳnh quang dùng để phát hiện và định lượng các chất và dẫn

xuất có khả năng phát ra ánh sáng huỳnh quang. Chất phân tích hấp thụ ánh

sáng ở một bước sóng nhất định ngay sau đó suy biến và phát ra huỳnh quang

ở bước sóng dài hơn. Detector huỳnh quang có độ nhạy cao nhất, với LOD

gấp 3 lần detector UV-VIS. Tuy nhiên detector này có gái thành cao, cần

được kích hoạt băng bức xa laser và có thể gây ra hiện tượng giảm tín hiệu đo

do cường độ ánh sáng kích thích lớn [26, 27].

1.3.6.2. Detector khối phổ

Detector khối phổ là detector vạn năng cho phân tích và định lượng, có

độ nhạy cao vì thế ưu việt hơn detector quang học, điện hóa. Trong phương

pháp khối phổ, các phân tử bị ion hóa được tăng tốc trong một trường điện từ

và tách theo khối lượng của nó. Quá tình ion hóa thường cung cấp đủ năng

lượng để phân tử bị phá võ thành các mảnh khác nhau. Ngoài định tính và

định lượng, detector khối phổ còn cho biết cấu trúc của các chất phân tích, do

đó nó trở thành công cụ quan trọng để phân tích đặc tính của các phân tử sinh

học như peptit, protein, [27].....

1.3.6.3. Detector điện hóa

Detector đo thế là một detector đơn giản và tiện lợi nhất trong các

detector điện hóa. Trong detector đo thế, nồng độ chất phân tích được xác

định dựa vào sự thay đổi của thế điện cực của điện cực làm việc khi nhúng

trong dung dịch phân tích cùng điện cực so sánh. Detector chỉ đáp ứng chọn

lọc với một số ion nhất định nên là detector có độ chọn lọc cao nhất trong các

detector điện hóa [26, 27].

Detector đo dòng là một hệ 3 điện cực gồm: điện cực làm việc, điện

cực so sánh và điện cực phụ trợ, lập thành một mạch điện đặc biệt. Dòng điện

sinh ra do quá trình oxi hóa hoặc khử các chất phân tích hay chính là do sự

chuyển electron giữa điện cực làm việc và điện cực phụ trợ, dòng điện này tỉ

lệ với chất phân tích. Tuy nhiên detector này chỉ phù hợp với các chất phân

tích có tính oxi hóa hoặc khử như amin thơm, phenol,...

Detector đo độ dẫn là detector phù hợp với tất các chất phân tích mang

điện. Chất phân tích được phát hiện bởi detector trong một nền dung dịch điện

ly. Detector đo độ dẫn trực tiếp đo độ dẫn của dung dịch phân tích được đặt

giữa hai điện cực. Detector đo độ dẫn có thể đo theo kiểu tiếp xúc hoặc không

tiếp xúc, vị trí đặt detector có thể tiếp xúc hoặc không tiếp xúc với điện cực

và dung dịch điện ly tương ứng.

Một nhược điểm chung của detector điện hóa khi dùng để định lượng

trực tiếp là độ chọn lọc kém. Giải pháp để hạn chế nhược điểm này là kết hợp

giữa định lượng bằng detector điện hóa với kỹ thuật tách, trong đó tách bằng

điện di được coi là kỹ thuật đơn giản và phù hợp nhất.

1.3.6.4. Detector đo độ dẫn không tiếp xúc

Nguyên lí hoạt động

Hình 1.8: Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc.

Hình 1.9: A) Sơ đồ biểu diễn cấu trúc của detector C4D

B)Mạch điện tương đương

Hai điện cực hình ống được đặt nôi tiếp đồng trục bên ngoài mao quản

có chứa dung dịch cần đo. Hai điện cực hình ống tạo với dung dịch bên trong

mao quản thành hai tụ điện C. Khoảng dung dịch nằm giữa hai điện cực đóng

vai trò như điện trở R. Việc xác định điện trở này sẽ cho ta thông tin về độ

dẫn của các ion trong dung dịch đó [27].

Nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) được áp vào điện cực thứ

nhất. Tại điện cực thứ hai, tín hiệu đo được ở dạng cường độ dòng điện (I).

Theo đó, dòng điện thu được tại điện cực thứ 2 sẽ phụ thuộc vào độ lớn của

điện thế V và tần số f Nguồn kích thích V có giá trị càng cao thì tín hiệu I đo

được cũng càng lớn.

Hình 1.10: Biểu diễn mối liên hệ giữa tín hiệu đầu ra và độ lớn (điện thế và tần số) của nguồn kích thích xoay chiều

Tần số hoạt động f của nguồn kích thích phải cao (tối thiểu vài trăm

kHz), để triệt tiêu giá trị dung kháng Z=(1/2πC)2. Ở tần số cao, V=I/R với R

là điện trở của dung dịch cần đo.

Tín hiệu đầu ra thu được ở dạng cường độ dòng điện (xoay chiều), sau

đó sẽ được chuyển đổi và khuếch đại thành tín hiệu dạng vôn thế (xoay

chiều), thông qua việc sử dụng một điện trở khuếch đại. Vôn thế xoay chiều

sau đó được chuyển đổi thành vôn thế 1 chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau

cùng chuyển đổi thành tín hiệu số hóa (xem hình 4) trước khi được hiển thị và

lưu trữ trên máy tính [27].

Hình 1.11: Sơ đồ thiết kế của C4D

Để tăng độ nhạy cần sử dụng giải pháp nâng cao nguồn điện thế kích

thích xoay chiều thay vì dùng điện trở khuếch đại quá lớn. Lý do là khi dùng

điện trở khuếch đại lớn thì cả tín hiệu cần đo và nhiễu nền cùng được khuếch

đại gây cản trở cho định tính và định lượng [27]. Thông thường điện trở

khuếch đại có giá trị 330kΩ đến 1,5MΩ.

1.3.7. Các kỹ thuật bơm mẫu

Quá trình bơm mẫu vào cột tách của phương pháp có thể thực hiện theo

hai phương pháp như hình 1.12:

Hình 1.12: Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp CE

- Kĩ thuật bơm mẫu kiểu thủy động học: trong kĩ thuật này, mẫu được

bơm vào mao quản nhờ áp lực (hình a,b,d). Khi đó, lượng mẫu bơm

vào phụ thuộc vào áp lực sử dụng (áp suất, lực hút chân không hoặc

chiều cao bơm mẫu và thời gian bơm mẫu).

- Kĩ thuật bơm mẫu kiểu điện động học: kĩ thuật sử dụng lực điện khi áp

thế cao (5-10kV trong vài giây) để bơm mẫu vào mao quản. Phương

pháp này cho kết quả các pic phân tách có độ sắc nét cao. Tuy nhiên,

diện tích pic dùng để định lượng có độ lặp lại thấp với các nền mẫu

khac nhau, do đó thường dùng để định tính [27].

Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) là một phương pháp

tách và phân tích các chất dựa trên cơ sở sựu di chuyển khác nhau của các ion

mang điện tích trong dung dịch chất điện ly dưới tác dụng của điện trường

sinh ra từ nguồn thế cao áp vào hai đầu mao quản. Thời gian di chuyển các

ion được dung để định tính, định lượng sẽ dựa vào diện tích pic thu được sau

quá trình phân tích [27].

Phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả

tách cao, thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Hiện nay, phương

pháp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: y dược, sinh học [28, 29, 30, 31],....

Gần đây, phương pháp điện di mao quản cho thấy được tiềm năng phát

triển do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu

tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để xác định kháng sinh trong

nhiều đối tượng mẫu khác nhau.

Dựa vào các đặc điểm đó có rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng và đã thu

được một kết quả nhất định như Shoko Taniguchi và các cộng sự [32] theo

dõi quá trình phân hủy của kháng sinh meropenem, biapenem và imipenem

trong một vài điều kiện khác nhau với điều kiện điện di dung dịch đệm điện di

100mM photphat, pH=8,0, cột 25 µm và thế tách 30kV, nhận thấy rằng các

carbapenem đều phân hủy khoảng 30% sau 24 tiếng khi có thêm các tác nhân

gây ức chế như fosmicin; ở nghiên cứu khác nhóm tác giả Toshihiro

Kitahashi [33] và Yahya Mrestani [34] đều sử dụng detector UV để định

lượng hàm lượng meropenem trong một số mẫu như huyết tương, huyết thanh

và nước tiểu thì thời gian di chuyển của meropenem đều nằm trong khoảng từ

5-7 phút và có độ nhạy rất tốt với giới hạn phát hiện LOD nhỏ hơn 2 mg/l

cùng với độ lặp tốt (RSD < 10%) và hiệu suất thu hồi cao (H>90%) qua đó

chứng tỏ phương pháp có thể áp dụng cho việc phân tích thực tế.

Ngoài điện di mao quản vùng thì điện di điện động học micelle cũng

được ứng dụng trong định lượng các carbapenem, điển hình như hai nhóm

nghiên cứu Michalska với 2 công trình đã công bố [35, 36] và Yu-Wei Chou

[37] với 1 công trình đã công bố. Với nhóm nghiên cứu Katarzyna Michalska

cả 2 công trình đều sử dụng natri dodecyl sulfat để tạo môi trường micelle, tất

cả các kết quả của hai công trình đều được đối chứng với phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao nhận thấy rằng sai khác đều nhỏ hơn 10%, chứng tỏ

phương pháp có độ đúng cao. Còn đối với nhóm nghiên cứu Yu-Wei Chou thì

họ đã thành công trong việc xác định hàm lượng meropenem trong huyết

tương của các bệnh nhân viêm màng não và qua nghiên cứu các tác giả thấy

rằng nồng độ meropenem sẽ giảm từ 45,04mg/l xuống còn 1,2mg/l từ 1 tiếng

sau truyền đến 8 tiếng sau truyền.

Kết quả các nghiên cứu xác định carbapenem bằng phương pháp điện

di mao quản được tổng hợp trong bảng 1.2 dưới đây.

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu tách và xác định các carbapenem bằng điện di mao quản

Đối tượng Kiểu Điều kiện Tác giả Detector Kết quả nghiên cứu điện di điện di

Dung dịch

đệm:

100mM

Shoko photphat, UV-Vis Taniguchi pH=8 meropenem CZE tại LOD=0,128ppm và các cộng Cột: 25 µm 210nm sự [32] I.Dx34,7

cm.

Thế tách

30kV

Dung dịch

đệm:

25mM Toshihiro khoảng tuyến meropenem UV-Vis Natri Kitahashi tính 0-200mg/l; trong huyết MEKC tại tetraborat/ và Itaru LOD 2mg/l, thanh 210nm natri Furuta [33] RSD<8.87% hydroxit

(pH=10),

SDS

90mM.

Cột: 50cm,

75µmI.D.

Thế tách

25kV

Dung dịch

đệm: Yahya 10mM Mrestani, meropenem PDA từ Khoảng tuyến phosphat Reinhard trong huyết 200nm tính 0,5 - (pH=7,2). CZE Neubert, tương, nước đến 200ppm, Sử dụng Z- Frank tiểu 500nm LOD=0,5ppm cell. Nagel [34] Thế tách

30kV

Dung dịch

đệm:

22,5mM

HCOOH(p

H=4,3) và

150mM Katarzyna

Michalska biapenem UV tại natri MEKC LOD = 0,5ppm và các cộng trong thuốc 200nm dodecyl

sulfat sự [35]

Cột:

60/50cm;

50µm I.D.

Thế tách

22kV

Dung dịch

đệm:

60mM

NaH2PO4, Katarzyna 20mM ertapenem Michalska UV tại trong dược MEKC LOD = 0,3ppm H3BO3 và các cộng 214nm (pH=6), phẩm sự [36] Cột: 60/52;

75 µm I.D.

Thế tách

18kV

Dung dịch

đệm: Tris

40mM, Yu-Wei meropenem pH=8, SDS Khoảng tuyến Chou và trong huyết UV tại MEKC Cột: tính 0,5-50ppm. các cộng sự tương và 300nm 40,2/30cm, LOD = 0,2ppm [37] dịch não tủy 50 µm I.D.

Thế tách

15kV

Như vậy có thể thấy, các nghiên cứu sử dụng phương pháp điện di ở

trên chủ yếu sử dụng detector UV. Qua đây cho thấy được tiềm năng lớn của

phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc

CE-C4D trong việc kiểm nghiệm, xác định bốn kháng sinh nhóm carbapenem.

Dưới đây sẽ chỉ ra thực nghiệm của quá trình xác định đồng thời doripenem,

meropenem, imipenem và ertapenem trong mẫu thuốc sử dụng phương pháp

điện di mao quản với detector độ dẫn không tiếp xúc.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu nghiên cứu, các nội dung chính cần thực hiện là:

* Nghiên cứu khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc xác định đồng thời

Doripenem, Meropenem, Imipenem và Ertapenem:

- Điều kiện phân tích trên thiết bị điện di: Cố định một số điều kiện như

chiều dài cột, đường kính cột và chiều cao bơm mẫu.

- Khảo sát hệ đệm, nồng độ đệm và pH của dung dịch đệm.

- Khảo sát thời gian bơm mẫu.

- Khảo sát điện thế đặt vào hai đầu mao quản.

* Thẩm định phương pháp phân tích

- Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn.

- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).

- Đánh giá độ chụm của phương pháp phân tích.

- Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích.

* Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc trên thị trường.

* Thực hiện phân tích đối chứng với phương pháp tiêu chuẩn sắc ký

lỏng hiệu năng cao sử dụng detector PDA.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp phân tích CE-C4D

Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp

xúc (CE-C4D) được phát triển mạnh mẽ những năm gần đây. Phương pháp

được ứng dụng rộng rãi để phân tích để phân tích các đối tượng mẫu khác

nhau đặc biệt hiệu quả trong tách và phân tích các loại mẫu sinh học, dược

phẩm. Đây là một trong số ít các phương pháp phân tích vừa có thể triển khai

hiệu quả trong phòng thí nghiệm, vừa có thể triển khai hiệu quả tại hiện

trường, thậm chí tự động hóa quá trình phân tích khi cần thiết. Do đó, phương

pháp điện di mao quản là sự lựa chọn phù hợp cho nghiên cứu phát triển và

ứng dụng xác định hàm lượng ba kháng sinh nhóm Carbapenem trong dược

phẩm, từ đó góp đảm bảo chất lượng dược phẩm, củng cố niềm tin của người

tiêu dùng.

2.3.1.Thiết bị và hóa chất

2.3.1.1. Thiết bị CE-C4D

Thiết bị CE-C4D sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi Công ty

3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/). Thiết bị có nguồn thế cao lên đến 25

kV, sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D). Hình ảnh thiết bị CE-

C4D sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện trong hình 2.1.

Hình 2.1: Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D sử dụng trong nghiên cứu

(1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến độ dẫn không tiếp

xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh, 6: Bộ phận điều khiển, 7:

Bình khí nén)

2.3.1.2. Các thiết bị khác và dụng cụ

- Máy ly tâm của hãng LCEN -200.

- Máy rung siêu âm có gia nhiệt BRANSON 521.

- Máy đo pH của hãng HANNA.

- Tủ lạnh Sanaky VH-2899W.

- Máy lọc nước Direct Q3-UV hãng Merck Millipore

- Cân phân tích với độ chính xác 0,1mg.

Các dụng cụ bao gồm:

- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức 10,00ml, 25,00ml và 50,00ml; cốc,

ống nghiệm, phễu.

- Micropipet các loại: 200 µl và 1000 µl.

- Một số dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm.

2.3.1.3. Hóa chất

Các hóa chất đều thuộc loại tinh khiết phân tích

+ Chất chuẩn: Bốn kháng sinh nhóm carbapenem: doripenem 95% số lô

2-HBS-109-1, meropenem sodium salt 98% số lô 6-ALN-168-1, imipenem

monohydrate 98% số lô 3-XJZ-149-1, ertapenem disodium 90 % số lô 5-

HBN-41-1 (Hãng Toronto Research Chemicals, Canada)

+ Hóa chất dung môi:

- Tris (Sigma, Singapore, hàm lượng ≥99%)

- Arigin (Sigma, Singapore, hàm lượng ≥99%)

- Axit L-ascorbic (Sigma, Singapore, hàm lượng ≥99%)

- Axit lacitc (Merck, Đức, hàm lượng ≥99%)

- Axit axetic (Merck, Đức, hàm lượng ≥99%)

- Nước deion (theo tiêu chuẩn Mỹ, châu Âu) dùng cho phân tích điện

di, sắc ký được lấy từ máy lọc nước Direct Q3-UV có sử dụng lọc cuối LC-

pack (cỡ lọc 0,45 µm).

+ Chuẩn bị các dung dịch hóa chất:

- Dung dịch chuẩn gốc bốn kháng sinh doripenem, meropenem,

imipenem và ertapenem 1000ppm được pha từ chất chuẩn như sau: cân chính

xác 0,0106g doripenem 0,0116g meropenem, 0,0108g imipenem, 0,0116g

ertapenem, chuyển vào từng bình định mức 10,00ml, lắc đều. Sau đó định

mức đến vạch bằng nước deion. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh từ -

4oC-2 oC, tránh ánh sáng và có thể sử dụng trong vòng 3 tháng.

- Dung dịch đệm điện di được pha như sau: cân chính xác 0,0303g Tris,

chuyển vào bình định mức 25,00ml, lắc đều. Sau đó định mức đến vạch bằng

nước deion. Dung dịch được chuẩn lại pH=8 bằng axit axetic trước khi đẩy

vào mao quản. Dung dịch đệm được pha mới hàng ngày.

2.4. Phương pháp xử lý mẫu

2.4.1. Mẫu dược phẩm

Các mẫu dược phẩm sử dụng trong nghiên cứu được mua tại các nhà

thuốc tư nhân và cơ sở y tế đã liệt kê ở PL3.

2.4.2. Xử lý mẫu dược phẩm

- Mẫu kháng sinh nhóm carbapenem dạng bột

Cân chính xác trên cân phân tích một lượng 0,0100g mẫu đã trộn đều,

sau đó, cho vào bình định mức 10,00ml hòa tan bằng nước deion và định mức

tới vạch bằng nước deion, rung siêu âm và lọc qua màng 0,45µm. Pha loãng

20 lần bằng nước deion trước khi tiến hành bơm vào thiết bị CE.

2.5. Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích

Độ tin cậy của phương pháp CE-C4D trong phân tích được đánh giá qua

các thông số: giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, hiệu suất thu

hồi.

2.5.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD) [38, 39, 40] được xem là nồng độ thấp nhất

của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có

nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Đối với quá trình điện di,

LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3.

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà

hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định

lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Thông thường với quá trình

sắc kí, LOQ là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10.

2.5.2. Độ chụm (độ lặp lại của phương pháp)

Độ lặp lại, một cách tương đối, là độ sai lệch của các giá trị riêng lẻ xi

và giá trị trung bình trên các mẫu thử giống hệt nhau trong những điều kiện

thí nghiệm giống nhau (cùng người phân tích, cùng trang thiết bị, phòng thí

nghiệm) trong những khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại có thể xác định qua

độ lệch chuẩn hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD%). Khi độ lệch chuẩn càng

lớn thì sai số của phép đo hay phương pháp càng lớn [38, 39, 40].

Công thức tính độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối là:

RSD(%) = SD/Stb x

100%

Trong đó:

- Si là diện tích pic thứ i

- Stb là diện tích trung bình của n lần chạy

- N là số lần chạy lặp lại

2.5.3. Độ đúng, độ thu hồi của phương pháp

Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các

kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, thước đo

độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay cách xác định độ thu hồi

[37, 38, 39].

Hiệu suất thu hồi (H): H = Ctt/Clt x100%

Trong đó

- H là hiệu suất thu hồi (%)

- Ctt là nồng độ thực tế của chất phân tích thu được

- Clt là nồng độ lý thuyết được tính toán từ lượng chuẩn thêm vào.

Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu trước khi xử lý mẫu ta có độ đúng của

phương pháp, còn nếu chất chuẩn được thêm vào trước khi bơm vào thiết bị

CE ta có độ đúng của thiết bị.

2.5.4. Độ phân giải

Định nghĩa: Độ phân giải được mô tả khả năng tách giữa hai pic. Nếu R

là lớn hơn hoặc bằng 1,5 thì khả năng tách của 2 pic là 99%. Công thức tính

độ phân giải [38, 39, 40]:

R = 2x tb − ta Wa + Wb

Wa, Wb: độ rộng giữa 2 pic

ta, tb : thời gian di chuyển của 2 pic tính theo đỉnh pic đó.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu trong việc tách và xác định bốn kháng sinh

nhóm carbapenem bằng phương pháp CE-C4D

3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm

pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm điện di là những yếu tố

ảnh hưởng rất lớn trong phương pháp điện di mao quản, nó gây ảnh hưởng

đến quá trình di chuyển của các chất trong mao quản và dòng điện di thẩm

thấu (EOF). Vì vậy, các yếu tố được lựa chọn khảo sát trước tiên là pH, thành

phần và nồng độ đệm của hệ đệm điện di, bên cạnh các yếu tố khác như thời

giam bơm mẫu, thế tách và các yếu tố ảnh hưởng khác.

3.1.1.1. Khảo sát đồng thời các loại đệm và pH của đệm

Do các chất phân tích có cấu tạo phân tử cồng kềnh, điện tích ít, do đó

việc sử dụng phân cực thuận (sử dụng phân cực cùng dấu tại đầu bơm mẫu:

áp thế dương với các chất phân tích là cation, áp thế âm với các chất phân tích

là anion) sẽ khó cho kết quả tốt. Trên thực tế, việc phân tích theo phân cực

thuận đã được thực hiện và kết quả không cho tín hiệu các chất phân tích. Vì

vậy, kỹ thuật phân cực ngược (sử dụng thế dương khi phân tích các anion)

trong đó lợi dụng dòng EOF kéo các chất phân tích với độ linh động thấp đã

được sử dụng. Kết quả đã cho tín hiệu các chất phân tích rõ ràng và phân tách

tốt.

Để thực hiện phân cực ngược sử dụng dòng EOF, cần phải lựa chọn pH

thích hợp: pH cao để tạo dòng EOF đủ lớn nhưng nếu pH cao quá sẽ cho độ

lặp kém hơn và nhiễu đường nền tăng cao. Thêm vào đó, do sử dụng detector

độ dẫn thì các đệm sử dụng trong phương pháp CE-C4D phải đảm bảo độ điện

ly nhưng độ dẫn không được quá cao sẽ làm giảm độ nhạy của phương pháp.

Vì vậy, các loại đệm được lựa chọn khảo sát đồng thời thành phần và pH đệm

nhằm lựa chọn được hệ đệm phù hợp nhất gồm: arginin 10mM/ axit axetic,

arginin 10mM/ axit ascobic, arginin 10mM/ axit lactic, Tris (hydroxymetyl)

aminometan 10mM/ axit lactic và Tris (hydroxymetyl) aminometan 10mM/

axit axetic với các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và 9,0.

Đầu tiên, hệ đệm Arg/Ace với các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và 9,0 với nồng

độ đệm 10mM, thế tách 20kV, chiều cao bơm mẫu 10cm và thời gian bơm

mẫu 20s được chọn để khảo sát. Các kết quả thu được trong hình 3.1 và bảng

3.1.

Hình 3.1: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng hệ đệm Arg 10mM/Ace ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm

Bảng 3.1: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Ace

Độ phân giải Dori-Mero Mero-Imi Imi-Erta

pH=7,0 - 9,56 5,27

pH=7,5 3,10 7,75 8,36

pH=8,0 4,00 5,05 10,52

pH=8,5 1,67 5,17 10,48

pH=9,0 1,33 4,18 10,18

Từ hình 3.1 và bảng 3.1 có thể thấy rằng, bốn carbapenem tách nhau

tương đối tốt. Các pic sắc nét, đường nền ổn định và đặc biệt tại pH=8,0 thì có

đường nền và các pic có diện tích lớn nhất.

Tiếp theo, hệ đệm Arg/Asc được khảo sát ở các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và

9,0, với các điều kiện khác tương tự hình 3.1. Các kết quả thu được trong hình

3.2 và bảng 3.2.

Bảng 3.2: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Asc

Độ phân giải Dori-Mero Mero-Imi Imi-Erta

pH=7,0 1,09 - -

pH=7,5 - 4,53 6,63

pH=8,0 3,63 5,75 -

pH=8,5 2,63 6,14 -

pH=9,0 2,04 8,57 -

Hình 3.2: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng hệ đệm Arg 10mM/Asc ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm

Ngược lại với hệ đệm Arg/ Ace thì ở hệ đệm Arg/ Asc, tín hiệu của các

carbapenem tương đối nhỏ, không có sự xuất hiện của ertapenem và đường

nền bị nhiễu. Tuy không có sự xuất hiện của ertapenem nhưng tại pH=8,0 cho

tín hiệu của doripenem, meropenem và imipenem là tốt nhất so với các pH

còn lại.

Sau khi khảo sát hệ đệm Arg/ Ace thì hệ đệm được khảo sát ở các pH

7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và 9,0, với các điều kiện khác tương tự hình 3.1. Các kết quả

thu được trong hình 3.3 và bảng 3.3.

Hình 3.3: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng hệ đệm Arg 10mM/Lactic ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm

Bảng 3.3: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Lactic

Độ phân giải Dori-Mero Mero-Imi Imi-Erta

pH=7,0 - - 4,83

pH=7,5 3,20 8,00 7,84

pH=8,0 5,14 6,17 8,42

pH=8,5 4,29 4,75 9,88

pH=9,0 1,14 10,31 6,09

Với hệ đệm Arg/ Lactíc, thì có thế thấy rõ, tại pH=8,5 tín hiệu cả bốn

carbapenem là tốt nhất với đường nền ổn định và chất phân tích cho tín hiện

tốt nhất.

Với đặc điểm là axit amin có độ dẫn điện kém thì Tris cũng thường

được sử dụng làm cấu tử đệm trong phương pháp điện di mao quản CE-C4D,

hệ đệm Tris/Ace ở các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và 9,0 với các điều kiện khác

tương tự hình 3.1. Các kết quả thu được trong hình 3.4 và bảng 3.4.

Hình 3.4: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng hệ đệm Tris 10mM/Lactic ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm ( độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm

Bảng 3.4: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Tris/Lactic

Độ phân giải Dori-Mero Mero-Imi Imi-Erta

pH=7,0 3,64 11,03 8,34

pH=7,5 5,62 5,32 9,32

pH=8,0 5,04 3,95 4,07

pH=8,5 2,45 3,88 7,56

pH=9,0 - - -

Với hệ đệm Tris/Latic, các pH đều có thể tách hoàn toàn cả bốn

carbapenem ngoại trừ pH=9,0. Nhưng trong đó, pH=8,0 cho tín hiệu chất

phân tích tốt nhất và đường nền ổn định nhất.

Cuối cùng hệ đệm được chọn là Tris/ Ace ở các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và

9,0, với các điều kiện khác tương tự hình 3.1. Các kết quả thu được trong hình

3.5 và bảng 3.5.

Hình 3.5: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng hệ đệm Tris 10mM/Ace ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm

Bảng 3.5: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Tris/Ace

Độ phân giải Dori-Mero Mero-Imi Imi-Erta

pH=7,0 12,97 5,12 -

pH=7,5 4,82 5,07 9,71

pH=8,0 pH=8,5 3,54 - 3,85 3,06 9,15 8,14

pH=9,0 2,38 2,80 7,38

Từ hình 3.5 và bảng 3.5 có thể nhận thấy, với hệ đệm Tris/ Ace ở tất cả

pH cả bốn carbapenem đều tách được tốt và tín hiệu chất phân tích tốt nhất so

với các hệ đệm trước. Đặc biệt tại pH=8,0 thì tín hiệu chất phân tích là tốt

nhất với đường nền ổn định. Do đó, để có thể so sánh tốt hơn kết quả khảo sát

phân tích đồng thời bốn carbapenem, điện di đồ ở pH=8,0 của tất cả các hệ

đệm được thể hiện trong hình 3.6.

Hình 3.6: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng tại pH=8 của các hệ đệm điện di khác nhau. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm

Từ hình 3.6, có thể thấy rằng so với các hệ đệm còn lại thì hệ đệm Tris/

Ace cho tín hiệu chất phân tích là lớn nhất nhưng đường nền vẫn đảm bảo ổn

định. Do đó, đệm Tris/Ace pH=8,0 được lựa chọn là hệ đệm tối ưu nhất cho

các khảo sát tiếp theo.

3.1.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm

Sau khi chọn được pH và thành phần của dung dịch đệm, nồng độ của

dung dịch đệm điện di cũng cần được khảo sát tối ưu. Trong phương pháp

điện di mao quản, nồng độ đệm phải đủ lớn để tạo nên môi trường điện ly cho

các ion di chuyểnvà không tạo ra các vùng dẫn điện khác nhau trong mao

quản làm ảnh hưởng đến quá trình di chuyển này. Qua tham khảo tài liệu [25,

27], nồng độ của các cấu tử trong dung dịch đệm điện di sử dụng trong

phương pháp CE-C4D thường lớn hơn 5 mM. Do đó, việc khảo sát được tiến

hành với các nồng độ từ 5mM trở lên, cụ thể là hệ đệm Tris/ Ace pH = 8,0 có

các nồng độ 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM và 50 mM. Các điều kiện khác

bao gồm:

- Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của doripenem 50,0 ppm;

meropenem 50,0 ppm; imipenem 50,0 ppm và ertapenem 50,0 ppm.

- Thế điện di 20kV, thời gian bơm mẫu 20s, chiều cao bơm mẫu 10cm

Các kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di

được thể hiện trong hình 3.7 và bảng 3.6.

Bảng 3.6: Độ phân giải của các cặp carbapenem ở các nồng độ đệm khác nhau

Độ phân giải Dori-Mero Mero-Imi Imi-Erta

Nồng độ đệm 5mM 2,27 2,50 7,20

Nồng độ đệm 10mM 3,54 3,85 9,15

Nồng độ đệm 15mM 4,50 4,70 10,91

Nồng độ đệm 20mM 4,09 4,52 10,00

Nồng độ đệm 30mM 4,08 3,85 9,56

Nồng độ đệm 50mM - - -

Hình 3.7: Điện di đồ của các carbapenem (nồng độ 50ppm) khi thay đổi nồng độ đệm. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm

Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, khi càng tăng nồng độ đệm thì chất phân

tích sẽ di chuyển chậm hơn do nồng độ ion trong cột mao quản tăng. Với

nồng độ 5mM và 50mM thì pic rất bé hoặc không xuất hiện, nhưng trong

khoảng nồng độ đệm từ 10mM đến 30mM thỏa mãn được tín hiệu của tỷ lệ

tín hiệu/ đường nền tốt hơn so với ở nồng độ thấp. Với đường nền ổn định

cũng như thời gian di chuyển nhỏ hơn thì nồng độ đệm được chọn cho các

khảo sát tiếp theo là 10mM.

3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu

Trong quá trình nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu hay vùng mẫu nạp

phải đủ lớn để đảm bảo đạt được độ nhạy tốt nhưng nếu vùng mẫu nạp vào

quá lớn thì sự phân tán (mở rộng vùng mẫu) sẽ xuất hiện mạnh do hiện tượng

khuếch tán làm giảm hiệu suất tách. Do đó, thời gian bơm mẫu hợp lý cũng

cần được khảo sát để đảm bảo thu được tín hiệu lớn nhất mà pic không bị giãn

rộng. Việc khảo sát thời gian bơm mẫu được thực hiện theo phương pháp thủy

động lực học kiểu xiphông ở độ cao 10cm với 4 giá trị thời gian bơm mẫu

khác nhau là 10s, 20s và 30s. Các điều kiện khảo sát khác như sau:

- Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của doripenem 50,0 ppm;

meropenem 50,0 ppm; imipenem 50,0 ppm và ertapenem 50,0 ppm.

- Thế điện di 20kV, chiều cao bơm mẫu 10cm

Các kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di

được thể hiện trong hình 3.8 và bảng 3.7.

Hình 3.8: Điện di đồ của các carbapenem (nồng độ 50ppm) khi thay đổi thời gian bơm mẫu. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), chiều cao bơm mẫu 10cm

Bảng 3.7: Độ phân giải của các cặp carbapenem ở các nồng độ đệm khác nhau

Độ phân giải Dori-Mero Mero-Imi Imi-Erta

Thời gian bơm mẫu 10s 4,05 4,15 12,08

Thời gian bơm mẫu 20s 3,54 3,85 9,15

Thời gian bơm mẫu 30s 2,69 2,95 6,56

Từ các kết quả khảo sát ở hình 3.8 có thể nhận thấy, khi tăng thời gian

bơm mẫu, thời gian di chuyển của các chất hầu như không thay đổi hoặc thay

đổi rất ít nhưng diện tích pic tăng tương ứng khi tăng thời gian bơm mẫu từ

10s đến 30s. Điều này hoàn toàn phù hợp vì khi tăng thời gian bơm mẫu sẽ

làm tăng lượng mẫu được bơm vào mao quản, tạo tín hiệu lớn hơn. Tuy

nhiên, khi thời gian bơm mẫu dài độ phân giải giữa các pic sẽ giảm và bên

cạnh đó với việc đối tượng mẫu là kháng sinh với hàm lượng hoạt chất lớn

cùng với đó là pic tạp cũng nhỏ cho nên thời gian bơm mẫu 20 s là phù hợp

cho các khảo sát tiếp theo.

3.1.4. Khảo sát chiều cao bơm mẫu

Để tránh hiện tượng khuếch tán vùng mẫu và làm doãn chân pic của

chất phân tích khi thời gian bơm mẫu tăng mà vẫn đưa lượng mẫu vào mao

quản được nhiều thì tăng chiều cao bơm mẫu là sự lựa chọn tốt nhất. Các

chiều cao bơm mẫu được lựa chọn để khảo sát là 5cm, 10cm, 15cm và 20cm.

- Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của doripenem 50,0 ppm;

meropenem 50,0 ppm; imipenem 50,0 ppm và ertapenem 50,0 ppm.

- Thời gian bơm mẫu 20s, chiều cao bơm mẫu 10cm

Các kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di

được thể hiện trong hình 3.9 và bảng 3.8.

Hình 3.9: Điện di đồ của các carbapenem (nồng độ 50ppm) khi thay đổi chiều cao bơm mẫu. Các điều kiện CE-C4D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 20s

Bảng 3.8: Độ phân giải của các cặp carbapenem khi thay đổi chiều cao bơm mẫu

Độ phân giải Dori-Mero Mero-Imi Imi-Erta

5 cm 4,24 4,39 12,76

10 cm 3,54 3,85 9,15

15 cm 3,31 3,52 8,67

20 cm 3,06 2,78 6,74

Khi tăng chiều cao bơm mẫu thì lượng mẫu vào mao quản càng lớn, do

đó có thể làm tăng độ nhạy chất phân tích của thiết bị. Thêm vào đó, với mục

tiêu mở rộng hướng đề tài sau này có thể áp dụng trong quy trình phân tích và

định lượng các kháng sinh nhóm carbapenem trong mẫu nước tiểu và huyết

tương nên chiều cao bơm mẫu 20cm là phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thế tách

Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế (E) một

chiều nhất định đặt vào hai đầu mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di

của các chất. Để có kết quả tốt và ổn định thì cần phải chọn thế thích hợp nhất

và giữ cho thế này luôn ổn định trong suốt quá trình phân tách. Trên cơ sở

trang thiết bị sẵn có và tham khảo tài liệu [25, 27], các điện thế được lựa chọn

khảo sát là: 15 kV, 20 kV và 25kV. Các điều kiện khác áp dụng ở các kết quả

tối ưu đã thu được bao gồm:

- Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của doripenem 50,0 ppm;

meropenem 50,0 ppm; imipenem 50,0 ppm và ertapenem 50,0 ppm

- Thời gian bơm mẫu 20s, chiều cao bơm mẫu 20cm

Các kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di

được thể hiện trong hình 3.10 và bảng 3.9.

Bảng 3.9: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng các thế điện di khác nhau

Độ phân giải Dori-Mero Mero-Imi Imi-Erta

15kV 12,97 5,12 -

20kV 3,06 2,78 6,74

25kV 2,97 2,26 5,71

Hình 3.10: Điện di đồ của các carbapenem (nồng độ 50ppm) khi thay đổi thế áp 2 đầu mao quản. Các điều kiện CE-C4D khác: mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 20s chiều cao bơm mẫu 20cm

Khi áp thế từ 15 kV đến 25 kV, thời gian di chuyển của các chất tăng.

Ở tất cả các thể tách khảo sát, các chất phân tích đều tách nhau tốt. Nhưng tại

thế tách 15kV sau hơn 1200s pic của chất thứ 3 mới xuất hiện còn tại thế

25kV đương nền phân tích bị nhiễu và bị dâng có thể vì khi tăng thế E, dòng

điện I lớn sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm nóng mao quản, làm giảm hiệu

quả tách. Tại thế tách 20kV đạt hiệu quả tách tốt, thời gian phân tích phù hợp.

Vì vậy thế 20kV là thế tách tối ưu.

Trên cơ sở các kết quả khảo sát ở trên, điều kiện tối ưu nhằm xác định

các carbapenem bằng phương pháp điện di mao quản sử dung detector đo độ

dẫn không tiếp xúc CE-C4D được thể hiện trong bảng 3.10 và điện di đồ phân

tách các chất ở điều kiện tối ưu ở hình 3.11.

Bảng 3.10: Điều kiện tối ưu xác định bốn kháng sinh nhóm carbapenem

Các yếu tố Điều kiện tối ưu

Detector CE - C4D

Mao quản silica, tổng chiều dài 60cm, chiều dài Mao quản hiệu dụng là 50cm, đường kính trong là 50µm

Phương pháp bơm mẫu Thủy động lực học kiểu xi phông: 20 cm

Thời gian bơm mẫu 20s

Dung dịch đệm điên di Tris 10mM/Ace, pH=8,0

Thế tách 20 kV

Hình 3.11: Điện di đồ phân tách đồng thời bốn kháng sinh ở điều kiện tối ưu như bảng 3.10

3.2. Đánh giá phương pháp phân tích

Để phương pháp có độ tin cậy và tính chính xác cao, cần đánh giá các

thông số sau: Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện, giới hạn

định lượng của chất phân tích, độ chụm và độ đúng của phương pháp.

3.2.1. Xây dựng đường chuẩn các carbapenem

Các dung dịch dùng để dựng đường chuẩn được pha loãng từ các dung

dịch chuẩn gốc. Các dung dịch này có nồng độ biến thiên trong khoảng từ

4ppm đến 250 ppm. Mỗi dung dịch chuẩn được bơm trên hệ điện di ba lần,

diện tích pic trung bình thu được sẽ là số liệu để dựng đường chuẩn sự phụ

thuộc của diện tích pic vào nồng độ. Các điều kiện đo trên cơ sở điều kiện tối

ưu nêu ở bảng trên và diện tích pic trung bình của các chất thu được như trong

bảng 3.11.

Bảng 3.11: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất của các carbapenem

Imipenem Ertapenem

STT

Doripenem Diện tích pic 0,0400

Nồng độ (ppm) 4,0 7,0

Meropenem Diện Nồng Nồng Diện Nồng Diện tích độ độ tích độ tích (ppm) pic (ppm) pic (ppm) pic 5,0 0,0163 9,0 0,0175 0,0143 8,0 0,0332 16,0 0,0248 10,0 0,0490 18,0 0,0346 20,0 0,1020 27,0 0,0470 11,0 0,0493 24,0 0,0380 0,2930 45,0 0,0795 18,0 0,0695 40,0 0,0607 50 0,6470 62,0 0,1021 26,0 0,1030 56,0 0,0902 100 0,9840 89,0 0,1510 37,0 0,1410 79,0 0,1280 150 0,1980 0,2350 55,0 0,2094 1,4010 200 0,2510 0,5580 150 0,4346 1,7560 250 118 150 133 250 1 2 3 4 5 6 7 8

Từ kết quả thu được ở bảng 3.11 và sử dụng phần mềm excel các

đường chuẩn đã được xây dựng thể hiện trong hình 3.12.

Đường chuẩn Doripenem

Đường chuẩn Meropenem

0.5

0.45

1.8

y = 0,0071x-0,0377 R² = 0,9994

y = 0,0017x+0,0007 R² = 0,9994

0.4

1.6

)

0.35

1.4

V m

1.2

0.3

( c i p

0.25

h c í t

0.8

0.2

n ệ i D

0.6

0.15

0.4

0.1

0.2

0.05

100

200

300

100 200 Nồng độ (ppm)

Nồng độ (ppm)

(a) (b)

Đường chuẩn Imipenem

Đường chuẩn Ertapenem

0.25

0.2

y = 0,0037x+0,0054 R² = 0,9988

)

y = 0,0017x-0,0017 R² = 0,9989

)

V m

0.15

( c i p

( c p h c í t

h c í t

0.1

n ệ D

n ệ i D

0.05

100

150

20 40 Nồng độ (ppm)

Nồng độ (ppm)

Hình 3.12: Đường chuẩn của các carbapenem

(a) doripenem (b) meropenem

Đánh giá phương trình hồi qui của đường chuẩn

*Kiểm tra sự sai khác của a với giá trị 0

Phương trình hồi quy có dạng: y = a + bx

Nếu xem a ≈ 0 thì phương trình trên được viết thành dạng yi = b’xi thay

′̅̅̅ = 𝑏𝑖

các giá trị yi, xi tương ứng vào thu được

2 =

∑ 𝑏𝑖 𝑛 − 1

′̅̅̅𝑥𝑖)

2 =

= 𝑆𝑦 ∑(𝑦𝑖 − 𝑦𝑖̂)2 𝑛 − 2 ∑(𝑦𝑖 − 𝑎 − 𝑏𝑥𝑖 )2 𝑛 − 2

= 𝑆′𝑦 ̂) ∑(𝑦𝑖 − 𝑦′𝑖 𝑛 − 3 ∑(𝑦𝑖 − 𝑏𝑖 𝑛 − 3

2 𝑆𝑦 2; F(0,95;8;7) = 3,726 𝑆′𝑦

Ta có Ftính=

Các giá trị thu được thể hiện trong bảng 3.12.

Bảng 3.12: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường chuẩn doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem

Chất phân tích Doripenem Meropenem Imipenem Ertapenem

23,568 17,794 41,833 16,412

bi‘ 2 60,358 158,998 65,891 57,840

2 y

Sy S’ 110,987 563,947 161,873 95,739

24,567 18,343 16,552 Ftính

35,469 Như vậy, Ftính < Fbảng nên không có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê

giữa a và 0, tức là phương pháp không mắc sai số hệ thống.

3.2.2. Giới hạn định lượng (LOD) và giới hạn phát hiện của phương pháp

(LOQ)

Trên cơ sở công thức tính giới hạn phát hiện nếu trong mục 2.5.1, LOD

là nồng nhỏ nhất có tín hiệu trên tín hiệu nền (S/N) ≥3. Kết quả xác định được

thể hiện trong bảng 3.13.

Bảng 3.13: Giới hạn phát hiện của doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem bằng phương pháp điện di mao quản

Chất S/N C (ppm) Chiều cao pic (S) Tín hiệu đường nền (N)

0,196

0,6209 0,5911 0,6549 0,6250 3,167 3,016 3,341 3,189 1,16 0,71 1,89 0,36

Doripenem Meropenem Imipenem Ertapenem Từ bảng 3.13 cho thấy, giới hạn phát hiện (LOD) của doripenem

1,16ppm; meropenem 0,71ppm; imipenem 1,89ppm và ertapenem 0,36ppm.

Theo cách tính tại mục 2.5.1 sẽ thu được giới hạn định lượng (LOQ) của các

carbapenem và được trình bày như trong bảng 3.14.

Bảng 3.14: Phương trình đường chuẩn, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của các carbapenem

LOD LOQ Chất phân tích Phương trình đường chuẩn Hệ số tương quan (R2)

Doripenem y = 0,0071x – 0,0377 0,9994 (ppm) 1,16 (ppm) 3,50

Meropenem y = 0,0017x + 0,0007 0,9994 0,71 2,36

Imipenem y = 0,0037x + 0,0054 0,9989 1,89 6,30

Ertapenem y = 0,0017x - 0,0017 0,9988 0,36 1,20

3.2.3. Độ chụm của phương pháp

Độ chụm của phương pháp được đánh giá thông qua độ lặp lại khi phân

tích bốn carbapenenem (doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem) ở

bốn mức nồng độ khác nhau thuộc đường chuẩn. Mỗi mức nồng độ được tiến

hành với bảy lần bơm mẫu độc lập. Kết quả thu được trình bày trong các bảng

3.15 và 3.16.

Bảng 3.15: Độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng doripenem và meropenem

Tham số 10 20 30 50 150 Nồng độ (ppm)

0,0051 0,1753 0,3196 1,0345 Doripenem

2,65 0,91 0,82 0,57

0,0180 0,0372 0,0588 0,2557 Meropenem

Giá trị trung bình (ppm) RSD Giá trị trung bình (ppm) RSD 2,31 1,82 0,76 0,63

Bảng 3.16: Độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng imipenem và ertapenem

10 40 50 60 150 Nồng độ (ppm)

0,0430 0,1562 0,2279 0,5681 Imipenem

1,25 1,20 0,33 0,25

0,0162 0,0832 0,1029 0,2562 Ertapenem

Giá trị trung bình (ppm) RSD Giá trị trung bình (ppm) RSD 3,05 2,14 1,84 0,97

Từ bảng trên, nhận thấy rằng khi đo lặp 7 lần của các carbapenem ở các

mức nồng độ khác nhau thì RSD đều đáp ứng với mục tiêu hướng đến là phân

tích nguyên liệu, bán thành phẩm và sàng lọc. Do đó, phương pháp có độ

chụm tốt và đáng tin cậy.

3.2.4. Độ đúng của phương pháp

Độ đúng của phương pháp được đánh giá dựa vào hiệu suất thu hồi của

quá trình xử lý mẫu, là một yếu tố quan trọng để đánh giá phương pháp phân

tích cùng với độ lặp lại. Với việc không có nền mẫu trắng để đánh giá độ

đúng của phương pháp bằng việc xác đinh hiệu suất thu hồi nhưng lại có

thành phần nền mẫu giống với mẫu thực tế nên có thể đánh giá độ đúng trên

nền mẫu trắng đó.

Các mẫu tự tạo được chuẩn bị như sau:

- Mẫu 1: Cân 0,2080g Na2CO3 hòa tan và định mức 10,00ml bằng nước

deion, rung siêu âm 10 phút, rồi lọc qua màng 0,45 µm.

- Mẫu 2: Cân 0,1750g NaHCO3 hòa tan và định mức 10,00ml bằng nước deion, rung siêu âm 10 phút điều chỉnh pH=7,5 bằng NaOH, rồi lọc qua màng 0,45µm.

Thêm chuẩn ở ba mức nồng độ:

- Mức 1: Thêm 50µl dung dịch chuẩn mỗi các carbapenem có nống độ 1000ppm tương ứng với meropenem vào 950ml mẫu 1 và imipenem và ertapenem 950µl mẫu 2.

- Mức 2: Thêm 70µl dung dịch chuẩn mỗi các carbapenem có nống độ 1000ppm tương ứng với meropenem vào 930ml mẫu 1 và imipenem và ertapenem 930µl mẫu 2.

- Mức 3: Thêm 100µl dung dịch chuẩn mỗi các carbapenem có nống độ 1000ppm tương ứng với meropenem vào 900ml mẫu 1 và imipenem và ertapenem 900µl mẫu 2.

Kết quả thu được trong bảng 3.17.

Bảng 3.17: Độ thu hồi phương pháp CE-C4D xác định ba kháng sinh nhóm carbapenem

Chất phân tích Mức Hiệu suất thu hồi Nồng độ chuẩn thêm vào Nồng độ thu hồi được Hiệu suất thu hồi trung bình

1 50 51,18 102,38

Meropenem 98,03

2 3 70 100 65,86 97,62 94,08 97,62

1 50 47,07 94,14

2 70 71,68 102,40 Imipenem 98,71

3 100 99,59 99,59

1 50 47,51 95,02

Ertapenem 97,89

2 3 70 100 69,96 98,73 99,94 98,73

Nhận xét: Các kết quả thu được ở các bảng trên cho thấy hiệu suất thu

hồi khá cao, lớn hơn 97%. Điều đó chứng tỏ phương pháp có thể áp dụng để

xác định các carbapenem trong mẫu thực tế.

3.3. Phân tích mẫu thực tế và đối chứng phương pháp tiêu chuẩn HPLC

3.3.1. Phân tích một số mẫu thuốc kháng sinh carbapenem

Các mẫu thuốc được thu mua trên thị trường có chứa các hoạt chất

carbapenem đã được xử lý theo quy trình theo mục 2.4.2 và sau đó được phân

tích trên thiết bị điện di CE-C4D. Các kết quả thu được như bảng 3.18 và một

số điện di đồ minh họa trong hình 3.14.

Bảng 3.18: Kết quả phân tích các kháng sinh nhóm carbapenem bằng phương pháp CE-C4D

Hàm lượng (mg/mL) Sai khác

STT Tên mẫu Carbapenem CE-C4D

Hàm lượng ghi trên nhãn so với nhãn công bố (%)

1 Meronem Meropenem 887 ± 5,8 1000 11,30

2 Meronem Meropenem 489 ± 3,8 500 2,24

Meropenem 498 ± 3,1 500 0,40

Meropenem 914 ± 7,3 1000 8,62 3 Meropenem Kabi 4 Meropenem Kabi

Ivanz Pizulen

5 Medozopen Meropenem Tienam 6 Tiepanem 7 Lastinem 8 Cepemid 9 10 Cepemid 11 Mixipem 12 13 14 Nimidine 15 Merugold Imipenem Meropenem Imipenem Imipenem Imipenem Imipenem Ertapenem Meropenem Imipenem Meropenem 937 ± 8,5 515 ± 3,9 980 ± 7,1 519 ± 4,5 735 ± 5,3 735 ± 5,3 478 ± 3,5 867 ± 4,8 486 ± 2,9 495 ± 3,5 975 ± 6,9 1000 500 1000 500 750 750 500 1000 500 500 1000 6,33 -3,00 2,03 -3,81 2,05 2,05 4,44 13,31 2,82 1,04 2,50

Hình 3.13: Kết quả phân tích giữa nhãn công bố và CE-C4D

Hình 3.14: Kết quả phân tích một số mẫu dược phẩm trên thị trường. Điều kiện CE-C4D như hình 3.11

Từ bảng 3.18 cho thấy, kết quả phân tích bằng phương pháp CE-C4D

cho hàm lượng các hoạt chất kháng sinh carbapenem trong các mẫu dược

phẩm sai khác so với nhãn công bố trong khoảng từ -3,81% đến 13,31%.

3.3.2. Phân tích đối chứnghàm lượng các carbapenem trong mẫu dược

phẩm với phân pháp tiêu chuẩn HPLC-PDA

Để kiểm chứng kết quả phân tích bằng phương pháp CE-C4D, hàm

lượng kháng sinh trong 12 mẫu đã được thực hiện đối chứng theo dược điển

Mỹ bằng phương pháp HPLC tại Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương. Các

kết quả thu được trong bảng 3.19, hình 3.15 và các phiếu kiểm nghiệm thể

hiện trong phụ lục.

Bảng 3.19: Kết quả phân tích các kháng sinh nhóm carbapenem bằng phương pháp CE-C4D và phương pháp tiêu chuẩn HPLC-PDA

Nồng độ (mg/g)

STT Tên mẫu Hoạt chất

CE-C4D Sai số giữa hai phương pháp (%) HPLC- PDA

Meronem Meropenem 887 ± 5,8 934 -5,03 1

Meronem Meropenem 489 ± 3,8 442 10,63 2

Meropenem 498 ± 3,1 491 1,43 3 Meropenem Kabi

Meropenem 914 ± 7,3 934 -2,14 4 Meropenem Kabi

Medozopen Meropenem 937 ± 8,5 951 -1,47 5

Merugold Meropenem 975 ± 6,9 930 4,84 6

Tienam Imipenem 515 ± 3,9 506 1,78 7

8 Tiepanem Meropenem 980 ± 7,1 884 10,86

9 Lastinem Imipenem 519 ± 4,5 508 2,17

10 Cepemid Imipenem 469 ± 2,7 482 -2,70

11 Mixipem Imipenem 478 ± 3,5 481 -0,62

1000

y = 0,9864x + 1,1711 R² = 0,9721

900

800

12 Ivanz Ertapenem 867 ± 4,8 883 -1,81

) g / g m

(

700

C L P H

600

500

400

500

600

800

900

1000

700 CE-C4D (mg/g)

Hình 3.15: Sự tương quan giữa kết quả phân tích HPLC và CE-C4D

Kết quả ở bảng 3.19 cho thấy, sai khác về kết quả hàm lượng giữa hai

phương pháp CE-C4D và HPLC đều nhỏ hơn 10%, trừ hai mẫu có chứa hoạt

chất meropenem, có thể do ảnh hưởng lớn của nền mẫu và/hoặc sai khác giữa

các phương pháp định lượng. Hệ số tương quan về kết quả phân tích giữa hai

phương pháp đạt được là khá cao (R2=0,9721). Điều này chứng tỏ phương

pháp CE-C4D có độ chính xác và độ đúng tốt, đặc biệt với mục tiêu phân tích

chất lượng nguyên liệu, bán thành phẩm và sàng lọc, góp phần đảm bảo chất

lượng của sản phẩm và bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Sau quá trình nghiên cứu, với mục tiêu ứng dụng phương pháp điện di

mao quản tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) để tách và

xác định đồng thời các carbapenem bao gồm doripenem, imipenem,

meropenem và ertapenem trong mẫu dược phẩm, luận văn đã thu được các kết

quả như sau:

- Đã tối ưu được các điều kiện tách và xác định đồng thời 4 chất họ

kháng sinh carbapenem (Dori, Imi, Mero và Erta) bằng phương pháp CE-

C4D. Các điều kiện tối ưu bao gồm: detector: CE-C4D; dung dịch điện ly: đệm

Tris 10mM/ Ace pH=8,0; Thế điện di: 20kV; Sử dụng mao quản silica, tổng

chiều dài 60cm, chiều dài hiệu dụng 50cm, đường kính trong 50µm; Phương

pháp bơm mẫu: thủy động lực học kiểu xiphông ở độ cao 20cm trong 20s.

Thứ tự các chất tách được với mao quản silica là: doripenem, imipenem,

meropenem và ertapenem.

- Đã đánh giá được phương pháp phân tích: xây dựng đường chuẩn xác

định 4 chất trong khoảng nồng độ 0,36 – 250,0 ppm, tính tuyến tính (các giá

trị R2 đều lớn hơn 0,9988), độ lặp lại (các giá trị RSD đề nhỏ hơn 3), độ đúng

(hiệu suất thu hồi của Imi, Mero và Erta đều lớn hơn 97 %), giới hạn phát

hiện (LOD) của doripenem, imipenem, meropenem và ertapenem lần lượt là

1,16 ppm; 0,71 ppm; 1,89 ppm và 0,36ppm; giới hạn định lượng (LOQ) của

Dori, Imi, Mero và Erta lần lượt là 3,50ppm; 2,36 ppm; 6,30 ppm và

1,20ppm.

- Đã ứng dụng phương pháp để phân tích hàm lượng imipenem,

meropenem và ertapenem trong 15 mẫu dược phẩm, cho kết quả sai khác giữa

hàm lượng các hoạt chất kháng sinh này trong mẫu dược phẩm phân tích bằng

phương pháp CE-C4D so với nhãn công bố nằm trong khoảng từ -3,81% đến

13,31%.

- Đã thực hiện phân tích đối chứng 12 mẫu đã được thực hiện phân tích

đối chứng bằng phương pháp HPLC tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung

ương. Kết quả thu được cho thấy sai khác giữa hai phương pháp đều nhỏ hơn

10%, trừ hai mẫu có chứa hoạt chất meropenem cao hơn 10% không đáng kể.

Hệ số tương quan về kết quả phân tích bằng hai phương pháp đạt được khá

cao (R2=0,9721). Điều này cho thấy phương pháp CE-C4D là đáng tin cậy,

phù hợp với mục tiêu phân tích chất lượng nguyên liệu, bán thành phẩm và

sàng lọc.

Từ các kết quả thu được nhận thấy, phương pháp điện di mao quản tích

hợp detector độ dẫn không tiếp xúc (CE- C4D) phù hợp với việc xác định

đồng thời hàm lượng Dori, Imi, Mero và Erta trong dược phẩm qua đó kiểm

soát được chất lượng thuốc và nghiên cứu có thể mở rộng xác định hàm lượng

các hoạt chất kháng sinh này trong mẫu huyết tương, góp phần hỗ trợ điều trị

hiệu quả.

Danh mục công bố liên quan đến nội dung luận văn

1. Thi Ngoc Mai Pham , Thai Binh Le , Duc Dung Le , Tran Hung Ha , Ngoc

Son Nguyen , Tien Duc Pham , Peter C Hauser , Thi Anh Huong

Nguyen , Thanh Duc Mai (2019), “Determination of Carbapenem

Antibiotics Using a Purpose-Made Capillary Electrophoresis Instrument

With Contactless Conductivity Detection”, Journal of Pharmaceutical

and Biomedical Analysis, Volume 178, 30 January 2020, 112906.

2. Lê Thái Bình, Lê Đức Dũng, Phạm Thị Ngọc Mai, Nguyễn Thị Ánh Hường

(2019), “Nghiên cứu xác định đồng thời một số kháng sinh carbapenem

bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp

xúc (CE-C4D)”, Báo cáo poster tại Hội thảo khoa học giao lưu ngành Hóa

lần thứ XII tại Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội ngày 19/4/2019.

3. Nguyễn Thị Ánh Hường, Phạm Thị Ngọc Mai, Lê Thái Bình, Lê Đức

Dũng, Chu Thị Huệ, Hà Trần Hưng, Nghiên cứu phát triển và ứng dụng

phương pháp CE- C4D nhằm định lượng kháng sinh carbapenem trong

dược phẩm và lâm sàng, Hội nghị nữ tri thức Việt Nam, trang 147-148.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Center Therapeutic Research (2007), “Comparison of carbapenem antibiotics”, Pharmacist’s Letter/ Prescriber’s Letter, 23(12),pp. 231205.

2. George G Zhanel, PharmD PhD, et al. (1998), “Imipenem and meropenem: Comparison of in vitro activity, pharmacokinetics, clinical trials and adverse effects”, Can J Infect Dis, 9(4), pp. 215-228.

3. Sharma S., A. Nitasha, S. Jaskaran and Shukla S.K. (2015), “Qualitative analysis of 5th Generation of Carbapenem Antibiotics by UVSpectrophotometric Method”, Research Journal of Chemical Sciences,Vol. 5(7), pp. 35-39.

4. R.J. Forsyth (1994), “Determination of imipenem and cilastatin sodium in Primaxin@ by first order derivative ultraviolet spectrophotometry”, Journal of Pharmaceutical& Biomedical Analysis, Vol. 12, No. 10, pp. 1243.1248.

5. Abdelilah H., J. C. Jimenez, Manuel C., Miguel A. B. and Alfonso G.(2005), “Electrochemical study of imipenem’s primary metabolite at the mercury electrode Voltammetric determination in urine”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 38, pp. 768–775.

6. L. Hakobyan, J. Pla Tolos, Y. Moliner-Martinez, C. Molins-Legua, J. R. Ramos, M. Gordon, P. Ramirez-Galleymore and P. Campins-Falco (2018), “Determination of meropenem in endotracheal tubes by in-tube solid phase microextraction coupled to capillary liquid chromatography with diode array detection”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 151, pp. 170-177.

7. Kayo I., Kazuro I., Norifumi M., Mizuka M., Shin-Ichiro N. and Masao

K. (2007), “High-performance liquid chromatography with ultraviolet

detection for real-time therapeutic drug monitoring of meropenem in

plasma”, Journal of Chromatography B, 856, pp. 371–375.

high-performance human serum by in

8. Mehnam S., Alasdair P. M. and Andrew M. L. (2006), “Assay of ertapenem liquid chromatography”, International Journal of Antimicrobial Agents, 27, pp.165–167.

9. Yuji K., Junko K. and Seiji H. (2008), “Simple and rapid determination of serum carbapenem concentrations by high-performance liquid chromatography”, J. Infect Chemother, 14, pp. 30–34.

10. E. Dailly, R. Bouquié, G. Deslandes, P. Jolliet and R. Le Floch (2011), “A liquid chromatography assay for a quantification of doripenem, ertapenem, imipenem, meropenem concentrations in human plasma: Application to a clinical pharmacokinetic study”, Journal of Chromatography B, 879, pp.1137–1142.

11. Therese K., M. Deters, K. Resch and V. Kaever (2006), “Quantification of the carbapenem antibiotic ertapenem in human plasma by a validated liquid chromatography – mass spectrometry method”, Clinica Chimica Acta, 364, pp. 239 – 245.

12. Bộ Y tế (2017), Dược thư quốc gia Việt Nam dùng cho tuyến y tế cơ sở,

Hà Nội.

13. Eric Scholar (2007),” Meropenem, imipenem, ertapenem”, The

comprehensive pharmacology reference, pp. 1.15.

14. Nilsson-Ehle I, Hutchison M, et al. (1991), “Pharmacokinetics of meropenem compared to imipenem-cilastatin in young, heathy males”, Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 10(2), pp. 85-88.

15. Clissold S. P., Todd P. A., et al. (1987), “Imipenem/ cilastatin. A review of its antibacterial activity, pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy”, Drugs, 33(3). Pp. 183.241.

16. George G Zhanel, Ryan Wiebe, et al. (2007), “Comparative Review of

the carbapenem”, Drugs, 67(7), pp. 1027-1052.

17. Zhanel GG, Johanson C, et al. (2005), “Ertapenem: Review of a new

carbapenem.”, Expert Rev Anti Infect Ther, 3(1), pp. 23.39.

18. Hutchison M, Faulker KL, et al. (1995), “A compilation of meropenem 36 J Antimicrob Chemother., distribution data.”,

tissue Suppl(A:43.56),pp.

19. David P Nicolau (2008), “Carbapenems: a potent class of antibiotics”,

Expert Opin, Pharmacother, 9(1), pp.23.27.

20. Gerald Mandell, John Bennett, et al. (2009), “Carbapenems and monobactams”, Madell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th Edition, Churchill Livingstone, pp 21. Norry S.R. (1995), “Carbapenem”, Med Clin North Am, 79(4), pp.745-

59.

22. Nadine, Thorsten, Stefanie, Markus and T. Hoppe-Tichy (2017), “Therapeutic drug monitoring of beta-lactam antibiotics – influence of sample stability on the analysis of piperacillin, meropenem, ceftazidime and flucloxacillin by HPLC-UV”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 143, pp.86-93.

23. M. Paal, M. Zoller, C. Schuster, M. Vogeser and G. Schütze (2018), “Simultaneous quantification of cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid and piperacillin in human serum using an isotope-dilution HPLC–MS/MS method”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 152, pp.102.110.

24. Meropenem for Injection, USP40, Volume-3, pp. 5024-5026. 25. Imipenem and Cilastatin for Injection, USP40, Volume-3, pp. 4571-

4572.

26. Nguyễn Văn Ri (2016) “Hóa học phân tích phần 2: Các phương pháp

phân tích công cụ.”

27. Lê Thị Hồng Hảo, Phạm Thị Ngọc Mai, Nguyễn Thị Ánh Hường, Nguyễn Vân Anh, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Trang (2016), “Ứng dụng phương pháp điện di trong phân tích thực phẩm”, Nhà Xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

28. Nguyễn Thị Ánh Hường (2010), “Nghiên cứu xác định các dạng Asen vô cơ trong nước ngầm bằng phương pháp điện di mao quản kết nối với cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc”, Luận án tiến sĩ hóa học, Đại học Quốc gia Hà Nội.

29. Nguyễn Thị Quỳnh Hoa (2017), “Nghiên cứu phương pháp điện di mao quản kết nối với cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc xác định một

số phụ gia thực phẩm và β-agonist.”, Luận án tiên sĩ hóa học, Đại học Quốc gia Hà Nội.

30. Nguyễn Văn Ri(2006).“Chuyên đề các phương pháp tách chất“, NXB

ĐH QGHN

31. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003), “Các phương pháp phân tích công cụ”, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.

32. Shoko T., K Hamase, A. Kinoshita and K. Zaitsu (1999), “Simple and rapid analytical method for carbapenems using capillary zone electrophoresis”, Journal of Chromatography B, 727, pp.219–225. 33. Toshihiro K. and I. Furuta (2005), “Determination of Meropenem by Capillary Electrophoresis Using Direct Injection of Serum”, Journal of Chromatographic Science, Vol. 43, 430-433.

34. Yahya M., R. Neubert and F. Nagel (1999), “Capillary zone electrophoresis determination of meropenem in biological media using a high sensitivity cell”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 20, pp. 899–903.

35. Katarzyna M., J. Cielecka-Piontek, G. Pajchel and S. Tyski (2013), “Determination of biapenem in a medicinal product by micellar electrokinetic chromatography with sweeping in an enhanced electric field”, Journal of Chromatography A, 1282, pp.153.160.

36. Katarzyna M, Genowefa and Stefan. (2009), “Different sample stacking strategies for the determination of ertapenem and its impurities in pharmaceutical by micellar electrokinetic chromatography formulation”, Journal of Chromatography A, 1216, pp.2934.2942. 37. Yu-Wei Chou, Yuan-Han, Jin-Hon, Chen-Chun and Su-Hwei (2007), “Quantification of meropenem in plasma and cerebrospinal fluid by micellar electrokinetic capillary chromatography and application in bacterial meningitis patients”, Journal of Chromatography B, 856, pp. 294–301.

38. Tạ Thị Thảo, giáo trình môn học, “Thống kê trong hóa phân tích”, Đại

học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN.

39. Daniel C. Harris, “ Quantative Chemiscal Analysis”, 9th Edition,

Freeman, W. H. & Company.

40. Douglas A. Skoog, Donald M. West, F. James Holler, Stanley R. Crouch, “Fundamentals of Analysis Chemistry“, University of Wisconsin.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Kết quả phân tích đối chứng do viện Kiếm nghiệm thuốc

trung ương thực hiện

Hình PL1: Kết quả phân tích mẫu thuốc IVANZ chứa hoạt chất Ertapenem

(a)

(b)

(c)

(d)

Hình PL2: Kết quả phân tích mẫu dược phẩm chứa Imipenem

(a) Mẫu thuốc Lastinem (b) Mẫu thuốc Cepemid 500mg

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

Hình PL3: Kết quả phân tích mẫu dược phẩm chứa Meropenem

(a) Mẫu thuốc Meropenem Kabi (b) Mẫu thuốc Pizulen

(e) Mẫu thuốc Medozopen

Phụ lục 2: Thông tin mẫu thuốc sử dụng trong nghiên cứu

Bảng PL1: Thông tin mẫu thuốc sử dụng trong nghiên cứu

Tên sản STT Đặc điểm Xuất xứ Hàm lượng phẩm

Dạng bột

pha dùng NSX: ACS dịch để Chứa DOBFAR tiêm meropenem SPA, Italya, hoặc trihydrate số lô MX267, truyền 1, 2 Meronem meropenem tương đương NSX với 500 và 1g 22/07/2016, meropenem HSD: khan 30/06/2020

Dạng bột Công ty cổ Chứa pha dùng phần meropenem dịch để Fresenius trihydrate tiêm Kabi tương đương Meropenem hoặc 3, 4 meropenem Bidiphar, Số với 1g và Kabi truyền lô: 500mg MVM5027, meropenem HSD: khan 06/2020

Dạng bột NSX Chứa 5 Medozopen meropenem pha dùng Medochemie meropenem

dịch để ltd – Factory trihydrate

tiêm C, Số LOT: tương đương

hoặc CK34AG, với 1g

truyền NSX meropenem

10/2017, khan, 208mg

HSD 10/2019 sodium

carbonate

NSX: Merck Chứa bột vô

Sharp & trùng Dạng bột Dohme Corp, imipenem pha dùng đóng gói tại: monohydrate dịch để Laboratoires tương đương tiêm Merck Sharp 500mg hoặc 6 Tienam imipenem & Dohme- imipenem truyền Chibret, số khan và natri

Lot R005318, cilastatin

NSX: tương đương

05122017, 500mg

HSD: cliastatin

04122019 khan

NSX: ACS Chứa Dạng bột Dobfar.S.P.A, meropenem pha dùng Ý, số Lot trihydrate dịch để 7 Tiepanem meropenem C005340, tương đương tiêm NSX: với 1000mg hoặc 08092017, meropenem truyền HSD: khan

08092020

Chứa bột vô NSX VENUS trùng REMEDIES Dạng bột imipenem LIMITED, pha dùng monohydrate DNNK: công dịch để tương đương ty TNHH tiêm 500mg Bình Việt hoặc imipenem 8 Lastinem imipenem Đức, Số Lot truyền khan và natri X8IB033A, cilastatin ngày sản xuất tương đương 22/09/2018 500mg HSD cliastatin 21/03/2021 khan

Chứa bột vô

trùng

imipenem Dạng bột NSX: công ty monohydrate pha dùng cổ phần dược tương đương dịch để phẩm Minh 500mg và tiêm Dân, Việt 750mg 9, hoặc Nam, số lô Cepemid imipenem imipenem 10 truyền 010917, ngày khan và natri SX 22/09/17, cilastatin HSD tương đương 22/09/2020 750mg

cliastatin

khan

Chứa bột vô

trùng Dạng bột NSX: imipenem pha dùng FACTA monohydrate dịch để Farmaceutici tương đương tiêm S.P.A, Italy, 500mg hoặc 11 Mixipem imipenem số lô imipenem truyền IVN1018, khan và natri

ngày sản xuất cilastatin

11/2017, tương đương

500mg HSD 11/2020 cliastatin

khan

NSX:

Laboratoires

Merck Sharp Dạng bột

& Dohme- pha dùng Chứa Chibret, dịch để ertapenem DNNK: Công tiêm natri tương ty cổ phần hoặc đương 1g 12 Ivanz ertapenem dược liệu TW truyền ertapenem 2, số lô: dưới dạng gốc R005269, acid tự do NSX

18/12/2017,

HSD

17/12/2019

13 Pizulen meropenem Dạng bột NSX: Demo Chứa

pha dùng S.A. meropenem

dịch để Pharmaceutic trihydrate

tiêm al Industry - tương đương

hoặc HY LẠP, với 500

truyền NĐK: Demo meropenem

S.A. khan

Pharmaceutic

al Industry, số

lô MX267,

NSX

22/07/2018,

HSD:

30/06/2021

NSX: Anfarm Dạng bột

Hellas S.A - pha dùng Chứa HY LẠP, dịch để meropenem NĐK: tiêm trihydrate Vipharco, số hoặc tương đương 14 Nidimine imipenem lô 31817, truyền với 500 NSX imipenem 05/2019, khan HSD:

05/2020

Dạng bột NSX: Facta Chứa

pha dùng Farmaceutici meropenem

15 Merugold meropenem dịch để S.p.A, trihydrate

tiêm Teramo Ý, số tương đương

hoặc lô 0007D7, với 1000

truyền NSX meropenem

30/06/2017, khan

HSD:

30/06/2020

Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm carbapenem bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D)

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM

CARBAPENEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

(CE-C4D)

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM

CARBAPENEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

(CE-C4D)

B)Mạch điện tương đương

Đường chuẩn Doripenem

Đường chuẩn Meropenem

Đường chuẩn Imipenem

Đường chuẩn Ertapenem

) g / g m

(

C L P H

700 CE-C4D (mg/g)

Có thể bạn quan tâm

Tình hình đề kháng kháng sinh nhóm Carbapenem và sinh enzyme Carbapenemase của vi khuẩn Enterobacteriaceae, Pseudomonas Aeruginosa, Acinetobacter baumannii tại bệnh viện trường Đại học Y Dược Cần Thơ năm 2024-2025

Đề cương ôn tập Hóa phân tích

Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của loài Biến hoa sông hằng (Asystasia gangetica (L.) T. Anderson)

Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học từ lá của loài Hibiscus tiliaceus L.

Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu tổng hợp và đánh giá tính chất hệ nanoliposome mang cao ethanol ớt định hướng gây độc tế bào trên dòng MCF-7

Tỷ lệ nhiễm và gen kháng thuốc metallo-β-lactamase NDM, IMP, VIM của một số trực khuẩn gram âm trên bệnh nhân viêm phổi tại Bệnh viện Đa khoa thành phố Cần Thơ năm 2022-2023

Xây dựng quy trình định lượng đồng thời paracetamol, cafein và codein phosphat trong chế phẩm bằng phương pháp điện di mao quản

Ứng dụng tác nhân đối quang trong phân tích đồng phân Ketoprofen bằng phương pháp điện di mao quản

Xác định đồng thời glucosamin và canxi trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc CE-C4D

Tóm tắt luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu quy trình giám định một số chất ma túy tổng hợp nhóm ATS trong nước tiểu bằng phương pháp điện di mao quản

Bài giảng Đại cương hóa phân tích (57 trang)

Khảo sát tình hình sử dụng vancomycin tại Bệnh viện Thống Nhất Tp. Hồ Chí Minh

Thực trạng sử dụng kháng sinh của khoa ngoại tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Trà Vinh năm 2017

Nghiên cứu xác định hợp chất phthalate trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí - khối phổ

Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu các chất gây hại phát sinh trong quá trình bảo quản cá ngừ vằn

Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu phân tích Bis (1,3-dichloro-2-propyl) phosphate trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LCMS/MS)

Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu phân tích paraben và dẫn xuất của chúng trong cá biển và động vật hai mảnh vỏ

Luận văn Thạc sĩ Hoá học hữu cơ: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của Pouzolzia pentandra (Roxb.) Benn

Luận văn Thạc sĩ Hoá học hữu cơ: Phân lập và đánh giá tác dụng gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất prenyl xanthone từ rễ cây Tai chua (Garcinia cowa Roxb.)

Luận văn Thạc sĩ Hoá học hữu cơ: Nghiên cứu tách chiết, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất tách được từ cây sầm núi (Memecylon scutellatum (Lour.))

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok