Luận văn thực hiện với mục tiêu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của tập đoàn giống lúa chịu mặn bản địa của Việt Nam ở mức phân tử và xác định mối quan hệ di truyền giữa các nguồn gen ở các địa phương khác nhau phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen lúa chịu mặn bản địa của Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Lúa gạo là cây lương thực quan trọng đối với con người. Trên thế giới cây lúa
được xếp vào vị trí thứ hai sau cây lúa mì về diện tích và sản lượng. Ở Châu Á, lúa gạo
được coi là cây lương thực quan trọng nhất, chiếm diện tích 135 triệu ha trong tổng số
148,4 triệu ha trồng lúa của toàn thế giới. Trong tương lai, xu thế sử dụng lúa gạo sẽ
còn tăng hơn vì đây là loại lương thực được sử dụng khá phổ biến, dễ bảo quản, dễ chế
biến và cho năng lượng khá cao.
Theo tính toán của Peng và cộng sự, đến năm 2030 sản lượng lúa của thế giới
cần phải đạt 800 triệu tấn mới có thể đáp ứng được nhu cầu lương thực của con người
[52]. Với tình hình dân số tăng nhanh, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lương
thực. Theo một nghiên cứu của Lobell, đến năm 2030 sản lượng lương thực ở châu Á
sẽ giảm khoảng 10%, đặc biệt là sản phẩm lúa gạo [38]. Nguyên nhân năng suất và sản
lượng lúa gạo giảm đi do ảnh hưởng bởi thiên tai, sâu bệnh và các yếu tố môi trường.
Trong đó, yếu tố đáng chú ý là hiện tượng đất nhiễm mặn. Trên thế giới, đất trồng trọt
bị ảnh hưởng mặn ước khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3 tổng diện tích đất canh tác [3].
Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng năm
những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm thực của biển.
Theo số liệu thống kê, diện tích đất ngập mặn năm 1982 là 494.000 ha, đến năm 2000
là 606.792 ha [9]. Theo báo cáo mới nhất của Cục trồng trọt, tại đồng bằng sông Cửu
Long, xâm ngập mặn đã ảnh hưởng đến 620.000 ha/1.545.000 ha lúa đông xuân 2009-
2010, chiếm 40% diện tích toàn vùng (tại các tỉnh ven biển như Tiền Giang, Trà Vinh,
Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang và Bến Tre). Trong đó, diện tích có nguy
cơ bị xâm ngập mặn cao khoảng 100.000 ha/650.000 ha, chiếm 16% diện tích canh tác
lúa của các tỉnh trên. Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện
tượng băng tan ở hai cực, nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven
biển. Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho
chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo và là một thử thách lớn của mục tiêu đảm bảo
an ninh lương thực và xuất khẩu lúa gạo của Việt nam. Chính vì vậy, việc chọn tạo
giống lúa chịu mặn đang được đặt ra là hết sức cấp bách và cần thiết.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Trong tập đoàn quĩ gen lúa của Việt Nam có rất nhiều nguồn gen lúa chịu mặn
thích nghi với điều kiện sinh thái ở các địa phương khác nhau, nhưng chưa được
nghiên cứu và đánh giá một cách đầy đủ. Hầu hết các giống chịu mặn có năng suất còn
rất thấp. Một số giống lúa được cải tiến, lai tạo và chọn lọc vẫn chưa đáp ứng được
nhu cầu của sản xuất. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa dạng
di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu mặn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR”
nhằm cung cấp các thông tin về các nguồn gen lúa chịu mặn phục vụ công tác bảo tồn
và chọn tạo giống lúa chịu mặn.
2. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của tập đoàn giống lúa chịu mặn bản địa
của Việt Nam ở mức phân tử và xác định mối quan hệ di truyền giữa các nguồn gen ở
các địa phương khác nhau phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu
quả các nguồn gen lúa chịu mặn bản địa của Việt Nam.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Hiểu biết về đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa chịu mặn tạo cơ sở lý luận
cho việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm năng di truyền của các giống lúa chịu
mặn trong sản xuất.
Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa chịu mặn có ý nghĩa quan trọng
trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng chính xác các nguồn
gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo
tồn đa dạng nguồn gen lúa chịu mặn ở mức phân tử.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua các chỉ thị phân tử góp phần nâng cao
hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất cao,
có khả năng chịu mặn, phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng nhiễm mặn và cơ cấu
sản xuất lúa vùng nhiễm mặn ở Việt Nam.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng:
Đối tượng nghiên cứu là cứu là tập đoàn 38 giống lúa có đặc tính chịu mặn
được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ và bảo
tồn tại ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật) và ngân
hàng gen của Viện Lúa đồng bằng sông Cửa Long
4.2. Phạm vi nghiên cứu:
Đề tài nghiên cứu, đánh giá nguồn gen ở mức phân tử bằng chỉ thị SSR; Các thí
nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di Truyền Nông nghiệp.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Vài nét sơ lược về cây lúa
1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố của cây lúa
Tổ tiên cây lúa đã tồn tại từ đầu kỷ Phấn trắng. Vào giữa kỷ này, xuất hiện
một trong những loại nguyên thuỷ nhất thuộc tộc Oryzae, đó là loại Streptochasta
Schrad. Đến cuối kỷ Phấn trắng xuất hiện loại tre (Bambusa) và loại lúa (Oryza).
Một số loại khác xuất hiện muộn hơn vào kỷ thứ ba, thời kỳ phát triển mạnh nhất
của họ Hoà thảo (Gramineae). Các loài lúa Oryza spp. có cùng tổ tiên chung vào
thời địa cầu Gondwanaland, sau khi trái đất tách rời thành năm lục địa cách đây
khoảng 85-90 triệu năm [4].
Theo Chang, lúa trồng Oryza sativa được tiến hoá từ cây lúa dại hàng năm Oryza
nivara. Do thích ứng với điều kiện khí hậu, đặc biệt là nhiệt độ, lúa Oryza sativa lại tiếp tục
tiến hoá làm ba nhóm: Indica thích hợp với khí hậu nhiệt đới, Japonica thích ứng với khí
hậu lạnh và cho năng suất cao và Javanica có đặc tính trung gian [18].
Theo Oka (1988) lại cho rằng Oryza sativa có nguồn gốc từ cây lúa dại lâu năm
Oryza rufipogon [50].
Tác giả Cheng khi nghiên cứu di truyền tiến hoá của 101 giống lúa, bao gồm cả lúa
trồng và lúa dại cho thấy loài lúa trồng Oryza sativa chia thành hai nhóm tương ứng với hai
loài phụ là Indica và Japonica. Trong khi đó Oryza rufipogon chia thành bốn nhóm, một
nhóm là Oryza rufipogon hàng niên và ba nhóm Oryza rufipogon đa niên. Kết quả cho thấy
các giống lúa Japonica có quan hệ gần gũi với một nhóm Oryza rufipogon đa niên, còn các
giống lúa Indica có quan hệ gần với nhóm lúa Oryza rufipogon hàng niên [20].
Ở châu Phi cả hai loài lúa dại Oryza longistaminata (đa niên) và Oryza
brevigulata (hàng niên) đều hiện diện, vì vậy, nhiều tác giả cho rằng Oryza
breviligulata là nguồn gốc của Oryza glaberrima [4].
Hiện nay, nhiều chuyên gia lúa gạo đồng ý rằng lúa glaberrima và lúa sativa
có cùng chung nguồn thủy tổ vào thời kỳ lục địa nguyên thuỷ Gondwanaland,
nhưng sau khi các lục địa tách rời nhau, lúa sativa và glaberrima tự tiến hoá từ các
loài lúa dại bản địa ở hai châu lục là châu Á và châu Phi (Khush, 1997) [36].
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Hình 1.1. Sơ đồ tiến hoá của hai loài lúa trồng (Khush, 1997) [36]
Việc thuần hoá cây lúa diễn ra ở bán đảo Trung Ấn và được bắt đầu khoảng
10.000 - 15.000 năm trước, còn cây lúa trồng đã xuất hiện ở châu Á cách đây khoảng
8.000 năm [19,39].
Theo tác giả Chang thì O. sativa được thuần hóa ở Nam Himalaya, vùng núi
Đông Nam Á và Đông Nam Trung Quốc.
Từ trung tâm phát sinh, cây lúa theo thời gian đã được di thực đi nhiều vùng
sinh thái mới. Qua quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo, cây lúa có khả năng
thích nghi ngày càng rộng. Hiện nay, cây lúa được trồng trong những điều kiện
sinh thái và khí hậu rất khác nhau. Lúa được trồng ở Tây Bắc Trung Quốc (50 o vĩ
Bắc), ở miền Trung Xumatra trên đường xích đạo và ở cả New South Wales, châu
Úc (35o vĩ Nam). Lúa cũng được trồng từ những vùng thấp hơn mực nước biển, ở
Kerala (Ấn Độ) đến những vùng có độ cao 2000 mét ở Kasmia (Ấn Độ) và có thể
trồng trên cạn hoặc điều kiện nước sâu tới 1,5 - 5 mét [8].
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
1.1.2. Phân loại
Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae), họ
phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima. Loài
Oryza sativa là lúa trồng ở châu Á và Oryza glaberrima là lúa trồng ở châu Phi. Năm
1753, Lineaeus là người đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza. Dựa vào
mày hạt và dạng hạt tác giả đã phân chi Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata,
coarctala, rhynchoryza và chi Oryza gồm tất cả 19 loài [4].
Morinaga là người đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật phân tích genome để định danh
các loài lúa dại. Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này đã giúp phân tích
các loài lúa được chính xác hơn [4].
Hội nghị Di truyền lúa Quốc tế họp tại Philippines năm 1963 đã thống nhất
chia chi Oryza thành 19 loài. Tại Hội nghị di truyền lúa Quốc tế tiếp theo ở Viện
nghiên cứu lúa Quốc tế tại Philippines (năm 1967) lại khẳng định chi Oryza có 22 loài
trong đó có 20 loài lúa dại và hai loài lúa trồng [19].
Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea là
loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia thành bốn nhóm
genome. Danh sách các loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ gen của từng loài ở Bảng 1.1
(Vaughan, 1994) [62].
Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài trong đó 21
loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima thuộc loại nhị
bội 2n = 24 có bộ gen AA. Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung
Phi còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và được chia thành hai loài phụ
là Indica và Japonica.
Tác giả Vitte cũng cho rằng hai loài phụ Indica và Japonica được phân hoá độc
lập với nhau, cách đây khoảng 200.000 năm [63]. Trong khi đó tác giả Jianxin dựa vào
kết quả phân tích ADN nhân tế bào lại cho rằng lúa Indica và lúa Japonica được tách
ra từ một tổ tiên chung, cách đây khoảng 440.000 năm [34].
Theo Tateoka (1963, 1964) Oryza được phân thành 22 loài. Trong đó, tác giả
cũng thống nhất 2 loài lúa trồng O. sativa L. và O. glaberrima Steud, nhưng xem dạng
lúa Châu Phi (O. perennis Moench) như là một loài riêng, dạng lúa Châu Á và Châu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Mỹ thuộc về loài O. rufipogon Griff. Tateoka cũng bổ sung 2 loài mới là O.
longiglumis Jansen và O. angustifolia Hubbard (Bảng 1) [59,60].
Bảng 1.1 Các loài Oryza theo Takeoka (1963) với số nhiễm sắc thể,
kiểu gen và phân bố địa lý
Nhóm/loài 2n Kiểu gen Phân bố địa lý
AA AA AA AA AA EE CC
24 Khắp thế giới, lúa trồng 24 Châu Á, Châu Mỹ 24 Châu Phi 24 Châu Phi, lúa trồng 24 Châu Phi 24 Châu Úc Châu Phi 24 24, 48 BB, BBCC Châu Phi 24 48 48 48 48 Châu Á Châu Á Châu Mỹ Châu Mỹ Châu Mỹ CC BBCC CCDD CCDD CCDD
New Guinea
Châu Á 24
Châu Á New Guinea 48 48
FF
Châu Phi Châu Phi Malagasy Châu Phi 24 24 24 24
Nhóm Oryzae Sativa L. Rufipogon Griff. Barthii A. Chev. glaberrima Steud. breviligulata A. Chev. et Roehr. australiensis Domin eichingeri A. Peter punctata Kotschy officinalis Wall. minuta J.S. Presl latifolia Desv. alta Swallen grandiglumis Prod. Nhóm Schlechterianae schlechteri Pilger Nhóm Granulatae meyeriana Baill. Nhóm Ridleyanae ridleyi Hook. F. longiglumis Jansen Nhóm Angustifoliae brachyantha A. Chev. et Roehr. angustifolia Hubbard perrieri A. Camus Tisseranti A. Chev. Nhóm Coarctatae Coarctata Roxb. Châu Á 48
Nguồn: Oka, 1988
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Bảng 1.2 Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa
INDICA JAPONICA
JAVANICA - Thân cao trung bình - Nở bụi thấp
Đặc tính Thân Chồi Lá - Thân cao - Nở bụi mạnh - Lá rộng, xanh nhạt - Lá rộng, cứng, xanh - Thân thấp - Nở bụi trung bình - Lá hẹp, xanh đậm
Hạt
nhạt - Hạt to, dầy - Hạt không có đuôi hoặc có đuôi dài - Trấu có lông dài - Ít rụng hạt - Hạt tròn, ngắn - Hạt không đuôi tới có đuôi dài - Trấu có lông dài và dầy - Ít rụng hạt - Hạt thon dài, dẹp - Hạt hầu như không có đuôi - Trấu ít lông và lông ngắn - Hạt dễ rụng
Sinh học -Tính quang cảm rất thay đổi - Tính quang cảm rất yếu - Tính quang cảm rất thay đổi
Nguồn: Chang, 1965.
Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm hơn 1/10 diện tích đất trồng trọt trên thế
giới và có 15 nước trên thế giới trồng lúa với diện tích hơn hơn 1 triệu ha (trong đó có
tới 13 nước thuộc Châu Á). Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích
trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu. Bangladesh, Indonexia, Thái Lan mỗi nước
đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước Mĩ La
tinh. Cả châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích trồng lúa của Việt Nam,
nhưng sản lượng lúa lại thấp hơn Việt Nam từ 2-3 lần [12].
1.2. Đất nhiễm mặn
Đất mặn được xem là một trong những vấn đề cần quan tâm trên thế giới, bởi
nó ảnh hưởng rất lớn đến diện tích và năng suất cây trồng. Tính chất vật lý và hoá học
của đất mặn rất đa dạng, biến thiên tuỳ thuộc vào nguồn gốc của hiện tượng mặn, độ
pH của đất, hàm lượng chất hữu cơ trong đất, chế độ thuỷ văn và nhiệt độ [24].
Đất mặn chứa một lượng muối hoà tan trong nước ở vùng rễ cây, làm ảnh
hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây trồng. Mức độ gây hại của đất mặn tuỳ thuộc
vào loài cây trồng, giống cây, thời gian sinh trưởng, các yếu tố môi trường đi kèm và
tính chất của đất. Do đó, người ta rất khó định nghĩa đất mặn một cách chính xác và
đầy đủ. Hội Khoa học Đất của Mỹ (SSSA) đã xác định đất mặn là đất có độ dẫn điện
(EC) lớn hơn 2 dS/m, không kể đến hai giá trị khác: tỉ lệ hấp thu sodium (SAR) và pH.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Tuy nhiên, hầu hết các định nghĩa khác đều chấp nhận đất mặn là đất có độ dẫn điện
EC cao hơn 4 dS/m ở điều kiện nhiệt độ là 250C, tỉ lệ phần trăm sodium trao đổi ESP
kém hơn 15, và pH nhỏ hơn 8,5 [6].
Đất mặn khá phổ biến ở vùng sa mạc và cận sa mạc. Muối tích tụ và mao dẫn
lên, chảy tràn trên mặt đất theo kiểu rửa trôi. Đất mặn có thể phát triển ở vùng nóng
ẩm, cận nóng ẩm trên thế giới trong điều kiện thích hợp như vùng ven biển; hoặc mặn
do nước biển xâm nhập khi triều cường, lũ lụt; hoặc mặn do nước thấm theo chiều
đứng hay chiều ngang từ thủy cấp bị nhiễm mặn [53].
Đất bị ảnh hưởng mặn chiếm 7% diện tích đất toàn thế giới (ước tính hơn 1 tỷ
ha). Đất bị ảnh hưởng mặn ở đại lục thuộc châu Âu và Bắc Mỹ rất ít có khả năng trồng
trọt. Ở châu Phi và Nam Mỹ, khoảng 30% đất bị nhiễm mặn có khả năng trồng trọt. Ở
châu Á, hơn 80% đất bị ảnh hưởng mặn có khả năng trồng trọt và đã được khai thác
cho sản xuất nông nghiệp. Hiện tượng đất nhiễm mặn là mối đe dọa lớn nhất đến việc
gia tăng sản lượng lúa gạo [24].
1.3 Các vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam
Ở Việt Nam, do tác động của biển, các vùng nhiễm mặn tập trung chủ yếu ở hai
vùng châu thổ lớn là đồng bằng sông Hồng (ĐBSH) và đồng bằng sông Cửu Long
(ĐBSCL). Ảnh hưởng của nước biển ở vùng cửa sông và đất liền ở ĐBSH chỉ khoảng
15 km, nhưng ở vùng ĐBSCL có thể xâm nhập tới 40-50 km. Nhóm đất mặn có diện
tích khoảng 1 triệu ha. Căn cứ vào nồng độ muối hoà tan với tỷ lệ clo trong đó, Hội
Khoa học Đất Việt Nam chia đất mặn ra theo bảng sau.
Bảng 1.3 Phân loại đất mặn
Độ mặn Tỷ lệ muốn hòa tan Nồng độ Cl (%)
Rất mặn > 0,25 > 1,0
Mặn nhiều 0,15 – 0,25 0,5 – 1,0
Mặn trung bình 0,05 – 0,15 0,25
Mặn ít < 0,05 < 0,25
1.3.1. Vùng lúa nhiễm mặn ở vùng đồng bằng sông Hồng
Ở đồng bằng sông Hồng trong mùa khô, sự xâm nhập mặn trở nên phổ biến đã
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
ảnh hưởng xấu đến sản xuất nông nghiệp, làm trở ngại cho nuôi trồng thủy hải sản.
Các con sông bị xâm nhập mặn hàng năm là rất lớn (bảng 1.4)
Các vùng lúa nhiễm mặn ở ĐBSH thuộc các tỉnh: Thái Bình, Hải Phòng, Nam
Định, Ninh Bình, Thanh Hóa. Một số vùng ven biển thuộc Hải Phòng bị nhiễm mặn
khoảng 20.000 ha ở cả hai dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâm nhiễm từ
0,3-0,5%, chủ yếu tập trung tạo các huyện: Kiến Thuỵ, Tiên Lãng, Thủy Nguyên, Vĩnh
Bảo. Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000 ha nhiễm mặn chủ yếu ở các huyện Thái Thụy,
Tiền Hải, Kiến Xương. Tỉnh Nam Định có khoảng 10.000 ha chủ yếu ở các huyện
Nghĩa Hưng, Xuân Trường, Giao Thủy. Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000 ha đất
nhiễm mặn ở các huyện Hậu Lộc, Nga Sơn, Hoằng Hóa, Hà Trung. riêng huyện Hậu
Lộc có 8.000 ha do nước biển tràn vào sau mùa lũ năm 2005 [3].
Bảng 1.4. Tình hình xâm nhập mặn một số con sông ở châu thổ sông Hồng
Tên sông 0,1 L max.(km)* 0,1 L min.(km) 0,4 L max.(km)
- Kinh Thầy - Lạch trà - Vân úc - Thái Bình - Trà Lý - Sông Hồng - Ninh Cơ - Sông Đáy 40 30 28 22 20 14 32 40 27 22 18 15 8 10 11 15 12 12 8 6 3 2 10 10
Nguồn: Chu Đinh Hoàng, 1993
* 0,1%; 0,4% = độ mặn; Lmax = chiều dài xâm nhập tối đa;
Lmin = Chiều dài xâm nhập tối thiểu
Dọc theo ven biển các tỉnh miền Trung đất cũng bị nhiễm mặn như Hà Tĩnh có
khoảng 17.919 ha, Quảng Bình có hơn 9.300 ha bị nhiễm mặn và Ninh Thuận có gần
2.300 ha đất bị nhiễm mặn.
1.3.2. Vùng lúa nhiễm mặn ở vùng đồng bằng sông Cửu Long
Diện tích tự nhiên khoảng 3,96 triệu ha, chiếm 12% diện tích cả nước, đồng
bằng sông Cửu Long giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Đây là
vùng đất có ưu thế lớn về nông nghiệp với diện tích đất sản xuất nông nghiệp khoảng
2,9 triệu ha (sản lượng lương thực chiếm 50% tổng sản lượng lương thực của cả nước)
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
[1]. Theo Trần Thanh Cảnh (1998), vùng ĐBSCL có các nhóm đất chính sau: (1) Đất
phù sa có diện tích khoảng 1.180.000 ha, chiếm 30,1% diện tích toàn vùng; (2) Đất
phèn mặn có diện tích khoảng 1.600.000 ha, ước tính 40,7% diện tích toàn vùng; (3)
Đất mặn có diện tích là 744.000 ha, chiếm 18,9%, có độ phì tự nhiên cao nhưng bị
nhiễm mặn nên việc tăng vụ, tăng năng suất trong sản xuất bị hạn chế; (4) Đất xám có
diện tích khoảng 134.656 ha, chiếm 3,4% bao gồm đất xám trên phù sa cổ, đất xám
đọng mùn gley trên phù sa cổ. Toàn bộ diện tích tự nhiên của 8 tỉnh ven biển đồng
bằng sông Cửu Long là 2,86 triệu ha, trong đó được phân bố ra 4 loại đất: phù sa cổ,
phù sa mới, đất mặt acid và đất mặn (hình 1.2)
Hình 1.2. Sự Phân bố tình trạng đất ở đồng bằng sông Cửu long
Do ảnh hưởng của thủy triều, nước mặn từ biển thường tràn vào sâu trong đất
liền vào mùa khô. Các vùng lúa ven biển ĐBSCL thuộc các tỉnh: Sóc Trăng, Bến Tre,
Tiền Giang, Trà Vinh, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang đều bị nhiễm mặn, nhiều hay ít
tùy thuộc vào ảnh hưởng của thủy triều và hệ thống kênh ngòi, đê ngăn mặn của từng
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
vùng. Độ mặn lớn nhất trong sông theo quy luật thường xuất hiện trùng với kỳ triều
cường trong tháng, nước biển mặn vào sâu trong đất liền ở các vùng triều mạnh và có
ít nước thượng nguồn đổ về. Do vậy, mức độ xâm nhập mặn tùy thuộc vào sự xâm
nhập của nước biển và tùy vào mùa trong năm. Cao điểm vào các tháng có lượng mưa
thấp, khoảng tháng 3-4 dương lịch [12].
Trước đây, diện tích bị xâm nhập mặn ở vùng ven biển ĐBSCL ở mức 1g/l là
2,1 triệu ha, mức 4 g/l là 1,7 triệu ha. Gần đây, diện tích này đã giảm và đang biến đổi
do sự phát triển hạ tầng thủy lợi. Qua chuỗi số liệu thực đo 10 năm (1991-2000) ở
ĐBSCL, Lê Sâm đã phân tích diễn biến nồng độ mặn, xác định đường đẳng trị mặn
ứng với các trị số: 0,4 g/l, 2 g/l, 4 g/l, 16 g/l theo thời gian từng tháng trong mùa khô,
tìm ra diễn biến mặn trung bình tháng 4 (tháng có nồng độ mặn cao nhất trong năm)
trong thời gian 10 năm diện tích bị xâm nhập mặn >0,4 g/l là 2.126.635 ha (bảng 1.5)
[6].
Bảng 1.5. Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL trung bình tháng 4 (1991-2000)
STT Khu vực Độ mặn (g/l) Diện tích (ha) Tỷ lệ (%)
1 Không ảnh hưởng mặn 1.773.365 45,5
2 Xâm nhập mặn 0,0-0,4 107.025 2,8
3 Xâm nhập mặn 0,4 – 2,0 232.816 6,0
4 Xâm nhập mặn 2,0 – 4,0 148.244 3,8
5 Xâm nhập mặn 4,0- 16,0 1.378.550 35,3
6 Xâm nhập mặn >16,0 260.000 6,6
Tổng cộng (làm tròn) 3.900.000 100
Nhìn chung ở Việt Nam, đất bị nhiễm mặn được xếp vào một trong những trở
ngại chính cho sản xuất nông nghiệp. Những năm gần đây, việc chuyển đổi cơ cấu sản
xuất ở các tỉnh ven biển từ trồng lúa sang nuôi tôm một cách tự phát trên diện rộng đã
làm cho tình hình xâm nhập mặn trở nên phức tạp, nhiều nơi nằm ngoài sự kiểm soát
và tiềm ẩn các hậu quả xấu về môi trường.
1.4. Tính chống chịu mặn của cây lúa
Đối với cây lúa, tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
theo các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây [28]. Tính trạng bất thụ của bông lúa
khi bị stress do mặn được điều khiển bởi một số gen trội, nhưng các gen này không
tiếp tục thể hiện ở các thế hệ sau. Phân tích diallel về tính trạng chống chịu mặn, người
ta ghi nhận cả hai hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính với hệ số di
truyền thấp (19,18%) và ảnh hưởng của môi trường rất lớn [54].
Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động
rất khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có
hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏ
ngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn
giống. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng
hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền
tính chống chịu mặn [25].
Hiện nay, chúng ta có rất ít thông tin về kiểu hình chống chịu mặn ở giai đoạn
trưởng thành của cây lúa. Hầu hết các thí nghiệm đều được tiến hành trên giai đoạn mạ
với quy mô quần thể hạn chế và chỉ số Na/K thường được dùng như một giá trị chỉ thị
[28,44]. Cây lúa nhiễm mặn có xu hướng hấp thu Na nhiều hơn cây chống chịu.
Ngược lại, cây chống chịu mặn hấp thu K nhiều hơn cây nhiễm. Ngưỡng chống chịu
NaCl của cây lúa là EC = 4 dS/m [44]. Trong quá trình bị nhiễm mặn, nồng độ ion K+
trong tế bào được điều tiết tương thích với cơ chế điều tiết áp suất thẩm thấu và khả
năng tăng trưởng tế bào. Nhiều loài thực vật thuộc nhóm halophyte và một phần của
nhóm glycophyte thực hiện hoạt động điều tiết áp suất thẩm thấu làm cản trở ảnh
hưởng gây hại của mặn. Hoạt động này sẽ giúp cây duy trì một lượng lớn K+ và hạn
chế hấp thu Na+ [45].
1.4.1. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa
Ảnh hưởng của mặn đến hoạt động sinh trưởng và phát triển của cây lúa, ở từng
giai đoạn khác nhau thì mức độ thiệt hại khác nhau [54]. Nhưng việc khám phá ra cơ
chế và những tổn hại trên cây lúa do mặn thì rất phức tạp, ngay cả dưới những điều
kiện ngoại cảnh kiểm soát được. Do đó, để nghiên cứu một cách đầy đủ về cơ chế
chống chịu mặn của cây lúa phải chia ra nhiều giai đoạn về sự sinh trưởng và phát
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
triển. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa được biết thông qua nhiều công trình nghiên
cứu [45].
Nhiễm mặn gây tổn hại đến cây lúa là do mất cân bằng thẩm thấu và tích lũy
quá nhiều ion Cl- [44]. Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng nguyên nhân
gây tổn hại cho cây lúa trong môi trường mặn là do tích lũy qúa nhiều ion Na+, ion này
trực tiếp gây độc trên cây.
Ion Na+ có tác động phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất trong cây.
Ion K+ có vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tính
chống chịu mặn của cây. Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na-K trong cây sẽ làm giảm
năng suất hạt. Do vậy, cây lúa chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu
Na+ và gia tăng hấp thu K+ để duy trì sự cân bằng Na-K trong chồi [53].
Theo Gregorio và cs, mặn gây hại trên cây lúa bắt đầu bằng triệu chứng giảm
diện tích lá, những lá già nhất bắt đầu cuộn tròn và chết, theo sau đó là những lá già kế
tiếp và cứ thế tiếp diễn. Cuối cùng, những cây sống sót có những lá già bị mất, những
lá non duy trì sự sống và xanh. Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lượng khô có xu
hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng do giảm diện tích lá.
Trong điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lượng khô của chồi và rễ suy giảm tương
ứng với mức độ thiệt hại [30].
Nhiều nghiên cứu còn cho thấy rằng, cây lúa chống chịu mặn trong suốt giai
đoạn nẩy mầm lại trở nên rất nhiễm trong giai đoạn mạ non (giai đoạn 2-3 lá), sau đó
chống chịu trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, rồi lại nhiễm trong suốt giai đoạn
thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng trở nên chống chịu hơn trong giai đoạn chín [50,56].
Theo một nghiên cứu khác của Aslam và cs (1993), thấy rằng tại giai đoạn trổ bông
cây lúa không mẫn cảm với mặn [16].
Theo Yeo và Flowers (1984) [66], những thay đổi sinh lý của cây lúa liên quan
đến tính chống chịu mặn được tóm tắt như sau:
- Cây lúa không hấp thu (hoặc hạn chế ở mức rất thấp) lượng muối dư thừa nhờ
hiện tượng hấp thu có chọn lọc.
- Cây lúa hấp thu lượng muối thừa nhưng tái hấp thu lại trong mô libe, do đó
Na+ không di chuyển đến chồi thân.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
- Sự vận chuyển của Na+ từ rễ đến chồi là rất thấp.
- Lượng muỗi hấp thu thừa sẽ được vận chuyển đến các lá già và được giữ lại
tại đó.
- Tăng tính chống chịu của cây lúa do lượng muối hấp thu dư thừa sẽ được giữ
lại tại các không bào, làm giảm mức gây hại đến quá trình sinh trưởng của cây lúa.
- Cây làm loãng nồng độ muối dư thừa nhờ tăng tốc độ sinh trưởng và gia tăng
hàm lượng nước trong chồi.
Tất cả những cơ chế trên đều nhằm hạ thấp nồng độ Na+ trong các mô chức
năng, do đó làm giảm tỉ lệ Na+/K+ trong chồi (<1).
Theo Yeo và Flowers, hầu hết tất cả các giống lúa đều bị ảnh hưởng rõ rệt ở
nồng độ 50 mol NaCl/m3 trong giai đoạn mạ (14 ngày), thời gian làm cho 50% số cá
thể chết tại nồng độ mặn này thay đổi từ 9 đến 60 ngày tùy theo giống lúa. Vì vậy, môi
trường có nồng độ 50 mol NaCl/m3 dung dịch được xem như một môi trường hữu
dụng để thanh lọc mặn cây lúa [66].
Ở cây lúa, hàm lượng muối đi vào chồi được điều chỉnh rất thấp. Điều này có
thể là do sự hấp thu chọn lọc rất hiệu quả đối với K+. Một khả năng khác là ion Na+
được hấp thu với hàm lượng lớn nhưng lại được hấp thu lại trong nhựa xylem trong
những phần của đầu rễ hoặc chồi và sau đó được dự trữ hoặc được chuyển trở lại đất
[66]. Theo Aslam và cs (1993), khi cây lúa được đặt trong dung dịch NaCl, hàm lượng
sodium, calcium, kẽm, phosphorus và chloride đều gia tăng, trong khi hàm lượng
potasium và magnesium đều giảm trong nhựa của chồi. Khả năng chống chịu mặn của
các giống lúa cao hay thấp có quan hệ với hiệu quả ngăn chặn Na+ và Cl- vào cây. So
sánh khả năng hấp thu lựa chọn K+ cho thấy rằng, đã có sự khác nhau lớn giữa các
giống lúa về khả năng hấp thu chọn lọc K+ trong môi trường.
Theo Zhu (2001), ion K+ tham gia làm tăng hoạt hóa một số enzyme ở tế bào
thực vật và tỷ lệ “Na+/K+” thấp hay đúng hơn là hàm lượng K+ trong dung dịch của
chồi lúa xác định tính chống chịu mặn của những dòng lúa khác nhau [47]. Người ta
còn thấy vai trò của kẽm (Zn) trong chồi có liên quan đến tính chống chịu mặn của cây
lúa khi hàm lượng Zn trong chồi của giống NIAB6 cao, tính chống chịu mặn cao.
Muhammad và cs (1987) cũng đã chứng minh rằng, ở giống chống chịu mặn KS282,
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
nồng độ của Zn cao hơn so với dòng nhiễm IR28. Vai trò của Zn khi tham gia vào tính
chống chịu mặn có thể là do nó làm gia tăng hàm lượng N trong chồi. [44]. Điều này
dẫn tới việc sinh trưởng nhanh hơn và năng suất lúa cao hơn trong điều kiện mặn. Như
vậy, có sự liên quan giữa tính chống chịu mặn của cây với sự ngăn chặn hiệu quả các
ion Na+, Cl- đồng thời, hấp thu ưu tiên và có chọn lựa các ion K+ và Zn2+ để có tỷ lệ
K+/Na+ và Zn/P phù hợp [16].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, các giống lúa chống chịu mặn sẽ duy trì
nồng độ Na+ và Cl- thấp, nồng độ của K+ và Zn2+ cao hơn và tỷ lệ Na+/K+ thấp trong
mầm lúa. Kết quả phân tích trên một số giống lúa chịu mặn như Pokkali, SR26B và
giống nhiễm mặn điển hình như IR28, IR29 cho thấy: tỷ lệ Na+/K+ trong giống pokkali
rất thấp (0,397) và giống SR26B (0,452) trong khi đó rất cao ở IR28 (0,652) và IR29
(0,835) [53].
Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn ở giai đoạn mạ, trong
dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn EC = 12 dS/m, các yếu tố môi trường được
kiểm soát trong 19 ngày. Kết quả cho thấy, sự tăng khả năng hấp thu K+ là duy trì tốt
tỷ lệ cân bằng Na+/K+ trong chồi. Tỷ lệ này được kiểm soát bởi hiệu quả gen cộng và
gen trội. Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối tương quan giữa số lượng muối được đi
vào rễ cây với nồng độ muối trên chồi. Sự tương quan này đã được xác định bởi mối
quan hệ giữa tốc độ sinh trưởng của chồi với sự di chuyển thực của những ion ngoài
rễ. Giá trị này là số lượng thực của những ion được di chuyển tới chồi trên đơn vị
trọng lượng của rễ trong một đơn vị thời gian.
Quan sát kiểu chết của lá lúa trong điều kiện nhiễm mặn cho chúng ta thấy
rằng, có sự khác nhau về hàm lượng Na+ trong những lá khác nhau, tại bất cứ thời gian
nào. Những lá già bị chết trong khi những lá non hơn vẫn giữ màu xanh và sinh
trưởng. Đây là đặc điểm đặc trưng nhất trong cơ chế chống chịu mặn ở họ hòa thảo.
Cây lúa là một tập hợp gồm lá cây, đốt, bộ rễ, những nhánh có khả năng sống độc lập
được tách ra. Dạng sinh trưởng này giúp cây một lá mầm tự hủy những phần, bộ phận
của cây dễ dàng hơn so với những cây hai lá mầm. Vì vậy, rụng lá là một hiện tượng
thông thường ở những cây một lá mầm có khả năng chống chịu mặn. Do đó, khi phân
tích trên những lá lúa sống trong môi trường mặn cho thấy rằng: có sự chênh lệch hàm
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
lượng muối từ lá này tới lá khác, muối luôn được tích lũy với nồng độ cao trong những
lá già và hiện tượng chết của những lá già là một cơ chế loại muối ra khỏi cơ thể. Tất
cả những cơ chế này đều nhằm hạ thấp nồng độ Na+ trong các mô chức năng, do đó
giảm tỷ lệ Na+/K+ trong chồi. Tỷ lệ Na+/K+ trong chồi được xem như là chỉ tiêu chọn
lọc giống lúa chống chịu mặn. Mỗi một giống lúa đều có một hoặc hai cơ chế chống
chịu mặn nêu trên. Phản ứng của cây trồng đối với môi trường mặn rất phức tạp, là
tổng hợp của nhiều yếu tố riêng lẻ [66].
1.4.2. Nghiên cứu di truyền về giống lúa chống chịu mặn
1.4.2.1. Nghiên cứu di truyền số lượng về tính chống chịu mặn của cây lúa
Rất nhiều nghiên cứu cho rằng: yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động
rất khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có
hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏ
ngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn
giống. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng
hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền
tính chống chịu mặn [25].
Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn giai đoạn mạ của cây lúa
trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao (EC = 12 dS/m) trong
môi trường kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh, người ta thấy rằng, tính trạng chiều
dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi, khối lượng khô của chồi và rễ thể hiện sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống chống chịu và giống nhiễm, tính trạng này
chủ yếu được điều khiển do hoạt động của một nhóm gen cộng tính. Hệ số di truyền
tính chống chịu thông qua các tính trạng này rất thấp [61].
Theo Mishra và cs (1990), trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa, tính trạng
chiều cao cây, năng suất, trong điều kiện mặn được điều khiển bởi nhóm gen cộng tính
[42].
Do ảnh hưởng rất lớn của môi trường bên ngoài, sự thể hiện di truyền là rất
thấp trong các tính trạng. Bằng phương pháp lai diallel đầy đủ Gregorio và Senadhira
(1993) cho rằng: có thể tìm ra một số cặp lai tốt phục vụ cho chương trình ưu thế lai.
Nghiên cứu về di truyền số lượng tính chống chịu mặn thông qua lai diallel 6 x 6, năng
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
suất thể hiện hoạt động của một nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong điều kiện
bình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn. Năng suất lúa bị
giảm là do ảnh hưởng của mặn. Trong một số giống lúa, ưu thế hoạt động của gen
cộng tính đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho chọn lọc giống cho môi trường
mặn [30].
Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra và cs (1996) cho rằng, chiều dài
bông và khối lượng hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi trường, nếu như chọn
giống chống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này sẽ không hiệu quả. Khối lượng bông,
số hạt chắc trên bông, chiều cao cây có hệ số path rất cao trong môi trường mặn.
Chính ba tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi
trường mặn [42]. Thêm nữa, theo nghiên cứu của Narayanan và cs. (1990), số hạt chắc
trên bông, chiều dài bông là tính trạng chính đóng góp vào năng suất của các giống lúa
trong những vùng đất bị nhiễm mặn [46].
1.4.2.2. Nghiên cứu di truyền phân tử về tính chống chịu mặn của cây lúa
Bản đồ QTL (Quantitative Trait loci) được áp dụng trong trường hợp những
tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (tính chống chịu mặn, hạn, lạnh, ...). Di
truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những loci riêng biệt gắn
với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết
của nó với những gen khác. Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng marker
phủ trên toàn bộ nhiễm sắc thể trong hệ gen cây trồng có thể cung cấp cho chúng ta
công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng phức tạp, định vị gen
trên những nhiễm sắc thể và xác định các gen mục tiêu liên kết với gen khác.
Teng (1994) đã sử dụng quần thể cận giao tái tổ hợp (RI) thế hệ F8 bao gồm
324 cá thể thuộc tổ hợp lai giữa IR29/Nona Broka để nghiên cứu di truyền tính chống
chịu mặn của cây lúa. Các dòng RI được thanh lọc mặn trong nhà lưới ở điều kiện EC
= 15 dS/m và điều kiện đồng ruộng. Phân tích RFLP với 5 enzyme phân cắt hạn chế
(DraI, EcoRV, HindIII, ScaI, XbaI) cho thấy trong 266 RFLP marker, có 117 RFLP
marker thể hiện đa hình (43,98%), phủ trên hệ gen cây lúa với mật độ 15 cM/quãng.
RG100 và RZ323 được ghi nhận cho đa hình rõ nhất. Có13 marker định vị gần RG100
và RZ323 trên nhiễm sắc thể số 3 cũng được sử dụng để xem xét liên kết gen. Phân
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
tích ANOVA một chiều chứng minh Nona Broka mang allele (allele) kháng liên kết
với RG100 và RZ323 tại các loci số lượng. Khi phân tích ANOVA hai chiều, tác giả
phát hiện thêm RZ323 (trên nhiễm sắc thể số 3) và RG333 (trên nhiễm sắc thể số 8)
liên kết với QTL chống chịu mặn. Các cá thể tái tổ hợp mang allele từ Nona Broka ở
locus RZ323 và từ IR29 ở locus RG333 có kiểu hình sống sót lâu hơn trong môi
trường mặn so với những tổ hợp khác [61].
Bản đồ QTL (trên cơ sở AFLP và STS marker) cho thấy gen chủ lực điều khiển
tính trạng chống chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể số 1 (saltol). Bên cạnh gen chủ
lực, 3 QTL được ghi nhận có quan hệ với tính trạng hấp thu K cao, 4 QTL có quan hệ
với tính trạng hấp thu Na thấp và 3 QTL có quan hệ với tính trạng tỷ số Na/K thấp.
Những QTL này định vị trên nhiễm sắc thể số 1, 3, 4, 10 và 12 [14, 23, 33].
Kawasaki và cs (2001) đã sử dụng kĩ thuật microarray để theo dõi sự thể hiện
của phân tử transcript và từng quá trình thể hiện gen điều khiển tính chống chịu mặn
trong cây lúa. Trên cơ sở thư viện cDNA ly trích từ rễ lúa và bộ marker EST của hệ
gen cây lúa chống chịu mặn pokkali, người ta đã áp dụng kỹ thuật microarray để kiểm
soát những transcript trong việc so sánh với nghiệm thức không xử lý mặn, thời gian
thay đổi từ 15 phút đến 1 tuần lễ trong điều kiện gây mặn nhân tạo. Vật liệu được sử
dụng là giống lúa pokkali (chuẩn kháng) và giống IR29 (chuẩn nhiễm). Nhóm tác giả
này tập trung xem xét phản ứng đối với stress do mặn trong quần thể lai có 1782
transcript dẫn suất từ rễ của cây bị xử lý mặn (NaCl ở nồng độ 150mM). Kết quả này
cho thấy một tiến trình điều tiết gen chức năng với nhiều mức đồ khác nhau của
transcript. Trong giai đoạn đầu tiên, đáp ứng của IR29 chậm hơn so với pokkali. Sau
3-6 giờ xử lý mặn, mức độ phong phú của transcript thay đổi nhanh trong Pokkali, còn
IR29 có sự suy giảm trong vòng 3 giờ đầu gây nên cái chết của giống này ngay sau đó
[22].
1.5. Chỉ thị phân tử SSR và ứng dụng trong nghiên cứu, xác định gen
chống chịu mặn.
1.5.1. Chỉ thị phân tử SSR
Simple sequence repeat (SSR) là một trong những chỉ thị phân tử quan trọng
nhất. SSR marker được sử dụng rộng rãi trong dấu chuẩn phân tử ADN, lập bản đồ,
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
MAS, và trong những nghiên cứu về đá dạng di truyền và di truyền quần thể. SSR hay
microsatelites (các vi vệ tinh) là trình tự ADN lặp tồn tại trong hệ gen sinh vật, có
chiều dài khác nhau, phân bố một cách ngẫu nhiên. Mỗi đơn vị lặp thường có số lượng
không vượt quá 5 nucleotit (có tài liệu nói đoạn lặp có thể có từ 1-6 nucleotit) [61]. Số
lần lặp lại của mỗi đơn vị có thể từ 10 đến 100 lần. Ở lúa người ta đã phát hiện ra các
kiểu trình tự lặp như: GA, GT, CAT, CTT.
Các đoạn ADN nhắc lại có trình tự hai đầu rất đặc trưng. Bởi vậy trình tự đặc
trưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại được sử dụng để thiết kế mồi cho phản ứng PCR. Do
có sự khác nhau về chiều dài giữa các đoạn nhắc lại mà kỹ thuật này rất phù hợp trong
nghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen. Cũng giống như kỹ thuật RADP, kỹ
thuật SSR đơn giản, thuận tiện, không tốn kém. Mặt khác, SSR là chỉ thị đồng trội nên
nó được sử dụng để phát hiện các cá thể dị hợp tử, và lập bản đồ gen khi sử dụng quần
thể F2 [5].
1.5.2. Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn
Trên thực tế, việc chọn giống chống chịu stress mặn dựa trên kiểu hình rất khó
do có sự tương tác giữa các gen. Nhờ chỉ thị phân tử mà công việc xác định gen chống
chịu mặn, chọn, tạo giống chống chịu trở lên dễ dàng, chủ động và chính xác hơn.
Xác định gen kháng bằng chỉ thị phân tử nghĩa là sử dụng các chỉ thị phân tử
liên kết chặt với các gen kháng và các QTLs để chọn được các cá thể mang gen kháng
trong quần thể phân li. Độ chính xác của phương pháp này có thể lớn hơn 99,75% khi
gen kháng kẹp giữa hai chỉ thị liên kết với gen kháng đó và khoảng cách di truyền từ
chỉ thị phân tử đến gen kháng nhỏ hơn 5cM. Bằng cách chọn lọc này, các tổ hợp gen
kháng khác nhau được chọn lọc là dựa trên kiểu gen thay vì dựa trên kiểu hình [68].
Về cơ bản các loại chỉ thị trên đều có thể được ứng dụng để lập bản đồ di truyền
hoặc nghiên cứu sự đa dạng di truyền hoặc phân lập gen, hoặc xác định gen,…. Tuy
nhiên, mỗi loại chỉ thị có ưu nhược điểm riêng vì thế tuỳ vào mục đích, yêu cầu và
điều kiện cụ thể của mỗi nghiên cứu mà lựa chọn sử dụng chỉ thị nào cho thích hợp.
Trong số các chỉ thị phân tử, thì SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện,
nhanh, chính xác, độ đa hình cao và kinh tế.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Sự phát triển của marker phân tử và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần
đây đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu
mặn của cây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Các nghiên cứu của
Gregorio (1997) và Niones (2004) đã lập được bản đồ gen rất chi tiết cho QTL
“Saltol” hiện diện trên nhiễm sắc thể số 1, quyết định tới khoảng 40-65% tính chống
chịu mặn của lúa [26, 47].
Mohammadi và cs (2008) [43] thí nghiệm 33 SSR marker đa hình trên đoạn
Saltol của nhiễm sắc thể số 1 nhằm xác định mức độ liên kết và hữu dụng của các
marker này trong chọn giống chống chịu mặn. Các SSR marker này được dùng để thử
nghiệm trên 36 giống lúa được phân loại thành 5 nhóm: rất chống chịu, chống chịu,
chịu mặn trung bình, nhiễm mặn và rất nhiễm mặn qua thanh lọc mặn nhân tạo. Trong
số 33 marker, 6 marker: RM10745, RM1287, RM8094, RM3412, RM493 và RM140
liên kết chặt với đoạn Saltol ở vị trí 10.8-12.28 Mb. Đoạn Saltol được có thể nằm
trong vị trí có chứa các marker RM8094, RM3412, RM493. Các giống lúa: IR70023,
IR65858, IR69588, IR74105, IR71832, IR74099, Cherivirrupo và IR66946-3R-178-1-
1 (FL478) có sản phẩm PCR giống như sản phẩm PCR của Pokkali khi được nhân bản
bởi marker RM 8094 và cho tính chống chịu rất tốt hoặc tốt đối với mặn. Do đó,
marker RM8094 thể hiện liên kết thuận và chặt chẽ với tính kháng mặn ở giai đoạn
mạ. Mohammadi và cs (2008) càng khuyến cáo việc sử dụng hai marker RM8094 và
RM10745 trong xác định kiểu gen của cây lúa chống chịu mặn có mang đoạn QTL
Saltol trong các chương trình lai tạo giống lúa chịu mặn [43].
Hình 1.3. Đoạn gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 của lúa, vị trí xác định
của các SSR marker [46]
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Lang và cs (2001) đã sử dụng 74 chỉ thị RFLP kết hợp với 91 cặp mồi SSR trên
quần thể RIL F8 của tổ hợp lai Tenasai 2 / CB và đã lập được bản đồ QTL của một số
tính trạng mục tiêu liên quan đến hiện tượng chống chịu mặn ở cây lúa (Hình 1.4) [3].
Bùi Chí Bửu và cs (2000) đã sử dụng 30 SSR marker để lập bản đồ gen cho tính
chống chịu mặn của quần thể F3 gồm 257 cá thể phân ly, phát triển từ tổ hợp lai
IR28/Đốc Phụng. Các tác giả đã xác định 10 SSR marker cho đa hình của các sản
phẩm PCR giữa các cá thể phân ly và bố mẹ. Tuy nhiên chỉ có marker RM223 liên kết
với gen chống chịu mặn với khoảng cách là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8. RM223
nhân bản đoạn ADN có kích thước 120 bp, liên kết với gen chống chịu mặn, từ giống
Đốc Phụng và sản phẩm PCR có kích thước 160 bp từ giống nhiễm IR28 [3]. Nguyễn
Thị Lang và cs (2001) báo cáo marker OSR1 và RM315 liên kết với QTL cho tính
chống chịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể số 1 [3].
1.6. Chọn tạo giống lúa chịu mặn
1.6.1. Chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới
Các quốc gia trên thế giới, đã và đang tiến hành chọn tạo và canh tác có hiệu
quả một số giống lúa chịu mặn. Nhiều nguồn giống lúa mùa địa phương như Nona
Broka, Burarata chống chịu tốt với điều kiện mặn tương đương với giống Pokkali đã
được xác định.
Những năm cuối thế kỷ 20, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng những biến đổi
di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng năng suất cao, chất lượng gạo tốt,
kháng một số sâu bệnh chính và chống chịu với những điều kiện bất lợi như khô hạn,
ngập úng, mặn. Trong chiến lược chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, Viện nghiên cứu
lúa quốc tế (IRRI), từ năm 1977-1980 đã tiến hành chọn được những dòng lúa chống
chịu mặn tốt như IR42, IR4432-28-5, IR4595-4-1, IR463-22-2, IR9884-54-3. Năng
suất đạt 3,6 tấn/ha trung bình cho tất cả 25 thí nghiệm. Những giống lúa cải tiến này
cho năng suất cao hơn những lúa cổ truyền 2 tấn/ha [53].
Gregorio và cs (2002) đã báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào soma lúa để tạo ra các
biến dị soma chống chịu mặn. Từ giống lúa Pokkali (lúa mùa cao cây, cảm quang, yếu
rạ, lá dài to bản và rũ, đẻ chồi ít, gạo màu đỏ, phẩm chất gạo xấu), tác giả đã thu được
dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 là giống lúa cao sản, thấp cây, sinh trưởng
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
mạnh, chống chịu mặn cao như Pokkali, gạo có màu trắng và phẩm chất gạo tốt hơn
giống gốc, cho năng suất cao hơn nhiều so với Pokkali. Giống lúaTCCP226-2-49-B-B-
3 đã được sử dụng trong các chương trình tạo giống lúa chịu mặn tại nhiều trung tâm
nghiên cứu lúa trên thế giới [27].
Năm 1993, IRRI phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chống chịu mặn
khá tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29. Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai chuyển
gen chống chịu mặn từ Pokkali và một số giống lúa mùa địa phương có tính chống
chịu mặn bằng phương pháp hồi giao vào các nguồn giống lúa cao sản thích nghi với
từng vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt [30]. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp
lai tạo truyền thống là mất nhiều thời gian. Thông thường thì 6-8 lần hồi giao cần
được thực hiện, tương đương với 3-4 năm lai tạo. Một khó khăn khác thường gặp
trong lai tạo giống mới là đôi khi có mối liên kết khá chặt chẽ giữa tính trạng chống
chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn, thường được lai chuyển vào con
lai cùng lúc. Các gen điều khiển tính trạng không mong muốn này ảnh hưởng xấu đến
biểu hiện của con lai. Do đó, lai tạo cho tính trạng chống chịu mặn trong vài trường
hợp mất đến 10 hoặc 15 năm để phát triển một giống lúa mới [22].
Ngoài ra, việc lai tạo giống lúa chống chịu mặn còn gặp khó khăn do bản chất
đa gen của tính trạng chống chịu mặn. Biểu hiện tính chống chịu mặn của một giống
lúa bị ảnh hưởng rất lớn của điều kiện ngoại cảnh. Theo Islam (2004) thì hệ số di
truyền của tính chống chịu mặn thấp (<19,18%), nên tính chống chịu mặn của các
dòng con lai thường không cao như bố me có gen sẵn có [31].
Để khắc phục một phần nhược điểm của phương pháp lai tạo truyền thống,
người ta kết hợp với các phương pháp sinh học phân tử.
Xu và cs (1996) đã chuyển gen hvaI của lúa mạch vào giống lúa Nipponbare.
Cây lúa chuyển gen và không chuyển gen sau 3 tuần tuổi được xử lý mặn 2 vòng: lần
đầu với 200 mM NaCl trong 10 ngày, tiếp theo là không xử lý mặn 10 ngày; lần hai xử
lý mặn 30 ngày với 50 mMNaCl. Tác giả ghi nhận là cây lúa chuyển gen có tốc độ
sinh trưởng và phục hồi tốt hơn cây lúa không chuyển gen khi bị xử lý mặn và không
xử lý mặn [65].
Jang và cs (2003) đã chuyển gen trehalose 6-phosphate synthase và trehalose
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
6-phosphate phosphatase dưới sự kiểm soát của promoter ubiquitine của bắp, đã làm
gia tăng sự tích luỹ của treholose trong cây lúa chuyển nạp gen và làm tăng tính chống
chịu mặn, hạn, lạnh [54].
Ohta và cs (2002) cũng đã chuyển gen Na+/H+ antipoter vào giống lúa mẫn
cảm với mặn Kinhuikari. Cây lúa chuyển nạp gen sống sót sau khi thanh lọc mặn ở
mức 300 mM NaCl trong 3 ngày, các cây lúa không được chuyển gen đều chết [49].
Nagamiya và cs (2007) lại chuyển nạp gen kat E, một catalase gen, vào giống
lúa japonica. Các cây lúa được chuyển gen sống và phát triển hơn 14 ngày trong môi
trường mặn có hàm lượng muối 250 mM, trổ bông và cho hạt ở nồng độ muối 100
mM. Khi đánh giá mức độ biểu hiện của gen catalase trong cây lúa được chuyển gen,
hoạt động của enzyme Catalase tăng lên khoảng 1,5-2,5 lần so với cây lúa không được
chuyển gen [47].
1.6.2. Chọn tạo giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam
Từ năm 1992-1995 Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam đã tiến hành thanh
lọc mặn cho 88 giống lúa địa phương và 100 giống lúa nước của IRRI với giống
Pokkali làm đối chứng chống chịu mặn. Kết quả chọn được 14 giống triển vọng, trong
đó có 2 giống từ bộ giống của IRRI là: FRG67, ROHYD15 và 12 giống lúa từ tập đoàn
giống của cổ truyền là: lúa Tiêu, Ba Lê, Đốc Đỏ, Nàng Thước Dài, Chân Hương, Tam
sắc, Nàng Quốc Nhuyễn, Nưng Hương 2, Nàng Hương 3, Nàng Co đỏ, Bảy Dảnh, Một
Bụi trong đó đặc biệt chú ý đến giống FRG67, có nguồn gốc từ Pakistan, cho năng
suất cao, chống chịu mặn tốt, phẩm chất gạo tốt [12].
Nguyễn Thị Lang và cs, 2002 đánh giá tính chống chịu mặn của 62 giống lúa cổ
truyền, với Pokkali là giống chuẩn kháng và giống IR29 là giống chuẩn nhiễm đã thu
được các giống chống chịu mặn là: Nếp áo Già, Trắng Điệp, Móng Chim, Móng Chim
Rơi và Nếp Bờ Giếng [7].
Đặng Minh Tâm và Nguyễn Thị Lang (2003) đã nuôi cấy mô 10 giống, bao
gồm lúa mùa địa phương và cao sản chống chịu mặn khá (cấp 3-5). Kết quả cho thấy :
trong môi trường có chứa NaCl ở mức 1,0 và 1,5% cho tỷ lệ tái sinh cao [10].
Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một
số giống lúa địa phương vùng đồng bằng ven biển Bắc Bộ. Kết quả gây đột biến nguồn
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Coban (Co60) đã cho ra những biến dị có lợi cho chọn giống. Các giống lúa CM1,
CM5, ... là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được những đặc tính chống chịu
mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao [2].
Ngô Đình Thức (2006) cũng đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và nuôi cấy túi
phấn trong chọn tạo giống lúa chịu mặn đạt được kết quả khả quan. Tác giả tạo được 8
dòng biến dị soma từ OM576, IR64, Basmati và VD20 có khả năng chống chịu mặn ở
cấp 5 khi thanh lọc ở giai đoạn mạ với EC = 12 dS/m [13].
Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2009 đến nay đã bước đầu tìm 30
dòng lúa có triển vọng chịu mặn là những dòng lúa kế thừa, được phát hiện chịu mặn
qua nhiều lần thanh lọc trong phòng thí nghiệm và nhà lưới. Một số giống lúa mới của
Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long xác định có khả năng kháng mặn khá cao như:
OM6976, OM6677, OM5464, OM5629, OM5166, OM 5451, OM 4059 và OM 6164
đã và đang được khảo nghiệm ở một số tỉnh như Sóc Trăng, Kiên Giang, Bến Tre, Bạc
Liêu. Kết quả khảo nghiệm ban đầu ghi nhận khá khả quan, trong đó giống lúa
OM5464 đang được đề nghị nhân rộng và trình Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận
là giống lúa sản xuất thử trong năm 2010. Hai giống OM6976 và OM5166 đang được
tiếp tục khảo nghiệm, xác định biện pháp kỹ thuật thích hợp để tăng tính chịu mặn và
năng suất của giống. Hai giống lúa mới này dự kiến xin công nhận trong năm 2011.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu nghiên cứu là tập đoàn 38 giống có đặc tính chịu mặn được thu thập ở
nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ và bảo tồn tại ngân
hàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật) và ngân hàng gen của
Viện Lúa đồng bằng sông Cửa Long (bảng 2.1).
Bảng 2.1: Danh sách tập đoàn 38 giống lúa nghiên cứu
TT Kí hiệu Tên giống Thu mẫu Nguồn gốc
M1 Chiêm đá 1 Quảng Ninh Hạt
M2 Lúa mặn 2 Quảng Nam Đà Nẵng Hạt
M3 Nếp mặn 3 Quảng Nam Đà Nẵng Hạt
M4 Nước mặn 4 Quảng Nam Đà Nẵng Hạt
M5 Háu trắng 5 Thừa Thiên Huế Hạt
M6 Lúa đỏ 6 Quảng Bình Hạt
M7 Lúa ven 7 Quảng Bình Hạt
M8 Tẻ chăm 8 Quảng Bình Hạt
M9 Quảng trắng 9 Quảng Trị Hạt
10 M10 Nếp trứng Quảng Trị Hạt
11 M11 Chiêm đỏ Quảng Trị Hạt
12 M12 Chiêm mặn Quảng Trị Hạt
13 M13 Lúa nước mặn Quảng Ngãi Hạt
14 M14 Nếp Quảng Ngãi Bình Định Hạt
15 M15 Lúa ngoi Hạt Quảng Ninh
16 M16 Lúa bông dừa Hạt Trà Vinh
17 M17 Lùm cần Hạt
18 M18 Trắng chùm Trà Vinh TP Hồ Chí Minh Hạt
19 M19 OM 9915 Vĩnh Long Hạt
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Bảng 2.1: Danh sách tập đoàn 38 giống lúa nghiên cứu
(tiếp theo)
TT Kí hiệu Tên giống Thu mẫu Nguồn gốc
OM 9921 20 Hạt Vĩnh Long
M20 hiệu M21 Nàng quất điểm 21 Hạt Tiền Giang
M22 Nàng neo 22 Hạt
M23 Ngoi tía 23 Hạt Long An Nam Định
M24 Nếp cúc 24 Hạt Ninh Bình
M25 OM 5981 25 Hạt Vĩnh Long
M26 Tép Hành 26 Hạt Vĩnh Long
M27 Lúa sỏi 27 Hạt Trà Vinh
M28 Nàng Co Đỏ 2 28 Hạt Bạc Liêu
M29 Ba túc 29 Hạt Trà Vinh
M30 30 Hạt Bạc Liêu
M31 Mô ̣t Bu ̣i Đỏ Thần Nông Đuôi 31 Hạt Bạc Liêu
M32 Một bụi vàng 32 Hạt Bạc Liêu
M33 Móng chim rơi 33 Hạt Bạc Liêu
M34 Ba bụi sớm 34 Hạt Bạc Liêu
M35 Đốc phụng 2 35 Hạt Bạc Liêu
M36 OM 5464 36 Hạt Vĩnh Long
M37 OM5166 37 Hạt Vĩnh Long
M38 OM 4059 Hạt Vĩnh Long
38
2.1.2. Hoá chất
Hoá chất tách chiết ADN
- Đệm tách chiết ADN tổng số (đệm CTAB):
CTAB 1%
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Tris-HCl 0,1M
EDTA 0,5M, pH 8,0
NaCl 5M
-mercapthoethanol 14M
- TBE 5x (Tris-borat buffer):
Tris base
Boric acid
EDTA 0,5M, pH 8,0
Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR:
- Đệm PCR 1x (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2 , 5 mM KCl)
hoặc đệm PCR 1x của Quiagen, Invitrogen.
- MgCl2 của Fermentas, Invitrogen.
- dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP) của Fermentas, Invitrogen.
- Mồi, Marker 1 kb, Marker GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low của
hãng Fermentas, Invitrogen.
- Taq polymerase của Fermentas, Invitrogen
Hoá chất chạy điện di:
Các mồi SSR:
30 cặp mồi SSR được được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM được
chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về
trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở
trên 12 NST khác nhau đã được McCouch (2002) và cộng sự công bố (bảng 2.1)
[40].
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Bảng 2.2: Thông tin về các cặp mồi nghiên cứu
TT Tên mồi Trình tự mồi NST Kích thước sản phẩm (bp)
1 RM302 1 120-191 3’-TCATGTCATCTACCATCACAC-5’ 5’-ATGGAGAAGATGGAATACTTGC-3’
2 RM323 1 241-244 3’-CAACGAGCAAATCAGGTCAG-5’ 5’-GTTTTGATCCTAAGGCTGCTG-3’
3 RM341 2 126-186 3’-CAAGAAACCTCAATCCGAGC-5’ 5’-CTCCTCCCGATCCCAATC-3’
4 RM318 2 134-154 3’-GTACGGAAAACATGGTAGGAAG-5’ 5’-TCGAGGGAAGGATCTGGTC-3’
5 RM138 2 104-155 3’-AGCGCAACAACCAATCCATCCG-5’ 5’-AAGAAGCTGCCTTTGACGCTATGG
6 RM174 2 207-222 3’-AGCGACGCCAAGACAAGTCGGG-5’ 5’-TCCACGTCGATCGACACGACGG-3’
7 RM156 3 150-160 3’-GCCGCACCCTCACTCCCTCCTC-5’ 5’-TCTTGCCGGAGCGCTTGAGGTG-3’
8 RM143 3 195-207 3’-GTCCCGAACCCTAGCCCGAGGG-5’ 5’-AGAGGCCCTCCACATGGCGACC-3’
9 RM135 3 119-131 3’-CTCTGTCTCCTCCCCCGCGTCG-5’ 5’-TCAGCTTCTGGCCGGCCTCCTC-3’
10 RM142 4 235-238 3’-CTCGCTATCGCCATCGCCATCG-5’ 5’-TCGAGCCATCGCTGGATGGAGG-3’
11 RM13 5 124-154 3’-TCCAACATGGCAAGAGAGAG-5’ 5’-GGTGGCATTCGATTCCAG-3’
12 RM153 5 196-234 3’-GCCTCGAGCATCATCATCAG-5’ 5’-ATCAACCTGCACTTGCCTGG-3’
13 RM161 5 165-189 3’-TGCAGATGAGAAGCGGCGCCTC-5’ 5’-TGTGTCATCAGACGGCGCTCCG-3’
14 RM30 6 171-183 3’-GGTTAGGCATCGTCACGG-5’ 5’-TCACCTCACCACACGACACG-3’
15 RM345 6 152-167 3’-ATTGGTAGCTCAATGCAAGC-5’ 5’-GTGCAACAACCCCACATG-3’
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Bảng 2.2: Thông tin về các cặp mồi nghiên cứu (tiếp theo)
TT Trình tự mồi NST Tên mồi Kích thước sản phẩm (bp)
16 RM340 6 118-191 3’-GGTAAATGGACAATCCTATGGC-5’ 5’-GACAAATATAAGGGCAGTGTGC-3’
17 RM172 7 159-165 3’-TGCAGCTGCGCCACAGCCATAG-5’ 5’-CAACCACGACACCGCCGTGTTG-3’
18 RM264 8 148-178 3’-GTTGCGTCCTACTGCTACTTC-5’ 5’-GATCCGTGTCGATGATTAGC-3’
19 RM284 8 141-149 3’-ATCTCTGATACTCCATCCATCC-5’ 5’-CCTGTACGTTGATCCGAAGC-3’
20 RM337 8 154-194 3’-GTAGGAAAGGAAGGGCAGAG-5’ 5’-CGATAGATAGCTAGATGTGGCC-3’
21 RM245 9 136-146 3’-ATGCCGCCAGTGAATAGC-5’ 5’-CTGAGAATCCAATTATCTGGGG-3’
22 RM257 9 120-170 3’-CAGTTCCGAGCAAGAGTACTC-5’ 5’-GGATCGGACGTGGCATATG-3’
23 RM171 10 310-356 3’-AACGCGAGGACACGTACTTAC-5’ 5’-ACGAGATACGTACGCCTTTG-3’
24 RM239 10 100-150 3’-TACAAAATGCTGGGTACCCC-5’ 5’-ACATATGGGACCCACCTGTC-3’
25 RM224 11 120-152 3’-ATCGATCGATCTTCACGAGG-5’ 5’-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3’
26 RM286 11 99-128 3’-GGCTTCATCTTTGGCGAC-5’ 5’-CCGGATTCACGAGATAAACTC-3’
27 RM17 12 160-171 3’-TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC-5’ 5’-GGTGATCCTTTCCCATTTCA-3’
28 RM270 12 104-117 3’-GGCCGTTGGTTCTAAAATC-5’ 5’-TGCGCAGTATCATCGGCGAG-3’
29 RM277 12 117-126 3’-CGGTCAAATCATCACCTGAC-5’ 5’-CAAGGCTTGCAAGGGAAG-3’
30 RM309 12 158-180 3’-GTAGATCACGCACCTTTCTGG-5’ 5’-AGAAGGCCTCCGGTGAAG-3’
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch
2.2.1.1 Tách chiết ADN tổng số
ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp CTAB của Obara và Kako
(1998) [48]. Quy trình tách chiết như sau:
1. Nghiền 1,5 – 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ.
2. Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml đệm chiết CTAB (đã
được làm nóng đến 650C).
3. Đảo đều và ủ mẫu ở 650C trong thời gian 60 phút, 10 phút đảo đều một lần.
4. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Bổ sung 4 ml Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1),
đảo đều trong 10 phút.
5. Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
6. Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống falcon sang một ống mới (4ml). Bổ sung
một thể tích tương đương (4ml) Isopropanol, đảo đều, giữ ở nhiệt độ - 200C trong 30
phút.
7. Tủa DNA bởi máy ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa tủa 2 - 3
lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%.
8. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml đệm TE và 15 µl RNase A (10 mg/ml).
Ủ ở 37oC trong 3h.
9. Chuyển dung dịch DNA vào một ống mới. Thêm 2 ml phenol- chloroform-isoamyl
alcohol (25:24:1), đảo đều trong 5 - 10 phút và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.
10. Chuyển phần dịch phía trên vào ống mới. Thêm 750 µl NaCl 5M và 3ml Ete bão
hòa hơi nước. Trộn đều và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.
11. Loại bỏ lớp Ete bên trên. Cẩn thận chuyển phần bên dưới vào ống mới
12. Thêm 3 ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở -20°C trong 30 phút. Lấy DNA ra
bằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh.
13. Rửa tủa 3 lần với 1.5 ml ethanol 70%.
14. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 800 µl đệm TE để hòa tan tủa.
15. Giữ dung dịch DNA ở - 20°C.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
2.2.1.2. Đo độ tinh sạch của ADN
Độ tinh sạch và nồng độ của ADN được kiểm tra bằng phương pháp điện di
trên agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5x (108g Tris base (MW = 121,10);
27,5g Axít boric (MW = 61,83); 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) và dùng marker ADN
chuẩn có nồng độ (50 ng/µl) để so sánh. Sau khi chạy điện di, tiến hành nhuộm bản gel
bằng ethidium bromide. Việc chụp ảnh mẫu và đo nồng độ được thực hiện bằng máy
Molecular imager FX.
2.2.2. Thành phần phản ứng PCR với mồi SSR
Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Mastercycler - Personal. Mỗi phản ứng
PCR bao gồm các thành phần được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3: Thành phần của một phản ứng PCR
Thành phần Nước cất hai lần khử ion Đệm PCR 10X
STT 1 2 3 MgCl2 25mM dNTPs 10mM 4 5 Taq DNA polymerase 5U/µl 6 Mồi xuôi 10µM 7 Mồi ngược 10µM 8 DNA
Thể tích (µl) 6.2 1.5 1.2 0.3 0.3 1.5 1.5 2.5 15.0
Tổng thể tích của một phản ứng
2.2.3. Chương trình chạy PCR
Chu trình nhiệt PCR như sau:
Bảng 2.4: Các bước phản ứng PCR
Số chu kỳ 1
Các bước Nhiệt độ (oC) Thời gian 94 94 5’ 1’ I II
33 - 35
45’ 1’ 7’ 30’ 55-58 72 72 4 1 1 IV V
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
2.2.4. Nhuộm gel và ghi nhận kết quả
Sản phẩm thu được từ phản ứng PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6-
8%, trong môi trường đệm TBE 1x, Marker GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low.
Việc kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR được tiến hành như sau:
- Chuẩn bị gel polyacrylamide:
Bảng 2.5: Thành phần gel polyacrylamide (bản gel có kích thước 20cm x 30cm)
Dung dịch acrylamide 6% APS 10% TEMED Nước đề ion
14ml 70ml 800l 52l
- Điện di sản phẩm:
Khi gel đông lại (sau khoảng 30-60 phút), rút lược ra, vệ sinh bản gel bằng TAE
1x, cho khay chứa gel vào máy điện di có sẵn dung dịch đệm TBE 1x. Lấy 3µl mẫu
(chứa sản phẩm của quá trình PCR), trộn đều với 3µl dung dịch loading dye 1,5x và tra
vào các giếng. Sau đó, đặt máy điện di ở chế độ 200V trong thời gian 2-2,5 giờ. Để đo
kích thước băng chúng tôi sử dụng Marker GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low làm
chuẩn.
- Nhuộm gel và ghi nhận kết quả:
Sau khi điện di, tiến hành nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide
(0,5 ng/ml) trong 30 phút. Soi và chụp ảnh băng sản phẩm điện di trên máy soi UV của
hãng UVP.
2.2.5. Phân tích và xử lí số liệu
Kết quả được thống kê dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng
ADN (các allele). Số liệu được xử lý, phân tích bằng chương trình Exel version 5.0 và
phần mềm NTSYSpc 2.1.
2
Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau:
PIC =1 - Pi
(trong đó Pi là tần số xuất hiện của allele thứ i).
Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi mẫu được tính theo công thức:
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Trong đó: X: là tổng số mồi có xuất hiện 2 allele/1 locus SSR.
M: là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Y: là tổng số mồi SSR có xuất hiện băng ADN.
Tỷ lệ khuyết số liệu (M) được tính bằng công thức:
Trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng DNA.
M là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
TT Tên giống Tên giống TT Ký hiệu H (%)
1 M1 Chiêm đá Ký M (%) hiệu 3,33 3,45 21 M21 Nàng quất điểm M (%) 0,00 H (%) 0,00
2 M 2 Lúa mặn 0,00 0,00 22 M22 Nàng neo 0,00 3,33
3 M 3 Nếp mặn 0,00 0,00 23 M23 Ngoi tía 0,00 0,00
4 M 4 Nước mặn 0,00 0,00 24 M24 Nếp cúc 0,00 0,00
5 M 5 Háu trắng 3,33 0,00 25 M25 OM 5981 0,00 3,33
6 M 6 Lúa đỏ 0,00 3,33 26 M26 Tép hành 0,00 0,00
7 M 7 Lúa ven 0,00 3,33 27 M27 Lúa sỏi 3,33 0,00
8 M 8 Tẻ chăm 0,00 0,00 28 M28 Nàng co đỏ 2 0,00 0,00
9 M 9 Quảng trắng 0,00 0,00 29 M29 Ba túc 3,33 0,00
10 M10 Nếp trứng 0,00 0,00 6,67 0,00 30 M30 Mô ̣t bu ̣i đỏ
11 M11 Chiêm đỏ 0,00 3,33 31 M31 Thần nông đuôi 3,33 0,00
12 M12 Chiêm mặn 3,33 6,90 32 M32 Một bụi vàng 0,00 0,00
13 M13 Lúa nước mặn 0,00 6,67 33 M33 Móng chim rơi 0,00 0,00
14 M14 Nếp Quảng Ngãi 0,00 3,33 34 M34 Ba bụi sớm 0,00 0,00
15 M15 Lúa ngoi 0,00 0,00 35 M35 Đốc phụng 2 0,00 0,00
16 M16 Lúa bông dừa 3,33 3,45 36 M36 OM 5464 0,00 3,33
17 M17 Lùm cần 0,00 3,33 37 M37 OM5166 3,33 0,00
18 M18 Trắng chùm 0,00 10,0 38 M38 OM 4059 3,33 0,00
19 M19 OM 9915 0,00 0,00 Tổng 39,97 57,11
20 M20 OM 9921 3,33 0,00 Trung bình 1,05 1,50
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
M1 | 1.00 M2 | 0.42 1.00 M3 | 0.24 0.41 1.00 M4 | 0.42 0.32 0.18 1.00 M5 | 0.25 0.33 0.40 0.33 1.00 M6 | 0.33 0.32 0.23 0.53 0.47 1.00 M7 | 0.27 0.21 0.24 0.50 0.34 0.58 1.00 M8 | 0.17 0.24 0.27 0.24 0.28 0.21 0.33 1.00 M9 | 0.30 0.32 0.23 0.32 0.33 0.32 0.21 0.24 1.00 M10 | 0.20 0.15 0.17 0.20 0.28 0.22 0.17 0.13 0.20 1.00 M11 | 0.19 0.19 0.19 0.21 0.20 0.24 0.33 0.33 0.27 0.10 1.00 M12 | 0.21 0.16 0.11 0.26 0.19 0.31 0.29 0.18 0.26 0.27 0.38 1.00 M13 | 0.16 0.16 0.09 0.23 0.16 0.26 0.26 0.16 0.20 0.22 0.41 0.71 1.00 M14 | 0.12 0.09 0.09 0.12 0.19 0.12 0.16 0.08 0.09 0.31 0.16 0.20 0.20 1.00 M15 | 0.12 0.12 0.07 0.21 0.17 0.14 0.14 0.14 0.21 0.34 0.14 0.18 0.13 0.32 1.00 M16 | 0.12 0.27 0.19 0.12 0.15 0.16 0.17 0.24 0.21 0.23 0.27 0.29 0.35 0.10 0.14 M17 | 0.09 0.20 0.18 0.09 0.16 0.16 0.16 0.18 0.26 0.22 0.26 0.25 0.30 0.09 0.18 M18 | 0.09 0.20 0.15 0.07 0.16 0.15 0.20 0.20 0.18 0.21 0.26 0.24 0.27 0.13 0.11 M19 | 0.10 0.16 0.16 0.10 0.15 0.12 0.22 0.19 0.16 0.20 0.24 0.18 0.21 0.12 0.16 M20 | 0.08 0.14 0.14 0.06 0.12 0.10 0.20 0.17 0.17 0.20 0.22 0.16 0.19 0.14 0.14 M21 | 0.04 0.05 0.12 0.02 0.08 0.07 0.14 0.12 0.09 0.17 0.14 0.13 0.16 0.16 0.14 M22 | 0.08 0.07 0.14 0.05 0.12 0.12 0.16 0.16 0.16 0.22 0.16 0.16 0.18 0.14 0.16 M23 | 0.06 0.05 0.04 0.12 0.14 0.12 0.12 0.08 0.12 0.20 0.12 0.13 0.13 0.26 0.35 M24 | 0.10 0.07 0.04 0.14 0.12 0.14 0.14 0.12 0.18 0.17 0.14 0.18 0.11 0.26 0.35 M25 | 0.09 0.09 0.13 0.09 0.12 0.07 0.09 0.09 0.09 0.17 0.09 0.13 0.13 0.13 0.05 M26 | 0.08 0.07 0.16 0.05 0.08 0.05 0.06 0.14 0.09 0.10 0.12 0.07 0.09 0.07 0.05 M27 | 0.08 0.10 0.16 0.06 0.08 0.06 0.06 0.12 0.10 0.08 0.17 0.07 0.07 0.10 0.08 M28 | 0.19 0.16 0.16 0.12 0.15 0.12 0.12 0.19 0.16 0.13 0.14 0.12 0.12 0.12 0.12 M29 | 0.13 0.14 0.17 0.10 0.17 0.14 0.15 0.25 0.17 0.18 0.20 0.16 0.14 0.10 0.10 M30 | 0.12 0.18 0.18 0.07 0.19 0.14 0.12 0.19 0.16 0.10 0.19 0.13 0.11 0.12 0.07 M31 | 0.10 0.12 0.14 0.08 0.13 0.10 0.10 0.20 0.19 0.13 0.17 0.12 0.12 0.06 0.12 M32 | 0.14 0.14 0.16 0.07 0.12 0.07 0.14 0.19 0.18 0.10 0.16 0.09 0.11 0.12 0.12 M33 | 0.12 0.16 0.14 0.09 0.08 0.09 0.08 0.14 0.21 0.10 0.14 0.13 0.16 0.12 0.09 M34 | 0.14 0.21 0.21 0.05 0.12 0.09 0.08 0.16 0.23 0.12 0.14 0.11 0.11 0.14 0.09 M35 | 0.14 0.18 0.14 0.05 0.12 0.12 0.08 0.12 0.14 0.10 0.08 0.09 0.09 0.09 0.07 M36 | 0.16 0.18 0.13 0.11 0.10 0.09 0.09 0.14 0.16 0.10 0.16 0.11 0.15 0.05 0.07 M37 | 0.14 0.22 0.17 0.06 0.13 0.08 0.08 0.10 0.17 0.10 0.15 0.12 0.08 0.12 0.08 M38 | 0.17 0.22 0.12 0.06 0.08 0.08 0.08 0.12 0.17 0.08 0.10 0.12 0.12 0.12 0.06
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
M16 | 1.00
M17 | 0.61 1.00
M18 | 0.55 0.61 1.00 M19 | 0.44 0.45 0.59 1.00
M20 | 0.49 0.46 0.61 0.83 1.00
M21 | 0.39 0.31 0.46 0.46 0.56 1.00
M22 | 0.42 0.31 0.40 0.42 0.56 0.66 1.00
M23 | 0.10 0.11 0.11 0.14 0.17 0.12 0.16 1.00
M24 | 0.08 0.07 0.09 0.10 0.12 0.09 0.14 0.61 1.00 M25 | 0.21 0.22 0.30 0.23 0.33 0.28 0.28 0.13 0.16 1.00
M26 | 0.24 0.20 0.22 0.19 0.27 0.26 0.35 0.09 0.09 0.37 1.00
M27 | 0.19 0.14 0.23 0.19 0.25 0.27 0.30 0.14 0.12 0.32 0.58 1.00
M28 | 0.27 0.29 0.28 0.30 0.28 0.21 0.24 0.10 0.12 0.32 0.42 0.33 1.00
M29 | 0.28 0.19 0.29 0.22 0.23 0.24 0.27 0.14 0.17 0.19 0.37 0.41 0.38 1.00
M30 | 0.27 0.23 0.33 0.30 0.30 0.26 0.35 0.09 0.12 0.26 0.38 0.39 0.36 0.51 1.00
M31 | 0.22 0.27 0.29 0.25 0.23 0.24 0.33 0.10 0.12 0.21 0.37 0.34 0.30 0.50 0.65
M32 | 0.30 0.26 0.28 0.39 0.40 0.32 0.41 0.09 0.07 0.18 0.32 0.24 0.42 0.37 0.49
M33 | 0.33 0.23 0.25 0.30 0.27 0.29 0.32 0.07 0.05 0.18 0.32 0.21 0.39 0.30 0.41
M34 | 0.27 0.18 0.25 0.27 0.27 0.23 0.32 0.07 0.07 0.20 0.29 0.27 0.30 0.30 0.45
M35 | 0.21 0.20 0.25 0.27 0.24 0.21 0.23 0.09 0.12 0.18 0.21 0.24 0.24 0.37 0.38
M36 | 0.18 0.15 0.11 0.18 0.16 0.13 0.23 0.05 0.11 0.15 0.23 0.21 0.26 0.30 0.31
M37 | 0.17 0.21 0.21 0.22 0.20 0.14 0.19 0.04 0.10 0.16 0.19 0.25 0.20 0.32 0.40
M38 | 0.25 0.21 0.21 0.22 0.26 0.17 0.22 0.06 0.12 0.21 0.24 0.17 0.25 0.35 0.37
M31 | 1.00 M32 | 0.51 1.00 M33 | 0.47 0.66 1.00 M34 | 0.44 0.57 0.66 1.00 M35 | 0.44 0.49 0.45 0.53 1.00 M36 | 0.42 0.37 0.37 0.34 0.40 1.00 M37 | 0.38 0.37 0.30 0.44 0.60 0.42 1.00 M38 | 0.35 0.44 0.40 0.44 0.60 0.50 0.54 1.00
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
x x 1 Nếp mặn
x x x 2 Tẻ chăm
x 3 Quảng trắng
4 Nếp trứng x
x 5 Nếp Quảng Ngãi
x 6 Lúa ngoi
x 7 OM 5981
x 8 Lúa sỏi
x 9 Ba túc
x
10 OM5166
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Hình 3.10: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu
với cặp mồi RM13 (M: GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low)
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Hình 3.11: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu
với cặp mồi RM153 (M: GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low)
Hình 3.12: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu
với cặp mồi RM174 (M: GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low)
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
Hình 3.13: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu
với cặp mồi RM224 (M: GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low)
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
Tập đoàn lúa chịu mặn bản địa của Việt Nam rất đa dạng về các thành phần
allele. Phân tích 30 cặp mồi SSR trên 38 giống lúa chịu mặn thu được tổng số 1128
băng ADN, thuộc 156 loại allele khác nhau, trung bình 5,2 allele/cặp mồi. Hệ số
PIC dao động từ 0,145 đến 0,842, trung bình 0,661. Các giống lúa chịu mặn có độ
thuần di truyền khác nhau, tỉ lệ dị hợp của các mẫu nghiên cứu dao động từ 0% đến
10% (trung bình là 1,50%).
Các giống lúa chịu mặn nghiên cứu có độ đa dạng di truyền rất cao, hệ số
tương đồng di truyền giữa các giống dao động trong khoảng từ 0,02 đến 0,83. Mức
độ đa dạng di truyền của các giống ở các địa phương khác nhau của 3 vùng miền
khác nhau rất rõ rệt. Các giống lúa chịu mặn ở cùng một vùng miền có hệ số tương
đồng di truyền lớn và được phân bố ở cùng một nhóm. Tập đoàn 38 giống lúa chịu
mặn nghiên cứu được chia thành 3 nhóm lớn: Nhóm I có 12 giống, trong đó 11 giống
có nguồn gốc từ miền Trung, 1 giống ở miền Bắc (Chiêm đá). Nhóm II có 5 giống bao
gồm 2 giống thuộc miền Trung và 3 giống thuộc miền Bắc. Nhóm III có 21 giống lúa
đều có nguồn gốc từ miền Nam. Kết quả này rất có ý nghĩa để phân loại, xác định
các nhóm ưu thế lai, chọn lọc các nguồn gen và lai tạo giống.
Trong số 30 cặp mồi SSR nghiên cứu có 10 cặp mồi xác định được 14 allele
hiếm (trung bình 0,47 allele hiếm trên mỗi locus). Cặp mồi RM340 xác định được 3
allele hiếm nhận dạng được các giống Nếp mặn, Nếp trứng và Lúa ngoi. Cặp mồi
RM30 xác định được 2 allele hiếm ở giống Nếp mặn và Tẻ chăm. Cặp mồi RM17 xác
định được 2 allele hiếm ở giống Lúa sỏi và Ba túc. Các cặp mồi RM13, RM153,
RM174, RM 224, RM 264, RM318 và RM 341 xác định được 1 allele hiếm trên mỗi
locus nhận dạng được các giống Nếp Quảng Ngãi, Lúa sỏi, Quảng Trắng, Tẻ chăm,
Nếp mặn, OM5166 và OM 5981. Các kết quả thu được rất hữu ích trong việc nhận
dạng chính xác các nguồn gen phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có
hiệu quả trong các chương trình chọn tạo giống lúa chịu mặn của Việt Nam.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
2. Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu và đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn lúa chịu mặn ở
mức hình thái nông học kết hợp với chỉ thị SSR nhằm xác định các marker liên kết với
tính trạng chống chịu mặn để phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn.
Tiếp tục nghiên xác định các allele đặc trưng, allele hiếm để nhận dạng chính
xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác
thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa chịu mặn ở mức phân tử.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Nguyễn Ngọc Anh (2005), Chiến lược bảo vệ và sử dụng hợp lý dòng chảy kiệt
đồng bằng sông Cửu Long, Báo cáo hội thảo Khai thác và sử dụng hợp lý tài
nguyên nước khu vực đồng bằng sông Cửu Long Cần Thơ, ngày 21/4/2005.
2. Đỗ Hữu Ất (2004), “Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tạo giống lúa chịu mặn cho
vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ”, Thông tin Khoa học và Công nghệ Hạt
nhân, (4), tr. 28-30.
3. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với
thiệt hại do môi trường của cây lúa, Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.
4. Trần Văn Đạt (2005), Sản xuất lúa gạo thế giới: Hiện trạng và khuynh hướng phát
triển trong thế kỷ 21, NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Ngọc Đệ (2008), Giáo trình cây lúa, Trường Đại học Cần Thơ, Cần Thơ.
6. Nguyễn Thị Lang, Phạm Thị Xim, Bùi Chí Bửu (2008), “Nghiên cứu ứng dụng
marker phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng kỹ thuật nuôi cấy túi
phấn”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, (8/2008), tr. 13-17.
7. Nguyễn Thị Lang (2002), Những phương pháp cơ bản trong công nghệ sinh học,
NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh.
8. Trần Văn Minh (2004) (Chủ biên), Giáo trình cây lương thực, NXB Nông
nghiệp, Hà Nội.
9. Đỗ Đình Sâm, Ngô Đình Quế, Nguyễn Tử Siêm, Nguyễn Ngọc Bình (2006), Cẩm
nang nghành Lâm nghiệp: Chương Đất và Dinh dưỡng Đất, Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn
10.Đặng Minh Tâm, Nguyễn Thị Lang (2003), “In vitro selecsion for sail tolerance in
rice”, Omorice, tr. 68-75.
11. Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Thị Hồng Liên (2008), “Đánh giá khả năng chịu mặn
của các giống lúa OM4498, VND 95-20, IR64, CR203 ở mức độ mô sẹo bằng
phương pháp nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 65(03), tr. 143-
148.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
12. Đỗ Khắc Thịnh, Nguyễn Ngọc Quỳnh, Dương Ký, Nguyễn Văn Huấn (1997), “Kết
quả tuyển chọn giống lúa mùa FRG67 cho vùng đất phèn, nhiễm mặn, ảnh hưởng
thuỷ triều ven thành phố Hồ Chí Minh”, Tạp chí Nông nghiệp và Công Nghiệp
Thực Phẩm, (11/1997), tr. 475-476.
13. Ngô Đình Thức (2006), Nghiên cứu phát triển giống lúa chống chịu mặn cho vùng
đồng bằng sông Cửu Long, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, trường Đại học Nông lâm
TP.HCM.
14. Khuất Hữu Trung, Nguyễn Thị Phương Đoài (2010), “Nghiên cứu đa dạng di
truyền và nhận dạng một số giống trong tập đoàn lúa Tám đặc sản của Việt Nam
bằng chỉ thị phân tử SSR (microsatellite)”, Tạp Chí Nông nghiệp và PTNT, (149),
tr. 3-8.
15. Khuất Hữu Trung, Nguyễn Thị Phương Đoài, Nguyễn Thúy Điệp, Trần Thị Thúy
(2010), “Nghiên cứu xác định các chỉ thị sao chép có trình tự đơn giản (Marker
SSR) nhận dạng một số giống lúa Nếp, lúa Nương bản địa Việt Nam”, TC Nông
nghiệp và PTNT, (153), tr 15-21.
Tài liệu tiếng Anh
16. Aslam M., Qureshi R.H., and Ahmad. (1993), Mechanisms of salinity tolerance in
rice (Oryza sativva L.), Department of soil science and physiology, University of
Agriculture, Pakistan.
17. Cai H., and Morishima H. (2002), “QTL clusters reflect character associations in
wild and cultivated rice”, Theor Appl Genet, (8), pp. 1270-1277.
18. Chang T.T. (1985), "Crop history and genetic conservation. Rice, A case study. In:
Iwova state", Journal of research, 59(4), pp. 425-455.
19. Chang T.T., Vaughan D.A. (1991), Manual of operations and procedures of the
International genebank, IRRI.
20. Cheng C.Y., Motohashi R., Suchimoto S.T., Fukuta Y., Ohtsubo H. (2003),
"Polyphyletic origin of cultivated rice: based on the interspersion pattern of
SINEs", Mol. Biol, (20), pp. 67–75.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
21. Cheng Y.J., Guo W.W., Yi H.L., Pang X.M. (2003), “An efficient protocol for
genomic DNA extraction from citrus species”, Plant Molecular Biology Reporter,
(21), pp. 177-178.
22. Collar B.C., and Mackill D.J. (2008), “Marker-aided selection: an approach for
precision plant breeding in the twenty first century”, Biol. Sci, (363), 557-572.
23. DeDatta S.K. (1981), Principles and practices of rice production, John Wiley &
Son Inc., Canada.
24. F.A.O., AGL. (2000), Extent and causes of salt-affected soils in participating
countries. Global network on intergrated soil management for sustainable use of
salt-affected soils, Land and plant nutrition management service.
25. Greenway, and Munns. (1980), Mechanisms of salt tolerance in nonhalophytes,
Department of Agronomy, University of Western Australia
26. Gregorio G.B, (1997), Tagging salinity tolerance gene in rice (Oryza sativa) using
amplified fragment length polymorphism (AFLP), PhD dissertation, University of
the Philippines Los Banos, Philippines.
27. Gregorio G.B., Senadhira D., Mendoza R. D., Manigbas N. L., Rosxas J.P., Guerta
C.Q. (2002), “Progress in breeding for salinity tolerance and associated abiotic
stresses in rice”, Field Crio Research, (76), pp. 91-101.
28. Hoai N.T.T., Shim I.S., Kobayashi K., Usui K. (2003), “Accumulation of some
nitrogen compounds in response to salt stress and their relationships with salt
tolerance in rice (Oryza sativa L.) seedlings”, Plant Growth Regulation, (41), pp.
159-164.
29. IRGSP (2005), “The map-based sequence of the rice genome”. Nature, (436), pp.
793-800.
30. Islam A.M., Heuter S., Thomson M.J., and Wissuwa M. (2007), “Geneticand
genomic approaches to develop rice germplasm for proplem soil”, Plant Molecular
Biology, (4), pp. 547-570.
31. Islam M.M. (2004), Mapping salinity tolerance gene in rice (Oryza sativa) at
reproduction stage. PhD dissertation, University of the Philippines Los Banos,
Philippines.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
32. Jang I.C., Oh S.J., Seo J.S., Choi W.B., Song S.I., Kim C.H., Kim Y.S., Seo H.S.,
Choi Y.D., Nahm B.H., Kim J.K. (2003), “Expression of a bifunctional fusion of
the Escherichia coli genes for trehalose 6-phosphate synthase and trehalose 6-
phosphate phosphatase in transgenic rice plants increase trehalose accumulation
and abiotic stress tolerance without stuning growth”. Plant Physiol, (131),pp. 516-
524.
33. Jayamani P., Negrao S., Martins M., Macas B., and Oliveira M.M. (2007).
“Genetic Relatedness of Portuguese Rice Accessions from Diverse Origins as
Assessed by Microsatellite Markers”. Crop Science, (47), pp. 879-884.
34. Jianxin Ma and Bennetzen (2004) J.L., "Rapid recent growth and divergence of
rice nuclear genomes", Proc. Natl. Acad. Sci., (101), pp. 12404–12410.
35. Joshi R.K., Behera L,. (2006). “Identification and differentiation of indigenous
non-Basmati aromatic rice genotypes of India using microsatellite markers”.
African Journal of Biotechnology, (Vol. 6 (4)), pp.348-354.
36. Khush G. (1997), "Origin, dispersal, cultivation and variation of rice", Plant Mo.
Biol, (35), pp. 25-34.
37. Kimura M. (1983). “Rare variant alleles in the light of the neutral theory”. Mol.
Biol. Evol., (1),pp. 84-93.
38. Lobell D.B., Burke1 M.B., Tebaldi C., Mastrandrea M.D., Falcon W.P., and
Naylor R.L. (2008), “Prioritizing Climate Change Adaptation Needs for Food
Security in 2030”, Science (319), pp. 607-610
39. Lu Y.D. (1995), The Wild Relatives of Oryza: Nomenclature and Potention value
in Rice Improvement, In: Field Collection and Conservation Genetic Resources
Center, IRRI, Los Banos, the Philippines.
40. McCouch S.R., Leonid T., Xu Y., Lobos K.B., Clare K., Walton M., Fu B.,
Maghirang R., Li Z., Xing Y., Zhang Q., Kono I., Yano M., Fjellstrom R.,
DeClerck G., Schneider D., Cartinhour S., Ware D., Stein L.. (2002).
“Development and Mapping of 2240 New SSR for Rice (Oryza sativa L.)”, ADN
Res, (9), pp.199-207.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
41. McCouch, S. R., Sunita J., Jain R.K. (2005), “Genetic analysis of Indian aromatic
and quality rice (Oryza sativa L.) germplasm using panels of fluorescently-labeled
microsatellite markers”, Theoretical and Applied Genetics, 109( 5), pp. 965-977.
42. Mishra B., Akbar M., Seshu D.V. (1990), Genetic studies on sanility tolerance in
rice towards better productivity in salt affected soils, IRRI, Philippine.
43. Mohammadi N.G., Arzani1 A., Rezai1 A.M., Singh R.K., and Gregorio G.B.
(2008), “Assessment of rice genotypes for salt tolerance using microsatellite
markers associated with the saltol QTL”, African Journal of Biotechnology, (7),
730-736.
44. Muhammad S., Akbar M., and Neue H.U. (1987), “Effect of Na/Ca and Na/K ratio
in saline culture solution on the growth and mineral nutrition of rice (Oryza sativa
L.)”, Plant Soil 104, pp. 57-62.
45. Munns R (2002), “Comparative physiology of salt and water stress”. Plant Cell
and Envriron, (25), pp. 239-250.
46. Nagamiya K., Motohashi T., Nakao K., Prodhan SH., Hattori E., Hirose S., Ozawa
K., Ohkawa Y., Takabe T., Takabe T., Takabe T and Ohkawa Y. (2007),
“Enhancement of salt tolerance in transgenic rice expressing an Escherichia coli
catalase gene”, Plant Biotech, (1), pp. 49-55.
47. -33. Niones J.M. (2004), Fine mapping of the salinity tolerance gene on
chromosome 1 of rice (Orysa sativa) using near-isogenic lines. MSc thesis,
University of the Philippines Los Banos.
48. Obara-Okeyo P. and Kako S. (1998), “Genetic diversity and identifi cation of
Cymbidium cultivars as measured by random amplifi ed polymorphic DNA (RAPD)
markers”. Euphytica, (99), pp. 95-101.
49. Ohta M., Hayashi Y., Nakashima A., Hamada A., Tanaka A., Nakamura T and
Hayakawa T. (2002), “Introduction of a Na+/H+ antipoter gene from Atriplex
gmelini confers salt tolerance in rice”, FEBS Lett, (532), pp. 279-282.
50. Oka H.I. (1988), "Origin of cultivated rice", J. Sci. Societies press, Tokyo, p.
129.
51. Olufowote J.O., Xu Y., Chen X., Park W.D., Beachell H.M., Dilday R.H, Goto M.,
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
McCouch S.R. (1997), “Comparative evaluation of within-cultivar variation of rice
(Oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP markers”, Genome, (38),
pp.1170–1176.
52. Peng, S., Cassman, K.G., Virmani, SS., Sheehy, J., and Khush, G.S. (1999),
“Yield potential trends of tropical rice since the release pff IR8 and the challenge
of increasing rice yield potential”, Crop Sci, (39), pp. 1552-1559.
53. Ponnamperuma, F.N. (1984), Role of cultivar tolerance in increasing rice
production on saline lands, John Wiley and sons, New York.
54. Tuberosa R., and Salvi S. (2007), “Dissecting QTLs for Tolerance to Drought and
Salinity”, Advances in Molecular Breeding Toward Drought and Salt Tolerant
Crops, pp. 381-412.
55. Singh K.N., and Chatrath R. (2001), Salinity tolerance. Application of Physiology
in Wheat Breeding. Reynolds MP, Ortiz-Monasterio JI, McNab A (Eds) ,
CIMMYT, Mexico.
56. Raj K.J., Lambodar B. (2006). Identification and differentiation of indigenous non-
Basmati aromatic rice genotypes of India using microsatellite. African Journal of
Biotechnology, Vol. 6 (4), pp. 348-354
57. Smith J.S.C., Chin E.C.L., Shu H., Smith O.S., Wall S.J., Senior M.L., Mitchell
S.E., Kresovich S.,Ziegle J. (1997), “An evaluation of the utility of SSR loci as
molecular markers in maize (Zeamays L.,): comparisons with data from RFLPs and
pedigree”, Theor Appl Genet, (95), pp. 163-173.
58. Tang, J.B., Xia H.A., Cao M.L., Zhang X.Q., Zeng W.Y. (2004), "A comparison
of rice chloroplast genomes", Plant Physiol,1(35), pp. 412–420.
59. Tateoka T., (1963), “Taxononic Studies of Oryza III. Key to the species and their
enumeration”, Bot. Mag, Tokyo (76), pp. 165-173.
60. Tateoka, T., (1964), “Notes on some grasses. XVI. Embryo structure of the
genus Oryza in relation to the systematics”, Amer. J. Bot, (51), pp. 539-543.
61. Teng S. (1994), Gene tagging for salt tolerance in rice (Oryza sativa L.), The
University of the Philippine, Los Banos, Laguna, Philippine.
Luận văn thạc sỹ Bùi Văn Hiệu
62. Vaughan D.A. (1994), “The wild relative of rice - A genetic resources handbook”,
IRRI, pp. 3 - 5.
63. Vitte C., Ishii T., Lamy F., Brar D., Panaud O. (2004), "Genomic paleontology
provides evidence for two distinct origins of Asian rice (Oryza sativa L)", Mol.
Gen. Genomics, (272), pp. 504-511.
64. Weir B.S. (1996), Genetic data analysis II, 2nd ed, Sinauer Associates Inc,
Sunderland, Massachusetts.
65. Xu D., Duan X., Wang B., Hong B., Ho T.H.D., and Wu R. (1996), “Expression of
a late embryogenesis abundant (LEA) protein gene, HavI, from barley confers
tolerance to drought and sanility in transgenic rice”, Plant Physiol, (110), pp. 249-
247.
66. Yeo A.R. and Flower T.J (1986), “Salinity resistance in rice and a pyramiding
approach to breeding varieties for saline soils”, Australian Journal of Plant
Physiology, 13 (1), pp. 161 – 173.
67. Zahida H., Pervaiz, Malik A., Rabbani, Stephen R., Pearce and Salman A., Malik.
(2009), “Determination of genetic variability of Asian rice (Oryza sativa L.)
varieties using microsatellite markers”, African Journal of Biotechnology, 8 (21),
pp. 5641-5651.
68. Zeng L., Kwon T.R., Liu X., Wilson C., Grieve C.M., Gregorio G.B. (2004),
“Genetic diversity analyzed by microsatellite markers among rice (Oryza sativa L.)
genotypes with different adaptations to saline soils”, Plant Sci, 166(5), pp. 1275-
1285.
