TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 84-89<br />
<br />
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC LẬP MÔI TRƯỜNG<br />
NUÔI CẤY VI NẤM CỘNG SINH PHÂN LẬP TỪ RỄ CÂY THÔNG ĐỎ TẠI<br />
VÙNG LẠC DƯƠNG, TỈNH LÂM ĐỒNG<br />
Đàm Sao Mai1*, Võ Trung Âu2<br />
1<br />
<br />
Trường Đại học Công nghiệp tp. Hồ Chí Minh, *damsaomai@foodtech.edu.vn<br />
2<br />
Trường Đại học Szent István, Hungary<br />
<br />
TÓM TẮT: Nghiên cứu này đề cập đến vi nấm nội cộng sinh có khả năng sinh taxol, được phân lập từ<br />
các cây thông đỏ (Taxus wallichiana) mọc tự nhiên tại vùng Lạc Dương, Lâm Đồng. Kết quả nghiên cứu<br />
cho thấy, trên các cây thông đỏ khảo sát chủ yếu tồn tại vi nấm nội cộng sinh Fusarium oxysporum, loài<br />
này đã được xác lập và phát triển tốt trên môi trường MMN cải tiến có bổ sung vitamin B1 (0,05 mg),<br />
KH2PO4 (0,9 g), NH4+, (0,15 g), dung dịch FeCl3 1% (1,8 mL); sau 30 ngày nuôi cấy, thu nhận được<br />
10,85 g sinh khối/l môi trường (theo khối lượng khô). Nấm F. oxysporum còn được xác định phát triển rất<br />
tốt trên môi trường PDB có bổ sung 0,1 g vitamin B1/l môi trường; sau 16 ngày nuôi cấy, thu nhân được<br />
9,71 g sinh khối/l môi trường (theo khối lượng khô). Lượng taxol thu nhận được là 250,98 mg/kg khối<br />
lượng khô.<br />
Từ khóa: Fusarium oxysporum, Taxus wallichiana, nấm cộng sinh.<br />
MỞ ĐẦU<br />
<br />
Vi nấm cộng sinh với rễ thực vật nhằm hỗ<br />
trợ và cung cấp dinh dưỡng, sự giúp đỡ qua lại<br />
đó giúp cả hai sinh trưởng và phát triển. Cây<br />
trồng phải thông qua giai đoạn cộng sinh mới<br />
hoàn thành vòng đời hoặc chu kỳ sống của<br />
mình. Vì vậy, hiện tượng cộng sinh là giai đoạn<br />
phát triển không thể thiếu để chúng tồn tại và<br />
sinh sản [1, 7, 8]. Các nhà khoa học đã xác định<br />
được một số hình thức cộng sinh, trong đó, quá<br />
trình cộng sinh chủ yếu là giữa nấm và rễ cây,<br />
được gọi là nấm rễ cộng sinh. Harley & Smith<br />
(1983) [4] cho biết có đến 70-90% trong số các<br />
loài thực vật sống trên đất tham gia vào việc<br />
hình thành cộng sinh nấm rễ (arbuscular<br />
mycorrhizae-AM).<br />
Thông đỏ (Taxus wallichiana) thuộc họ<br />
Thanh tùng (Taxaceae), từ vỏ và lá cây thông đỏ<br />
chiết xuất được taxol và các hoạt chất, dùng để<br />
chữa bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung<br />
thư não và có triển vọng xử lý u hắc tố. Hiện<br />
nay, ở Việt Nam, thông đỏ chỉ tồn tại ở một số<br />
vùng rừng của Lâm Đồng với số quần thể và cá<br />
thể rất ít và cũng đang đối diện với nguy cơ biến<br />
mất. Đã có một số nghiên cứu thành công liên<br />
quan đến cây thông đỏ như: nhân giống hữu<br />
tính, vô tính; nuôi cấy tế bào thông đỏ [5].<br />
Mục tiêu của nghiên cứu này là định tên và<br />
xác định vi nấm nội cộng sinh có khả năng kết<br />
84<br />
<br />
hợp tốt nhất với thông đỏ, xác lập môi tường<br />
nuôi cấy thích hợp của vi nấm, đồng thời định<br />
lượng taxol tạo thành khi nuôi cấy trong môi<br />
trường nghiên cứu.<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
<br />
Rễ cây thông đỏ được lấy từ các cây thông<br />
đỏ tại 5 địa điểm khác nhau ở vùng núi thuộc<br />
Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng tại độ cao trên<br />
1.600 m so với mặt nước biển.<br />
Các mẫu thu nhận được rửa sạch bằng<br />
ethanol 70% (v/v) trong 1 phút và HgCl2 0,1%<br />
(v/v) trong 8 phút, sau đó được rửa lại 6 lần<br />
bằng nước cất trước khi đem đi phân lập vi nấm<br />
nội cộng sinh.<br />
Sử dụng môi trường MMN (0,067 g<br />
CaCl2.2H2O; 0,025 g NaCl; 0,5 g KH2PO4; 0,25<br />
g (NH4)2)HPO4; 0,15 g MgSO4.7H2O; 0,1 g<br />
Thiamin.HCl; 1,2 mL FeCl3(1%); 3,0 g Malt<br />
extract; 10 g D-glucose; 15 g Agar) và môi<br />
trường PDA (0,23 l dịch chiết khoai tây, 20 g<br />
dextrose; 0,77 l nước, 15 g Agar) của Difco để<br />
nhân giống và phân lập vi nấm. Chọn lọc vi<br />
nấm nội cộng sinh phù hợp cho nghiên cứu tiếp.<br />
Xác định môi trường tối ưu của vi nấm nội<br />
cộng sinh chọn lọc qua môi trường MMN dạng<br />
lỏng và môi trường PDB có bổ sung vi lượng<br />
(bảng 1).<br />
<br />
Dam Sao Mai, Vo Trung Au<br />
<br />
Bảng 1. Thành phần môi trường của các công thức khảo sát trên môi trường MMN<br />
Công<br />
thức<br />
CT Cơ<br />
bản<br />
NT1<br />
NT2<br />
NT3<br />
NT4<br />
NT5<br />
NT6<br />
NT7<br />
NT8<br />
NT9<br />
NT10<br />
NT11<br />
NT12<br />
NT13<br />
NT14<br />
NT15<br />
NT16<br />
NT17<br />
NT18<br />
NT19<br />
NT20<br />
NT21<br />
NT22<br />
NT23<br />
NT24<br />
NT25<br />
NT26<br />
<br />
Thành phần môi trường (g) (*)<br />
Glucose<br />
(g)<br />
<br />
MgSO4.<br />
7H2O (g)<br />
<br />
CaCl2.<br />
2H2O (g)<br />
<br />
NaCl<br />
(g)<br />
<br />
VTB1<br />
(mg)<br />
<br />
Malt<br />
(g)<br />
<br />
NH4+<br />
(g)<br />
<br />
KH2PO4<br />
(g)<br />
<br />
FeCl3 1%<br />
(mL)<br />
<br />
10<br />
<br />
0,15<br />
<br />
0,067<br />
<br />
0,025<br />
<br />
0,1<br />
<br />
3<br />
<br />
0,25<br />
<br />
0,5<br />
<br />
1,2<br />
<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
10<br />
<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,15<br />
<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
0,067<br />
<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
0,025<br />
<br />
0,15<br />
0,05<br />
0,05<br />
0,15<br />
0,05<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,05<br />
0,05<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,05<br />
0,15<br />
0,05<br />
0,05<br />
0,15<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,05<br />
0,15<br />
<br />
1<br />
5<br />
1<br />
5<br />
1<br />
5<br />
1<br />
5<br />
1<br />
5<br />
1<br />
5<br />
1<br />
5<br />
1<br />
5<br />
1<br />
5<br />
3<br />
3<br />
3<br />
3<br />
3<br />
3<br />
3<br />
3<br />
<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,35<br />
0,35<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,35<br />
0,35<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,35<br />
0,35<br />
0,15<br />
0,15<br />
0,35<br />
0,35<br />
0,25<br />
0,25<br />
0,15<br />
0,35<br />
0,25<br />
0,25<br />
0,25<br />
0,25<br />
0,25<br />
0,25<br />
<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,9<br />
0,9<br />
0,9<br />
0,9<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,1<br />
0,9<br />
0,9<br />
0,9<br />
0,9<br />
0,5<br />
0,5<br />
0,5<br />
0,5<br />
0,1<br />
0,9<br />
0,5<br />
0,5<br />
0,5<br />
0,5<br />
<br />
0,6<br />
0,6<br />
0,6<br />
0,6<br />
0,6<br />
0,6<br />
0,6<br />
0,6<br />
1,8<br />
1,8<br />
1,8<br />
1,8<br />
1,8<br />
1,8<br />
1,8<br />
1,8<br />
1,2<br />
1,2<br />
1,2<br />
1,2<br />
1,2<br />
1,2<br />
0,6<br />
1,8<br />
1,2<br />
1,2<br />
<br />
*Công thức môi trường của các công thức thí nghiệm được xác lập qua phần mềm Modde 5 (tối ưu hóa thực<br />
nghiệm).<br />
<br />
Sử dụng môi trường PDB cơ bản (0,23 l<br />
dịch chiết khoai tây, 20 g dextrose; 0,77 l nước)<br />
có bổ sung vitamin B1 với lượng lần lượt là 0,1;<br />
0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 g/l.<br />
<br />
cột C18, tốc độ dòng là 0,5 mL/phút với hệ<br />
methanol-nước (65:35, v/v), thể tích tiêm mẫu là<br />
10 µl, với taxol chuẩn.<br />
<br />
Vi nấm được nuôi cấy lắc (160rpm) sau 16<br />
ngày trong môi trường PDB có bổ sung thiamin,<br />
tại nhiệt độ 24-28oC; sau đó được xử lý bằng<br />
phương pháp siêu âm trong thời gian 5h ở nhiệt<br />
độ phòng với ethyl acetate theo tỷ lệ 3:1 (v/v).<br />
Dịch thu nhận được cô quay, sau đó, hòa tan<br />
trong 10 mL MeOH 100% (v/v). Xác định lượng<br />
taxol hình thành từ vi nấm nội cộng sinh bằng<br />
HPLC, với đầu dò PAD, phổ hấp thụ là 230 nm,<br />
<br />
Kết quả trong các công thức thí nghiệm<br />
được trình bày là giá trị trung bình và độ lệch<br />
chuẩn của 3 lần lặp (sai số≤5%). Dữ liệu được<br />
phân tích bằng phương pháp phân tích phương<br />
sai một chiều (ANOVA) bằng phần mềm<br />
Statgraphic phiên bản 3.0. Sự khác biệt giữa các<br />
mẫu có ý nghĩa về mặt thống kê với p 0,25 g/l. Như vậy NH4- tác động<br />
đến quá trình tăng trưởng của vi nấm này.<br />
Công thức 8, 10, 11, 14 và 15 cho kết quả<br />
vượt trội sau 30 ngày nuôi cấy, trong đó, có thể<br />
thấy với công thức 14 có sự tăng đột ngột của<br />
lượng sinh khối tạo thành. Trong công thức này,<br />
các nguyên tố vi lượng cần bổ sung, cụ thể là:<br />
vitamin B1 (0,05 mg), KH2PO4 (0,9 g), NH4 (0,15 g), dung dịch FeCl3 1% (1,8 mL). Lượng<br />
vi nấm có thể đạt là 10,85 g/l môi trường (tính<br />
theo khối lượng khô).<br />
<br />
Khối lượng vi nấm (g/L)<br />
<br />
Kết quả định danh đã xác định đây là chủng<br />
Fusarium oxysporum F-H.6.5-030318-02. Theo<br />
Stoner (1981) [9], F. oxysporum là vi nấm đa<br />
dạng và dễ thích nghi đã được tìm thấy trong<br />
các loại đất khác nhau, từ sa mạc Sonoran, rừng<br />
nhiệt đới và ôn đới, đồng cỏ. F. oxysporum gây<br />
phản ứng như là một tác nhân gây bệnh cây<br />
trồng, bệnh héo cây. Gordon & Martyn (1997)<br />
[3] đã xác định F. oxysporum có thể liên kết với<br />
các vi nấm ngoại cộng sinh, từ đó có thể xâm<br />
nhập vào các tế bào trong rễ và định cư ở các hệ<br />
thống rễ, lúc này các triệu chứng cây héo có thể<br />
giảm, đồng thời tạo một số chất mới trong cây.<br />
Như vậy, với các cây thông đỏ, sẽ là giải pháp<br />
<br />
tốt nếu kết hợp vi nấm ngoại cộng sinh trong<br />
quá trình chăm sóc và trồng trọt từ đó giảm<br />
thiểu bệnh cho cây và tăng khả năng phát triển<br />
cây cũng như tăng lượng các chất hình thành<br />
trong cây.<br />
<br />
Công thức<br />
<br />
Hình 3. Tác động của các nguyên tố vi lượng đến sự phát triển<br />
của F. oxysporumtrên môi trường MMN<br />
MMN là môi trường tốt cho F. oxysporum<br />
phát triển, tuy nhiên, để giảm giá thành và tăng<br />
hiệu quả kinh tế, môi trường PDB được khảo sát<br />
với việc bổ sung thêm vitamin B1. Hình 4 cho<br />
thấy, tác động của vitamin B1 đến sự phát triển<br />
của F. oxysporum trên môi trường PDB hoàn<br />
toàn phù hợp cho F. oxysporum phát triển. Từ<br />
các hình 3 và 4 có thể thấy, F. oxysporum phát<br />
triển trên môi trường MMN tốt hơn trên môi<br />
<br />
trường PDB. Tuy nhiên, thời gian phát triển của<br />
vi nấm trên môi trường PDB ngắn hơn. Lượng vi<br />
nấm đạt được sau 16 ngày tăng trưởng đã gần<br />
tương đương với công thức phát triển tốt nhất là<br />
NT14 sau 30 ngày tăng trưởng. Kết quả ANOVA<br />
thể hiện tỷ lệ F (F ratio), trong trường hợp này<br />
bằng 22,06. Với giá trị P
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
