intTypePromotion=3

Nghiên cứu phân lập và xác lập môi trường nuôi cấy vi nấm cộng sinh phân lập từ rễ cây thông đỏ tại vùng Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

0
40
lượt xem
1
download

Nghiên cứu phân lập và xác lập môi trường nuôi cấy vi nấm cộng sinh phân lập từ rễ cây thông đỏ tại vùng Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của nghiên cứu này là định tên và xác định vi nấm nội cộng sinh có khả năng kết hợp tốt nhất với thông đỏ, xác lập môi trường nuôi cấy thích hợp của vi nấm, đồng thời định lượng taxol tạo thành khi nuôi cấy trong môi trường nghiên cứu.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu phân lập và xác lập môi trường nuôi cấy vi nấm cộng sinh phân lập từ rễ cây thông đỏ tại vùng Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 84-89<br /> <br /> NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC LẬP MÔI TRƯỜNG<br /> NUÔI CẤY VI NẤM CỘNG SINH PHÂN LẬP TỪ RỄ CÂY THÔNG ĐỎ TẠI<br /> VÙNG LẠC DƯƠNG, TỈNH LÂM ĐỒNG<br /> Đàm Sao Mai1*, Võ Trung Âu2<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Công nghiệp tp. Hồ Chí Minh, *damsaomai@foodtech.edu.vn<br /> 2<br /> Trường Đại học Szent István, Hungary<br /> <br /> TÓM TẮT: Nghiên cứu này đề cập đến vi nấm nội cộng sinh có khả năng sinh taxol, được phân lập từ<br /> các cây thông đỏ (Taxus wallichiana) mọc tự nhiên tại vùng Lạc Dương, Lâm Đồng. Kết quả nghiên cứu<br /> cho thấy, trên các cây thông đỏ khảo sát chủ yếu tồn tại vi nấm nội cộng sinh Fusarium oxysporum, loài<br /> này đã được xác lập và phát triển tốt trên môi trường MMN cải tiến có bổ sung vitamin B1 (0,05 mg),<br /> KH2PO4 (0,9 g), NH4+, (0,15 g), dung dịch FeCl3 1% (1,8 mL); sau 30 ngày nuôi cấy, thu nhận được<br /> 10,85 g sinh khối/l môi trường (theo khối lượng khô). Nấm F. oxysporum còn được xác định phát triển rất<br /> tốt trên môi trường PDB có bổ sung 0,1 g vitamin B1/l môi trường; sau 16 ngày nuôi cấy, thu nhân được<br /> 9,71 g sinh khối/l môi trường (theo khối lượng khô). Lượng taxol thu nhận được là 250,98 mg/kg khối<br /> lượng khô.<br /> Từ khóa: Fusarium oxysporum, Taxus wallichiana, nấm cộng sinh.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Vi nấm cộng sinh với rễ thực vật nhằm hỗ<br /> trợ và cung cấp dinh dưỡng, sự giúp đỡ qua lại<br /> đó giúp cả hai sinh trưởng và phát triển. Cây<br /> trồng phải thông qua giai đoạn cộng sinh mới<br /> hoàn thành vòng đời hoặc chu kỳ sống của<br /> mình. Vì vậy, hiện tượng cộng sinh là giai đoạn<br /> phát triển không thể thiếu để chúng tồn tại và<br /> sinh sản [1, 7, 8]. Các nhà khoa học đã xác định<br /> được một số hình thức cộng sinh, trong đó, quá<br /> trình cộng sinh chủ yếu là giữa nấm và rễ cây,<br /> được gọi là nấm rễ cộng sinh. Harley & Smith<br /> (1983) [4] cho biết có đến 70-90% trong số các<br /> loài thực vật sống trên đất tham gia vào việc<br /> hình thành cộng sinh nấm rễ (arbuscular<br /> mycorrhizae-AM).<br /> Thông đỏ (Taxus wallichiana) thuộc họ<br /> Thanh tùng (Taxaceae), từ vỏ và lá cây thông đỏ<br /> chiết xuất được taxol và các hoạt chất, dùng để<br /> chữa bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung<br /> thư não và có triển vọng xử lý u hắc tố. Hiện<br /> nay, ở Việt Nam, thông đỏ chỉ tồn tại ở một số<br /> vùng rừng của Lâm Đồng với số quần thể và cá<br /> thể rất ít và cũng đang đối diện với nguy cơ biến<br /> mất. Đã có một số nghiên cứu thành công liên<br /> quan đến cây thông đỏ như: nhân giống hữu<br /> tính, vô tính; nuôi cấy tế bào thông đỏ [5].<br /> Mục tiêu của nghiên cứu này là định tên và<br /> xác định vi nấm nội cộng sinh có khả năng kết<br /> 84<br /> <br /> hợp tốt nhất với thông đỏ, xác lập môi tường<br /> nuôi cấy thích hợp của vi nấm, đồng thời định<br /> lượng taxol tạo thành khi nuôi cấy trong môi<br /> trường nghiên cứu.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Rễ cây thông đỏ được lấy từ các cây thông<br /> đỏ tại 5 địa điểm khác nhau ở vùng núi thuộc<br /> Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng tại độ cao trên<br /> 1.600 m so với mặt nước biển.<br /> Các mẫu thu nhận được rửa sạch bằng<br /> ethanol 70% (v/v) trong 1 phút và HgCl2 0,1%<br /> (v/v) trong 8 phút, sau đó được rửa lại 6 lần<br /> bằng nước cất trước khi đem đi phân lập vi nấm<br /> nội cộng sinh.<br /> Sử dụng môi trường MMN (0,067 g<br /> CaCl2.2H2O; 0,025 g NaCl; 0,5 g KH2PO4; 0,25<br /> g (NH4)2)HPO4; 0,15 g MgSO4.7H2O; 0,1 g<br /> Thiamin.HCl; 1,2 mL FeCl3(1%); 3,0 g Malt<br /> extract; 10 g D-glucose; 15 g Agar) và môi<br /> trường PDA (0,23 l dịch chiết khoai tây, 20 g<br /> dextrose; 0,77 l nước, 15 g Agar) của Difco để<br /> nhân giống và phân lập vi nấm. Chọn lọc vi<br /> nấm nội cộng sinh phù hợp cho nghiên cứu tiếp.<br /> Xác định môi trường tối ưu của vi nấm nội<br /> cộng sinh chọn lọc qua môi trường MMN dạng<br /> lỏng và môi trường PDB có bổ sung vi lượng<br /> (bảng 1).<br /> <br /> Dam Sao Mai, Vo Trung Au<br /> <br /> Bảng 1. Thành phần môi trường của các công thức khảo sát trên môi trường MMN<br /> Công<br /> thức<br /> CT Cơ<br /> bản<br /> NT1<br /> NT2<br /> NT3<br /> NT4<br /> NT5<br /> NT6<br /> NT7<br /> NT8<br /> NT9<br /> NT10<br /> NT11<br /> NT12<br /> NT13<br /> NT14<br /> NT15<br /> NT16<br /> NT17<br /> NT18<br /> NT19<br /> NT20<br /> NT21<br /> NT22<br /> NT23<br /> NT24<br /> NT25<br /> NT26<br /> <br /> Thành phần môi trường (g) (*)<br /> Glucose<br /> (g)<br /> <br /> MgSO4.<br /> 7H2O (g)<br /> <br /> CaCl2.<br /> 2H2O (g)<br /> <br /> NaCl<br /> (g)<br /> <br /> VTB1<br /> (mg)<br /> <br /> Malt<br /> (g)<br /> <br /> NH4+<br /> (g)<br /> <br /> KH2PO4<br /> (g)<br /> <br /> FeCl3 1%<br /> (mL)<br /> <br /> 10<br /> <br /> 0,15<br /> <br /> 0,067<br /> <br /> 0,025<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0,25<br /> <br /> 0,5<br /> <br /> 1,2<br /> <br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> 10<br /> <br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> <br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> 0,067<br /> <br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> 0,025<br /> <br /> 0,15<br /> 0,05<br /> 0,05<br /> 0,15<br /> 0,05<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,05<br /> 0,05<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,05<br /> 0,15<br /> 0,05<br /> 0,05<br /> 0,15<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,05<br /> 0,15<br /> <br /> 1<br /> 5<br /> 1<br /> 5<br /> 1<br /> 5<br /> 1<br /> 5<br /> 1<br /> 5<br /> 1<br /> 5<br /> 1<br /> 5<br /> 1<br /> 5<br /> 1<br /> 5<br /> 3<br /> 3<br /> 3<br /> 3<br /> 3<br /> 3<br /> 3<br /> 3<br /> <br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,35<br /> 0,35<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,35<br /> 0,35<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,35<br /> 0,35<br /> 0,15<br /> 0,15<br /> 0,35<br /> 0,35<br /> 0,25<br /> 0,25<br /> 0,15<br /> 0,35<br /> 0,25<br /> 0,25<br /> 0,25<br /> 0,25<br /> 0,25<br /> 0,25<br /> <br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,9<br /> 0,9<br /> 0,9<br /> 0,9<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,1<br /> 0,9<br /> 0,9<br /> 0,9<br /> 0,9<br /> 0,5<br /> 0,5<br /> 0,5<br /> 0,5<br /> 0,1<br /> 0,9<br /> 0,5<br /> 0,5<br /> 0,5<br /> 0,5<br /> <br /> 0,6<br /> 0,6<br /> 0,6<br /> 0,6<br /> 0,6<br /> 0,6<br /> 0,6<br /> 0,6<br /> 1,8<br /> 1,8<br /> 1,8<br /> 1,8<br /> 1,8<br /> 1,8<br /> 1,8<br /> 1,8<br /> 1,2<br /> 1,2<br /> 1,2<br /> 1,2<br /> 1,2<br /> 1,2<br /> 0,6<br /> 1,8<br /> 1,2<br /> 1,2<br /> <br /> *Công thức môi trường của các công thức thí nghiệm được xác lập qua phần mềm Modde 5 (tối ưu hóa thực<br /> nghiệm).<br /> <br /> Sử dụng môi trường PDB cơ bản (0,23 l<br /> dịch chiết khoai tây, 20 g dextrose; 0,77 l nước)<br /> có bổ sung vitamin B1 với lượng lần lượt là 0,1;<br /> 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 g/l.<br /> <br /> cột C18, tốc độ dòng là 0,5 mL/phút với hệ<br /> methanol-nước (65:35, v/v), thể tích tiêm mẫu là<br /> 10 µl, với taxol chuẩn.<br /> <br /> Vi nấm được nuôi cấy lắc (160rpm) sau 16<br /> ngày trong môi trường PDB có bổ sung thiamin,<br /> tại nhiệt độ 24-28oC; sau đó được xử lý bằng<br /> phương pháp siêu âm trong thời gian 5h ở nhiệt<br /> độ phòng với ethyl acetate theo tỷ lệ 3:1 (v/v).<br /> Dịch thu nhận được cô quay, sau đó, hòa tan<br /> trong 10 mL MeOH 100% (v/v). Xác định lượng<br /> taxol hình thành từ vi nấm nội cộng sinh bằng<br /> HPLC, với đầu dò PAD, phổ hấp thụ là 230 nm,<br /> <br /> Kết quả trong các công thức thí nghiệm<br /> được trình bày là giá trị trung bình và độ lệch<br /> chuẩn của 3 lần lặp (sai số≤5%). Dữ liệu được<br /> phân tích bằng phương pháp phân tích phương<br /> sai một chiều (ANOVA) bằng phần mềm<br /> Statgraphic phiên bản 3.0. Sự khác biệt giữa các<br /> mẫu có ý nghĩa về mặt thống kê với p 0,25 g/l. Như vậy NH4- tác động<br /> đến quá trình tăng trưởng của vi nấm này.<br /> Công thức 8, 10, 11, 14 và 15 cho kết quả<br /> vượt trội sau 30 ngày nuôi cấy, trong đó, có thể<br /> thấy với công thức 14 có sự tăng đột ngột của<br /> lượng sinh khối tạo thành. Trong công thức này,<br /> các nguyên tố vi lượng cần bổ sung, cụ thể là:<br /> vitamin B1 (0,05 mg), KH2PO4 (0,9 g), NH4 (0,15 g), dung dịch FeCl3 1% (1,8 mL). Lượng<br /> vi nấm có thể đạt là 10,85 g/l môi trường (tính<br /> theo khối lượng khô).<br /> <br /> Khối lượng vi nấm (g/L)<br /> <br /> Kết quả định danh đã xác định đây là chủng<br /> Fusarium oxysporum F-H.6.5-030318-02. Theo<br /> Stoner (1981) [9], F. oxysporum là vi nấm đa<br /> dạng và dễ thích nghi đã được tìm thấy trong<br /> các loại đất khác nhau, từ sa mạc Sonoran, rừng<br /> nhiệt đới và ôn đới, đồng cỏ. F. oxysporum gây<br /> phản ứng như là một tác nhân gây bệnh cây<br /> trồng, bệnh héo cây. Gordon & Martyn (1997)<br /> [3] đã xác định F. oxysporum có thể liên kết với<br /> các vi nấm ngoại cộng sinh, từ đó có thể xâm<br /> nhập vào các tế bào trong rễ và định cư ở các hệ<br /> thống rễ, lúc này các triệu chứng cây héo có thể<br /> giảm, đồng thời tạo một số chất mới trong cây.<br /> Như vậy, với các cây thông đỏ, sẽ là giải pháp<br /> <br /> tốt nếu kết hợp vi nấm ngoại cộng sinh trong<br /> quá trình chăm sóc và trồng trọt từ đó giảm<br /> thiểu bệnh cho cây và tăng khả năng phát triển<br /> cây cũng như tăng lượng các chất hình thành<br /> trong cây.<br /> <br /> Công thức<br /> <br /> Hình 3. Tác động của các nguyên tố vi lượng đến sự phát triển<br /> của F. oxysporumtrên môi trường MMN<br /> MMN là môi trường tốt cho F. oxysporum<br /> phát triển, tuy nhiên, để giảm giá thành và tăng<br /> hiệu quả kinh tế, môi trường PDB được khảo sát<br /> với việc bổ sung thêm vitamin B1. Hình 4 cho<br /> thấy, tác động của vitamin B1 đến sự phát triển<br /> của F. oxysporum trên môi trường PDB hoàn<br /> toàn phù hợp cho F. oxysporum phát triển. Từ<br /> các hình 3 và 4 có thể thấy, F. oxysporum phát<br /> triển trên môi trường MMN tốt hơn trên môi<br /> <br /> trường PDB. Tuy nhiên, thời gian phát triển của<br /> vi nấm trên môi trường PDB ngắn hơn. Lượng vi<br /> nấm đạt được sau 16 ngày tăng trưởng đã gần<br /> tương đương với công thức phát triển tốt nhất là<br /> NT14 sau 30 ngày tăng trưởng. Kết quả ANOVA<br /> thể hiện tỷ lệ F (F ratio), trong trường hợp này<br /> bằng 22,06. Với giá trị P

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

Đồng bộ tài khoản