Luận văn: NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG TRONG THỰC PHẨM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -------*-------

PHAN THỊ HOÀNG HẢO NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NCVC Chu Hoàng Hà

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Thái Nguyên, Năm 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng

sự nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học

thực hiện từ tháng 3 tới tháng 9 năm 2010.

Hà Nội, ngày 27 tháng 09 năm 2010

Học viên ký tên

Phan Thị Hoàng Hảo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

iii

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. NCVC Chu

Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, TS. Phạm Bích Ngọc phòng Công nghệ tế bào

thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá

trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Nghiêm Ngọc Minh đã cho phép tôi tham

gia thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal

enterotoxin B (SEB) phục vụ cho tạo kít phát hiện nhanh ngộ độc thực phẩm do độc

tố tụ cầu vàng”

Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo

tận tình của TS. Lê Văn Sơn, TS. Lâm Đại Nhân, CN. Hoàng Hà, Ths. Lê Thu Ngọc

và các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật cùng các bạn sinh viên trong phòng.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh

học, Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học

đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và

Viện.

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo

điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành

bản luận văn này.

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Phan Thị Hoàng Hảo

MỤC LỤC

Trang

CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................... viii

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. ix

DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. xi

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột

staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam................................ 3

1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm ....................................................... 3

1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc

tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam .................... 4

1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ............................................................... 6

1.2.1. Đặc điểm phân loại ...................................................................................... 6

1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn học ................................................................................ 6

1.2.2.1. Hình dạng và kích thƣớc .......................................................................... 6

1.2.2.2. Độc tố và khả năng gây bệnh .................................................................... 7

1.2.3. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ............................................... 10

1.3. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B .............................................. 10

1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B ....................................... 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B .................................... 12

1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng ............ 14

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 16

2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ............................................ 16

2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid ....................................................................... 16

2.1.2. Các bộ kít .................................................................................................... 16

2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị ................................................................... 16

2.1.4. Môi trƣờng và đệm .................................................................................... 17

2.1.5. Cặp mồi sử dụng ........................................................................................ 17

2.1.6. Phần mềm................................................................................................... 17

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 17

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................... 17

2.2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................... 18

2.2.2.1. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................. 18

2.2.2.2. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)...................... 20

2.2.2.3. Phƣơng pháp xử lý enzym hạn chế ........................................................ 20

2.2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch ADN từ gel agarose .......................................... 22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector .......................................... 23

2.2.2.6. Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia

coli DH5α ............................................................................................................. 24

2.2.2.7. Phƣơng pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn Escherichia coli

DH5α .................................................................................................................... 24

2.2.2.8. Biểu hiện protein staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp trong tế bào

vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) ...................................................... 26

2.2.2.9. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide .......................... 26

2.2.2.10. Phƣơng pháp tinh sạch protein ............................................................ 27

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28

3.1. Kết quả nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện ...................... 29

3.1.1. Thiết kế mồi ............................................................................................... 30

3.1.2. Kết quả PCR nhân gen seb ........................................................................ 31

3.1.3. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb .................................. 32

3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen seb đột biến ........... 34

3.2.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên pET21a+ .............................. 34

3.2.2. Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu hiện ............................. 36

3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR ......... 37

3.2.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế ................... 38

3.2.5. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện ……. ……….……40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEB tái tổ hợp ......................... 39

vii

3.3.1. Biến nạp vector tá i tổ hợ p pET21a+/SEB vào Escherichia coli chủng

BL21(DE3) ........................................................................................................... 40

3.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen seb.................................................................... 41

3.3.3. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện gen seb ...................................................... 43

3.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB .............................................................. 47

KẾT LUẬN .......................................................................................................... 49

KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 50

viii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Deoxyribonucleic acid ADN

Ammonium persulphate APS

Ribonucleic Acid ARN

Base pair bp

Cộng sự cs

Nước khử ion dH2O

Deoxyribonucleotide dNTP

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

IPTG Isopropylthio--D-galactoside

Kilobase Kb

Luria and Bertani LB

Phosphate buffer saline PBS

Polymerase Chain Reaction PCR

S. aureus Staphylococcus aureus

Sodium dodecyl sulfate SDS

Staphylococcal enterotoxin B SEB

Staphylococcal enterotoxins SEs

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Vòng / phút v/p

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 – 2009

2.1

Chu kì phản ứng PCR

2.2

Công thức pha gel tách (12%)

2.3

Công thức pha gel cô (5%)

3.1

Trình tự cặp mồi nhân bản đoạn gen seb đột biến từ vector GS45350

DANH MỤC BẢNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1 Hình ảnh các vi khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi điện tử

1.2 Các độc tố quyết định của S. aureus

1.4 Mô phỏng cấu trúc 3 chiều của protein SEB

1.5

Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của các tế bào T

2.1

Sơ đồ các bước thí nghiệm

3.1 Các axit amin sai khác giữa protein SEB đột biến và protein SEB kiểu dại 29

3.2

Sơ đồ vector GS45350 mang gen seb đột biến

3.3 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F và

mSEB- R

3.4 Điện di sản phẩm seb sau tinh sạch

3.5 Điện di plasmid pET21a+

3.6 Điện di plasmid pET21a+ sau khi cắt bằng các enzym hạn chế

3.7 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB vào tế bào khả biến E.

coli DH5α

3.8 Kết quả điện di colony-PCR để chọn dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ

hợp

3.9 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB của các dòng

khuẩn lạc

3.10 So sánh trình tự nucleotide của wtseb và mtseb bằng phần mềm Bioedit

3.11 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F và R

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

xii

3.12 Điện di so sánh protein tổng số của các tế bào E.coli BL21(DE3)

3.13 Điện di so sánh khả năng biểu hiện protein SEB ở các nhiệt độ khác nhau 45

3.14 So sánh khả năng biểu hiện protein SEB tại các điều kiện khác nhau

3.15 Điện di kiểm tra protein SEB dạng tan trước khi tinh sạch

3.16 Điện di kết quả tinh sạch protein SEB tái tổ hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

Thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn chứa các chất

có tính độc hại đối với người ăn là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến

trên toàn cầu, xảy ra ở các các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như

các nước lạc hậu, kém phát triển. Tại Việt Nam, trong những năm gần đây số vụ

nhiễm độc thực phẩm cũng ngày càng tăng và hậu quả ngày càng nghiêm trọng.

Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất ở

người và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau. Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể

do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột

chiếm ưu thế về số lượng. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với

nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S.

aureus. Hiện nay, việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều

khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh. Vì vậy, việc xác định sự có

mặt SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm đóng vai trò hết sức quan trọng.

Trên thế giới và tại Việt Nam hiện nay cũng đã phát triển các loại kít phát hiện

nhanh tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch, phương pháp này

đòi hỏi cần có kháng thể đặc hiệu. Do vậy việc biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên

SEB tái tổ hợp không có độc tính, có khả năng gây phản ứng miễn dịch tạo các

kháng thể IgG đặc hiệu là cấp thiết.

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo đột

biến khử độc và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal

enterotoxin B (SEB) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện tụ cầu vàng trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

thực phẩm. ”

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung

Nghiên cứu hệ thống biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp

staphylococcal enterotoxin B (SEB) đã được gây đột biến loại độc tính phục vụ cho

việc chế tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng (S. aureus) trong thực phẩm.

Mục tiêu cụ thể

- Thiết kế hệ vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB đã

được gây đột biến loại độc tính.

- Biểu hiện và tinh sạch protein SEB trong tế bào vi khuẩn E. coli tạo nguyên liệu

tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng trong thực phẩm.

Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được mục tiêu đặt ra, đề tài thực hiện những nội dung chính sau:

- Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB đã

được gây đột biến loại độc tính.

- Nghiên cứu các điều kiện để tối ưu khả năng biểu hiện protein SEB trong tế bào vi

khuẩn E. coli.

- Tinh sạch protein SEB để sử dụng làm nguyên liệu tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cầu vàng trong thực phẩm.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố

ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam

1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị nhiễm

vi khuẩn hoặc độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn có chứa các chất độc hại đối với

người ăn. Bệnh có tính chất đột ngột, có thể nhiễm độc cho nhiều người tại cùng

một thời điểm khi họ tiêu thụ cùng 1 loại thức ăn. Ngộ độc thực phẩm có những

triệu chứng của một bệnh cấp tính như nôn mửa, tiêu chảy .v.v hoặc kèm theo các

triệu chứng khác tùy theo từng loại tác nhân gây ngộ độc [43].

Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hoá, việc sản xuất và phân phối sản

phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn đến khả năng lan tràn

khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm. Đồng thời, trong quá trình công

nghiệp hoá, thực phẩm thường được sản xuất hàng loạt, đã làm số ca mắc các bệnh

do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [21]. Hậu quả và

thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày

càng tăng.

Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm: vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus;

trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% ca bệnh và tử vong ở người [9]. Trong số

các nguyên nhân đã được xác định, một số vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc cấp

tính rất nguy hiểm, với tỷ lệ tử vong cao như: Staphylococcus aureus, Listeria

monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio chlolera, Samonella aureuslmonella,

Campylobacterer, Yersinia enterocolitica .v.v [12]. Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng

(S. aureus) là nguyên nhân hàng đầu gây ra ngộ độc [2] .

Thực phẩm ô nhiễm các vi sinh vật và các độc tố của chúng là một trong

những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở các các nước có nền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu, kém phát triển [37]. Tại

Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa dạng, thường gặp

nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), thịt hun khói (100%), xúc xích

(96,6%), bánh gato (85%), Patê (83,3%) v.v. Đáng chú ý là vi khuẩn S. aureus

thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn [5].

1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc

tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam

Tụ cầu S. aureus là một trong những loài vi khuẩn gây bệnh được ghi nhận

sớm nhất vào đầu những năm 1880. Sự liên quan của tụ cầu tới nhiễm trùng, nhiễm

độc thức ăn được biết đến từ năm 1914, nhưng mãi tới năm 1930, Dack và cs mới

xác định được nhiễm trùng, nhiễm độc tụ cầu có thể gây ra bởi các độc tố ruột có

trong dịch nuôi cấy tụ cầu vàng [4].

Từ giữa những năm 1969 và 1990, tại Anh, 53% trường hợp ngộ độc thực

phẩm do S. aureus được ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc biệt là

ruốc); 22% các trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên quan sữa, 7%

từ cá, sò, ốc .v.v và 3,5% từ trứng [38]. Tại Pháp, trong số các thực phẩm nhiễm S.

aureus được ghi nhận trong hai năm (1999-2000) có các sản phẩm từ sữa (đặc biệt

là pho-mát) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá và hải sản (11%), trứng và các

sản phẩm từ trứng (11%) hoặc các sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%) [17]. Tại Hoa

Kỳ, trong số các trường hợp ngộ độc thực phẩm do S. aureus được báo cáo giữa các

năm 1975 và 1982 thì 36% là do tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát,

11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt: 5,1% đến 1,4%, còn lại là từ các sản phẩm liên

quan tới sữa và hải sản [41]. Như vậy, giữa các nước khác nhau loại thực phẩm dễ

nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau.

Cho tới nay tại Việt Nam thực tế chưa có những thống kê cụ thể về số ca mắc

hay tử vong do ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB. Có nhiều nguyên nhân gây

khó khăn cho quá trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do SEB: 1)

Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các cơ sở chuyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

khoa; 2) Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thường có nhiều bệnh có biểu

hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chưa kết luận đúng bệnh; 3) Việc tiến hành

các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột

SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá mới mẻ, chủ yếu vẫn dựa vào

các phương pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức và thời gian kéo dài. Do đó,

khi bệnh nhân nhiễm độc tụ cầu và các nội độc tố như SEB sẽ gặp nguy hiểm gấp

bội vì SEB là một siêu kháng nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh , có thể dẫn

tới tử vong ở người.

Số người

Đặc điểm

STT

Địa điểm

Thời gian

mắc bệnh

bệnh nhân

1 Mầm non bán công Vĩnh Thọ - Phú Thọ

9/2007

100

Học sinh

Mầm non Vườn Hồng, P9 - Tân Bình; Tiểu học Âu

Trẻ em

12/ 2007

Cơ, Q11 - TP HCM

(từ 2-5 tuổi)

3 Minh Long - Quảng Ngãi

2/2008

Người dân

Khách dự

4 Hà Nội

5/2008

122

đám cưới

100

Công nhân

5 Cty TNHH Alliace One, KCN Giao Long, Bến Tre

6/2008

6 Sơn La

581

9/2008

Người dân

Học sinh và

7 Tiểu học Tam Bình, Q. Thủ Đức -TP HCM

11/ 2008

phụ huynh

Cty Phú Nguyên, KCN An Đồng

8/2009

160

Công nhân

Hải Dương

Bảng 1.1. Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 – 2009.

Dựa theo bảng 1.2 trên đây, chúng tôi nhận thấy tình trạng xuất hiện vi sinh

vật S. aureus ở các loại thực phẩm diễn ra khá phổ biến trong cả nước. Vi khuẩn có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

thể gây ngộ độc cấp tính cho nhiều người trong cùng một thời điểm khi họ cùng tiêu

thụ một loại thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus có thể xảy ra với bất kì

đối tượng nào. Tuy nhiên, người già, trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém sẽ

dễ mắc và biểu hiện triệu chứng nhiễm độc nặng nề hơn [3].

Việc tìm ra phương pháp phát hiện sớm S. aureus và độc tố SEB của nó gây

nhiễm trùng nhiễm độc trực tiếp trên thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng và cấp

thiết, nhằm loại bỏ và có biện pháp xử lý sớm đối với các thực phẩm đang nhiễm

độc nhiễm trùng. Chính vì vậy, việc tiến hành đề tài này sẽ là một nhu cầu thực tiễn

và cấp bách.

1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus

1.2.1. Đặc điểm phân loại

Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ

Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài Staphyococcus

aureus.

- Tên khoa học: Staphyococcus aureus Rosenbach 1884 [6].

Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chính: tụ

cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase. S. aureus gây bệnh ngộ độc thực

phẩm là tụ cầu có coagulase. Nhờ enzym này mà trên môi trường nuôi cấy có máu,

vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn được gọi là tụ cầu vàng.

Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng

nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn. Nhưng dựa

vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn.

Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các nhóm

I, II, III, IV. Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại S. aureus [4].

1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn học

1.2.2.1. Hình dạng và kích thƣớc

Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với “staphyle” có nghĩa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

chùm nho) là những cầu khuẩn có đường kính khoảng 1 μm, không di động và sắp

xếp theo mọi hướng tạo thành cụm (tụ) trông giống như chùm nho. Chúng là các

cầu khuẩn Gram dương, không có lông, không tạo nha bào và thường không có vỏ

(Hình 1.1).

Hình 1.1. Hình ảnh các vi khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi điện tử.

Ngoài ra, cầu khuẩn S. aureus không có khả năng tạo bào tử như các vi khuẩn

Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum, và Bacillus cereus cũng

thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn [41].

1.2.2.2. Độc tố và khả năng gây bệnh

- Các loại độc tố

Tụ cầu vàng sản sinh ra 11 độc tố (hình 1.2): độc tố gây hội chứng sốc nhiễm

độc (TSST-Toxic shock syndrome toxin); độc tố exfoliatin hay độc tố epidermolitic;

độc tố alpha; độc tố bạch cầu (leucocidin); ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic); dung

huyết tố (hemolysin hay staphylolysin); fribrinolysin (staphylokinase); coagulase;

hyaluronidase; β – lactamase và độc tố ruột (enterotoxin) – trong đó có SEB [4].

Ngoài ra, tụ cầu có hệ enzym phong phú góp phần làm tăng độc lực của chúng đối

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

với các tế bào vật chủ.

Hình 1.2. Các độc tố quyết định của S. aureus

(Nguồn: http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/staph.html)

Độc tố ruột được sản xuất bởi phần lớn các chủng tụ cầu vàng, nhưng không

phải là tất cả mọi chủng. Các độc tố này là những protein tương đối bền với nhiệt,

nên không bị phá hủy bởi sự đun nấu, có trọng lượng phân tử từ 28000-30000

Dalton và bao gồm 6 loại (type) được ký hiệu từ A tới E [4]. Ono và cs (2008), đã

phát hiện ra 2 loại độc tố mới là SES và SET cũng nằm trong nhóm những độc tố

ruột do S. aureus tạo ra [27]. Về miễn dịch, các loại này được phân biệt khá rõ ràng,

mặc dù giữa chúng có những kháng nguyên chéo. Về cơ chế gây bệnh, độc tố ruột

kích thích miễn dịch ở cơ thể vật chủ tạo ra một lượng lớn interleukin I và II. Các

enterotoxin có thể được xác định bằng các kỹ thuật miễn dịch [4]. Trong các dạng

độc tố ruột do S. aureus sinh ra thì các độc tố SEA, B, C và D là những độc tố

thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do độc tố của tụ cầu. Ngoài ra

SEB còn là một trong những nhóm độc tố do vi sinh vật sản sinh ra được liệt kê

trong danh mục vũ khí sinh học dùng để tấn công khủng bố sinh học và chiến tranh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

sinh học [16].

- Cơ chế gây bệnh

Việc tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý

nghĩa quan trọng trong quá trình phòng chống bệnh. Bước quan trọng đầu tiên trong

quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính (adherence)

của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ. Các bề mặt này bao gồm da,

niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) và các tổ chức sâu hơn (tổ chức

lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô). Giống như các vi

khuẩn Gram dương khác là Streptococcus và Mycobacteria, S. aureus bám dích vào

bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide. Một khi đã bám dính vào

bề mặt tế bào vật chủ, tác nhân gây bệnh như S. aureus mới có khả năng khởi động

các quá trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm nhập và

hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ. S. aureus sẽ tiếp tục tiến sâu vào

trong cơ thể vật chủ để tiếp tục chu trình xâm nhập (invasion). S. aureus xâm nhập

ngoại bào bằng cách tiết một số enzym như: hyaluronidase; hemolysine, leukocidin;

exfoliatine .v.v, phá hủy các thành phần cấu tạo tế bào vật chủ [44, 45].

Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc

do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. Nguyên nhân là

sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi

khuẩn đường ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt, tạo điều kiện thuận lợi cho tụ

cầu vàng tăng trưởng về số lượng. Ngoài bệnh nguyên do là tụ cầu, một số trường

hợp có thêm vai trò của vi khuẩn Clostridium difficile [4]. Ước tính khoảng 0,1 μg

S. aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở người. Tuy nhiên, lượng này cũng có thể

thay đổi tùy thuộc độ nhạy cảm với tác nhân ở mỗi bệnh nhân [14, 41].

- Triệu chứng ngộ độc thức ăn do nhiễm tụ cầu vàng Staphylococcus aureus

Ngộ độc thức ăn do tụ cầu S. aureus và độc tố của nó thường có các triệu

chứng cấp tính. Thời gian ủ bệnh của tụ cầu vàng ngắn hơn (chỉ 1-6 giờ) thời gian ủ

bệnh của nhóm vi khuẩn đường ruột gây ngộ độc thức ăn khác (trung bình 2-3 giờ).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bệnh nhân ngộ độc thức ăn do tụ cầu xuất hiện các triệu chứng nôn ói, đau quặn

bụng và tiêu chảy dữ dội, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước. Triệu

chứng tiêu chảy do tụ cầu cũng không kèm theo máu và ít mất nước hơn so với tả

và E. coli. Bệnh nhân không sốt hay phát ban, đây là đặc điểm để phân biệt giữa

ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng với các nhóm vi khuẩn khác; thần kinh người

bệnh bình thường. Phần lớn trường hợp bệnh tự khỏi và hồi phục trong vòng 8-24

giờ sau khởi phát nhưng trường hợp nặng có thể bị tụt huyết áp và gây tử vong.

Bệnh nhân ngoài ra có thể bị sốc do mất nhiều nước và chất điện giải. Khác với ngộ

độc thực phẩm do vi khuẩn thông thường không gây sốt hoặc sốt nhẹ, bệnh nhân

mắc ngộ độc do độc tố SEB của S. aureus sẽ bị sốt cao [3].

1.2.3. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus

Hiện nay người ta cũng đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng tụ

cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315,

Mu50, RF122 .v.v. [7, 15, 19, 8, 23, 18]. Ví dụ: Steven và cs đã thành công trong

việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S. aureus COL. Kết quả giải

trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen nhân và

CP000045 cho hệ gen plasmid. Theo đó, trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít các

cặp G-C, điều này gây ra mối quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng

tới các tác nhân gây bệnh Gram dương khác [34].

Trong số các chủng S. aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ giống

enterotoxigenic được ước tính khoảng 25% [10]. Tại Pháp, trong số 61 chủng phân

lập từ pho-mát và sữa tươi có 15,9% chủng là giống enterotoxigenic [30]. Ở Pháp,

trong 332 chủng S. aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa

các gen seg, seh, sei và sej xuất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen sea và

see, trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế [29, 41].

1.3. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B

1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B

SEB là 1 trong các nội độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn S. aureus. Thông

chuyển ion và nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin (độc tố ruột) [11].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

thường khi bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các hệ thống vận

Độc tố ruột SEB bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ

ngộ độc thực phẩm do S. aureus [11]. Độc tố ruột SEB được hình thành khi tụ cầu

S. aureus sống trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ môi trường gia tăng đột

ngột, thiếu oxy, sự mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu .v.v [3].

Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn S. aureus

nên SEB được nghiên cứu khá chi tiết. Trình tự axit amin của SEB đã được xác

định từ năm 1970 [20]. Giống như các cấu trúc protein ngoại bào khác của S.aureus

thường được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy hay trong thực phẩm bị ô nhiễm,

protein SEB bao gồm một trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 axit amin ở đầu

N’. Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB tiết ra ngoài môi trường

nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhất định. SEB dạng hoạt

động trong môi trường ngoài tế bào gồm 239 amino axit trong 1 chuỗi polypeptit

đơn, có khối lượng phân tử khoảng 28,336 KDa. Ở dạng hoạt động protein SEB có

cấu trúc gồm: 7 cấu trúc xoắn α, 14 phiến gấp nếp β và một cầu nối disulphit nối

cystein ở vị trí 120 và 140 [46]. Theo Gleason và cs (2009), protein SEB có 2 vùng

cấu trúc đặc biệt phức tạp được đóng gói nhỏ gọn chặt chẽ nên cho phép SEB chống

lại sự tác động của các proteases, gồm trypsin, chymotrypsin và papain có trong

ruột [11].

Staphylococcal enterotoxin B có cấu trúc và đặc tính sinh học gần giống với

các độc tố ruột khác là A, C, D, E, F, G ,S, T cùng do vi khuẩn S. aureus tạo ra. Đặc

biệt, trình tự axit amin của SEB có mối tương đồng cao với trình tự axit amin độc tố

ruột C1 cũng có 239 axit amin [13]. SEB chỉ thiếu các vị trí bám của kẽm so với các

siêu kháng nguyên staphylococcal enterotoxin A, C2 và D chỉ có một vị trí bám trên

phân tử MHC nhóm II. Phân tích chi tiết vị trí bám trên TCR của các kháng nguyên

SEA, SEB và SEC2 sẽ chỉ ra sự khác biệt dẫn tới hiệu quả bám lên vùng Vβ [11].

Năm 1986, Christopher và cs đã xác định thành công trình tự gen seb của

chủng vi khuẩn S. aureus S6. Theo đó, trình tự của 1 gen seb hoàn thiện được tính

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

từ codon mở đầu ATG ở vị trí nucleotide 244, sau đó là vùng khung đọc mở gồm

798 nucleotide, và kết thúc tại codon TGA tại vị trí nucleotide thứ 1042 [13]. Đoạn

gen seb phân lập từ các chủng được phân lập từ nhiều vùng địa lý khác nhau đã

được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết. Trình tự gen seb của các chủng

khác nhau như PM36 (AB479118, ATCC14458, AY518386), COL (CP000046,

AF410775) .v.v đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) [26, 15, 40].

Cấu trúc tinh thể của protein SEB trình bày ở hình 1.4 được xác định ở độ

phân giải 1,5 A là độ phân giải cao nhất cho đến nay dành cho 1 siêu kháng nguyên.

(Nguồn : http//www.pdb.org/pdb/explore.do?structureId=3SEB )

Hình 1.4. Mô phỏng cấu trúc 3 chiều của protein SEB

1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B

Staphylococcal enterotoxin B (SEB) là trung gian kích thích các lympho T ở

hệ miễn dịch của các vật chủ. Các độc tố liên kết trực tiếp đến phức hợp protein

(MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích, sau đó kích thích gia tăng số lượng lớn các

lympho T. SEB được coi là một "siêu kháng nguyên” của vi khuẩn vì có thể tạo

thành một “cầu nối” giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện kháng nguyên và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

vùng Vβ của các thụ thể tế bào T như CD 4, CD 8; từ đó, kích thích hoạt hóa các tế

bào T biểu hiện các đoạn gen Vβ mà không cần thiết phải có một quá trình chế biến

và trình diện thông thường. Điều này gây ra sự sản sinh một số lượng lớn của

cytokine, interleukin 2 (IL-2), các yếu tố hoại tử khối u β (TNF-β), và các

interferon. Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnh nhân có các triệu chứng như chán ăn,

buồn nôn, nôn, và tiêu chảy. Các triệu chứng này xuất hiện là do các cytokine trong

các tế bào T của lông ruột được sinh ra ồ ạt [11].

Siêu kháng nguyên bám trực tiếp vào phức hợp MHC lớp II của tế bào trình diện kháng nguyên

bên ngoài vị trí bám thông thường của kháng nguyên. 1/5 các tế bào T trong cơ thể bị kích thích

sản xuất cytokin một cách ồ ạt gây lên hiện tượng shock độc tính trong cơ thể.

(Nguồn: http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/staph.html)

Hình 1.5 Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của các tế bào T.

SEB dễ dàng hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định. SEB có

khả năng chịu tác động cơ học ở mức vừa phải và có thể chịu được nhiệt độ sôi

trong vài phút. Nếu được bảo quản trong môi trường đông lạnh khô, SEB có thể

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

được lưu trữ trong hơn một năm [11].

1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng

Công nghệ sinh học hiện đại có khả năng tạo ra các protein tái tổ hợp ứng

dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có y sinh học. Biểu hiện gen seb thành protein

tái tổ hợp không độc phục vụ nghiên cứu tạo vaccine cũng được quan tâm nghiên

cứu từ khá sớm. Năm 2002, Lee và cs đã nghiên cứu tạo vaccine tiềm năng phòng

chống SEB dựa trên việc sử dụng hệ vector từ virus mang gen mã hóa SEB đột

biến. Chuột sau khi tiêm vaccine này có khả năng chống lại được 5 liều trung bình

SEB [24]. Tiếp đó, Woody và cs, (1997) đã nghiên cứu tạo được 2 loại protein SEB

mang đột biến thay thế asparagine bằng lysine tại vị trí 23 (N23K) và phenylalanine

bằng serine tại vị trí 44 (F44S) trên trình tự polypeptid SEB không độc. Theo đó,

khi thử nghiệm 10µg SEB N23K và F44S (tương đương liều 30 LD50) đã không gây

chết chuột thử nghiệm. Một điều thú vị là mặc dù protein SEB N23K và F44S thử

nghiệm ở liều lượng thấp nhưng vẫn được phát hiện bởi phương pháp miễn dịch

liên kết enzym ELISA nhờ kháng thể đa dòng kháng SEB. Sử dụng SEB tái tổ hợp

N23K, F44S sẽ thúc đấy phản ứng kháng SEB bảo vệ 80 - 87% chuột [39]. Ngoài

ra, Lowell và cs cũng đã nghiên cứu tạo được vaccine proteosome SEB có hiệu quả

miễn dịch 100% cả trong cơ và trong thể dịch ở khỉ [25].

Swaminathan và cs (1992) đã nhận thấy những thay đổi nhỏ trên bề mặt phân

tử SEB tại vị trí hoạt động rãnh 4α tạo ra các SEB không độc trong khi vẫn bảo thủ

khả năng miễn dịch của phân tử [35]. Năm 1994, Thibodeau đã phân tích cấu trúc

tinh thể SEB đột biến và tìm ra vị trí hoạt động gây nên triệu chứng nôn mửa gồm

14 axit amin nằm trong vùng từ axit amin 113 – 126 (rãnh α4). 14 axit amin này nối

vùng 1 và 2 của phân tử SEB và trong 14 axit amin có 11 axit amin là giống nhau

với mọi SEs [36].Tại rãnh α4 có từ 3 tới 5 vị trí có histidine (H32, H121, và H166)

rất quan trọng cho các tế bào T (TCR - T Cell Receptor) bám vào. Năm 1982,

Stelma và Bergdoll đã khá thành công trong nghiên cứu làm giảm độc tính của SEA

và SEB bằng cách methyl hóa nhóm carboxyl ở các phân tử histidin trong cấu trúc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

protein SEB [33]. Vì tyrosine có cấu trúc gần giống histidine nên thay thế histidine

tích điện dương bằng tyrosine ưa nước sẽ không làm thay đổi cấu trúc bề mặt phân

tử, do đó có thể thay thế việc methyl hóa nhóm carbonxyl của histidine ở thí nghiệm

trên. Các phân tử SEA, SEB khi được methyl hóa nhóm carbonxyl của các histidine

không những có thể làm giảm độc tính của các kháng nguyên mà còn bảo tồn được

khả năng gây miễn dịch của chúng [33, 28]. Dựa trên cơ sở đó, năm 2003, Korolev

và cs đã nghiên cứu tạo 4 đột biến điểm thay thế các axit amin histidine bởi các

tyrosine tại 4 vị trí có codon mã hóa cho histidine (codon 12; 32; 105 và 121). Tác

giả Savransky và cs sau đó 1 năm (2004) cũng khẳng định SEB mang 4 đột biến

thay thế histidine bằng tyrosine tại vị trí các codon 12; 32; 105 và 121 đã tạo ra một

kháng nguyên tái tổ hợp không mang độc tố, và có khả năng kích ứng ở mức độ cao

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

các kháng thể IgG đặc hiệu [22, 31, 32].

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid

Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng DH5α và BL21(DE3) được

sử dụng cho mục đích tách dòng và biểu hiện protein SEB, vector tách dòng

GS45350 mang đoạn gen mã hóa cho protein SEB đã được gây đột biến và vector

pET21a+ (Novagen) được sử dụng làm vector biểu hiện protein tái tổ hợp do Phòng

Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

2.1.2. Các bộ kít

- Kít tinh sạch ADN (AccuPrep® Gel Purification Kit) (Bioneer, Hàn Quốc)

- Kít tách chiết plasmid (Plasmid Extraction Kit) (Bioneer, Hàn Quốc)

2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị

- Hóa chất: Bacto pepton, yeast extract, NaCl, agarose, glucose, trypton, KCl, Tris

HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol 70%, các dung dịch

đệm muối phosphate, nước khử ion. Kháng sinh ampicillin và các loại hóa chất

thông dụng khác (ethidium bromide, .v.v.), các loại enzym cắt giới hạn (EcoRI,

HindIII), Taq ADN polymerase và Pfu turbo ADN polymerase được mua từ các

hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham do Phòng Công nghệ tế bào

thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

- Máy móc và thiết bị: Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện

di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi ADN (Mini-transllumminatior, Bio-Rad,

Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex

(Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant,

Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các trang thiết bị khác của

Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Viện Công nghệ sinh học.

2.1.4. Môi trƣờng và đệm

Môi trường cho vi khuẩn và các loại đệm sử dụng trong nghiên cứu được

chuẩn bị theo Sambrook và cs (1998) hoặc theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.1.5. Cặp mồi sử dụng

Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này để tạo các điểm cắt của hai enzym giới

hạn là EcoRI và HindIII ở hai đầu đoạn gen mã hoá cho protein SEB (đã được gây

đột biến thay thế nucleotide nhằm mục đích loại bỏ tính độc của protein này):

mSEB-F và mSEB-R.

2.1.6. Phần mềm

Thiết kế mồi, và dữ liệu trình tự ADN được xử lý bằng phần mềm Lasergene

version 7 của DNASTAR Inc., Mỹ; BLAST (Basic Local Alignment Search Tool;

Altschul et al., 1990); BioEdit version 7 (Tom Hall, Department of Microbiology ,

North Carolina State University, NC) và Primer3 Input Version 4 [42].

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ như mô tả tại hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ các bước thí nghiệm

2.2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.2.1. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Nguyên lý:

Kỹ thuật tổng hợp ADN nhân tạo cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của

sao chép ADN trong tế bào vi sinh vật như: Đoạn ADN cần được mở xoắn thành 2

mạch đơn, cần có các cặp mồi xuôi, ngược, cần nguyên liệu và điều kiện môi trường

thích hợp và enzym ADN polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (94oC) để biến tính chuỗi ADN sợi kép, kết hợp với enzym Taq ADN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn

phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động. Kỹ thuật PCR

nhân bản lượng lớn ADN chỉ với một lượng nhỏ ADN ban đầu.

Tiến hành:

- Sau khi đo nồ ng độ ADN khuôn , tính và tạo các nồng độ ADN của các m ẫu

như nhau để khi đưa và o mỗi ống phản ứng thể tí ch ADN khuôn được giống nhau ,

và đạt khoảng 50ng trong tổng thể tích là 25µl/ 1 phản ứng.

- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các thành

phần rồi chia vào các ống đã có khuôn ADN.

- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy.

Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

16 Nước khử ion vô trùng

Dung dịch đệm (10X) 2.5

dNTPs (10mM) 2

Primer mSEB-F (100ng/µl) 1,25

Primer mSEB-R (100ng/µl) 1,25

Taq ADN polymerase hoặc Pfu

turbo ADN polymerase (2.5u/µl ) 1

Vector GS45350/SEB (50 ng/µl) 1

Tổng thể tích 25

Phản ứng PCR được thực hiện với chu kì nhiệt như sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 2.1. Chu kì phản ứng PCR

Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kì

1 Biến tính 94 3 phút

2 Biến tính 94 30 giây

3 Gắn mồi 55 30 giây 30

4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 45 giây

5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút

6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

2.2.2.2. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Nguyên lý:

Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR cũng dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR,

chỉ khác ở mẫu ADN được thay thế bằng ADN plasmid được giải phóng từ khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao 94oC đến 95oC, màng tế bào bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ

hợp. Plasmid tái tổ hợp sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi

đặc hiệu, hoặc mồi vector.

Tiến hành:

Hòa tan tế bào vi khuẩn trong 25µl nước khử ion. Sau đó sử dụng 5µl hỗn hợp

này để dùng cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR được thực hiện như mô tả tại mục

2.2.2.1.

2.2.2.3. Phƣơng pháp xử lý enzym hạn chế

Nguyên lý:

Enzym hạn chế là các nuclease nội bào (endonuclease) có khả năng nhận biết

và cắt các đoạn ADN tại các vị trí với trình tự nucleotide nhất định. Trong nghiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cứu này hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII được sử dụng với các mục đích bao

gồm: i) để tạo đầu cắt so le cho gen seb sau khi đã được nhân bản bằng phản ứng

PCR từ vector tách dòng GS45350; ii) để mở vòng vector biểu hiện pET21a+ để sử

dụng cho phản ứng kết nối với gen seb; iii) để kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+

mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) sau

khi được chuyển vector này. Về nguyên tắc thành phần phản ứng cắt enzym hạn chế

không khác nhau, điểm khác nhau chỉ có là thể tích của các thành phần sẽ được điều

chỉnh thích hợp với mỗi mục đích và ADN mẫu.

Tiến hành:

Phản ứng cắt mở vòng vector pET21a+ được thực hiện với các thành phần như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

4 Nước khử ion vô trùng

Đệm R (10X) 1,5

Enzym EcoRI (10u/µl) 1

Enzym HindIII (10u/µl) 1

Plasmid pET 21a+ 7,5

Tổng thể tích 15

Phản ứng tạo đầu cắt so le cho gen seb sau khi đã được nhân bản bằng phản

ứng PCR từ vector tách dòng GS45350 được thực hiện với các thành phần như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

12 Nước khử ion vô trùng

Đệm R (10X) 5

Enzym EcoRI (10u/µl) 1,5

Enzym HindIII (10u/µl) 1,5

Sản phẩm PCR 30

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Tổng thể tích 50

Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ

các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) thực hiện với các thành phần

như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

2 Nước khử ion vô trùng

Đệm R (10X) 1

Enzym EcoRI (10u/µl) 1

Enzym HindIII (10u/µl) 1

Vector pET 21a+/SEB 5

Tổng thể tích 10

Thành phần phản ứng được trộn đều và tiến hành trong 2 giờ ở nhiệt độ 37oC,

sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.

2.2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch ADN từ gel agarose

Nguyên lý:

Phương pháp này được áp dụng để tinh sạch đoạn ADN quan tâm từ bản điện

di trên gel agarose. Trong trường hợp này, đoạn gen seb sau khi được nhân bản

bằng phản ứng PCR từ vector GS45350 sẽ được tinh sạch để làm nguyên liệu cho

các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu. Trong phương pháp này phân tử ADN

quan tâm sẽ được giữ lại trên cột tinh sạch có bản chất là các hạt sepharose, sau đó

sử dụng đệm để thu lại các phân tử ADN này. Thông qua phương pháp này mẫu

ADN sẽ đủ tinh sạch để tiến hành các phản ứng khác như xử lý enzym hạn chế hay

kết nối với vector.

Tiến hành:

- Cắt vùng gel chứa đoạn ADN quan tâm trên bản điện di.

- Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1 µl thể tích.

- Bổ sung dịch kết gắn ADN vào cột tinh sạch GB (Gel Binding), theo tỉ lệ:

Vmẫu:VGB = 1:3.

- Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút và cứ 2 phút thì đảo nhẹ 1 lần cho đến khi

gel tan hoàn toàn.

- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết ADN và ly tâm 13000 v/p trong 1

phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.

- Tiếp tục bổ sung đệm rửa 500µl WB (Washing Buffer), ly tâm 13000 v/p

trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút

để loại đệm WB.

- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới 1,5ml. Bổ sung 30-50µl nước khử ion

khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút để thu mẫu

ADN.

2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector

Nguyên lý:

T4 ligase xúc tác tạo liên kết phosphatdieste bằng cách liên kết đầu 5’

phosphat trong phân tử ADN hoặc ARN này với đầu 3’ hydroxyl của phân tử ADN

hoặc ARN kia do vậy mà có thể nối 2 sợi ADN hoặc ARN khác nhau. Vector biểu

hiện tái tổ hợp được thiết kế bằng cách ghép đoạn gen seb và plasmid pET21a+ sau

khi đã xử lý bởi hai enzym giới hạn là EcoRI và HindIII.

Tiến hành:

- Tính nồng độ vector và nồng độ mẫu ADN trong trường hợp nối đầu so le (tỉ

lệ về số mol giữa vector : đoạn seb chèn là 1:4)

- Tính các thành phần còn lại cho 1 phản ứng và mix phản ứng.

Phản ứng kết nối đoạn ADN vừa tinh sạch vào vector tách dòng được thực

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

hiện trong hỗn hợp sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

2 Nước khử ion

Đệm T4 ligase (10X) 2

Gen seb (100ng) 12

Plasmid pET21+ (20ng) 2

Enzym T4 ligase (1u/1µl) 2

Tổng thể tích 20

Phản ứng kết nối được thực hiện trong 2 giờ ở nhiệt độ 22oC. Sau khi kết thúc,

hỗn hợp được dùng để biến nạp hoặc lưu giữ ở tủ -20oC.

2.2.2.6. Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia

coli DH5α

Nguyên lý:

Biến nạp là quá trình chuyển ADN trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có

khả năng tiếp nhận ADN được gọi là tế bào khả biến. Quá trình này gồm 2 giai

đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.

Tiến hành:

- Bổ sung 1µl ADN plasmid vào ống tế bào khả biến (50 - 100µl).

- Để ổn định trong đá trong vòng 15 phút.

- Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút.

- Bổ sung 400µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 220 v/p trong vòng

1giờ, 37oC.

- Cấy trải 100 - 150µl trên môi trường thạch LB chứa ampicillin.

- Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm.

2.2.2.7. Phƣơng pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyên lý:

Phương pháp tách chiết ADN plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa

chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn và biến tính

các phân tử protein. Khi thay đổi pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa

kali acetat, các phân tử protein và ADN hệ gen sẽ bị kết tủa, tách ra khỏi dung dịch

bằng ly tâm tốc độ cao. ADN plasmid được tủa lại bằng ethanol 100% hoặc

isopropanol. Lượng ARN còn tồn tại trong dung dịch chứa ADN plasmid được loại

bỏ bằng cách bổ sung RNase.

Tiến hành:

- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào Eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p

trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.

- Thêm 100µl dung dịch Sol I (50 mM gluco, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM

EDTA (pH 8)), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.

- Bổ sung 200µl dung dịch Sol II (0,2N NaOH; 1% SDS (trọng lượng/thể tích:

w/v)), đảo nhẹ.

- Thêm 150µl dung dịch Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH;

28,5 ml nước), đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút.

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.

- Bổ sung dung dịch chloroform : isoamyl (24:1) theo tỷ lệ 1:1.

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống Eppendorf 1.5ml mới.

- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ít nhất 20 phút.

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút, thu kết tủa.

- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500µl ethanol 70%, ly tâm 7000 v/p trong 1 phút.

- Làm khô ADN bằng máy Speed-vac 110A, sau đó thêm 50µl nước khử ion, để ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn. Plasmid có thể được bảo quản ở -20oC để

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.2.2.8. Biểu hiện protein staphylococcal enterotoxin B trong tế bào vi khuẩn

Escherichia coli chủng BL21(DE3)

Nguyên lý:

E. coli BL21(DE3) là chủng biểu hiện mang gen mã hóa enzym T7 RNA

polymerase trong genome. Khi trong môi trường có IPTG enzym này sẽ được kích

hoạt bám vào promoter của vector tái tổ hợp khởi động quá trình dịch mã sản xuất

protein SEB. Sau đó, dựa vào tác động vật lý của sóng siêu âm tế bào vỡ ra và giải

phóng protein nếu protein ở dạng hòa tan trong tế bào chất.

Tiến hành:

- Nuôi lỏng khuẩn lạc mong muốn trong 10 ml môi trường LB lỏng có kháng

sinh ampicillin ở nhiệt độ 37oC, lắc 220 v/p qua đêm.

- Hoạt hóa tế bào: Lấy 0,5 ml dịch khuẩn nuôi qua đêm chuyển sang 10 ml môi trường LB lỏng có kháng sinh như trên, nuôi ở 37oC, lắc 220 v/p trong 1-2 giờ

sao cho OD600 0,4-0,6.

- Cảm ứng bằng IPTG: Bổ sung IPTG ở các nồng độ 1mM vào dịch khuẩn thu được ở bước 2, nuôi lắc 220 v/p trong khoảng thời gian 3 giờ ở các nhiệt độ 37oC , hoặc 28oC.

- Thu khuẩn lạc vào ống Falcon 50ml, rửa cặn khuẩn bằng dung dịch đệm PBS

1X 3 lần. Bổ sung PBS 1X, hoàn tan tế bào vi khuẩn, ủ trong đá và tiến hành siêu

âm tế bào. Sau đó ly tâm 13000 v/p trong 15 phút.

- Định lượng protein thu được ở phần dịch nổi bằng phương pháp Bradford.

- Cặn khuẩn được rửa lại bằng dung dịch PBS 1X, sau đó bổ sung hỗ hợp ure

5M và PBS1 X theo tỉ lệ 1:3, hoà tan cặn.

- Protein thu được từ phần dịch nổi và cặn được kiểm tra bằng phương pháp

điện di trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE).

2.2.2.9. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyên lý chung:

Điện di là kĩ thuật được dùng để phân tách các protein dựa trên cơ sở kích

thước, khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện được

đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc

cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng.

Tiến hành:

Điện di protein được tiến hành trên gel polyacrylamide chuẩn bị với thành

phần như sau:

Bảng 2.2. Công thức pha gel tách (12%)

Nồng độ cuối các Thành phần 10ml thành phần trong gel 12 %

3,3 dH2O vô trùng

30% Acrylamid 12 % 4,0

Tris-HCl 1,5M; pH 8,8 0,375 M 2,5

10% SDS 0,1 % 0,1

10% APS 0,1 % 0,1

TEMED 0,002% 0,004

Bảng 2.3. Công thức pha gel cô (5%)

Nồng độ cuối các Thành phần 3ml thành phần trong gel 5 %

2,1 dH2O vô trùng

30% Acrylamid 5 % 0,5

Tris-HCl 1M; pH 6,8 0,13 M 0,38

10% SDS 0,1 % 0,03

10% APS 0,1 % 0,03

TEMED 0,001% 0,003

2.2.2.10. Phƣơng pháp tinh sạch protein Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyên lý:

Protein tái tổ hợp thu được dưới dạng dung hợp có đuôi His-tag nên dễ dàng

tinh sạch thông qua phương pháp sắc kí ái lực sử dụng cột nikel.

Tiến hành:

Tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp

được nuôi trong 100ml môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin và cảm ứng IPTG

với nồng độ cuối cùng là 1mM trong khoảng thời gian 5 giờ trên máy lắc 220 v/p ở nhiệt độ 28oC.

- Ly tâm 8000 v/p trong 15 phút 400ml dịch khuẩn rồi tiến hành thu cặn.

- Thêm 15ml dung dịch đệm gắn (Binding buffer).

- Ủ trong đá 15phút.

- Tiến hành siêu âm để phá vỡ thành tế bào với chu kỳ 20 giây/lần, nghỉ 20

giây trong 1 tiếng 30 phút.

- Chia nhỏ dung dịch ra các ống Eppendorf 2ml rồi tiến hành ly tâm 13000 v/p

trong 10 phút rồi thu dịch.

- Phần dịch nổi có chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột ProBond Nickel-

Chelating Resin đã chuẩn bị trước.

- Lắc nhẹ cột trên máy vortex trong thời gian 15 phút ở nhiệt độ phòng để

protein tái tổ hợp liên kết với Ni++.

- Các protein không có ái lực Ni++ sẽ bị đẩy ra khỏi cột bằng cách rửa cột

nhiều lần bằng các đệm thôi (Elution buffer).

- Rửa cột bằng dung dịch đệm rửa (Native wash buffer) với thành phần: 50ml

dung dịch đệm tinh sạch (Native purification buffer) (250mM NaH2PO4, pH=8.0,

2,5M NaCl), 335μl dung dịch imidazole 3M, pH 6,0, chuẩn pH 8,0. Rửa cột 3 lần,

mỗi lần 3ml.

- Protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột bằng đệm thôi (Native elution buffer)

có thành phần 50mM NaH2PO4 pH 8,0; 500 mM NaCl, 250 mM imidazole và được

kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.1. Kết quả tạo đột biến và nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện

Kết quả tạo đột biến trên gen seb:

Theo những nghiên cứu trước đây, protein SEB được thay thế histidine bằng

tyrosine (ngoại trừ phân tử SEB thay thế cả 4 histidine tại 4 vị trí khác nhau trên

phân tử SEB bằng tyrosine) vẫn giữ nguyên độc tính không khác SEB chưa được

gây đột biến khử độc (wild-type SEB) [22]. Bên cạnh đó, qua kiểm tra khả năng

bám dính MHC, Korolev và cs khẳng định việc thay thế 4 tyrosine cho 4 histidine

tại 4 vị trí khác nhau trên phân tử SEB không những làm giảm độc tính mà còn

không làm mất đi khả năng bám dính của SEB vào HLA DR4,4. Kết quả này 1 năm

sau đó đã được khẳng định lại bởi Sarvansky và cs vào năm 2004. Nhóm nghiên

cứu đã đưa ra kết luận protein SEB mang 4 đột biến thay thế histidine bằng tyrosine

tại các vị trí axit amin 12; 32; 105 và 121 không mang độc tố, và có khả năng kích

ứng ở mức độ cao các kháng thể IgG đặc hiệu [31, 22]. Dựa trên những cơ sở khoa

học trên, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã thiết kế

gen seb đột biến thay thế T bởi C tại các vị trí nucleotide số 37, 97, 316, 369 (tương

ứng với thay thế axit amin histidine bằng tyrosine tại vị trí 12; 32; 105 và 121 trên

trình tự protein SEB) theo nguyên tắc tạo đột biến điểm bằng phản ứng PCR từ gen

wtseb của chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus S6. Gen seb đột biến sau đó được

đưa vào vector tách dòng GS45350 (hình 3.2)

Hình 3.1. Các axit amin sai khác giữa protein SEB đột biến và protein SEB kiểu dại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

(được đánh dấu màu đỏ). mtSEB: trình tự protein SEB đột biến; wtSEB: trình tự protein SEB kiểu dại

Hình 3.2. Sơ đồ vector GS45350 mang gen seb đột biến

3.1.1. Thiết kế mồi

Gen seb đột biến được đưa vào vector GS45350 không chứa đoạn mã hóa hai

enzym cần thiết cho quá trình kết nối với vector biểu hiện pET21a+ là EcoRI và

HindIII (Hình 3.2.). Chính vì vậy, điểm cắt của hai enzym này được bổ sung bằng

phản ứng PCR sử dụng cặp mồi chứa hai điểm nhận biết của EcoRI và HindIII.

Trình tự mồi này được thiết kế dựa trên trình tự gen seb đột biến với các thông số

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

được thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi nhân bản đoạn gen seb đột biến từ vector GS45350.

Tỉ lệ

Mồi

Trình tự mồi

Tm (0C)

G-C (%)

mSEB - F 5’- GGGGAATTCATGGAGAGTCAACCA - 3’

61.8

5’- CCCCAAGCTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGC

80.8

mSEB - R

53,7

TTTTTCTTTG - 3’

Trình tự 2 mồi được thiết kế thêm các điểm cắt của enzym hạn chế EcoRI

(GAATTC) và HindIII (AAGCTT) (được kí hiệu đậm và có gạch chân trên bảng

3.1) xuôi chiều với promotor của 2 vector và nằm sát ngay các bộ ba tận cùng của

đoạn gen. Hai enzym này sẽ tạo những đầu cắt so le phù hợp tại vector biểu hiện và

gen đích, đồng thời làm giảm khả năng tự đóng vòng khi phải mở vòng vector. Vì

EcoRI và HindIII là các enzym hạn chế có hoạt tính mạnh nên cần có 1 trình tự bao

ngoài điểm cắt của các enzym. Do đó, trong trình tự mồi chúng tôi thiết kế có trình

tự GGG và CCC nằm tại 2 đầu mút của mồi.

Trình tự mồi xuôi còn chứa codon khởi đầu (ATG), trình tự mồi ngược không

chỉ có codon kết thúc (TCA) đánh dấu điểm cuối của gen đích mà còn chứa trình tự

His-taq (GTG GTG GTG GTG GTG GTG) có ý nghĩa trong quá trình tinh sạch

protein đích sau này. Cả 2 mồi đều được thiết kế 1 đoạn trình tự bổ sung với 2 đoạn

trình tự đầu và cuối của gen seb tái tổ hợp.

Với thiết kế như trên chúng tôi sẽ nhân được nguyên vẹn chiều dài đoạn gen

và giữ đúng khung đọc thông suốt khi đưa vào vector biểu hiện pET21a+ từ vị trí

mở đầu trên vector, thông qua đoạn gen seb, 6 axit amin histidine và kết thúc ở bộ

ba kết thúc.

3.1.2. Kết quả PCR nhân gen seb

Trên cơ sở nguồn ADN plasmid GS45350 mang gen seb đột biến, chúng tôi

tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu mSEB- F và mSEB- R để

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

khuếch đại đoạn gen seb mang 4 đột biến với kích thước khoảng 800 bp. Qui trình

tiến hành, thành phần phản ứng và chu kì nhiệt của phản ứng PCR như mục 2.2.2.1.

Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1 %, kết quả thể hiện như sau:

Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB -

F và mSEB - R. M: thang ADN chuẩn 1 kb; 1: seb

Kết quả điện di cho thấy: với cặp mồi đặc hiệu mSEB - F và mSEB - R ta thu

được đoạn ADN đặc hiệu, rõ nét không có vạ ch phụ kè m theo , có kích thước

khoảng 800 bp đúng theo tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi. Do vậy, sản phẩm

PCR này được chúng tôi sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.

3.1.3. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb

Khi thiết kế mồi, chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzym

cắt hạn chế EcoRI và HindIII vào hai đầu đoạn gen seb. Do đó, chúng tôi sử dụng

chính hai enzym này để tạo đầu cắt so le phù hợp cho đoạn gen thu được sau khi

tinh sạch sản phẩm của phản ứng. Thành phần phản ứng cắt seb bằng hai enzym

EcoRI và HindIII như mục 2.2.2.3.

Sản phẩm PCR sau khi được xử bằng hai enzym được tinh sạch theo quy trình của bộ kít “AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer)”. Do trong sản phẩm cắt vẫn

có những tạp chất tham gia phản ứng còn dư thừa; vì vậy, để tăng hiệu quả kế t nố i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

gen vào vector cầ n thiế t phả i tinh sạ ch sả n phẩ m c ắt. Tinh sạch ADN là phương

pháp thu đoạn ADN tinh khiết dựa trên nguyên lý sử dụng các hạt sepharose để giữ

các phân tử ADN đã được gắn với các hạt ion lúc mix sản phẩm cắt trong đệm gắn.

Do đó khi chuyển hỗn hợp ADN, enzym, muối chứa trong các đệm .v.v , lên cột

phân tách, chỉ có ADN được gắn lên mạng lưới, còn các thành phần khác như

protein, muối sẽ bị rửa trôi qua cột. Sau đó, để tách ADN ra khỏi cột người ta sử

dụng đệm tách (hoặc nước deion khử trùng để hòa tan ADN). Sau khi tinh sạch tiến

hành kiểm tra một lần nữa bằng cách lấy khoảng 5 µl ADN của mẫu đã được tinh

sạch ở trên điện di trên gel agarose 1%. Kết quả kiểm tra sản phẩm tinh sạch được

thể hiện trong hình 3.4.

1 kb; Giếng 1: seb

Hình 3.4. Điện di sản phẩm seb sau tinh sạch. Giếng M: thang ADN chuẩn:

Trên bảng điện di chỉ xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước trong khoảng

750 đến 1000bp, chứng tỏ quy trình tinh sạch ADN đã thành công, đây sẽ là nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

liệu sử dụng để tạo vector biểu hiện.

3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen seb đột biến

3.2.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen pET21a+

- Chuẩn bị vector biểu hiện pET21a+

Muốn gen đích biểu hiện thành protein cần thiết kế gen vào vector mang các

cấu trúc cần thiết cho quá trình phiên mã và dịch mã. Các vector này được gọi là

vector biểu hiện. Các trình tự quan trọng nhất trợ giúp cho quá trình biểu hiện gen

đích là: (1) promoter, (2) terminator, (3) trình tự điều hòa (regulator). Trong nghiên

cứu này, chúng tôi đã sử dụng vector pET21a+ là vector biểu hiện.

Vector pET21a+ là vector biểu hiện mạnh có kích thước 5443bp, mang một

trình tự T7-taq ở đầu N’ tại vị trí 207 đến 239, và trình tự His-taq ở đầu C’ tại vị trí

140 đến 157. Vector pET21a+ chứa promoter T7 có nhiệm vụ khởi đầu quá trình

phiên mã. Trình tự T7-tag và His-tag có chức năng cung cấp điểm khởi đầu dịch

mã và kết thúc quá trình dịch mã cũng như tinh sạch protein bằng liên kết ái lực.

Vector có gen kháng ampicillin thuận lợi cho quá trình chọn lọc dòng vi khuẩn sau

này. Một đặc điểm khác của vector biểu hiện ở mức độ dịch mã so với các vector

biểu hiện ở mức độ phiên mã là phải có trình tự rbs (ribosome binding site-vị trí

liên kết ribosome) được thiết kế ở giữa vị trí của promoter và đoạn gen được chèn

vào. Như vậy, việc biểu hiện protein tái tổ hợp có thể được thực hiện bằng cách

xen đoạn ADN đích vào vùng đa tách dòng (Multiple Cloning Site - MCS) của

vector biểu hiện.

Để tạo nguồn vector biểu hiện, tiến hành nuôi lỏng chủng E. coli DH5 đã

được biến nạp pET21a+ trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicilline 100 mg/l qua đêm ở máy lắc 37oC, 220 v/p. Sau đó tách chiết plasmid

pET21a+ như trong mục 2.2.2.7. Điện di 5l plasmid tách được trên gel agarose

0,8% để kiểm tra kết quả tách chiết plasmid (hình 3.5). Kết quả trên hình 3.5 cho

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

thấy chúng tôi đã tách chiết được plasmid pET21a+ từ chủng E. coli DH5.

Hình 3.5. Điện di plasmid pET21a+

- Xử lý enzym hạn chế trên pET21a+

Tiếp đó chúng tôi tiến hành cắt mở vòng plasmid pET21a+ đã tách từ E. coli

DH5 bằng hai enzym E.coRI và HindIII trong 3 giờ ở 37oC để tạo ra vết cắt giống

với đoạn gen seb sẽ cài vào. Kết quả mở vòng vector pET21a+ được thể hiện ở

hình 3.6. Kết quả trên hình cho thấy, vector sau khi mở vòng bằng hai enzym là 1

băng duy nhất có kích thước khoảng 5500 bp tương ứng với kích thước của vector

pET21a+ như trong lý thuyết.

ADN chuẩn 1kb; 1: Vector pET21a+ mở vòng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.6. Điện di plasmid pET21a+ sau khi cắt bằng các enzym hạn chế. M: Thang

3.2.2. Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu hiện

Vector pET21a+ sau khi mở vòng và tinh sạch được ghép nối với gen seb nhờ

xúc tác của T4 ADN ligase (mục 2.2.2.5). Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế

bào khả biến E. coli DH5, sau đó chọn lọc khuẩn lạc biến nạp trên môi trường có

chứa kháng sinh chọn lọc ampicilline. Kết quả biến nạp được trình bày trên hình 3.7.

Hình 3.7. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB

vào tế bào khả biến E. coli DH5α

Kết quả thu được cho thấy trên đĩa thạch có nhiều khuẩn lạc phát triển, nhưng

không biết khuẩn lạc nào mang vector tái tổ hợp. Bởi vì tế bào E.coli DH5α không

có khả năng kháng kháng sinh ampicillin nên sau khi biến nạp và nuôi cấy trải trên

môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin 100mg/l sẽ có các trường hợp sau xảy ra:

+ Các tế bào không chứa vector tái tổ hợp sẽ không mọc được trên môi

trường có chứa kháng sinh ampicillin.

+ Các tế bào chứa vector biểu hiện tự đóng vòng (do một trong 2 enzym cắt

không hoàn toàn), có gen kháng kháng sinh nên vẫn tồn tại, và tạo khuẩn lạc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

+ Các tế bào có chứa vector tái tổ hợp pET21a+/SEB mang gen mã hóa cho

SEB có gen kháng kháng sinh nên mọc được trên môi trường chọn lọc.

Do đó, chúng tôi phải tiến hành chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp bằng

phương pháp colony - PCR

3.2.3. Kết quả chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng

colony - PCR

Để kiểm tra khuẩn lạc của dòng tế bào nào mang vector tái tổ hợp

pET21a+/SEB, chúng tôi tiến hành PCR trực tiếp từ các dòng khuẩn lạc khác nhau

(colony-PCR) với cặp mồi của vector: T7-promoter và T7-terminater. Các bước tiến

hành, thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt như mô tả ở mục 2.2.2.2. Kết quả sau

khi tiến hành colony-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và thể

hiện trên hình 3.8.

Hình 3.8. Kết quả điện di colony-PCR để chọn dòng khuẩn lạc mang plasmid tái

khuẩn lạc khác nhau; (-): Đối chứng âm

tổ hợp pET21a+/SEB. M: Thang ADN chuẩn 1kb; 1-20: Sản phẩm colony-PCR của các dòng

Dựa vào kết quả trên hình 3.8 cho thấy có 17 dòng khuẩn lạc đã xuất hiện một

băng ADN có kích thước khoảng trên 1kb phù hợp với kích thước gen seb như đã Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

tính toán lý thuyết. Các giếng 9, 12, 14 còn lại cũng xuất hiện 1 băng với kích

thước khoảng 250 bp phù hợp với kích thước đoạn gen giữa 2 mồi vector. Điều này

chứng tỏ các khuẩn lạc số 9, 12, 14 chỉ có vector pET21a+ tự đóng vòng mà thôi.

3.2.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế

Để kết quả chắc chắn hơn, chúng tôi quyết định nuôi lỏng khuẩn lạc các dòng

số 1, 2, 3, 4, 5 để tách và kiểm tra plasmid của chúng. Các plasmid sau khi tách

được xử lý bằng 2 enzym hạn chế E.coRI và HindIII. Theo tính toán trong ảnh

điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp pET21a+/SEB phải có hai băng ở hai vị

trí tương ứng kích thước của gen seb (khoảng 800bp) và kích thước của vector

pET21a+ (khoảng 5400 bp). Kết quả xử lý enzym trên plasmid các dòng đã được

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1000bp

~800 bp

kiểm tra trên gel 1% và thể hiện trên hình 3.9.

Thang ADN chuẩn 1kb; 1, 3, 5, 7, 9: Plasmid tách từ các dòng khuẩn lạc 1, 2, 3, 4, 5; 2, 4, 6, 8, 10: Sản phẩm cắt plasmid của các dòng 1, 2, 3, 4, 5.

Hình 3.9. Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21a+/SEB của các dòng khuẩn lạc. M:

Dựa vào kết quả trên hình 3.9 cho thấy ở các giếng 2, 4, 6, 8, 10 sản phẩm cắt

phân thành hai băng tương ứng với kích thước của vector pET21a+ khoảng 5400

bp và kích thước của đoạn gen seb khoảng 800 bp như đã tính toán trước đó.

Plasmid thu từ khuẩn lạc dòng số 1 được chọn để giải trình tự gen. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.2.5. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện

Kết quả đọc trình tự mẫu ADN pET21a+/SEB tách chiết từ các vi khuẩn dòng

Hình 3.10. So sánh trình tự nucleotide của wtseb và mtseb bằng phần mềm Bioedit

số 1 bằng kít tách plasmid của Bioneer thể hiện trên hình 3.10 dưới đây.

Theo hình 3.10 chúng tôi đã tạo được các đột biến thay thế nucleotide C bằng

T ở các bộ ba mã hóa cho histydine và tyrosine như theo lý thuyết. Kết quả giải

trình tự gen seb đột biến theo nguyên lý của phương pháp dideoxy được cải tiến dựa

vào các thiết bị tự động cho kết quả đẹp. Như vậy, chúng tôi kết luận đã thiết kế

thành công vector biểu hiện pET21a+/SEB mang gen đột biến theo đúng mục đích.

Plasmid thu từ khuẩn lạc dòng số 1 sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein tái tổ hợp SEB

3.3.1. Biến nạp vector tá i tổ hợ p pET 21a+/SEB vào Escherichia coli chủng

BL21(DE3)

E. coli BL21(DE3) là chủng vi khuẩn biểu hiện gen thường được sử dụng khi

biểu hiện 1 protein lạ và là vật chủ phù hợp cho biểu hiện protein khi dùng vector

biểu hiện có chứa promoter T7 hoặc lac promoter T7 như vector pET21a+. Hơn

nữa chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) đã được biến đổi để tăng cường khả năng

biểu hiện protein ngoại lai. Bởi vậy, đây là chủng phù hợp với đối tượng và mục

đích nghiên cứu của đề tài.

Sau khi chọn dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn

gen seb, chúng tôi tiến hành biến nạp sản phẩm tái tổ hợp thu được từ dòng đó vào

tế bào khả biến E. coli chủng BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt. Dịch khuẩn

được nuôi cấy trải trên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh ampicilline 100

mg/l.

Tế bào E.coli BL21(DE3) không có khả năng kháng kháng sinh ampicillin

nên sau khi biến nạp và nuôi cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin

100mg/l sẽ có các trường hợp sau xảy ra:

+ Các tế bào không chứa vector tái tổ hợp sẽ không mọc được trên môi

trường có chứa kháng sinh ampicillin.

+ Các tế bào có chứa vector tái tổ hợp pET21a+/SEB mang gen mã hóa cho

SEB và có gen kháng kháng sinh nên mọc được trên môi trường chọn lọc.

Để chắc chắn hơn nữa về sự có mặt của plasmid tái tổ hợp trong các dòng

khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 8 dòng khuẩn lạc và tiến

hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc này với cặp mồi đặc hiệu mSEB - F và mSEB - R.

Sản phẩm colony-PCR được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra và kết quả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

được thể hiện trên hình 3.11.

Hình 3.11. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F

BL21(DE3) từ 1 tới 8; (-): Đối chứng (-); 9: Đối chứng (+) là sản phẩm PCR cùng cặp mồi đặc hiệu

và khuôn mẫu là plasmid pET21a+/SEB tách từ dòng số 1 DH5α.

và R. M: thang ADN chuẩn 1 kb; 1 – 8: Sản phẩm PCR từ plasmid của các dòng khuẩn lạc

Kết quả thu được trên hình 3.11 cho thấy ở tất cả các giếng kiểm tra (trừ giếng

đối chứng âm) đều xuất hiện một băng duy nhất trên đường chạy với kích thước

khoảng 800 bp tương ứng với kích thước của gen seb. Như vậy, chúng tôi đã biến

nạp thành công plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB vào chủng E. coli BL21(DE3). Từ

kết quả này, chúng tôi quyết định lựa chọn ngẫu nhiên dòng khuẩn lạc số 1 để kiểm

tra khả năng biểu hiện của gen seb tái tổ hợp.

3.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen seb

Gen seb trong vector biểu hiện hoạt động dưới sự điều khiển của T7 lac

promoter và được kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D-

thiogalactoside) có trong môi trường. Do đó, để nghiên cứu sự biểu hiện của protein

tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành công được nuôi cấy trong môi trường LB

lỏng có kháng sinh ampicillin và chất cảm ứng IPTG.

Trước khi thực hiện cảm ứng biểu hiện bằng IPTG, các tế bào vi khuẩn E.coli

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

BL21(DE3) chứa plasmid tái tổ hợp cần phải được hoạt hoá bằng cách nuôi lắc ở nhiệt độ 37oC trong môi trường LB chứa kháng sinh ampicillin 100mg/l cho đến khi

các tế bào bước vào pha sinh trưởng (OD600 nằm trong khoảng 0,4 đến 0,6). Sau 3 giờ cảm ứng IPTG 1mM ở nhiệt độ 37oC, tiến hành ly tâm 8000 vòng trong 5 phút

để thu sinh khối tế bào. Đối với mẫu đối chứng âm, các tế bào E.coli BL21(DE3)

chứa plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB và tế bào E.coli BL21(DE3) không chứa

plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB cũng được hoạt hóa trên môi trường chứa kháng sinh ampicillin 100mg/l ở nhiệt độ 37oC cho đến mật độ tế bào thích hợp. Sau đó các tế bào này cũng được biểu hiện ở nhiệt độ 37oC nhưng không bổ sung IPTG (

với đối chứng (-) có vector biểu hiện), và bổ sung 1mM IPTG (với đối chứng (-)

không có vector biểu hiện) trước khi thu sinh khối tế bào như trên. Sau đó, chúng

tôi tiến hành pha loãng sinh khối tế bào bằng dung dịch đệm PBS 1X và Tween 20

(0,05%), phá vỡ tế bào bằng cách siêu âm khô, thu protein tổng số và chạy điện di

protein trên gel polyacrylamide như mục 2.2.2.9 để kiểm tra sự biểu hiện.

Kết quả kiểm tra protein tổng số của các dòng tế bào mang plasmid

pET21a+/SEB tái tổ hợp được trình bày ở hình 3.12.

Hình 3.12. Điện di so sánh protein tổng số của các tế bào E.coli BL21(DE3)

marker - Fermentas); 1: Đối chứng âm (protein tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc

BL21(DE3); 2: Protein tổng số trong dịch chết BL21(DE3)/pET21a+/SEB được cảm ứng IPTG; 3:

Protein cặn của dòng khuẩn lạc BL21(DE3)/pET21a+/SEB được cảm ứng IPTG; 4: Đối chứng âm

(protein tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc BL21(DE3)/pET21a+/SEB nhưng không được

cảm ứng IPTG.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

mang gen seb tái tổ hợp. M: Thang protein chuẩn (Prestained protein molecular weight

Từ kết quả trên hình 3.12 cho thấy ở các giếng 2 và 3 vi khuẩn BL21(DE3)

mang vector biểu hiện pET21a+/SEB có cảm ứng IPTG xuất hiện một băng protein

lạ so với 2 đối chứng âm và có kích thước khoảng 28 kDa tương ứng với kích thước

protein SEB theo tính toán lí thuyết. Kết quả này được giải thích là khi có mặt chất

cảm ứng IPTG thì lac repressor thay đổi cấu hình và không thể gắn vào lac

operator. Sự loại bỏ lac repressor ra khỏi operator cho phép ARN polymerase bám

vào lac promoter và khởi động quá trình phiên mã. Dòng vi khuẩn đối chứng (-)

còn lại do không mang vector có gen seb tái tổ hợp nên dù được cảm ứng IPTG

giống như với các dòng vi khuẩn mang vector có cảm ứng IPTG cũng không biểu

hiện được băng có kích thước như vậy. Năm 2003, Korolev cùng các cs cũng tạo

thành công protein SEB không mang đoạn tín hiệu nhưng vẫn hiện diện trong vùng

chu chất của tế bào. Trong thí nghiệm đó Korolev và cs, đã sử dụng vector biểu hiện

pET22b+ có mang trình tự tín hiệu signal peptide có tác dụng dẫn protein ngoại lai

ra vùng khoang chu chất của tế bào biểu hiện [22]. Trong nghiên cứu này, vector

pET21a+ không mang trình tự tín hiệu và gen seb tái tổ hợp được thiết kế cũng

không có trình tự mã hóa cho đoạn polypeptide đặc biệt này. Do đó, để thu được

protein SEB ngoại lai ở dạng tan phù hợp mục tiêu thử hoạt tính kháng nguyên sau

này, chúng tôi tiến hành tối ưu các điều kiện biểu hiện gen.

3.3.3. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện gen seb

Sự tổng hợp protein phụ thuộc rất nhiều yếu tố cho nên việc xác định được

điều kiện tối ưu cho tổng hợp protein quan tâm là điều quan trọng. Để xác định

được điều kiện tối ưu đó chúng tôi tiến hành thử biểu hiện gen ở các điều kiện nhiệt

độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng khác nhau.

Kết quả tối ưu nhiệt độ cảm ứng

Thông thường, nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn E. coli là ở 37oC. Tuy nhiên, đối với protein tái tổ hợp thường bị ức chế bởi các protein vật

chủ, hoặc bị phân hủy bởi nhiệt độ cao hoặc gây độc với tế bào vật chủ .v.v thì nhiệt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

độ này trong nhiều trường hợp là không phù hợp. Về mặt lý thuyết, điều này được

giải thích là khi sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu protein tái tổ hợp do được điều khiển

bởi promoter mạnh như T7 promoter sẽ được tổng hợp ồ ạt một lượng rất lớn trong

một thời gian ngắn. Trong khi đó, các protein chức năng khác tham gia vào quá

trình tạo cấu trúc protein bậc cao hơn lại không được tổng hợp với tốc độ tương

ứng, do đó ảnh hưởng đến cấu trúc thứ cấp của protein tái tổ hợp và thông thường

làm cho protein được tổng hợp dưới dạng không tan, có hoạt tính thấp hoặc thậm chí mất hoạt tính. Thêm vào đó 37oC là nhiệt độ tối thích cho các protease nội bào

hoạt động, do đó các protein ngoại lai sẽ bị phân cắt sau khi tổng hợp, ảnh hưởng

đến hiệu suất biểu hiện và chất lượng protein [1].

Để thu protein SEB với lượng lớn có hoạt tính mà không lẫn quá nhiều protein

của bản thân E.coli, tăng hiệu quả quá trình tinh sạch protein sau này, chúng tôi

quyết định tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein SEB tái tổ hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 28oC và 37oC với cùng nồng độ chất cảm ứng IPTG

1mM và thời gian cảm ứng 3 giờ. Sau 3 giờ nuôi cảm ứng tế bào được thu lại để

kiểm tra mức độ biểu hiện và tính chất của protein tái tổ hợp. Dịch chiết và phần

cặn tế bào được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12%. Kết quả trình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

bày trên hình 3.13.

Hình 3.13. Điện di so sánh khả năng biểu hiện protein SEB ở các nhiệt độ khác

ở 37oC, cặn; 5: Cảm ứng ở 28oC C, cặn; 6: Cảm ứng ở 28oC C, dịch; 7: Không cảm ứng ở 28oC.

nhau. M: Thang protein chuẩn; 2: Không cảm ứng ở 37oC; 3: Cảm ứng ở 37oC, dịch; 4: Cảm ứng biểu hiện

Kết quả thu được trên hình 3.13 cho thấy ở đường chạy của giếng số 5 xuất

hiện băng protein SEB đậm hơn hẳn băng protein ở giếng số 2. Chứng tỏ protein SEB tái tổ hợp trong điều kiện 28oC tan tốt hơn so với điều kiện nhiệt độ 37oC. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ cảm ứng là 28oC cho các nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng trên gen seb

Protein ngoại lai được điều khiển tổng hợp bởi promoter T7 trên vector

pET21a+. Promoter này được cảm ứng bởi sự có mặt của IPTG trong môi trường

nuôi cấy. Nồng độ chất này ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện protein ngoại lai của

tế bào. Ở nồng độ quá cao nó gây độc cho tế bào, trong khi ở nồng độ quá thấp

protein ngoại lai thường được tổng hợp kém [1]. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả

năng biểu hiện protein SEB tái tổ hợp ở các nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau từ 0,4 - 1 mM (0,4 mM; 0,6 mM; 0,8 mM và 1 mM) ở 28oC và thu mẫu sau 3 giờ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cảm ứng. Kết quả thí nghiệm được thể hiện tổng quát qua hình 3.14. Theo đó, lượng

protein SEB tái tổ hợp được tổng hợp nhiều nhất tương ứng với nồng độ chất cảm

ứng IPTG 1mM. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM cho

nghiên cứu tiếp theo.

Thời gian cảm ứng cũng có liên quan chặt chẽ đến số lượng và chất lượng của

protein tái tổ hợp được biểu hiện. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát các thời điểm

thu mẫu khác nhau từ 1 giờ đến 5 giờ sau khi bổ sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1 mM và nuôi cấy ở 28oC. Protein tổng số ở các giai đoạn được kiểm tra trên gel

điện di polyacrylamide 12% và kết quả thí nghiệm được thống kê trong hình 3.14.

Sau 5 giờ cảm ứng, protein SEB tái tổ hợp biểu hiện được là một băng đậm, rõ nét

hơn so với băng thu được ở các thời điểm khác. Từ kết quả này, chúng tôi lựa chọn

khoảng thời gian cảm ứng là 5 giờ cho các quá trình tổng hợp protein SEB.

Hình 3.14. So sánh khả năng biểu hiện SEB tại các điều kiện khác nhau

Như vậy, điều kiện tối ưu để cảm ứng biểu hiện protein SEB trong chủng biểu hiện BL21(DE3) là ở nhiệt độ 28oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM sau 5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

giờ cảm ứng.

3.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB

Theo thiết kế vector biểu hiện pET21a+/SEB, khi protein SEB được tổng hợp,

nó sẽ nối thêm 6 axit amin Histidin ở phần - COOH. Đây là một đặc điểm thuận lợi

cho việc tinh sạch sản phẩm, đồng thời cũng là một tín hiệu để nhận biết sản phẩm

được tổng hợp bằng Western blot. Trong thí nghiệm này chúng tôi tinh sạch trực

tiếp thu protein SEB dựa trên những kết luận về điều kiện cảm ứng ở trên. Sau quá

trình biểu hiện, các tế bào được được phá vỡ bằng sóng siêu âm và tiến hành ly tâm

13000 vòng trong 15 phút để tách riêng pha cặn và pha dịch. Kiểm tra trên gel

polyacylamide thấy protein SEB biểu hiện ở dạng hòa tan đủ lượng thì tiến hành

tinh sạch (hình 3.15).

Protein tổng số trong pha cặn; 2: Protein tổng số mẫu đối chứng (-) không cảm ứng IPTG; M:

Thang protein chuẩn; 4: Protein tổng số trong pha dịch

Hình 3.15. Điện di kiểm tra protein SEB dạng tan trước khi tinh sạch. 1:

Phương pháp tinh sạch bằng cột HisTrap dựa vào liên kết ái lực giữa ion niken (Ni2+) với vòng imidazol của histidin. Khi các axit amin histidin ở gần nhau thì liên

kết giữa chúng với các ion niken càng mạnh. Protein tái tổ hợp do gen seb mã hoá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

có đuôi His - tag với 6 axit amin histidin liên tục sẽ liên kết đặc hiệu với ion niken.

Các phân tử protein trong tế bào được tổng hợp ra do không có đuôi His - tag sẽ

không gắn được với ion niken. Mặt khác các ion niken trong cột lại được liên kết

với các hạt Sepharose bằng một phức càng cua nên protein tái tổ hợp sẽ không bị

rửa trôi bằng các đệm rửa như các protein khác. Protein tái tổ hợp được giữ lại trên

cột sẽ được tách ra khi cho qua dung dịch đệm có chứa nồng độ imidazol thích hợp.

Việc thu mẫu được tiến hành theo từng phân đoạn liên tục để kiểm tra protein ngoại

lai bắt đầu tách ra khỏi cột từ phân đoạn nào và kết thúc ở phân đoạn nào. Trong

quá trình tinh sạch và thu mẫu protein trên chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm

trước và sau khi tinh sạch trên gel polyacrylamide 12%. Kết quả tinh sạch protein SEB sau 5 giờ cảm ứng 1mM IPTG, ở nhiệt độ 28oC được thể hiện trong hình 3.16.

Đối chứng (-): Không cảm ứng IPTG; 2: Cảm ứng IPTG; 3 Phân đoạn Flow; 4: Phân đoạn

Washing; 5-Protein sau tinh sạch

Hình 3.16. Điện di kết quả tinh sạch protein SEB tái tổ hợp. M: Thang protein chuẩn; 1:

Kết quả trên điện di đồ cho thấy, sản phẩm tinh sạch chỉ có một băng protein

duy nhất với trọng lượng khoảng 28 kDa tương đương trọng lượng của băng biểu

hiện trước khi tinh sạch. Chúng tôi kiểm tra các phân đoạn thu mẫu khác nhau. Từ

phân đoạn thứ 2 bắt đầu thu được protein ngoại lai và đến phân đoạn thứ 6 thì hầu

như không thấy xuất hiện nữa. Như vậy chúng tôi đã thu được hoàn toàn lượng

protein ngoại lai tinh sạch. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

KẾT LUẬN

1. Thiết kế thành công vector biểu hiện mang gen mã hóa cho kháng nguyên tái

tổ hợp staphylococcal enterotoxin B đã được gây đột biến loại độc tính.

2. Đã xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu để tăng khả năng biểu hiện protein

staphylococcal enterotoxin B đột biến ở dạng tan trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) là ở các điều kiện: nhiệt độ 28oC, nồng độ

IPTG 1mM và thời gian cảm ứng là 5 giờ.

3. Tinh sạch thành công protein staphylococcal enterotoxin B đột biến để sử

dụng làm nguyên liệu tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus

aureus trong thực phẩm.

KIẾN NGHỊ

1. Kiểm tra độc tính của protein staphylococcal enterotoxin B đột biến trên đối

tượng thử nghiệm (chuột hoặc thỏ)

2. Xác định nồng độ protein staphylococcal enterotoxin B, chuẩn bị nguồn

nguyên liệu cho việc tạo kháng thể đơn dòng để chế tạo kít chuẩn đoán nhanh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ngộ độc thực phẩm do độc tố tụ cầu vàng gây ra ở giai đoạn sau.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I - Tài liệu tiếng Việt

1. Đỗ Thị Huyền, Bùi Hồng Vân, Văn Thị Như Ngọc, Trương Văn Dung, Trương

Nam Hải (2009), Biểu hiện gen ha5 mã hoá kháng nguyên Hemagglutinin (HA)

của virus cúm A/H5N1 trong Escherichia coli, Tạp chí Công nghệ sinh học,

7(2), 185-192.

2. Đông Phương (2008), Đề phòng ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng,

http://news.restaurants.com.vn/?page=tintuc&code=home&id=587.

3. Lâm Quốc Hùng (2009), Phòng chống ngộ độc tại Việt Nam năm 2008, dự báo

và giải pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm năm 2009, Cục an toàn vệ sinh

thực phẩm, http://vfa.gov.vn/news.asp?ID=21322.

4. Lê Huy Chính (2003), Vi sinh y học, Nxb Y học, Hà Nội.

5. Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thanh Yến, Phan Thị Kim, Nguyễn Thị Sợt, Nguyễn

Thị Khánh Sâm (2005), Tình hình ô nhiễm vi khuẩn và nhận thức vệ sinh an

toàn thực phẩm ở người kinh doanh thức ăn đường phố. Cục An toàn vệ sinh

thực phẩm, www.vfa.gov.vn.

6. Nguyễn Thị Liên Hạnh, Huỳnh Hồng Quang (2009), Các nguyên nhân gây bệnh

ỉa chảy nhiễm khuẩn do Tụ cầu vàng và Virus, http://www.impe-

qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=2745.

II - Tài liệu tiếng Anh

7. Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K. (2008), Genome

sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and comparative analysis of

staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major

pathogenicity islands, J. Bacteriol, 190(1), 300-310.

8. Baba T., Takeuchi F., Kuroda M., Yuzawa H., Aoki K., Oguchi A., Nagai Y.,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Iwama N., Asano K., Naimi T., Kuroda H., Cui L.,Yamamoto K., Hiramatsu K.

(2002), Genome and virulence determinants of high virulence community-

acquired MRSA, Lancet, 359(9320), 1819-1827.

9. Bean N. H., Griphin P. M., Goulding J. S., Ivey C. B. (1990), Foodborne disease

outbreaks, 5 year summary, 1983-1987, J. Food Prot, 53, 711-728.

10. Bergdoll M. S. (1989), Staphylococcus aureus, Foodborne Bacterial Pathogens

(Doyle, M.P., ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA, 463-523.

11. Bruce A. G., Kermit D. H. (2009), CBRNE - Staphylococcal Enterotoxin B,

http://emedicine.medscape.com/article/830715-overview.

12. CAST (1994), CAST Report: Foodborne Pathogens: Risks and Consequences,

Task Force Report No. 122, Washington, DC: Council for Agricultural Science

and Technology.

13. Christopher L. J., Saleem A. K. (1986), Nucleotide Sequence of the Enterotoxin

B Gene from Staphylococcus aureus, Journal of bacteriology, 166(1), 29-33.

14. Evenson M. L., Hinds M. W., Bernstein R. S., Bergdoll M. S. (1988),

Estimation of human dose of staphylococcal enterotoxin A from a large outbreak

of staphylococcal food poisoning involving chocolate milk, Int. J. Food

Microbiol, 7, 311-316.

15. Gill S. R., Fouts D. E., Archer G. L., Mongodin E. F., Deboy R. T., Ravel J.,

Paulsen I. T., Kolonay, J. F., Brinkac L., Beanan M., Dodson R. J., Daugherty S.

C., Madupu R., Angiuoli S. V., Durkin A. S., Haft D. H., Vamathevan J., Khour

I. H., Utterback T., Lee C., Dimitrov G., Jiang L., Qin H., Weidman J., Tran K.,

Kang K., Hance I. R., Nelson K. E., Fraser C. M. (2005), Insights on evolution

of virulence and resistance from the complete genome analysis of an early

methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain and a biofilm-producing

methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis strain, J. Bacteriol, 187, 2426-2438.

16. Greenfield R. A., Brown B. R., Huntchins J. B., Iandolo J. J., Jackson R., Slater

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

L. N., Bronze M. S. (2002), Microbiological, biological, and chemical weapons

of warfare and terrorism, The American Journal of the Medical Science, 323(6),

326-340.

17. Haeghebaert S., Le Q. F., Gallay A., Bouvet P., Gomez M., Vaillant V. (2002),

Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000, Bull.

Epidémiol. Hebdo, 23, 105-109.

18. Herron O. L., Fitzgerald J. R., Musser J. M., Kapur V. (2007), Molecular

correlates of host specialization in Staphylococcus aureus, PLoS ONE, 2(10),

E1120.

19. Holden M. T.,Feil E. J., Lindsay J. A., Peacock S. J., Day N. P., Enright M. C.,

Foster T. J., Moore C. E., Hurst L., Atkin R.,Barron A., Bason N., Bentley S. D.,

Chilling W. C., Chilling W.T., Churcher C., Clark L., Corton C., Cronin

A.,Doggett J., Dowd L., Feltwell T., Hance Z., Harris B., Hauser H.,Holroyd S.,

Jagels K., James K. D., Lennard N., Line A., Mayes R.,Moule S., Mungall K.,

Ormond D., Quail M. A., Rabbinowitsch E., Rutherford K., Sanders M., Sharp

S., Simmonds M., Stevens K.,Whitehead S., Barrell B. G., Spratt B. G., Parkhill

J. (2004), Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains:

evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 101(26), 9786-9791.

20. Huang L. Y., Bergdoll M. S. (1970), The primer structure of staphylococcal

enterotoxin B, J. Biol. Chem, 245, 3518-3525.

21. Kọferstein F. K., Motarjemi Y., Bettcher D. W. (1997), Foodborne disease

control: a transnational challenge, Emerging Infect, Dis, 3, 503-510.

22. Korolev S., Pinelis D., Savransky V., Komisar J., Vogel P., Fegeding K. (2003),

Toxicity of the staphylococcal enterotoxin B mutants with histidine-to-tyrosine

substitutions, Toxicology, 187(2/3), 229–238.

23. Kuroda M., Ohta T., Uchiyama I., Baba T., Yuzawa H., Kobayashi I., Cui L.,

Oguchi A., Aoki K., Nagai Y., Lian J., Ito T., Kanamori M., Matsumaru H.,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Maruyama A., Murakami H., Hosoyama A., Mizutani U. Y., Takahashi N. K.,

Sawano T., Inoue R., Kaito C., Sekimizu K., Hirakawa H., Kuhara S., Goto S.,

Yabuzaki J., Kanehisa M., Yamashita A., Oshima K., Furuya K., Yoshino C.,

Shiba T., Hattori M., Ogasawara N., Hayashi H., Hiramatsu K. (2001), Whole

genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus Aureus, Lancet,

357(9264), 1225-1240.

24. Lee J. S., Dyas B. K., Nystrom S. S., Lind C. M., Smith J. F., Ulrich R. G.

(2002), Immune protection against staphylococcal enterotoxin-induced toxic

shock by vaccination with Venezuelan equine encephalitis virus replicon, J.

Infect. Dis, 185, 1192-1196.

25. Lowell G. H., Colleton C., Frost D., Kaminski R. W., Hughes M., Hatch J.,

Hooper C., Estep J., Pitt L., Topper M., Hunt R. E., Baker W., Baze W. B.

(1996), Immunogennicity and efficacy agains lethal aerosol staphylococcal

enterotoxin B challenge in monkeys by intramuscular and respiratory delivery of

proteosome – toxoid vaccines, Infect. Immun, 64(11), 4686-4693.

26. Nema V., Agrawal R., Kamboj D. V., Goel A. K., Singh L. (2007), Isolation and

characterization of heat resistant enterotoxigenic Staphylococcus aureus from a

food poisoning outbreak in Indian subcontinent, Int. J. Food Microbiol, 117(1),

29-35.

27. Ono H. K., Omoe K., Imanishi K., Iwakabe Y., Hu D. L., Kato H. (2008),

Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins,

types S and T, Infect Immun, 76(11), 4999-5005.

28. Reck B., Scheuber P. H., Londong W., Sailer-Kramer B., Bartsch K., Hammer

D. K. (1988), Protection against the staphylococcal enterotoxin-induced

intestinal disorder in the monkey by anti-idiotypic antibodies, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 85(9), 3170-3174.

29. Rosec J. P., Gigaud O. (2002), Staphylococcal enterotoxin genes of classical and

new types detected by PCR in France, Int. J. Food Microbiol, 77, 61-70.

30. Rosec J. P., Guiraud J. P., Dalet C., Richard N. (1997), Enterotoxin production by

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

staphylococci isolated from foods in France, Int. J. Food Microbiol, 35, 213-221.

31. Savransky V., Pinelis D., Korolev S., Ionin B., Fegeding K. (2004),

Immunogenicity of the histidine-to-tyrosine staphylococcal enterotoxin B

mutant protein in C3H/HeJ mice, Toxicon, 43, 433–438.

32. Savransky V., Rostapshov V., Pinelis D., Polotsky Y., Korolev S., Komisar J.,

Fegeding K. (2003), Murine lethal toxic shock caused by intranasal

administration of staphylococcal enterotoxin B, Toxicol. Pathol, 31(4).

33. Stelma G. N., Bergdoll M. S. (1982), Inactivation of staphylococcal enterotoxin

A by chemical modification, Biochem. Biophys. Res. Commun, 105(1), 121-126.

34. Steven R. G., Derrick E. F., Gordon L. A. (2005), Insights on Evolution of

Virulence and Resistance from the Complete Genome Analysis of an Early

Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strain and a Biofilm-Producing

Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis Strain, J Bacteriol, 187(7),

2426–2438. PMCID: PMC1065214.

35. Swaminathan S., Furey W., Pletcher J., Sax M. (1992), Crystal structure of

staphyloccocal enterotoxin B, a superantige, Nature, 359, 801 – 806.

36. Thibodeau J., Cloutier I., Lavoie P. M., Labrecque N., Mourad W., Jardetzky

T., Sekaly R. P. (1994), Subsets of HLA-DR1 molecules defined by SEB and

TSST-1 binding, Sciences, 266(5192), 1874-1878.

37. Wallace D. J., Van G. T., Shallow S., Fiorentino T., Segler S. D., Smith K. E.,

Shiferaw B., Etzel R., Garthright W. E., Angulo F. J. and the Food Net Working

Group. (2000), Incidence of Foodborne Illnesses Reported by the Foodborne

Diseases Active Surveillance Network (FoodNet)-1997, J. Food Prot, 63, 807-809.

38. Wieneke A. A., Roberts D., Gilbert R. J. (1993), Staphylococcal food poisoning

in the United Kingdom, 1969-90, Epidemiol. Infect, 110, 519-531.

39. Woody M. A., Krakauer T., Stiles B. G. (1997), Staphylococcal enterotoxin B

mutants (N23K and F44S): biological effects and vaccine potential in a mouse

40. Yarwood J. M., McCormick J. K., Paustian M. L., Orwin P. M., Kapur V.,

model, Vaccine, 15, 133-139.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Schlievert P. M. (2002), Characterization and expression analysis of

staphylococcus aureus pathogenicity island 3. Implications for the evolution of

staphylococcal pathogenicity islands, J. Biol. Chem, 277(15), 13138-13147.

41. Yves L. L., Florence B., Michel G. (2003), Staphylococcus aureus and food

poisoning, Genet. Mol. Res, 2(1), 63-76.

III - Tài liệu internet

42. http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

43. http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/dai-cuong-an-toan-thuc-pham.271194.html

44. http://vi.wikipedia.org/wiki/Cơ_chế_độc_lực_của_vi_khuẩn

45. http://vi.wikipedia.org/wiki/Tụ_cầu_khuẩn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

46. http://www.uniprot.org/uniprot/P01552

Luận văn: NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

KẾT LUẬN .......................................................................................................... 49

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bảng

Tên bảng

Trang

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tỉ lệ

Mồi

Trình tự mồi

Tm (0C)

G-C (%)

KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I - Tài liệu tiếng Việt

II - Tài liệu tiếng Anh

III - Tài liệu internet

Có thể bạn quan tâm

Hỗ trợ xây dựng mục tiêu tập luyện và các hoạt động hằng ngày cho người bệnh đau mạn tính

Tổng quan nghiên cứu về chế độ ăn thực dưỡng trong kiểm soát viêm loét dạ dày

Phân lập chất theo hướng tác dụng chống oxy hóa từ vỏ thân núc nác (Oroxylum indicum)

Tác dụng giảm đau của cao chiết từ lá cây nọc xoài (Struchium sparganophorum (L.) Kuntze)

Khảo sát một số hoạt tính sinh học của trà diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.)

Đặc điểm thực vật và sơ bộ thành phần hóa thực vật của cây Nọc Xoài (Struchium sparganophorum (L.) Kuntze), họ Cúc (Asteraceae)

Hàm lượng polyphenol, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết từ cây Nọc Xoài (Struchium sparganophorum (L.) Kuntze), họ Cúc (Asteraceae)

Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của andrographolid từ phân đoạn ethyl acetate của xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees)

Nghiên cứu đặc điểm thực vật, vi học loài Gnetum latifolium Bl. và so sánh đặc điểm hình thái với các loài Gnetum khác tại Việt Nam

Đánh giá kiểm soát đường huyết và lipid máu ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 ngoại trú

Nghiên cứu màng hydrogel chứa keo ong định hướng giúp làm lành vết thương trên da

Nghiên cứu điều chế viên nang chứa cao cỏ mực (Eclipta prostrata (L.) Asteraceae)

Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng EDTA trong mayonnaise bằng phương pháp HPLC-UV

Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu kinh giới Herba Elsholtziae ciliatae

Nghiên cứu cải thiện độ tan và độ hòa tan của Tadalafil bằng phương pháp tạo phức với β-Cyclodextrin

Đánh giá tính an toàn và hiệu quả chống đông của Acenocoumarol trên bệnh nhân ngoại trú tại Bệnh viện Nhân Dân Gia Định năm 2024

Khảo sát tình hình bệnh nhân suy thận mạn nhiễm trùng dùng Vancomycin tại Bệnh viện Chợ Rẫy năm 2023-2024

Một số nhân tố ảnh hưởng đến hành vi bán thuốc dược liệu của người bán lẻ thuốc tại tỉnh Vĩnh Long năm 2024

Phân tích tình hình kê đơn thuốc điều trị ngoại trú bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính tại Bệnh viện Chợ Rẫy năm 2023

Yêu người ngóng núi (Nguyễn Ngọc Tư) và Đến độ hoa vàng (Đỗ Bích Thúy) từ góc nhìn cổ mẫu

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng