33
Nghiên cứu tính kích ứng da và tác dụng
kháng khuẩn của Cao tiêu viêm trịñộc-TA
trên thực nghiệmD
EXPERIMENTAL STUDY ON SKIN IRRITATION AND ANTIBACTERIAL
EFFECTS OF TAD - ANTI-INFLAMMATORY AND DETOXIFYING EXTRACT
Lê Hải Thảo , VũNam , ðỗ ThịMinh Nghĩa , ðào Ngọc An , Nguyễn ThịThu Hằng
Phạm Thanh Tùng , Nguyễn ThịMinh Thu
1 1 1 1 2
2 2
1Bệnh viện Y học cổtruyền Trung ương
Học viện Y-Dược học cổtruyền Việt Nam
2
Ngày nhận bài: 9/10/2024
Ngày phản biện: 10/12/2024
Ngày chấp nhận ñăng: 28/3/2025
Tác giảliên hệ: Lê Hải Thảo
ðiện thoại: 0986189006
E-mail: lehaithaogd@gmail.com
//doi.org/10.60117/vjmap.v60iðặc biệt 02.363Mã DOI: https:
TÓMTẮT
SUMMARY
Subjects and methods: Skin irritation was assessed on rabbits according to the guidelines of the
Ministry of Health of Vietnam and OECD. Antibacterial effects were evaluated on two bacterial strains
including Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Streptococcus mutans ATCC 35668 by agar well
diffusionandcolonycountingmethods.
Conclusions: TAD-anti-inflammatory and detoxyfying extract did not irritate rabbits' skins
and had good antibacterial effect against Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Streptococcus
mutansATCC35668.
Key words: TAD-Anti-inflammatory and Detoxifying Extract, skin irritation, in vitro
antibacterialeffect.
Objectives: To evaluate the skin irritation and antibacterial effects of TAD-anti-inflammatory
anddetoxifyingextract(TADpreparation)inexperiments.
Từkhóa:Caotiêuviêmtrị ñộc-TAD,kíchứngda,tácdụngkhángkhuẩninvitro.
ðối tượng và phương pháp: ðánh giá tính kích ứng da trên thỏtheo hướng dẫn của BộY tếvà
OECD. Tác dụng kháng khuẩnñượcñánh giá trên 2 chủng Staphylococcus aureus ATCC 6538 và
StreptococcusmutansATCC35668bằngphươngphápkhuếchtángiếngthạchvàñếmkhuẩnlạc.
Mục tiêu: ðánh giá tính kích ứng da và tác dụng kháng khuẩn của Cao tiêu viêm trị ñộc-TAD (chế
phẩmTAD)trênthựcnghiệm.
Kết luận: Cao tiêu viêm trị ñộc-TAD không gây kích ứng da thỏvà có tính kháng khuẩn với 2
StaphylococcusaureusATCC6538vàStreptococcusmutansATCC35668.
Kết quả:
khi ñắp
Da thỏhoàn toàn bình thường, khỏe mạnh, không có biểu hiện dị ứng, phù nềhay viêm
2,0 g mẫu thửtrên diện tích da 2,5 × 2,5 cm trong suốt 24 giờ. Chếphẩm TAD có tính kháng
khuẩn tốt in vitro trên 2 chủng Staphylococcus aureus và Streptococcus mutans ởcác nồng ñộ 0,01;
0,02;0,05;0,1và1g/mlvớigiátrịMICở15và30phútủñềulà0,05g/ml.
Results: Rabbits' skins were completely healthy with no signs of allergy, edema or inflammation
when 2.0 g of samples weres applied to skin areas of 2.5 × 2.5 cm continuously for 24 hours. The TAD
preparation had good in vitro antibacterial effects on 2 strains of Staphylococcus aureus and
Streptococcusmutansat concentrations of 0.01, 0.02,0.05, 0.1 and 1g/ml with MIC valuesat15 and 30
minutesofincubationbothbeing0.05g/ml.
BÀI NGHIÊN CỨU
SỐ ðẶC BIỆT 02 (60) – 2025
34
ðốitượng nghiêncứu
Chếphẩm TAD:
Cao tiêu viêm trị ñộc-TAD (chếphẩm TAD)
ñượcchiết xuất từ6 dược liệu(ñạt tiêu chuẩn cơ
sởhoặc tiêu chuẩn DượcñiểnViệt NamV) gồm:
Hoàng bá ( ) ðại hoàng
( ) Hoàng bá (
Cortex Phellodendri ,
Rhizoma Rhei , Caulis et Radix
Fibraureae , Fructus Xanthii
strumarii , Folium et Ramulus Crotonis
tonkinensis , Folium Lawsoniae
) Ké ñầu ngựa (
) Khổsâm (
) Lá móng ( ). Dược
ðẶTVẤN ðỀ
Viêm da cơ ñịa (VDCð) là một bệnh da mạn
tính tái phát, có liên quan ñến cơ ñịa dị ứng.
Nguyên nhân của VDCðlà tổng hợp của nhiều
yếu tốnhưdi truyền, miễn dịch, nhiễm trùng
hàngrào bảovệda[1].
Hiện nay, ñiều trịVDCðchủyếu là ñiều trị
triệu chứng bằng corticoid bôi và các chếphẩm
ức chếcalcineurin tại chỗ, kết hợp giữ ẩm cho
da, dùng kháng histamin H1 theo ñường uống
kết hợp các chấtức chếmiễn dịch khác và
chống phân bào. Y học cổtruyền (YHCT) có
nhiều vịthuốc dưới dạng uống, ngâm rửa, bôi
ngoài ñể ñiều trịVDCð. Một sốbài thuốc, vị
thuốcñãñược nghiên cứu dược lý và thểhiện
hiệu quảtốt, ñộc tính thấp, dễsửdụng và có
khảnăng phát triển thành dạng thuốc dùng
ñiều trịtrên người [2]. Xuất phát từnhu cầu
phát triển dược liệu trong y học, hoa Da liễu,
Bệnh viện YHCT Trung ương, với hơn 10 năm
kinh nghiệm sửdụng bài thuốc gồm các vị ðại
hoàng, Hoàng bá, Hoàng ñằng, Ké ñầu ngựa, Lá
móng, Khổsâm dùng làm thuốc ngâm ñể ñiều
trịtổn thương của VDCð,ñãñạtñược những
kết quảkhảquan nhấtñịnh.Tuy nhiên, cho ñến
nay, chưa có nghiên cứu khoa học rõ ràng ñể
ñánh giá tính an toàn và tác dụng của bài thuốc
trên. Vì vậy, ñể góp phần phát triển dạng thuốc
dùng ngoài da trong ñiều trịVDCðtừcác dược
liệu trên, nghiên cứu này ñược tiến hành nhằm
mục tiêu: ðánh giá tính kích ứng da và tác dụng
kháng khuẩn trên thực nghiệm của Cao tiêu
viêm trị ñộc-TAD (chếphẩm TAD) do Bệnh viện
sảnxuất.
K
ðỐITƯỢNG VÀPHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
liệusau khithu hái, ñược phânloại, rửa sạch, sấy
khô ởnhiệtñộ 70 C, sau ñó thái phiến rồi chiết
với nước tinh khiết (3 lần), lọc lấy dịch trong.
Gộp 3 dịch chiết rồi cô bớtñể ñược cao lỏng.
Mỗi 252 ml chếphẩmTAD chứa: Hoàng bá 42 g,
Hoàng ñằng 42 g, ðại hoàng 42 g, Ké ñầu ngựa
42 g, Khổsâm 42 g, Lá móng 42 g. Liều dùng dự
kiến trên người là 100 ml/ngày (100 g dược
liệu/ngày). Chếphẩmñược chiết xuất tại Khoa
Dược, Bệnh việnY học cổtruyềnTrung ương và
ñãñượckiểmnghiệmñạt tiêu chuẩncơsở.
o
Thỏtrưởng thành ( L.),
cân nặng 2,1 ± 0,2 kg, 2 tháng tuổi, khỏe mạnh,
không phân biệtñực - cái, doTrung tâm nghiên
cứu dê và thỏSơn Tây cung cấp. ðộng vật cái
không mang thai, không nuôi con bú và chưa
sinh sản lần nào. Thỏ ñược nuôi ổnñịnh 5 ngày
trong ñiều kiện thí nghiệm trước khi tiến hành
nghiên cứu.Thỏ ñược nuôi ởnhiệtñộ 22 –25 ,
ñộẩm 50 –70%.
Oryctolagus cuniculus
℃
Các chủng vi khuẩn
ATCC 6538 và ATCC
35668 do Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương
cungcấp.
Staphylococcus aureus
Streptococcus mutans
Thuốc,hóachất:
Các hóa chấtñể pha môi trường nuôi cấy vi
khuẩn gồm: Môi trường casein ñậu tương lỏng,
thạch dinh dưỡng và Mueller-Hinton ñều tinh
khiết, do côngty Himedia(Ấnðộ)sản xuất.
ðộng vật, vi khuẩn:
Thiếtbịvàdụngcụ:
- Cân phân tích model Sartorius –BP121S –
ðức, nồi hấp tiệt trùng model Hirayama HV -
110, tủ ấm model Froilabo Bc 120, tủcấy vi sinh
model Clean bench, tủlạnh Panasonic, tủsấy
Memmert Ule 600, ống MacFaland model
biMeriux từMỹ, bình ñịnhmức100 ml,bìnhtam
giác, bông không thấm nước, cốc thủy tinh 100
ml,250 ml,ñèn cồn,ñĩa petri, ñũathủytinh.
Nghiên cứuñược tiến hành từtháng 5/2024
ñến tháng 7/2024, tại Học viện Y-Dược học cổ
truyềnViệtNam.
- , kNước cất, tông ñơ ñiện éo, pank, ống
ñong thủy tinh chia vạch, băng, gạc vô trùng,
kính lúp.
Thờigianvàñịañiểm nghiêncứu
SỐ ðẶC BIỆT 02 (60) – 2025
35
Phươngpháp nghiêncứu
ðánh giá tính kích ứng da:
Tiến hành trên thỏtheo hướng dẫn của BộY
tếvàOECD 404[3],[4],[5].
Thiếtkếnghiêncứu:Thửnghiệmtrênñộngvật.
Lựa chọn 06 thỏñủñiều kiện nghiên cứu.
Các thỏñược chọnñặt mẫu thửtheo thứtự.
Trước thí nghiệm, làm sạch lông thỏ ở vùng
bên sườn một khoảng ñủ rộng ñể ñặt các mẫu
thửvà ñối chứng (khoảng 10 x 15 cm). Chỉ
những thỏcó da khoẻmạnh, ñồng ñều và lành
lặn mớiñược dùng vào thí nghiệm. Cắt các
miếng gạc vô trùng với kích thước 2,5 x 2,5 cm
từmiếng gạc lớn ban ñầu có ñộ dày 2 mm.Tẩm
mỗi miếng gạc với 2,0 ml Cao iêu viêm trịñộc-t
Cỡmẫu và phương pháp chọn mẫu:
TAD. Mỗi miếng gạc chứa 2,0 g dược liệu. Mỗi
thỏñều có vùng da bên sườnñặt 1 miếng gạc
Cao iêu viêm trịñộc-TAD và bên cạnh ñóñặt 1
miếng gạc tẩm nước cất, cách nhau 2 cm. ðặt
trên da thỏ ở một bên sườn 1 miếng gạc tẩm
mẫu thửvà bên cạnh là 1 miếng gạc tẩm nước
cất. Cố ñịnh miếng gạc bằng băng dính không
gây kích ứng da và gạc trong 24 giờ.Tại mỗi thời
ñiểm quan sát, bỏgạc và băng dính, dùng nước
cấtlau nhẹñểlàm sạch mẫuthửcòn lạitrênda.
t
Quan sát và ghi ñiểm phảnứng trên chỗda
ñặt chất thửso với a không ñặt chất thử ở các
thờiñiểm 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờvà 24 giờsau
khi làm sạch mẫu thử.ðánh giá phảnứng trên
da ởcác mứcñộ gây ban ñỏ, phù nềtheo qui
ñịnhtại bảng dướiñây.
d
Trên mỗi thỏ,ñiểm phảnứng ñược tính bằng
tổng số ñiểmởhai mứcñộ ban ñỏ và phù nề
chia cho sốlần quan sát. ðiểm kích ứng của mẫu
thử ñược lấy trung bình ñiểm phảnứng của các
thỏ ñã thử. Chỉsửdụng các ñiểm tại thời gian
quan sát ở6 giờ ñể tính kết quả.ðối chiếuñiểm
kích ứng với các mứcñộ quy ñịnh ñể xác ñịnh
khảnănggâykíchứngtrêndathỏcủa mẫuthử.
BÀI NGHIÊN CỨU
SỐ ðẶC BIỆT 02 (60) – 2025
36
ðánhgiá tácdụngkhángkhuẩn:Tiến hành
theo phương pháp khuếch tán giếng thạch và
ñếmkhuẩnlạc [4].
+ Pha huyền dịch chứa vi khuẩn chủng
chuẩn từkhuẩn lạc thuần nuôi trong môi
trường thạch dinh dưỡng ñến khi ñạtñộ ñục
tương ñương 0,5 ñộ McFarland (10 vi
khuẩn/ml). Cấy chuyển vi khuẩn sang môi
trườngMueller Hinton.
8
-ðánh giá tác dụng kháng khuẩn bằng
phương pháp ñục lỗthạch:Từkhuẩn lạc thuần,
pha huyền dịch vi khuẩn nồng ñộ 10 vi
khuẩn/ml (cấy chuyển vào 2ml nước cất vô
trùng), ñiều chỉnh ñộ ñục của huyền dịch vi
khuẩn tương ñương ñộ ñục chuẩn 0,5
McFarland. Hút 100 µl huyền dịch vi khuẩn, ñổ
lên bềmặt thạch Mueller- Hinton, dàn ñều vi
khuẩn trên ñĩa môi trường, lần lượtñục các lỗ
nhỏcao trên môi trường, ñể ở nhiệtñộ phòng
trong 30 phút, rồiñể tủ ấm 37ºC. Sau 24 giờ,ño
vòngức chếvi khuẩn bằng thước kẹp Panmecó
ñộ chính xác 0,1 mm. ðường kính vòng ức chế
vi khuẩnñược tính bằng giá trịtrung bình giữa
8
Hoạt hóa chủng vi khuẩn: Cấy vi khuẩn trên
môi trường dinh dưỡng Casein ñậu tương. Khi
vi khuẩn phát triển làm ñục môi trường thì cấy
chuyển sang môi trường thạch dinh dưỡng,
bảoquản trongtủlạnh ở2 - 8 C.
0
- Chuẩn bịdung dịch pha loãng chếphẩm
TADvàhuyềndịch 02 loại vikhuẩn:
+Từ ống nghiệm gốc chứa chếphẩm TAD (1
g/ml), pha loãng với nước cấtñể ñược các dung
dịchcó nồngñộ0,1; 0,05; 0,02và0,01 g/ml.
Thăm dò nồng ñộ kháng khuẩn của chế
phẩmTAD:
Chỉtiêuñánhgiá:
ðạoñứctrongnghiên cứu
KẾTQUẢ
-Ủvi khuẩn trong dung dịch chếphẩm
TAD ởcác nồng ñộ khác nhau trong 15 phút
và 30 phút.
Nghiêncứu tuân thủcác quyñịnh vềantoàn
sinh học. Sốlượng ñộng vật và vi khuẩn nằm
trong giới hạn quy ñịnh, ñủñể thu ñược kết quả
cóñộtincậyvàxửlýthống kê.
- Chuẩn bịdung dịch pha loãng chếphẩm
TAD và huyền dịch 02 loại vi khuẩn: Tiến hành
tươngtựnhưphần thăm dòởtrên.
3lần thửnghiệm.
- Cấy 100 µl dung dịch ủ ở trên lên ñĩa thạch
Muller –Hinton và xác ñịnh nồng ñộ chếphẩm
TAD thấp nhất và thời gian ủmà vi khuẩn
không mọcñược (diệt99% sốlượng vi khuẩn).
XácñịnhMICcủachếphẩmTAD:
- Mứcñộ phảnứng trên da thỏ, sựtạo vảy và
banñỏ,phù nề,kíchứng.
-ðường kính vòng kháng khuẩn (mm), số
lượng khuẩn lạc (CFU/ml), nồng ñộ ức chếtối
thiểu(MIC).
Phươngpháp xửlývàphân tíchsốliệu
Các sốliệu nghiên cứuñược biểu diễn dưới
dạng ± SD. Sốliệuñược xửlý theo phương
pháp thống kê y học với cỡmẫu nhỏ(<30), sử
dụng T-test Student, test trước sau (Avant -
Après) bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
Sựkhác biệt cóý nghĩa thốngkê vớip<0,05.
X
ðộng vật và vi khuẩn sau khi sửdụng ñược
loạibỏtheo quy ñịnh.
Tínhkíchứngda
SỐ ðẶC BIỆT 02 (60) – 2025
37
Trong suốt thời gian theo dõi, sau khi ñặt
thuốc 1, 2, 4, 6 và 24 giờ, vùng da ñặt mẫu thử
vẫn bình thường, không có dấu hiệu ban ñỏ,
không bịkích ứng, không phù nềhay viêm.
Sau khi bóc mẫu thử, vùng da ñặt chất thửcó
màu nâu vàng, nhưng da nguyên vẹn,
lành lặn, không có biểu hiện sưng tấy, ñỏ
hay viêm nhiễm. Da hoàn toàn khỏe mạnh.
Vùng da ñặt chất thửvà vùng da chứng
tương tựnhau.
ðánh giá tác dụng kháng khuẩn
Chếphẩm TAD có khảnăng kháng
Staphylococcus aureus ởtất cảcác nồng ñộ.
ðường kính vòng vô khuẩn giảm dần khi nồng
ñộ TAD giảm xuống. ðường kính vòng kháng
khuẩn lớn nhất là 27,10 ± 0,707 mm (nồng ñộ 1
g/ml), lớn hơn có ý nghĩa thống kê so với các
nồng ñộ còn lại (p<0,05) và nhỏnhất là 8,2 ±
0,500mm (nồng ñộ0,01g/ml).
Chếphẩm TAD có khảnăng kháng
Staphylococcus aureus ởtất cảcác nồng ñộ.
ðường kính vòng vô khuẩn giảm dần khi nồng
ñộ TAD giảm xuống. ðường kính vòng kháng
khuẩn lớn nhất là 27,10 ± 0,707 mm (nồng ñộ 1
g/ml), lớn hơn có ý nghĩa thống kê so với các
nồng ñộ còn lại (p<0,05) và nhỏnhất là 8,2 ±
0,500mm (nồng ñộ0,01g/ml).
BÀI NGHIÊN CỨU
SỐ ðẶC BIỆT 02 (60) – 2025
