Một số phương pháp đưa ADN tái tổ hợp vào
tế bào chủ
1. Hóa biến nạp
Hiện tượng biến nạp là chìa khóa giúp ta hiểu biết cơ sở phân tử của gen,
cũng là công cụ để thực hiện các thao tác tạo tính di truyền của vật sống.
Theo Mandel và Higa cho thấy rằng, E. Coli trở nên rất dễ bị biến nạp bởi
DNA ngoại lai khi các tế bào vi khuẩn được xử lí trong môi trường có
CaCl2 và trước đó được sốc nhiệt ở 42°C.
Hóa biến nạp là phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa
vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. Quá trình được thực hiện theo hai buớc sau:
Xử lí tế bào chủ trong dung dịch CaCl2 ở nhiệt độ thấp nhằm để thay
đổi màng tế bào và ủ vector tái tổ hợp với tế bào chủ đã xử lí.
Hiệu suất của phương pháp hóa biến nạp này vào khoảng 105 đến 106 tế bào
biến nạp trên 1mg DNA tái tổ hợp. Qua các kết quả thực nghiệm, người ta
thấy rằng, các tế bào phát triển ở pha sớm đến pha giữa dễ được biến
nạp hơn. Những nghiên cứu sau này cho thấy việc xử lí tế bào bằng các ion
kim loại hóa trị hai như Ca+2 , Mn+2 và Ba+2 cũng cho khả năng biến nạp lớn.
Ngoài ra, hiệu suất biến nạp còn phụ thuộc vào kích thước của plasmid,
plasmid càng nhỏ thì hiệu suất biến nạp càng cao.
2. Điện biến nạp
Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trên
màng sinh học của tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp
được dễ dàng.
Hiệu suất: Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, tuy
nhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều có khi lên tới 70%. Hiệu suất của
phương pháp này phụ thuộc vào các yếu tố sau:
- Độ mạnh của điện trường tác động khác nhau đối với các loại tế
bào khác nhau,
- Độ dài của hằng số thời gian (thời gian ngắt xung - ms). Theo
nhiều nghiên cứu, hầu hết đối với các loại tế bào sinh vật, hiệu
quả biến nạp cao khi hằng số thời gian đạt được khoảng 6ms
- Nồng độ tế bào chủ
- Nồng độ DNA tái tổ hợp
- Giai đoạn phát triển của tế bào (tế bào quá già hoặc quá non
đều không thích hợp),
- Môi trường dung dịch đệm,
- Cấu trúc màng tế bào.
3. Biến nạp tế bào trần (protoplast)
Là phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ đã được xử lí bằng
polyetylen glycol (PEG). Để tạo tế bào trần, người ta ủ tế bào với PEG nồng
độ 30% đến 40%. Đây là phương pháp chuyển gen có hiệu quả cao đối với tế
bào thực vật. Bằng phương pháp này, người ta đã nhận được các cây mang
gen biến nạp ổn định và di truyền qua nhiều thế hệ (Potrykus và cộng sự -
1995).
Ưu điểm: Tần số biến nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao. Có
thể chuyển gen vào tế bào protoplast của bất kỳ loại cây nào. Đặc biệt là loại
cây có giá trị kinh tế cao như lúa, ngô, đại mạch.
Nhược điểm: Việc tái sinh cây protoplast còn rất khó khăn ở một số loài cây.
4. Phương pháp bắn gen
Nguyên tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng được bao bọc DNA và bắn
trực tiếp vào tế bào.
Ưu điểm: Phương pháp này có thể biến nạp cho tất cả các loại tế bào thực
vật. Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào.
Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyên nhận được cây biến nạp
khảm (cây có tế bào biến nạp và tế bào không biến nạp).
Một số thành tựu đã đạt được bằng phương pháp bắn gen: Năm 1988, Mc.
Cabe và cộng sự đã nhận được cây đậu tương biến nạp đầu tiên bằng phương
pháp bắn gen. Năm 1990, Promm, Gordon, Kamm và cộng sự đã nhận được
cây ngô biến nạp ở nhiều phòng thí nghiệm. Những năm gần đây có hàng loạt
công bố về biến nạp thành công ở lúa. Năm 1996, Zthang và cộng sự đã biến
nạp ở đu đủ, mía và bông. Điều đó đã khẳng định tính ưu việt của phương
pháp này.
5. Phương pháp vi tiêm
Phương pháp vi tiêm là phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi để đưa
DNA tái tổ hợp vào mỗi tế bào nhất định.
Đây là quá trình lai ghép cho tế bào bậc cao hoặc tế bào hợp tử. Tùy thuộc
từng trường hợp cụ thể, người ta có thể chọn phương pháp sao cho việc đưa
DNA tái tổ hợp vào tế bào có hiệu quả cao.
Ưu điểm: Có thể tối ưu lượng DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào và quyết định
đưa DNA vào loại tế bào nào. Đưa chính xác và thậm chí vào tận nhân của tế
bào và có thể quan sát được. Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn, tế bào
tiền phôi cũng có thể tiến hành một cách chính xác. Có thể biến nạp cho mọi
giống cây.
Nhược điểm: Một phát tiêm chỉ được một tế bào và thao tác cần phải khéo
léo và tỉ mỉ.
6. Tải nạp
Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi
khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, trong đó có quá trình chuyển gen và tái tổ hợp
gen ở vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage).
Thực nghiệm đã chứng minh được tải nạp ở E. Coli qua phage λ, phage P1 và
ở Bacillus subtilis qua phage SP10 . So với các phương pháp trên, tải nạp cho
hiệu suất cao hơn.
Như vậy, đến nay đã có nhiều phương pháp hóa học, hóa lý, cơ học và sinh
học để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ. Tùy các đối tượng và yêu cầu cụ
thể, phương pháp này hay phương pháp khác có hiệu quả và được sử dụng
nhiều hơn.