PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU
VI SINH CƠ BẢN CỦA THỰC PHẨM
1. ĐỊNH LƯỢNG VSV B ẰNG PH ƯƠNG PHÁP ĐẾM
SỐ KHUẨN LẠC TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC
- Đối với vsv đơn bào, ta có thể xem mỗi khuẩn lạc là kết
quả của sự phát triển từ một tế bào ban đầu
- Ưu điểm: định lượng được tế bào sống
- Nhược điểm: tốn nhiều thời gian, nhân lực
Lê Minh Tâm - 2007
55
Pha loãng: ti ến hành pha loãng m ẫu với các độ pha loãng khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3 ...
Tính kết quả:
v Chú ý: ch ọn tất cả các h ộp petri có s ố khu ẩn lạc dao
động trong khoảng 25-250.
Trường hợp 1: chỉ có 1 hộp petri có số khuẩn lạc dao động
trong kho ảng 25-250 (t ất cả các h ộp petri còn l ại có s ố
2
khuẩn lạc dao động nằm ngoài khoảng trên)
=
Công thức tính:
N
+ C C 1 d 2
Trong đó:
N – s ố khu ẩn lạc có trong 1mL m ẫu huy ền phù ban
đầu
C1,C2 – số khuẩn lạc đếm được trên 2 h ộp petri ở độ
pha loãng đã chọn
d – hệ số pha loãng mẫu
Ví dụ: tính số khuẩn lạc có trong 1mL m ẫu ban đầu, biết
Lê Minh Tâm - 2007
56
số liệu thí nghiệm như sau:
Số khuẩn lạc đếm được
Hệ số pha loãng
Hộp petri 1 Hộp petri 2
10-1 40 20
10-2 6 3
Đáp số: 3.102 khuẩn lạc/mL
Trường hợp 2: chỉ có 1 độ pha loãng v ới 2 hộp petri có s ố
khuẩn lạc dao động từ 25-250 (tất cả các hộp petri khác có
số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên)
Công thức tính: tương tự như trên
Ví dụ: tính số khuẩn lạc có trong 1mL m ẫu ban đầu, biết
số liệu thí nghiệm như sau:
Số khuẩn lạc đếm được
Hệ số pha loãng
Hộp petri 1 Hộp petri 2
10-3 > 250 > 250
10-4 150 120
10-5 15 10
Đáp số: ~1,4.106 khuẩn lạc/mL
Trường hợp 3: ở hai độ pha loãng liên ti ếp, các hộp petri
có số khu ẩn lạc dao động từ 25-250. Khi đó, ta ph ải tính
kết quả cho từng độ pha loãng.
3.1 Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên ti ếp chênh
Lê Minh Tâm - 2007
57
lệch nhau 2 lần hoặc nhỏ hơn, ta tính như sau:
C
=
N
)
+ (0,1. nn d 1
2
(cid:229)
Trong đó:
N – số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu huyền phù ban đầu
C – số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn
n1,n2 – số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn
d – hệ số pha loãng mẫu
Ví dụ: - Ở độ pha loãng 10 -2, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp
petri là 151 và 215. Suy ra, s ố khuẩn lạc trong 1mL m ẫu
4
ban đầu là:
=
khuẩn lạc/mL
1,8.10
+ 151215 2.10- 2
- Ở độ pha loãng 10 -3, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp
petri là 25 và 31. Suy ra, s ố khuẩn lạc trong 1mL mẫu ban
4
đầu là:
=
2,8.10
3
khuẩn lạc/mL
+ 2531 2.10-
- Vì chênh lệch giữa 1,8.104 và 2,8.10 4 không lớn hơn hai
4
lần, nên kết quả cuối cùng như sau:
=
=
N
1,9.10
2
-
khuẩn lạc/mL
+ ++ 1512152531 + (20,1.2).10
Lê Minh Tâm - 2007
58
3.2 Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên ti ếp chênh
lệch nhau lớn hơn 2 lần: sử dụng độ pha loãng nhỏ hơn để
tính kết quả:
Ví dụ: - Ở độ pha loãng 10 -2, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp
petri là 180 và 250. Suy ra, s ố khuẩn lạc trong 1mL m ẫu
4
ban đầu là:
=
2,2.10
khuẩn lạc/mL
+ 180250 2.10- 2
- Ở độ pha loãng 10 -3, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp
petri là 60 và 75. Suy ra, s ố khuẩn lạc trong 1mL mẫu ban
4
=
6,8.10
đầu là:
khuẩn lạc/mL
3
+ 6075 2.10-
Vì chênh lệch giữa 2,2.104 và 6,8.104 lớn hơn 2 lần, nên ta sẽ sử dụng độ pha loãng nhỏ hơn 10-2 để tính kết quả. Số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu sẽ là 2,2.104
Trường hợp 4: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc nhỏ
hơn 25. Khi đó, ta s ẽ ch ọn hệ số pha loãng th ấp nh ất để
tính kết quả:
Lê Minh Tâm - 2007
59
Ví dụ: kết quả thí nghiệm thu được như sau:
Số khuẩn lạc đếm được
Hệ số pha loãng
Hộp petri 1 Hộp petri 2
10-1 20 15
10-2 3 2
Chọn hệ số pha loãng th ấp nh ất là 10 -1. Số khu ẩn lạc có
trong 1mL mẫu ban đầu là:
2
-
=
N
1,8.10
1
-
;
khuẩn lạc/mL
+ 2015 2.10
Trường hợp 5: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc lớn
hơn 250. Khi đó, ta s ẽ ch ọn hệ số pha loãng cao nh ất để
tính kết quả:
Số khuẩn lạc đếm được
Hệ số pha loãng
Hộp petri 1 Hộp petri 2
10-4 2550 2800
10-5 260 300
7
=
=
N
2,8.10
Chọn hệ số pha loãng th ấp nh ất là 10 -5. Số khu ẩn lạc có
-
khuẩn lạc/mL
trong 1mL mẫu ban đầu là: + 260300 5 2.10
Trường hợp 6: không có khuẩn lạc nào mọc trên tất cả các
) hộp petri. Khi đó, ta s ẽ ghi k ết qu ả là có ít h ơn (1x 1 d
Lê Minh Tâm - 2007
60
khuẩn lạc. Trong đó, d là hệ số pha loãng thấp nhất.
Ví dụ: hệ số pha loãng m ẫu lần lượt là 10 -3, 10 -5 và 10 -7.
Sau khi nuôi c ấy không th ấy có khu ẩn lạc nào phát tri ển trên tất cả các hộp petri. Ta ghi k ết quả như sau: < 1.10 -3
khuẩn lạc trong 1mL mẫu ban đầu.
2. TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG TP
- Đánh giá khái quát v ề tình tr ạng vệ sinh c ủa th ực
phẩm, dự đoán thời gian bảo quản của sản phẩm.
- Tổng số VK hi ếu khí cho phép có m ặt trong sản phẩm có thể thay đổi, cao nhất là 5.104 khuẩn lạc/g sản phẩm.
- Sử dụng môi trường thạch tryptone glucose:
Tryptone : 5g
Chất chiết nấm men : 2,5g
Glucose : 1g
Thạch : 15-20g
Nước cất (định mức) : 1L
pH cuối : 7,0 – 0,2
Tiệt trùng môi trường ở 1210C trong thời gian 15 phút
- Cách thực hiện:
• Chuẩn bị mẫu: lấy 25g m ẫu rồi cho vào bình xay
vô khuẩn. Cho ti ếp vào bình xay 225mL n ước peptone và
Lê Minh Tâm - 2007
61
xay nhuyễn mẫu. Ta sẽ thu được dd huy ền phù có độ pha
loãng là 10 -1. Sử dụng nước peptone để tiếp tục pha loãng mẫu với các hệ số pha loãng là 10-2, 10-3 …
• Cấy mẫu: mẫu thực phẩm được nuôi cấy với ba độ
pha loãng khác nhau, s ử dụng 2 hộp petri cho m ỗi độ pha
loãng.
• Nuôi cấy: mẫu được giữ trong điều kiện hiếu khí ở
nhiệt độ 300C-350C trong thời gian từ 48-72g.
- Tính kết qu ả: tương tự nh ư ph ương pháp định lượng
vi sinh vật trên môi trường đặc.
3. TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ NẤM SỢI TRONG TP
- Tiến hành tương tự như phương pháp xác định tổng vi
khuẩn hiếu khí trong thực phẩm.
- Sử dụng môi trường thách nấm men và nấm sợi (Yeast
and mould agar). Thành phần như sau:
Chất chiết nấm men : 3g
Chất chiết malt : 3g
Peptone : 5g
Dextrose : 10g
Thạch : 20g
Nước cất : 1L
pH cuối : 6,2 – 0,2
Lê Minh Tâm - 2007
62
Tiệt trùng môi trường ở 1210C trong thời gian 15 phút
4. SỐ BÀO TỬ TRONG GIA VỊ THỰC PHẨM
- Có 2 gi ống bào t ử th ường gặp trong công ngh ệ th ực
phẩm là Bacillus và Clostridium. Các loài thu ộc gi ống
Bacillus thu ộc nhóm hi ếu khí b ắt bu ộc ho ặc kỵ khí tùy
tiện; còn các loài thu ộc giống Clostridium thu ộc nhóm kỵ
khí bắt buộc.
- Chúng ta xác định số bào tử trong gia vị thực phẩm, ví
dụ như tiêu đen.
- Phương pháp thực hiện:
• Chuẩn bị mẫu: cân 1g tiêu đen cho vào erlen ch ứa 99mL peptone. Đặt erlen vào b ể điều nhi ệt ở 80 0C trong
thời gian 30 phút. Tr ộn th ật đều mẫu và ti ến hành pha
loãng.
• Cấy mẫu: dùng ph ương pháp c ấy mẫu trên môi
trường thạch trong hộp petri.
• Nuôi cấy: đặt các hộp petri vào t ủ ấm, nuôi kỵ khí.
Nuôi ở 350C trong 48-72g.
- Tính kết qu ả: tương tự nh ư ph ương pháp định lượng
Lê Minh Tâm - 2007
63
vi sinh vật trên môi trường đặc.
VỆ SINH CÔNG NGHIỆP
1. KIỂM TRA VI SINH NGUỒN NƯỚC SẢN XUẤT
- Trong thực tế sản xuất, nhà máy th ường dựa vào 2 ch ỉ
tiêu cơ bản sau đây:
• Tổng số vi khuẩn hiếu khí • Tổng số Coliform và Coliform phân • Dùng E. coli làm vi sinh vật chỉ thị
- Một số khái niệm cơ bản:
• Coliform là trên g ọi chung để ch ỉ một nhóm vi
khuẩn G(-) thuộc họ Enterobacteriaceae.
• Có những vi khuẩn thuộc nhóm Coliform không có
nguồn gốc từ phân
• Điểm khác bi ệt gi ữa nhóm Coliform có ngu ồn gốc
từ phân là chúng có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 440C.
- Môi tr ường sử dụng: Desoxycholate, Mac Conkey,
Violet Red Bile Agar (VRBA)
Chú ý: ki ểm tra E. coli bằng các th ử nghiệm sinh hóa
(kiểm tra Indol-d ương tính, Methyl red-d ương tính,
Lê Minh Tâm - 2007
64
Voges-Proskauer-âm tính, citrate-âm tính)
2. XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHI ỄM VI SINH V ẬT CỦA
KHÔNG KHÍ TRONG PHÂN XƯỞNG SẢN XUẤT
- Sử dụng ph ương pháp đếm khu ẩn lạc trên h ộp petri
chứa môi trường thạch
- Lấy mẫu không khí:
• Phương pháp truy ền thống: đặt các h ộp petri trên
tại một vài v ị trí trong phân x ưởng. Tại mỗi vị trí trong
phân xưởng, sử dụng 2 h ộp petri ch ứa môi tr ường th ạch
tryptone glucose và 2 h ộp petri ch ứa môi tr ường th ạch
nấm men, nấm mốc. Thời gian mở nắp hộp để cấy vsv có
thể kéo dài đến 1g.
• Dùng membrane để vi lọc không
khí: lọc không khí b ằng membrane;
sau đó, đặt membrane vào hộp petri vô
khuẩn. Ti ến hành t ương tự nh ư
phương pháp truyền thống.
- Nuôi cấy: đối với các hộp petri chứa môi trường thạch tryptone glucose, nuôi ở 370C trong thời
Lê Minh Tâm - 2007
65
gian 24g; hộp petri ch ứa môi tr ường thạch nấm men nấm mốc được nuôi ở 300C trong 48g.
3. XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHIỄM VSV CỦA THIẾT BỊ
- Kiểm tra: các thi ết bị ch ế bi ến, thi ết bị ch ứa nguyên
liệu, bán thành ph ẩm, thành ph ẩm (nguyên li ệu hoặc sản
phẩm đã bị nhiễm vi sinh vật).
rửa bằng - Quy trình vệ sinh: rửa thiết bị bằng nước fi
rửa bằng nước fi rửa bằng dung dịch hóa chất (soude) fi
có chứa chất diệt khuẩn fi rửa lại bằng nước sạch
- Thường kiểm tra chỉ tiêu: tổng số vi khuẩn hiếu khí
- Lấy mẫu:
Lê Minh Tâm - 2007
66
• Sử dụng nước rửa thiết bị gieo cấy • Sử dụng miếng gạt để lấy mẫu bề mặt
