Bài tiểu luận: Phát hiện và đếm coliforms trong nước uống, các phương pháp hiện thời và phương pháp tiếp cận nổi bậc

ƯƠ

BÔ CÔNG TH

NG

ƯỜ

Ạ Ọ

Ự

Ẩ

Ệ

TR

NG Đ I H C CÔNG NGHI P TH C PH M

Ố Ồ

THÀNH PH H CHÍ MINH

Ự

Ẩ

Ệ

KHOA CÔNG NGH TH C PH M



ự

ẩ

Môn : Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ề Đ Tài

:

Detection And Enumeration Of Coliforms In Drinking Water: Current Methods And Emerging Approaches

ệ

ướ

ố ế

ươ

(Phát Hi n Và Đ m Coliforms Trong N c U ng: Các ậ ng Pháp Ti p C n Ph

ế ệ ờ ng Pháp Hi n Th i Và Ph ổ ậ N i B c)

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

TP.HCM,THÁNG 112014

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 2

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

Ụ

M C L C

Ụ

M C L C 3 ......................................................................................................... TÓM T T Ắ 4 ......................................................................................................... 5 ....................................................................................................................... 1. Giới Thiệu

1.1. Coliforms là gì?

7 ...............................................................................................................

2. Mục Tiêu

10 .......................................................................................................................

3. Phương Pháp Cổ Điển

10 .................................................................................................

10 3.1. Kỹ thuật lên men nhiều ống ..........................................................................................

12 3.2. Kỹ thuật màng lọc .........................................................................................................

4. Phương Pháp Enzyme

15 .................................................................................................

15 4.1 Nguyên tắc chung ..........................................................................................................

4.2. Kỹ thuật có/ không có sự hiện diện của vi khuẩn và đếm bằng các kỹ thuật nhiều ống 17 sử dụng phương pháp enzyme ...........................................................................................

4.3. MF kỹ thuật liên hợp với phát hiện enzyme của vi khuẩn

20 ............................................

4.4. Xác định trực tiếp hoạt tính của enzyme bằng fluorimetry

21 ...........................................

4.5. Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp sử dụng enzyme đếm tế bào pha rắn

22 ...........

4.6. Kết luận về phương pháp enzyme

23 ...............................................................................

24 5. Phương Pháp Phân Tử ...............................................................................................

24 5.1. Phương pháp miễn dịch ..............................................................................................

28 5.2. Phương pháp dựa trên axit nucleic .............................................................................

6. Kết Luận

41 .......................................................................................................................

Ờ Ả Ơ 44 L I C M N ................................................................................................

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 3

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

TÓM T T Ắ

ượ ử ụ ủ ộ ỉ Nhóm coliform đ ư ộ c s d ng r ng rãi nh m t ch tiêu c a ch t l ấ ượ ng

ề ươ ệ ị ệ ứ ử ế ệ ẫ ả ỏ ướ n c và v ph ộ ng di n l ch s đã d n đ n khái ni m b o v s c kh e c ng

ể ể ụ ủ ệ ươ ệ ồ đ ng. M c đích c a vi c xem xét này là đ ki m tra ph ng pháp hi n đang

ể ượ ề ể ấ ặ ị ượ ượ ử ụ đ c s d ng ho c có th đ ệ c đ xu t cho vi c ki m tra đ nh l ng coliforms

ướ ố trong n c u ng.

ự ế ử ệ ề ạ ầ ơ ơ Trên th c t , nhu c u v các th nghi m nhanh h n, nh y h n và c th ụ ể

ầ ế ệ ướ ậ ỹ ề ơ h n là đi u c n thi t trong ngành công nghi p n c. Các k thu t thông th ườ ng

ượ ừ ượ ư ả ậ ươ và đ ậ ộ c th a nh n r ng rãi, đã đ c th o lu n, nh là các ph ổ ậ ng pháp n i b c

ứ ầ ể ủ ừ ự t s phát tri n c a các nghiên c u g n đây.

ươ ố ượ ể ệ ấ ậ Ph ề ng pháp truy n th ng đã đ c ch p nh n đ phát hi n coliform bao

ử ụ ề ố ậ ậ ọ ỹ ỹ ồ g m k thu t lên men nhi u ng (MTF) và k thu t màng l c (MF) s d ng môi

ườ ấ ụ ể ệ ủ ề ữ ươ tr ng nuôi c y c th và đi u ki n khác nhau. Nh ng ph ẫ ng pháp này v n

ư ờ ữ ế ạ ạ ủ ệ ự ệ ẳ còn nh ng h n ch , ch ng h n nh th i gian ậ ố b nh, s can thi p sinh v t đ i

ụ ể ố ớ ế ệ ậ ể ệ kháng, thi u tính c th và vi c phát hi n kém đ i v i các vi sinh v t phát tri n

ồ ạ ể ậ ặ ấ ỹ ể ch m ho c có th phát tri n và t n t ậ i mà không nuôi c y. Ngày nay, k thu t

ọ ơ ả ố ươ ượ ử ụ màng l c đ n gi n và không t n kém là ph ng pháp đ ấ ộ c s d ng r ng rãi nh t

ượ ườ ướ ố ệ ị cho vi c đ nh l ng thông th ng coliforms trong n c u ng.

ự ư ệ ệ ặ ả ệ ạ Vi c phát hi n coliforms d a trên ho t tính enzyme đ c tr ng đã c i thi n

β β ủ ạ ộ ươ ượ đ c đ nh y c a các ph ng pháp này. Các enzyme D galactosidase và D

ượ ử ụ ệ ộ ị ượ glucuronidase đ ể c s d ng r ng rãi đ phát hi n và đ nh l ổ ng coliforms t ng

ươ ứ ề ấ và Escherichia coli, t ng ng. Nhi u ch t chromogenic và fluorogenic đ ượ c

ệ ụ ể ủ ử ể ệ ạ dùng đ phát hi n c th ho t tính c a các enzyme này và các th nghi m mang

ươ ạ ượ ự ề ự ấ tính th ng m i khác nhau đ ẵ c d a trên các ch t có s n này. Nhi u s so sánh

ữ ử ệ ể ế ấ ộ ợ đã cho th y nh ng th nghi m này có th là m t thay th thích h p cho các k ỹ

ậ ổ ể ươ ờ ủ thu t c đi n. Tuy nhiên, ph ắ ơ ng pháp này thì đ t h n, và th i gian ặ , m c dù

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 4

ư ể ế ả ả ẫ gi m, nh ng v n còn quá dài đ cho k t qu cùng ngày.

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ậ ế ư ỹ ụ ơ ế ắ Các công c phân tích tinh vi h n nh k thu t đ m t bào pha r n có th ể

ụ ể ầ ờ ế ể ạ ộ ệ ượ ậ đ ả c t n d ng đ làm gi m th i gian c n thi ủ t đ phát hi n các ho t đ ng c a

ở ẩ ộ ớ ưỡ ệ ệ ấ enzyme vi khu n, v i m t ng ằ ng phát hi n th p. Phát hi n coliforms b ng

ươ ử ượ ề ậ ươ ph ng pháp phân t này cũng đ c đ c p, vì các ph ữ ng pháp này cho nh ng

ệ ấ ụ ể ấ ầ phát hi n r t c th và nhanh chóng mà không c n nuôi c y.

ươ ở ễ ậ ỹ ị Ba ph ng pháp phân t ử ượ đ c đánh giá đây: các k thu t mi n d ch,

ả ứ ỗ ỗ ươ ph n ng chu i polymerase (PCR) và lai t i ng pháp ạ ch (ISH). Trong cách ph

ễ ể ố ị ạ ẩ ượ ạ mi n d ch, các kháng th khác nhau ch ng l i vi khu n coliform đ c t o ra,

ư ệ ậ ỹ ườ ấ ặ ụ nh ng vi c áp d ng k thu t này th ệ ể ng cho th y kháng th mang tính đ c hi u

ể ượ ử ụ ể ệ ẩ ằ ấ th p. PCR có th đ c s d ng đ phát hi n vi khu n coliform b ng ph ươ ng

ế ệ ạ ự pháp khu ch đ i tín hi u: trình t DNA mã hóa cho các gen lacZ (gen b

ượ ử ụ ể galactosidase) và gen uidA (b – D gen glucuronidase) đã đ c s d ng đ phát

ệ ổ ươ ứ ệ ị ượ hi n t ng coliforms và E. coli, t ng ng. Tuy nhiên, vi c đ nh l ớ ng v i PCR

ế ệ ệ ả ỏ ẫ v n thi u chính xác và đòi h i ph i làm vi c trong phòng thí nghi m chuyên

ệ ử ụ ế ầ ậ ỹ ụ d ng. K thu t FISH liên quan đ n vi c s d ng các đ u dò oligonucleotide đ ể

ệ ự ổ ế ụ ể ầ phát hi n các trình t b sung bên trong t bào c th . Đ u dò oligonucleotide

ế ệ ủ ạ ử ượ đ c thi ế ặ t k đ c bi t cho ph m vi c a các phân t ủ RNA 16S c a

ể ượ ử ụ ấ ượ ủ Enterobacteriaceae có th đ ể ể c s d ng đ ki m soát ch t l ng vi sinh c a các

ướ ộ ỹ ậ ầ ể ế ố ẫ m u n c u ng. FISH nên là m t k thu t c n quan tâm có th thay th cho các

ươ ấ ườ ể ị ướ ố ph ng pháp nuôi c y thông th ng đ xác đ nh nhóm coliform trong n c u ng,

ữ ệ ấ ị ượ ả ắ ộ ờ vì nó cung c p các d li u đ nh l ng trong m t kho ng th i gian khá ng n (6 –

ỏ ỗ ự ư ứ ế ẫ 8 ti ng), nh ng v n đòi h i n l c nghiên c u.

ớ

ệ

1. Gi

i Thi u

ệ ứ ệ ả ồ ườ ỏ ướ ố ỏ Vi c b o v s c kh e công đ ng và môi tr ng đòi h i n ả c u ng ph i

ứ ữ ề ệ an toàn, đi u đó có nghĩa là không ch a VSV gây b nh. Gi a các VSV phân tán

ồ ướ ệ ở ộ ạ ễ ắ ặ ữ ấ trong các ngu n n c, VSV gây b nh ru t là nh ng lo i d b t g p nh t. Nh ư

ộ ệ ễ ả ồ ướ ạ ộ m t h qu , các ngu n ô nhi m phân trong n c dành cho ho t đ ng con ng ườ i

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 5

ả ượ ể ẽ ệ ặ ườ ộ ph i đ c ki m soát ch t ch . Tác nhân gây b nh đ ư ng ru t, nh Escherischia

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ườ ệ ạ ồ ộ ấ ệ ấ ườ coli O157: H7, th ng hi n di n t i n ng đ r t th p trong môi tr ng n ướ c

ộ ệ ự ậ ạ ươ ứ ạ ượ trong m t h vi th c v t đa d ng. Các ph ng pháp ph c t p đ c đòi h i đ ỏ ể

ữ ệ ươ ầ ố ờ phát hi n ra chúng, và nh ng ph ế ng pháp này thì vô cùng t n th i gian. H u h t

ớ ố ượ ệ ệ ệ ự ậ ườ ớ ườ coliform hi n di n v i s l ng l n trong h th c v t đ ộ ủ ng ru t c a ng i và

ế ậ ượ ấ ả ộ đ ng v t máu nóng khác, và vì th nên chúng đ c tìm th y trong phân th i. Nh ư

ộ ệ ả ượ ệ ở ồ ệ ẩ ộ ơ m t h qu , coliforms, đ c phát hi n n ng đ cao h n vi khu n gây b nh,

ỉ ố ể ệ ự ệ ư ộ ề ẩ ủ ệ ượ ử ụ đ c s d ng nh m t ch s th hi n s hi n di n ti m n c a tác nhân gây

ườ ộ ườ ướ ệ ử ụ ệ b nh đ ng ru t trong môi tr ng n c. Vi c s d ng các nhóm coliform, và c ụ

ư ộ ể ơ ỉ ố ấ ượ ủ ướ ừ ự th h n là E. coli, nh m t ch s vi sinh c a ch t l ng n c có t ậ s phân l p

ủ ậ ừ ố ầ đ u tiên c a các vi sinh v t này t ế ỷ ứ phân vào cu i th k th 19. Coliforms cũng

ườ ượ ấ ườ ự ư ộ ạ th ng đ c tìm th y trong môi tr ng t nhiên đa d ng, nh m t vài loài trong

ố ừ ấ ư ồ ướ ố ộ ườ ố s đó có ngu n g c t đ t, nh ng n ả c u ng không ph i là m t môi tr ng t ự

ệ ủ ự ệ ủ ướ ả ượ ấ ố nhiên c a chúng. S hi n di n c a chúng trong n c u ng ít nh t ph i đ c coi

ậ ề ự ệ ủ ặ ấ ủ ố ọ ộ là m t m i đe d a ho c d u hi u c a vi sinh v t v s suy thoái c a ch t l ấ ượ ng

ố ẫ ổ ươ ồ ướ ộ ượ ử ướ n c. S m u coliform t ng d ng tính trong m t ngu n n c đã đ c x lý mà

ườ ệ ử ể ệ ả th ấ ỉ ng không có coliform thì có th là ch ra vi c x lý không có hi u qu , m t

ủ ử ủ ự ự ấ ọ ộ ị mát c a ch t kh trùng, b ch c th ng (McFeters và các c ng s , 1986), s xâm

ủ ậ ướ ễ ấ ồ ướ ạ nh p c a n c ô nhi m vào các ngu n cung c p n c sinh ho t (Geldreich và

ự ự ề ặ ấ ộ ộ ử ụ các c ng s , 1992; Clark và các c ng s , 1996) ho c các v n đ tái s d ng

ư ộ ệ ệ ố ả ố (LeChevallier, 1990) trong h th ng phân ph i, và, nh m t h qu , không đ ượ c

cho phép.

ỉ ố ề ệ ệ ử ụ ư ộ ể ệ ệ Vi c s d ng các nhóm coliform nh m t ch s v vi c có th hi n di n

ệ ườ ộ ề ệ ố ủ ộ các tác nhân gây b nh đ ng ru t trong các h th ng th y sinh là m t đ tài

ề ậ ả ệ ườ ề tranh lu n trong nhi u năm. Nhi u tác gi ị đã báo cáo d ch b nh qua đ ng n ướ c

ộ ọ ướ ự ị trong cu c h p quy đ nh coliform trong n ộ c (Payment và các c ng s , năm 1991;

ự ự ộ ộ ộ Moore và các c ng s , 1994; MacKenzie và các c ng s , 1994; Gofti và các c ng

ụ ủ ế ể ả ả ậ ự s , 1999). Tuy nhiên, m c đích c a bài vi t này không ph i là đ th o lu n v ề

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 6

ỉ ố ệ ể ị ươ các khái ni m ch s , mà là đ xác đ nh ph ệ ng pháp hi n đang đ ượ ử ụ c s d ng

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ể ượ ặ ề ệ ị ướ ố ho c có th đ c đ ngh cho vi c theo dõi coliforms trong n ự ầ c u ng. S c n

ế ủ ể ệ ơ ổ thi ạ t c a các ki m nghi m nhanh và nh y h n là không thay đ i trong ngành

ệ ướ ụ ủ ụ ự ế ớ công nghi p n c, v i m c đích là theo dõi tr c tuy n liên t c c a các nhà máy

ướ ử x lý n ả c th i.

1.1. Coliforms là gì?

ộ ự ữ ề ạ ậ ồ Các nhóm coliform bao g m m t s đa d ng phong phú v thu t ng chi

ế ầ ặ ộ ọ ị và loài, dù có ho c không thu c h Enterobacteriaceae. H u h t các đ nh nghĩa

ủ ế ự ặ ườ coliforms là ch y u d a trên các đ c tính sinh hóa thông th ng. Trong các

ươ ệ ể ẩ ướ ướ ả ph ng pháp tiêu chu n cho vi c ki m tra n c và n c th i (Part 9221 và 9222;

ự ộ ượ ả ư APHA và các c ng s , 1998),các thành viên nhóm coliform đ c mô t nh sau:

ấ ả ề ế ỳ ỵ ử 1. T t c đ u k khí và hi u khí tu ý, gram , không bào t ẩ , vi khu n

oC (K thu t ậ ỹ

ạ ở hình que và lên men lactose sinh khí và t o axit trong vòng 48h 35

ề ố ầ ặ lên men nhi u ng; Ph n 3.1) ho c

ấ ả ế ỵ ỳ ử ề 2. T t c hi u khí và k khí nhi u tu ý, gram âm, không bào t ẩ , vi khu n

ể ộ ỏ ở ẩ ạ hình que phát tri n thành m t khu n l c màu đ ánh kim trong vòng 24h 35

ườ ọ ỹ ứ ầ ậ ạ ộ trên m t môi tr ng lo i Endo có ch a lactose (màng l c k thu t; Ph n 3.2).

ủ ầ ị ượ Đ nh nghĩa các thành viên c a nhóm coliform g n đây đã đ ở ộ c m r ng

β ả ứ ư ể ẳ ặ ồ ạ bao g m các đ c đi m khác, ch ng h n nh ph n ng Dgalactosidase d ươ ng

ệ ề ầ ể tính (Part 9223;. APHA et al, 1998) (ki m tra enzyme n n, ph n 4.2). Vi c tìm

β ế ươ ệ ươ ậ ki m các vi sinh v t galactosidase d β ng tính và đ m galactosided ng tính

ộ ướ ậ ậ ỹ cũng cho phép m t b ề c xác nh n lên men lactose, khi đó k thu t lên men nhi u

ố ượ ử ụ ử ệ ượ ử ụ ng đ c s d ng. Các th nghi m cytochrome oxidase cũng đ c s d ng nh ư

ể ạ ỏ ộ ố ủ ử ệ ẩ ẳ ộ ị là m t th nghi m kh ng đ nh đ lo i b m t s vi khu n c a chi Aeromonas

ể ặ ho c Pseudomonas mà có th lên men lactose.

ủ ẩ ộ ố ị ặ ơ Đ nh nghĩa c a vi khu n coliform h i khác tùy thu c vào qu c gia ho c

ổ ứ ề ệ ạ ị ị các t ị ch c ch u trách nhi m v các quy đ nh giám sát vi sinh. T i Canada, đ nh

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 7

ư ở ỹ ộ ố ướ ớ ệ ộ ố nghĩa gi ng nh M , và khác v i m t s n ụ c châu Âu. Ví d , Hi p h i Tiêu

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ể ượ ẩ chu n Pháp (NFT90413 và NFT90414; AFNOR, 1990), nó có th đ c xem là

ệ ạ ậ ộ ổ ị ư m t mô hình đ i di n cho lu t pháp châu Âu, xác đ nh coliforms t ng (TC) nh :

(cid:0) Hình que, không bào t

ử ế , gram âm, oxidase âm tính, hi u khí ho c k ặ ỵ

ự ệ ủ ể ệ ẩ ố ỳ ậ ể khí tu ý. Vi khu n có th phát tri n trong s hi n di n c a mu i m t

ề ặ ế ự ứ ụ ế ạ ặ ấ ho c ch t có ho t tính b m t thay th khác có tác d ng c ch s tăng

ưở ươ ự ặ tr ng t ng t và lên men lactose sinh khí và sinh acid (ho c aldehyde)

oC.

trong vòng 48 gi ờ ở 37 ± 1

ằ ơ ị AFNOR (1990) đi xa h n b ng cách đ nh nghĩa nhóm coliform khác, bao

ả ị ệ ụ ể ơ ọ ồ g m c các coliform ch u nhi t (còn g i là coliforms phân, FC), và c th h n, E.

coli là:

(cid:0) Coliforms ch u nhi

ị ệ ư ặ t có cùng đ c tính lên men nh coliforms (TC),

oC.

ư ệ ộ nh ng nhi t đ 44 ± 0,5

(cid:0) E. coli là m t coliform ch u nhi

ộ ị ệ ề ạ ộ ỉ t, ch khác m t vài đi u, t o indole

oC, cho k t qu th nghi m methyl đ

ạ ệ ộ ả ử ệ ế ừ t tryptophane t i nhi t đ 44 ± 0.5 ỏ

ể ạ ươ d ử ụ ng tính, không th t o ra acetylmethyl carbinol và không s d ng

ấ ủ ồ citrate làm ngu n carbon duy nh t c a nó.

ệ ử ụ ư ộ ỉ ố ễ ả Vi c s d ng các nhóm coliform nh m t ch s ô nhi m phân ph i ph ụ

ặ ủ ủ ả ộ ị thu c vào các quy đ nh nghiêm ng t c a chính ph (B ng 1). E. coli là coliforms

ệ ự ậ ườ ổ ế ấ ộ ủ ộ ậ ậ ộ ph bi n nh t trong h th c v t đ ng ru t c a đ ng v t máu nóng đ ng v t và

ủ ế ủ ệ ể ế ễ ự ệ s hi n di n c a nó có th liên quan ch y u đ n ô nhi m phân. Do đó không

ướ ố ượ đ c phép có E. coli trong n c u ng.

ệ ơ ườ ộ ố ệ ỳ ả C quan B o v Môi tr ng Hoa K (EPA) đã phê duy t m t s ph ươ ng

ề ố ể ệ ậ ỹ ỹ ọ ậ pháp đ phát hi n coliform: các k thu t lên men nhi u ng, k thu t màng l c

ử ử ệ ệ ặ ặ ồ và các th nghi m có m t /không có m t (bao g m các th nghi m ONPG –

ệ ỹ ề ố ậ ỹ ậ MUG). AFNOR (1990) đã phê duy t k thu t lên men nhi u ng và k thu t

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 8

màng l c. ọ

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ươ ư ờ ữ ế ạ ạ ẳ Các ph ng pháp này có nh ng h n ch , ch ng h n nh th i gian ủ ự , s

ụ ể ở ậ ố ủ ệ ế can thi p c a sinh v t đ i kháng, thi u tính c th các nhóm coliform và đ ộ

ủ ố ớ ặ ị ổ ể ệ ậ ươ phát hi n kém c a đ i v i coliforms phát tri n ch m ho c b t n th ế ng. Vì th ,

ệ ố ộ ườ ỉ ộ ầ ổ ỏ tùy thu c vào h th ng môi tr ng, ch m t ph n nh (0,115%) trong t ng s ố

ể ượ ể ầ ẩ ế ở ươ qu n th vi khu n có th đ c đ m b i ph ấ ng pháp nuôi c y (Amann và các

ỷ ệ ự ể ị ả ấ ẩ ưở ộ c ng s , 1990). T l vi khu n không nuôi c y có th b nh h ề ở ng b i đi u

ậ ợ ệ ể ẩ ấ ố ki n không thu n l ặ i cho vi khu n phát tri n trong su t quá trình nuôi c y ho c

ạ ộ ủ ả ố ở ạ ặ ở b i kh năng s ng sót ho c ho t đ ng c a chúng ấ tr ng thái không nuôi c y

ặ (VBNC ho c ABNC) (Roszak và Colwell, 1987; Joux và Lebaron, 2000; Colwell

và Grimes, 2000).

ộ ố ệ ễ ẩ ả ị ướ ố B ng 1. M t s quy đ nh ch ng nhi m khu n hi n và h ẫ ng d n cho

ướ ố n c u ng

ầ Yêu c u giám sát Coliform t ngổ E.coli ẫ M t đậ ộ M u/tháng

0/100 ml (95%)

≈ United 0/100 ml 1/1000 sinh ẫ ộ m t m u liên ti p t ế ừ

(100%) v tậ Statesa ị cùng v trí không đ ượ c

có coliform

0/100 ml (90%)

ứ ề không nên ch a nhi u

ẫ <5000 4 m u/ tháng ơ h n 10 CFU/100 ml 0/100 ml Canadab (100%) 5000 – 9000 1/1000 sinh v tậ ẫ ộ m t m u liên ti p t ế ừ

ộ ị cùng m t v trí không

ượ đ c có coliform

ị

Trang 9

GVGD: Phan Th Kim Liên

ổ ứ T ch c y t ế 0/100 ml 90 + (1/10000 0/100 ml (95%) >9000 (100%) sinh v t)ậ th gi ế ớ c i

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ệ ơ ườ ả a. C quan B o v Môi tr ỳ ng Hoa K năm 1990.

ế ộ b B y t Canada, 1996.

ế ế ớ ổ ứ c T ch c Y t Th gi i, 1994.

ụ 2. M c Tiêu

ướ ố ưỡ ươ ấ Vì n ế ộ c u ng là ch đ nghèo dinh d ng, các ph ng pháp nuôi c y kém

ệ ệ ạ ế ị ổ ươ ế ắ nh y trong vi c phát hi n các t ẩ bào vi khu n b t n th ng và s p ch t có th ể

ứ ộ ữ ế ệ ấ ạ ọ ễ ạ t o ra nh ng h n ch nghiêm tr ng do vi c đánh giá quá th p m c đ ô nhi m.

ồ ạ ươ ể ượ ử ụ ệ ể Có t n t i các ph ng pháp khác mà có th đ c s d ng đ phát hi n coliform,

ủ ự ữ ứ ụ ể ạ và là nh ng tr ng thái khác nhau c a s phát tri n và ng d ng. Đánh giá này mô

ứ ắ ườ ươ ả t các nguyên t c và các cách th c thông th ủ ng c a ph ổ ể ng pháp c đi n, cũng

ư ộ ố ươ ớ ươ ớ ổ ế nh m t s các ph ổ ng pháp đ i m i và ph ệ ậ ng pháp ti p c n m i n i. Vi c

ứ ụ ươ ể ệ ộ ng d ng các ph ng pháp khác nhau đ phát hi n coliforms trong m t môi

ườ ấ ưỡ ư ướ ố ượ ự tr ng nghèo ch t dinh d ng nh n c u ng cũng đ c đánh giá d a trên

ữ ư ể ượ ư ớ ạ ủ ệ ể nh ng u đi m và nh c đi m c a chúng. Các tiêu chí nh gi i h n phát hi n và

ạ ươ ầ ờ ế ể ượ ế ủ ộ đ nh y c a các ph ng pháp, th i gian c n thi t đ có đ ả c k t qu và các

ả ỹ ủ ệ ồ ộ kinh phí c a phòng thí nghi m (bao g m c k năng, lao đ ng và chi phí) cũng

ả ậ ượ đ c th o lu n.

ươ

ổ ể

3. Ph

ng Pháp C Đi n

ề ố ậ ỹ 3.1. K thu t lên men nhi u ng

ậ ể ế ằ ỹ ươ ề ố K thu t đ đ m coliforms b ng ph ng pháp lên men nhi u ng (MTF)

ượ ử ụ ư ơ ộ ươ đã đ c s d ng h n 80 năm nh là m t ph ể ng pháp ki m tra ch t l ấ ượ ng

c.ướ n

ươ ệ ấ ạ ớ ố ồ ị Ph ộ ng pháp này bao g m vi c c y m t lo t các ng v i dung d ch pha

ợ ủ ẫ ậ ướ ạ ọ loãng th p phân thích h p c a các m u n ặ c. T o b t khí, hình thành axit ho c

oC thì có th là ph n ng ả ứ ể

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 10

ưở ề ệ ố tăng tr ng nhi u trong ng nghi m sau 48 gi ờ ủ ở 35

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ả ườ ể ề ị ươ d ng tính. C môi tr ng d ch th lactose và lauryl tryptose đ u có th đ ể ượ ử c s

ườ ấ ả ị ư ộ ư ộ ụ d ng nh m t môi tr ng nuôi c y gi đ nh, nh ng Seidler và các c ng s ự

ớ ố ượ ệ ộ ớ ự (1981) và Evans và các c ng s (1981) đã can thi p, v i s l ẩ ng l n vi khu n

ử ụ ả ườ ấ ả ố ỏ không ph i là coliform, thì s d ng môi tr ng dich l ng lactose. T t c ng có

ươ ả ị ự ử ế ệ ệ ả ộ ả ứ ph n ng d ng tính gi ẳ đ nh ti p sau đó ph i th c hi n m t th nghi m kh ng

ự ứ ố ườ ị đ nh. S hình thành khí trong các ng lên men ch a môi tr ng brilliant green

oC t o thành m t th

ạ ấ ỳ ờ ể ạ ộ lactose bile t i b t k th i đi m nào trong vòng 48 gi ờ ở 35 ử

ệ ị ươ ử ụ ử ệ ộ ẳ nghi m kh ng đ nh d ng tính. Các th nghi m coliform phân (s d ng m t môi

ườ ể ượ ụ ổ ị tr ng canh EC) có th đ c áp d ng cho xác đ nh colifom t ng (TC) mà c th ụ ể

oC trong

ệ ạ ự ộ ờ ủ ở là FC (APHA và các c ng s , 1998): vi c t o khí sau 24 gi 44,5

ượ ộ ế ả ươ canh EC đ c coi là m t k t qu d ng tính.

ả ủ ỹ ế ậ ượ ể ệ ề Các k t qu c a k thu t MTF đ c th hi n trong đi u kho n s l ả ố ượ ng

ề ự ệ ể ả ủ ệ ậ ấ ố ộ có th x y ra nh t (MPN) v s hi n di n c a vi sinh v t. Con s này là m t

ủ ệ ẫ ả ố ố ỹ ướ ượ c l ậ ng th ng kê c a trung bình s coliform trong m u. H qu là, k thu t

ượ ư ể ị ượ ơ ộ ủ ộ này đ c đ a ra đ đ nh l ệ ng s b coliforms. Tuy nhiên, đ chính xác c a vi c

ụ ế ố ố ụ ể ấ ộ ỉ ướ ượ c l ng thì th p và ph thu c vào s ng dùng đ phân tích: ví d , n u ch 1

ượ ứ ả ẫ ộ ml đ ố c xem xét trong m t m u ch a 1 coliform / ml, kho ng 37% trong các ng

ợ ự ế ẽ ể ạ ế ả ố 1 ml có th mong đ i d ki n s mang l ẫ i k t qu âm tính vì các phân ph i ng u

ủ ư ế ẫ ẫ ẩ ố ỗ nhiên c a các vi khu n trong m u. Nh ng, n u năm ng, m i 1 ml m u, đ ượ ử c s

ộ ế ể ượ ự ế ủ ẽ ờ ả ụ d ng, m t k t qu âm tính có th đ ơ c d ki n s ít h n 1% c a th i gian

ự ộ (APHA và các c ng s , 1998).

ế ố ề ưở ể ệ Nhi u y u t ể ả có th nh h ẩ ế ng đáng k coliform đ n phát hi n vi khu n

ặ ệ ạ ả ị ệ ủ ự ằ b ng MTF, đ c bi ố t là trong su t giai đo n gi đ nh. S can thi p c a m t l ộ ượ ng

ẩ ả ộ ự ớ l n vi khu n không ph i là coliform (Seidler et al, 1981; Evans và các c ng s ,

ư ả ế ủ ấ ứ 1981; Means và Olson, 1981), cũng nh b n ch t c ch c a môi tr ườ ng

ự ượ ế ố ị ầ ộ (McFeters và các c ng s , 1982), đã đ c xác đ nh là y u t góp ph n đánh giá

ề ị ế ậ ấ ạ ỹ ị th p các coliform đa d ng. K thu t MTF thi u chính xác v đ nh tính và đ nh

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 11

ầ ờ ế ể ượ ế ả ậ ơ ớ ỹ ượ l ng. Th i gian c n thi t đ có đ c k t qu cao h n so v i các k thu t khác.

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ế ỹ ề ậ ậ ọ ỹ ườ K thu t màng l c đã thay th k thu t MTF trong nhi u tr ợ ng h p cho

ệ ố ệ ể ướ ố ữ ẫ ỹ vi c ki m tra h th ng n ặ ậ c u ng. Tuy nhiên, k thu t này v n còn h u ích, đ c

ệ ậ ọ ề ệ ẳ ỹ bi ạ ử ụ t là khi đi u ki n không cho phép s d ng các k thu t l c màng, ch ng h n

ạ ướ ụ ư nh các lo i n ặ c đ c ho c có màu.

ễ ự ể ượ ệ ộ ỹ ự ệ ậ ở MTF là d th c hi n và có th đ c th c hi n b i m t k thu t viên

ơ ả ư ạ ươ ể ở ấ ượ đ ề c đào t o c b n v vi sinh, nh ng ph ng pháp này có th tr nên r t dài

ề ề ầ ị ượ ử dòng và c n nhi u nhân công vì nhi u dung d ch pha loãng đã đ ỗ c x lý cho m i

ướ ươ ố ố ỏ ẫ m u n c. Tuy nhiên, nó t ng đ i là không t n kém, vì nó không đòi h i thi ế t

ứ ạ ệ ươ ỳ ố ự ị b phòng thí nghi m ph c t p. Tuy nhiên, ph ờ ng pháp này là c c k t n th i

ả ả ị ế ả ạ ỏ ộ ộ gian, đòi h i 48h cho k t qu gi ấ đ nh, và bu c ph i có m t giai đo n nuôi c y

ể ấ ẳ ị ớ ơ ạ ể l i đ kh ng đ nh mà có th m t lên t i h n 48h.

ỹ ọ ậ 3.2. K thu t màng l c

ọ ỹ ượ ấ ượ ậ Các màng l c k thu t (MF) đã hoàn toàn đ ậ c ch p nh n và đã đ c phê

ư ộ ấ ượ ệ ể ậ ướ ủ ụ duy t nh m t th t c đ theo dõi ch t l ng vi sinh v t trong n ố c u ng ở

ề ươ ẫ ướ ọ ộ ộ ố nhi u qu c gia. Ph ồ ng pháp này bao g m l c m t m u n ọ c trên m t màng l c

ẫ ẩ ủ ớ vô trùng v i kích th ướ ỗ c l 0,45 mm mà v n gi ữ ạ l i vi khu n, ọ màng l c này trên

ườ ọ ọ ế ể ọ môi tr ẩ ạ ng ch n l c và đ m các khu n l c đi n hình trên các màng l c.

ề ườ ệ ủ ươ ượ ử Nhi u môi tr ề ng và đi u ki n cho ph ng pháp MF đ ệ c th nghi m

ụ ồ ố ư ủ ệ ừ ẫ ướ cho vi c ph c h i t i u c a coliformst m u n c (Grabow và du Preez, 1979;

ộ ượ ử ụ ổ ế ự Rice và các c ng s , 1987). Trong đó, đ c s d ng ph bi n cho phân tích n ướ c

ạ ườ ở ắ ự ộ ỹ ố u ng là lo i môi tr ng mEndo B c M (APHA và các c ng s , 1998) và môi

ườ ở ẩ tr ng Tergitol TTC châu Âu (AFNOR, 1990). Vi khu n coliform hình thành

ẩ ạ ỏ ộ ườ ạ ạ ườ khu n l c màu đ ánh kim trên m t môi tr ng lo i Endo lo i môi tr ng có

oC đ i v i TC) ho c khu n l c màu vàng – cam

ứ ẩ ạ ố ớ ặ ủ ch a lactose ( trong 24 gi ờ ở 35

oC đ i v i TC và FC,

ườ ở ố ớ trên môi tr ủ ng TergitolTTC ( trong 24 và 48 h 37 và 44

ứ ườ ư ạ ấ ẳ ạ ươ t ng ng). Môi tr ng nuôi c y khác, ch ng h n nh th ch MacConkey và môi

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 12

ườ ượ ử ụ ở ữ tr ng Teepol, đã đ c s d ng Nam Phi và Anh. Tuy nhiên, so sánh gi a các

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ườ ấ ạ ị ế ượ môi tr ạ ng nuôi c y thì th ch mEndo mang l i giá tr đ m đ ạ ơ c cao h n th ch

ể ế ạ ặ MacConkey ho c th ch Teepol (Grabow và du Preez, 1979). Đ đ m các FC,

ọ ượ ủ ự ằ ộ ườ APHA và các c ng s (1998) cho r ng màng l c đ c trên môi tr ng làm giàu

oC trong 24 gi

ở ệ ộ ờ ở lactose (mFC) nhi t đ 44,5 . B i vì nhi ệ ộ ủ t đ ệ tăng cao và vi c

ẩ ạ ử ả ố ố ổ b sung thu c th mu i acid rosolic, vài khu n l c không ph i coliform phân phát

ể ườ ự ộ tri n trên các môi tr ng mFC (APHA và các c ng s , 1998).

ệ ế ằ ọ ế ự Vi c đ m TC b ng cách l c màng thì không hoàn toàn thi t th c. Khi MF

ế ớ ợ ườ ấ ẩ ượ đ c k t h p v i môi tr ạ ứ ng nuôi c y mEndo ch a lactose, các khu n l c

ỏ ẫ ể ầ ặ ỉ không đi n hình thì có màu đ s m, nh y ho c có nhân và không có ánh kim th nh

ẩ ạ ệ ể ể ắ ả ấ ồ ặ tho ng có th xu t hi n. Khu n l c không đi n hình màu xanh, h ng, tr ng ho c

ế ượ ậ không màu thi u ánh thì không đ ỹ c xem trong TC trong k thu t này (APHA và

ơ ữ ộ ộ ự ể ộ ớ ẩ ạ các c ng s , 1998). H n n a, các khu n l c đi n hình v i m t đ óng ánh đôi khi

ả ẩ ở ượ ạ đ c t o ra b i vi khu n không ph i là coliform và ng ượ ạ c l ẩ ạ i, các khu n l c

ẩ ạ ỏ ẫ ể ặ không đi n hình (màu đ s m ho c khu n l c có nhân mà không có ánh kim)

ườ ể ượ ệ ậ ả th ng không ph i là coliforms. Do đó vi c xác nh n Coliform có th đ ấ c ch p

ẩ ạ ự ậ ả ạ ộ nh n cho c hai lo i khu n l c (APHA và các c ng s , 1998).

ư ộ ỹ ọ ọ ệ ệ ậ ấ ậ ớ V i vi c ch p nh n MF nh m t k thu t ch n l c cho vi c theo dõi

ự ố ộ ỏ ướ n c u ng (APHA và các c ng s , 1998; AFNOR, 1990), các câu h i liên quan

ệ ị ủ ệ ệ ượ ế đ n vi c phát hi n coliform và tính chính xác c a vi c đ nh l ng đã tăng lên. S ự

ệ ủ ố ượ ệ ị ưỡ ẩ ớ ệ ồ ề ả hi n di n c a s l ng l n vi khu n d d ụ ủ ng n n làm gi m vi c h i ph c c a

ự ộ ẩ ạ coliform trong MF (Clark, 1980; Burlingame và các c ng s , 1984). Các khu n l c

ớ ợ ườ ề ệ ắ ả ớ ậ t p h p quá l n trên các môi tr ng mEndo đã g n li n v i vi c làm gi m các

ẩ ạ ạ khu n l c coliform t o ra ánh kim (Hsu và Williams, 1982; Burlingame và các

ự ộ c ng s , 1984).

ể ụ ồ ề ề ả Đi u đáng quan tâm v MF là nó không có kh năng đ ph c h i coliforms

ặ ị ổ ẳ ươ ộ ố ế ố ậ ọ ị b căng th ng ho c b t n th ng. M t s y u t ế hóa h c và v t lý liên quan đ n

ệ ử ướ ố ử ệ ể ồ ươ vi c x lý n c u ng, bao g m vi c kh trùng, có th gây ra th ng vong cho vi

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 13

ộ ế ế ẩ ả ị ư ỏ ể khu n coliform, k t qu là m t t ộ bào b h h ng thì không th hình thành m t

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ẩ ạ ườ ọ ọ ủ ẩ ơ khu n l c trên môi tr ệ ng mang tính ch n l c. Vi c ph i sáng c a vi khu n đ ể

ế ổ ể ẫ ư ẩ ả ươ ạ ả ạ t o ra s n ph m nh clo có th d n đ n t n th ớ ng và tăng tính nh y c m v i

ạ ộ ế ấ ậ ặ ố ặ ề ặ mu i m t ho c các ch t ho t đ ng b m t thay th (sodium desoxycholate ho c

ộ ố ứ ườ ọ ọ ấ Tergitol 7) ch a trong m t s môi tr ộ ố ả ế ng nuôi c y ch n l c. M t s c i ti n

ươ ố ớ ị ổ ệ ẩ ộ ươ trong ph ng pháp đã tăng đ phát hi n đ i v i vi khu n coliform b t n th ng,

ả ệ ể ồ ườ ặ ệ ệ bao g m c vi c phát tri n các môi tr ng mT7 đ c bi ụ t dành cho vi c ph c

ị ổ ươ ướ ộ ố ồ ủ h i c a coliforms b t n th ng trong n ự c u ng (LeChevallier và các c ng s ,

ườ ẫ ướ ố 1983). Đánh giá th ề ng xuyên v các m u n ộ c u ng (LeChevallier và các c ng

ướ ề ặ ự ộ ự s , 1983; McFeters et al, 1986) và n c b m t. (McFeters và các c ng s , 1986;

ụ ồ ấ ự ơ Freier và Hartman, 1987) cho th y s ph c h i coliform cao h n trên môi tr ườ ng

ườ ể ệ ớ mT7 so v i trên môi tr ng mEndo. Tuy nhiên, mT7 có th không hi u qu ả

ị ổ ậ ộ ươ ằ b ng mEndo khi các b ph n b t n th ng khác chlorine có liên quan. Rice và

ự ộ ạ ự ệ ể các c ng s (1987) đã đem l i s khác bi ụ t khôn đáng k trong coliform đã ph c

ớ ừ ẫ ồ h i trên mT7 so v i mEndo LES t m u monochloraminated, và Adams và các

ấ ằ ự ườ ố ằ ườ ộ c ng s (1989) th y r ng môi tr ng mT7 không t t b ng môi tr ng mEndo

ệ ề ế ế ớ trong vi c đi u tra các t bào E. coli và C. freundii ti p xúc v i ozone.

ả ử ệ ằ ằ ả ợ ưở Các tác gi khác đã g i ý r ng vi c kh trùng b ng clo nh h ế ng đ n các

ứ ủ ư ề ẩ ạ ạ ch c năng khác nhau v ho t tính c a vi khu n coliform, nh ho t tính enzym

ẩ ộ catalase (Calabrese và Bissonnette, 1990; Sartory, 1995). Vi khu n hoat đ ng trao

ấ ạ ườ ị ổ đ i ch t t o ra hydrogen peroxide (H ệ 2O2), vi c này th ng nhanh chóng b thoái

ị ươ ở ủ ẽ ạ ả ớ hóa b i catalase. Coliforms b th ng v i ho t tính c a catalase gi m s tích lũy

ự ỳ ấ ộ ạ ch t đ c hydrogen peroxide, mà chúng thì c c k nh y. Calabrese và Bissonnette

ụ ồ ề ự ệ ườ (1990) báo cáo v s tăng lên trong vi c ph c h i coliform trên môi tr ng nuôi

ụ ồ ư ự ệ ấ c y mEndo và mT7, cũng nh s gia tăng trong vi c ph c h i E. coli trên mFC

ườ ấ ượ ổ ặ ả khi các môi tr ng nuôi c y đ c b sung catalase, sodium pyruvate ho c c hai.

ằ ượ ở ồ ộ Sartory (1995) cho r ng sodium pyruvate nên đ c thêm vào n ng đ 0,010,1%

ườ ệ ẩ ả ẩ ấ ỳ cho b t k môi tr ng phát hi n coliform chu n nào vì s n ph m này cho phép

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 14

ụ ồ ủ ự ệ ệ ị ả c i thi n vi c ph c h i c a các coliform ch u áp l c chlorine.

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ố ượ ớ ườ ử ụ ấ ả ộ ổ S l ng l n môi tr ng nuôi c y thay đ i trong s d ng là m t ph n ánh

ự ế ằ ườ ồ ạ ụ ệ th c t r ng không có môi tr ng thông d ng nào hi n nay t n t i cho phép t ố i

ư ố ừ ệ ế ồ ườ u vi c đ m các loài coliform khác nhau có ngu n g c t các môi tr ng khác

ệ ở ệ ữ ề ạ ợ ể ủ ỹ nhau và hi n di n nhi u tr ng thái sinh lý. Nh ng l ậ i ích đáng k c a k thu t

ề ơ ươ ớ ủ ướ ệ ể ề MF nhi u h n là ph ng pháp MTF, vi c ki m tra các th tích l n c a n c là

ề ậ ả ạ ộ ơ ơ ộ ị kh thi, nh y h n và đ tin c y cao h n. MF cũng là m t đi u tra đ nh l ượ ng

ươ ố ớ ệ ị ượ ơ ộ ượ ậ mang tính t ng đ i v i vi c đ nh l ng s b các thông tin đ ở c ghi nh n b i

ươ ậ ữ ộ ỹ ố ph ệ ng pháp MTF. MF là m t k thu t h u ích cho đa s các phòng thí nghi m

ấ ượ ướ ộ ươ ươ ể ử ụ ố ơ ề v ch t l ng n c vì nó là m t ph ng pháp t ả ng đ i đ n gi n đ s d ng.

ể ượ ử ề ớ ế ị ẫ Nhi u m u có th đ ộ c x lý trong m t ngày v i các thi ệ t b phòng thí nghi m

ậ ớ ộ ỹ ế ằ ơ ả ỹ ị ạ b h n ch b ng m t k thu t v i các k năng vi sinh c b n . Tuy nhiên, vì

ươ ư ủ ế ự ầ ẳ ạ ộ ị ph ng pháp này thì ch a đ thi t th c, m t giai đo n kh ng đ nh là c n thi ế t,

ể ấ ơ ạ ủ ầ ườ mà nó có th m t h n 24 h sau giai đo n đ u tiên trên môi tr ọ ọ ng ch n l c.

ạ ế ệ ả ươ ự ộ Đây là lý do t i sao vi c c i ti n ph ng pháp MF d a trên các thu c tính

ủ ượ ề ụ ấ enzyme c a coliforms đã đ c đ xu t (xem m c 4.3).

ươ

4. Ph

ng Pháp Enzyme

ắ 4.1 Nguyên t c chung

ượ ử ụ ể ẩ ệ ệ Các xét nghi m sinh hóa đ ị c s d ng đ xác đ nh vi khu n và li t kê các

ươ ấ ổ ể ườ ượ ự ổ ph ng pháp nuôi c y c đi n th ng đ ấ ả ứ c d a trên các ph n ng trao đ i ch t.

ụ ể ệ ề ế ậ ổ K t lu n này, chúng không hoàn toàn c th , và nhi u xét nghi m b sung này

ầ ế ể ượ ệ ử ụ ậ đôi khi c n thi t đ có đ ủ c xác nh n chính xác. Vi c s d ng các enzyme c a

ố ớ ế ấ ệ ể ẫ ẩ ẩ ộ ươ vi khu n đ phát hi n vi khu n là m t thay th h p d n đ i v i các ph ng pháp

ụ ể ả ứ ể ặ ộ ổ ể c đi n. Ph n ng enzyme có th là nhóm, chi ho c loài c th , tùy thu c vào

ư ậ ả ứ ụ ữ ả ả ạ ơ enzyme m c tiêu.H n n a, ph n ng nhanh và nh y c m.Nh v y, kh năng

ệ ụ ể ạ ộ ệ phát hi n và li t kê coliforms thông qua các ho t đ ng enzyme c th đã đ ượ c

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 15

ề ề đi u tra nhi u năm nay.

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

β β ủ ẫ ấ ộ Dglucuronidase là m t enzyme xúc tác th y phân d n xu t D

ươ ủ ứ glucopyranosiduronic vào aglycons t ng ng c a chúng và acid Dglucuronic.

ặ ẩ ượ ộ ặ ệ ầ M c dù enzyme vi khu n này đ ệ c phát hi n đ u tiên trong E. coli, đ đ c hi u

ố ủ ể ế ậ ị ươ t ng đ i c a nó đ xác đ nh các vi sinh v t này là không rõ ràng cho đ n khi

ằ ả ạ Kilian và Bulow (1976) kh o sát các Enterobacteriaceae và báo cáo r ng ho t

ủ ế ớ ạ ổ ế ủ ự ộ đ ng glucuronidase ch y u là gi i h n E. coli. S ph bi n c a enzyme này và

ủ ệ ệ ệ ẩ ướ ti n ích c a nó trong vi c phát hi n vi khu n E. coli trong n c sau đó đã đ ượ c

ả ứ ở ươ xem xét b i Hartman (1989). Ph n ng BDglucuronidase d ng tính đã đ ượ c

ủ ậ ượ ử ệ quan sát trong 94 96% c a E. coli phân l p đ c th nghi m (Kilian và Bulow,

ộ ự 1976; Feng và Hartman, 1982; Edberg và Kontnick, 1986;. Kaspar và c ng s ,

ộ ỷ ệ ấ ủ ơ ộ 1987), trong khi Chang và c ng al. (1989) tìm th y m t t l cao h n c a BD

ờ ừ ẩ glucuronidaseE. coli âm tính (th i gian trung bình là 15% t vi khu n E. coli phân

ủ ườ ạ ộ ậ ừ ẫ l p t m u phân c a con ng i). Ng ượ ạ c l i, ho t đ ng BDglucuronidase là ít

ổ ế ư ẩ ạ ẳ ơ ph bi n h n trong chi Enterobacteriaceae khác, ch ng h n nh vi khu n Shigella

ủ (4458%), Salmonella (2029%) và ch ng Yersinia và Flavobacteria (Kilian và

Bulow, 1976; Massanti et al ., 1981; Feng và Hartman, 1982; Frampton và

ủ ủ ự Restaino, 1993). BDgalactosidase, xúc tác s phân h y c a lactose thành glucose

ượ ử ụ ủ ế ể ệ và galactose và đã đ c s d ng ch y u đ li t kê các nhóm coliform trong h ọ

ử ụ ệ ạ ộ Enterobacteriaceae. Vi c s d ng BDglucuronidase và các ho t đ ng BD

ể ệ ế ẩ ươ ượ galactosidase đ phát hi n và đ m vi khu n E. coli và TC t ứ ng ng, đ c xem

ở xét đây.

ả ấ ấ ỳ Chromogenic và ch t fluorogenic s n xu t màu và hu nh quang, t ươ ng

ứ ụ ể ấ ở ộ ượ ử ụ ng khi chia tách b i m t enzyme c th .Các ch t đã đ ệ ể c s d ng đ phát hi n

ụ ể ệ ố ạ ộ ủ ệ ặ ủ ả ự ệ s hi n di n ho c các ho t đ ng c a enzyme c th trong các h th ng th y s n

ộ ố ả ấ (Chrost, 1991). M t s tác gi đã xem xét ch t fluorogenic và chromogenic đ ượ c

ọ ư ể ẩ ẩ ử ụ s d ng đ ch n đoán vi khu n (Bascomb, 1987; Manafi et al, 1991.). H l u ý

ệ ử ụ ế ả ệ ệ ẫ ấ ộ ằ r ng vi c s d ng các ch t đã d n đ n c i thi n đ chính xác và phát hi n nhanh

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 16

ươ ể ượ ệ ề ặ ự ệ ộ ơ h n.Ph ng pháp phát hi n ho c đi u tra có th đ c th c hi n trong m t môi

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ườ ự ầ ằ ấ ế ủ ộ tr ng duy nh t, do đó b ng cách thông qua s c n thi ủ ụ ố t c a m t th t c t n

ờ ướ ự ủ ể ệ ệ ị th i gian cách ly tr ệ c khi xác đ nh. Đ phát hi n s hi n di n c a BD

ấ ề ượ ử ụ glucuronidase trong E. coli, các ch t n n chromogenic sau đây đ c s d ng:

ự ộ (Brenner và c ng s , 1993) indoxylBDGlucuronide (IBDG), các

ứ ạ phenolphthaleinmonoBDglucuronide ph c t p (Butle và SBS, 1989) và 5

bromo4chloro3indolylBDglucuronide (XGlu) (Watkins et al, 1988).Th ngườ

ề ấ ấ xuyên nh t, các ch t n n fluorogenic 4 methylumbelliferylBDglucuronide

ượ ử ụ (MUGlu) đã đ ấ c s d ng (Dahlen và Linde, 1973; Feng và Hartman, 1982). Ch t

ư Chromogenic nh onitrophenylBDgalactopyranoside (ONPG), pnitrophenylB

Dgalactopyranoside (PNPG), 6bromo2naphtylBDgalactopyranoside (burger,

1967) và 5bromo 4chloro3indolylBDgalactopyranoside (XGal) (Ley et al.,

ượ ử ụ ự ệ ủ ệ ệ ể 1993) đã đ ả c s d ng đ phát hi n s hi n di n c a BDgalactosidase s n

ư ấ ề ặ ấ ở xu t b i coliforms, cũng nh ch t phát quang b m t 4 methylumbelliferylBD

galactopyranoside (MUGal).

ệ ủ ế ằ ẩ ỹ 4.2. K thu t có/ không có s hi n di n c a vi khu n và đ m b ng

ử ụ ự ệ ươ ậ ỹ ậ ề ố các k thu t nhi u ng s d ng ph ng pháp enzyme

ự ế ợ ư ộ ử ụ ủ S k t h p c a MUGlu vào lauryl tryptose broth s d ng nh m t môi

ườ ậ ầ ề ố ầ ấ ỹ tr ng nuôi c y cho quá trình lên men nhi u ng (MTF) k thu t l n đ u tiên

ậ ứ ấ ể ệ ề ậ ượ đ c đ xu t đ phát hi n nhanh chóng và xác nh n ngay l p t c E. coli trong

ự ẩ ẫ ướ ự ệ ệ th c ph m và m u n ủ c (Feng và Hartman, 1982). S hi n di n c a

ẫ ươ ủ ượ ự ủ methylumbelliferone do s th y phân c a MUGlu (m u d ng tính) đã đ c phát

ở ự ế ủ ự ự ệ ớ ự hi n b i s ti p xúc v i ánh sáng tia c c tím sóng dài và tr c quan c a s phát

ộ ố ắ ỳ ả ử ụ hu nh quang màu xanhtr ng. M t s tác gi ặ đã s d ng spectrofluorometer ho c

ổ ộ m t quang ph (Park et al, 1995.) (Standridge et al, 1992; Apte et al, 1995) đ ể

ả ưỡ ệ ả ờ ỳ ủ ệ gi m ng ng phát hi n hu nh quang và do đó làm gi m th i gian b nh.

ự ủ ẩ ấ ộ ươ ị D a vào tính ch t enzyme c a vi khu n, m t ph ấ ng pháp xác đ nh ch t

ượ ộ ố ạ ế ủ ụ ể ể ậ ắ ỹ ề n n đ c phát tri n đ kh c ph c m t s h n ch c a MTF và k thu t MF.

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 17

ư ố ươ ạ ỏ ự ủ ể Không gi ng nh các ph ng pháp này, trong đó lo i b s phát tri n c a vi

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ệ ề ặ ượ ấ ứ ế ẩ ả ớ khu n khôngph i coliform v i hóa ch t c ch , công ngh b m t đ c xác

ắ ằ ự ụ ẩ ỉ ị đ nh d a trên nguyên t c r ng ch có các vi khu n m c tiêu (TC và E. coli) đ ượ c

ấ ượ ấ ề ẩ ấ cung c p và không đ ộ ề ặ c cung c p ch t n n cho các vi khu n khác. M t b m t

ị ượ ử ụ ồ ưỡ ượ đ c đ nh nghĩa đ ư ộ c s d ng nh m t ngu n dinh d ố ớ ọ ng quan tr ng đ i v i

ấ ề ử ụ ụ ễ ắ ẩ ộ ặ các vi khu n m c tiêu. Trong quá trình s d ng ch t n n, m t nhi m s c ho c

ộ ượ ể ừ ề ặ ủ ệ m t fluorochrome đ c phát tri n t ấ ự ệ b m t, cho th y s hi n di n c a các vi

ụ ậ sinh v t m c tiêu.

ệ ề ặ ế ợ ấ ử ụ ề ớ Edberg và Edberg (1988) đ xu t s d ng công ngh b m t k t h p v i

ấ ề ặ ấ ả ch t n n ONPG cho các enzyme bgalactosidase có m t trong t ẩ t c các vi khu n

ệ ụ ể ủ ấ ề ệ ươ ị và MUGlu ch t n n cho vi c phát hi n c th c a E. coli. Ph ng pháp xác đ nh

ấ ề ơ ả ượ ự ệ ư ể ệ ậ ộ ch t n n c b n đã đ ự ắ c thành l p nh là m t ki m tra s hi n di n, s v ng

ẫ ẫ ặ ố m t.Các ng, cái mà sao khi thêm m u v n không màu.Ngoài ra, đ ượ ủ ở c

ấ ỳ ủ ủ ệ ố ỉ 35oC.B t k màu vàng trong ng nghi m (ch ra quá trình th y phân c a ONPG)

ươ ấ ỳ ố ố ớ ượ ế ượ đ c coi là d ng tính đ i v i TC. B t k ng vàng đ ớ c ti p xúc v i ánh sáng

ự ướ ể ệ ự ệ ắ ỳ tia c c tím b ệ c sóng dài, và hu nh quang màu xanhtr ng th hi n s hi n di n

ả ượ ử ệ ầ ậ ẩ ổ ủ c a vi khu n E. coli. Không có th nghi m xác nh n b sung c n ph i đ ự c th c

hi n.ệ

ứ ệ ể ằ ầ Thí nghi m đ u tiên (Edberg và Edberg, 1988) ch ng minh r ng ki m tra

ủ ườ ạ ươ ủ ấ ộ ươ các ch ng môi tr ng c a TC và E. coli cho th y đ nh y t ng đ ớ ng v i các

ươ ổ ể ớ ặ ư ế ả ph ớ ng pháp c đi n (lên đ n 1 CFU / 100 ml) v i đ c tr ng có kh năng l n

ữ ệ ị ươ ệ ẩ ậ ớ ờ ả ơ h n. D li u cũng xác nh n kh năng phát hi n vi khu n b th ng v i th i gian

ố ờ ử ụ ủ ề ứ đáp ng t i đa 24 gi . Rice et al. (1990, 1991) s d ng nhi u ch ng tinh khi ế t

ả ủ ệ ệ ệ ể ẩ ị ấ ề ủ c a vi khu n E. coli đ xác đ nh hi u qu c a công ngh phát hi n ch t n n

ự ế ả ấ ớ ị ượ đ c đ nh nghĩa v i BDglucuronidase và cho th y k t qu tích c c (95,5%

ủ ươ ờ ươ ch ng BDglucuronidase d ng tính trong 24 gi và 99,5% d ng tính sau 28

ờ ủ ậ ươ gi ). Không có E. coli phân l p d ng (Rice et al., 1990).

ộ ố ệ ươ ạ ượ ể ự M t s xét nghi m th ng m i sau đó đ c phát tri n d a trên công ngh ệ

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 18

ệ ị ề ặ ượ b m t đ ỹ c xác đ nh: Colilert (IDEXX phòng thí nghi m, Portland, ME, M ),

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

Colisure (công ty Millipore, Bedford, MA, USA), ColiQuick (Hach, Loveland, CO,

ự ệ ả ứ ế ẵ ầ ố ộ ệ ự ắ USA). H u h t trong s này là có s n cho m t ph n ng s hi n di n/s v ng

ử ụ ề ố ế ấ ặ ậ ằ ộ ố ỹ m t và đ m b ng k thu t nhi u ng.S d ng r ng rãi nh t trong s đó là th ử

ậ ề ặ ượ ệ ỹ ỉ ử ụ nghi m Colilert, trong đó s d ng các k thu t b m t đ ấ ớ c ch rõ tính ch t v i

ấ ộ ữ ữ ử ề ấ ệ ONPG và MUGlu.R t nhi u và r t r ng rãi so sánh gi a nh ng th nghi m

ươ ổ ể ạ ươ ượ ự ệ th ng m i và MTF c đi n và ph ế ậ ng pháp ti p c n MF đã đ c th c hi n đ ể

ệ ạ ướ ự ộ li t kê TC và E. coli trong các lo i n c (Edberg và c ng s , 1988, 1989,

ự ự ộ ộ ự ộ 1990.Clark và c ng s , 1991. Olson và c ng s năm 1991, McCarty và c ng s ,

ự ộ 1992;McFeters et al, 1993;. Palmer và c ng s , 1993; Clark và ElShaarawi năm

ủ ế ậ 1993; Colquhuon et al, 1995; Fricker và Fricker, 1996). K t lu n chính c a các

ả ể ứ ử ữ ệ ệ ệ nghiên c u này là nh ng th nghi m có hi u qu đ phát hi n các vi khu n t ẩ ừ

ề ồ ướ ườ ế ậ ư ạ ả nhi u ngu n n c khác nhau, th ng là nh y c m nh là cách ti p c n MTF đ ể

ể ệ ệ ả ẩ ơ ầ ạ phát hi n vi khu n E. coli và đôi khi nh y c m h n đ phát hi n các TC. G n

ở ộ ủ ể ả ộ đây, QuantiTray (QT) (IDEXX), mà là m t phiên b n m r ng c a MPN ki m tra

ộ ố ớ ạ ộ ớ ố ượ ả Colilert (m t phiên b n MPN v i m t s gi i h n các ng cũng đã đ c th ươ ng

ạ ở ầ ượ ớ ươ ặ ệ m i hóa ạ giai đo n đ u), đ c so sánh v i các ph ng pháp MF, đ c bi t là

ướ ố ở ẫ m u n c u ng, b i Fricker et al. (1997), De Roubin et al. (1997) và Eckner

ấ ả ọ ề ự ậ ệ ể ệ ế ế (1998). T t c h đ u k t lu n không có s khác bi t đáng k cho vi c đ m E.

ươ ồ ủ ụ ả ữ coli gi a các ph ớ ng pháp QT và MF, trong khi kh năng ph c h i c a TC l n

ớ ỹ ậ ơ ớ ươ ơ h n v i k thu t QT h n so v i ph ng pháp MF. McFeters et al. (1997a, b) tham

ả ẩ ớ ươ ử ể kh o các tiêu chu n so sánh v i các ph ệ ng pháp th nghi m Colisure đ phát

ị ổ ệ ẩ ớ ồ ị ươ hi n vi khu n ch u clo: v i Colisure, thu h i TC và E. coli b t n th ở ng b i clo

ệ ơ ươ ộ ướ ế ả ượ ả đ c c i thi n h n các ph ẩ ng pháp tiêu chu n, k t qu là m t c tính th c t ự ế

ề ỉ ố ấ ướ ẩ ồ ộ ơ h n v ch s vi khu n trong ngu n cung c p n c công c ng.

ệ ề ặ ượ ế ể ậ ự Trong k t lu n, ki m tra d a trên công ngh b m t đ ằ ị c xác đ nh b ng

ử ụ ấ ượ ụ ệ cách s d ng ch t chromogenic và fluorogenic đ ệ c áp d ng cho vi c phát hi n

ượ ướ ệ ố ị và đ nh l ng Coliform và E. coli trong n c u ng. Các xét nghi m này d s ễ ử

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 19

ộ ướ ấ ự ế ơ ặ ơ ệ ụ d ng và cung c p cho m t c tính nhanh h n và th c t h n (đ c bi t là s ự

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ệ ủ ỉ ố ư ễ ệ ẩ ướ ơ hi n di n c a Clo d ) các ch s ô nhi m vi khu n trong n c h n so v i tr ớ ườ ng

ự ệ ữ ươ ệ ổ ể ợ h p không có s hi n di n c đi n hay MTF. Nh ng ph ể ố ng pháp này có th t n

ớ ơ ươ ổ ể ầ ướ kém h n so v i ph ng pháp c đi n khi sau này không c n các b ậ c xác nh n

ướ ậ ượ ả ầ ổ b sung. Khi b c xác nh n đ c yêu c u, các chi phí phát sinh trong c hai

ươ ươ ươ ọ ườ ươ ph ng pháp là t ng đ ng. Trong m i tr ợ ng h p, ph ng pháp enzyme đòi

ủ ọ ề ị ươ ự ơ ấ ạ ơ ỏ h i nhân l c ít h n và do đó chi phí c a h v giá tr th ng m i th p h n.

ợ ớ ủ ệ ậ ẩ ỹ 4.3. MF k thu t liên h p v i phát hi n enzyme c a vi khu n

ự ế ợ ủ Dahlen và Linde (1973) đánh giá s k t h p c a MUGlu vào môi tr ườ ng

ự ệ ủ ệ ệ ể ạ ạ ộ th ch đ phát hi n s hi n di n c a ho t đ ng BDglucuronidase (E. coli).

ể ườ ứ ạ Brenner et al. (1993) đã phát tri n môi tr ng th ch MI, có ch a các MUGal

ệ ờ ồ fluorogenic và IBDG chromogenic, đ ng th i phát hi n TC và E. coli trong n ướ c.

ươ ượ ụ ể ọ ọ ứ ạ ả Ph ng pháp này đã đ c ch ng minh là nh y c m, ch n l c, c th và nhanh

ự ế ả ẵ ộ chóng (k t qu có s n trong 24 h) (Brenner và c ng s , 1996.). Gaudet et al.

ớ ổ ể ặ (1996) và Ciebin et al. (1995) liên quan MUGlu ho c XGlu v i c đi n mTEC

ạ ớ ươ ổ ớ ệ ạ và th ch lauryl tryptose và so sánh v i các ph ng pháp hi n đ i thay đ i v i các

ươ ổ ườ ệ ạ ổ ườ ph ể ng pháp c đi n. Các môi tr ng hi n đ i thay đ i môi tr ạ ng th ch

ườ ấ ự ụ ồ ặ ươ ơ ự ư ủ th ng cho th y s ph c h i cao h n ho c t ng t nh c a TC và E. coli.

ườ ấ ươ ệ ạ ẵ Các môi tr ng nuôi c y th ể ng m i đang có s n đ phát hi n các TC và

ồ ườ ườ ổ ể ạ E. coli. Chúng bao g m các môi tr ấ ng nuôi c y môi tr ng th ch c đi n đ ượ c

ề ấ ớ ặ ử ụ s d ng cho E. coli và Coliform v i các ch t n n chromogenic và / ho c

ể ể ụ ệ ặ fluorogenic c th đ phát hi n các BDglucuronidase và / ho c BD

ứ ạ ạ galactosidase: th ch Chromocult Coliform (Merck, Darmstadt, Đ c), th ch Fluo

ự ế rocult E. coli tr c ti p (Merck) và mColiBlue24 broth (Hach) (Grant, 1997).

ệ ử ụ ươ ế ả ấ Vi c s d ng các ph ồ ng pháp đ m đĩa, bao g m c ch t chromogenic

ễ ề ặ ơ ơ và / ho c fluorogenic, cho phép nhi u h n, nhanh chóng, d dàng h n và các ướ c

ề ề ấ ơ ướ ố tính chính xác h n v coliform và E.coli r t nhi u trong n ớ ơ c u ng h n so v i

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 20

ệ ử ụ ươ ổ ể ể ượ ử ụ vi c s d ng các ph ng pháp c đi n. Chúng có th đ c s d ng b i b t k ở ấ ỳ

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ể ử ụ ệ ươ ề ấ ố phòng thí nghi m, có th s d ng ph ng pháp nuôi c y truy n th ng. Tuy

ả ề ế ấ ỏ ề ố nhiên, có nhi u t n kém và gi ế i quy t không th a đáng các v n đ liên quan đ n

ệ ủ ấ ỉ ị ẩ ự ệ s hi n di n c a vi khu n ch th không nuôi c y.

ự ế ủ ạ ằ ị 4.4. Xác đ nh tr c ti p ho t tính c a enzyme b ng fluorimetry

ươ ể ể ự Các ph ng pháp mô t ả ở ẫ ấ trên là d a trên nuôi c y đ ki m tra và v n

ườ ỏ ừ ờ ể ầ ơ th ng đòi h i t ế 18 đ n 24 gi đ hoàn thành.G n đây h n, BDgalactosidase

ủ ộ ượ và BDglucuronidase thu c tính c a TC và E. coli đã đ c khai thác trên n ướ c

ự ẫ ọ ộ ướ ng t (Berg và Fiksdal, 1988; George và c ng s , 2000.)Và m u n ể c bi n

ự ệ ầ ộ (Davies và c ng s , 1995.) xét nghi m nhanh chóng mà không c n b t k b ấ ỳ ướ c

ấ nuôi c y nào.

ự ự ả ộ ộ ề George và c ng s .(2000) hoàn thành m t biên b n d a trên n n

ế ủ ự ệ ộ fluorogenic MUGal và MUGlu cho m t phát hi n enzyme tr c ti p c a FC trong

ữ ọ ươ ướ ướ n c ng t trong 30 phút. Nh ng ph ng pháp này cho phép c tính nhanh chóng

ề ứ ự ễ ế ộ ồ ướ ư ặ ớ ạ và tr c ti p v m c đ ô nhi m vi sinh ngu n n c m t, nh ng gi i h n phát

ủ ệ ả ọ hi n c a h (20 CFU / 100 ml cho FC kho ng 340 CFU / ml cho 100 TC) ngăn

ệ ử ụ ể ướ ố ự ộ ả c n vi c s d ng chúng đ theo dõi n ộ c u ng. M t phân tích t đ ng (Colifast

ượ ơ ở ể CA100 (Colifast Systems, Oslo, Na Uy)) đã đ ộ c phát tri n trên c s các thu c

ủ ự ẩ ộ ẫ tính enzyme c a vi khu n (Ofjord et al, 1998; Berg và c ng s , 1998.). Các m u

oC cho TC và 44oC

ế ầ ằ ậ ọ ượ ủ đ c (sau khi t p trung b ng cách l c, n u c n thi ế ở t) 37

ộ ườ ọ ọ ứ ể FC trong m t môi tr ng phát tri n có ch n l c cho coliforms và ch a MUGal.

ế ố ượ ủ ự ẫ ỳ N u s l ủ ng coliform trong m u là đ , s gia tăng hu nh quang do MUGal th y

ể ượ ệ ở ư ầ ờ ẩ phân b i các vi khu n hi n nay có th đ c đo trong vòng ch a đ y 2 gi ế . N u

ỏ ự ệ ệ ệ ộ ọ ỳ ể không, vi c phát hi n m t tín hi u hu nh quang quan tr ng đòi h i s phát tri n

ẩ ướ ệ ộ ườ ấ ả ấ ủ c a vi khu n tr ệ c. Vi c phát hi n m t môi tr ng nuôi c y TC m t kho ng 11

ờ ươ ư ậ ủ ự ế ộ gi .Ph ạ ộ ế ị ng pháp này là nh v y, m t quy t đ nh tr c ti p c a các ho t đ ng

ẫ ớ ướ ế ặ ộ enzyme cho m u v i coliform cao (n ạ c m t) và liên quan đ n m t giai đo n

ưở ấ ẫ ướ ệ ố tăng tr ớ ng cho các m u v i coliform th p (n ử c u ng). Các th nghi m Coli

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 21

ườ ề ế ơ ướ ắ nhanh th ng khuy n khích nhi u h n cho n ế ụ c t m, và ti p t c phân tích đ ượ c

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ự ướ ố ớ ươ ẫ ệ th c hi n trong n c u ng v i phân tích này và các ph ng pháp khác v n đ ượ c

ế ế ầ ậ ượ ể ừ ướ ố yêu c u n u k t lu n đ c rút ra. Tuy nhiên, k t khi phân tích n ớ c u ng v i

ạ ộ ỏ ưở ệ ố các phân tích Coli nhanh đòi h i m t giai đo n tăng tr ng, h th ng này s ẽ

ể ệ ấ ẩ không th phát hi n vi khu n không nuôi c y.

ệ ẩ ằ ươ ử ụ ế ế 4.5. Phát hi n vi khu n b ng ph ng pháp s d ng enzyme đ m t

bào pha r nắ

ể ủ ể ầ ự ậ ỉ ươ Ch tiêu đáng k g n đây đã t p trung vào s phát tri n c a ph ng pháp

ụ ướ ạ ế ụ ả ố ớ ị enzyme nhanh chóng áp d ng cho n c u ng v i m c tiêu đ t k t qu trong l ch

ệ ủ ệ ộ trình m t ngày làm vi c c a Văn Poucke và Nelis (1999) đánh giá phát hi n công

ể ả ủ ệ ộ ờ ỳ ể ụ c tín hi u hu nh quang đ gi m th i gian phân tích c a m t màng enzyme ki m

ử ụ ộ ọ ọ ế ị tra l c. H đã s d ng m t thi t b quét laser (ScanRDI1Chemunex, Ivrysur

ệ ệ ố ượ ủ ấ ế Seine, Paris, Pháp) trong đó phát hi n và li t kê s l ng th p c a các t bào

ỳ ượ ậ ế ệ ằ ế ắ hu nh quang đ ộ c kí hi u b ng m t kĩ thu t đ m t bòa pha r n (Brailsford,

ệ ố ấ ộ ớ ạ ệ ị ượ ự 1996). H th ng này cung c p m t gi i h n phát hi n đ nh l ế ấ ng tr c ti p r t

ệ ừ ấ ế ế ệ th p cho phép phát hi n t 1 đ n 1000 t ố ỳ bào có kí hi u hu nh quang phân ph i

ệ ố ử ụ ề ấ ộ trên màng. S d ng h th ng này, Văn Poucke và Nelis (1999b) đ xu t m t th ử

ề ệ ệ ẩ ả nghi m cho phép phát hi n vi khu n E. coli và TC trong kho ng 3.5 h, v nguyên

ồ ế ạ ộ ư ấ ổ ắ t c cũng bao g m các t ấ bào trao đ i ch t ho t đ ng nh ng không nuôi c y.

ủ ươ ế ư ẩ ắ Nguyên t c c a ph ng pháp cho các t bào vi khu n E. coli nh sau (Văn

ẫ ướ ố ệ ệ ượ Poucke và Nelis, 1999b, 2000a): E. coli hi n di n trong m u n c u ng đ c gi ữ

ộ ộ ọ ọ ế ị ắ ạ l i trên m t b l c 0.4mm sau khi l c chân không. Các t ẹ bào E. coli b m c k t

ấ ể ạ ị ằ ề ượ đ c đi u tr b ng hóa ch t đ t o ra các enzyme BDglucuronidase (3 gi ờ ở

ệ ế ỉ 37oC) và có kí hi u (0,5 gi ờ ở oC) các t 0 bào gây ra. Ch có BDglucuronidase

ể ượ ữ ẩ ỉ ủ c a E. coli có th đ ấ ề c gây ra và do đó ch nh ng vi khu n tách các ch t n n

ỳ ỳ không hu nh quang (fluoresceindiBDglucuronide), gi ữ ạ l ả i hu nh quang s n

ẩ ố ế ộ ế ủ ự ỳ ph m cu i cùng bên trong t bào. S phát hu nh quang c a m t t bào đ n l ơ ẻ

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 22

ẩ ạ ả ặ ỏ ộ ỳ ượ ệ ho c m t khu n l c nh (mà có kh năng phát hu nh quang) đ ở c phát hi n b i

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ế ị ố ế ế các thi t b ScanRDI1: quét laser qua màng cho phép đ m s t ỳ bào hu nh quang

ủ ả ậ ộ ỳ ượ ự trong 3 phút. M t xác nh n hình nh c a phát hu nh quang đ ằ ệ c th c hi n b ng

ể ể ế ộ ượ ắ ộ cách chuy n màng đ n m t kính hi n viepifluorescence đ ớ c g n v i m t giai

ạ ơ ớ ượ ề ề ể ầ ở đo n c gi i hóa đ ệ c đi u khi n b i ph n m m ScanRDI1. Quy trình phát hi n

ươ ự ư ượ ử ụ các TC là t ng t , nh ng fluoresceindiBDgalactoside đ ư c s d ng nh là

ấ ề ệ ch t n n, cho phép phát hi n các BD galactosidase (Văn Poucke và Nelis, 2000b).

ụ ươ ễ ề ấ ộ Áp d ng các ph ng pháp đ xu t cho E. coli và TC ô nhi m m t cách t ự

ướ ễ ế ướ ẫ ặ ướ ỉ nhiên và n ị c gi ng b ô nhi m, n c m t và khai thác các m u n c đã ch ra

ẩ ơ ượ ươ ươ ơ h n 90% vi khu n E. coli và h n 92% l ng TC và t ng đ ớ ng v i ph ươ ng

ạ ả ạ ồ ạ pháp tham kh o bao g m th ch MFC (E. coli), th ch mEndo (TC) và th ch

Chromocult Coliform (E. coli và TC) (Văn Poucke và Nelis, 1999a, b, 2000a, b).

ứ ớ ả ố ớ Tính so v i trung bình th hai, t ỷ ệ l âm tính gi là 3% đ i v i E. coli và 3,2% cho

ộ ố ượ ố ượ ẫ ạ ấ TC. Trong m t s l ế ủ ng h n ch c a m u, s l ậ ủ ng th p (1 3) c a các sinh v t

ụ ượ ả ở ố ượ ệ ằ m c tiêu đã đ c phát hi n b ng cách quét laser và không ph i b i s l ng đĩa

ườ ữ ế ế ả ượ ươ thông th ng. N u nh ng k t qu này đ ậ c xác nh n trong t ng lai, ph ươ ng

ắ ẽ ượ ầ ắ ờ ế ể ắ pháp này ch c ch n s đ c quan tâm do th i gian ng n c n thi t đ phân tích

ẫ ướ ộ m t m u n c.

ậ ề ươ ế 4.6. K t lu n v ph ng pháp enzyme

ấ ổ ườ B sung ch t fluorogenic và chromogenic vào môi tr ấ ng nuôi c y (agar và

ườ ạ ộ ủ ệ ể ỏ môi tr ng l ng) đ phát hi n ho t đ ng enzyme c a TC và E. coli đã tăng đ ộ

ạ ố ộ ơ ươ ổ ể nh y và t c đ nhanh chóng h n các ph ng pháp c đi n đ ể ướ ượ c l ng vi sinh

ướ ộ ố ệ ể ệ ặ ố ậ v t trong n c u ng. M c dù m t s các xét nghi m này có th phát hi n vi

ị ổ ẩ ươ ể ả ư ợ ế ấ ề ủ khu n b t n th ng, nh ng chúng không phù h p đ gi ệ i quy t v n đ c a vi c

ế ệ ệ ấ ẩ ỳ ệ phát hi n các t ủ bào không nuôi c y.Vi c phát hi n vi khu n hu nh quang c a

ế ể ả ắ ộ ượ ầ ờ ế đ m t bào pha r n là m t cách đáng quan tâm đ gi m l ng th i gian c n thi ế t

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 23

ư ả ươ ộ ế ỏ ế ắ ể ạ ượ ế đ đ t đ c k t qu , nh ng ph ng pháp này đòi h i m t t bào k pha r n.

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ươ

5. Ph

ử ng Pháp Phân T

ươ ử ượ ể ể ố Ph ng pháp phân t đã đ ộ ủ c phát tri n đ tăng nhanh chóng t c đ c a

ươ ể ạ ượ ứ ộ ủ ộ ạ ộ phân tích. Ph ng pháp nàycó th đ t đ c m t m c đ cao c a đ nh y và đ ộ

ứ ạ ệ ầ ộ ổ ướ ặ đ c hi u mà không c n m t canh tác ph c t p và b sung thêm các b c xác

ữ ậ ươ ệ ẩ nh n. Do đó, nh ng ph ng pháp này cho phép phát hi n các vi khu n có( kh ả

ụ ể ặ ờ ớ ấ năng và/ ho c không nuôi c y) c th trong vòng vài gi , thay vì vài ngày v iyêu

ươ ộ ố ề ố ươ ử ầ c u các ph ng pháp truy n th ng. M t s ph ng pháp phân t ụ áp d ng cho

ệ ụ ể ủ ệ ướ ướ ố ẽ ượ ả vi c phát hi n c th c a Coliform trong n c và n c u ng s đ ậ c th o lu n

ở đây.

ươ ễ ị 5.1. Ph ng pháp mi n d ch

ươ ậ ụ ể ữ ự ễ ể ị Ph ng pháp mi n d ch d a trên ghi nh n c th gi a kháng th và kháng

ả ứ ủ ư ệ ậ ố ặ nguyên và các m i quan h cao, đó là đ c tr ng c a ph n ng công nh n này.

ứ ộ ụ ộ ươ ạ Tùy thu c vào m c đ phân lo i các kháng nguyên m c tiêu, ph ễ ng pháp mi n

ở ứ ặ ệ ị d ch cho phép phát hi n các kháng nguyên phân loài, chi, loài ho c m c type

ể ượ ả ể ơ ể ế ấ ạ huy t thanh. Có hai lo i kháng th có th đ c s n xu t: kháng th đ n dòng và

ụ ể ơ ụ ủ ứ ể ặ ậ đa dòng, nào là c th h n đ các sinh v t m c tiêu. Các đ c tính c a ph c kháng

ể ượ ử ụ ể nguyên kháng th có th đ c s d ng:

(cid:0) Đ th c hi n m t mi n d ch b t c p( immunocapture) c a các t

ể ự ắ ặ ủ ệ ễ ộ ị ế

ệ ế ặ ở ễ bào ho c các kháng nguyên b i liên k t enzyme xét nghi m mi n

ị d ch ( IMS ho c ặ ELISA), ho c ặ

(cid:0) Đ phát hi n các t

ể ệ ế ủ ụ ử ễ ệ ị ỳ bào m c tiêu c a th nghi m mi n d ch hu nh

ễ ệ ả ặ ị quang (IFA) ho c mi n d ch enzyme kh o nghi m ( IEA).

ơ ươ ị ượ ỗ ự ệ H n 10 năm qua, ph ễ ng pháp mi n d ch đã đ ự c n l c th c hi n đ s ể ử

ấ ượ ệ ể ỉ ướ ướ ụ d ng đ phát hi n các ch tiêu ch t l ng n c trong n c u ng. ố Obst et al.

ể ộ ươ ử ụ ể ơ (1989) đã phát tri n m t ph ố ng pháp ELISA s d ng kháng th đ n dòng ch ng

ộ ạ ạ l i các kháng nguyên enterobacterial chung (ECA), m tlo ilipopolysaccharide ,

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 24

ủ ế ươ ượ đ c liên k t trong màng ngoài c a Enterobacteriaceae. Ph ng pháp này không

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ấ ẫ ạ ướ ọ ọ ộ ủ đ nh y , tuy nhiên, do đónuôi c y m u tr c trong m t canh ch n l c trong 24

ờ ế ể ị ớ ạ ệ ủ ươ gi ầ là c n thi t đ đ nh gi i h n phát hi n c a ph ng pháp ELISA (100.000 t ế

ể ạ ượ ớ bào / ml) có th đ t đ ể ơ c. Hubner et al. (1992) tìm ra ELISA v i kháng th đ n

ệ ườ ủ ấ ể dòng ECA đ phát hi n th ộ ng xuyên c a Enterobacteriaceae và cho th y m t

ộ ươ ứ ự ớ ươ ề ố ẩ m c đ t ng t 98% v i ph ng pháp tiêu chu nTC (lên men nhi u ng).

ủ ệ ặ ể ơ ấ Levasseur et al. (1992) đã phân tích th u đáo tính đ c hi u c a kháng th đ n

ủ ẩ ọ dòng ECA sau khi sàng l c 259 ch ng Enterobacteriaceae và 125 vi khu n Gram

ả ứ ọ ữ ệ âm khác. H phát hi n ra ph n ng chéo ( ớ crossreactivity) v i nh ng nhóm khác,

ủ ạ ủ ủ ể ọ ố ch ng khác nhau c a AeroMonas, đó là đ i th c nh tranh quan tr ng đ vi

ể ẩ ườ ả ứ ấ khu n Coliform phát tri n trên môi tr ng nuôi c y mEndo .Ph n ng d ươ ng

ả ượ ở ườ ề ậ ế tính gi cùng đã đ c báo cáo b i Hubner et al. (1992), ng ả i đã đ c p đ n ph n

ứ ộ ố ẩ ớ ng chéo v i m t s vi khu n Gram âm(Pseudomonas và Aeromomas) và vi

ẩ ươ ể ơ ượ ử ụ khu n Gram d ng(Bacillus) , khi kháng th đ n dòng ECA đ c s d ng đ ể

ệ phát hi n Enterobacteriaceae.

ử ệ ả ả ạ ộ ơ ELISA là m t th nghi m nhanh chóng, đ n gi n và khá nh y c m, cho

9 g protein kháng nguyên (Stryer, 1988). Tuy nhiên, kh oả

ơ ệ phép phát hi n ít h n 10

ệ ớ ườ ệ ủ ể ượ ử ụ ụ ộ nghi m có gi i th ặ ng ph thu c vào tính đ c hi u c a kháng th đ c s d ng,

ộ ủ ả ể ạ ị ả ứ ồ n ng đ c a c hai kháng th và kháng nguyên và các lo i dung d ch ph n ng

ấ ề ẫ ườ ế ẫ ặ ượ ử ụ đ c s d ng.Ngoài ra, ch t n n m uth ệ ế ng d n đ n liên k t không đ c hi u

ặ ươ ể ứ ủ c a kháng nguyên ho c kháng th th hai (Kfir và Genthe, 1993). Ph ng pháp

ấ ữ ể ể ệ ặ ậ ể ơ này r t h u ích đ ki m tra kháng th đ n dòng ho c phát hi n vi sinh v t tăng

ứ ủ ụ ệ ể ế ụ ể ừ ộ ị ọ v t. Tuy nhiên, ng d ng c a nó đ phát hi n các t bào c th t ẫ m t m u b ô

ự ị ớ ạ ộ ủ ư ặ ễ nhi m t nhiên b gi ủ ứ i h n (Hanai et al, 1997.).M c đ c a các đ c tr ng c a

ươ ợ ặ ứ ủ ể ệ ệ ộ ph ệ ng pháp ELISA có th can thi pm c đ cao c a h vi và th l n tài li u

ụ ế ẫ không có m c tiêu liên quan đ n m u .

ộ ế ế ễ ệ ả ỳ ị ị Kh o nghi m mi n d ch hu nh quang cho phép xác đ nh và đ m m t t bào

ẫ ự ấ ộ ệ ụ ể c th duy nh t trong m t m u t nhiên (Campbell, 1993).Xét nghi m có th ể

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 25

ự ự ế ế ệ ặ ằ ươ ượ đ c th c hi n b ng cách tr c ti p ho c gián ti p .Trong ph ễ ng pháp mi n

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ể ặ ự ỳ ệ ế ớ ợ ế ị d ch hu nh quang tr c ti p, các kháng th đ c bi ộ ự t là liên h p tr c ti p v i m t

ươ ế ự ế ủ ế fluorochrome.Ph ng pháp gián ti p liên quan đ n s liên k t c a các kháng th ể

ụ ể ố ớ ệ ổ ụ ế ộ chính c th đ i v i kháng nguyên m c tiêu ti p theo là vi c b sung m t kháng

ể ượ ự ế ấ ố ạ ể ầ th đ c đánh d u fluorochrome tr c ti p ch ng l Ư i các kháng th đ u tiên. u

ể ứ ấ ể ễ ủ ể đi m c a cách làm này là các kháng th th c p có th d dàng đ ượ ấ ừ ộ m t c l y t

ấ ươ ạ ớ ạ ộ ợ nhà cung c p th ng m i v i m t lo t các fluorochromes liên h p (Hoff, 1993).

ươ ỳ ị ế ể ạ ượ Ph ng pháp xác đ nh hu nh quang t bào nhanh chóng có th đ t đ ằ c b ng

ử ụ ể ế ặ ắ ế cách s d ng kính hi n vi epifluorescence ho c pha r n đ m t ọ bào sau khi l c

ẫ ướ ụ ặ ở ộ ủ c a m u n c, ho c b i dòng cytometry. Zaccone et al. (1995) áp d ng m t xét

ự ệ ễ ệ ỳ ị ễ ế nghi m mi n d ch hu nh quang tr c ti p trên màng cho vi c đánh giá ô nhi m

ẫ ừ ướ ụ ể ồ phân trong các m u t vùng n ồ ọ c ven bi n và h . H so sánh FC ph c h i

ạ ượ ể ằ efficien các chính IFA đ t đ c b ng cách epifluorescence kính hi n vi và

ươ ộ ớ ậ ấ ơ ph ng pháp MF và cho th y cao h n IFA CFU tính 2 b c đ l n. Tuy nhiên, h ọ

ự ồ ạ ủ ộ ưỡ ướ ươ đã báo cáo s t n t i c a m t ng ng d i đây mà các ph ng pháp IFA không

ể ượ ẩ ụ ể ụ ướ ủ ế ổ th đ c áp d ng (khi vi khu n c th là d ố i 1% t ng dân s ) và ch y u liên

ố ượ ệ ế ạ ộ ớ ượ ọ quan đ n các h t can thi p n i dung, khi kh i l ng l n đ c l c.

ụ ể ệ ở ứ ộ ơ ị Trong khi IFA cho phép xác đ nh c th và phát hi n m c đ đ n bào, nó

ủ ế ữ ề ạ ấ ặ không cung c p nh ng thông tin v tình tr ng sinh lý c a t bào, ho c cho dù Vi

ế ệ ễ ạ ậ ố ộ ỳ ị sinh v t đang s ng hay đã ch t. M t sáng t o xét nghi mmi n d ch hu nh quang

ạ ể ị ượ đ c phát tri n b i ở Rockabrand et al. (1999), trong đó xác đ nh tình tr ng sinh lý

ạ ằ ị ưở ủ ế c a t bào b ng proteinđ nh hình trong giai đo ntăng tr ụ ể ự ng c th . S khác

ệ ủ ể ạ ượ ự ệ ủ ự ệ bi t c a giai đo n phát tri n coliform đ c d a trên s hi n di n c a baprotein

ấ ổ ạ ộ ổ ị ộ n i bào( protein cytosolic): DnaK, m t lo i protein trao đ i ch t n đ nh; Dps,

ặ ọ ộ ổ ị ế ạ m t protein quan tr ng trong pha n đ nh ho c các t bào không t m ngh ỉ

ươ ớ ố ộ ị ưở ộ ,Dpst ng quan ngh ch v i t c đ tăng tr ng; và Fis, mà đóng m t vai trò quan

ệ ề ọ ợ ớ ưở ượ ố ổ tr ng trong vi c đi u ph i t ng h p rRNA v i tăng tr ị ng. Đ nh l ng protein

ượ ự ệ ằ ử ụ ộ n ibào( cytosolicprotein)đ c th c hi n b ng cách s d ng Enterobacteria

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 26

ể ơ fluorochrome nhãn kháng th đ n dòng (kháng DnaK, kháng Dps và kháng Fis).

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ể ử ư ủ ệ ặ ượ ể ằ Các đ c tr ng c a kháng th th nghi m đã đ ế c ki m tra b ng cách so sánh k t

ả ớ ữ ườ ượ ừ ụ ử ệ qu v i nh ng ng i thu đ c t ể ớ th nghi m 16S rRNA c th v i

ườ ủ ầ Enterobacteriaceae (Mittelman et al, 1997.) Trên các môi tr ngthu n túy c a sáu

ủ ủ ộ ớ Enterobacteriaceae và m t thành viên khác c a phân gamma c a l p con

ẫ ồ ướ ể ả ớ ờ Proteobacteria. Đ ng th i thăm dò các m u n c th i v i các kháng th và

ả ấ ươ ế DnaKOligonucleotide 16S rRNA cho th y c ph ng phápđã cho k t qu t ả ươ ng

ể ế ủ ể ặ ư ượ ữ ệ ự t . Theo hi u bi t c a chúng tôi, nh ng kháng th đ c hi u ch a đ ụ c áp d ng

ệ ẩ ướ ố ể đ phát hi n các vi khu n trong n c u ng.

ủ ế ạ ươ ụ ễ ị H n ch chính c a ph ấ ng pháp mi n d ch áp d ng cho giám sát ch t

ướ ượ ệ ớ ố ượ ủ ấ ế ượ l ng n ố c u ng đ c liên h v i s l ấ ng r t th p c a các t ụ bào m c tiêu

ố ượ ự ệ ẫ ẫ ớ ướ ọ trong các m u. Phân tích th c hi n trên s l ng l n các m u n c l c có gi ớ i

ự ộ ộ ạ h n, tùy thu c vào dung tích(Faude và Hofle năm 1997; Hanai và c ng s , 1997).

ị ượ ế ụ ể ể ượ ằ Tuy nhiên,Đ nh l ngcác t bào c th pha loãng có th thu đ c b ng ph ươ ng

ươ ử ụ ạ ừ pháp tách immunomagnetic (IMS, Dynal). Ph ng pháp này s d ng h t t tính

ể ơ ủ ể ặ ả ượ đ ề c ph các kháng th đ n dòng ho c đa giá, làm cho nó có th làm gi m n n

ế ậ ẫ ằ ọ ế ụ ặ m u liên quan đ n b ng cách l c và t p trung các t bào m c tiêu. M c dù

ươ ượ ệ ố ượ ụ ể ộ ph ng pháp IMS đã đ c áp d ng r ng rãi đ phát hi n s l ấ ủ ng th p c a các

ừ ự ẫ ẩ ế t bào t các m u th c ph m (Peng và Shelef năm 1999; Mansfield và Forsythe,

ư ế ứ ự ệ ẫ ộ 2000), m t vài nghiên c u báo cáo nh th nào nó th c hi n trên m u n ướ c

ộ ự ế ợ ủ ề ầ ạ ấ ố u ng. G n đây, Pyle et al. (1999) đ xu t m t s k t h p c a IMS và giai đo n

ế ế ủ ệ ả ẩ ộ solid tia laser đ m t ạ bào cho m t phát hi n nh y c m c a vi khu n E. coli

ọ ạ ặ ượ ự O157: H7 tăng v t trong n ướ ướ c.b c Làm s ch và côđ c đã đ ằ ệ c th c hi n b ng

ủ ố ử ụ ế ạ ỏ ộ cách s d ng h t supermagnetic ph ch ng O157 huy t thanh th và m t tách t ừ

ể ạ ỏ ế ố ị ạ ừ ẫ tính, làm cho nó có th lo i b các t bào c đ nh trên h t t ự ọ m u. H đã th c

ệ ế ạ ỏ ư ị ạ ượ hi n phân tích khác nhau trên các t ẳ bào lo i b , ch ng h n nh đ nhl ng các t ế

ế ấ ượ ấ ệ ở ấ bào nuôi c y và các t ế bào hô h p . T bào nuôi c yđ c li t kê b i MF và xác

ở ộ ươ ự ế ế ệ ớ ị đ nh b i m t ph ợ ng pháp IFA tr c ti p k t h p v i phát hi n ScanRDI1.

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 27

ươ ụ ế ề ạ ẫ ậ ướ Ph ng pháp ti p c n nhi u giai đo n này áp d ng trên m u n ọ c nh n cho

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ủ ự ứ ả ạ ấ ộ ơ ộ ớ ơ ươ ự th y m t m c đ cao h n c a s nh y c m h n so v i ph ng pháp d a trên

nuôi c yấ

ệ ử ụ ươ ễ ệ ị Vi c s d ng các ph ệ ng pháp mi n d ch cho vi c pháthi n vi sinh v t c ậ ụ

ộ ỹ ủ ế ể ả ậ ơ ộ th là m t k thu t nhanh chóng và đ n gi n, đ chính xác trong đó ch y u là

ủ ư ụ ể ể ặ ộ ộ ph thu c vào đ c tr ng c a kháng th (Kfir và Genthe, 1993). M t cách đ tăng

ộ ụ ể ể ơ ự ệ ọ ươ ạ ộ ặ đ đ c hi u là l a ch n kháng th đ n dòng có đ c th trong t ng tácl ộ i m t

ụ ể ể ừ ặ ộ ơ epitope c th . Tuy nhiên, k t ộ ể khi m t epitope có th có m t trong h n m t

ặ ủ ử ệ ệ ặ ộ ố thu c kháng nguyên, m t th nghi m đ c hi u nghiêm ng t c a các kháng th ể

ủ ẽ ặ ả ẩ ổ ớ ợ ơ đ n dòng t ng h p v i các ch ng vi khu n liên quan ch t ch và xa ph i đi tr ướ c

ườ ẫ ườ ề ề ả ấ th ng xuyên các m u môi tr ả ng. Nhi u kh năng do cho v n đ này có ph n

ứ ệ ử ụ ủ ớ ươ ễ ị ẩ ng chéo v i các ch ng vi khu n khác, vi c s d ng các ph ng pháp mi n d ch

ữ ở ế ư ệ ẫ ơ ể đ phát hi n E.coli và coliforms v n ch a thành công. H n n a, ứ ủ ki n th c c a

ể ự ể ố ạ ấ ả ườ chúng tôi, các kháng th th c đ ch ng l ủ t c các ch ng môi tr i t ủ ng c a vi

ồ ạ ẩ ụ ể ệ ờ khu n E. coli không t n t ể ơ i vào th i đi m này. Vi c áp d ng các kháng th đ n

ậ ụ ể ệ ể ộ ườ ự ặ ệ dòng đ phát hi n các sinh v t c th trong m t môi tr ng t nhiên, đ c bi t là

ướ ố ứ ạ ể ầ ơ ướ ẩ các vi khu n trong n ề c u ng, có th c n đi u tra ph c t p h n h ề ng v kháng

ể ặ ự ủ ệ ẩ ẫ ộ ướ ố ở th đ c hi u và s phong phú c a vi khu n trong m t m u n c u ng. B i vì

ể ơ ư ư ặ ầ ả ố kháng th đ n dòng có kho ng đ c tr ng gi ng nh các đ u dò oligonucleotide

ủ ọ ự ề ấ ơ ờ ợ 16S rRNA và vì s saûn c a h là nhi u h n m t th i gian, không có l i th đ ế ể

ươ ễ ỳ ị ươ ạ ử ụ s d ng ph ng pháp mi n d ch hu nh quang trong ph ng pháp lai t i ch ỗ

ữ ầ ộ ợ ẽ ạ ượ (FISH) (xem ph n sau). M t trong nh ng l i ích FISH s đ tđ c trong vi c s ệ ử

ủ ư ể ẽ ộ ố ụ d ng c a m t kháng th nh ch ng Fis (Rockabrand et al., 1999) s phân bi ệ t

ẩ ượ ủ ạ ẫ ướ ệ tình tr ng sinh lý c a vi khu n đ c phát hi n trong m u n c.

ươ ự 5.2. Ph ng pháp d a trên axit nucleic

ầ ươ ử ụ ử ế H u h t các ph ng pháp s d ng acid nucleic tính lai phân t , trong đó có

ệ ậ ữ ự ụ ệ ộ vi c công nh n trình t ự ổ ợ b tr gi a th c nghi mnucleic và m t m c tiêu

ả ứ ể ượ ụ ộ ự nucleic.thăm dò và m c tiêu nucleic. M t ph n ng lai có th đ ệ c th c hi n

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 28

ữ ộ ộ ỗ gi a m t tàu thăm dò nucleic DNA và m t chu i DNA chromosomic (DNA

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ặ ộ ự ặ DNA hybrid hóa) ho c m t rRNA hay tRNA t (DNA RNA lai). Đ c hi u, ệ ở

ả ồ ứ ụ ụ ụ ộ ộ đây, ph thu c vào m c đ b o t n các m c tiêu trong nhóm m c tiêu phân

ữ ạ ươ ạ ở ấ ộ lo i. Nh ng ph ấ ng pháp này cung c p thông tin phân lo i các c p đ khác

ộ ố ố ọ ư ặ ạ ẳ ớ ọ nhau, ch ng h n nh các l p h c, chi, loài ho c phân loài. M t s trong s h có

ể ượ ộ ướ ự ệ ầ ứ ạ th đ c th c hi n mà không c n m t b c canh tác ph c t p, do đó cho phép

ẩ ụ ể ệ ờ ầ phát hi n các vi khu n c th trong vòng vài gi , thay vì vài ngày c n thi ế ớ t v i

ươ ự ươ ự các ph ng pháp canh tác d a trên. Các ph ng pháp d a trên nucleic acid

ườ ử ụ ả ứ ơ ỗ th ng xuyên h n là s d ng ph n ng chu i polymerase (PCR) và các ph ươ ng

ạ ệ ệ ệ ỗ pháp lai t ẩ ấ ủ ọ i ch (ISH). Đánh giá hi u su t c a h trong vi c phát hi n vi khu n

ẫ ướ ố ượ ậ ướ ả trong các m u n c u ng đ c th o lu n d i đây.

5.2.1. Phương pháp phản ứng chuỗi polymerase

ụ ạ ộ ượ ế PCR cho phép m t đo n DNA m c tiêu đ ạ ằ c khu ch đ i b ng cách sao

ể ượ ự ệ chép vòng (cycling replication). Sao chép này, có th đ ố c th c hi n trong ng

ặ ạ ệ ỗ ả ứ ộ ồ ỗ nghi m(in vitro) ho c t i ch (in situ), ở bao g m m t chu i ph n ng xúc tác b i

ử ụ ộ ồ ặ m t DNA polymerase (Taq polymerase) và s d ng các m i oligonucleotidic. Đ c

ộ ươ ụ ứ ệ ệ ộ ụ ữ ổ ồ hi u phát hi n ph thu c vào m c đ t ng đ ng và b sung gi a m c tiêu và

ồ ệ ộ ủ m i và nhi ế t đ lai (hybridization temperature). Các vòng sao chép c a PCR là k t

ủ ố ượ ấ ố ế ả ạ ộ ụ ỗ qu trong m t khu ch đ i theo c p s nhân c a s l ng các chu i m c tiêu và

ặ ố ươ ế ệ ể ả ộ ỗ làm tăng đáng k kh năng phát hi n m t chu i hi m ho c s t ấ ố ng đ i th p

ụ ẫ ậ ộ ộ ự ủ c a các vi sinh v t m c tiêu trong m t m u (Bej et al, 1990;.. Waage và c ng s ,

1999a , b;. Burtscher et al, 1999).

ươ ườ ượ ụ Ph ng pháp PCRth ng đ c áy d ng cho vi c ệ phát hi nệ và xác đ nhị các

ẩ ồ ướ ế ộ vi khu n bao g m m t sao chép vòng sau b c tách chi ệ ố t DNA trong ng nghi m

ạ ượ ế ự ệ ượ (in vitro). Khu ch đ i đ c th c hi n trên hàm l ng axit nucleic thu đ ượ ằ c b ng

ộ ộ ế ấ ọ ế m t ly gi ả ế i t bào theo sau là m t chi t xu t hóa h c. Các b ướ chi c t tách có thể

ọ ể ữ ạ ế ự ệ ự ẩ ộ ượ đ c th c hi n trên màng l c đ gi i t l bào vi khu n(Bej và c ng s , 1991a;.

ự ộ ộ ự Juck và c ng s , 1996;..Iqbal và c ng s , năm 1997; Tsen et al., 1998). Quá trình

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 29

ế ế ạ ồ ộ ừ ạ khu ch đ i PCR bao g m: (i) m t bi n tính DNA t ỗ ể m ch đôi đ DNA chu i

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ồ ủ ớ ợ ơ ở ệ ộ ụ ể ở ộ ơ đ n, (ii) m i v i DNA s i đ n nhi ở t đ lai c th , và (iii) m r ng lót b i

ỗ ằ ạ ủ ộ ộ ươ ế m t DNA polymerase Taq. Khu ch đ i c a m t chu i b ng ph ng pháp PCR

ườ ỳ ả ế ẩ ỏ ượ ệ ệ th ng đòi h i 20 đ n 40 chu k . S n ph m PCR đ c phát hi n sau khi đi n di

ạ ở ế ạ ẩ ộ ộ ố ả trên gel agarose và sau khi nhu m các s n ph m khu ch đ i b i m t lo i thu c

ộ ầ ộ ớ ượ ắ ặ nhu m fluorochrome ho c lai v i m t đ u dò đ c g n nhãn.

ươ ườ ượ ả ể ệ ị Ph ng pháp PCR th ng đ c mô t đ phát hi n và xác đ nh các vi sinh

ự ẩ ấ ầ ướ ế ế ủ ậ v t trong th c ph m, đ t, tr m tích và n c. N u chi ti t cols nguyên th y cho

ệ ử ụ ự ườ ề ẵ vi c s d ng PCR trên ples th c sam môi tr ng đã có s n trong nhi u năm

ụ ươ ể ị (Trevors và van Elsas, 1995), áp d ng ph ng pháp này đ xác đ nh các vi sinh

ướ ộ ố ử ệ ầ ố ượ ể ậ v t trong n c u ng là g n đây. M t s th nghi m đã đ ể c phát tri n đ phát

ệ ổ hi n các t ng coliform (total coliform) TC, coliform phân (faeacl coliform) FC (E.

ệ ả ậ ồ ẩ coli và vi sinh v t có liên quan) và tác nhân gây b nh bao g m c vi khu n

ả Salmonella spp. (B ng 2).

ố ớ ể ừ ể ạ ặ ẩ ồ Đ i v i vi khu n, phát tri n đo n m i đã g p khó khăn k t khi nhóm

ệ ị ướ ạ ộ ủ coliform, theo quy đ nh c a ngành công nghi p n c, là m t nhóm đa d ng, bao

ạ ừ ộ ố ượ ề ế ẽ ế ả ặ ồ ồ g m nhi u chi và lo i tr m t s đ ả c liên k t ch t ch . K t qu là, m i ph i

ẽ ệ ặ ọ ế ủ ụ ể đ c th mà h không phát hi n ch t ch phylogenetically không liên quan đ n

ồ ự ẩ ượ ử ụ ể ẩ vi khu n. M i d a trên gen lacZ đã đ ở ệ c s d ng đ phát hi n các vi khu n b i

ươ ườ ượ ự ể ẩ ả vì ph ng pháp giám sát coliform th ng đ ứ c d a trên các s n ph m bi u th c

ủ (bgalactosidase) c a gen này (Bej et al, 1990, 1991a, b;.Fricker và Fricker, 1994).

ủ ả ẩ ượ ạ ỡ S n ph m PCR c a các kích c khác nhau (326 và 264 bp) đ ằ c t o ra b ng cách

ớ ố ượ ủ ệ ả ặ ồ ế ử ụ s d ng c p m i khác nhau và k t qu là phát hi n c a TC v i s l ng nh ỏ

ư ế ử ụ ầ ạ ấ nh t bào 1/100 ml s d ng đ u dò gen đánh d u phóng x (Bej et al., 1990,

ứ ư ủ ặ ồ 1991a). Fricker và Fricker (1994) đã nghiên c u đ c tr ng c a m i cùng thi ế ậ t l p

ậ ằ ọ ế ư ủ ấ ẩ ộ ự nh Bej et al. (1991a) trên 324 ch ng tr c khu n nuôi c y. H k t lu n r ng m t

ượ ể ừ ứ ự ộ ồ b m i nên đ c phát tri n t m c d a vào gen lacZ không cho phép phân bi ệ t

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 30

ộ ố ủ ố ử ủ đ i x c a m t s ch ng odorifera Hafnia alvei và Serratia.

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ệ ụ ể ủ ủ ể ẩ ộ Đ phát hi n c th c a vi khu n E. coli, m t vùng c a gen malB này mã

ụ ề ể ầ ấ ậ ộ ỗ hóa m t protein v n chuy n maltose là chu i m c tiêu đ u tiên đ xu t (Bej et

ị ừ ự ồ ộ ề ặ al., 1990). Khu v c này bao g m các gen mà th t c u mã hóa m t protein b m t

ẩ ụ ể ậ ở ộ ượ đ ủ c công nh n b i m t E. coli vi khu n c th . Tuy nhiên, các thành viên c a

ể ượ ử ụ ệ ằ Shigella và Salmonella chi cũng có th đ ộ ồ c phát hi n b ng cách s d ng b m i

ệ ử ụ ượ ề ấ ể ệ ẩ này. Vi c s d ng các gen uidA sau đó đã đ c đ xu t đ phát hi n vi khu n E.

ự ả ộ ị ự coli (Bej et al., 1991a, b; Tsai và c ng s ., 1993). C hai khu v c quy đ nh (uidR)

ượ ử ụ và gen mã hóa các uidA dase BDglucuroni (GUD) enzyme đ c s d ng sau đó

có

ự ộ ế M t khu v c Amplified chi ti t: gen lacZ: mã hóa cho enzym b

ề ặ ượ ừ ộ ậ ụ ể galactosidase; gen c u: mã hóa cho m t protein b m t đ c công nh n c th do

ẩ vi khu n E. coli lambda; gen uidA: mã hóa cho enzym BDglucuronidase; gen

ự ủ ả ộ uidR: mã hóa cho khu v c qu n lý c a uidA; gen phoE: mã hóa cho m t protein

ỗ ỗ màng ngoài l r ng hình thành.

ự ộ ộ Thành công (Fricker và Fricker, 1994;. Juck và c ng s , 1996;.Iqbal và c ng

ồ ượ ụ ể ặ ự s , 1997). Các c p m i đ c c th cho E. coli và Shigella spp. Bej et al. (1991b)

ạ ố ơ ủ ộ ươ ể ớ đã báo cáo đ nh y t t h n c a ph ề ặ ng pháp PCR so v i các bài ki m tra b m t

ủ ự ề ồ ị ượ đ c xác đ nh d a MUG. Nhi u ch ng E. coli MUG âm, trong đó bao g m các

ủ ệ ế ượ ệ E. coli gây b nh c a type huy t thanh O157: H7, đã đ c phát hi n sau khi PCR

ơ ữ ủ cation amplifi c a gen uidA. H n n a, Phong et al. (1991)

ủ ề ả ả ẩ ằ ỉ đã ch ra r ng nhi u ch ng MUG âm có gen uidA ngay c khi s n ph m gen

ượ ể ệ ồ ượ (enzyme bDglucuronidase) không đ ặ c th hi n. C p m i khác đ c thi ế ế t k

ự ượ ấ ể ệ ề ẩ cho hai khu v c khác nhau đã đ ộ c đ xu t đ phát hi n vi khu n E. coli, m t

ố ọ ộ trong s h mã hóa cho m t protein bên ngoài màng (gen phoE) (Spierings et al.,

ộ ự ủ 1993) và m t trình t ủ DNA mã hóa cho các vùng V3 và V6 c a gen 16S rRNA c a

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 31

ủ ủ ệ ẩ ữ ệ b nh và ch ng không gây b nh c a vi khu n E. coli (Tsen et al., 1998). Nh ng

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ệ ụ ể ủ ủ ẩ ồ ặ c p m i cho phép phát hi n c th c a vi khu n E. coli, mà còn c a các loài vi

ẩ ự ề ị ượ ạ khu n Shigella khi các trình t đ ngh đ ế c khu ch đ i.

ệ ủ ệ ệ ể ằ ặ ươ Đ tăng tính đ c hi u c a vi c phát hi n b ng ph ng pháp PCR, m t s ộ ố

ả ệ ử ụ ả ứ ề ấ tác gi ồ đã đ xu t vi c s d ng các ph n ng multiplex PCR, trong đó bao g m

ử ế ạ ạ ờ ổ ồ đ ng th i khu ch đ i đo n DNA khác nhau. Bej et al. (1991b) s a đ i ph ươ ng

ể ệ ự ữ ế pháp này đ phát hi n các trình t gen liên quan đ n nhóm TC và nh ng ng ườ i

ế ệ ườ ư ộ liên quan đ n tác nhân gây b nh đ ng ru t nh E. coli, Salmonella spp. và

ạ ộ ể ố ớ ấ ả ỗ Shigella spp. Multiplex PCR có th không ho t đ ng t t v i t ợ t c các h n h p

ủ ề ầ ồ m i, tuy nhiên. Thành ph n và chi u dài c a pri mer oligonucleotide, cũng nh ư

ướ ể ả ủ ả ỡ ưở ế ẫ kích th c c a các m nh v AMPLIfied, có th nh h ạ ng l n khu ch đ i

ụ ủ ế ạ ượ ự ệ ằ PCR. Ví d , khu ch đ i multiplex c a TC và E. coli đ ồ c th c hi n b ng n ng

ộ ồ ẳ ồ ả ằ ồ ử ầ ộ đ cân b ng các m i c , trong khi n ng đ m i đ ng phân t không c n thi ế t

ệ ệ ồ ổ ấ ả ẩ ờ cho vi c phát hi n đ ng th i Legion viêm ph i Ella và t ộ t c các vi khu n thu c

chi (Bej et al., 1991a).

ấ ủ ứ ể ệ ệ ậ ặ ỉ Đ phát hi n các m c th p c a tác nhân gây b nh ho c vi sinh v t ch th ị

ẫ ướ ộ ướ ậ ư ọ ướ ả ượ ự trong các m u n c, m t b c t p trung nh l c tr c tiên ph i đ ệ c th c hi n.

ử ụ ươ ở ọ Bej et al. (1991a) báo cáo s d ng ph ng pháp l c và phát hành b i DNA đóng

ả ạ ưở ế ự ế ạ băng tan băng đi xe đ p mà không nh h ự ng đ n s khu ch đ i PCR. Khi tr c

ủ ả ẩ ượ ự ệ ạ ằ ớ quan c a s n ph m PCR đ ầ ử ụ c th c hi n b ng cách s d ng lai t o v i các đ u

ạ ươ ộ ớ ạ ế dò phóng x , ph ng pháp này cho phép m t gi ệ i h n phát hi n lên đ n 1 t ế

ụ ệ ươ ể ườ bào / 100 ml. Tuy nhiên, vi c áp d ng ph ng pháp này đ theo dõi th ng xuyên

ủ ả ộ ầ ự ể ẩ ở ớ có th là khó vì tr c quan c a s n ph m b i hóa hybrid v i m t đ u dò phóng

ể ừ ể ệ ễ ơ ầ ạ x có th yêu c u 23 ngày k t ệ ố khi ph i nhi m. H th ng phát hi n không

ư ồ ế ữ ể ạ ố ộ ề phóng x , gi ng nh m i biotinylated, có th là m t thay th h u ích cho nhi u

ụ ủ ệ phát hi n nhanh chóng c a DNA m c tiêu thăm dò lai. Juck et al. (1996) đã phát

ộ ấ ủ ứ ể ệ ể ộ ồ tri n m t giao th c đ phát hi n nhanh chóng n ng đ th p c a E. coli trong các

ướ ổ ủ ứ ự ự ồ ẫ m u n ứ ọ c d a trên giao th c PCR l ng nhau và s thay đ i c a giao th c l c

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 32

ế ồ ạ ằ b ng Bej et al. (1991a). Nested PCR bao g m hai vòng utive consec khu ch đ i

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ệ ầ ượ ự ư ệ ườ ồ ủ ớ ạ PCR. Vi c ch y đ u tiên đ c th c hi n nh bình th ớ ng, v i m i v i các

ụ ể ở ộ ụ ự ế ầ ẫ ồ khu v c m c tiêu c th (m u) ti p theo là ph n m r ng cho sion m i. Vòng

ủ ự ạ ầ ử ụ ứ ế ẫ ả ẩ ộ th hai s d ng các s n ph m c a s khu ch đ i đ u tiên làm m u cho m t

ủ ủ ớ ơ ở ộ ườ ườ vòng c a và m r ng v i s n lót khác nhau Ng i ta th ả ng liên minh s n

ủ ứ ế ế ạ ả ẩ ả ộ ộ ộ ể ả ph m c a các k t qu khu ch đ i th hai trong m t m nh đó là n i b đ s n

ủ ủ ế ệ ạ ả ẩ ầ ế ph m c a vòng đ u tiên c a khu ch đ i PCR. Nested PCR tăng hi u qu khu ch

ị ươ ệ ả ẩ ạ ầ ạ ừ đ i t ấ các c p đ a ph ng phát hi n s n ph m PCR t o ra trong vòng đ u tiên

ạ ể ạ ượ ế ệ ở ứ ộ ứ ượ đ c khu ch đ i đ đ t đ c m c đ phát hi n ệ ử ụ vòng th hai.Vi c s d ng

ồ ồ ấ ạ ộ ố ộ ấ các đo n m i l ng nhau cung c p m t c p đ qu c Ngoaøi tính c th k t ụ ể ể ừ

ể ượ ứ ỉ ự ệ ự vòng PCR th hai ch có th đ ế c th c hi n n u đúng trình t ồ (plementary đ ng

ượ ứ ế ạ ầ ể ồ đ m i bên trong) đ c khu ch đ i trong vòng đ u tiên. Giao th c Nested PCR

ộ ố ể ệ ẩ ượ ử ụ đ c s d ng đ phát hi n vi khu n E. coli (Juck et al, 1996.) Và m t s tác nhân

ệ ướ ố gây b nh (Delabre et al, 1997.)Trong n c u ng, trong khi Waage et al. (1999a, b)

ố ượ ụ ệ ệ ủ ấ áp d ng chúng vào vi c phát hi n s l ng th p c a Salmonella spp. và Y.

ế ở ể ệ ậ ộ ỹ enterocolitica t bào ơ vùng bi n.K thu t này cho phép phát hi n m t nhanh h n

ớ ườ ể ừ ậ ủ ỗ (68 h) so v i PCR thông th ng (vài ngày), k t ế khi xác nh n c a chu i khu ch

ầ ằ ầ ế ặ ạ ả ộ ạ đ i chính xác b ng đ u dò lai là không còn c n thi ủ t. M c dù đ nh y c m c a

ể ử ụ ố ượ ể ấ ị ậ ỹ mình, r t khó đ s d ng PCR đ xác đ nh s l ậ ng vi sinh v t. Hai k thu t

ượ ể ị ượ ươ ủ ế ch y u đ c phát tri n cho DNA đ nh l ằ ng b ng ph ng pháp PCR: (.

ể ả ố ượ ấ ạ Toranzos et al, 1993) các đ i nh t có th x y ra, s l ạ ng PCR và PCR c nh

ộ ố ể ệ ủ ạ ạ ỉ ệ tranh (thêm m t đ i th c nh tranh cho giai đo n DNA PCR đ hi u ch nh hi u

ứ ủ ể ế ậ ả ỹ ư qu PCR) (Zachar et al., 1993).Đ ki n th c c a chúng tôi, các k thu t này ch a

ụ ế ị ượ ượ đ c áp d ng t ừ ướ tr c đ n nay cho các đ nh l ng coliform trong n ướ c

ư ậ ệ ườ ể ị ư ượ ậ ộ ố u ng.Nh v y, hi n nay, nó d ng nh không th đ nh l ng m t đ coliform

ướ ằ ố ươ ế ẫ trong n c u ng b ng ph ng pháp PCR.Cho đ n nay, MPNPCR v n không

ỏ ự ể ướ ạ ố chính xác và PCR c nh tranh đòi h i s prepara đáng k tr ủ ạ c đ i th c nh

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 33

ẫ ướ ụ tranh DNA t ố ượ t đ c áp d ng cho các m u n c.

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ứ ự ế ậ ầ ộ ờ ị ượ ẹ M t cách ti p c n đ y h a h n là th i gian th c tích đ nh l ng PCR,

ẩ ả ồ trong đó bao g m giám sát các s n ph m fluores cently PCR khi chúng đ ượ c

ọ ủ ả ế ẩ ạ ộ ộ ạ khu ch đ i (Heid et al., 1996). Đ ng h c c a s n ph m PCR là m t giai đo n

ấ ố ự ạ ấ ộ ệ ủ tích lũy theo c p s nhân theo sau là m t giai đo n cao nguyên. S xu t hi n c a

ụ ể ề ẳ ộ ố ạ cao nguyên này ph thu c vào nhi u thông s soát không ki m soát, ch ng h n

ệ ủ ấ ứ ự ư ế ấ ồ ờ ự nh dimerization m i và s xu t hi n c a các ch t c ch . Cation th i gian th c

ố ượ ể ậ ơ ố ớ ị quantifi là đáng tin c y h n so v i đi m cu i xác đ nh s l ng vì các phép đo

ự ệ ệ ể ạ ượ đ ấ ố c th c hi n trong giai đo n theo c p s nhân. Nó cũng có th phát hi n các

ả ứ ế ồ ấ ứ ủ ề ấ v n đ ition inhib c a ph n ng PCR do các ch t c ch đ ng tinh khi ế ớ t v i

ế ầ ượ ụ ệ ệ ậ DNA. Cách ti p c n này g n đây đã đ c áp d ng cho vi c phát hi n và

ủ enterohemorhagic enterotoxigenic E. coli ch ng vi sinh lâm sàng (Bellin et al,

ạ ượ ự ế ẩ ả ộ 2001;. Carroll và c ng s , 2001.). Khi s n ph m PCR khu ch đ i đ ộ c nhu m

ử ụ ộ ố ộ ớ v i thu c nhu m SYBR Green, s d ng m t LightCycler (Roche, Mannheim,

ề ặ ộ ỹ Ger nhi u) ho c m t GeneAmp (Applied Biosystems, Foster City, M ), ph ươ ng

ự ệ ạ ờ ơ ộ ơ ộ ặ pháp PCR th i gian th c hi n nhanh chóng h n và đ nh y cao h n và đ đ c

ự ệ ớ ớ ề ệ hi u trong s so sánh v i các xét nghi m PCR song v i phân tích gel truy n

ố ươ ư ượ th ng (Carroll et al., 2001). Tuy nhiên, ph ng pháp này ch a đ ộ ụ c áp d ng r ng

ệ ụ ể ủ ộ ấ ể ẫ ậ ồ ệ rãi đ phát hi n c th c a vi sinh v t hi n nay n ng đ th p trong các m u môi

ườ ể ượ ư ươ ầ ơ tr ng, nh ng có th đ ể c phát tri n trong t ng lai. G n đây h n, Tani et al.

ự ề ề ế ấ ộ ế ụ (1998) đã đ xu t m t đi u tra tr c ti p các t ử ụ ằ bào m c tiêu b ng cách s d ng

ự ế ệ ạ ỗ ự ạ ủ ế ộ tr c ti p trong xét nghi m PCR t i ch . S khu ch đ i c a m t trình t ự ụ ể c th

ệ ừ ộ ự ệ ệ ả ơ ế ượ đ c th c hi n t m t gen đ n b n sao hi n di n trong các t ứ bào. Các giao th c

ườ ả ượ ử ổ ể ự ể ượ PCR thông th ng ph i đ c s a đ i đ trình t axit nucleic có th đ ế c khu ch

ơ ể ớ ố ị ữ ề ệ ợ ồ ạ đ i trong c th . V i c đ nh và permeabilization nh ng đi u ki n thích h p, m i

ế ể ầ ả ứ oligonucleotide và các thành ph n ph n ng khác có th khu ch tán vào các t ế

ạ ệ ế ạ ự ụ ẩ bào, và khi đi xe đ p nhi t, khu ch đ i trình t ụ ể ả m c tiêu c th . S n ph m PCR

ả ở ỡ ố ượ đ c dán nhãn b i digoxigeninUTP (DIG dUTP), và các m nh v ch ng DIG

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 34

ộ ợ ố ớ ỳ ượ ử ụ ệ ể Fab 'liên h p v i thu c nhu m hu nh quang đ ằ c s d ng đ phát hi n b ng

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ế ể ậ ấ ỳ ự kính hi n vi hu nh quang epifluores. Cách ti p c n này cho phép nhìn th y tr c

ế ế ẩ ả ạ ỳ ở ộ ứ ộ ơ ti p các s n ph m khu ch đ i hu nh quang ộ m t m c đ đ n bào và do đó m t

ể ượ ự ề ế ủ ế ả đi u tra tr c ti p có th đ c dán nhãn c a các t bào. Các tác gi ụ đã áp d ng

ươ ớ ự ủ ự ế ớ ừ ẫ ph ng pháp PCR m i này v i s enumera tr c ti p c a E. coli t m u n ướ c

ệ ườ ế ấ ả ộ ọ ế ủ ộ ỳ ế ng t.K t qu cho th y m t tín hi u c ng đ hu nh quang y u c a các t bào

ậ ằ ọ ế ụ ề ả ộ m c tiêu.Tuy nhiên, h k t lu n r ng phân tích hình nh cho phép m t đi u tra

ự ế ế ỗ ườ ụ ứ ặ tr c ti p các t bào m c tiêu E. coli. M c dù trong giao th c PCR ch d ng nh ư

ượ ử ụ ệ ệ ườ ing promis, nó đã không đ c s d ng cho vi c phát hi n th ế ng xuyên và đ m

ậ ướ ố s vi sinh v t trong n c.

ủ ề ể ế ế ặ ạ ỹ ầ Nhi u h n ch liên quan đ n các đ c đi m k AMPLIPCR c a DNA c n

ả ượ ả ế ướ ươ ể ượ ử ụ ể ph i đ c gi i quy t tr c khi ph ng pháp này có th đ c s d ng đ phân

ủ ẫ ả ẩ ạ ướ ặ ố ươ tích nh y c m c a vi khu n trong m u n c u ng. M c dù ph ng pháp này đã

ộ ố ể ệ ầ ớ ượ ử ụ đ ả c s d ng v i m t s thành công đ phát hi n E.coli và coliforms, c n ph i

ứ ằ ầ ỉ ượ ự ệ ẫ ướ ế ch ra r ng h u h t các nghiên c u đ c th c hi n trên m u n ọ ớ c tăng v t v i

ủ ế ậ ả ặ ẩ ấ các ch ng nuôi c y vi khu n (B ng 2) và xác nh n là hi m khi, ho c không,

ự ệ ẫ ườ ự ế ặ ượ ượ đ c th c hi n trên các m u môi tr ng. M c dù th c t là PCR đ c công

ệ ậ ộ ị ươ ấ ụ ể ể nh n là m t phát hi n và xác đ nh ph ng pháp r t c th , nó có th trình bày

ộ ố ạ ế ệ ệ ế ộ ụ m t s h n ch khi áp d ng cho vi c phát hi n các t bào trong m t m u t ẫ ự

ấ ả ặ ổ ị ậ ậ ạ ộ nhiên là kh thi ho c trao đ i ch t ho t đ ng mà không b culturable. Th t v y,

ụ ế ạ ố ớ ế ế khu ch đ i PCR áp d ng đ i v i acid nucleic chi t xu t t ấ ừ t ố bào s ng và

ế ệ ả culturable, kh thi và không culturable hay đã ch t. Do đó, xét nghi m PCR không

ủ ế ể ạ ấ ộ ạ ụ ề th cung c p thông tin v tình tr ng sinh lý c a t bào m c tiêu. M t h n ch c ế ố

ể ẫ ườ ế ườ ứ ữ h u đ phân tích PCR các m u môi tr ng là c ch th ả ủ ng xuyên c a các ph n

ứ ấ ượ ọ ng enzym: Các ch t humic đ ợ c g i là (ASE Taqpolymer) enzyme trùng h p

ấ ứ ự ự ế ấ ớ ộ ch t c ch , và ch t keo có ái l c cao v i DNA (Way và c ng s , 1993. ). S ự

ế ố ệ ệ ẫ ộ ướ ủ hi n di n c a các y u t này trong m t m u n ể ả ể c do đó có th đáng k gi m

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 35

ấ ạ ượ ụ ể ệ ẩ ế năng su t khu ch đ i PCR đ ấ c áp d ng đ phát hi n các vi khu n pha loãng r t

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ế ệ ể ạ ề ọ ả ạ ẩ nhi u. H cũng có th h n ch vi c ti ế ộ t l ế các s n ph m khu ch đ i (Straub et

al., 1995).

5.2.2. Kỹ thuật lai in situ (In situ hybridization techniques)

ử ụ ệ ầ ổ ỗ ể ISH s d ng đ u dò oligonucleotide đ phát hi nchu i axit nucleic b sung.

ươ ủ ể ả ộ ớ Ph ng pháp này khai thác kh năng c a axit nucleic đ bám v i nhau m t cách

ấ ụ ể ể ạ ầ ố ượ ụ ể ở ổ b sung r t c th đ t o gi ng lai. Các đ u dò đ c c th b i vì chúng đ ượ c

ừ ượ ổ ọ ỗ ự xây d ng t , và đ ấ ể ư c b sung vào, ch n nucleic acid chu i đó là duy nh t đ đ a

ụ ể ầ ặ ắ ậ ặ ộ ra m t vi sinh v t, các loài ho c nhóm. Các đ u dò có th nh m m c tiêu ho c là

ặ ử ự ể ADN ho c các phân t ử ụ RNA. S d ng trình t rRNA (5S, 16S và 23S) đ nghiên

ơ ở ủ ự ỳ ủ ọ ệ ể ố ứ c u các m i quan h phát sinh loài trên c s c a s phân k c a h và đ phát

ế ị ế ờ ượ ậ ể tri n thi ấ t b thăm dò lai r t quy t tâm, bây gi cũng đ c thành l p (Amann et

ự ủ ủ ệ ẩ ơ al, 1995.). Trình t c a h n 2500 c a rRNA 16S loài vi khu n hi n trao các gen

ấ ị ở ộ ứ ộ ự có giá tr thông tin r t cao m t m c đ phát sinh loài. So sánh trình t làm cho

ể ể ụ ự ị ượ ả ồ ả nó có th đ xác đ nh các khu v c m c tiêu đ c b o t n hoàn h o trong m c đ ứ ộ

ụ ể ể ấ ạ ừ ể ề phân lo i khác nhau và do đó c th đ các c p, t các tên mi n đ phân loài.

ụ ử ứ ủ ử Cũng quan tâm trong m c tiêu phân t rRNA là m c cao c a các phân t rRNA

ầ ượ ế ớ ố ượ ớ ế ả b n, đó là l n l t liên k t v i s l ng l n các ribosome trong t bào. S l ố ượ ng

ườ ừ ế ribosome khác nhau, th ng t ạ ẩ 103 đ n 105 trên vi khu n, theo các loài và tr ng

ủ ế ượ ế ươ ự ộ thái logic physio c a các t bào, và đ c tr c ti p t ớ ố ng quan v i t c đ tăng

ưở ủ ế ụ ể ể ủ ế ầ tr ng c a t bào (Amann et al., 1995). Đ u dòc th đ rRNA (ch y u là 16S

ầ ự ụ ể ẩ ở ị ậ và 23S rRNA CES tu n t ) đã tr thành công c tiêu chu n đ xác đ nh sinh v t

ự ộ (Olsen và c ng s , 1986.).

ế ị ươ ự ạ ọ ộ ố M t s thi t b thăm dò oligonucleotide th ng m i hóa và l a ch n xem

ử ụ ế ế ườ ụ ể ớ ộ có nên s d ng chúng hay thi ữ t k , nh ng ng ầ ớ ụ i c th m i ph thu c ph n l n

ứ ụ ụ ụ ể ấ ỗ ộ vào ng d ng. Đ tìm chu i m c tiêu liên t c duy nh t cho m t vi sinh v t c ậ ụ

ỗ ợ ứ ự ể ự ẵ th , các nhà nghiên c u d a vào máy tính h tr so sánh trình t có s n trong c ơ

ự ở ữ ệ s d li u d án ribosome (RDP) (Maidak et al., 1996), trong GenBank cho DNA

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 36

ề ệ ặ ầ (Benson et al., 1999), ho c trong gói ph n m m ARB (Vi n Max Planck, Bremen,

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ư ứ ố ơ ự ụ ế ắ ố ớ ặ Đ c). Đ i v i đ c tr ng t t h n, trình t m c tiêu nên ng n (15 đ n 30 base) và

ỗ ủ ậ ặ ấ ớ có ít nh t 23 nucleotide khác nhau v i chu i c a các sinh v t liên quan ch t ch ẽ

ệ ớ ạ ể ự ỗ (DeLong, 1993) Làm vi c s m trong ch lai d a vào thăm dò phóng x đ phát

ự ụ ệ ệ ộ ệ hi n và phát hi n các m c tiêu lai probe (Olsen và c ng s , 1986.). Công vi c

ệ ạ ạ ử ụ ầ ỗ ỳ hi n t i trên rRNA trong lai t i ch hu nh quang s d ng đ u dò nucleotide nhãn

ổ ế ủ ỹ ư ỉ ể ự ệ ậ ầ h u nh ch đ phát hi n hóa hybrid (FISH). S ph bi n c a k thu t FISH là

ợ ố ớ ế ủ ạ ồ ộ ố do l ạ i th c a mình đ i v i nhãn phóng x , trong đó bao g m đ nh y, t c đ ộ

ủ ế ự ể ằ ặ ơ ế ị ủ c a tr c quan c a t bào đ n (b ng kính hi n vi ho c các thi t b cytometrical),

ủ ả ề ệ ả ẩ ờ ị ự ổ s n đ nh c a s n ph m lai, an toàn, th i gian phát hi n gi m đi, nhi u nhãn

ễ ử ụ ề ắ (nhi u màu s c) và d s d ng (Richardson et al., 1991; DeLong, năm 1993;

ộ ố ỳ Swinger và Tucker, 1996). Hu nh quang và thu c nhu m Rhodamine là

ử ụ ộ ườ ự ấ ộ fluorochromes xuyên s d ng đ th ng xuyên nh t (DeLong và c ng s năm

ự ộ ộ 1989,;. Amann và cs, 1990;. Manz và c ng s , 1992;. Năm 1993;. Wagner và c ng

ư ế ả ẫ ố ộ ơ ỳ ự s , 1994), nh ng thu c nhu m CY3, sáng h n và d n đ n gi m hu nh quang

ệ ầ ặ ơ ớ ượ ự không đ c hi u h n so v i rochromes fluo khác, g n đây đã thu hút đ c s chú

ự ề ơ ộ ý nhi u h n (Wessendorf và Brelje năm 1992; Glockner và c ng s năm 1996,;.

ộ ự Zarda et al, 1997;. Kalmbach và c ng s 1997a,;. Ouverney và Fuhrman, 1999).

ự ế ướ ủ ụ ố ị ế ặ Trong th c t , các b c th t c cá là: c đ nh t ặ bào, lai (đ c và nghiêm ng t

ụ ệ ộ ờ ồ ố ồ ộ ộ ộ ph thu c vào nhi ề t đ và th i gian lai, n ng đ mu i, n ng đ thăm dò và chi u

ể ạ ỏ ử ậ ụ ể ệ ặ ộ ộ dài), r a h u lai (đ lo i b ràng bu c ho c không c th tài li u ràng bu c) và

ế ệ ườ ượ ệ ể ằ phát hi n. T bào lai này th ng đ ộ c phát hi n b ng kính hi n vi và m t

ư ậ ư epifluorescence counterstain nh v y nh DAPI (40,60diamidino2phenylindole)

ặ ượ ử ụ ố ế ể ổ ị ộ ho c màu cam acridine đ c s d ng đ xác đ nh t ng s t bào. Tùy thu c vào

ế ụ ể ộ ả ệ ộ ủ ồ n ng đ c a các t ẫ bào m c tiêu trong m u và đ tăng đ phân gi i, phát hi n cá

ể ượ ự ệ ằ ươ ệ ư ượ ế ắ ặ có th đ c th c hi n b ng các ph ng ti n l u l ng ho c pha r n đ m t ế

ế ị ượ ườ ộ ỗ ỳ bào. Đo dòng t bào cho phép đ nh l ng c ụ ng đ hu nh quang cho m i m c

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 37

ự ộ tiêu thăm dò lai (Fuchs và c ng s , 1998.).

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ể ủ ố ớ ự ộ ụ ể Đ i v i TC, s phát tri n c a m t c th 16S rRNA thăm dò cho nhóm này

ể ể ừ ủ là không th , k t ị khi nhóm coliform theo quy đ nh c a ngành công nghi p n ệ ướ c

ẩ ừ ứ ộ ượ ế là m t nhóm có ch a vi khu n t chi đ c phylogeneti Cally khác nhau. K t qu ả

ầ ả ượ ể ọ ơ là, các đ u dò (B ng 3) đã đ c phát tri n cho h Enterobacteriaceae h n là cho

ệ ầ ượ ể ể TC. Vi c đ u tiên, Entero (Mittelman et al., 1997) đã đ ệ c phát tri n đ phát hi n

ủ ễ ườ ứ ể lâm sàng c a nhi m trùng đ ng ti u. Th hai, ENT1 (Loge et al., 1999) đã đ ượ c

ụ ứ ể ẫ ướ ả ẫ phát tri n cho các ng d ng trên các m u n c th i. Hai m u dò khác nhau trong

ầ ủ ọ ệ ề thành ph n c a h và trong các đi u ki n lai. Các Entero thăm dò là dài 25 base có

ượ ơ ở ầ ớ hàm l ng C + G 48% so v i 17 c s và 70% C + G cho đ u dò ENT1. Nghiên

ố ớ ầ ệ ấ ặ ứ c u trong RDP (Maidak et al., 1996) cho th y tính đ c hi u cao đ i v i đ u dò

ớ ơ ENT1 cho các loài Enterobacteriaceae h n so v i thăm dò Entero (Rompre' và

ệ ướ ố ủ ị Baudart, NSERC Ch t ch công nghi p vào n c u ng, Ecole Polytechnique

Montreal,thong tin cá nhân).

ự ụ ể ệ ẩ Trình t rRNA thăm dò m c tiêu đ phát hi n vi khu n E. coli cũng đã

ầ ố ộ ổ ượ đ c công b . Các đ u dò ỗ EC1531 (Poulsen et al., 1994), b sung cho m t chu i

ớ ộ ồ 23S rRNA, bao g m 20 nucleotide v i n i dung C + G 55%. Shi et al. (1999) đã s ử

ệ ể ề ệ ẩ ầ ổ ụ d ng đ u dò này đ phát hi n vi khu n E. coli sau khi thay đ i các đi u ki n lai,

ề ậ ư ế ầ ả ượ ử ụ ư ộ nh ng không có k t qu đã đ c p. Các đ u dò đã đ ề c s d ng nh m t đi u

ử ụ ệ ể ằ ộ ộ ỏ ế khi n trong m t thí nghi m b ng cách s d ng m t mô hình thu nh chi ấ t xu t

ọ ớ ể ầ ơ tăng v t v i E. coli DNA. G n đây h n, Regnault et al. (2000) đã phát tri n thăm

ệ ể ướ ẩ dò Colinsitu đ phát hi n vi khu n E. coli và E. fergusonii trong n ể c ti u, n ướ c

ướ ự ẩ ẫ ả ồ (sông và n c th i) và các m u th c ph m. Các đ ng Colinsitu thăm dò mang

ổ ộ ữ ỗ ộ ồ ế đ n nh ng b m t chu i 16S rRNA và bao g m 24 nucleotide (C + G n i dung

ủ c a 46%). thăm dò này

ộ ặ ệ ố ấ ủ ự ừ ươ cho th y đ đ c hi u t t cho tr c quan c a E. coli t các ph ệ ng ti n

ề ượ ớ ượ ử ụ ử truy n thông khác nhau đã đ ệ c th nghi m và m i đ c s d ng thành công đ ể

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 38

ệ ướ ố ẫ ẩ phát hi n vi khu n E. coli trong n c u ng m u (Delabre et al., 2001).

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ỹ ườ ư ộ ươ ậ K thu t FISH d ng nh là m t ph ng pháp phát hi n r t c th ệ ấ ụ ể ở ấ c p

ụ ệ ể ế ộ ế đ t ộ ố ạ bào; Tuy nhiên, nó có th có m t s h n ch khi áp d ng cho vi c phát

ệ ấ ưỡ ị ỏ ế ổ ế ẩ hi n các ch t dinh d ng b b đói các t bào vi khu n ph bi n trong drink

ả b ng 3

ầ ượ ử ụ ể ị Đ u dò oligonucleotide đ c s d ng đ xác đ nh các Enterobacteriaceae và

ườ E. coli trong môi tr ng

ụ ụ ệ ả ặ ị Thăm dò liên t c (50 30) rRNA v trí m c tiêu đ c tài li u tham kh o

 ENTEROa CATGAATCACAAAGTGGTAAGCGCC 16S, 14581482

Enterobacteriaceae Mittelman et al, 1997.

 ENT1 CCGCTTGCTCTCGCGAG 16S, 12731289

Enterobacteriaceae Loge et al, 1999.

 EC1531 CACCGTAGTGCTCGTCATCA 23S, 1531 . 1550 E. coli

Poulsen et al, 1994

 COLINSINTU GAGACTCAAGATTGCCAGTATCAG 16S, 637660

E. coli Regnault et al, 2000.

 PNA thăm dò GCAAAGCAGCAAGCTC 16S, 7186 E. coli Prescott

và Fricker, 1999

Ở ự ệ ễ ơ ượ ư đây Entero cho s khác bi t d dàng h n vì không có tên đã đ c đ a ra

ả ướ ộ ộ ữ ế ế ạ ở b i các tác gi trong n c. Nh ng h n ch này có liên quan đ n m t n i dung

ố ượ ủ ỏ ụ ủ ỏ ẩ ribosom c a vi khu n nh và do đó s l ng nh các 16S rRNA m c tiêu c a các

ế ệ ỳ ế t bào, trong đó gây ra tín hi u lai hu nh quang y u (Amann et al, 1995;. Lebaron

ẽ ạ ế ượ ả et al, 1997.). Đây có l là lý do t i sao cá hi m khi đ c mô t ệ trong các tài li u

ệ ố ế ế ả ạ ố ướ n ẳ c u ng vào lúc này. K t qu là, h th ng khu ch đ i rescence fluo, ch ng

ư ề ậ ỹ ạ h n nh nhi u thăm dò (thay vì monolabeled thăm dò trong k thu t FISH

ươ ứ ạ ủ ặ ự ventional d ng), tính t ả ng tác c a các biotine avidine ph c t p và / ho c c i

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 39

ể ạ ự ề ợ ớ ệ ng a trăm oxydase liên h p v i fluorochrome tyramide n n , có th đ i di n

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ể ộ ườ ộ ủ ệ ở ỳ ế cho m t cách đ tăng c ng đ c a tín hi u hu nh quang phát ra b i các t bào

ầ lai đói (Lebaron et al, 1997;. scho nhuber et al, 1997.). G n đây, Prescott và Fricker

ệ ử ụ ộ ạ (1999) báo cáo vi c s d ng m t axit nucleic peptide (PNA) thăm dò cho lai t o

ệ ẩ ỗ ướ ả ạ t i ch và phát hi n các vi khu n E. coli trong n ế c máy. Các k t qu lai cũng

ự ư ườ ươ ế ấ ộ ươ t ng t ữ nh nh ng ng i thu đ ượ ừ c t ph ộ ng pháp đ m t m. M t PNA là m t

ổ ợ ươ ườ ượ axit nucleic t ng h p, trong đó x ố ng s ng đ ng đ ộ ế ằ c thay th b ng m t

ữ ố ợ ế ể ử ụ ầ ươ x ng s ng peptide. Nh ng l i th đ s d ng PNA thay vì đ u dò DNA bao

ố ơ ớ ồ ộ ậ ể ấ ộ ồ g m kháng t ố t h n đ nuclease t n công, hybrid hóa đ c l p v i n ng đ mu i,

ệ ộ ự ể ạ ượ ắ ơ ộ ề nhi u bi t ràng bu c cific và trình t thăm dò ng n h n, đ đ t đ ạ c đ nh y

ể ừ ẽ ơ ế ạ ớ ơ ớ l n h n. K t ụ khi thăm dò PNA liên k t m nh m h n v i các trang web m c

ả ứ ể ượ ắ ờ ộ tiêu, ph n ng lai có th đ c hoàn thành trong m t th i gian ng n (30 phút).

ể ế ủ ạ ừ Theo hi u bi t c a chúng tôi, ngo i tr tàu thăm dò E. coli PNA (Prescott và

ữ ố ế ị ượ ử ụ Fricker, 1999), không ai trong s nh ng thi t b thăm dò đã đ c s d ng cho vi

ệ ẩ ặ ẩ ướ ố ướ khu n ho c vi khu n gây b nh giám sát trong n c u ng. Tr c khi h đ ọ ượ c

ư ộ ấ ậ ươ ả ầ ề ạ ả ọ ch p nh n nh m t ph ng pháp đi u tra coliform nh y c m, h ph i đ u tiên

ể ậ ẫ ấ ả ạ ộ ợ ị ph i ch u m t giai đo n xác nh n đ thăm dò phù h p nh t cho các m u phân

ể ượ ự ể ố ư ế ầ ệ ề ế tích có th đ ọ c l a ch n và đ t i u hóa các đi u ki n lai n u c n thi t.

ệ ử ụ ỏ ớ ả ả ộ ộ Kh năng di đ ng là m t câu h i l n n y sinh trong vi c s d ng cá đ ể

ễ ồ ướ ố ượ ậ ằ theo dõi ô nhi m ngu n n c u ng. Nó đ ủ ộ c thành l p r ng n i dung rRNA c a

ế ẩ ươ ớ ố ộ ự ế ưở các t bào vi khu n có t ng quan tr c ti p v i t c đ tăng tr ng (Amann et al.,

ủ ể ẩ ạ ộ ộ 1995). Tuy nhiên, n i dung rRNA c a m t lo i vi khu n có th không hoàn toàn

ư ộ ố ượ ủ ẻ ả ạ ỏ ph n ánh tình tr ng sinh lý c a nó. Có v nh m t s l ng nh các phân t ử

ể ộ ờ ươ ấ ố rRNA có th duy trì trong m t th i gian t ng đ i dài sau khi m t culturability. S.

ệ ẫ ờ ạ ừ ả aureus và E. coli rRNA v n còn phát hi n 48 gi sau khi kích ho t v a ph i nhi ệ t

ẫ ấ ặ ho c tia UV (McKillip et al., 1998). Sheridan et al. (1998) v n còn tìm th y vi

ẩ ờ ạ ộ ừ ệ ở ứ khu n E. coli 16S rRNA 16 gi sau khi ng ng ho t đ ng nhi m c 100, 80 và t

ủ ế ố ộ ớ ế 60 C. Cu i cùng, Prescott và Fricker (1999) ti p xúc v i m t ch ng E. coli đ n

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 40

ử ụ ế ầ ỳ 1,5 mg / l clo cho đ n 30 phút. S d ng đ u dò PNA và tyramide hu nh quang h ệ

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ố ộ ờ ố ọ th ng cation amplifi (TSA b ; Perkin Elmer Khoa h c đ i s ng, Ontario,

ự ử ệ ằ ẫ ẩ ọ Canada), h vi khu n v n phát hi n ngay s sau khi kh trùng b ng clo, trong khi

ế ượ ở ố ượ ươ không có các t bào đ ệ c phát hi n b i s l ặ ng đĩa ho c các ph ng pháp

ằ ầ ế ệ ẫ ị ử Colilert. Hai tu n sau khi kh trùng b ng clo, 10% các t ở bào v n b phát hi n b i

ể ượ ề ộ ợ ế ộ b PNA thăm dòTSA. Đi u này có th đ ư c xem nh là m t l i th cho các

ươ ể ượ ứ ph ng pháp trong đó các hình th c coli không culturable có th đ ệ c phát hi n,

ộ ấ ợ ặ ế ể ượ ế ệ ứ ho c là m t b t l i trong đó các t bào ch t có th đ c li t kê. Nghiên c u sâu

ủ ề ẩ ạ ượ ệ ầ ở ơ h n v tình tr ng sinh lý c a vi khu n đ c li ẫ t kê b i cá v n còn c n thi ế ể t đ

ộ ế ể ể ứ ế ề ề ấ ậ ỏ ộ đi đ n m t k t lu n v câu h i này. M t cách có th đ nghiên c u v n đ này

ậ ố ự ế ả ớ ỹ ệ là vài k thu t s kh thi tr c ti p (DVC) (Kog ure et al., 1979) v i phát hi n

ầ ớ ố FISH (Nishimura et al., năm 1993; Kalmbach et al., 1997b). Kh p n i này g n đây

ượ ụ ể ệ ẩ ướ ố ủ đã đ c áp d ng đ phát hi n vi khu n E. coli trong n c u ng c a Delabre et al.

ả ấ ể ơ ớ (2001). Các tác gi th y đáng k cao h n E. coli phong phú v i giao th c c a h ứ ủ ọ

ở ố ượ ệ ấ ượ ộ ươ ơ h n b i s l ng t m. CÁ hi n đang đ c coi là m t ph ng pháp phát hi n t ệ ế

ặ ươ ể ự ố ễ ư ủ ặ ệ bào đ c hi u cao, và là t ệ ng đ i d dàng đ th c hi n. Các đ c tr ng c a phát

ụ ư ủ ệ ặ ặ ộ hi n ph thu c vào đ c tr ng c a tàu thăm dò oligonucleotidic và tính ch t ch ẽ

ệ ử ụ ủ ụ ề ẫ ỗ ẻ các đi u ki n s d ng lai. Cation Identifi c a chu i m c tiêu v n còn t ạ nh t,

ể ượ ụ ể ệ tuy nhiên, cá không th đ c áp d ng đ phát hi n các phi phylogenetically xác

ư ẩ ậ ẳ ườ ệ ợ ạ ị đ nh vi sinh v t, ch ng h n nh vi khu n. Trong tr ng h p này, công vi c có

ể ượ ự ệ ị th đ c th c hi n trên nghieäp obacteriaceae, các phylogenetically xác đ nh

ể ượ ầ ỉ ố ề ủ ễ ộ ấ nhóm g n nh t mà có th đ c coi là m t ch s ti m năng c a ô nhi m phân.

ế

ậ

6. K t Lu n

ụ ủ ế M c đích c a bài vi t này là:

ể ề ạ ầ ơ ươ Đ truy n đ t inventory và g n đây h n là ph ng pháp

ủ ế ữ ụ ệ ấ phát hi n nhóm coliforms, ch y u là nh ng áp d ng cho phân tích ch t

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 41

ượ l ng vi sinh

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ế ủ ữ ể ạ ươ Đ đánh giá nh ng h n ch c a ph ng pháp này v đ ề ộ

ứ ụ ủ ạ nh y và ng d ng c a nó

ậ ọ ộ ỹ ươ ổ ế ấ Ngày nay k thu t màng l c là m t ph ệ ng pháp ph bi n nh t cho vi c

ướ ễ ự ệ ả ậ ố ơ ỹ ế đ m coliforms trong n c u ng , k thu t này đ n gi n, d th c hi n và không

ả ờ ỏ ủ ấ ờ ơ ố t n kém, đòi h i ph i có th i gian ít nh t là qua đêm ( 2472 gi h n) sau khi

ẩ ạ ữ ề ẩ ầ ơ ườ đi u tra khu n l c ban đ u, H n n a, khi tiêu chu n media môi tr ạ ng th ch

ặ ị ổ ớ ỹ ứ ế ế ậ ươ ượ ử ụ đ c s d ng v i k thu t này là c ch , coliforms y u ho c b t n th ng phát

ể ườ ệ ệ ổ ư ợ tri n trong môi tr ặ ng đ c bi t nh ( mT7) và vi c b sung các h p ch t c th ấ ụ ể

ư ụ ồ ủ ế ị ổ ế ươ ( nh pyruvate) nâng cao t ỷ ệ l ph c h i c a các t ặ bào y u ho c b t n th ng,

ủ ụ ự ử ệ ờ ộ ộ ệ Ngoài ra, th i gian th c hi n dài, đ dài c a nó ph thu c vào các th nghi m

ử ụ ướ ế ố ạ ậ ế sinh hóa s d ng cho các b ẫ c xác nh n, v n còn y u t h n ch

ố ớ ự ể ủ ữ ứ ọ ươ Nh ng thách th c quan tr ng đ i v i s phát tri n c a ph ng pháp phát

ể ả ủ ệ ệ ặ ớ ươ hi n coliforms m i là đ c i thi n các đ c tính c a ph ng pháp này, mà có th ể

ạ ỏ ể ư ờ ố ế ị ổ ế ươ lo i b làm t n th i gian, đ đ a vào các t ặ bào y u ho c b t n th ng và đ ể

ả ờ gi m th i gian phân tích

ụ ể ạ ộ ủ ề ộ ộ ượ ệ ả M t cu c đi u tra ho t đ ng c a enzyme c th nên đ c c i thi n đ ộ

ử ụ ủ ệ ệ ạ nh y c a vi c phát hi n EColi, s d ng D galactosidase và Dglucuronidase,

ồ ạ ề ấ ấ ỳ ệ ệ Nhi u ch t chromgenic và ch t hu nh quang t n t ạ i cho vi c phát hi n ho t

ấ ề ơ ở ủ ử ệ ẵ ộ đ ng c a enyme và th nghi m trên c s các ch t n n có s n,

ữ ử ề ệ ấ ươ ẩ R t nhi u so sánh gi a th nghi m này và các ph ng pháp tiêu chu n đã

ớ ỹ ự ể ể ậ ằ ọ ỉ ợ ch ra r ng nó có th là l a ch n phù h p v i k thu t MF, Các bài ki m tra d ễ

ự ệ ầ ỉ ế ị ơ ả ị ộ ể ệ dàng th c hi n, ch yêu c u thi ạ t b , phòng thí nghi m c b n, hi n th đ nh y

ộ ặ ệ ươ ề ậ ắ ơ và đ đ c hi u cao, Tuy nhiên ph ơ ng pháp này đ c h n, th m chí nhi u h n

ư ậ ờ ủ ả ể ế ả ấ ả ế nh v y n u th i gian gi m (kho ng 18h ) và m t quá lâu đ có k t qu trong

ngày

ệ ằ ươ ế ể ậ Phát hi n coliforms b ng ph ng pháp ti p c n tìm hi u enzyme ở ứ m c

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 42

ế ợ ể ượ ầ ớ ỳ ề ấ ộ ế đ t bào k t h p v i các đ u dò hu nh quang cũng có th đ c đ xu t, các

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ươ ph ầ ệ ấ ụ ể ng pháp này cho phép phát hi n r t c th và nhanh chóng mà không c n

ộ ướ ự ấ ờ ươ ệ ượ m t b c nuôi c y nào, th i gian th c ph ng pháp phát hi n đ ể c phát tri n

ươ ế ậ ở b i Van Poucke và Nelis ( 2000a,b),Ph ớ ng pháp ti p c n m i này cho phép tăng

ử ệ ạ ớ ơ ộ đ nh y trong khi nhanh h n so v i th nghi m khác

ươ ị ươ ổ ế ễ ấ Ph ễ ng pháp mi n d ch, ph ng pháp này đã r t ph bi n, d dàng áp

ả ứ ố ạ ư ủ ế ế ẫ ộ ụ d ng nh ng v n còn m t s h n ch lien quan đ n ph n ng chéo c a các t ế

ủ ụ ể ươ ấ ộ bào không m c tiêu c a kháng th , Ph ng pháp PCR cung c p m t phát hi n ệ ở

ộ ặ ứ ệ ơ ươ ế ớ m c đ đ c hi u cao h n, Neverless, ph ạ ng pháp này có h n ch l n khi áp

ẫ ự ồ ế ạ ấ ụ d ng cho các m u t nhiên, bao g m t ỷ ệ l khu ch đ i th p, liên quan đ n s ế ự

ệ ủ ạ ộ ấ ứ ủ ế ệ ế ề ế hi n di n c a các ch t c ch và thi u thông tin v ho t đ ng sinh lý c a t bào.

ươ ủ ư ề ầ ộ Ph ng pháp PCR yêu c u đ i ng nhân viên có tay ngh cao cũng nh không

ử ụ ể ể ụ ệ ể ố ẩ ủ gian phòng thí nghi m chuyên d ng và thu c th c th đ tránh nhi m b n c a

ẫ ặ ệ ầ các m u AND bên ngoài, đ c bi t là khi nestedPCR yêu c u.

ươ ầ ượ ư ươ Ph ng pháp FISH cũng c n đ c xem xét nh là 1 ph ế ng pháp đ m

ế ệ ướ ố ư ươ ề thay th cho vi c đi u tra coliforms trong n c u ng, nh ph ng pháp này cũng

ỉ ệ ị ượ ệ ử ụ ế ị ch hi n đ nh l ệ ng trong vòng 1 ngày. Hi n nay vi c s d ng các thi t b thăm

ổ ế ệ ế ấ ề ớ dò oligomicnucleonde cho vi c đ m coliform là không ph bi n. Các v n đ l n

ể ế ụ ệ ế ỉ ố ẫ ướ ớ v i vi c áp d ng FISH đ đ m các t bào có ch s phân trong m u n c uông

ẩ ướ ủ ế ạ ử ấ lien quan đ n tình tr ng sinh lí c a vi khu n n c uông (do ch t kh trùng). Trên

ự ế ế ẩ ườ ượ ư ặ ở ượ th c t ữ nh ng t bào vi khu n th ng đ c đ c tr ng b i hàm l ng sibosome

ứ ạ ủ ệ ỏ ệ ử ụ nh , làm ph c t p vi c phân tích c a positne fluoucseent signals. Vi c s d ng

ặ ử ụ ệ ấ ế ạ ầ ỳ các đ u dò PNA thay DNA ho c s d ng các h th y khu ch đ i hu nh quang

ườ ộ ườ ủ ộ ỳ nên c ạ ng đ nh y cao và c ng đ hu nh quang c a positive signdes.

ẫ ướ ố ụ ệ ệ ả ỏ Vi c áp d ng FISH trong m u n ể c u ng hi n nay đòi h i ph i phát tri n

ơ ữ ể ạ ượ ố ư ế ưỡ cao h n n a đ đ t đ ệ ế c vi c đ m t i u các t ế bào thi u dinh d ế ng y u đi.

ườ ượ ớ ố ượ ẫ ỏ ướ Th ng coliforms đ ấ c tìm th y v i s l ng nh trong m u n ố c u ng

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 43

ề ở ấ ộ ế ủ ế ụ ế ệ do đó vi c đi u tra c p đ t bào c a t ệ ự bào m c tiêu lien quan đ n vi c l a

ự

ẩ

Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ế ề ố ượ ữ ạ ớ ọ ch n. M i đây Joux and Lebara (2000) phân tích nh ng h n ch v s l ng và

ấ ượ ụ ủ ể ỳ ch t l ỳ ng c a công c phân tích hu nh quang khác nhau (kính hi n vi hu nh

quang, flow cytometer, confocal scanning laser microscope and the new solid –

phase laser scanning cytometer),

ự ủ ự ệ ệ ấ ờ ươ ớ S xu t hi n các phát hi n và th i gian th c c a các ph ng pháp m i có

ế ự ầ ế ẩ ố ơ lien quang đ n s c n thi t cho các chu n đoán đánh giá t ề t h n v ch t l ấ ượ ng

ủ ướ ể ạ ượ ụ ự vi sinh c a n c, M c tiêu này có th đ t đ ệ c thong qua s gia tăng trong vi c

ệ ụ ể ờ ả phát hi n c th và gi m th i gian phân tích

ứ ạ ậ ỹ ươ ế ủ ứ ạ Tuy nhiên k thu t ph c t p và chi phí t ng ng cao h n ch c a mình

ươ ệ ệ ẩ ể ở đ tr thành ph ẫ ng pháp chu n hóa cho vi c phát hi n coliforms trong m u

ệ ạ ữ ệ ế ệ ơ ố ớ ướ n ứ c u ng. H n n a , v i ki n th c hi n có trong công vi c hi n t i ngo i tr ạ ừ

ư ứ ẫ ượ ằ ộ ỷ ệ ứ Delabre et al(2001) nghiên c u, v n ch a ch ng minh đ c r ng m t t l đáng

ị ế ỉ ựợ ộ ạ ặ ả ấ ể k các ch th t bào đ ạ ộ c tìm th y trong m t tr ng thái kh thi ho c ho t đ ng

ộ ườ ư ế ố ệ ố nh ng không culturable trong h th ng phân ph i, N u đây là m t tr ợ ng h p,

ướ ứ ủ ế ẽ ả ộ ế các b c nghiên c u ti p theo s là đánh giá kh năng tác đ ng c a các t bào

ạ ộ ỉ ề ư ề ệ ả ặ ố s ng ho c ho t đ ng nh ng không ch v kh năng gây b nh, mà còn v kh ả

năng tái sinh

Ờ Ả Ơ L I C M N

ủ ứ ự ế ậ ầ ộ ộ Đánh giá này là m t ph n c a d án nghiên c u m t cách ti p c n toàn

ể ể ệ ố ố ướ ệ ộ di n đ ki m soát toàn b coliforms trong h th ng phân ph i n ố c u ng đ ượ c

ợ ở ả ế ơ ỗ h tr b i Vivendi WaterUSFilter, Tác gi cám n ti n sĩ Camper và

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Trang 44

ủ ọ ữ ữ ả ả Dr.V.Gautheir cho nh ng rà soát h u ích c a h trong b n th o.

Bài tiểu luận: Phát hiện và đếm coliforms trong nước uống, các phương pháp hiện thời và phương pháp tiếp cận nổi bậc

ƯƠ

BÔ CÔNG TH

NG

ƯỜ

Ạ Ọ

Ự

Ẩ

Ệ

TR

NG Đ I H C CÔNG NGHI P TH C PH M

Ố Ồ

THÀNH PH H CHÍ MINH

Ự

Ẩ

Ệ

KHOA CÔNG NGH TH C PH M



ự

ẩ

Môn : Phân Tích Vi Sinh Th c Ph m

ề Đ Tài

:

Detection And Enumeration Of Coliforms In Drinking Water: Current Methods And Emerging Approaches

ệ

ướ

ố ế

ươ

ươ

(Phát Hi n Và Đ m Coliforms Trong N c U ng: Các ậ ng Pháp Ti p C n Ph

ế ệ ờ ng Pháp Hi n Th i Và Ph ổ ậ N i B c)

ị

GVGD: Phan Th Kim Liên

Ụ

Ụ

M C L C

TÓM T T Ắ

ớ

ệ

ụ 2. M c Tiêu

ươ

ổ ể

ươ

ươ

ử ng Pháp Phân T

5.2.1. Phương pháp phản ứng chuỗi polymerase

5.2.2. Kỹ thuật lai in situ (In situ hybridization techniques)

ế

ậ

Ờ Ả Ơ L I C M N

Có thể bạn quan tâm

Bài tiểu luận: Giới thiệu Trường Đại học Công Thương TP.HCM

Bài tiểu luận: Tìm hiểu và thiết kế một nội dung giáo dục ở trường phổ thông theo mô hình lớp học đảo ngược

Bài tiểu luận: Thực trạng và giải pháp thực hiện chiến lược trách nhiệm xã hội và phát triển bền vững tại Công ty TNHH Becamex Tokyu

Bài tiểu luận: Lãnh đạo trong kỷ nguyên số

Bài tiểu luận: Hệ thống sản xuất aspirin từ thiết bị vỏ áo hoạt động liên tục cho ra 10kg sản phẩm mỗi giờ

Bài tiểu luận: Thẩm quyền ban hành văn bản quy phạm pháp luật của cơ quan hành chính nhà nước. Liên hệ thực tiễn tại một Ủy ban nhân dân cấp tỉnh

Bài tiểu luận: Chăm sóc dược cho bệnh nhân đái tháo đường và bệnh nhân viêm phổi cộng đồng

Bài tiểu luận: Chăm sóc dược cho bệnh nhân đái tháo đường và bệnh nhân viêm phổi cộng đồng

Bài tiểu luận: Mô hình cơ cấu tổ chức của công ty cổ phần ở Việt Nam

Bài tiểu luận: Thống kê ứng dụng

Bài tiểu luận: Đánh giá tổ chức, quản lý công tác văn thư, lưu trữ tại Tập đoàn Bưu chính Viễn thông Việt Nam

Bài tiểu luận: Làm rõ bước đi, biện pháp xây dựng chủ nghĩa xã hội ở Việt Nam theo quan điểm Hồ Chí Minh, vận dụng vào công cuộc đổi mới kinh tế ở nước ta hiện nay

Bài tiểu luận: Đánh giá tình hình tranh chấp đất đai năm 2024 của huyện M’Đrắk, tỉnh Đắk Lắk

Bài tiểu luận: Phân tích và làm rõ mối quan hệ “Giữa xây dựng và bảo vệ Tổ quốc Việt Nam xã hội chủ nghĩa.” Vận dụng vào công tác thực tiễn

Bài tiểu luận: Định nghĩa và vai trò chuỗi cung ứng; lựa chọn nhà cung ứng

Bài tiểu luận: Công tác tự đánh giá tại trường Mầm non Sunflower - Thành phố Thái Bình - Thái Bình năm học 2022-2023

Bài tiểu luận: Nâng cao hiệu quả công tác giáo dục đạo đức học sinh tại trường THPT Phú Quốc, Thành phố Phú Quốc, Tỉnh Kiên Giang, Năm học 2021- 2022

Bài tiểu luận: Xử lý vướng mắc về việc thu hồi đất bồi thường, GPMB đối với hộ ông Lê Hữu Phước tại dự án xây dựng nâng cấp tuyến đường Bái Đính – Ba Sao đoạn qua địa phận huyện Gia Viễn, tỉnh Ninh Bình năm 2020

Bài tiểu luận: Mô phỏng hệ thống cảnh báo trước va chạm trên xe Toyota Corolla bằng phần mềm Matla

Bài tiểu luận: Cơ sở Hóa sinh

Tài liêu mới

Đề cương đồ án tốt nghiệp: Thành lập bản đồ địa chính khu vực xã Mỹ Lạc, huyện Thủ Thừa, tỉnh Long An bằng công nghệ GNSS-RTK

Báo cáo bài tập lớn Vật lý 1: Xác định quĩ đạo của chất điểm khi có phương trình vận tốc

Bài tiểu luận: Hệ thống sản xuất aspirin từ thiết bị vỏ áo hoạt động liên tục cho ra 10kg sản phẩm mỗi giờ

Báo cáo bài tập lớn Vật lý A1: Vẽ quỹ đạo chuyển động ném xiên trong trọng trường bỏ qua lực cản và xác định một vài thông số liên quan

Báo cáo bài tập lớn Vật lý 1: Vẽ quĩ đạo của vật khi có phương trình chuyển động

Báo cáo bài tập lớn: Vẽ quỹ đạo chuyển động ném xiên trong trọng trường bỏ qua lực cản và xác định một vài thông số liên quan

Bài tập lớn: Tính toán thiết bị trao đổi nhiệt gián tiếp loại ống chùm thẳng đứng

Báo cáo bài tập lớn Vật lý A1: Vẽ quỹ đạo chuyển động ném xiên trong trọng trường bỏ qua lực cản và xác định một vài thông số liên quan