Phytase, enzyme phân giải phytate và tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học
A. Giới thiệu về phytate
Phytate là một dạng phospho hữu cơ chiếm từ 1 đến 5% (w/w) của đậu hạt, ngũ
cốc, hột chứa dầu, phấn hoa và hạnh nhân (Cheryan, 1980); hầu hết thực phẩm có
nguồn gốc thực vật chứa từ 50% đến 80% phospho tổng là phytate (Harland và
Morris, 1995) và dĩ nhiên phytate chứa khoáng liên kết với acid amin và protein.
Theo Posternak (1902) là người đầu tiên phát hiện ra phytin. Ông dùng phytin để
chỉ một chất phospho trong các loại hạt mà ông khám phá ra và xem nó như sản
phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp diệp lục tố nhưng Pfeffer tìm ra acid
phytic từ năm 1872.
Trong tự nhiên, acid phytic tồn tại chủ yếu trong các dạng muối phytate dưới dạng
phức hợp với các cation quan trọng cho dinh dưỡng như Ca2+, Zn2+ và Fe2+ và
phytate chứa 14-25% phospho, 1,2-2% Canxi, 1-2% kẽm và sắt. Lượng phytate
cao nhất trong các loại ngũ cốc, bắp (0,83-2,22%) và trong các loại hạt đậu (5,92-
9,15%) (Reddy, et al., 1989).
Phytate làm giảm khả năng tiêu hóa protein, tinh bột và lipit vì phytate tạo phức
với protein làm protein kém tan và kháng lại được sự phân giải protein. Acid
phytic có thể ảnh hưởng đến sự tiêu hóa tinh bột thông qua sự tương tác với
enzyme amylase (Kerovuo, et al., 2000). Ở pH thấp [acid], acid phytic có điện tích
âm mạnh vì các nhóm phosphate phân ly không hoàn toàn. Dưới điều kiện này,
acid phytic có ảnh hưởng xấu đến khả năng hòa tan protein vì liên kết ion của các
nhóm phosphate của acid phytic và các gốc acid amin bị ion hóa (lysyl, histidyl,
arginyl). Trong pH acid, acid phytic có thể gắn chặt với các protein thực vật, vì
điểm đẳng điện của protein này nằm trong pH 4,0-5,0. Ở pH 6,0-8,0, acid phytic và
protein thực vật đều có điện tích âm, phức hợp acid phytic và protein vẫn được
hình thành. Việc gắn kết này làm giảm giá trị dinh dưỡng của protein thực vật
(Vohra, et al., 2003).
B. Thành phần Phytase trong tự nhiên
* Phytase từ thực vật
Phytase có nhiều trong các loại ngũ cốc như lúa mì, bắp, lúa mạch, gạo, và từ các
loại đậu như đậu nành, đậu trắng,… Phytase cũng được tìm thấy trong mù tạt,
khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina, và phấn hoa huệ tây (Dvorakova, 1998). Trong
hạt đang nảy mầm hoặc trong hạt phấn, phytase có vai trò phân giải phytin
(Greene, et al., 1975). Suzuki et al., (1907) là những người đầu tiên sản xuất chế
phẩm phytase từ cám gạo và lúa mì.
* Phytase từ động vật
Collum và Hart (1908) đã phát hiện thấy phytase từ thận và máu dê, phytase cũng
phát hiện trong máu các động vật có xương sống bậc thấp hơn như chim, bò sát, cá,
rùa biển (Rapoport et al, 1914). Vì phytate hoạt động như một nguyên tố kháng
dưỡng trong cơ thể động vật nên các nhà khoa học đã quan tâm và khảo sát hoạt
động của phytase trong đường tiêu hóa của nhiều loài động vật. Phytase được tìm
thấy trong đường ruột (Patwaradha, 1937) của heo, cừu, bò (Spitzer và Phillip,
1972). Tuy nhiên, phytase trong hệ động vật không đóng vai trò quan trọng trong
việc tiêu hóa phytate (Williams và Taylor, 1985).
Phytase ruột người cũng có hoạt tính thấp 30 lần so với phytase từ ruột chuột và
cũng không có ý nghĩa trong việc tiêu hóa phytate, phytate được tiêu hóa trong hệ
tiêu hóa người nhờ lượng phytase trong thực phẩm (Frolich, 1990). Động vật nhai
lại tiêu hóa được phytate nhờ hoạt động của phytase được sản xuất bởi hệ vi sinh
vật trong dạ cỏ. Lượng phosphate vô cơ giải phóng ra nhờ hoạt động của phytase
lên phytate được cả hệ vi sinh vật đường ruột và vật chủ sử dụng (Kerovuo et al.,
2000).
* Phytase từ vi sinh vật
Những vi sinh vật sản xuất phytase có từ nhiều nguồn khác nhau như đất
(Cosgrove et al., 1970; Richardson và Hadobas, 1997), động vật dạ cỏ (Lan et
al.,2002), bột đậu (Choi et al., 2001), nước biển (Kim et al., 2003), hạt thực vật
(Nakano et al., 2000; Greiner, 2004; Greiner và Egki, 2003), điều này cho thấy khả
năng thủy phân của phytase có thể được đóng góp một cách rộng rãi trong hệ sinh
thái. Được biết là những vi sinh vật sản xuất phytase bao gồm cả những vi khuẩn
hiếu khí như Pseudomonas spp (Richardson và Hadobas, 1997; Kim et al., 2002),
Bacillus subtilis (Shimizu, 1992) và Klebsiella spp (Greiner et al., 19993), vi
khuẩn kị khí như Escherichia coli (Greiner et al., 1993) và Mitsuokella spp (Lan et
al., 2002), nấm như Aspergillus spp (Ullah, 1998; Shimizu, 1992) và Penicillum
spp (Tseng et al., 2002). Những vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas, Arthrobacter,
Staphylococcus và Bacillus thì được xác nhận là có phytase có hoạt tính.
+ Vi khuẩn sản xuất phytase
Phytase có mặt rộng rãi trong thực vật, mô động vật và vi sinh vật kể cả con người.
Tuy nhiên, những nghiên cứu đã chỉ ra rằng phytase ở vi sinh vật có ứng dụng
nhiều nhất trong kỹ thuật sinh học. Mặc dù việc sản xuất phytase thương mại đều
chủ yếu tập trung ở nấm Aspergillus, những nghiên cứu đã đề nghị rằng phytase
của vi khuẩn có thể thay thế enzyme phytase từ nấm bởi vì mật độ tập trung cao và
nét riêng biệt của chúng, độ bền với sự thủy phân protein cao và hiệu quả xúc tác
tốt nhất. Những vi khuẩn sản xuất phytase có thể phân lập từ vùng cạn hoặc từ môi
trường nước và phytase thì có mặt rộng rãi trong nhiều loại vi khuẩn khác nhau,
như Bacillus, Enterbacteria, vi khuẩn kị khí ở dạ cỏ động vật nhai lại và ở
Pseudomonas (Jorquera et al., 2008).
Đối với vi khuẩn, phytase được tổng hợp ở cả vi khuẩn gram dương (B. subtilis)
và gram âm (Aerobacter aerogegnes, E. coli, các chủng Pseudomonas, Klebsiella).
Phytase từ các vi khuẩn gram âm là các protein nội bào trong khi phytase từ các vi
khuẩn gram dương là các protein ngoại bào (Choi et al., 2001).
Theo kết quả nghiên cứu của Kerovuo et al., (2000), 21 dòng từ giống Bacillus
được kiểm tra cho khả năng sản xuất enzyme phytase trên môi trường Luria broth
(LB) và trong môi trường có bột bắp, không có dòng nào sản xuất phytase trong
môi trường LB. Tuy nhiên, trong môi trường bột bắp thì có 2 dòng B.
amyloliquefaciens và 1 dòng B. subtilis sản xuất số lượng lớn phytase. Có 3 dòng
thì có khả năng phóng thích lân vô cơ trong môi trường là B. subtilis VTT E-
68013, B. amyloliquefaciens VTT E- 71015, B. amyloliquefaciens VTT E-90408
trong đó dòng B. subtilis VTT E 68013 thì có hoạt tính phytase cao nhất. (Jane et
al., 2007).
+ Phytase từ vi nấm
Đối với nấm mốc, hầu hết các chủng nấm mốc đều thuộc các giống Aspergillus,
Penicillium, Mucor và Rhizoous ( Liu et al, 1998) và đều sản xuất phytase nội bào
có hoạt tính. A. niger được xem là loại nấm mốc sản xuất phytase nấm có hoạt tính
cao nhất. A. ficuum NRRL 3135 cũng sản xuất phytase trong môi trường lên men
rắn với cơ chất là bột canola (Vohra et al., 2003). Một số nhóm Aspergillus niger
thì sản xuất phytase ngoại bào mà chúng có thể cắt phospho từ Calcium phytate
trong môi trường acid. Được phân lập từ đất nhưng A. ficuum NRRL 3135 sản
xuất hầu hết phytase có hoạt tính trong môi trường tinh bột ngô. Việc sản xuất