Sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định từ nuôi cấy in vitro của cây Đương quy Nhật Bản

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165­173<br /> <br /> <br /> <br /> SỰ HÌNH THÀNH VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA RỄ BẤT ĐỊNH <br /> TỪ NUÔI CẤY IN VITRO CỦA CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN <br /> (ANGELICA ACUTILOBA KITAGAWA)<br /> <br /> Nguyễn Thị Quỳnh*, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Lê Anh Thư<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *qtnguyen_vn@yahoo.com<br /> <br /> TÓM TẮT:  Cây Đương quy nhật bản (ĐQNB) là cây thuốc quí, đầu vị  trong nhiều bài thuốc cổ <br /> truyền, với dược tính chủ  yếu đến từ  bộ  rễ. Trong nghiên cứu này, sự  hình thành và tăng trưởng rễ <br /> của cây ĐQNB in vitro đã được thực hiện trong điều kiện tối với nhiệt độ phòng nuôi  24 ± 2oC, độ ẩm <br /> tương đối 65  ±  5%. Phiến lá  ở  ba vị  trí khác nhau  của chồi  in vitro  được nuôi cấy trên môi trường <br /> khoáng  MS  kết hợp với vitamin Morel hay khoáng và vitamin Gamborg’s B5 . Tỷ  lệ  mẫu tạo rễ  đạt <br /> 100% cũng như  khối lượng tươi của rễ  (132,7 mg/mẫu) lớn nhất khi phiến lá ở  vị  trí thứ  hai tính từ <br /> chồi ngọn được nuôi cấy trên môi trường Gamborg’s B5. Khi phiến lá được nuôi cấy trên môi trường  <br /> Gamborg’s B5 có bổ sung các cytokinin bao gồm BA, Kin hoặc TDZ ở các nồng độ 0,1; 0,5 hay 1 mg/l, <br /> tỷ lệ  mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi của rễ cũng như  tỷ  lệ  khối lượng tươi rễ/khối lượng  <br /> tươi mẫu lớn nhất ở nồng độ 0,1 mg/l BA. Trong môi trường lỏng gồm khoáng MS, vitamin Morel, và <br /> bổ sung IBA ở các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l, rễ bất định của cây ĐQNB  in vitro khi được nuôi trên <br /> máy lắc  ở tốc độ  100 vòng/phút đã gia tăng sinh khối theo sự gia tăng nồng độ  IBA và theo thời gian <br /> nuôi cấy.  Ở  ngày thứ  28, rễ  bất định của cây ĐQNB trong môi trường bổ  sung 1 mg/l IBA có khối <br /> lượng tươi (2423,7 mg/bình) lớn nhất và tăng gần 5 lần so với khối lượng rễ ở ngày nuôi cấy ban đầu  <br /> (500 mg/bình).<br /> Từ khóa: Angelica acutiloba, auxin, cytokinin, rễ bất định.<br /> <br /> MỞ ĐẦU ẩm mát, vì vậy việc gieo hạt và sinh trưởng <br /> của cây cần trùng với thời gian có nhiệt độ <br /> Cây   Đương   quy   nhật   bản   (Angelica <br /> thấp   trong   năm.   Thời   gian   gieo   hạt   ở   Việt  <br /> acutiloba  (Sieb.   &   Zucc.)   Kitagawa)   là   cây <br /> Nam tốt nhất là đầu tháng 10. Việc gieo hạt <br /> thuốc quí, đầu vị  và không thể  thiếu trong y <br /> vào thời điểm muộn hơn (tháng 11 đến tháng <br /> học cổ  truyền đối với việc điều trị  bệnh phụ <br /> 2) sẽ  dẫn đến tỷ  lệ  nẩy mầm giảm đáng kể <br /> nữ và bồi bổ khí huyết, đồng thời còn là thuốc <br /> do   nhiệt   độ   giảm   mạnh   ở   thời   điểm   này. <br /> trị  bệnh như  thuốc chữa thiếu máu, đau đầu, <br /> Ngoài   ra,   hạt   Đương   quy   dễ   mất   khả   năng <br /> kháng viêm, tăng cường miễn dịch. Dược tính <br /> nảy   mầm   khiến   việc   sử   dụng   hạt   để   nhân <br /> của cây Đương quy đến từ bộ phận rễ nơi có <br /> giống   gặp   nhiều   khó   khăn.   Nhu   cầu   rễ   cây <br /> chứa rất nhiều hợp chất thứ cấp, bao gồm 47  <br /> ĐQNB rất lớn trên thế  giới, khoảng 450 tấn  <br /> hợp   chất   khác   nhau,   trong   đó   ligustilide <br /> năm 2005 trong khi cung chỉ  đạt được xấp xỉ <br /> (22,8%) và butylidenephthalide (19,5%) là hai <br /> 197   tấn,   vì   vậy   cần   tìm   phương   pháp   nhân <br /> hợp chất chính. Cây Đương quy nhật bản từ <br /> nhanh hữu hiệu cây Đương quy mà vẫn đảm <br /> lúc trồng đến lúc thu hoạch rễ phải mất từ 2­3 <br /> bảo sự đồng nhất về mặt di truyền. <br /> năm, dẫn đến chi phí công lao động và chăm  <br /> sóc trên đồng ruộng gia tăng khiến giá thành  Phương pháp nuôi cấy mô tế  bào thực vật <br /> sản phẩm tăng theo rất cao [3].  từ khi ra đời đã đem đến khả năng làm tăng hệ <br /> số nhân giống của thực vật chỉ trong một thời <br /> Cây   Đương   quy   nhật   bản   (ĐQNB)   đã <br /> gian   ngắn,   đồng   thời   việc   nuôi   cấy   các   cơ <br /> được du nhập vào trồng ở Việt Nam với diện  <br /> quan hay mô, tế  bào thực vật đã giúp các nhà  <br /> tích mở  rộng từ  Tây Bắc đến khu vực sông <br /> nghiên cứu thu nhận được các hợp chất thứ <br /> Hồng gần Hà Nội [14]. Cây ĐQNB ưa khí hậu <br /> <br /> <br /> 165<br />  Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu<br /> <br /> cấp có giá trị  trong y dược với hiệu suất cao   được rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương.  <br /> khi không thể  sản xuất từ  tế  bào vi sinh vật  Môi   trường   nuôi   cấy   được  bổ   sung  30   g/l <br /> hoặc tổng hợp bằng con đường hoá học. Công  đường sucrose, 8 g/l agar,  6 mg/l  NAA và  1 <br /> trình nghiên cứu về  nuôi cấy mô tế  bào cây  mg/l kinetin (Kin) với pH được điều chỉnh đến <br /> ĐQNB tại Việt Nam chưa nhiều. Hoàng Ngọc  5,8 và hấp vô trùng  ở  121oC, 1 atm trong thời <br /> Nhung và nnk. (2012) [13] đã chứng minh sự  gian 20 phút. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn <br /> tạo   chồi   trực   tiếp   của   cây   ĐQNB   bằng   ngẫu nhiên theo kiểu 2 yếu tố: (A) thành phần <br /> phương   pháp   nuôi   cấy   lớp   mỏng   cắt   ngang  môi   trường,   có   2   mức   độ:   khoáng   MS   và <br /> của   chồi   đỉnh   cây  in   vitro  trên   môi   trường  vitamin   Morel   hoặc   khoáng   và   vitamin <br /> khoáng   MS,   vitamin   Gamborg’s   B5,   bổ   sung  Gamborg’s B5 [4]; và (B) là vị trí phiến lá mọc  <br /> 0,1   mg/l   α­naphthaleneacetic   acid   (NAA),   1   ở chồi in vitro, có 3 mức độ: lá mở 2, 3 hoặc 4  <br /> mg/1 thidiazuron (TDZ), 30 g/l đường sucrose,  tính   từ   chồi   ngọn   xuống.   Thí   nghiệm   có   6 <br /> 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine. nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 5 bình (V = <br />       Trong bài này, ảnh hưởng của thành phần  130 ml), mỗi bình chứa 18 ml môi trường với <br /> khoáng và vitamin khác nhau trong môi  1 mẫu phiến lá được đặt hoàn toàn trong tối. <br /> trường nuôi cấy, cũng như  vai trò của   Phòng nuôi cây có nhiệt độ  24  ±  2oC, độ   ẩm <br /> cytokinin   lên   sự   tạo   rễ   bất   định   từ  tương đối 65 ± 5%. Các thí nghiệm đều được <br /> mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB  in  lặp lại 3 lần, thời gian thí nghiệm 42 ngày.  Tỷ <br /> vitro  đã   được   khảo   sát,   đồng   thời  lệ  (%)  mẫu   tạo   rễ,   số   rễ/mẫu,   khối   lượng  <br /> nghiên   cứu   bước   đầu   về   sự   tăng  tươi (KLT)  và  khô (KLK)  của  rễ,  được  xác <br /> trưởng của rễ  bất định khi được tách  định ở ngày thứ 42. <br /> rời   khỏi   mẫu  và   nuôi   cấy  trong  môi   Vai trò của cytokinin lên sự  tạo rễ  bất định  <br /> trường lỏng được trình bày. trên mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitro<br /> Mẫu   cấy   là   phiến   lá   thứ   2   của   chồi  in <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường <br /> Vật liệu MS. Mỗi phiến lá được cắt thành 3 phần, mỗi  <br /> Chồi  in vitro  cây ĐQNB có nguồn gốc từ  phần rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương.  <br /> cây nảy mầm từ hạt (do Đại học Chiba, Nhật  Thí nghiệm kế  thừa kết quả  của thí nghiệm <br /> Bản   cung   cấp)   khi   được   nuôi   cấy   trên   môi  trước,   môi   trường   nuôi   cấy   với   thành   phần <br /> trường khoáng MS [12]  kết hợp với vitamin  khoáng và vitamin Gamborg’s B5 có bổ  sung <br /> Morel  [11]  có  bổ  sung  30  g/l   đường  sucrose  30   g/l   đường   sucrose,   8   g/l   agar   và   6   mg/l <br /> (công ty Đường Biên Hòa), 8 g/l agar (công ty   NAA. Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức với 3  <br /> Cổ   phần   Đồ   hộp   Hạ   Long).   pH   của   môi  loại   cytokinin,   bao   gồm   N6­benzyladenine <br /> trường trước khi khử trùng là 5,8. Môi trường   (BA), Kin hoặc TDZ, được bổ  sung vào môi  <br /> được khử trùng  ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong  trường trước khi khử  trùng  ở  3 mức nồng độ <br /> 20 phút.  0,1; 0,5 hay 1 mg/l. Mỗi nghiệm thức có 3 bình <br /> (V = 130 ml), mỗi bình chứa 18 ml môi trường <br /> Phương pháp<br /> với 1 mẫu phiến lá. Thí nghiệm được lặp lại  <br /> Sự phát sinh rễ ở các vị trí phiến lá khác nhau   3   lần.   Điều   kiện   nuôi   cấy   giống   như   thí <br /> của   cây   ĐQNB   in   vitro   dưới   ảnh   nghiệm trên. Các chỉ  tiêu theo dõi bao gồm tỷ <br /> hưởng   của   thành   phần   khoáng   và   lệ  (%) mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, KLT rễ, tỷ lệ <br /> vitamin   khác   nhau   trong   môi   trường   (%) KLT rễ/KLT mẫu, được xác định  ở  ngày <br /> nuôi cấy thứ 42.<br /> Mẫu cấy là phiến lá của chồi in vitro được  Nghiên cứu sự  tăng trưởng của rễ  bất định  <br /> nuôi cấy trước đó trên môi trường MS. Mỗi  cây ĐQNB khi nuôi cấy trong môi trường lỏng  <br /> phiến   lá   được   cắt   thành   3   phần,   mỗi   phần  có lắc<br /> <br /> <br /> 166<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165­173<br /> <br /> Cùng lúc với nghiên cứu tạo rễ bất định từ  khối lượng tươi của rễ  bất định  ở  các vị  trí <br /> phiến lá, thí nghiệm khảo sát sự  tăng trưởng   mẫu  khác  nhau vào ngày kết thúc thí nghiệm <br /> của rễ bất định tách rời từ chồi cây ĐQNB khi  (bảng 1, hình 1). Tất cả các mẫu phiến lá cấy <br /> nuôi cấy trên môi trường lỏng cũng được tiến  trên môi trường khoáng và vitamin Gamborg’s <br /> hành   nhằm   hướng   đến   việc   sản   xuất   sinh   B5 đều cho KLT cao hơn các mẫu cấy trên <br /> khối   rễ   trong   hệ   thống   bioreactor   sau   này.  môi trường có thành phần<br /> Mẫu cấy là rễ  bất định tách ra từ  cây ĐQNB <br /> in vitro  hình  thành trong  quá  trình phát  triển  <br /> chồi thành cây hoàn chỉnh. Mỗi mẫu có trọng <br /> lượng tươi ban đầu là 500 mg được đặt vào <br /> trong bình tam giác (V = 370 ml) chứa 50 ml  <br /> môi   trường   lỏng   gồm   khoáng   MS,   vitamin <br /> Morel, 30 g/l đường sucrose và được bổ  sung <br /> indole­3­butyric   acid   (IBA)   với   các   nồng   độ <br /> 0,2; 0,5 hay 1 mg/l. pH của môi trường được <br /> điều chỉnh là 5,8 trước khi hấp khử  trùng  ở <br /> 121oC,   1   atm   trong   20   phút.   Các   bình   môi <br /> trường lỏng chứa mẫu cấy được đặt trên máy <br /> lắc   INNOVA   (công   ty   New   Brunswick <br /> Scientific, Hoa Kỳ), model 2100, với vận tốc  <br /> 100 vòng/phút trong điều kiện hoàn toàn tối. <br /> Phòng  nuôi  cấy  có  nhiệt  độ   24±2oC,  độ   ẩm <br /> tương đối 65±5%. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm <br /> thức   tương   ứng   với   3   nồng   độ   IBA,   mỗi <br /> nghiệm thức 3 bình, được lặp lại 3 lần. Thời <br /> gian thí nghiệm là 28 ngày. Khối lượng tươi <br /> của rễ được đo ở các ngày nuôi cấy thứ 7, 14,  <br /> 21, 28 và 35. <br /> Số   liệu   các   thí   nghiệm   được   phân   tích <br /> ANOVA,   một   hoặc   hai   yếu   tố,   bằng   phần  <br /> mềm thống kê MSTATC, phiên bản 2.1, của  <br /> Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ  và vẽ  biểu  <br /> đồ   bằng   phần   mềm   Microsoft   Office   Excel  <br /> 2007.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Sự  phát sinh rễ   ở  các vị  trí phiến lá khác <br /> nhau   của   cây   ĐQNB   in   vitro   dưới  <br /> ảnh hưởng của thành phần khoáng <br /> và   vitamin   khác   nhau   trong   môi <br /> trường nuôi cấy<br /> Sự   cảm   ứng   tạo   rễ   bất   định   và   dinh <br /> dưỡng khoáng có mối quan hệ  mật thiết với  <br /> nhau.   Trong   thí   nghiệm   này,   thành   phần <br /> khoáng   và   vitamin   có   ảnh   hưởng   rõ   rệt   lên <br /> <br /> <br /> 167<br />  Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu<br /> <br /> khoáng   MS   kết   hợp   với   vitamin   Morel.   khoáng đa lượng của môi trường Gamborg’s <br /> Mẫu cấy  ở  công thức B2 cho rễ  có KLT cao   B5, NH4+  hiện diện chỉ  bằng 8% so với môi <br /> nhất   132,7   mg/mẫu,   trong   khi   mẫu   cấy   có  trường MS ((NH4)2SO4/NH4NO3), nên tính đối <br /> KLT của rễ thấp nhất là ở công thức M2 (3,0   kháng giữa sự  đồng hoá đạm và hấp thu các <br /> mg/mẫu).   Hai   loại   môi   trường   MS   và  cation đa lượng không cao, vì thế sự cảm ứng  <br /> Gamborg’s B5 đều tương đồng về  chủng loại   tạo   rễ   bất   định   của   mẫu   cấy   phiến   lá   cây <br /> và hàm lượng các thành phần khoáng vi lượng.  ĐQNB trên môi trường khoáng Gamborg’s B5 <br /> Vì   vậy,   sự   phát   sinh   rễ   bất   định   của   cây  đạt hiệu quả  lớn hơn (bảng 1). Nghiên cứu  <br /> ĐQNB trong nuôi cấy này có thể  do sự  khác  của Nguyễn Thị  Liễu và nnk. (2010) [8] cũng <br /> biệt về  thành phần và hàm lượng của khoáng  cho thấy  thành  phần khoáng  đa  lượng  và   vi  <br /> đa   lượng   hay   vitamin.   Schwambach   et   al.   lượng trong môi trường Gamborg’s B5 là phù <br /> (2005) [17] chứng minh Ca, Zn và N trong môi  hợp   cho   sự   tạo   rễ   bất   định   từ   mô   sẹo   có  <br /> trường nuôi cấy đã có ảnh hưởng đáng kể đến  nguồn   gốc   từ   rễ   của   cây   Sâm   ngọc   linh <br /> số   lượng   rễ   hình   thành   trên   đối   tượng  (Panax   vietnamensis  Ha   et   Gurshv.)   khi   môi <br /> Eucalyptus globulus  Labill. Trong thành phần  trường có bổ sung 7 mg/l NAA.<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của thành phần khoáng, vitamin và vị  trí phiến lá của cây ĐQNB lên tỷ  lệ <br /> mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi (KLT) và khối lượng khô (KLK) của rễ ở ngày thứ 42 <br /> Công thứcz Tỷ lệ mẫu tạo  Số rễ/mẫu KLT rễ  KLK rễ <br /> M2  73,6 4,3 3,0 ex 0,9<br /> M3  44,4 4,5 5,4 de 0,8<br /> M4  55,6 14,3 16,5 d 4,1<br /> B2 100,0 39,5 132,7 a 17,6<br /> B3  90,0 36,4 71,4 c 11,9<br /> B4  88,9 42,5 103,4 b 14,1<br /> ANOVAy<br /> Khoáng ­ Vit (A) ** ** ** **<br /> Vị trí lá (B) * * ** NS<br /> A x B NS NS ** NS<br /> M hoặc B bên trái đại diện cho khoáng MS kết hợp với vitamin Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s <br /> z <br /> <br /> B5, các số bên phải đại diện cho vị trí lá thứ 2, 3 hoặc 4;  y NS, *, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý <br /> nghĩa  ở p ≤ 0,05 hoặc 0,01; xCác trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự  khác biệt <br /> theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Range Test.<br /> <br /> Trong   thành   phần   vitamin,   thyamine  cao gấp 10 lần so với trong vitamin Morel. Vì <br /> đóng vai trò quan trọng trong sự  chuyển hoá  vậy, có thể  thyamine cũng đã  ảnh hưởng đến <br /> carbohydrate   và   trực   tiếp   tham   gia   vào   quá  việc làm gia tăng số lượng rễ bất định của cây <br /> trình sinh tổng hợp một số loại acid amin, cho   ĐQNB.  Chée (1995) [1] cũng đã chứng minh <br /> nên thyamine cần được cung cấp liên tục trong  thyamine cần thiết cho quá trình cảm  ứng tạo  <br /> quá trình nuôi cấy [15]. Thyamine hiện diện  rễ bất định ở loài Taxus sp..<br /> trong   vitamin   Gamborg’s   B5   với   hàm   lượng <br />  <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 168<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165­173<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin trong môi trường nuôi cấy <br /> lên sự hình thành rễ ở các vị trí khác nhau của mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB<br /> M hoặc B bên trái đại diện cho khoáng MS và vitamin Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s B5, các <br /> số bên phải đại diện cho vị trí lá thứ 2, 3 hoặc 4.<br /> <br /> Môi trường nuôi cấy là yếu tố  tác động   và cytokinin nội sinh nhất định.  Auxin sẽ <br /> chính gây cảm  ứng  ở  mô nuôi cấy, tuy nhiên,  cảm  ứng mẫu cấy tạo mô sẹo và hình thành <br /> tuổi sinh lý của mô cấy cũng cần quan tâm do  sơ khởi rễ khi phối hợp với cytokinin theo một <br /> ảnh hưởng của nó liên quan đến sự  phát sinh  tỷ lệ thích hợp. Khi môi trường nuôi cấy có bổ <br /> hình thái  ở  thực vật nuôi cấy như  sự  tạo mô  sung auxin và cytokinin ngoại sinh, tùy vào tỷ <br /> sẹo, tạo chồi hay rễ bất định. Ở ngày thứ  42,   lệ  auxin tổng: cytokinin tổng mà mẫu cấy sẽ <br /> tỷ   lệ   mẫu   cấy   hình   thành   mô   sẹo   ở   vết  có những đáp  ứng khác nhau, nếu tỷ lệ auxin: <br /> thương và tạo rễ  giảm dần  ở các vị  trí phiến  cytokinin lớn thì kích thích sự  ra rễ. Trong thí <br /> lá   càng   xa   chồi   ngọn   dù   cấy   trên   loại   môi  nghiệm   này,   phiến   lá   cây   ĐQNB   được   nuôi <br /> trường nào, cùng với số mẫu phiến lá hóa nâu  cấy trong môi trường có 6 mg l­1 NAA và khi <br /> đen và chết tăng dần.  Ở  mẫu phiến lá thứ  4  bổ   sung   thêm   Kin   hoặc   BA   đều  có   sự   hình <br /> tuy   cho   lượng   rễ   nhiều,   nhưng   tỷ   lệ   mẫu   thành rễ  bất định (bảng 2). Tuy nhiên, tỷ  lệ <br /> không   tạo   rễ   cao.   Mẫu   nuôi   cấy   trên   môi   mẫu tạo rễ   ở  các công thức có sự  hiện diện  <br /> trường khoáng và vitamin Gamborg’s B5 có tỷ  của BA cao hơn so với các nghiệm thức có <br /> lệ  tạo rễ  ở  phiến lá thứ  2 lên đến 100% mặc  Kin, đồng thời tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu  <br /> dù không khác biệt về  phương diện thống kê  giảm dần khi nồng độ  BA tăng từ  0,1 lên 1 <br /> so với các nghiệm thức còn lại (bảng 1). Mẫu  mg/l. Gaspar et al. (1996) [5] cho rằng việc bổ <br /> cấy càng già, khả  năng phản biệt hoá bị  suy  sung cytokinin có thể gây  ức chế một số hoạt <br /> giảm khiến khiến khả  năng tái biệt hoá thành  tính của auxin. Vì vậy, KLT của rễ  cùng với <br /> rễ bất định theo con đường trực tiếp hoặc gián  tỷ lệ KLT rễ/KLT mẫu giảm dần khi nồng độ <br /> tiếp thông qua mô sẹo cũng bị ảnh hưởng.  BA   bổ   sung   vào   môi   trường   tăng   dần.   Tuy  <br /> Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định  nhiên, tùy theo loại cytokinin mà sự  phối hợp <br /> với auxin trong môi trường đem đến sự  khác <br /> trên   mẫu   cấy   phiến   lá   của   cây   ĐQNB   in <br /> biệt  về  tỷ   lệ  mẫu tạo rễ,  số  lượng  rễ  hay  <br /> vitro<br /> khối lượng rễ, tương tự như thí nghiệm ở cây <br /> Mỗi   loại  mẫu  cấy  đều chứa  một  lượng  đậu   (Phaseolus   vulgaris),   kinetin   ức   chế   sự <br /> auxin  hình thành rễ trên trụ hạ diệp [6], trong khi lại  <br /> <br /> <br /> 169<br />  Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu<br /> <br /> kích thích hình thành rễ bất định ở trụ hạ diệp  rễ cùng với tỷ lệ KLT rễ/KLT mẫu tăng cùng <br /> và  cuống  lá  của  Pinus  radiata  [18],  hay  của  với sự tăng nồng độ Kin trong môi trường nuôi <br /> cây hoa hồng [21]. Tương tự trong thí nghiệm   cấy (bảng 2, hình 2).<br /> này, tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ, đồng thời KLT  <br /> <br /> Bảng 2.  Ảnh hưởng của cytokinin lên tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ, khối lượng tưới (KLT) và tỷ  lệ <br /> khối lượng tươi rễ/khối lượng tươi mẫu (KLT rễ/KLT mẫu) của rễ bất định trên  <br /> mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB ở ngày thứ 42<br /> Nghiệm thứcz Tỷ lệ mẫu Số rễ/mẫu KLT rễ KLT rễ/KLT <br /> B0,1 74,1 ax 26,4 a 137,30 ax  34,63 a<br /> B0,5 74,1 a 22,3 a  91,59 a  15,60 b<br /> B1 29,6 bc  1,7 b  3,62 b  1,92 c<br /> K0,1  7,4 c  0,7 b  0,76 b  0,25 c<br /> K0,5 25,9 bc  5,1 b  14,29 b  5,43 bc<br /> K1 44,4 ab 20,8 a  92,71 a  28,32 a<br /> T0,1  0,0 c  0,0 b  0,00 b  0,00 c<br /> T0,5  0,0 c  0,0 b  0,00 b  0,00 c <br /> T1  0,0 c  0,0 b  0,00 b  0,00 c<br /> ANOVAy      <br />  Loại cyt. (A) ** ** * **<br />  Nồng độ cyt. (B) NS NS NS NS<br />  A x B ** ** ** **<br /> z <br /> B, K, hoặc T bên trái đại diện cho BA, Kin hoặc TDZ; các số  bên phải đại diện cho nồng độ  (0,1; 0,5 <br /> hoặc 1 mg l­1); y NS, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,01;  xCác trị số có <br /> chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng  <br /> Duncan’s Multiple Range Test.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 170<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165­173<br /> <br /> Hình 2. Ảnh hưởng của BA, Kin hay TDZ ở các nồng độ khác nhau <br /> lên sự hình thành rễ của mẫu cấy phiến lá cây ĐQNB<br /> Chữ B, K hoặc T bên trái đại diện BA, Kin hoặc TDZ; các số bên phải <br /> đại diện cho nồng độ (0,1; 0,5 hoặc 1 mg l­1).<br /> Sự  hiện diện của TDZ trong môi trường   nhanh   ở   tất   cả   các   nghiệm   thức <br /> nuôi cấy đã không cảm  ứng mẫu cấy tạo rễ  (log/exponential phase ­ pha tăng trưởng). Sự <br /> bất định như BA hay Kin mà chỉ cảm ứng tạo   tăng trưởng của rễ  trở  nên chậm, tương đối <br /> mô sẹo có màu vàng trắng nơi có vết thương.   ổn   định   từ   ngày   nuôi   cấy   21   đến   ngày   28 <br /> Điều này chứng tỏ TDZ kết hợp với auxin nội  (stationary phase ­ pha  ổn định), và có khuynh <br /> sinh trong mô cấy đã cảm  ứng sự tăng sinh tế  hướng đi vào trạng thái suy thoái, không tăng <br /> bào, nhưng hoạt tính tạo sơ  khởi rễ  bất định  trưởng   thêm   từ   ngày   28   vào   ngày   thứ   35 <br /> có thể đã bị TDZ ức chế nên không hình thành  (diminishing   growth   phase   ­   pha   suy   thoái) <br /> sơ  khởi rễ  bất định. Theo Mok et al. (1982)   (hình 3). Từ kết quả này, việc nuôi cấy rễ bất <br /> [10],   cấu   trúc   phân   tử   của   TDZ   có   2   nhóm  định cây ĐQNB  trên môi trường lỏng có bổ <br /> chức năng là nhóm phenyl và nhóm thidiazon.  sung IBA nên dừng  ở ngày thứ  28 để  thu sinh  <br /> Do đó, tùy theo sự  hoạt động của hai nhóm   khối, hoặc môi trường mới cần được bổ sung <br /> này mà kết quả  cảm  ứng của mô nuôi cấy sẽ  cho chu kỳ nuôi cấy rễ tiếp theo.<br /> khác nhau. <br /> Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định  I0.2<br /> 400<br /> cây ĐQNB khi nuôi cấy trong môi trường  I0.5<br /> Khối lượng tươi gia tăng (%)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> lỏng có lắc I1<br /> 300<br /> <br /> Việc bổ  sung các auxin như  IBA vào môi <br /> trường nuôi cấy ở nhiều loài thực vật dẫn đến  200<br /> sự   cảm   ứng   tạo   rễ   bất   định   [9].   Trong   thí <br /> nghiệm này, sự  gia tăng sinh khối rễ theo thời  100<br /> gian nuôi cấy chịu  ảnh hưởng rõ rệt bởi sự <br /> hiện   diện   và   sự   gia   tăng   nồng   độ   của   IBA  0<br /> (hình 3 và 4). Khối lượng tươi của rễ gia tăng  0 7 14 21 28 35<br /> <br /> khi nồng độ  IBA trong môi trường nuôi cấy  Ngày<br /> <br /> tăng.  Ở  các ngày nuôi cấy thứ 14, 21, 28 khối <br /> Hình 3. Sự biến thiên sinh khối rễ cây ĐQNB <br /> lượng tươi của rễ đều gia tăng nhanh, gấp đôi  <br /> theo thời gian nuôi cấy<br /> hay gấp ba khi nồng độ  IBA bổ  sung  ở  mức <br /> 0,5 hay 1 mg/l so với rễ nuôi trong môi trường  Chữ I đại diện cho IBA, các số bên phải của <br /> có bổ sung IBA 0,2 mg/l (hình 3). Ở ngày nuôi   chữ I đại diện các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l.<br /> cấy thứ 28, sự gia tăng sinh khối rễ ở nghiệm <br /> thức bổ  sung IBA 1 mg/l là lớn nhất (1923,7   Sự  không tăng sinh khối tươi rễ   ở  tất cả <br /> mg/bình) với khối lượng tươi trung bình của  các công thức khi kéo dài thời gian nuôi cấy từ <br /> nghiệm   thức   này   là   2423,7   mg/bình.   Sự   gia   ngày 28 đến ngày thứ 35 có lẽ do sự giảm pH <br /> tăng   khối   lượng   tươi   rễ   bất   định   ở   bất   kỳ  của môi trường nuôi cấy thông qua việc hấp <br /> nồng   độ   IBA   nào   của   cây   ĐQNB   theo   thời  thu dinh dưỡng khoáng của các tế  bào rễ. Sau <br /> gian   nuôi   cấy   đã   thể   hiện   động   học   tăng  35 ngày nuôi cấy, pH của môi trường bổ  sung <br /> trưởng   rễ   điển   hình   (hình   3).   Từ   ngày   nuôi  IBA 0,2; 0,5 hay 1 mg/l lần lượt là 4; 3,9 hay <br /> cấy đầu tiên đến ngày nuôi cấy thứ  7, khối  3,8.   pH   của   môi   trường   giảm   càng   mạnh, <br /> lượng rễ gia tăng tương đối chậm (lag phase ­   chứng   tỏ   tế   bào  hấp  thu  lượng   dinh  dưỡng  <br /> pha tiềm tàng). Từ  ngày nuôi cấy thứ  7 đến  khoáng từ  môi trường càng lớn. Rễ  cây luôn <br /> ngày nuôi cấy thứ  21, khối lượng rễ  gia tăng   có sự  hấp thu tích cực và chọn lọc các chất <br /> <br /> <br /> 171<br />  Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu<br /> <br /> dinh dưỡng thông qua quá trình trao đổi chất  Lượng khí CO2 này kết hợp với nước tạo ra <br /> của tế  bào. Để  hấp thu các chất dinh dưỡng  một   lượng   acid   carbonic,   tích   lũy   ngày   càng <br /> dưới dạng cation, rễ  cây phải tiết ra các ion  nhiều   dẫn   đến   việc   làm   giảm   pH   của   môi <br /> H+ để trao đổi với môi trường xung quanh. Ion  trường [20]. Tuy nhiên, Dilorio et al. (1992) [2] <br /> H+ tích lũy dần trong vùng rễ, làm cho pH của  đã chứng minh sự  gia tăng khí CO2 trong bình <br /> môi trường giảm dần. Mặt khác sự  hấp thu  nuôi   cấy  do  sự   hô   hấp   của   rễ   cùng   với   sự <br /> tích   cực   cũng   dẫn   đến   tiêu   hao   nhiều   năng  thiếu hụt O2  đã kích thích rễ  tơ  tăng trưởng  <br /> lượng của tế  bào, vì vậy rễ  hô hấp mạnh và  mạnh hơn.<br /> thải ra nhiều khí CO2 vào môi trường hệ  rễ. <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Rễ cây ĐQNB trên các môi trường nuôi cấy khác nhau<br /> Chữ I đại diện cho IBA, các số bên phải chữ I đại diện các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l.<br /> <br /> Trong thí nghiệm này, rễ  tăng trưởng còn  tất cả  các công thức đều giảm. Rễ bất định ở <br /> nhờ   vào  nguồn  carbon  hữu  cơ  có  mặt  trong   ngày đầu tiên nuôi cấy không có sự hiện diện <br /> môi trường nuôi cấy, chủ  yếu là của đường  của các rễ thứ cấp. Sau 35 ngày nuôi cấy, các <br /> sucrose. Rễ  cây ĐQNB thông qua hô hấp sẽ  rễ  thứ  cấp được hình thành từ  rễ  sơ  cấp ban  <br /> tiêu  thụ   carbon   đồng   hóa  để   có   năng   lượng  đầu  ở  tất cả  các công thức khảo sát (hình 4).  <br /> cần thiết cho sự  duy trì và gia tăng sinh khối,  Tuy nhiên, sự gia tăng nồng độ IBA trong môi  <br /> vì vậy tiến trình này cần thiết phải có sự hiện  trường nuôi cấy đã làm gia tăng số  lượng rễ <br /> diện của oxy. Theo Yu et al. (2000) [22], sự  thứ cấp. Kim et al. (2003) [7] cũng chứng minh <br /> thông   khí   của   hệ   thống   nuôi   cấy   là   yếu   tố  IBA   có   ảnh   hưởng   mạnh   mẽ   đến   sự   hình <br /> quan   trọng   trong   sự   hình   thành   rễ   bất   định.  thành rễ  thứ  cấp sau 7 ngày nuôi cấy rễ  bất  <br /> Soffer   và   Burger   (1988)   [19]   cũng   đã   chứng  định của cây sâm Panax ginseng; San José et al. <br /> minh rằng oxy hòa tan thiết yếu cho sự  hình  (2012) [16] cũng đã chứng minh sự  hiện diện <br /> thành và tăng trưởng của rễ bất định. Do bình  của IBA 0,1 mg/l trong môi trường nuôi cấy đã <br /> nuôi cấy rễ  bất định của cây ĐQNB là bình  làm sự  hình thành rễ  thứ  cấp của cây  Alnus <br /> kín, không có sự  trao  đổi khí với bên ngoài,  glutinosa gia tăng rõ rệt so với đối chứng trên <br /> lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy  môi trường không có IBA.<br /> sẽ   giảm   dần   trong   giai   đoạn   tăng   trưởng <br /> nhanh của rễ từ ngày 14 đến ngày 28. Vì vậy,   KẾT LUẬN<br /> ở ngày thứ 35, hoạt động phân chia của tế bào <br /> rễ có thể đã giảm dẫn đến sinh khối của rễ ở  Kết quả  nghiên  cứu đã cho thấy tính khả <br /> thi của việc tạo rễ bất định từ nuôi cấy phiến <br /> <br /> 172<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165­173<br /> <br /> lá cây ĐQNB  in vitro  trên môi trường thạch  3. J.,   1992.   Carbon   dioxide   improves   the <br /> cũng như việc nuôi cấy rễ bất định trong môi   growth   of   hairy   roots   cultures   on   solid <br /> trường lỏng với sự hỗ trợ của máy lắc để làm  medium   and   in   nutrient   mists.   Appl. <br /> tăng sinh khối rễ. Các nghiên cứu sâu hơn về  Microbiol. Biotechnol., 37: 463­467.<br /> nuôi   cấy   rễ   cần   được   tiến   hành   để   có   thể <br /> hoàn   thiện   quy   trình   nuôi   rễ   bất   định   đồng  4. Fukuda  K.,   Murata   K.,   Matsuda   H., <br /> thời cần triển khai các nghiên cứu về  sự  tích  Taniguchi   M.,   Shibano   M.,   Baba   K., <br /> lũy các hợp chất thứ cấp trong rễ   in vitro của  Shiratori   M.,   Tani   T.,   2009.  Quality   of <br /> cây ĐQNB. Angelica   acutiloba  roots   cutivated   ang <br /> processed   in   Sichuan   provice   of   China,   J. <br /> Lời cảm ơn: Nghiên cứu nhận được sự hỗ trợ <br /> Trad. Med., 26: 169­178.<br /> về nguồn hạt giống cây ĐQNB của GS Toyoki <br /> Kozai, Đại học Chiba, Nhật Bản, kỹ thuật của   5. Gamborg   L.,   Miller   A.,   Ojima   K.,   1968. <br /> Trịnh   Thị   Thanh   Vân   và   Phạm   Minh   Duy,   Nutrient   requirements   of   suspension <br /> phòng Công nghệ  Tế  bào Thực vật và trang  cultures   of   soybean   root   cells.   Exp.   Cell <br /> thiết bị của Phòng Thí nghiệm trọng điểm về  Res., 50: 151­158.<br /> Công nghệ  tế  bào thực vật  phía Nam,  Viện  6. Gaspar T., Kevers C., Greppin H., Reid M., <br /> Sinh học nhiệt đới. Thrope A., 1996. Plant hormones and plant <br /> growth regulators in plant tissue culture. In <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> vitro Cell Dev. Biol. Plant, 32: 272­289.<br /> 1. Chée P., 1995. Stimulation of adventitious  7. Humphries  E.C.,   1960.   Inhibition   of   root <br /> rooting of Taxus species by thiamine. Plant  development on pertioles and hypocotyls of <br /> Cell Rep., 14: 753­757.  dwarf bean (Phaseolus vulgaris) by kinetin. <br /> Physiol. Plant, 13: 659­663.<br /> 2. Dilorio A. A., Cheetham R. D., Weathers P. <br /> 8. Kim J. S., Hahn E. J., Yeung E. C., Paek K. <br /> Y.,   2003.   Lateral   root   development   and <br /> saponin accumulation as affected by IBA or <br /> NAA in adventitious root cultures of Panax <br /> ginseng  C.   A.   Meyer.  In­Vitro   Cel.Dev. <br /> Biol. Plant, 39(2): 245­249. <br /> 9. Nguyễn  Thị   Liễu,   Nguyễn  Trung  Thành, <br /> Nguyễn Văn Kết, 2010.  Nghiên cứu khả <br /> năng tạo rễ  bất định của sâm Ngọc Linh <br /> (Panax   vietnamensis  Ha   et   Grushv.)   trong <br /> nuôi  cấy  in vitro.  Tạp chí  khoa  học  Đại <br /> học quốc gia Hà Nội, Khoa học tự  nhiên <br /> và Công Nghệ, 27: 30­36.<br /> 10. Ludwig­Muller   J.,   2000.   Indole­3­butyric <br /> acid in plant growth and development. Plant <br /> Growth Reg., 32: 219­230.<br /> 11. Mok M. C., Mok D. W. S., Amstrong D. J., <br /> 1982.  Cytokinin   activity   of  N­phenyl­N’­<br /> 1,2,3­thidiazon­5­ylurea   (TDZ). <br /> Phytochem., 21: 1509­1511.<br /> <br /> <br /> <br /> 173<br />  Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu<br /> <br /> 12. Morel G., Wetmore R., 1951. Tissue culture  14. medium   for   rapid   growth   and   bioassays <br /> of   monocotyledons, American   Jour.   Bot.,  with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, <br /> 38(2): 138­140. 15(3): 473­497. <br /> 13. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised  15. Hoàng  Ngọc  Nhung,  Nguyễn Thị  Quỳnh, <br /> Nguyễn   Vũ   Ngọc   Anh,   Nguyễn   Lê  Anh <br /> Thư, Kozai T.,  2012.  Nghiên cứu sự  phát <br /> sinh   cơ   quan   từ   lớp   mỏng   tế   bào   cây <br /> đương quy Nhật Bản ­ Angelica acutiloba <br /> nuôi   cấy  in   vitro.   Tạp   chí  Sinh   học, <br /> 34(3SE): 196­204.<br /> 16. Ninh   T.   P.,   Nojima   H.,   Tashiro   T.,   2009. <br /> Effect   of   pretreatment   of   seeds   by <br /> gibberellin (GA3), kinetin and temperatures <br /> on   germination   and   seedling   growth   of <br /> Angelica acutiloba Kitagawa. J. Sci. Dev., 7 <br /> (Eng.Iss.2): 217­224.<br /> 17. Polikarpochkina  R.  T.,   Gamburg   K.  Z., <br /> Khavin E.E., 1979.  Cell­suspension culture <br /> of   maize  (Zea   mays  L.).  Z.P. <br /> flanzenphysiol., 95: 57­67.<br /> 18. San José M. C., Romero L., Janeiro L.V., <br /> 2012. Effect of indole­3­butyric acid on root <br /> formation in  Alnus glutinosa  microcuttings. <br /> Silva Fennica, 46(5): 643­654.<br /> 19. Schwambach  J.,   Fadanelli   C.,   Fett­Neto <br /> A.G.,   2005.   Mineral   nutrition   and <br /> adventitious   rooting   in   microcutting   of <br /> Eucalyptus globules. Tree Physiol., 25: 487­<br /> 494.<br /> 20. Smith   D.   R.,   Thorpe   T.   A.,   1975.   Root <br /> initiation   in   cuttings   of  Pinus   radiata <br /> seedlings. II. Growth regulator interactions. <br /> J. Exp. Bot., 26: 193­202.<br /> 21. Soffer H., Burgur D. W., 1988. Effects of <br /> dissolved   oxygen   concentrations   in   aero <br /> hydroponics on the formation and growth of <br /> adventitious   roots,   J.  Am.   Soc.  Hort.   Sci., <br /> 113: 218­221.<br /> 22. Thorpe   T.,   Stasolla   C.,   Yeung   E.   C.,   de <br /> Klerk G. J., Roberts A., George E. F., 2008. <br /> The   components   of   plant   tissue   culture <br /> media II: Organic additions, osmotic and pH <br /> effects,   and   support   systems.   In:  Plant <br /> <br /> <br /> 174<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165­173<br /> <br /> Propagation by Tissue Culture 3rd Edition,  rose   single   ­   node   softwood   cuttings,   Sci. <br /> Vol. 1: The Background, George E.F., Hall  Hortic., 34: 115­121.<br /> M.A.,   de   Klerk   G.J.   (eds.),   Springer, <br /> 24. Yu T. A., Yeh S. D., Cheng Y. H., Yang  <br /> Dordrecht, The Netherlands, 115­174.<br /> J.   S.,   2000.   Efficient   rooting   for <br /> 23. Vries  D.   P.,   Dubois   L.   A.   M.,   1988.   The  establishment   of   papaya  plantlets  by <br /> effect   of   BAP   and   IBA   on   sprouting   and  micropropagation,   Plant   Cell   Tiss.   Org. <br /> adventitous   root   formation   of   ‘Amanda’  Cult., 61(1): 29­35.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> FORMATION AND GROWTH OF ADVENTITIOUS ROOTS FROM IN VITRO <br /> ANGELICA ACUTILOBA KITAGAWA TISSUE CULTURE<br /> <br /> Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu<br /> Institute of Tropical Biology, VAST<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Japanese  touki  is considered  of high and  prior value  in many traditional  remedies  due  to medicinal  <br /> properties in the root system. In this study, root formation and growth of Japanese touki cultured in vitro were <br /> carried out in the dark condition of a culture room having temperature of 24 ± 2oC and RH of 65 ± 5%. Leaf <br /> blades from three different positions of the  in vitro  touki shoot were cultured either on basal mineral MS <br /> medium supplemented with Morel vitamins or Gamborg’s B5 medium. Percent of root formation was 100% <br /> as well as root fresh weight (132.7 mg explant ­1) was the greatest when the second leaf blade was cultured on <br /> the   Gamborg’s   B5   medium.   Percent   of   root   formation,   root   number,   root   fresh   weight   and   root   fresh <br /> weight/explant fresh weight were the greatest when the leaf blade was cultured on the Gamborg’s B5 medium <br /> supplemented with 0.1 mg/l BA. <br /> In the MS liquid medium including Morel vitamin, shaked at 100 ppm, and supplemented with different  <br /> IBA concentrations (0.2, 0.5 or 1 mg/l), adventitious roots of in vitro touki plants grew and increased their <br /> biomass over time with the increase in IBA concentrations. On day 28, touki roots had the greatest fresh <br /> weight (2423.7 mg/vessel) in the medium supplemented with 1 mg/l IBA, almost 5 times higher than that  <br /> (500 mg/vessel) at the first day of culture.<br /> Keywords: Angelica acutiloba, adventitious rout, auxin, cytokinin.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 30­6­2013<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 175<br />