Véc tơ tạo dòng simple

CHÖÔNG 5

Caùc vector & söï  taïo doøng

rDNA không ph i là nhân b n đ ng v t ậ

ả

ả

ộ

ỹ

ổ ợ

ậ ạ ụ

ứ

ấ

ủ

ự

K thu t t o DNA tái t h p là công c tìm hi u c u trúc, ch c ể năng, và s đi u hòa c a các ề gene và s n ph m c a gene. ẩ

ủ

ả

• Các m c đích c a k thu t t o DNA tái t

h p g m:

ậ ạ

ủ

ỹ

ổ ợ

ồ

ụ ậ

ạ

ề

ỉ

– Nh n d ng các gene – Tách các gene – Đi u ch nh các gene – Tái bi u hi n các gene ệ

ể

ở

sinh v t ho c c th ể

ậ

ặ

ơ

ch khác

ủ

• Cho phép các nhà khoa h c:ọ

– Xác đ nh các gene mã hóa và s n ph m c a

ủ

ả

ẩ

ị

chúng (breast cancer, retino-blastoma, và neurofibromatosis)

(cystic fibrosis, rheumatoid arthritis,

– Đi u tr các b nh do gene

ệ

ề

ị

– S n xu t l

vascular disease, và certain cancers) ấ ượ ớ ấ

ng l n hormones, vaccines, và các ọ (Insulin,

ả ợ

ọ

h p ch t sinh h c khác mà Y h c quan tâm growth hormone, follicle-stimulating hormone)

Vector Plasmid

DNA mang DNA ngo i lai vào t

bào

Vector t o ạ dòng là 1 phân t

ử

ạ

ế

ch , sao chép trong t

bào vi khu n ho c n m men đ t o ra nhi u

ủ

ế

ể ạ

ề

ẩ

ặ

ấ

b n sao ho c tao ra s n ph m protein c a DNA ngo i lai. ẩ

ủ

ạ

ả

ặ

ả

Đ c tr ng chính c a các vector t o dòng:

ư

ủ

ặ

ạ

• Có trình t

cho phép s t

sao chép trong vi khu n hay n m men

ự

ự ự

ẩ

ấ

• Có v trí đ chèn DNA ngo i lai. H u h t các vector có trình t

c t

ể

ế

ạ

ầ

ị

ự ắ

i h n (MCS)

duy nh t c a nhi u enzyme c t gi ề

ấ ủ

ắ

ớ ạ

ng là

• M t ph ộ

ươ

ng pháp đ nh n bi ể

ậ

t t ế ế

bào có ch a vector, th ứ

ườ

các marker ch n l c tính kháng kháng sinh.

ọ ọ

Các lo i vector ạ

• Plasmid – DNA d ng vòng t sao chép nhân đôi trong t bào vi ạ ự ế

khu n. Kh năng dòng hóa: 0.1-10 kilobases (kb) ả ẩ

• Phage – d n xu t c a bacteriophage lambda; phân t DNA có ấ ủ ẫ ử th ng ẳ

th đ c thay th b ng DN không làm gián đo n vòng ể ượ ế ằ A ngo i lai mà ạ ạ

đ i c a nó . Kh năng dòng hóa: 8-20 Kb ờ ủ ả

• Cosmids – DNA d ng vòng k t h p các tính năng c a plasmid và ạ ủ ế ợ

phage. Kh năng dòng hóa: 35-50 Kb ả

• Nhi m s c th nhân t o – d a trên mini-plasmid F ạ vi khu n (BAC) ẩ ễ ể ắ ự

75-300 Kb c a ủ vi khu n. ẩ Kh năng dòng hóa: ả

• Nhi m s c th nhân t o n m men (YAC) – m t nhi m s c th nhân ễ ể ạ ấ ắ ễ ể ắ ộ

t o có ch a telomeres, ngu n g c c a sao chép ạ ủ ứ ố ồ (ori), centromere c a ủ

n m men ấ , và marker để l a ch n xác đ nh các t ự ọ ị ế bào n m men ấ . Kh ả

năng dòng hóa: 100-1000 Kb

Plasmid Vectors

Đi n di trên gel agarose plasmid t

nhiên

ệ

ự

ạ

ầ

Plasmid nhân t o đ u tiên pBR322 (High-Copy-Number)

Plasmid t

nhiên (low copy number) pSC101

ự

Plasmid t

nhiên ColE1

ự

The pUC 18 or 19 Cloning Vector (Very high copy number)

Lac Z α

RE Sites in blue occur only once in the plasmid

Promotor Site

Origin of Replication

Antibiotic Resistance Gene

Multiple Cloning Site

MCS – Multi Cloning Site

ị

ắ

ễ

ạ

ắ

 Các v trí c t duy nh t ấ  Chèn/c t đo n DNA ngo i lai d dàng  Subcloning d dàng h n

ạ ễ

ơ

Ch c năng

sao chép không đ

c mã hóa trên

ứ

ượ

plasmid. Nó s d ng ch c năng

các

ụ

ứ

ử

t ừ

DNA polymerase I và III, DNA-RNA polymerase c a ủ

t ế

bào ch . ủ

Có th c ch s t ng h p protein v i thu c kháng ợ

ế ự ổ

ể ứ

ớ

ố

sinh (chloramphenicol, spectinomycin). V y s sao

ự

ậ

chép c a plasmid có x y

ra không khi

ủ

ả

chloramphenicol hi n di n trong t

bào?

ệ

ệ

ế

Replicons ki m soát kh năng

ể

ả

t ươ

ng thích c a plasmid ủ

ươ

• Kh năng t ả

c a pủ

lasmid: kh năng ả i trong ồ ạ

ng thích c a hai plasmid khác nhau cùng t n t ủ cùng m t ộ TB chủ

sao chép

ử ụ

ệ ố

i trong cùng

ể

ồ ạ

• Plasmid s d ng các h th ng giong nhau không th cùng t n t m t t

bào vi khu n

ộ ế

ẩ

• Các plasmid mang cùng replicon thu c ộ nhóm

không t

ng thích

ươ

S không t

ự

ươ

ng thích c a plasmids ủ

cùa cùng 1

ế ố

ẽ b máy sao chép

Khi 2 plasmid cùng chia s các y u t ộ

S có s c nh tranh ự ạ

ẽ

ọ ọ

Không th cùng t n t ồ ạ ể trong môi tr

ng nuôi vi khu n

i khi không có s ch n l c ườ

ự ẩ

ng thích



☞ Cùng replicon  nhóm không t

ươ

không th duy trì trong cùng 1 vi khu n

ể

ẩ

H n 30 nhóm không t

ng thích đ

c bi

ơ

ươ

ượ

t ế

Plasmid

Replicon Copy Number

pBR 322 and its derivatives pMB1

15-20

pUC vectors

pMB1

500-700

pACYC and its derivatives

p15A

10-12

pSC101 and its derivatives

pSC101 ~5

ColE1

ColE1

15-20

S an toàn c a plasmid

ủ

ên có th đ

ể ượ

ể

ự

ộ ố

c chuy n conjugation

ự M t s plasmid t cho TB giao Conjugation đòi h i ba y u t

nhi khác b ng ằ ế ố: trans-acting (mob)

ị

ụ ể b đ t m ch (nicked) b i c th ạ

ị ứ

ở mob

ị

ỏ – M t gen linh đ ng ộ ộ – M t ộ y u tế ố cis-acting (bom) – M t ộ v trí (nic) ộ ố ố ộ

cũ nh pBR322 b thi u mob ư pUC thi u nic / ớ

ư ơ

ế ế

M t s plasmid M t s vector m i h n nh bom và không th ể linh đ ngộ

Asilomar Conference

i ta tin r ng "an toàn" c a các ch ng vi khu n, vi ủ

ủ

ằ

ẩ

Ng ườ rút và vect

có th đ

c th c hi n trong m t vài tu n

ơ

ể ượ

ự

ệ

ầ

ộ

NIH thành l p Ban t

v n

h p (RAC)

ậ

ư ấ v ề DNA tái t

ổ ợ

ấ tiên

ướ EK2)

c khi đã

dòng "an toàn" E.coli ra.

đ

Ph i m t năm 1 (1976) tr ả đ u ầ

(lo i ạ

c ượ

t o ạ

ắ

ộ

Năm đó, RAC phát hành m t b nguyên t c đòi h i ỏ ộ vi c s d ng các vi khu n an toàn

ệ ử ụ

ẩ

NIH Guidelines

 Self Regulation in Science Milestone

 Contents

 Specified handling and construction processes

 Microorganisms containing recombinant DNA were

prohibited outside of the laboratory

 Vectors that sexually move to “unsafe” bacteria

was prohibited

 Subsequent modifications

 1986 expanded to include animals and plants, and

4 biosafety levels

 1994 officially relinquished control of GMO plants in

the environment to EPA and APHIS

ng ti p theo là phát tri n plasmid nh

ế

ể

ỏ

ệ

i

ả ủ ạ

ả

ắ

ớ

Xu h ướ u đi m Ư ể • Tăng hi u qu c a bi n ế n pạ • D dàng h n ơ t o b n đ enzyme c t gi ồ ễ h nạ • S l

ng plasmid

cao h nơ

ố ượ

Gi

ớ ạ

i h n chính c a t o dòng s ử ủ ạ d ng plasmid

i đa c a kích th

c DNA t o dòng là 10

i h n t ớ ạ ố

ướ

ạ

ụ ủ

• Gi kb ầ

ị

ế

ả ạ

bào ch kh n p ủ

ạ t đ t o ra trình t

thích h p

ả ầ

ự

ợ

ớ

• C n chu n b các t ẩ • Không hi u qu khi t o genomic libraries vì các ệ vùng trùng l p c n thi ặ ế ể ạ • Thích s l ng clone nh đ bi n n p ạ ố ượ • T o ra các vùng gene l n nh ng r i r c ờ ạ • N u b gene c a

ủ E. coli ch a 4,639,221 bp, c n

ạ ế

ầ

ộ

i h n liên quan

ớ ạ

ỏ ể ế ư ứ ả ộ ể ạ • N u là vector bi u hi n thì các gi ể đ n bi u hi n protein c a eukaryote

bao nhiêu clone đ t o dòng c b genome? ệ ủ

ế ế

ệ

ể

Bacteriophage lambda (λ)

1971

Alan In Campbell showed that the central third of the genome was not required for lytic People growth. started to replace it with E. coli DNA

http://phage.bocklabs.wisc.edu/Virus.htm

Các vector t o dòng là phage • Vector phage có th ể ch a đo n DNA ngo i lai l

ạ ứ

ạ

ạ

ên đ n 23 ế

KB

• Phage Lambda là ph bi n nh t ấ

ổ ế

t cho con đ

ng lytic.

ủ

• 60% c a b gen c n thi ộ

ầ ị ạ ỏ

ườ ả

ộ

Các đo n ạ ữ ượ gi c

ế c a DNA Lambda b lo i b và m t m nh stuffer đ ủ iạ l

• Đo n stuffer

ạ

c chèn vào vector

ữ cho kích th đ ạ

c ướ vector đúng và có mang , marker ượ

này gi gen marker. Khi DNA ngo i lai ạ . b b t ho t

ị ấ

• Ví d : Charon 4A Lambda

ụ

ả ứ

xanh lam. Khi các đo n DN

ẩ

ạ

ạ

ạ

Khi Charon 4A Lambda là còn nguyên v n, beta-galactosidase ph n ng v i X-gal và các ớ ẹ khu n l c có màu A ngo i lai chèn vào khu v c stuffer, gen lac mã hóa cho beta- ự galactosidase b b t ho t ị ấ

ạ , và các khu n l c có màu

tr ng.ắ

ẩ ạ

Lambda genome is approximately 49 kb in length.

Only 30 kb is required for lytic growth.

Thus, one could clone 19 kb of “foreign” DNA.

Packaging efficiency 78%- 100% of the lambda genome.

A complete animation of the lytic cycle: http://www.blackwellpublishing.com/trun/artwork/Animations/Lambda/lambda.html

Bacteriophage lambda

Lysis

Head

Replication

ori

Tail

Circularized lambda

Lysogeny

COS site: Cohesive “sticky” ends

Không ph i Bacteriophage lambda

ả

ạ

t ế

ầ

 Lo i các ph n DNA ko c n thi  Có th chèn đo n DNA l n (~ 20 kb)

ầ ớ

ể

ạ

COS

Lysis

Head

Replication ori

Tail

Lambda t

t :ố

ạ

ướ

ễ

ằ

ả ơ

ệ

ạ

c đo n chèn l n  Kích th ớ  Chuy n phage DNA vào E.coli b ng nhi m v i ớ ể phage hi u qu h n bi n n p plasmid DNA vào ế E.coli

Nhưng:

ả

ớ

 Ph i thao tác v i các vòng tan khu n l c (plaque)

ẩ ạ

Cosmids

 Vector

lai: plasmids mang cos

ori

 DNA ngo i lai (~ 33-48 kb) đ

bacteriophage lambda ạ

ượ

21.5 kb

c dòng hóa, đóng gói vào virus và c cho nhi m vào virus đ

E.coli

ượ

ễ

TetR

ể

cos

ẩ t o các khu n ạ

ẩ

EcoRI

i h n sao cho

c gi

ớ ạ

ượ có th nh i vào v c a phage

 Cosmid có th sao chép trong TB vi khu n do đó các TB nhi m phát ễ tri n l c bình ạ ể ngườ th  DNA chèn đ ể

ỏ ủ

ồ

ầ

 Không n đ nh, khó duy trì ị

ổ

ỉ ế t cho vi c đóng ệ

Ch Cos site c n thi gói vào phage

• Cosmids t ng t nh phage vector: s d ng lambda, nh ng lo i b t ươ ự ử ụ ư ư ạ ỏ ấ

ả ừ ị ọ ọ t in vitro t o thành 1 ạ

E. coli.

ẩ

c tr v trí cos, ori, và marker ch n l c. Đóng gói plasmid l n (50 kb) trong t t ế ừ ượ c c t v i cùng enzyme c t gi ượ ớ • Cosmids đ c tách chi • DNA ngo i lai cũng đ ạ ắ ớ

i h n ớ ạ ắ i h n và tr n v i ộ ớ ạ c đóng gói vào virus và cho nhi m vi khu n và c t v i enzyme c t gi ắ ớ ắ ớ h p đ ổ ợ ượ ễ

Shown above is a 50,000 base-pair long DNA molecule bound with six EcoRI molecules, and imaged using the atomic force microscope. This image clearly indicates the six EcoRI "sites" and allows an accurate restriction enzyme map of the cosmid to be generated.

http://homer.ornl.gov/cbps/afmimaging.htm

• cosmid đã c t. Cosmid tái t ắ vào vi khu n.ẩ rcosmid s p x p t o vòng và sao chép nh 1 plasmid. ế ạ ư ắ

Các vector khác

• Nhi m s c th nhân t o vi khu n – BACs (Bacterial

ẩ

ắ

ễ

ể

ng th p (có ori và marker ch n l c)

ọ ọ

ấ

ế

b gen vì đo n chèn có kích th

c 100

ữ

ố ượ E. coli ự ộ

ạ

ướ

ạ artificial chromosomes) – Là plasmid l n nh ng có s l ớ ư – Có th đi n bi n n p vào ạ ể ệ – H u d ng trong gi i trình t ả ụ - 300kb ắ ễ

ạ

• Nhi m s c th nhân t o n m men – YAC (Yeast Artificial ấ

ể Chromosome) – Có th sao chép trong ể – Là chromosome thu nh (ch a ori, marker ch n l c, 2 telomeres, và

E.coli và Yeast ỏ

ọ ọ

ứ

i trình t

1 centromere ể

ậ

ữ

ụ

ả

ự

– Có th nh n 200 kb -1000 kb; h u d ng trong gi ể

ự

ể ể

• Ti plasmids: đ chuy n gen vào th c v t ậ • Các vector bi u hi n ệ • Vector con thoi (shuttle vector): có th sao chép

2 loài khác

ể

ở

nhau

Yeast Artificial Chromosomes

ộ

sao chép t

ọ

ọ

ườ

ấ

• M t chromosome th ng, có ẳ telomeres, ARS centromere, đ ng – (trình t ự ộ ự autonomously replicating sequence), marker ch n l c trong n m men (th ng là các gene sinh t ng h p uracil hay ợ ổ tryptophan).

ọ ọ

ể

ạ

ể

• Cũng có E. coli ori và marker ch n l c, nên có th sao chép c ượ trong E. coli. Sau đó đ t, tinh s ch, n i v i tách chi ớ ố ế DNA ngo i lai và chuy n vào ạ trong n m men. ấ

Vector bi u hi n

ệ

ể

T o RNA và protein t

ạ

ạ

đo n DNA chèn vào. ừ ứ

– Ch t o RNA: vector ch a T7 promoter tr ướ

ứ ứ

ỉ ạ ể ả ế ủ ị ả ứ ợ ứ ấ ả ổ

c v trí chèn và 1 gene có th c m ng mã hóa cho T7 polymerase. C m ng b ng gen c ằ ch c a lac operon và ch t c m ng t ng h p IPTG (isopropyl thiogalactoside).

– T o polypeptide ho c m nh c a polypeptide: có th t o trong ủ

ể ạ c promoter. C n ki m tra l ầ E. coli i ạ ể ướ ạ ằ ả ắ

ặ b ng cách thêm v trí g n ribosome tr ị khung đ c.ọ

ổ ắ ỏ ể ệ ầ ặ ị

ầ

ở poly-A), m t marker ch n l c ho t đ ng trong eukaryote. – Bi n đ i sau d ch mã ho c protein c t b intron: c n trong bi u hi n ế TB eukaryote. C n promoter c a eukaryote, polyadenylation (thêm ủ ạ ộ ọ ọ ộ

Example Expression Vector

•

•

•

•

•

For eukaryotic expression, this vector (from Invitrogen) has a cauliflower mosaic virus promoter (PCMV), a bovine growth hormone polyadenlyation site (BGHpA). The DNA inserted at “hORF” gets fused to a short peptide called an epitope, for which very specific anitbodies exist. It also gets fused to 6 histidines, which allow easy purification on a column that has nickel ions bound to it (an affinity tag). For growth in mammalian cells, it has an SV40 viral origin of replication (SV40ori), and a zeocin resistance gene (Zeocin, with SV40 promoter/enhancer and SV40 poly A site). For growth in E. coli it has the ColE1 replicon. Zeocin works as a selectable marker in bacteria as well as in eukaryotic cells. There is also a T7 promoter for making RNA from the inserted gene, and an f1 origin of replication for making single stranded DNA (useful for sequencing).

Laøm gi aøu vect or t aùi t oå hôï p baèng Al kal i ne Phosphat ase

Dephosphorylation cuûa caùc vector dang thaúng (linearized vector) baèng Alkaline Phosphatase

Bi n n p và ch n l c ọ ọ

ế

ạ

White          White            Blue             Dead

Screening

Bieán naïp DNA taùi toå hôïp vaøo teá

baøo

Hoùa bieán naïp - DNA taùi toå hôïp ñöôïc uû vôùi soá löôïng lôùn teá  baøo  vi  khuaån chöa coù plasmid, coù khaû naêng dung naïp (competent) - Xöû lí CaCl2 laïnh, keøm soác nhieät (Ex: 420C, 2’)  theå  bieán  naïp (transformants) (Ex: 105-106 transformants/1 mg DNA)

theå ñeán 109-1010

Ñieän bieán naïp (electrotransformation hay electroporation) - Söû duïng doøng ñieän cao theá cuïc boä theo xung (pulse) - Hieäu quaû bieán naïp cao coù transformants/1mg DNA. - Ñoaïn DNA bieán naïp coù kích thöôùc lôùn (25-135kb) - Tæ leä teá baøo cheát ñaùng keå

C CH Đi U HÒA Bi U Hi N GEN

Ơ Ế Ề

Ể

Ệ

Z = beta galactosidase, Y = lactose permease. A = thiogalactoside transactylase, lacI = repressor, Pi = promoter for the lac repressor, P and O = promoter and operator

lac operon khi có lactose

lac operon khi không có lactose

Saøng loïc döïa treân Vector

Blue/White Screening • E. coli normally produces b -galactosidase • Production is under control by the lac operon • Ch ng ủ E. coli ch b xóa vùng N-terminus c a

ủ ị

ủ lacZ

gene

• Vector có P, O, và 58 amino acids đ u tiên c a

ủ

ầ

• Khi vector bi n n p vào ch ng đ t bi n m t alpha

ế

ấ c beta-

ủ ẽ ả

ế ộ ấ ượ

ủ

lacZ (alpha peptide) ạ (ex. JM109), ch ng này s s n xu t đ galactosidase

b

-galactosidase: a

4; 1023 aa

E. coli lacZ‘ (aa 1-146) fi

Lac- phenotype

E. coli lacZD M15 (aa 11-41) fi

Lac- phenotype

E. coli lacZ‘ + lacZD M15 fi

Lac+ phenotype =

a

-complemention

Nguyeân taéc boå sung a   (Complementation­a )

ấ ả ứ

• Ch t c m ng ISOPROPYL-ß-D- THIOGALACTOPYRANOSIDE (IPTG)

ỉ

ị

ấ

• Ch t ch th màu 5-Bromo-4-chloro- 3-indoxyl-beta-D-galactopyranoside (X-gal), khu n l c hóa xanh ẩ ạ

ạ

ữ

ự

ẩ

ạ ứ ẽ

ạ

• Khi chèn DNA ngo i lai vào mã hóa alpha gi a trình t peptide trên vector ho c ặ lacZ, c t o ra. Do peptide không đ ượ đó các khu n l c ch a vector ạ và DNA ngo i lai s có màu tr ngắ

- Teá baøo vi khuaån khoâng nhaän

ñöôïc plasmid

- Teá baøo nhaän ñöôïc plasmid khoâng

coù gene laï vaøo

- Teá baøo vi khuaån nhaän ñöôïc ñuùng

plasmid taùi toå hôïp

C ô ch aát cu û a b ­G alactosid ase

Chaát caûm öùng Operon lac

Cheøn  Baát

hoaït

Cheøn  Baát hoaït

(tieáp theo)

Lai treân khuaån laïc (Colony) vaø treân ñóa (Plaque)

Làm th nào đ xác đ nh và t o dòng

ế

ạ

ị c quan tâm?

gen đ

ể ượ

• Sàng l c DNA library:

ọ – Genomic – cDNA

• Dùng Polymerase Chain Reaction (PCR) đ t o dòng

ể ạ

gen đ

c quan tâm

ượ

c v i DNA library?

ượ ớ ổ

ổ ế

ứ

ẩ

Làm gì đ • Dùng b sung cho 1 đ t bi n (ph bi n trong nghiên c u vi khu n) ế ộ • S d ng trong lai khu n l c (colony hybridization) ẩ ạ

ử ụ

Thö vieän DNA (genomic library) • Toaøn boä DNA cuûa moät sinh vaät ñöôïc caét ñoaïn nhoû baèng laéc cô hoïc hay bôûi caùc RE roài gaén vaøo caùc vector

Phân tích tên gel agarose DNA b gene c t không ắ ộ hoàn toàn

Xác đ nh n ng đ enzyme t

i u

ồ

ộ

ị

ố ư

Genomic Library

53

ố ượ

ư ệ ộ

ng clone/th vi n b gene ạ

ố ượ ấ

ng clones, P = xác su t DNA ngo i lai tìm th y ấ c DNA ư ệ ướ

S l N = ln (1-P) / ln (1-f), N = s l trong th vi n, f = t n su t c a DNA ngo i lai trong th vi n = kích th ấ ủ ạ ầ ư ệ c DNA b gen (Kb) ngo i lai (Kb)/ kích th ộ

ướ ạ

ng clone c n thi ể ể ầ ả

t đ có th 99% tìm th y 1 clone mang m nh ấ c 4.7 x 10 3 ố ượ ạ ế ư ệ ướ ộ

Tính s l DNA ngo i lai 5 Kb trong th vi n DNA b gen E.coli có kích th Kb.

Thö vieän cDNA

 Reverse transcriptase toång hôïp c­

DNA maïch ñôn (complementary DNA)

töø khuoân mRNA

 DNA polymerase toång hôïp c-DNA

keùp

 Gaén c-DNA keùp vaøo plasmid

 Bieán naïp vaøo vi khuaån

cDNA library

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Screening libraries by colony hybridization

BÀI T PẬ

ả ứ ể ớ

ế ậ ộ ệ ị

Thi ồ ố ắ ầ ằ

ử ụ ượ

Bài t p 1. t l p ph n ng RE v i th tích 50 microlit. Cho biet enzyme ậ RE g c có n ng đ 20.000 unit/microlit, dung d ch đ m g c cho enzyme là ố ố 10X, DNA g c là 10 microgram/microlit. Cho r ng ph n ng c n c t 1 ả ứ ng DNA này c n s d ng 20 unit microgram DNA và đ c t hoàn toàn l ầ enzyme, dung d ch đ m 1X. ể ắ ệ ị

ả ứ ạ ộ ắ

ớ ớ

ớ ớ

ả ứ ắ

Tính toán ph n ng c t DNA v i 2 RE. RE A ho t đ ng 100% Bài t p 2. ớ ậ v i buffer 1 và 75% v i buffer 2. RE B ho t đ ng 50% v i buffer 1 và 100% ạ ộ v i buffer 2. Có bao nhiêu cách t o ph n ng c t? ạ N u c t đ ng th i v i 2 RE, buffer nào t ờ ớ t nh t? ấ ắ ồ ế ố

. Tìm xem trong nh ng RE sau, nh ng c p enzyme nào có th ể ữ ữ ặ

Bài t p 3ậ t o ra các đ u t ạ ầ ươ ng h p: ợ

Sau3AI : /GATC ; AluI : AG/CT ; EcoRI : G/AATTC ; XmaI : C/CCGGG ; PstI : CTGCA/G ; BamHI : G/GATCC ; SmaI : CCC/GGG ; SspI : AAT/ATT.

. Tính kho ng cách trung bình (lý thuy t) (đ n v nucleotide) gi a ị ơ ế ữ

2 đi m nh n bi ả t c a các RE sau: ậ

ầ

ề ệ ế

ế v i đi u ki n đo n DNA có thành ph n GC chi m ự ớ ế ằ ấ

ầ c trung bình c ướ ể ủ

Bài t p 4ậ ể ế ủ Sau3AI (GATC) EcoRI (GAATTC) SmaI (CCCGGG) SspI (AATATT) NotI (GCGGCCGC) 4.1. Cho r ng: đo n DNA có thành ph n GC chi m 50%. ạ ằ ng t 4.2. Cũng tính t ươ ạ ng h p b gene t bào n m men). Cho r ng kích th ộ bào n m men là 1.5 kb, vector plasmid có th chèn đ ữ ợ ộ ế ớ ạ

ấ c t ướ ố ạ ể ạ ượ ụ ả

38% (tr ườ c a gene thu c t đo n gene v i kích th d ng đ t o dòng các đo n DNA trên, gi trong ph n ng c t hoàn toàn hay t ng ph n? ượ i đa là 15 kb; nh ng enzyme RE nào có th s ể ử c s d ng i thích c th RE đ ử ụ ụ ể ầ ả ứ ừ ắ

ả ế ậ ệ ớ ượ ự ệ ồ

t l p b n đ RE: 4 thí nghi m đ ư t v i ử ụ ề

ả ệ ế ố

MM

HpaI PvuII PstI

ScaI

6660

6030

4630

4360

3800

3400

2320

2610

1350

2030

c th c hi n riêng bi Bài t p 5ậ . Thi ệ cùng 1 lo i DNA, các đi u ki n ph n ng nh nhau, ngo i tr các RE s d ng ả ứ ạ ừ ệ ạ HpaI, PvuII, PstI và ScaI. K t qu đi n di trong 4 ng là khác nhau, l n l t là: ầ ượ trên gel agarose s n ph m c a ph n ng c t cho k t qu nh hình sau: ả ả ứ ủ ư ế ả ẩ ắ

l c a b gene phage ng phân t marker ử ủ ượ ộ

ượ

ọ c c t b ng ắ ằ HindIII. ạ ủ ạ ấ ẳ ậ

Molecular Mass (MM): thang tr ng l (DNA m ch đôi) đ ạ 5.1. Suy lu n c u hình c a đo n DNA trên: m ch th ng hay d ng vòng? V i ớ m i lo i RE, cho bi t c a RE đó? ạ t có bao nhiêu đi m nh n bi ế ủ ế ể ậ ạ ỗ

ể t l p m t cách chính xác h n b n đ RE c a đo n DNA này, ả ạ ơ ồ ộ

ệ ế

BamHI

PstI

ClaI

PstI   + ClaI

BamHI    +  PstI

BamHI     +   ClaI

13.2

7.2

7.2

6.2

6.2

6.0

5.4

5.4

4.4

4.2

3.6

3.6

3.6

1.8

1.8

1.8

1.6

1.6

1.6

Đ có th thi ế ậ các ph n ng c t b ng 2 RE đ ượ ắ ằ s n ph m các ph n ng c t này đ ự c minh h a trên hình sau: ể ả ứ ẩ ả ứ ủ c th c hi n. K t qu đi n di trên gel agarose ả ệ ượ ắ ả ọ

ượ ữ ả ớ c suy lu n v c u ậ ề ấ

5.2. K t qu này có phù h p v i nh ng gi ả trúc c a đo n DNA? Thi ạ thuy t đã đ ợ ế t l p b n đ RE c a đo n DNA này. ạ ủ ế ậ ế ủ ả ồ

. Đo n DNA m ch đôi, d ng th ng đ c c t b i các RE. K t qu ả ượ ạ ạ

BamHI

PstI

ClaI

PstI   + ClaI

BamHI    +  PstI

BamHI     +   ClaI

13.2

7.2

7.2

6.2

6.2

6.0

5.4

5.4

4.4

4.2

3.6

3.6

3.6

1.8

1.8

1.8

1.6

1.6

1.6

ế c minh h a trong hình sau: Bài t p 6ậ đi n di s n ph m c t trên gel agarose đ ắ ả ắ ở ọ ẳ ượ ạ ẩ ệ

Thi ế ậ t l p b n đ RE c a đo n DNA này. ủ ạ ả ồ

HIV Gene Delivery System?

Shelley M. Martineau Jessica A. Matthews Catherine C. Miller Carol D. Riley Institute of TIP Productions, Inc.

that make some The characteristics retroviruses dangerous pathogens, are the very characteristics that make them an excellent gene transfer system

Retrovirus Characteristics

Retroviruses exist as proviruses in the hosts genome

Retroviruses have powerful promoters

genomes

can

accommodate

Retroviral changes to its configuration

are Retroviruses the only animal that viruses integrate into the hosts genome

The virus that causes aids may one day be used in gene therapy

WHY?

Because it is an lentivirus

What is a Lentivirus?

Lentiviruses are a subfamily of retroviruses – HIV is a lenitivirus

Why is a lentivirus necessary?

Lentiviruses can introduce a gene of interest into cells that do not divide – simple retroviruses cannot

This ability makes them ideal for a delivery system because most of our cells, like hemopoietic stem cells, do not divide

Why use HIV?

A genetically stripped down amalgam of HIV components can be fashioned with a molecular switch system that turns them off in response to a common antibiotic

This type of control allows doctors to control gene expression in people who are treated with gene therapy - If something goes wrong, the expression can be turned off

Adenoviruses are often used as a vector in gene therapy research but they do not have the capacity to integrate their genome into the hosts genome

The advantage to using a retrovirus is that you don’t lose the genomic sequence that is incorporated into the host DNA following cell division

Co-expression with Duet vectors

Lab of Molecular Genetics Yong-wook, Choi (2003. 4. 10)

Co-expression in E.coli

• Multi-component protein

· Important in many cellular processes · Elucidation & their mechanism of action

☞ cloning, expression & reconstitution of the

complex in a defined system • E.coli : Popular system used to generate the protein complex → easy usage & high expression

Why Co-expression ?

• Separated components of a complex ☞ Often, not soluble

hydrophobic not soluble mostly due to hydrophobic

patches that are exposed to the solvent.

patches involved in and These patches are usually involved in and protected by the binding to the other protected component(s) of the complex.

higher expression level of soluble protein higher expression level of soluble protein complex complex

Applications of Co-expression

• Protein-Protein interaction

• Analysis of complex multimeric assemblies

• Analysis of multi-subunit complexes

• Identification & characterization of the inter-

acting subunits in multi-protein complexes

• Analysis of biochemical pathways

Co-expression methods • Co-expression from different vectors

· For plasmid stability...

selectable markers Different selectable markers

origins of replication Different origins of replication

· Often the copy numbers for the vectors will

not be the same → Expression levels

· should be cloned into the different vectors

→ If possible, under the control of different promoters

incompatibility of plasmid cf. incompatibility of plasmid

Co-expression methods

• Co-expression from one vector

· The genes are…

same vector cloned into the same vector

one or more promoters expressed from one or more promoters

· If cloned under the regulation of one promoter

☞ the order in which the genes are cloned,

usually affects the expression levels of the

proteins.

Co-expression methods

Co-expression

from different  different

vectors   vectors

Co-expression

from one  one  vector vector

Dual gene expression vectors

• pETDuet-1 & pACYCDuet-1

· Cloning & expression of two target genes · T7lac promoter

pET Vector System

Summary

• Two target genes for independent transcription

from T7lac promoters

• Compatible each other → Enable coexpression

→ Four proteins in the same cell

• Protein complex analysis

Protein-Protein interactions

Enzymatic pathways

Take home message

• Các vector t o dòng: plasmid, phage,

ạ

cosmid, BAC, YAC,…

ạ

ặ

ư

ế

Ứ

ụ

• Đ c tr ng c a t ng vector t o dòng ủ ừ • Lac operon: c chơ • White/Blue screening • • Tính toán s clone c n đ t o th vi n

ng d ng c a t o dòng ủ ạ ầ ố

ư ệ

ể ạ

DNA

References

• http://www.rvc.ac.uk/Extranet/DNA_1/DNA_1_intro.htm • http://library.thinkquest.org/24355/data/light/details/media/recombinantanim.html • http://www.organoninc.com/products/consumer/