Hội thảo khoa học khoa Công nghệ thực phẩm 2018
NH HƯNG CA MT S THÔNG S CÔNG NGH ĐN QUY
TRNH TRCH LY PROTEIN T BO TM (LEMNA MINOR) VI S
H TR CA ENZYME CELLULASE
Phm Văn Đông*, Vy Th Minh, Trn Ch Hi
Trưng Đi hc Công nghip Thc phm Thnh ph H Ch Minh
*Email: dong05dhdb2@gmail.com
Ngày nhận bài: 07/7/2018; Ngày chấp nhận đăng: 12/7/2018
TM TT
Trong nghiên cu ny, enzyme cellulase đưc s dng đ h tr qu trnh trch ly protein t bo
tấm. Sau khi tin hnh cc th nghim kho st nh hưng ca mt s thông s công ngh (t l enzyme:cơ
chất, pH, nhit đ v thi gian) đn qu trnh trch ly, kt qu cho thấy cc mu c x l enzyme cho
hiu suất trch ly protein tăng xấp x 2 ln so vi mu không đưc x lenzyme trong cng điu kin.
Điu kin hot đng ph hp nhất ca enzyme cellulase trong th nghim l môi trưng c pH 5,5; nhit
đ x l mu 45oC trong thi gian 90 pht vi t lenzyme:cơ chất 30µL/g nguyên liu. Ti điu kin
ny, hm lưng protein tng trong dịch trch đt 131,00 mg/g cao gấp 2,29 ln so vi mu không s
dng enzyme  cng điu kin.
T kho: Bo tấm, enzyme cellulase, trch ly protein
1. M ĐU
Bo tấm (Duckweed) l loi thc vật đơn gin, thiu thân hoặc l, c hoặc không c r con, ch yu
sinh sn vô tnh, sng trôi ni trên mặt nưc. Thnh phn v hm lưng cc hp chất ha học trong bo
bao gm: 6,8-45% protein, 14,1-43,6% carbohydrate, 1,8-9,2% lipit, 12-27,6% khong v nhiu hp
chất khc.  điu kin sinh trưng tt, hm lưng protein c th lên đn 45%, tương đương vi lưng
protein c trong đậu nnh [1]. Nhm protein ny cha khong 5% lysin, 3% methionin + cysteine (lưu
huỳnh có cha các axit amin) và 8% phenylalanine + tyrosine. Cc axit amin ny rất cn thit cho con
ngưi theo khuyn co ca WHO [2]. Vic s dng enzyme cellulase đ h tr cho qu trnh trch ly
cc hp chất bên trong t bo đ đưc tin hnh trong nhiu nghiên cu trưc đ. Năm 1995, Joël
Fleurence v cng s tin hnh kho st v đnh gi nh hưng ca pH, nhit đ đn hot đng ca
nhm enzyme (carrageenase, xylanase, P-agarase, cellulase) gip phân ct thnh tbo đ h tr qu
trnh thu nhận protein tt hơn [3]. Gn đây, P. Martosuyono (2015) cng cho thấy nh hưng ca cc s
yu t (nng đ enzyme, pH, nhit đ v thi gian) trong quy trnh thu phân rong bin khi s dng
enzyme cellulase [4].
Da trên cơ s đ, trong nghiên cu ny, chng tôi tin hnh kho st nh hưng ca cc thông s
công ngh (t l enzyme:cơ chất, pH, nhit đ, thi gian) đn quy trnh trch ly protein t bo tấm vi
s h tr ca enzyme cellulase. Đây l nghiên cu tin đ cho các nghiên cu sâu hơn v trích ly protein
t bèo tấm, mt ngun nguyên liu đy tim năng nhưng vn chưa đưc quan tâm đng mc.
106
Phm Văn Đông, Vy Th Minh, Trn Ch Hi
2. VT LIU V PHƯƠNG PHP NGHIÊN CU
2.1. Vt liu nghiên cu
Bèo tấm đưc thu nhận t đm rau nhúc ti xã Tân Hoà Thành, huyn Tân Phưc, tnh Tin Giang.
Bo tươi sau khi thu nhận đưc làm sch, loi bỏ tp chất, phân loi, phơi khô, nghin nhỏ v sng qua
rây 0,3mm. Phn qua rây c đ m không qu 5% đưc đng gi, bo qun trong cc ti zip. Enzyme
cellulase đưc thu nhận t nấm mc Trichoderma reesei ca hãng Novozymes, vi tên thương mi là
Viscozyme Cassava C, đưc mua ti công ty TNHH Brenntag Vit Nam. Enzyme ny c hot lc 100
FBG/g.
2.2. Phương php nghiên cu
2.2.1. Chun bị mu th
Mu bo tấm nguyên liu đưc cân chnh xc 2.00g, ho trn trong nưc cất vi t l 1:20 (w/v),
điu chnh pH bằng acid HCl 2N, đ trong b n nhit  nhit đ kho st (khong 5 phút); sau đ bt
đu b sung enzyme, tính thi gian  mu. Kt thúc thi gian trích ly, mu đưc đem ly tâm tách cặn
5500 vòng/pht trong 15 pht. Dịch trch ly đưc xc định th tch bằng ng đong 50 ml, bo qun trong
lọ cha mu v đem xc định cc ch tiêu cn theo di.
2.2.2. B tr th nghim
Trong nghiên cu ny, bn th nghim kho st nh hưng ca tl enzyme:cơ chất, pH môi trưng,
nhit đ v thi gian x l trong quy trnh trch ly protein t bo tấm vi s h tr ca enzyme cellulase
s đưc tin hnh liên tip nhau đ chọn ra đim thch hp nhất cho tng yu t kho st.
− Th nghim 1: Kho st nh hưng ca t l enzyme:cơ cht đn qu trnh trch ly.
Cc t l enzyme: cơ chất đưc la chọn đ tin hnh th nghim kho st bao gm 0, 10, 20, 30,
40, 50 µL/g nguyên liu trong cc điu kin trch ly c định  pH 5, nhit đ 45oC trong 90 pht.
− Th nghim 2: Kho st nh hưng ca pH môi trưng đn qu trnh trch ly.
Cc đim pH đưc la chọn đ kho st l pH 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 v 7 trong điu kin trch ly c
định nhit đ 45oC trong vòng 90 pht vi t l enzyme: cơ chất đưc chọn t th nghim 1.
− Th nghim 3: Kho st nh hưng ca nhit đ x l đn qu trnh trch ly.
Cc đim nhit đ đưc la chọn kho st trong khong t 35oC đn 60oC vi bưc nhy l 5oC,
vi t l enzyme:cơ chất v pH x l đưc c định t kt qu ca hai th nghim trên trong thi gian
mu l 90 pht.
− Th nghim 4: Kho st nh hưng ca thi gian x l đn qu trnh trch ly.
Thi gian kho st đưc chọn trong khong t 0 đn 180 pht, bưc nhy thi gian l 30 pht. Cc
điu kin nng đ enzyme, pH v nhit đ đưc c định t cc th nghim trên
Đi vi tng th nghim kho st, mu đi chng (mu không s dng enzyme trong cng điu
kin) đưc s dng đ h tr đnh gi hiu qu hot đng ca enzyme cellulase trong qu trnh trch ly
protein t bo tấm
2.3. Phương php phân tch
2.3.1. Xc định hm lưng carbohydrate tng
Hm lưng carbohydrate tng trong dịch sau trch ly đưc xc định bằng phương php phenol
sulfuric acid [5]. Đưng chun đưc xây dng theo D-glucose vi cc nng đ 0; 25; 50; 75 v 100
ppm, đo quang  bưc sng 490nm.
107
Ảnh hưng ca mt s thông s công ngh đn quy trnh trch ly protein t bo tm (lemna minor) vi
s h tr ca enzyme cellulase
2.3.2. Xc định hm lưng protein
Hm lưng protein ho tan đưc xc định bằng phương php Lowry [6]. Abumin huyt thnh bò
(BSA) đưc s dng lm chất chun vi cc nng đ 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 v 1 mg/g, đo quang bưc
sng 660nm.
2.4. Phương php x l s liu
Trong nghiên cu này, mi thí nghim đưc tin hành lặp li ba ln, kt qu đưc trình bày dng
giá trị trung bình ± giá trị sai s. Đ tinh sch ca protein trong dịch sau trch ly đưc tnh theo công
thc:
Đ tinh sch (%) = 𝐶𝑥∗100
1000∗% 𝐶𝐾
Trong đ Cx (ppm): nng đ protein trong mu đo quang.
% CK (%): phn trăm chất khô c trong dịch sau trch ly
Kt qu đưc tính toán bằng phn mm Microft Office Excel 2013 và phn mm thng kê
Statgraphics Centurion XV.I. Kt qu phân tích ANOVA vi đ tin cậy 95%, so sánh s khác bit giữa
các nghim thc qua phép th LSD.
3. KT QU NGHIÊN CU V THO LUN
3.1. Kt qu kho st nh hưng ca t l enzyme:cơ cht đn qu trnh trch ly protein t bo
tm vi s h tr ca enzyme cellulase
V nguyên tc, vi mt lưng cơ chất xác định, khi nng đ enzyme cng tăng th hiu suất ca
phn ng enzyme cng tăng. Tuy nhiên, nu lưng enzyme tăng cao qu so vi lưng cơ chất có sẵn thì
hiu suất phn ng s không tăng nữa do lưng enzyme dư tha so vi lưng cơ chất có sẵn nên không
đ cơ chất cho enzyme hot đng, đng thi có th dn đn s cnh tranh cơ chất [7].
T kt qu th nghim cho thấy, khi t lenzyme:cơ chất tăng t 0 đn 30 µL/g th hm lưng
carbohydrate tăng cao do hot đng phân ct ca enzyme din ra mnh m ko theo hm hm lưng
protein trong dịch trch ly tăng cao. Vi mu s dng t l enzyme:cơ chất 30 µL/g nguyên liu, hm
0
10
20
30
40
50
60
0
20
40
60
80
100
120
010 20 30 40 50
Hm lưng Protein Hm lưng carbohydrate
Hiu suất trch ly protein
Hmlưng protein (mg/g)
T l enzyme:cơ cht (µL/g)
Hiu suất trch ly protein (%)
Hnh 1. Đ thị th hin s tc đng ca t l enzyme:cơ
chất đn hm lưng cc chất trch ly
108
Phm Văn Đông, Vy Th Minh, Trn Ch Hi
lưng carbohydrate tăng gấp 2,12 ln v hm lưng protein tăng thêm 49,20 (mg/g nguyên liu) so vi
mu không x l enzyme cng điu kin. Tuy nhiên, khi lưng enzyme cho vo mu tip tc tăng
thêm th hm lưng carbohydrate tăng không đng k cho thấy hot đng ca enzyme bt đu chậm li,
đng thi hm lưng protein trong dịch trch ly li c xu hưng gim nh (Hnh 1). Điu đ cho thấy,
t l enzyme:cơ chất 30 µL/g nguyên liu l nng đ enzyme cn thit đ qu trnh trch ly protein t
bo tấm đt hiu qu trch ly tt nhất, vic tăng thêm lưng enzyme cellulase sau đ l không cn thit
v s tăng thêm kinh ph, lm gim hiu qu kinh t ca quy trnh trch ly protein t bo tấm vi s h
tr ca enzyme cellulase; đng thi lm gim đ tinh sch ca protein sau trch ly. Vi t l enzyme:cơ
chất 30 µL/g nguyên liu, hm lưng protein thu đưc l 103,48 (mg/g nguyên liu), đt hiu suất trch
ly lên đn 42,71%.
3.2. Kt qu kho st nh hưng ca pH môi trưng đn qu trnh trch ly protein t bo tm vi
s h tr ca enzyme cellulase
Kt qu th nghim ny cho thấy, khi pH tăng t pH 4,5 lên pH 5,5, đi vi mu x l enzyme th
hm lưng protein tăng cao, đt gi trị cc đi ti pH 5,5 vi hm lưng protein thu đưc l 128,89
mg/g, cao gấp 2,19 ln so vi mu không x l enzyme cng điu kin. Tuy nhiên khi pH tip tc
tăng, th mu x l enzyme hm lưng protein thu đưc c xu hưng gim, trong khi mu không x
l enzyme li tăng  mc đ thấp. Tương t vi hm lưng protein th hm lưng carbohydrate  mu
x l enzyme cng c quy luật tăng gim tương ng (Hnh 2).
Bng 1. nh hưng ca pH đn qu trnh trch ly protein vi s h tr ca enzyme cellulase
STT
pH
Hiu suất trch ly
carbohydrate (%)
Hiu suất trch
ly protein (%)
1
4,5
(6,77± 0,07)a
(25,29± 0,23)a
(40,49± 0.60)a
2
5,0
(10,70± 0,20)e
(43,02± 0,26)d
3
5,5
(11.66± 0,09)f
(53,20± 0.69)e
4
6,0
(9,86± 0,19)d
(41,20± 0,47)c
5
6,5
(9,14± 0,09)c
(38,40± 0,78)b
6
7,0
(7,81± 0,12)b
(39,17± 0,25)b
Trong cùng một cột, cc gi trị đưc đnh dấu bởi cc chữ ci ging nhau thì s khc
nhau không có ý nghĩa về mặt thng kê theo phân tch ANOVA (α = 0,05).
Điu ny cho thấy, kh năng hot đng ca enzyme cellulase s dng trong kho st ny hot đng
tt trong vng acid yu pH 5-6 v hot đng tt nhất pH 5,5. Ti pH 5,5, hm lưng protein c gi trị
cc đi 128,89 mg/g, cao hơn 69,98mg/g so vi mu không đưc x l enzyme dng điu kin; đt
hiu suất trch ly 53,20%, vi đ tinh sch 68,49% (Bng 1).
Ngoi vai trò đi vi hot đng ca enzyme cellulase, pH còn là yu t quan trọng trong quá trình
trch ly protein tan trong nưc. pH làm nh hưng ti đin tích b mặt ca phân t protein và có th nh
hưng đn kh năng hòa tan ca protein [8]. Trong th nghim ny, hm lưng protein mu không
đưc x l enzyme tăng dn khi pH môi trưng chuyn t acid sang trung tnh, cho thấy kh năng ho
tan tt ca protein trong bo tấm tăng khi pH môi trưng tăng.
3.3. Kt qu kho st nh hưng ca nhit đ đn qu trnh trch ly protein t bo tm vi s h
tr ca enzyme cellulase
109
Ảnh hưng ca mt s thông s công ngh đn quy trnh trch ly protein t bo tm (lemna minor) vi
s h tr ca enzyme cellulase
Kt qu th nghim cho thấy, khi nhit đ tăng t 35oC lên 45oC, hm lưng carbohydrate v hm
lưng protein tăng cao.  45oC, hm lưng protein đt gi trị cc đi 131,04 mg/g, cao gấp 2,21 ln so
vi mu không s l enzyme; tương ng hm lưng carbohydrate cng cao gấp 2,12 ln. Khi nhit đ
tip tc tăng t 45oC lên 60oC, hm lưng protein v carbohydrate không tăng thêm m gim mnh, s
chênh lch hm lưng giữa mu không s dng enzyme v mu c x dng enzyme gim dn,  60oC
s chênh lch l không đng k, cho thấy hot đng ca enzyme bt đu gim dn khi nhit đ tăng trên
45oC (Hnh 3).
Điu đ cho thấy nhit đ nh hưng ln đn hot đng ca enzyme cellulase, nhit đ lm cc
cấu t chuyn đng nhanh hơn, do đ s hòa tan và kh năng khuch tán ca các cấu t t nguyên liu
vào trong dung môi s tăng. Ngoi ra, khi nhit đ tăng, đ nht ca dung môi s gim, dung môi s d
dàng xuyên qua lp nguyên liu, làm cho din tích tip xúc b mặt giữa nguyên liu và dung môi càng
ln và to điu kin thuận li cho quá trình trích ly. Tuy nhiên, trong phn ng vi s tham gia ca
enzyme, s gia tăng nhit đ trong quá trình trích ly có th làm bin tnh enzyme, do đ c th làm bin
đi trung tâm hot đng ca enzyme, khin phn ng đưc xúc tác bi enzyme không thc hin đưc
nữa. Đng thi, khi nhit đ gia tăng cng lm cc chất ho tan không mong mun d dng khuch tn
vo dịch trch ly lm gim đ tinh sch ca dịch protein sau trch ly.
Bng 2. nh hưng ca nhit đ lên qu trnh trch ly protein vi s h tr ca enzyme cellulase
STT
Nhit đ
(oC)
Hiu suất trch ly
carbohydrate (%)
Hiu suất trch ly
protein (%)
Đ tinh sach ca protein
trong dịch trch ly (%)
1
35,0
(7,74±0,43)a
(26,96±0,11)a
(42,6±0,96)a
2
40,0
(10,06±0,05)d
(42,83±0,64)d
(53,76±0,61)b
3
45,0
(11,78±0,30)e
(54,08±0,38)f
(67,14±2,31)d
4
50,0
(9,17±0,56)c
(48,85±0,65)e
(62,01±1,07)c
5
55,0
(8,27±0,29)ab
(39,25±0,38)c
(52,14±0,99)b
6
60,0
(8,69±0,33)bc
(30,42±0,31)b
(42,79±1,58)a
Trong cùng một cột, cc gi trị đưc đnh dấu bởi cc chữ ci ging nhau thì s khc
nhau không có ý nghĩa về mặt thng kê theo phân tch ANOVA (α = 0,05).
Enzyme cellulase Viscozyme Cassava C s dng trong th nghim ny hot đng tt trong khong
nhit đ 40-50oC, v hot đng tt nhất  nhit đ 45oC vi hm lưng protein thu đưc l 131,02mg/g
nguyên liu, đt hiu suất trch ly 54,07%, đ tinh sch ca protein sau trch ly l 67,14% (Bng 2). Kt
0
20
40
60
80
100
120
140
0
20
40
60
80
100
120
140
4.5 5 5.5 6 6.5 7
HLC_Không enzyme HLP_Không enzyme
HLC_C enzyme HLP_C enzyme
Hmlưng protein (HLP, mg/g)
Hmlưng carbohydrate (HLC, mg/g)
pH
Hnh 2. nh hưng ca pH đn hm lưng cc
chất trong dịch trch ly
0
20
40
60
80
100
120
140
0
20
40
60
80
100
120
140
35 40 45 50 55 60
HLC_Không enzyme HLP_Không enzyme
HLC_C enzyme HLP_C enzyme
Hmlưng protein (HLP, mg/g)
Hmlưng carbohydrate (HLC, mg/g)
Nhitđ (oC)
Hnh 3. nh hưng ca nhit đ đn hm lưng
cc chất trong dịch trch ly
110