Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào: Bài 4

4/01/2013

BÀI 4 CÁC QUI TRÌNH KIỂM TRA VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHI TRUYỀN THỐNG

Lớp phân tích vi sinh GV: ThS. Nguyễn Thành Luân luannt@cntp.edu.vn

Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật (Nhắc lại)

Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp  Trực tiếp như đếm trên kính hiển vi  Gián tiếp thông qua:

định

 Phương pháp đo độ đục  Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác

pháp pha loãng tới hạn (MPN).

 Định lượng một cách thống kê bằng phương

4/01/2013

Phƣơng pháp đếm trực tiếp

chóng mật độ vi sinh vật chứa trong mẫu.

• Ƣu điểm: Quy trình này cho phép xác định nhanh

- Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết - Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu - Khó đạt được độ chính xác cao - Không thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp.

• Nhƣợc điểm:

Phƣơng pháp đếm trực tiếp

THIẾT BỊ GÌ??

• Buồng đếm hồng cầu • Buồng đếm Breed • Kính hiển vi huỳnh quang

4/01/2013

Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc

• Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp cho độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp • Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa.

Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc

•Phương pháp này dễ sai số nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất ba đĩa. •Ƣu điểm: Độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu

4/01/2013

Phƣơng pháp MPN (Most Probable Number)

suất lớn nhất hiện diện trong 1 đơn vị thể tích mẫu

 Là phương pháp định lượng vi sinh vật theo xác

bậc 10 liên tiếp.

 Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại Thông thường là lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng

 Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của phương pháp này càng lớn.

Phƣơng pháp đo độ đục

vật.

• Là phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh

bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 – 610 nm.

• Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục

có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng

• Định lượng mật độ tế bào thông qua đo độ đục

4/01/2013

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA

• Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh VSV • Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa. • Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV: • Cách truyền thống • Sử dụng các bộ KIT • Sử dụng các thiết bị tự động

4/01/2013

Thử nghiệm khả năng lên men

CH của các VSV

• Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn

môi trường

• Nguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid  giảm pH

• Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose … • Dicarbonhydrate: sucrose, lactose … • Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose • Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO • Các loại đường rượu: chứa chức -OH

• Các loại carbohydrate

4/01/2013

Phenol Red Carbohydrate Broth

Trypticase 10g

NaCl 5g

Cao thịt 1g

Phenol red (7,2ml của dung dịch phenol red 0,25%)

0,018g

Hấp ở 115oC trong 15 phút

Carbohydrate* 1 g

Thử nghiệm khả năng lên men

• Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm

• VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH  thay đổi màu chất chỉ thị phenolred

• Phản ứng (+): môi trường

• Phản ứng (-): môi trường có

chuyển vàng

màu đỏ

4/01/2013

Thử nghiệm Citrate

• Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat

• Cở sở sinh hóa:

• VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm hóa MT • VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT

như là nguồn cacbon duy nhất.

Thử nghiệm Citrate

Môi trường Simmon citrate agar Ammonium dihydrogen phosphate Dipotassium hydrogen phosphate NaCl Sodium citrate MgSO4 Bromothymol blue Agar

1.0g 1.0g 5g 2g 0,2g 0,08g 13g

4/01/2013

Thử nghiệm Citrate

• Chú ý - Cấy lượng sinh khối vừa đủ - Có đối chứng trắng (BLANK) đi kèm

Pứ âm tính

Pứ dương tính

Đối chứng trắng

Thử nghiệm Urease

• Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease

• Cơ sở sinh hoá:

• Môi trường sử dụng:

• Urea Broth (Rustigian – Stuart) • Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)

(NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2  tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng – đỏ)

4/01/2013

Môi trƣờng Urea Broth

Urea

20g

Cao nấm mem

0,1g

9,5g

9,1g

Na2HPO4 K2HPO4 Phenol red

0,01g

Nước cất

1 lít

Thử nghiệm Urease

• Thực hiện

• Chuẩn bị môi trường • Cấy VSV vào 5ml môi trường • ủ 37oC/24 giờ • Quan sát

4/01/2013

Thử nghiệm khả năng sinh H2S

• Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2S

• Cơ sở sinh hóa:

desulfohydrase

H2S

thiosulfate reductase

 H2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen

(FeS, PbS)

H2S Acid amin chứa S Thiosulfate

Thử nghiệm khả năng sinh H2S • Để phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae và giống

• Môi trường sử dụng:

• KIA, TSI

(thạch nghiêng)

• SIM, PIA

(thạch sâu)

• BSA

(thạch đĩa)

Cấy vsv lên môi trường

Ủ (37oC, 24 – 48h)

Proteus

4/01/2013

Thử nghiệm khả năng sinh H2S • Đọc kết quả: (+)

(-)

Xuất hiện màu đen trong môi trường Không xuất hiện màu đen trong môi trường

ĐC

(+)

Thử nghiệm khả năng sinh H2S 20.0 g

Pancreatic digest of casein (casitone)

6.1 g Peptic digest of animal tissue (beef extract)

0.2 g Ferrous ammonium sulfate

Agar

3.5 g

Sodium thiosulfate 0.2 g

(+)

(-)

(+)

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

• Mục đích

Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các VSV có hệ emzym tryptophanase

4/01/2013

37oC / 24h

Chủng VSV MT canh trypton

Pứ dương tính Pứ âm tính

Thuốc thử Kovac’s

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

• Là phản ứng giúp phân biệt • E. coli (+) với Klebsiella (-) • Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+) • Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-) …

• Đối chứng (+) Proteus rettgeri

(-) Serratia marcescens

4/01/2013

Thử nghiệm KIA/TSI

• KIA: Kligler iron agar (trang 99)

20g 20g 1g 5g 0,5g 0,5g 15g 0,025g 1 lít Pepton Lactose Glucose NaCl Feric ammonium citrate Sodium thiosulphate Agar Phenol red Nước cất pH 7,4±0,2

Thử nghiệm KIA/TSI

• TSI: Triple sugar iron agar (trang 106)

20g 10g 10g 1g 5g o,2g 0,2g 13g 0,025g 1 lít Pepton Lactose Sucrose Glucose NaCl Feric ammonium sulphate Sodium thiosulphate Agar Phenol red Nước cất pH 7,4±0,2

4/01/2013

Thử nghiệm KIA/TSI

• Mục đích: phát hiện khả năng • sử dụng các nguồn cacbonhydrate • sinh H2S • tạo hơi (gas)

Ủ 37oC/24 giờ

Quan sát:

Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2S

Thử nghiệm KIA/TSI

ĐC

Thử nghiệm MR (Methyl red)

4/01/2013

• Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình lên men glucose.

• Chất chỉ thị pH: methyl red

dưới 4,4

5,0 – 5,8

trên 6,0

• MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường

• Cơ sở sinh hóa:

• MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính

càng acid

Thử nghiệm MR (Methyl red)

 Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth)

ủ 2 – 5 ngày

37oC

Chủng VSV

MR-VP broth

Pứ âm tính Pứ dương tính ĐC

 Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC

Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)

• Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin)

4/01/2013

• Cở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm

trong quá trình lên men glucose

khí hoàn toàn.

2 pyruvate acetoin + 2 CO2

Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)

• Môi trường sử dụng: MR-VP • Phương pháp tiến hành:

• Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP • Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC • Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ • Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ.

Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)

• Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng

(+) : Enterobacter cloacea (-) : E. coli • Đọc kết quả:

(+): màu đỏ trên môi trường (-): mặt môi trường không đổi màu

4/01/2013

(-)

(+)

Thử nghiệm Bile Esculin

• Mục đích: xác định khả năng thủy giải glucoside esculin thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật. • Cơ sở sinh hoá:

• Esculin là hợp chất nhân tạo • Esculetine được phóng thích phản ứng với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đen

Môi trường Bile Esculine Agar 3g 5g 1g 40g 0,5g 15g 1 lít

Beef extract Pepton Esculin Mật bò (Oxgall) Ferric citrate Agar Nước cất

4/01/2013

Esculetine

Phân tử Esculine

4/01/2013

Glucose

Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine

Thử nghiệm Bile Esculin

4/01/2013

Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả BEA (+)

Thử nghiệm Malonate

• Mục đích

Phát hiện các VSV có khả năng sử dụng malonate như nguồn carbon duy nhất

• Cơ sở sinh hoá

Malonate là chất cạnh tranh với succinate Khi VSV phân hủy được malonate thì cũng phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác  tạo thành sp kiềm  làm tăng pH môi trường

4/01/2013

Thử nghiệm Malonate

• Môi trường sử dụng:

Malonate broth (bromothymol blue) 6,0 – 7,6

pH <6,0

pH >7,6

• Dương tính: MT chuyển màu

• Âm tính: MT không đổi màu và

xanh da trời

không sinh khối

(+)

(-)

Đ C

Thử nghiệm catalase

• Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzym catalase. • Cơ sở sinh hoá:

catalase

H2O + O2 (bọt khí)

• Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý • H2O2 (hydrogen peroxide)

4/01/2013

Thử nghiệm catalase

• Thực hiện

• VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn) • Đặt VSV lên lam kính sạch • Nhỏ H2O2 30% • Quan sát sau 1-2 giây

• Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện • Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện

Thử nghiệm catalase

4/01/2013

Thử nghiệm catalase

Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H2O2 30%

Thử nghiệm decarboxylase

• Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác

Cấu trúc của phân tử Amino acid

phân cắt nhóm carboxyl ở một số acid amin

Ba thử nghiệm quan trọng

• Lysine decarboxylase (LDC) • Ornithine decarboxylase (ODC) • Arginine decarboxylase (ADC) / Arginine dehydrolase (ADH) Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng, chỉ được tạo ra khi trong môi trường nuôi cấy có cơ chất tương ứng

4/01/2013

Thử nghiệm decarboxylase

• Cơ sở sinh hoá

• Các sp tạo ra làm tăng pH môi trường  đổi màu chất chỉ thị • Môi trường sử dụng: Decacboxylase Basal Medium chỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8)

pH <5,2

5,2 – 6,8

pH >6,8

4/01/2013

Thử nghiệm decarboxylase

Dương tính: pH môi trường tăng Âm tính: pH giảm

MT trước khi cấy Pứ dương tính Pứ âm tính

THỬ NGHIỆM COAGULASE

• Mục đích: Thử nghiệm khả năng làm đông tụ huyết tương bởi

• Biểu hiện sinh hoá

• Là bước cuối trong định danh các giống Staphylococcus (+): S. aureus • Chủng đối chứng (-): S. epidermidis

• Thử nghiệm tiến hành với huyết tương và fibrinogen.

enzyme coagulase

THỬ NGHIỆM COAGULASE

4/01/2013

Thử nghiệm bằng 2 cách Thử trên phiến kính

Đọc kết quả

Giọt nước

Sinh khối vsv

Huyết tương người

Thử nghiệm trong ống nghiệm:

0,5ml huyết tương

Ủ và đọc kết quả mỗi

0,5ml huyết dịch sinh khối

30 phút

THỬ NGHIỆM COAGULASE

Kết quả thử nghiệm Coagulase

(+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương

(-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhất

4/01/2013

Thử nghiệm Gelatinase • Mục đích: thử nghiệm khả năng phân giải gelatine bởi

• Cơ sở sinh hóa:

gelatinase.

gelatinase polypeptide + acid amin

môi

trường đông đặc

VSV phân hủy gelatine môi trường lỏng

Gelatine Gelatine trong môi trường dinh dưỡng

Thử nghiệm gelatinase

• Đối chứng dương: Aeromonas hydrophila âm: E. coli • Môi trường sử dụng Nutrient Gelatine • Dạng ống nghiệm thạch sâu • Cấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng.

4/01/2013

Thử nghiệm gelatinase

• Đọc kết quả

(+) môi trường tan chảy (-) môi trường không tan chảy

TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA

• Mục đích: thử nghiệm khả năng chuyển hoá glucose theo các con đường khác nhau • Cơ sở sinh hóa:

• Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi trường acid cao • Ôxi hóa: là quá trình hiếu khí

4/01/2013

TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA

• Môi trường sử dụng: Oxidation/Fermentation media (Hugh &

• Chỉ thị pH: bromocresol purple

Leifson media)

pH <5,2

5,2 – 6,8

pH >6,8

TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA

Trực khuẩn gram âm

O (oxidation) Pseudomonas aeruginosa

F (fermentation) Serratia marcescens

Cầu khuẩn gram dương

O (oxidation) Micrococcus luteus

F (fermentation) Staphylococcus aureus

TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA

• Đọc kết quả:

A: đối chứng

B: phản ứng Ôxi hóa

C: phản ứng lên men

Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

• Mục đích: Thử nghiệm khả năng khử nitrate • Cở sở sinh hóa:

4/01/2013

NO2 + sulphanilamine/N-napthylethylenediamine hydrochloride  chất màu hồng

NO3 + bụi kẽm  màu hồng

Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

• Phương pháp tiến hành:

4/01/2013

chứa nitrate

• Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường

nitrite

• Bổ sung chất thử để kiểm tra sự hiện diện của

kẽm nhỏ để định tính nitrate

Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

• Phản ứng định tính nitrite (-) bổ sung lượng

Thử nghiệm oxydase

• Mục tiêu: phát hiện VSV có hệ enzym oxydase (hệ cytochrom C) • Cơ sở sinh hoá

4/01/2013

Thử nghiệm oxydase

• Thuốc thử

• TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p- phenylenediamine • Bảo quản lạnh trong tối • Thời hạn bảo quản: 2 tuần

• Đối chứng (+): Serratia marcescens

(-) : Proteus rettgeri

Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom C ôxi hoá + H2O Cytochrom C ôxi hoá + TMPD khử  TMPD ôxi hoá (màu xanh)

Thử nghiệm oxydase

• Thực hiện:

• Lấy VSV từ Nitrient Agar đặt lên giấy thấm • Nhỏ thuốc thử TMPD • Quan sát sau 30 giây Phản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanh Phản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắng

4/01/2013

Thử nghiệm oxydase

4/01/2013

Thử nghiệm ONPG

• Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme ß-

• Cơ sở sinh hóa: ONPG

galactosidase – enzyme cảm ứng.

Màu vàng

Không màu

o-nitrophenol

Thử nghiệm ONPG

ủ qua đêm

37oC

Lactose agar

Màu vàng

2ml ONPG broth

Pứ (+)

Pứ (-)

Chủng VSV

4/01/2013

Thử nghiệm khả năng tan huyết

• Mục tiêu: phát hiện các vi sinh vật có khả năng làm tan hồng cầu • Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ …

• Cơ sở sinh hoá:

• Các heamolysine là các tác nhân làm tan hồng cầu động vật • Vi sinh vật khác nhau  heamolysine khác nhau  cường độ và biểu hiện tan hồng cầu khác nhau

Thử nghiệm khả năng tan huyết

•Phân loại: 3 kiểu tan huyết

• Tan huyết hoàn toàn (ß): vòng tan huyết trong, rõ • Tan huyết không hoàn toàn (α):xung quanhvà dưới khuẩn lạc chuyển đục và có màu khác • Không tan huyết (ɣ): hoàn toàn không tan huyết

4/01/2013

Thử nghiệm CAMP

• Mục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng hưởng tan huyết giữa các VSV • Cơ sở sinh hóa:

toàn

• Ý nghĩa: dùng phân biệt Streptococcus nhóm B (+) với Streptococcus nhóm khác (-)

Staphylococcus aureus

Streptococcus agalactiae

• S. aureus tiết β-lysin gay tan hồng cầu • VSV tiết cAMP gây tan huyết • β-lysin + cAMP  gây tan huyết mạnh, hoàn

(+)

Streptococcus pyogenes

(-)

4/01/2013

Thử nghiệm tính di động

• Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật. • Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm mao • Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar). • Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát

triển lan ra khỏi vết cấy.

đường cấy, môi trường không bị đục.

• Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh

Thử nghiệm tính di động

(-)

(+)

4/01/2013

Ứng dụng thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV

• Mỗi loài vsv có những đặc tính sinh hóa khác nhau • Thực hiện kiểm tra các thử nghiệm sinh hóa có thể giúp xác định tên loài (định danh) vi sinh vật đó. • Bảng sinh hóa dùng định danh các loài vi sinh vật đường ruột

Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E (bioMerieux, Inc)

4/01/2013

Các phƣơng pháp truyền thống phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật

• Tổng số vi khuẩn hiếu khí Là số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm trên đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa chuẩn. Chỉ tiêu này được dùng để đánh giá mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và sản phẩm. Từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.

• Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử (O2). • Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu

đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng

• Được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm.

• Chỉ số này được xác định bằng phương pháp

4/01/2013

Coliforms và Escherichia coli

spp, Citrobacter spp, Klebsiella spp.

• Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi chung là IMViC

• Coliforms là những trực khuẩn Gram (-) không sinh bào tử hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ, hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt trong ruột người & động vật • Chúng bao gồm: Escherichia coli, Enterobacter

Các Coliforms khác

• Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC trong môi trường canh EC.

 Dùng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm cũng như chỉ thị sự ô nhiễm phân.

• Coliforms phân (Feacal Coliforms hay E.coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indol khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong canh Trypton.

4/01/2013

Staphylococcus aureus

Vi khuẩn Staphylococcus aureus hình cầu, Gram (+), có khả năng sinh nội độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Các tế bào thường liên kết thành các chùm nho, không tạo bào tử, không di động, có khả năng sinh coagulase. S. aureus hiếu khí hay kỵ khí tùy ý có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, saccarose.

S. aureus còn được gọi là tụ cầu khuẩn gây bệnh, do đó cần xác định để biết mẫu sản phẩm thực phẩm phân tích có mang mối nguy hiểm cho người tiêu dùng hay không

Staphylococcus. aureus được xác định trên cơ sở các

đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập

Clostridium

• Clostridium là các vi khuẩn Gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động, có thể thủy phân đường và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng. • Hầu hết nhóm Clostridium đều ưa nhiệt vừa tuy nhiên có một số loài ưa nhiệt và một số loài thuộc nhóm ưa lạnh. Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là C.botulinum và C.perfringens

4/01/2013

Clostridium

• Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphate, ủ ở 37oC trong 1 – 2 ngày. • Nếu nghi ngờ có ưa nhiệt thì ủ thêm ở 50oC. Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S2-) và ion sắt (Fe2+) có trong môi trường.

Salmonella • Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng di động, không tạo bào tử, lên men glucose và manitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indol, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amin từ triptophan, hầu hết đều sinh H2S. • Tăng sinh chọn lọc Salmonella trên các môi trường tăng sinh chọn lọc dùng để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm như: RV (Rappaport Vassiliadis), Tetrathionate Mueler Kauffmann Broth (TT)…

4/01/2013

Salmonella

- Khẳng định: nhằm xác nhận lại sự có mặt của các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập. • Bước này dựa trên các việc sử dụng các phản ứng sinh hóa và thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella như KIA/TSI, Indol, LDC, ODC, urease, lên men manitol, sorbitol,…

• Phân lập: Tách và nhận dạng Salmonella khỏi quần thể các vi sinh vật khác trong mẫu, môi trường giúp nhận dạng Salmonella dựa trên vài đặc tính.

Tổng số nấm men, nấm mốc

• Trong thực phẩm, sự hiện diện của nấm men, nấm mốc có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố hay gây ngộ độc thực phẩm.

• Mật độ nấm mốc, nấm men trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng số nấm mốc, nấm men bằng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol agar (DRBC).

4/01/2013

Các phƣơng pháp phi truyền thống

• Các phương pháp truyền thống có một số nhược điểm như: tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả, mất nhiều công sức, tốn kém…

động được phát triển và thưong mại hóa.

• Để khắc phục, nhiều phương pháp nhanh và tự

• Các phương pháp này được gọi chung là các

phương pháp không truyền thống và có đặc điểm chung là cho kết quả nhanh hơn phương pháp truyền thống. PHƢƠNG PHÁP PHI TRUYỀN THỐNG RA ĐỜI

Phƣơng pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh • Adenosin triphosphate (ATP) được tìm thấy trong tất cả các tế bào sống nên sự phát hiện ATP là dấu hiệu nhận biết vật chất sống đang tồn tại. • ATP có thể được phát hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng.

4/01/2013

Phƣơng pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh

• Kỹ thuật này có thể phát hiện được 1pg (10-12g) tương ứng với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10-15 gATP/tế bào). • Độ nhạy này có được khi sử dụng các hóa chất thương mại đắt tiền, sự phân tích thường chỉ diễn ra vài phút • Vì thế phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận lợi hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạ

Phƣơng pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh

Phản ứng phát sáng sinh học ở đom đóm trải qua hai giai đoạn:

E + LH2 + ATP ↔ E – LH2 AMP + PPi (1) E – LH2 AMP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν (2)

Phản ứng có thể đƣợc viết lại nhƣ sau: E + LH2 + ATP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν + PPi

(E: enzyme Luciferase; LH2: Luciferin)

4/01/2013

Nguyên tắc phản ứng

• Phản ứng phát sáng của đom đóm là có hiệu quả nhất, được biết đến như phản ứng phát sáng sinh học để xác định hàm lượng ATP.

• Phản ứng này đòi hỏi D-Luciferin và ion Mg2+ để hoạt động. Chất dioxetanone thì được hình thành bởi sự tạo phức hợp của luciferase với oxi và phức hợp Mg – ATP.

• Sau đó, ánh sáng vàng - xanh (bước sóng cao nhất là

• Tổng hàm lượng ATP này bao gồm hàm lượng ATP của

562nm) được phát ra.

• Ánh sáng phát ra bởi phản ứng phát sáng được đo bằng các loại máy đo ánh sáng đo được cường độ ánh sáng thấp

eukaryote và của tế bào vi sinh vật.

Nguyên tắc • Nguyên tắc chung của quy trình phát quang sinh học này

• Để biết mật độ vi sinh vật, so sánh trị số ánh sáng đo

như sau: Mẫu được thu bằng cách dùng que bông vô trùng quẹt một diện tích nhỏ nhất định trên bề mặt dụng cụ, thiết bị. Sau đó que bông được cho vào dung dịch trích ly ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng phát sáng. • Gần đây, nhiều hệ thống phát hiện được thiết kế, chế tạo chứa sẵn những hóa chất nằm trong dụng cụ quẹt mẫu bằng tay và sự phát sáng xảy ra ở phía đầu của dụng cụ quẹt mẫu, sau đó dụng cụ này được đặt trong máy đo lượng ánh sáng phát ra.

được với một đường chuẩn tương quan giữa lượng ánh sáng phát ra và mật độ tế bào vi sinh vật đã biết trước

4/01/2013

Phƣơng pháp ELISA (Enzyme – linked ImmunoSorbent Assay)

• ELISA được sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh.

• Những tiến bộ kỹ thuật trong vài thập niên qua đã phát triển của nhiều kỹ thuật ELISA trong chuẩn đoán huyết thanh nhanh nhạy, chính xác các bệnh truyền nhiễm. • Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu.

• Có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính

của kháng nguyên – kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme).

Phƣơng pháp lai phân tử

• Hiện nay nhiều hệ thống đã được thiết lập dựa trên DNA để định lượng vi sinh vật và độc tố.

còn gọi là phương pháp mẫu dò, probes) và phương pháp PCR là được thương mại hóa dưới dạng các bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm

• Tuy nhiên, chỉ có phương pháp lai phân tử (hay

4/01/2013

Phƣơng pháp lai phân tử • Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là phương pháp lai

phân tử.

• Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp các trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường.

yếu tố: • Nồng độ DNA trong môi trường, • Nhiệt độ và thời gian phản ứng, • Kích thước các trình tự lai • Lực ion của môi trường.

• Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều

Phƣơng pháp PCR

• Do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985.

• Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát

• Bước 1: Biến tính DNA ở 94 – 95oC trong 30 – 60 giây. Mạch đôi

DNA tách ra thành dạng mạch đơn.

• Bước 2: Bước Lai: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn, nhiệt độ này khoảng 40 – 70oC, từ 30 – 60 giây.

• Bước 3: Tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường từ 30 giây đến nhiều phút.

hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm…

4/01/2013

Quy trình chung cho việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm bằng PCR • Bước 1: Tăng sinh trên môi trường không hoặc ít chọn lọc

trong thời gian từ 10 – 20 giờ.

• Bước 2: Thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp

sinh khối tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào trong dung dịch TE (10mM Tris – HCl pH= 8,0, 1mM EDTA) với thể tích bằng 1/10 thể tích dịch nuôi cấy ban đầu, xử lý nhiệt ở 100oC trong 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất không tan ức chế phản ứng PCR.

• Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR

• Bước 4: Điện di trên gel agarose 1,5% xem kết quả trên đèn

UV.

Các phƣơng pháp khác

• Ngoài ra còn có một số phương pháp thử nhanh khác

như:

- Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ - Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp - Kỹ thuật màng Petri (petrifilm) - Kỹ thuật Redigel - Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng. - Kỹ thuật đo vi lượng calorie - Kỹ thuật đo mức phóng xạ

4/01/2013

Tài liệu tham khảo

1. Trần Linh Thước – Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm – NXB Giáo dục. 2. Nguyễn Đức Lượng – Vệ sinh an toàn thực phẩm – NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Câu hỏi

1. Vi sinh vật chỉ thị là gì? Ý nghĩa? Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm?

2. Kiểm tra vi sinh vật trong nguyên liệu thực phẩm và thực phẩm?

4/01/2013

Câu hỏi

3. Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm? 4. Các phương pháp định lượng vi sinh vật? 5. Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng? 6. Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật theo phương pháp truyển thống? 7. Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật theo phương pháp không truyền thống?