6. Định lượng gluxit bằng phương pháp sắc ký-điện di
– Phương pháp sắc ký-điện di trên giấy – Phương pháp sắc ký cột – Phương pháp sắc ký khí (GC) – Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 27
CHƯƠNG 4. LIPIT
Mục đích
Trích ly trực tiếp Trích ly sau khi xử lý hóa học
1. Định lượng lipit 1. 2. 2. Nghiên cứu thành phần cơ bản của lipit 1.
Nghiên cứu cấu trúc
– Nghiên cứu triglyxerit bằng HPLC – Nghiên cứu axit béo tại vị trí 2 Phân tích axit béo bằng GC Chất không xà phòng hóa
2. 3.
Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 28
PhD. Vũ Hồng Sơn-ĐHBK
14
3. Nghiên cứu chất lượng lipit 1.
Đo mức độ thủy phân lipit – Trị số axit
4.3.2. Đo mức độ oxy hóa – Trị số peroxyt (PV) – Phản ứng Kreiss – Trị số p-anisidin (p-AnV) – Phản ứng TBA – Phổ hấp thụ tử ngoại – Xác định axit oxy hóa – Phương pháp Rancimat
Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 29
CHƯƠNG 5. PROTEIN
1. Định lượng protein bằng N tổng số Hệ số chuyển đổi từ N tổng đạm tổng
– Protein động vật: 6,25 – Protein thực vật: 5,7 5.1.1. Xác định N amoniac • Vô cơ hóa
Chuyển N hữu cơ thành NH3 (Vô cơ hóa bằng axit H2SO4)
• Chuẩn độ NH3
– Phương pháp Kjeldahl Cất NH3 bằng bộ cất đạm Kjeldahl (NH4)2SO4 + NaOH NH3 + H2O + Na2SO4
Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 30
PhD. Vũ Hồng Sơn-ĐHBK
15
Thu NH3: 2 phương pháp
• Dùng H3BO3 với thuốc thử Taxiro
NH4OH + H3BO3 (NH4)2B4O7 + H2O (màu xanh) Chuẩn tetraborat amon (NH4)2B4O7 + H2SO4 (NH4)2SO4 + H3BO3 (màu tím)
• Dùng H2SO4
NH4OH + H2SO4 (NH4)2SO4 + H2O Chuẩn H2SO4 dư bằng NaOH
– Phương pháp chuẩn độ điện thế
Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 31
+ + OH-
Dùng điện cực amoniac: chứa NH4Cl được ngăn cách với bên ngoài bằng màng kỵ H2O có khả năng cho khí đi qua. Tại điện cực thiết lập cân bằng: NH3 + H2O ↔ NH4 E = Eo + 0,059lg[NH3] Định luật trên đúng khi [NH4 NH4 + NH3 cần tạo pH >11
+] trong khoảng 10-6M-1M. Để toàn bộ
Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 23
PhD. Vũ Hồng Sơn-ĐHBK
16
– Phương pháp so màu • Dùng thuốc thử NESSLER
Thuốc thử Nessler (HgI + KI) + NH4 sóng 389nm
• Phương pháp Berthelot
+ phức màu da cam, hấp thụ ở bước
NH4
• Phản ứng với xalixilat
NH4 + + HOC6H4COOH (với sự có mặt của clo) cho độ nhạy gấp 200 lần phương pháp Berthelot khi có mặt nitroxianat. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi do dễ dàng tự động hóa.
+ + fenat Na + hypoclorit phức màu xanh, hấp thụ cức đại ở 630nm
Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 33
Assay absorption mechanism detection limit advantages
small sample volume, rapid, low cost
UV absorption 280 nm 0.1-100 ug/ml Tyrosine and tryptophan absorption disadvantages incompatible with detergents and denaturating agents, high variability
Bicinchoninic 20-2000 ug/ml 562 nm acid low or no compatibility with reducing agents copper reduction (Cu2+ to Cu1+), BCA reaction with Cu1+ compatible with detergents and denaturating agents, low variability
470 nm 20-2000 ug/ml incompatible with detergents Bradford or Coomassie brilliant blue compatible with reducing agents, rapid
Lowry 750 nm 10-1000 ug/ml high sensitivity and precision incompatible with detergents and reducing agents, long procedure complex formation between Coomassie brilliant blue dye and proteins copper reduction by proteins, Folin-Ciocalteu reduction by the copper-protein complex 34 Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN
PhD. Vũ Hồng Sơn-ĐHBK
17
5.1.2. Phương pháp nhiệt phân (Dumas)
– Nguyên tắc: dựa trên sự tro hóa mẫu vật với ự có mặt của CuO. Cacbon và hydro bị oxy hóa tạo CO2 và H2O. Nito tạo thành N2 và được định lượng bằng detector dẫn nhiệt. Phương pháp này hiện nay đang được sử dụng rộng rãi (TCVN 7598:2007) do ưu điểm thời gian phân tích nhanh (3-5 min), ít gây ô nhiễm môi trường và cho kết quả rất tốt khi so sánh với phương pháp Kjeldahl.
Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 35
Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 36
PhD. Vũ Hồng Sơn-ĐHBK
18
5.1.3. Phương pháp kích hoạt bằng notron
– Cơ sở phương pháp: nito được kích hoạt bằng các hạt notron chuyển động nhanh. Đo bức xạ phát ra khi nguyên tử nito trở về trạng thái cơ bản, từ đó xác định lượng đạm tổng.
N14 + n N13 + 2
Nếu có mặt P hay Si có thể gây ảnh hưởng đến kết quả, tuy nhiên bức xạ của chúng có chu kỳ bán hủy 2-5 min. Do vậy có thể định lượng nito sau đó mà không gặp khó khăn.
5.1.4. Phương pháp kích hoạt bằng proton
N14 + N1 O14 + n O14 + + + N14
Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 37
2. Định tính, định lượng Pr bằng phương pháp hóa học
– Phản ứng Biure – Phản ứng Lowry – Phản ứng Ninhydrin – Chuẩn độ formol – Định lương Pr bằng cách gắn chất màu 3. Định lượng Pr bằng phương pháp vật lý
– Hấp thụ tử ngoại – Phổ huỳnh quang –Hấp thụ hồng ngoại (IR) và cận hồng ngoại (NIR) A (%) = K1AlgR1 + K2AlgR2 +…+ K12AlgR12 + K13A
4. Giá trị dinh dưỡng của protein • Định lượng hóa học • Giá trị sinh học
– Hệ số tiêu hóa Pr – Giá trị sinh học thực của Pr
– Hệ số sử dụng Pr
Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 38
