Bài giảng Phân tích thực phẩm Phần 2: Tài liệu Vũ Hoàng Yến

Chƣơng 4 PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU TRONG THỰC PHẨM

4.1. Xác định độ ẩm

4.1.1. Ý nghĩa c a việc xác định độ ẩm trong thực phẩm

Độ ẩm còn gọi là thủy phần là lƣợng nƣớc tự do trong thực phẩm.

Biết đƣợc độ ẩm là điều quan trọng trong công tác phân tích xác định giá trị dinh dƣỡng và chất lƣợng thực phẩm.

Về phƣơng diện dinh dƣỡng, nếu độ ẩm càng cao, các chất dinh dƣỡng càng thấp. Thí dụ: cùng 100g gạo nếu độ ẩm là 14% thì có 7,6g protide và 1g lipide và 62g glucide. Nếu độ ẩm là 20% thì có 7,0g protide, 0,9g lipide và 70,8g glucide.

Về phƣơng diện xác định chất lƣợng phẩm chất và khả năng bảo quản, nếu độ ẩm vƣợt quá mức tối đa, thực phẩm sẽ mau hỏng. Thí dụ: độ ẩm tối đa của bột là 14%, nếu vƣợt quá 14%, bột sẽ chóng chua.

4.1.2. Một số phƣơng pháp xác định độ ẩm

Có nhiều phƣơng pháp xác định độ ẩm thực phẩm, ngƣời ta thƣờng sử dụng các phƣơng pháp sau:

+ Phƣơng pháp sấy đến khối lƣợng không đổi.

+ Phƣơng pháp chƣng cất với dung môi.

+ Phƣơng pháp sử dụng khúc xạ kế.

+ Các phƣơng pháp hiện đại (xác định hàm lƣợng nƣớc tự do dƣới dạng vết)

4.1.2.1. Định lƣợng độ ẩm bằng phƣơng pháp sấy đến khối lƣợng không đổi

a. Nguyên tắc

Dùng sức nóng làm bay hơi hết nƣớc trong thực phẩm. Cân trọng lƣợng thực phẩm trƣớc và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nƣớc có trong thực phẩm.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho các loại thực phẩm dạng bột, dạng rắn trừ các loại

thực phẩm lỏng, bột gia vị, hƣơng liệu và các thực phẩm có độ ẩm  3%.

Tài liệu trích dẫn: TCVN 7035 : 2002

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Chén sấy  Tủ sấy điều chỉnh đƣợc nhiệt độ trong khoảng 100 – 105oC  Cân phân tích chính xác 0,0001g  Cát đã xử lý hoặc Na2SO4 khan.  Cách xử lý cát:

+ Đổ cát qua rây có lỗ đƣờng kính 4 – 5mm. Rửa bằng nƣớc máy,

+ Sau đó rửa bằng acid HCl (một phần HCl cho một phần cát): đổ acid vào cát rồi khuấy. Để qua một đêm sau đó rửa cát bằng nƣớc máy cho đến khi hết acid (thử bằng giấy quỳ)

+ Rửa lại bằng nƣớc cất, sấy khô, cho qua rây có lỗ đƣờng kính 1- 1,5mm. + Đem nung ở nhiệt độ 550 -600oC để loại chất hữu cơ, giữ trong lọ sạch dùng dần.

c. Cách tiến hành

Lấy một cốc thủy tinh có đựng 10-30g cát sạch và một đũa thủy tinh dẹt đầu đem sấy ở 100-1050C đến trọng lƣợng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác đến 0,0001g.

Sau đó cho vào cốc cân khoảng 10g chất thử đã chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ. Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác nhƣ trên.

Dùng que thủy tinh trộn đều chất thử với cát. Dàn đều thành lớp mỏng. Cho tất cả vào tủ sấy 100-1050C sấy khô cho đến trọng lƣợng không đổi, thƣờng tối thiểu là trong 6 giờ. Trong thời gian sấy, cứ sau 1 giờ lại dùng đũa thủy tinh dẹp đầu nghiền nhỏ các phần vón cục, sau đó lại dàn đều và tiếp tục sấy.

Sấy xong, đem làm nguội ở bình hút ẩm trong 30 phút và đem cân ở cân phân tích với độ chính xác nhƣ trên.

Cho lại vào tủ sấy 100-1050C trong 30 phút. Lấy ra, để nguội ở bình hút ẩm và cân nhƣ trên cho tới trọng lƣợng không đổi. Kết quả giữa hai lần cân liên tiếp không đƣợc cách nhau quá 0,5mg cho mỗi gam chất thử.

d. Tính kết quả

Độ ẩm theo phần trăm tính theo công thức:

( )

G: trọng lƣợng của cốc cân, cát và đũa thủy tinh (g)

G1: trọng lƣợng của cốc cân, cát, đũa thủy tinh và trọng lƣợng mẫu thử trƣớc khi sấy (g)

G2: trọng lƣợng của cốc cân, cát, đũa thủy tinh và trọng lƣợng mẫu sau khi sấy tới khối lƣợng không đổi (g)

Sai lệch giữa 2 lần xác định song song không đƣợc lớn hơn 0,5%, kết quả cuối cùng là trung bình cộng của kết quả 2 lần xác định song song, tính chính xác đến 0,01%.

Chú ý:

 Trong trƣờng hợp qui định trƣớc, có thể sử dụng phƣơng pháp sấy khô ở 1300C trong 2 giờ hoặc phƣơng pháp sấy chân không ở nhiệt độ thấp (600C).  Trƣờng hợp không có cốc thủy tinh có nắp kín, có thể dùng kim loại (nhôm) hay chén sứ.

 Trƣờng hợp mẫu bột mịn, mẫu lỏng có thể không sử dụng cát. Thực phẩm dạng đặc, sền sệt nhƣ bơ, magarin, pate, xúc xích… sử dụng cát trộn thực phẩm làm cho thực phẩm rời rạc, không đóng vón tăng diện tích tiếp xúc nhiệt d bốc hơi nƣớc.

Nhƣợc điểm:

 Phƣơng pháp sấy khô có thể cho những kết quả sai số làm tăng độ ẩm do khi sấy, các chất bay hơi (nhƣ tinh dầu, cồn, acid… bay hơi) cũng bay hơi với nƣớc hoặc bị phân giải thành furfurol, amoniac, khi sấy các thực phẩm chứa nhiều đƣờng, đạm làm giảm tỉ lệ thủy phần.

 Cũng có thể cho những kết quả sai số do một số thành phần bị oxy hóa khi gặp không khí ở nhiệt độ cao (thí dụ thực phẩm có nhiều chất béo).

4.1.2.2. Xác định độ ẩm bằng phƣơng pháp chƣng cất với dung môi

a. Nguyên tắc

Dùng dung môi hữu cơ thích hợp để chƣng cất lôi cuốn theo nƣớc trong thực phẩm. Dung môi và nƣớc ngƣng tụ trong một ống đong có khắc vạch thành hai lớp riêng biệt. Đọc thể tích nƣớc lắng ở phía dƣới, từ đó tính ra đƣợc độ ẩm của mẫu thực phẩm.

Phạm vi áp dụng: Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng để xác định độ ẩm thực phẩm có chứa nhiều chất d bay hơi hoặc chứa nhiều chất béo.

Tài liệu trích dẫn: TCVN 7040:2002

Yêu cầu dung môi:

– Có nhiệt độ sôi cao hơn nƣớc một ít, khi dung môi bay hơi sẽ kéo theo nƣớc

trong thực phẩm

– Không tan trong nƣớc, dung môi và nƣớc sẽ tách thành hai lớp riêng biệt khi

đo trong ống đong

– Nhẹ hơn nƣớc, lớp nƣớc ở dƣới lớp dung môi ở trong ống đong Dung môi thƣờng sử dụng là toluen tinh khiết nhiệt độ sôi 110oC hoặc xylen

nhiệt độ sôi 138 -144oC.

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

– Bộ cất xác định độ ẩm (chú ý những bộ phận trong máy cất lắp ráp với nhau bằng những mối nối nhám, không nên dùng nút cao su vì cao su d hòa tan trong các dung môi hữu cơ).

– Cân kỹ thuật chính xác 0,01g.

– Chén cân

– Cối chày sứ

– Đũa thủy tinh mảnh

– Bi thủy tinh hoặc đá bọt

Hình 4.1. Bộ xác định độ ẩm bằng dung môi hữu cơ

c. Cách tiến hành

– Tùy theo độ ẩm của mẫu thử cân khoảng 5 -10g thực phẩm (để có thể giải phóng khoảng 2 -3ml nƣớc) trong chén cân khô, bằng cân kỹ thuật với độ chính xác 0,01g.

– Cho mẫu thực phẩm vào bình cầu đã chứa sẵn khoảng 50ml toluen. Tráng chén cân hai lần bằng toluen, cho toluen tráng vào bình cầu. Thêm toluen đến khoảng 100 -150ml, cho them vài viên bi thủy tinh hoặc đá bọt.

– Lắp máy cất, mở nƣớc vào ống sinh hàn. Đun nóng bình sao cho toluen sôi mạnh, bốc hơi, kéo theo phần nƣớc có trong mẫu thử và ngƣng tụ với nƣớc trong ống đong có khắc vạch. Tiếp trục đun cho đến khi mực nƣớc trong ống đo không thay đổi. Nếu có những giọt nƣớc đọng lại trên thành ống, dung một đũa thủy tinh mảnh đƣa giọt nƣớc xuống.

– Trong ống đo, nƣớc và toluen chia làm hai phần rõ rệt, nƣớc ở phía dƣới và

toluene ở phía trên. Sau khi để nguội đọc thể tích nƣớc trong ống đo.

d. Tính kết quả

Độ ẩm theo phần trăm tính bằng công thức:

N: trọng lƣợng nƣớc trong ống đong (suy ra từ thể tích đọc đƣợc), g

G: trọng lƣợng mẫu, g

Ghi chú:

– Vì thể tích và trọng lƣợng nƣớc gần bằng nhau nên có thể coi số gam nƣớc

cũng tƣơng đƣơng với số ml nƣớc.

– Trong trƣờng hợp toluen và xylen có lẫn nƣớc lắp máy và đun cất dung môi (không có mẫu thử) cho đến khi lƣợng nƣớc trong ống đo không đổi. Để nguội và đọc thể tích nƣớc trong ống đo và sau đó cho mẫu thử vào dung môi và tiếp tục tiến hành nhƣ trên.

– Thể tích nƣớc lần cuối phải trừ đi thể tích nƣớc có trong dung môi, trƣớc khi

tính kết quả

– Đối với thực phẩm hòa tan trong dung môi nhƣ dầu, mỡ, những thực phẩm nhẹ hơn dung môi, khi sôi, nổi ở phía trên nhƣ bột, những thực phẩm đun sôi lâu không bị phá hủy nhƣ khoai, ngô v.v… cách làm nhƣ trên sẽ không trở ngại gì.

– Đối với thực phẩm nhƣ mứt mật, siro, phomat v.v… có thể dính vào thành bình cầu, khi đun sôi sẽ bị cacbon hóa, phải chú ý cho thêm vào bình cầu 30 - 40g cát sạch một phần cát trộn đều vào thực phẩm thành một khối rỗng vừa không dính vào thành bình, vừa làm thực phẩm rời rạc không đóng vón với nhau để d bốc hơi nƣớc, một phần cát lắng xuống đáy làm lửa không đốt cháy trực tiếp thực phẩm.

4.1.2.3. Xác định độ ẩm bằng phƣơng pháp sử dụng khúc xạ kế

a. Nguyên tắc

Khi đi từ một môi trƣờng này (không khí) vào một môi trƣờng khác (chất lỏng), ánh sáng sẽ bị lệch đi (khúc xạ). Nếu chất lỏng là một dung dịch chất hoà tan (dung dịch đƣờng, muối…) thì ta có thể xác định đƣợc nông độ của chất hoà tan dựa trên độ khúc xạ của ánh sang, từ đó tính ra hàm lƣợng của nƣớc (độ ẩm) có trong thực phẩm.

Phạm vi áp dụng: Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc ứng dụng để xác định hàm lƣợng chất khô trong các thực phẩm dạng lỏng gồm một chất đồng nhất nhƣ đƣờng, muối… hoà tan trong nƣớc. Ví dụ: siro, nƣớc rau quả...

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Chén sứ  Đũa thuỷ tinh đầu tròn  Vải gạc  Bông hút ẩm hay giấy mềm thấm nƣớc  Cát sạch  Khúc xạ kế  Cân kỹ thuật chính xác đến 0,01g

c. Cách tiến hành

Bƣ c 1: Chuẩn bị mẫu thử

 Nếu mẫu ở dạng dung dịch đồng nhất, trong và màu nhạt thì không cần thực

hiện bƣớc này.

 Nếu mẫu thử không thể ép thành giọt hay có màu sẫm thì chuẩn bị mẫu thử

nhƣ sau: + Cân khoảng 5  20g mẫu chính xác đến 0,01g cho vào chén sứ, (g) + Thêm 4g cát sạch vào một lƣợng nƣớc cất bằng lƣợng chất thử đã cân, (g) + Nghiền nhanh và cẩn thận bằng chày sứ + Lọc qua vải gạc và lấy ngay giọt thứ ba hay thứ tƣ để thử

Bƣ c 2: Ti n hành đo trên khúc xạ k

Nhỏ trực tiếp hay dùng đũa thuỷ tinh đƣa một giọt chất thử vào giữa mặt phẳng của lăng kính. Áp hai lăng kính (một mờ, một đục) với nhau. Dịch chuyển thị kính để tìm đƣờng phân chia rõ nhất giữa nửa tối và nửa sang của trƣờng quan sát. Điều chỉnh đƣờng phân chia sao cho trùng với đƣờng chấm chấm hay tâm của vòng tròn quan sát.

Đọc kết quả trên thang đo ở phía có ghi hàm lƣợng chất khô theo phần trăm, a20 (%)

d. Tính toán kết quả

Độ ẩm tính bằng phần trăm theo công thức:

X(%) = 100 - Y

Y: hàm lƣợng chất khô (%), đƣợc tính nhƣ sau:

+ Nếu không pha thêm nƣớc cất thì Y= a20 + Nếu pha thêm nƣớc cất thì Y= 2a20 Với Y là số đo đọc đƣợc trên khúc xạ kế ở 20oC (%).

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai kết quả thử song song, tính chính xác đến 0,1%. Chênh lệch kết quả giữa hai lần thử song song không đƣợc lớn hơn 0,3%.

Chú ý:

 Phải đọc số đo trên khúc xạ kế nhanh để tránh hiện tƣợng bốc hơi làm sai lệch kết quả.

 Sau mỗi lần đọc, lau lăng kính với bông thấm nƣớc ƣớt, rồi lau lại bằng bông khô.

 Có thể thử và đọc kết quả ở nhiệt độ thƣờng rồi hiệu chỉnh về nhiệt độ tiêu chuẩn 20oC theo bảng kèm theo máy, hay bằng cách điều chỉnh sau đây:

a20 = aT + (T-20).0,07 aT:là số đo đọc đƣợc trên khúc xạ kế ở T0C (%) T: là nhiệt độ khi đo bằng khúc xạ kế (0C)

4.1.2.4. Phƣơng pháp đo độ ẩm dựa trên sự mất màu của Iod (phƣơng pháp Fisher)

a. Nguyên tắc

Ở nhiệt độ thƣờng, Iod tác dụng với SO2 và H2O thành HI không màu theo phản ứng:

I2 + SO2 + 2H2O = 2HI + H2SO4 Từ sự mất màu của iod có thể tính ra phần trăm nƣớc có trong thực phẩm. Phản ứng trên là phả ứng thuận nghịch. Muốn cho phản ứng theo một chiều Fisher tiến hành trên môi trƣờng có piridin.

Phạm vi áp dụng: Phƣơng pháp này có thể xác định tới vết nƣớc (lƣợng nƣớc rất nhỏ trong thực phẩm) và nếu sử dụng một loại máy đo có thể định lƣợng độ ẩm hàng loạt trong công nghiệp thực phẩm.

Ứng dụng nguyên lý này có máy đo ẩm tự động theo phƣơng pháp Fisher.

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Thuốc thử Fisher (10 mol piridin, 3 mol SO2, 1 mol iod pha trong 5 lít

methanol)  Methanol  n-butanol  Máy đo độ ẩm tự động theo phƣơng pháp Fisher  Cân phân tích

c. Cách tiến hành

Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu thử

Nếu mẫu thử là chất lỏng có thể định lƣợng thẳng.

Nếu mẫu thử là chất rắn, chất đặc phải chiết suất bằng n-butanol và chuẩn độ trên dịch chiết.

Bƣớc 2: Pha loãng thuốc thử Fisher

Cách pha loãng: Pha loãng thuốc thử Fisher theo tỉ lệ sau:

Thuốc thử Fisher: methanol: n-butanol = 1:3:5

Cho thuốc thử Fisher sau khi đã pha loãng vào máy đo với piridin và mẫu thử sau khi đƣợc trộn lẫn với nhau ở bộ phận trộn và làm phản ứng với iod, nếu có nƣớc trong mẫu thử, dung dịch nhạt màu đƣợc đƣa vào đo ở sắc kế. Đồng thời xây dựng biểu đồ mẫu làm với thuốc thử chứa nƣớc theo tỷ lệ: 0%, 25%, 50%, 75%, 100% nƣớc.

d. Tính kết quả

Kết quả đƣợc ghi tự động trên biểu đồ, đồng thời so sánh biểu đồ mẫu làm với thuốc thử chứa 0%, 25%, 50%, 75%, 100% nƣớc.

Chú thích:

 Nếu không có máy đo tự động, có thể dùng phƣơng pháp so màu với thang mẫu.

 Phƣơng pháp chính xác với những mẫu chứa một lƣợng nƣớc rất thấp, có thể định lƣợng nhanh và xác định đƣợc hàng loạt.

Trong thực tế ở các nhà máy sản xuất thực phẩm thƣờng sử dụng các máy đo độ

ẩm nhanh.

Hình 4.2. Một số thi t bị xác định độ ẩm nhanh thƣờng dùng trong các nhà máy

4.2. Xác định hàm lƣợng muối khoáng

4.2.1. Ý nghĩa c a việc xác định hàm lƣợng muối khoáng

Tro là thành phần còn lại của thực phẩm sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ. Tro thật sự chỉ gồm các loại muối khoáng có trong thực phẩm (do đó, tro còn đƣợc gọi là tổng số muối khoáng). Trong trƣờng hợp thực phẩm có lẫn các chất bẩn (đất, cát) muốn có tro thật sự phải loại trừ đi đất cát và những chất không phải là muối khoáng mà lại không nung cháy ở nhiệt độ qui định.

Đối với thực phẩm có chứa đƣờng, độ tro đƣợc biểu thị bằng “độ tro dƣới dạng sulfate” (gọi tắt là tro sulfate). Muốn có độ tro thật sự hay tổng số muối khoáng, ta lấy tro sulfate nhân với 0,9.

4.2.2. Xác định tro tổng

a. Nguyên tắc

Dùng sức nóng (550-6000C) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại

đem cân và tính ra % tro có trong thực phẩm

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm.

Tài liệu trích dẫn: AOAC 945.38 và 923.03; TCVN 5155-90

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Chén nung bằng sứ hoặc bằng kim loại (kền, bạch kim)  Đèn cồn và bếp điện  Lò nung điều chỉnh đƣợc nhiệt độ (500 -600oC)  Cân phân tích, chính xác đến 0,0001g  Bình hút ẩm, phía dƣới có chất hút ẩm

c. Cách tiến hành Nung chén sứ hoặc chén kim loại đã rửa sạch ở lò nung tới 550-6000C đến trọng lƣợng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm, và cân ở cân phân tích chính xác đến 0,0001g.

Cho vào chén khoảng 5g chất thử. Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác nhƣ trên. Cho tất cả vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 550-6000C. Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại bỏ hết các chất hữu cơ thƣờng mất khoảng 6-7 giờ.

Trƣờng hợp còn tro đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O210% hoặc HNO3 đậm đặc và nung lại cho đến tro trắng. Để nguội trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác nhƣ trên. Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân cho tới trọng lƣợng không đổi. Kết quả giữa 2 lần nung và cân liên tiếp không đƣợc cách nhau quá 0,5mg cho 1g mẫu thử.

d. Tính kết quả

Hàm lƣợng tro theo % (X) tính theo công thức:

( ) ( )

G: trọng lƣợng của chén (g)

G1: trọng lƣợng của chén và trọng lƣợng mẫu thử trƣớc khi nung (g) G2: trọng lƣợng của chén và trọng lƣợng mẫu thử sau khi nung và cân tới trọng lƣợng không đổi (g)

Chú ý:

 Trƣờng hợp thực phẩm d bốc cháy nhƣ đƣờng, mỡ…đốt trên đèn cồn hay bếp điện cho đến khi thành than đen không bốc cháy nữa mới cho vào lò nung. Nếu thực phẩm lỏng, cô khô trên ngọn lửa trƣớc khi nung.

 Mẫu nhiều béo có thể chiết béo sơ bộ với các dung môi hữu cơ hòa tan béo  Khi chén nung còn nóng để vào bình hút ẩm, nhớ để nắp hé mở lúc đầu hoặc mở vòi không khí trên nắp bình hút ẩm tránh không khí nóng nở ra đẩy bật làm vỡ nắp bình.

4.2.3. Xác định tro không tan trong HCl

a. Nguyên tắc

Những chất bẩn (đất, cát,…) lẫn vào thực phẩm là một chất không hoà tan trong HCl. Sau khi lọc phần không hòa tan trong HCl đƣợc rửa sạch, nung và cân, từ đó tính ra phần trăm chất bẩn.

Tài liệu trích dẫn: TCVN 5253-90

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Chén nung bằng sứ hoặc bằng kim loại (kền, bạch kim)  Giấy lọc không tro  Dung dịch HCl 4N  Bếp điện, đèn cồn  Nồi cách thủy sôi  Lò nung điều chỉnh đƣợc nhiệt độ (500 - 600oC)  Cân phân tích, chính xác đến 0,0001g  Bình hút ẩm, phía dƣới có chất hút ẩm

c. Cách tiến hành

Tiến hành tro hóa giống phần 4.2.2.

Hoà tan tro toàn phần vào HCl 4N. Đun nóng ở nồi cách thủy sôi trong 15 phút. Thành phần không tan đƣợc lọc trên giấy lọc không tro. Rửa kỹ với nƣớc cất sôi cho đến khi nƣớc lọc không còn chứa Cl-(lấy hai giọt nƣớc lọc thử với 2 giọt HNO3 đậm đặc và một giọt AgNO3 0,1N không thấy kết tủa). Cho giấy lọc và tro không tan trong HCl vào chén sứ đã nung khô và cân, đem sấy khô toàn bộ trong tủ sấy ở 100 –1050C rồi cho vào lò nung 550- 6000C trong 30 phút. Lấy ra để nguội và cân.

d. Tính kết quả

Hàm lƣợng (%) tro không tan trong HCl đƣợc tính theo công thức sau: m1: là khối lƣợng chén nung và tro không tan trong HCl sau khi nung (g) m2: là khối lƣợng chén nung (g) m: là khối lƣợng mẫu (g)

4.2.4. Xác định hàm lƣợng muối ăn

Muối ăn còn đƣợc gọi là NaCl có dƣới thể tự nhiên trong thức ăn, hoặc đƣợc cho thêm vào với mục đích tăng gia vị hay bảo quản. Dù ở dƣới thể tự nhiên hay thêm vào, muối ăn cũng là thành phần khoáng trong thực phẩm, hay nói rộng hơn, là một thành phần của tro.

Có 2 phƣơng pháp xác định hàm lƣợng NaCl:

 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng NaCl trực tiếp (phƣơng pháp Mohr)

 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng NaCl gián tiếp (phƣơng pháp Volhard)

4.2.4.1.Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng NaCl trực tiếp (phƣơng pháp Mohr)

a. Nguyên tắc Dựa vào khả năng phản ứng của ion Ag+ với ion Cl- tạo thành AgCl kết tủa màu 2- tạo thành Ag2CrO4 màu đỏ gạch để tiến hành xác định trắng và ion Ag+ với ion CrO4 lƣợng NaCl.

Phƣơng trình phản ứng:

NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 Cho dung dịch chuẩn AgNO3 vào dung dịch trung tính chứa NaCl, khi NaCl trong dung dịch đã kết hợp hết với AgNO3, một giọt AgNO3 dƣ sẽ kết hợp với K2CrO4 cho kết tủa đỏ gạch (quá trình xác định kết thúc)

2AgNO3 + K2CrO4 Ag2CrO4 + 2KNO3 Từ lƣợng AgNO3 ta tính đƣợc lƣợng NaCl. Phản ứng này thực hiện tốt trong môi trƣờng trung tính.

Vì nếu môi trƣờng kiềm thì một lƣợng ion Ag+ sẽ bị hao đi do phản ứng:

2-.

2Ag+ + 2OH- = 2AgOH = Ag2O + H2O

2- thành ion bicromat Cr2O7

2- + H2O

Nếu môi trƣờng axit thì có sự chuyển từ CrO4

2- + 2H+ Cr2O7 Kết tủa sẽ không phải là Ag2CrO4 màu đỏ gạch mà là Ag2CrO7 màu vàng rất khó

2CrO4

2-, S2-... thì cũng tạo thành các kết tủa với ion

phát hiện điểm tƣơng đƣơng. Do đó kết quả sẽ thiếu chính xác.

Nếu trong dung dịch có ion CO3 Ag+ làm sai số.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm.

Tài liệu trích dẫn: TCVN 3701-90

b. Dụng cụ - Hóa chất - Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Dung dịch AgNO3 0,1N bảo quản trong chai nâu  Dung dịch K2CrO4 10% sử dụng sau khi pha 24h  Dung dịch NaHCO3 0,01N  Dung dịch phenolphtalein 1%  Dung dịch acid acetic 0,01N  Dung dịch paranitrophenol 0,05%  Giấy quỳ

c. Cách tiến hành

Bƣ c 1: Chuẩn bị mẫu

Tùy theo loại thực phẩm có nhiều muối hay ít, mà định lƣợng cách pha loãng:

 Đối với thực phẩm lỏng, ví dụ nhƣ nƣớc mắm, phải pha loãng, sau đó đem đi

chuẩn độ

 Đối với thực phẩm đặc: cắt nhỏ hay xay nhỏ, lắc với nƣớc nóng khoảng 1-2 giờ. Lọc và chuẩn độ.

 Đối với thực phẩm khó chiết xuất, thì nung thành tro trắng, hòa tan trong nƣớc cất và chuẩn độ.

 Trƣờng hợp những dung dịch đục, ví dụ sữa, khử tạp chất bằng dung dịch chì axetat, lọc và chuẩn độ.

Bƣ c 2: Pha loãng mẫu

 Lấy V(ml) dung dịch đã chuẩn bị ở bƣớc 1 cho vào bình định mức  Thêm nƣớc cất gần đến vạch định mức.  Kiểm tra dung dịch trong bình định mức có trung tính hay không, nếu không phải trung hòa. Dùng giấy quỳ để kiểm tra môi trƣờng của dung dich trƣớc khi tiến hành chuẩn độ. Nếu dung dịch acid thì cho CaCO3 kết tinh hay dung dịch bicacbonat natri 0,01N với chỉ thị màu phenolphtalein 1% cho đến khi có phản ứng trung tính, dung dịch từ không màu chuyển sang màu hồng nhạt. Nếu dung dịch kiềm cho HNO3 loãng từng giọt hoặc dung dịch axit acetic 0,01N với chỉ thị màu paranitrophenol 0,05% cho đến khi acid nhẹ, dung dịch từ màu vàng chuyển sang không màu, rồi trung hòa lại bằng CaCO3 hoặc bicacbonat natri 0,01N.

 Định mức đến vạch bằng nƣớc cất. Lắc đều.

Bƣ c 3: Chuẩn độ

 Dùng pipet hút 10ml dung dịch đã chuẩn bị ở bƣớc 2 cho vào bình tam giác,

đun sôi để loại CO2 và H2S nếu có.

 Thêm vào vài giọt K2CrO4 10% rồi từ buret chứa dung dịch AgNO3 0,1N ta nhỏ xuống từ từ, vừa nhỏ vừa lắc để tránh hiện tƣợng cộng kết. Trong khi AgCl kết tủa màu trắng thì cũng có Ag2CrO4 kết tủa màu đỏ gạch nhƣng khi lắc màu đỏ gạch tan đi. Chuẩn độ cho đến khi hết ion Cl- thì màu đỏ gạch Ag2CrO4 mới bền vững. Lắc đều, nếu sau 1 phút mà màu đỏ không mất đi là đƣợc.

 Ghi thể tích AgNO3 0,1N tiêu tốn (ml)  Tiến hành chuẩn độ không ít hơn 3 lần.

2- tạo thành Ag2CrO4 nên muốn đạt đƣợc độ chính xác cao hơn thì sau khi thí nghiệm ta trừ đi 0,05 – 0,08 ml dung dịch AgNO3 0,1N. Độ mặn tính bằng NaCl chứa trong thực phẩm tính bằng công thức sau:

d. Tính kết quả Vì lƣợng ion Ag+ đã dùng để phản ứng với ion CrO4

⁄ ( ) đ

V1: thể tích AgNO3 0,1N tiêu hao khi chuẩn độ (ml)

V2: thể tích dung dịch đem đi chuẩn độ (ml) V: thể tích mẫu thực phẩm (ml)

Vđm: thể tích bình định mức (ml) 0,00585 là số gam NaCl tƣơng đƣơng với 1ml dung dịch AgNO3 0,1N. Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai kết quả thử song song, tính chính xác đến 0,1g/l.

Chú ý: – Dung dịch thử không đƣợc chứa các halogenua, Ba2+ và Sr2+ vì K2CrO4 cũng cho tủa màu với các muối này.

– Phải chuẩn độ ở nhiệt độ thƣờng vì Ag2CrO4 hơi tan khi nóng – Phải tránh ánh sáng mặt trời mạnh để khỏi bị đen (do Ag2CrO4 bị khử thành

Ag)

4.2.4.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng NaCl gián tiếp (phƣơng pháp Volhard) a. Nguyên tắc Áp dụng hai phản ứng liên tiếp:

(1) NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3

(2) AgNO3 + KSCN  AgSCN + KNO3

Cho vào dung dịch NaCl một lƣợng thừa AgNO3, NaCl sẽ kết tủa dƣới dạng AgCl (phản ứng 1). AgNO3 thừa sẽ đƣợc chuẩn độ bằng KSCN (phản ứng 2) và một giọt dƣ KSCN sẽ kết hợp với ion Fe(III) trong phèn sắt amoni (chỉ thị màu) thành Fe(SCN)3 màu đỏ máu.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các thực phẩm. Tài liệu trích dẫn: TCVN 4836-1:2009 b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị  Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Dung dịch HNO3 5% trong nƣớc cất  Dung dịch HNO3 6N trong nƣớc cất  Dung dịch kali feroxyanua  Dung dịch kẽm acetat  Dung dich KOH 1N  Dung dịch H2O2 10%  Dung dịch KMnO4 bão hòa  Dung dịch AgNO3 0,1N  Dung dịch KSCN 0,1N  Dung dịch phèn sắt amoni ((NH4)2SO4.Fe2(SO4)3.2H2O bão hòa (khoảng 40%)

 Giấy lọc không tro c. Cách tiến hành Bƣ c 1: Chuẩn bị mẫu thử

Có thể định lƣợng NaCl trên tro hoặc trên ngay mẫu thử:

 Chuẩn bị mẫu thử trên tro: Nung 5g mẫu thử trong 1 giờ ở 2200C. Chiết suất tro nhiều lần bằng dung dịch HNO3 2%, đinh mức tới vạch 100ml. Lọc trên giấy lọc không tro. Lấy 10ml dịch lọc, định lƣợng bằng phƣơng pháp gián tiếp

 Chuẩn bị mẫu thử trên thực phẩm:

+ Thực phẩm chứa ít chất béo (dƣới 5%): Lắc trong 10 phút 5g thực phẩm nghiền nát với 200ml HNO3 4% ấm. Trung hòa bằng KOH 1N. Khử tạp bằng 5ml dung dịch kali feroxyanua và 5ml dung dịch kẽm acetat. Cho nƣớc cất cho vừa dủ 250ml. Lắc đều và lọc qua giấy lọc. Lấy 20-25ml dịch lọc và định lƣợng bằng phƣơng pháp gián tiếp. + Thực phẩm chứa nhiều chất béo (trên 5%):

 Cho vào bình tam giác 200ml, một lƣợng thƣc phẩm chứa khoảng 50g NaCl, với 20ml KOH 1N. Đun trên nồi cách thủy sôi 1h30 phút cho đến khi chất béo đƣợc xà phòng hóa hết và nổi lên trên mặt.

 Để nguội, chuyển vào bình định mức 100ml, rửa bình nón nhiều lần bằng nƣớc cất, định mức tới vạch 100ml. Lọc.

 Lấy 10ml dịch lọc, cho thêm vào hai giọt dung dịch metyl da cam 0,5% và trung hòa bằng HNO3 6N. Định lƣợng bằng phƣơng pháp gián tiếp. Làm song song một mẫu trắng. + Thực phẩm chứa nhiều đạm động vật:

 Cho vào bình tam giác dung tích 250ml một lƣợng thực phẩm chƣa khoảng 50g NaCl, một ít nƣớc cất có chứa HNO3 nhào đều. Cho thêm 10ml HNO3 đậm đặc và 20ml AgNO3 0,1N. Đun sôi và nhỏ từng giọt dung dịch KMnO4 bão hòa cho đến khi không mất màu nữa.

 Làm mất màu KMnO4 thừa bằng vài giọt NaNO3 60% hay H2O2 10%. Để nguội và định lƣợng AgNO3 dƣ bằng KSCN.

Bƣ c 2: Ti n hành thử

 Lấy một lƣợng nhất định mẫu thử đã chuẩn bị cho vào bình định mức 200ml, thêm 20ml HNO3 5% và 20ml AgNO3 0,1N lắc đều. Cho nƣớc vừa đủ 200ml. Lắc đều và để vào nơi tối cho tủa AgCl tập hợp lại. Lọc.

 Lấy 100ml dịch lọc trong, cho thêm 5ml phèn sắt amoni và định lƣợng AgNO3

thừa bằng dung dịch KSCN 0,1N cho đến màu hồng gạch.  Làm một mẫu trắng với nƣớc cất không có chứa halogenua.

d. Tính kết quả

Hàm lƣợng muối ăn NaCl theo phần trăm tính bằng công thức sau:

( )

N: số ml KSCN 0,1N sử dụng để định lƣợng mẫu trắng

n: số ml KSCN 0,1N sử dụng để định lƣợng AgNO3 dƣ trong mẫu thử P: trọng lƣợng mẫu thử tính bằng gam sau khi tính toán độ pha loãng

Chú ý:

 Phƣơng pháp định lƣợng gián tiếp phải tiến hành ở mộ trƣờng acid (HNO3 hoặc H2SO4).

 Muốn có kết quả chính xác, cần phải làm kết tủa AgCl (có thể cho thêm một ít ether để AgCl kết tủa nhanh hơn) hoặc lọc bỏ kết tủa AgCl vì Fe(SCN)3 (chỉ lúc phản ứng kết thúc) bị phân hủy một phần do tác dụng với AgCl ở dạng huyền phù theo phản ứng:

Fe(SCN)3 + 3AgCl  3AgSCN + FeCl3

Phản ứng trên sẽ làm mất màu Fe(SCN)3 và kết quả sẽ sai sai số thiếu.

4.2.5. Định lƣợng Fe bằng phƣơng pháp UV-VIS v i thuốc thử 1,10- phenaltroline

a. Nguyên tắc

Fe(II) trong dung dịch, kết hợp với 1,10-phenaltroline thành một phức chất màu cam đỏ bền trong môi trƣờng pH 3-9. Nếu muốn màu này không bị ảnh hƣởng của thuốc thử dƣ và có mặt của các ion khác, phản ứng cần tiến hành ở pH 3,5-4,5.

Phức chất này gồm 3 phân tử 1,10-phenaltroline kết hợp với 1 ion Fe(II). Phản ứng đặc hiệu cho Fe(II) nên phải chuyển hết Fe(III) về Fe(II) bằng cách khử với hydroquinon hay hydroxylamin clohydric.

2NH2OH + 4Fe3+ N2O + 4Fe2+ + 4H+ + H2O

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm.

Tài liệu trích dẫn: TCVN 6270:1997

b. Dụng cụ – Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Dung dịch hydroxylamine clohydric 1%  Dung dịch đệm pH 4,0  Dung dịch 1,10-phenalthroline 0,1%  Dung dịch HCl tinh khiết  Dung dịch HCl 20%  Giấy lọc  Bếp điện  Lò nung  Máy UV - VIS

c. Cách tiến hành

Định lƣợng mẫu thử: Đồng nhất mẫu, cân thật chính xác khoảng 10g thực phẩm sao cho mẫu có chứa 50  500 g Fe, nung thành tro trắng. Hòa tro với 5ml HCl tinh khiết, đun cách thủy tới khô ở nồi cách thủy sôi. Làm lại lần thứ 2 nhƣ trên. Lần thứ 3 hòa tan trong 5ml HCl 20%, lọc trên giấy lọc không tro. Rửa nhiều lần cặn, giấy lọc và ph u bằng nƣớc cất nóng. Dịch lọc và nƣớc rửa cho tất cả vào bình định mức 100ml cho thêm nƣớc cất đến khoảng 80 - 90 ml. Điều chỉnh đến pH 3,5-4,5 bằng CH3COONa 2M rồi với CH3COONa 0,2M. Sau đó cho nƣớc cất vừa đủ 100ml.

Pha dung dịch Fe2+ chuẩn: Cân thật chính xác 8,6g phèn sắt amoni công thức (NH4)Fe(SO4)2.12H2O hoặc (NH4)2SO4.Fe2(SO4)3.24H2O (tƣơng đƣơng với 1g Fe2+)) hòa tan vào nƣớc cất và cho nƣớc vừa đủ 1000ml (1ml dung dịch = 1mg Fe2+)

Lấy 10ml dung dịch trên pha với nƣớc cất cho vừa đủ 1000ml (dung dịch mẫu)

(1ml dung dịch = 10µg Fe2+)

Cho lần lƣợt vào các bình định mức 25ml nhƣ bảng 4.1.

Bảng 4.1. Dãy chuẩn để xác định hàm lƣợng Fe

DUNG DỊCH (mL) B1 B2 B3 B4 B5 Bmẫu

Dung dịchFe(II) 10 ppm 1 2 3 4 0 0

Dung dịch mẫu 0 0 0 0 10 0

Hydroxylamin 10% 1 1 1 1 1 (lắc 1 phút) 1

Dung dịch đệm pH 5 5 5 5 5 5 5

1,10-phenantroline 0.1% 1 1 1 1 1 1

Nƣớc cất hai lần Lắc nhẹ, sau 5 phút mới dùng nƣớc cất định mức tới vạch

10 20 30 40 0 CFe(II) (µg) Cx

Sau 15 phút đem đo ở ở  = 510nm

Đo mật độ quang ở máy UV-VIS bƣớc sóng 510 nm. Vẽ đồ thị chuẩn với độ hấp

thu ở trục tung và hàm lƣợng Fe ở trục hoành.

d. Tính kết quả

Kết quả đọc đƣợc đem so sánh với đồ thị chuẩn, nhân với hệ số pha loãng để đƣợc hàm lƣợng sắt trong 100g mẫu thử.

Ngƣời ta còn xác định hàm lƣợng sắt trong thực phẩm bằng phƣơng pháp AAS.

4.3. Xác định độ chua

4.3.1. Ý nghĩa c a việc xác định độ chua trong thực phẩm

Độ chua hay độ acid bao gồm tất cả các acid có thể định lƣợng đƣợc bằng một dung dịch kiềm chuẩn. Những acid này chủ yếu là các acid hữu cơ nhƣ acid acetic, acid malic, acid xitric, acid lactic… Các acid cacbonic và SO2 dƣới thể tự do hay kết hợp đều không tính trong độ chua của thực phẩm. Do đó những thực phẩm nhƣ bia, nƣớc ngọt, hoa quả…có chứa CO2 hay SO2 đều đƣợc loại trừ trƣớc khi chuẩn độ để xác định độ chua.

Các phƣơng pháp xác định độ chua:

 Phƣơng pháp phân tích thể tích cổ điển (phƣơng pháp trung hòa): sử dụng khi độ chua trong thực phẩm ở nồng độ đa lƣợng (mol/l, g/l), yêu cầu dung dịch chuẩn bị từ mẫu phân tích phải không màu. Phƣơng pháp cổ điển dụng cụ thiết bị rẻ tiền, d thực hiện, không đòi hỏi kỹ năng của ngƣời phân tích cao, thời gian phân tích lâu.

 Phƣơng pháp phân tích hiện đại:

+ Phƣơng pháp chuẩn độ điện thế: sử dụng phần nghìn trở lên, dung dịch chuẩn

bị từ mẫu phân tích không nhất thiết không màu

+ Phƣơng pháp sắc ký: Có thể phân tích riêng rẽ từng loại acid trong thực phẩm, hàm lƣợng ppm, thực phẩm có màu hay không màu đều sử dụng phƣơng pháp này đƣợc.

+ Phƣơng pháp phân tích hiện đại sử dụng thiết bị đắt tiền, đòi hỏi ngƣời phân tích có kỹ năng cao nhƣng thời gian phân tích nhanh, phân tích đƣợc nhiều loại mẫu thực phẩm.

4.3.2. Xác định độ chua toàn phần

Độ chua toàn phần bao gồm tất cả các acid có trong thực phẩm, loại trừ CO2, SO2 ở dạng tự do hay kết hợp đều không đƣợc tính vào độ chua của thực phẩm.

a. Nguyên tắc

Dùng dung dịch NaOH 0,1M để trung hòa lƣợng acid có trong mẫu với chất chỉ thị phenolphtalein 1%.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm.

Tài liệu trích dẫn: AOAC 950.15

b. Dụng cụ - Hóa chất - Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Cối, chày sứ  NaOH 0,1N  Phenolphtalein 1%.  Nồi nhôm  Bếp điện  Cân phân tích, chính xác đến 0,0001g

c. Cách tiến hành

ối với th c ph m dạng l ng:

Bƣ c 1: Chuẩn bị mẫu: Đuổi CO2 hay SO2 pha loãng mẫu với độ pha loãng phù hợp.

Bƣ c 2: Chuẩn độ

– Lấy chính xác 10ml mẫu cho vào bình tam giác 100ml. – Thêm 50ml nƣớc cất trung tính – Thêm 5 giọt phenolphtalein 1%,lắc đều (có thể chọn chỉ thị phenol đỏ,

bromothymolblue)

– Chuẩn độ dung dịch trong bình tam giác bằng bung dịch NaOH 0,1N đến

khi xuất hiện màu hồng bền sau 30 giây.

– Ghi thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn (ml).

d. Tính kết quả

Độ acid (độ chua) tính bằng g/l theo công thức:

( ⁄ )

V: là thể tích mẫu mang chuẩn độ (ml)

V2: là thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn trong chuẩn độ (ml) K: là hệ số của loại acid (là lƣợng acidtƣơng ứng với 1ml NaOH 0,1N)

 Với sữa kết quả biểu thị bằng acidlactic K = 0,0090  Với thực phẩm lên men chua lactic kết quả biểu thị bằng acid lactic K = 0,0090

 Với dấm kết quả biểu thị bằng acidacetic K = 0,0060  Với các loại hoa quả tƣơi, siro, kẹo….kết quả biểu thị bằng acid xitric K = 0,0064

 Với dầu mỡ kết quả biểu thị bằng acid oleic K = 0,0282

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai kết quả thử song song, tính chính xác đến 0,01%

Chênh lệch kết quả giữa hai lần thử song song không đƣợc lớn hơn 0,02%

ối với th c ph m dạng đ c:

Bƣ c 1: Chuẩn bị mẫu

 Cắt nhỏ, xay nghiền nhỏ.  Cân chính xác khoảng 10g mẫu vào cốc 100ml  m (g).  Cho khoảng 40  50ml nƣớc ấm trung tính vào cốc đã có mẫu.  Lắc đều khoảng 1 giờ.  Chuyển dung dịch từ cốc 100ml vào bình định mức 100ml.  Tráng cốc nhiều lần, chuyển toàn bộ nƣớc tráng vào bình định mức.  Định mức đến vạch bằng nƣớc cất.  Lắc đều.  Lọc bằng giấy lọc vào bình tam giác khô,sạch.

Bƣ c 2: Chuẩn độ

 Lấy chính xác 25ml dịch sau khi lọc cho vào bình tam giác 100ml (nếu dung dịch đậm màu thì cho thêm 50ml nƣớc cất trung tính).

 Thêm 5 giọt phenolphtalein 1%,lắc đều.  Chuẩn độ dung dịch trong bình tam giác bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền sau 30 giây.

 Ghi thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn (ml).

Chú ý: Mẫu là chất lỏng không phân cực (dầu ăn) không tan trong nƣớc dùng dung dịch chuẩn KOH pha trong cồn

Bƣ c 3: Tính k t quả

Độ acid (độ chua)tính bằng % theo công thức:

m: là khối lƣợng mẫu (g).

V: là thể tích dịch sau lọc mang chuẩn độ (ml)

V1: là thể tích bình đựng mức (ml) V2: là thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn trong chuẩn độ (ml) K: là hệ số của loại acid (là lƣợng acid tƣơng ứng với 1ml NaOH 0,1N)

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai kết quả thử song song,tính chính xác đến 0,01%.

Chênh lệch kết quả giữa hai lần thử song song không đƣợc lớn hơn 0,02%.

Ch ý: Đối với mẫu thực phẩm dạng rắn d hòa tan nhƣ kẹo cứng thì ở bƣớc 1 tiến hành giã nhỏ mẫu trƣớc rồi mới cân và hòa tan bằng nƣớc nóng.

Ngoài ra, độ acid toàn phần cũng có thể biểu thị bằng:

 Độ chua: là số ml NaOH 1N dùng để trung hòa acid có trong 100g thực phẩm.  Chỉ số độ chua: là số mg KOH dùng để trung hòa acid có trong 1g thực phẩm.

4.3.3. Xác định độ acid dễ bay hơi

Độ acid bay hơi gồm các acid nhƣ HCOOH, CH3COOH, C2H5COOH, C3H7COOH ở dạng tự do hoặc ở dƣới dạng muối. Không tính vào độ acid bay hơi các acid lactic, acid, CO2, SO2…

a. Nguyên tắc

Dùng một nguồn hơi nƣớc nóng đi qua thực phẩm kéo theo các acid bay hơi, khi gặp lạnh các acid này ngƣng tụ lại, chảy vào bình hứng. Dung dịch trong bình hứng đƣợc chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphtalein 1%.

b. Dụng cụ – Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Dung dịch NaOH 0,1N  Dung dịch phenolphthalein 1%  Cân phân tích, chính xác đến 0,0001g  Bộ cất acid d bay hơi

Hình 4.3. Bộ cất acid dễ bay hơi

A. Bình phát hơi, chứa nƣớc vôi trong F. Ống dẫn hơi nƣớc

B. Ống thải mẫu thử G. Cột cất phân đoạn

C. Kẹp ống thải mẫu thử H. Ống sinh hàn

D. Bình chứa mẫu thử I. Bình chứa dịch cất

E. Giá đỡ

c. Cách tiến hành

Bƣ c 1: Rửa bộ cất acid dễ bay hơi

 Cho một luồng hơi nƣớc thật mạnh chạy qua toàn bộ thiết bị để rửa.  Ngừng cho hơi nƣớc vào thiết bị.

Bƣ c 2: Cân mẫu

 Cân chính xác khoảng 10g – 20g mẫu, m(g)  Cho mẫu vào bình chứa mẫu thử D.  Thêm khoảng 50ml nƣớc cất trung tính.

Bƣ c 3: Chƣng cất

 Cho nƣớc vào ống sinh hàn.  Cho hơi nƣớc sục vào bình D và đun nhẹ bình D để hơi nƣớc khỏi ngƣng đọng.

 Cất cho đến khi hứng đƣợc khoảng 300ml.  Đun dung dịch cất đến vừa sôi để đuổi hết CO2.  Thêm 5 giọt phenolphtalein 1% lắc đều.  Chuẩn độ dung dịch trong bình hứng bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi xuất hiện hồng bền sau 30 giây.

 Ghi thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn (ml).

d. Tính kết quả

Độ acid d bay hơi (qui về acid acetic) tính bằng % theo công thức:

( )

m: khối lƣợng mẫu (g)

V: thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn trong chuẩn độ (ml)

0,006: lƣợng acid acetic tƣơng ứng với 1ml NaOH 0,1N (g)

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai kết quả thử song song, tính chính xác đến 0,01%. Chênh lệch kết quả giữa hai lần thử song song không đƣợc lớn hơn 0,02%.

Chú ý:Cần phải loại bỏ CO2 và SO2 Loại bỏ CO2: Trƣớc khi cất kéo hơi nƣớc để định lƣợng acid bay hơi, lọai bỏ CO2 bằng cách cho bay hơi ở chân không (dùng vòi phun tia nƣớc hút chân không).

Loại bỏ SO2: Sau khi định lƣợng acid trong dịch cất bằng NaOH 0,1N với phenolphtalein 1%,cho thêm vào dịch cất 1 giọt HCl tinh khiết, 2ml hồ tinh bột, 1 hạt tinh thể KI và chuẩn SO2 tự do bằng dung dịch I2 0,01N. Cho thêm 20ml natriborat bão hòa, chuẩn độ SO2 kết hợp bằng dung dịch I2 từ màu hồng nhạt sang xanh. Kết quả: Thể tích NaOH 0,1N thực tế dùng để định lƣợng acid bay hơi là:

V là thể tích NaOH 0,1N sử dụng để định lƣợng acid trong dịch cất (ml)

V1 là thể tích I2 0,1N sử dụng để định lƣợng SO2 tự do (ml) V2 là thể tích I2 0,1N sử dụng để định lƣợng SO2 kết hợp (ml) Có thể tính độ acid d bay hơi = độ acid toàn phần - độ acid cố định

4.3.4. Xác định độ acid cố định

Độ acid cố định bao gồm tất cả các acid không bay hơi.

a. Nguyên tắc

Cô cạn thực phẩm ở nồi cách thủy sôi để các acid d bay hơi bốc hết, hòa tan cặn vào nƣớc cất trung tính và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphtalein 1%.

b. Dụng cụ – Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Chén sứ  Dung dịch NaOH 0,1N  Dung dịch phenolphthalein 1%  Nồi nhôm  Bếp điện  Cân phân tích, chính xác đến 0,0001g

c. Cách tiến hành

 Cho vào chén sứ 10ml thực phẩm lỏng hoặc 10g mẫu đặc.  Để trên nồi cách thủy sôi cho đến cạn,thỉnh thoảng lại khuấy.  Hòa tan cặn vào nƣớc cất trung tính,chuyển vào bình tam giác 250ml.  Tráng chén sứ hai lần,chuyển toàn bộ dịch tráng vào bình tam giác.  Thêm 5 giọt phenolphtalein 1%, lắc đều.  Chuẩn độ dung dịch trong bình tam giác bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi xuất hiện hồng bền sau 30 giây.

 Ghi thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn (ml)

d. Tính kết quả

Độ acid cố định bằng g/l hoặc % theo công thức:

⁄ ( )

( )

m: là khối lƣợng mẫu (g)

V: là thể tích mẫu mang thử (ml)

V1: là thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn trong chuẩn độ (ml) K: là hệ số của loại acid (là lƣợng acid tƣơng ứng với 1ml NaOH 0,1N)

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai kết quả thử song song, tính chính xác đến 0,1g/l hoặc 0,01%. Chênh lệch kết quả giữa hai lần thử song song không đƣợc lớn hơn 0,2 g/l hoặc 0,02%.

4.3.5. Xác định độ acid toàn phần bằng phƣơng pháp chuẩn độ điện th

a. Nguyên tắc

Mẫu thực phẩm sau khi xử lý, chuyển hóa bằng các phƣơng pháp thích hợp, lấy thể tích dung dịch chính xác rồi chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N sử dụng điện cực chỉ thị thủy tinh. Điểm cuối chuẩn độ nhận đƣợc khi dung dịch xuất hiện bƣớc nhảy pH nhờ sự theo dõi biến thiên pH theo thể tích dung dịch chuẩn. Các máy chuẩn độ điện thế tự động ghi nhận điểm dừng chuẩn độ một cách tự động, ghi lại thể tích dung dịch đã chuẩn độ. Áp dụng định luật đƣơng lƣợng để tính kết quả.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho các mẫu có dung dịch chuẩn bị từ mẫu phân tích có màu.

b. Dụng cụ - Hóa chất –Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Chén sứ  Dung dịch NaOH 0,1N  Dung dịch phenolphthalein 1%  Nồi nhôm  Bếp điện  Cân phân tích, chính xác đến 0,0001g  Máy chuẩn độ điện thế tự động hoặc máy đo pH

c. Cách tiến hành

Bƣ c 1: Chuẩn bị mẫu

- Lấy 10ml mẫu (đã đuổi khí CO2) vào cốc - Thêm 40ml nƣớc cất

- Cho vào cốc cá từ

Bƣ c 2: Chuẩn độ

 Đối với máy chuẩn độ điện thế: Cài đặt thông số máy chuẩn độ điện thế theo

phần mềm của máy. Thực hiện theo qui trình hƣớng dẫn sử dụng của máy, ghi lại thể tích chuẩn độ và giá trị pH dừng.

 Đối với máy đo pH: Vừa chuẩn độ vừa theo dõi biến đổi pH, tại bƣớc nhảy pH thì ngừng chuẩn độ, ghi lại thể tích dung dịch chuẩn độ và pH.

Chú ý:

 Nếu mẫu có chất béo phải loại bỏ chất béo trƣớc khi chuẩn độ  Chuẩn hóa điện cực trƣớc khi phân tích và sau 10 lần phân tích. Rửa điện cực cẩn thận, ngâm điện cực trong dung dịch KCl bão hòa.

d. Tính kết quả

Nhƣ phần chuẩn độ acid toàn phần bằng phƣơng pháp chuẩn độ thể tích

4.4. Phân tích hàm lƣợng glucide

4.4.1. Ý nghĩa c a việc xác định hàm lƣợng glucide trong thực phẩm

Glucide là những hợp chất hữu cơ trong phân tử có các nguyên tố chính C, H, O

theo tỷ lệ H : O = 2 : 1, công thức chung (CH2O)n.

Hợp chất glucide gồm nhiều nhóm hydroxide và một nhóm aldehyde hoặc xeton tự do, ví dụ glucose, lactose…, hoặc một hay nhiều nhóm aldehyde hay xeton kết hợp với các nhóm hóa chất khác, ví dụ tinh bột, saccharose, xenlulo…

Về cấu tạo hóa học, hợp chất gluxid bao gồm các monosaccharide (1 gốc đƣờng), oligosaccharide (2 – 10 đƣờng), polysaccharide (nhiều hơn 10 gốc đƣờng)

Phân loại theo tính khử, glucide chia làm hai nhóm:

 Nhóm oza có tính khử trực tiếp oxy do có nhóm aldehyde hay xeton tự do trong phân tử, thí dụ các loại đƣờng glucose, lactose, fructose…

 Nhóm ozit không có tính khử trực tiếp oxy, vì các nhóm aldehyde và xeton dƣới dạng kết hợp với các nhóm chức khác khi thủy phân cho hai hoặc nhiều oza, thí dụ tinh bột, saccarose…, hoặc khi thủy phân, ngoài các oza còn cho các chất không phải oza thí dụ glucozide… Những glucozide không có giá trị về mặt dinh dƣỡng nhƣng có tính chất dƣợc lý dùng làm thuốc chữa bệnh hoặc là các chất độc.

Các đƣờng glucose, fructose, lactose… có tính khử nên tham gia phản ứng oxy hóa khử với các tác nhân oxy hóa nhƣ thuốc thử Fehling (Cu2+ , tactrat), nƣớc Brom, acid nitric, acid periodic HIO4 . Dựa vào tính chất này để định lƣợng hàm lƣợng đƣờng. Ngoài ra, đƣờng có khả năng quay mặt phẳng phân cực nên ứng dụng xác định hàm lƣợng đƣờng bằng máy phân cực kế.

Các loại đƣờng trong thực phẩm chủ yếu đƣợc cung cấp bởi ngũ cốc, rau quả…

Xác định hàm lƣợng các loại đƣờng nhằm xác định thành phần dinh dƣỡng và kiểm soát chất lƣợng quá trình sản xuất. Các chỉ tiêu kiểm tra glucide trong thực phẩm:

- Đƣờng khử

- Đƣờng nghịch đảo

- Đƣờng toàn phần

- Tinh bột

- Dextrin ….

4.4.2. Xử lý mẫu thử

4.4.2.1. Định lƣợng đƣờng khử

Tùy theo đối tƣợng nghiên cứu (hạt, quả,…) mà cách chuẩn bị dung dịch dùng để định lƣợng đƣờng có khác nhau đôi chút nhƣng nguyên tắc chung nhƣ sau:

 Trƣờng hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin, ta có thể chiết đƣờng khử từ nguyên liệu bằng nƣớc. Cân và cho vào cối sứ 1g nguyên liệu mẫu khô (đã đƣợc nghiền nhỏ và sấy khô đến trọng lƣợng không đổi). Nếu là nguyên liệu tƣơi nhƣ hoa, quả tƣơi) thì cân 510g. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30ml nƣớc cất nóng 70800C.

Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 100ml. Đun cách thủy ở 70800C trong 3545 phút, kết tủa protein và các tạp chất. Tiếp theo cho nƣớc cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô. Dung dịch lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm.

 Trƣờng hợp nguyên liệu chứa nhiều tinh bột nhƣ khoai, sắn…cần chiết bằng cồn 7080%V. Đun hỗn hợp cách thủy, trƣờng hợp này không cần thiết kết tủa protein vì lƣợng protein chuyển vào không nhiều.

- Trƣờng hợp nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ nhƣ cà chua, dứa, chanh…cần chú ý là trong quá trình đun khi chiết, đƣờng saccharose có thể bị thủy phân một phần. Do đó cần xác định riêng đƣờng khử và riêng saccharose. Trƣớc khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa axit bằng Na2CO3 bão hòa tới pH 6,47,0. Sau khi xử lý, dung dịch cũng đƣợc định mức tới vạch bằng nƣớc cất rồi đem lọc.

4.4.2.2. Định lƣợng đƣờng tổng

a. Đối với mẫu lỏng

Hút một lƣợng dung dịch mẫu (Vm) cho vào cốc 250ml, tiến hành thủy phân, khử tạp chất rồi định mức

- Thủy phân.

 Cho thêm nƣớc cất vào khoảng 50ml. Cho vào cốc 5ml HCl 5% và khuấy đều.

 Đem dung dịch thủy phân ở 70÷800C trong 30 phút rồi đem lọc.

 Trung hòa dịch lọc (trƣớc tiên bằng NaOH 1N, sau bằng NaOH 0,1N với phenolphtalein làm chỉ thị màu).

- Khử tạp.

 Cho vào dung dịch 10ml chì acetat 30%, lắc và để lắng 5 phút, nếu thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt ở bên trên lớp cặn thì việc khử tạp đã xong.

 Cho vào 10 ÷ 20ml dung dịch bão hòa natri sunfat để loại chì axetat thừa. Lắc đều và để tủa lắng xuống.

 Kiểm tra lại xem đã hết chì acetat thừa chƣa bằng cách cho hết sức cẩn thận một vài giọt natri sulphat vào thành bình. Nếu không thấy vẩn đục khi các chất lỏng tiếp xúc với nhau thì coi nhƣ đã hết chì acetat.

Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức, định mức tới vạch. Lọc. Dung

dịch lọc thu đƣợc đƣợc dùng để xác định hàm lƣợng đƣờng.

b. Đối với mẫu rắn

Cân m(g) mẫu đã đƣợc nghiền nhỏ, tiến hành trích ly, thủy phân, khử tạp rồi định mức.

Quá trình trích ly đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ khi chuẩn bị mẫu định lƣợng đƣờng khử. Quá trình thủy phân và khử tạp đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ đối với mẫu lỏng.

Sau khi định mức, dung dịch mẫu có thể tích Vđm

4.4.3. Phƣơng pháp Bertrand

a. Nguyên tắc

Glucide khử Cu(OH)2 ở môi trƣờng kiềm mạnh, tạo kết tủa dƣới dạng Cu2O màu đỏ gạch. Số lƣợng Cu2O tƣơng ứng với số lƣợng glucide.

RCHO + 2 Cu(OH)2  RCOOH + Cu2O + 2H2O Cu2O có tính chất khử, tác dụng với Fe(III) làm cho muối này chuyển sang dạng Fe(II) ở môi trƣờng acid.

Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4  2CuSO4+ H2O + 2FeSO4 FeSO4 có tính chất khử, tác dụng với KMnO4. Do đó, có thể dùng KMnO4 để chuẩn độ FeSO4 ở môi trƣờng acid.

FeSO4 + 8H2SO4 + 2KMnO4 K2SO4 + 2MnSO4 + 5 Fe2(SO4)3 + 8 H2O Từ số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ FeSO4 hình thành, tra bảng để có số mg đƣờng glucose, maltose, lactose hoặc saccarose nhân với hệ số pha loãng ta có hàm lƣợng đƣờng trong 100g thực phẩm.

Phạm vi áp dụng: Qui trình này dùng để xác định đƣờng khử trong thực phẩm.

Tài liệu trích dẫn: TCVN 4075:2009

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Phểu lọc xốp G4  Dung dịch chì acetat 10%  Dung dịch Na2SO4 bão hòa  Dung dịch Fehling  Dung dịch Fe2(SO4)3  Dung dịch KMnO4 0,1N  Dung dịch NaOH 10%  Dung dịch NaOH 0,1N  Máy bơm chân không  Máy đo pH

c. Cách tiến hành

Bƣ c 1: Chuẩn bị dịch thử

 Cho vào cốc 100ml một lƣợng chất thử hoặc một thể tích mẫu sao cho phần lọc để chuẩn độ sẽ có nồng độ đƣờng (biểu thị bằng glucose) vào khoảng từ 4 – 10%. Sữa tƣơi 10ml, đƣờng kính khoảng 40gam, mạch nha 5g, kẹo 5g, mật ong 5g.

 Khử tạp.

+ Cho vào cốc mẫu 20ml nƣớc cất, 10ml chì acetat 10%, lắc và để lắng 5 phút, nếu thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt ở bên trên lớp cặn thì việc khử tạp đã xong. + Cho vào 10 ÷ 20ml dung dịch bão hòa natri sulfate để loại chì acetat thừa. Lắc đều và để tủa lắng xuống.

+ Kiểm tra lại xem đã hết chì acetat thừa chƣa bằng cách cho hết sức cẩn thận một vài giọt natri sulfate vào thành bình. Nếu không thấy vẩn đục khi các chất lỏng tiếp xúc với nhau thì coi nhƣ đã hết chì acetat.

 Định mức: chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức tráng cốc 2 lần, mỗi lần với 10ml nƣớc cất, thêm nƣớc cất tới vạch (Vđm). Lọc lấy dung dịch lọc để làm thí nghiệm.

 Chú ý: sau khi định mức, chuyển toàn bộ dung dịch sang một cốc khô, sạch rồi tiến hành lọc và rửa bình định mức ngay để tránh các kết tủa bám bẩn bình định mức.

Bƣ c 2: Xác định hàm lƣợng đƣờng

 Cho vào bình nón dung tích 250ml: 10ml dịch lọc đã chuẩn bị ở trên và khoảng 20ml nƣớc cất, 10ml dung dịch Fehling A, 10ml dung dịch Fehling B. Đun sôi. Sau 3 phút, toàn bộ dung dịch phải sôi. Giữ sôi đúng 2 phút kể từ khi bắt đầu sôi lại.

 Lấy bình ra và để nghiêng cho cặn đồng (I) oxy lắng xuống. Dung dịch bên trên lớp cặn phải có màu xanh của Cu(OH)2. Nếu dung dịch bên trên có màu lục, vàng hoặc nâu nghĩa là không đủ lƣợng đồng cần thiết phải làm lại và lấy một lƣợng dịch lọc ít hơn, cuối cùng cũng thêm nƣớc cất cho có tổng thể tích sau cùng là 50ml.

 Khi kết tủa Cu2O lắng xuống, gạn lấy phần nƣớc bên trên và lọc qua ph u lọc burchner (ph u lọc cắm xuyên qua nút cao su của bình lọc có nhánh nối liền với ống hút chân không bằng tia nƣớc).

 Cho nƣớc đã đun sôi vào bình nón và tiếp tục gạn lọc vào ph u cho đến khi nƣớc trong bình nón hết màu xanh. Trong quá trình gạn lọc chú ý tránh đừng để cho kết tủa rơi vào ph u và luôn luôn giữa một lớp nƣớc đã đun sôi trên mặt kết tủa trong bình nón và trong ph u.

 Lần gạn lọc cuối cùng, gạn hết nƣớc và cho ngay vào bình nón 20ml dung dịch Fe(III) sulfate để hòa tan kết tủa Cu2O. Rút hết nƣớc trên ph u, ngừng cho chảy nƣớc ở phần ống hút chân không. Thay bình hút lọc cũ bằng bình mới. Đổ dung dịch Fe2(SO4)3 đã hòa tan hết kết tủa Cu2O trong bình nón, lên trên lớp cặn còn lại trên ph u. Tráng bình nón và rửa ph u bằng dung dịch Fe2(SO4)3 cho đến khi không còn vết Cu2O trong bình nón và trong phếu. Hút xuống bình lọc và tráng rửa lại bằng nƣớc cất đun sôi, hút cả xuống bình lọc.

Chú ý là chỉ dùng khoảng 30-50ml Fe2(SO4)3 để hòa tan hoàn toàn Cu2O, tráng bình và rửa ph u.

 Lấy bình lọc ra và chuẩn độ dung dịch Fe(II) hình thành bằng dung dịch KMnO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền vững trong 15 giây.  Đọc thể tích KMnO40,1N đã dùng và đem tra bảng để có lƣợng đƣờng glucose, lactose, maltose hoặc đƣờng nghịch đảo (đƣờng nghịch chuyển) tùy theo yêu cầu.

d. Tính kết quả

Hàm lƣợng đƣờng toàn phần biểu thị bằng đƣờng glucose hoặc đƣờng nghịch đảo (g) trong 100g thực phẩm, tính theo công thức:

G: trọng lƣợng thực phẩm cân lúc đầu (g)

n: độ pha loãng

1000: hệ số chuyển từ mg sang g

G1: trọng lƣợng đƣờng nghịch đảo hoặc đƣờng glucose (mg) tƣơng ứng với số ml KMnO4 0,1N đọc ở trong phụ lục II và phụ lục III.

4.4.4. Xác định đƣờng khử bằng phƣơng pháp Lane – Eynon

a. Nguyên tắc

Đƣờng khử trong dịch thuỷ phân đƣờng tan và thuỷ phân tinh bột có khả năng khử Cu2+ trong hỗn hợp Fehling về Cu+ (Cu2O) không tan, màu đỏ. Thể tích dung dịch đƣờng khử cần thiết để khử hoàn toàn một thể tích nhất định hỗn hợp Fehling đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ với chất chỉ thị xanh metylen.

Hàm lƣợng tinh bột đƣợc tính bằng hàm lƣợng glucoza trong dịch thủy phân tinh bột nhân với hệ số chuyển đổi 0,9.

Phạm vi áp dụng: Qui trình này áp dụng cho các loại hạt ngũ cốc nhƣ gạo, mì, ngô... cũng nhƣ các sản phẩm của ngũ cốc và qui định phép thử xác định hàm lƣợng đƣờng tổng số và tinh bột bằng phƣơng pháp Lane-Eynon.

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Dung dịch Fehling  Dung dịch xanh metylen  Dung dịch phenolphtalein  Dung dịch HCl tinh khiết  Dung dịch NaOH 20%  Nồi nhôm  Bếp điện

c. Cách tiến hành

 Chuẩn bị mẫu: Tƣơng tự nhƣ chuẩn bị mẫu rau quả. Có thể dùng dung dịch

mẫu rau quả đã chuẩn bị nhƣ trên để tiến hành định lƣợng

 Chuẩn độ + Làm mẫu trắng:

Cho 10ml Feling A, 10ml Feling B, 20ml nƣớc cất vào bình tam giác, đun sôi dung dịch trong bình tam giác 1 phút, cho thêm 3 – 5 giọt metyl xanh, luôn tay lắc bình tam giác, đồng thời đun sôi. Chuẩn độ nóng dung dịch trong bình tam giác bằng dung dịch đƣờng khử 1% cho đến khi mất màu xanh thì dừng lại. Ghi thể tích dung dịch đƣờng khử 1% tiêu tốn. (V)

+ Làm mẫu chính

Dùng pipet cho Vdd (ml) dung dịch mẫu vào bình tam giác 250ml, thêm 10ml Feling A, 10ml Feling B, 10ml nƣớc cất. Đun sôi 1 phút, cho thêm 3 – 5 giọt metyl xanh, luôn tay lắc bình tam giác, đồng thời đun cho sôi. Tiếp tục chuẩn độ nóng dung dịch trong bình tam giác bằng dung dịch đƣờng khử 1% cho đến khi mất màu xanh thì dừng lại. Thêm vài giọt metyl xanh, nếu màu dung dịch trong bình tam giác không đổi là phản ứng đã kết thúc. Ghi thể tích dung dịch đƣờng khử 1% tiêu tốn. (V1)

d. Tính kết quả

 Đối v i mẫu rắn

Hàm lƣợng đƣờng khử của mẫu tính bằng % theo công thức sau:

D: phần trăm đƣờng khử trong mẫu (%)

V là thể tích dung dịch đƣờng khử 1% tiêu tốn trong mẫu trắng, tính bằng ml.

V1 là thể tích dung dịch đƣờng khử 1% tiêu tốn trong mẫu chính, tính bằng ml. Vđm: thể tích bình định mức Vdd: thể tích dung dịch thử đƣợc hút ra để thực hiện phản ứng. m là khối lƣợng mẫu, tính bằng gam.

 Đối v i mẫu lỏng:

4.4.5. Phƣơng pháp quang phổ (v i thuốc thử DNS)

a. Nguyên tắc

Phƣơng pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử với thuốc thử dinitrosalicylic (DNS). Cƣờng độ màu của hỗn hợp tỷ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định, đƣợc đo bằng máy quang phổ so màu. Dựa theo đồ thị đƣờng chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử, tính hàm lƣợng đƣờng khử của mẫu nghiên cứu.

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Dung dịch glucose 1000ppm  Thuốc thử DNS  HCl đậm đặc  NaOH khan  Phenolphtalein 1%  Dung dịch Pb(CH3COO)2 10%  Dụng dịch Na2SO4 bão hòa  Than hoạt tính  Giấy lọc

c. Cách tiến hành

Chuẩn bị dãy ống nghiệm theo bảng sau:

Bảng 4.2. Dãy chuẩn để xác định hàm lƣợng glucose theo phƣơng pháp quang

phổ v i thuốc thử DNS

STT 0 1 2 3 4 5 6 7 Mẫu

0 1 2 3 4 5 6 7 0 Dung dịch chuẩn (500ppm)

Dung dịch mẫu 0 0 0 0 0 0 0 0 2

Nƣớc cất 9 8 7 6 5 4 3 2 7

Thuốc thử DNS 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Để các ống nghiệm vào nồi cách thủy đang sôi đúng 5 phút, lấy ra làm nguội đến nhiệt độ 25÷300C rồi đo mật độ quang ở bƣớc sóng 540nm

d. Tính kết quả

Sau khi có các số liệu về dãy chuẩn, dùng phƣơng pháp bình phƣơng cực tiểu tìm

phƣơng trình y = ax + b. Từ đó xác định đƣợc nồng độ đƣờng trong mẫu ban đầu.

4.4.6. Định lƣợng dextrine bằng phƣơng pháp k t t a v i cồn

a. Nguyên tắc

Phƣơng pháp này dựa vào tính chất dextrine kết tủa hoàn toàn trong cồn nồng độ cao, còn đƣờng glucose, maltose tan trong cồn.

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Cồn tuyệt đối  Giấy lọc  Tủ sấy

c. Cách tiến hành

Cân 5g mẫu cho vào cốc. Cho thêm 50ml nƣớc cất. Khuấy kỹ cho tan.

Lọc qua giấy lọc và cho vào bình định mức. Rửa giấy lọc vài lần bằng nƣớc cất, định mức đến vạch, lắc đều.

Dùng pipet lấy 10ml dung dịch trong bình định mức cho vào cốc. Thêm từ từ vào cốc 30ml cồn tuyệt đối, lắc đều. Để yên cốc khoảng 30 phút cho kết tủa dextrine màu trắng lắng xuống.

Lọc lấy kết tủa qua hai lớp giấy lọc (đã biết khối lƣợng). Rửa kết tủa vài lần bằng cồn tuyệt đối. Sấy giấy lọc có chứa kết tủa ở 1050C đến khối lƣợng không đổi.

Hàm lƣợng phần trăm dextrine trong mẫu là hiệu số giữa giấy lọc có chứa dextrine và giấy lọc không chứa dextrine.

d. Tính kết quả

Hàm lƣợng dextrine đƣợc xác định theo công thức sau:

X: % dextrine trong mẫu

a: khối lƣợng của giấy lọc và kết tủa sau khi sây (g).

b: trọng lƣợng giấy lọc (g).

V: thể tích bình định mức (ml).

V1: thể tích lấy xác định (ml). w: khối lƣợng mẫu phân tích (g)

4.5. Xác định hàm lƣợng protide

4.5.1. Ý nghĩa c a việc xác định hàm lƣợng protide trong thực phẩm

Về phƣơng diện hóa học, protide là những chất hữu cơ mà thành phần cấu tạo gồm C, H, O, N có khi còn có thêm P và S.

Protide gồm các acid amine (amino acid) và những hợp chất (peptit, protein) khi thủy phân cho một hoặc nhiều loại acid amine. Peptit là do một số giới hạn acid amine kết hợp với nhau bởi liên kết peptit (-CO-NH-) (nhóm chức acid của acid amine này kết hợp với nhóm chức amin của acid amine kia).

Protein là tên gọi để chỉ chung những protide, đƣợc chia thành 2 nhóm: holoprotein và heterprotein. Holoprotein khi thủy phân cho các acid amine. Heterprotein khi thủy phân ngoài acid amine còn cho những chất không phải là protide (gọi là chất phi protide) thí dụ nhƣ: lipide, acid nucleic…

Xác định hàm lƣợng protide là xác định các thành phần liên quan đến chất lƣợng và dinh dƣỡng của thực phẩm (xác định hàm lƣợng protide thô, xác định hàm lƣợng protein, xác định hàm lƣợng acid amine, xác định hàm lƣợng amoniac…)

4.5.2. Xác định hàm lƣợng protide thô

4.5.2.1. Nguyên tắc xác định hàm lƣợng protide thô

Về nguyên tắc, protide thô trong thực phẩm đƣợc định lƣợng bằng cách xác định lƣợng nitơ toàn phần và kết quả nhân với 6,25. Nhƣ thế nghĩa là protide luôn luôn chứa 16% N. Thực tế trong thực phẩm, bên cạnh protide thật, có những chất hữu cơ khác có chứa N nhƣ: amid, alcaloit, amoniac…(thí dụ nhƣ trong thực phẩm lên men), acid nitric… do đó, hàm lƣợng N toàn phần chính thức cao hơn 16%.

Ở protide động vật, hàm lƣợng nitơ toàn phần cũng thƣờng cao hơn 16% (16- 17%), nhƣng ở thực vật thì hàm lƣợng này lại thấp hơn 16%. Hệ số 6,25 là hệ số trung bình thô. Trong một vài trƣờng hợp, muốn có kết quả chính xác nên dùng các hệ số tƣơng ứng sau:

Thí dụ:

- Lúa mì và các chế phẩm: 6,95

- Sữa và các chế phẩm: 6,38

- Thực phẩm nguồn gốc động vật: 6,25

- Khoai tây, gạo và các chế phẩm: 6,25

- Thức ăn gia súc: 6,25

- Ngô, đỗ tƣơng, lúa mạch, lúa đại mạch: 6,00

- Đậu đỗ, khô lạc: 5,70

- Khô dầu bông, khô dầu lanh: 5,50

Có nhiều phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nitơ toàn phần, trong đó thƣờng sử dụng phƣơng pháp Kjeldahl.

4.5.2.2. Xác định nitơ toàn phần bằng phƣơng pháp Kjeldahl

a. Nguyên tắc

Khi đốt nóng mẫu thực phẩm với H2SO4 đậm đặc, các chất hữu cơ bị oxy hoá tạo thành SO2 CO2,H2O. Còn nitơ sau khi đƣợc giải phóng ra dƣới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạothành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.

Đẩy NH3khỏi muối (NH4)2SO4 bằng một baseơ mạnh (NaOH):

(NH4)2SO4 + 2NaOH = 2NH3 + 2H2O + Na2SO4

Định lƣợng NH3 bay ra bằng một acid (phƣơng pháp trực tiếp):

2NH3 + H3BO3  (NH4)2B4O7 + 5H2O (NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O  4H3BO3 + 2NH4Cl Hoặc có thể sử dụng H2SO4 0,1N dƣ, chuẩn độ lƣợng H2SO4 dƣ bằng dung dịch NaOH 0,1N (phƣơng pháp gián tiếp):

2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 2NaOH + H2SO4 dƣ = Na2SO4 + 2H2O

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm.

Tài liệu trích dẫn: TCVN 8099-2:2009

b. Dụng cụ – Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ, vật liệu thông thƣờng của phòng thí nghiệm

 Bình Kjeldahl dung tích 500ml

 Bộ cất đạm Kjeldahl

 Dung dịch H2SO4 đậm đặc

 Hỗn hợp xúc tác CuSO4 : K2SO4 = 1:10

 Dung dịch H3BO3 4% pH=5,5, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1N

 Dung dịch HCl 0,1N

 Dung dịch NaOH 0,1N

 Dung dịch H2SO4 0,1N

 Dung dịch Phenolphthalein 1%

 Dung dịch Tashiro hoặc Alirazin natri sunfonat

 Giấy quỳ

Hình 4.4. Bộ cất đạm Kjeldahl

1. Bình hứng 5. Bếp điện

2. Bình cất 7. Bình cầu

3, 6, 9. Khóa 8. Bình rửa

4. Phểu 10. Ống sinh hàn

c. Tiến hành

 Bƣ c 1: Vô cơ hóa mẫu

Hình 4.5. Vô cơ hóa mẫu bằng bình Kjeldahl

+ Cân chính xác khoảng 24g mẫu hoặc V (ml) dung dịch mẫu cho vào bình Kjeldahl dung tích 500ml. Chú ý không đƣợc dính mẫu lên thành bình.

+ Thêm 2g hỗn hợp xúc tác CuSO4 : K2SO4 = 1:10 vào bình. + Rót từ từ theo thành bình 10-20ml H2SO4 đậm đặc. + Lắc nhẹ bình để acid trộn đều vào mẫu.

+ Đậy bình bằng phểu thuỷ tinh rồi cặp vào giá đỡ và đặt nghiêng một góc 450 trên bếp điện.

+ Đun trong tủ hút cho đến khi dung dịch trong suốt không màu hoặc có màu xanh trong. Trong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo sao cho không còn một vệt đen nào của mẫu chƣa bị phân hủy sót lại trên thành bình.

+ Để nguội. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình cất đạm.

Vô cơ hóa mẫu bằng bộ phá mẫu nhiều ống:

+ Cân chính xác khoảng 24g mẫu hoặc V (ml) dung dịch mẫu cho vào ống phá mẫu

+ Thêm 2g hỗn hợp xúc tác CuSO4 : K2SO4 = 1:10. + Rót từ từ theo thành bình 10ml H2SO4 đậm đặc. + Đặt ống vào trong bộ phá mẫu

+ Mở máy và cài đặt nhiệt độ

+ Tiến hành phá mẫu trong tủ hút cho đến khi thu đƣợc dung dịch có màu

trong xanh hoặc trong suốt.

 Bƣ c 2: Ti n hành cất đạm

+ Lắp ráp bộ cất đạm và rửa sạch bộ cất đạm.

+ Cho vào bình tam giác hứng 50ml H3BO3 4% và 5 giọt chỉ thị Tashiro, dung dịch có màu xám (chỉ thị Tashiro có màu xanh lục nếu pH>5,5, màu tím nếu pH<5,5 và màu xám nếu pH=5,5).

+ Nhúng đầu ống sinh hàn của bộ cất đạm ngập hẳn trong dung dịch của bình tam giác hứng

+ Chuyển dung dịch đã vô cơ hóa vào bình cầu của máy cất đạm, rửa bình Kjeldahl 2 lần với nƣớc cất và chuyển tất cả nƣớc rửa vào bình cầu. Trung hòa bằng NaOH 30% với Tashiro làm chỉ thị màu (hoặc với chỉ thị Alizarin natri sulfonate), sau đó cho thêm 5ml NaOH 30%

+ Mở nƣớc vào ống sinh hàn.

+ Tiến hành cất kéo hơi nƣớc 15  30 phút.

+ Nâng đầu ống sinh hàn lên khỏi mặt dung dịch trong bình tam giác, dùng bình tia rửa đầu ống sinh hàn, tiếp tục cất thêm 2 phút nữa. Kiểm tra nƣớc chảy ra ở đầu ống sinh hàn không làm đổi màu giấy quỳ là đƣợc.

 Bƣ c 3: Chuẩn độ

Lấy bình hứng ra và chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1N dung dịch chuyển từ màu xanh lục sang màu tím. Ghi thể tích dung dịch HCl 0,1N tiêu tốn.

Chú ý: Rửa bộ cất đạm bằng HCl 10% và nhiều lần bằng nƣớc cất

d. Tính kết quả

Hàm lƣợng nitơ toàn phần đƣợc tính theo công thức:

Đối với mẫu rắn:

⁄ ơ à ầ ( )

Đối với mẫu lỏng:

ơ à ầ ( )⁄

V: thể tích dung dịch HCl0,1N (ml)

N: đƣơng lƣợng dung dịch HCl

Vm: thể tích mẫu thử (ml) m: khối lƣợng mẫu thử (g)

Có thể chuẩn độ hàm lƣợng NH3 bay ra bằng phƣơng pháp gián tiếp. Cho NH3 hấp thu vào một thể tích chính xác dung dịch H2SO4 0,1N. Lƣợng dƣ acid sulfuric dƣ 85

đƣợc chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 1N. Khi đó, hàm lƣợng nitơ toàn phần đƣợc tính theo công thức:

Đối với mẫu rắn:

⁄ ơ à ầ ( ) ( )

Đối với mẫu lỏng:

ơ à ầ ( ⁄ ) ( )

V1: thể tích dung dịch NaOH0,1N V2: thể tích dung dịch H2SO4 0,1N N: đƣơng lƣợng dung dịch H2SO4 0,1N Vm: thể tích mẫu thử (ml) m: khối lƣợng mẫu thử (g)

F: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH 0,1N

Hàm lƣợng protide thô đƣợc xác định bằng cách lấy kết quả nitơ toàn phần nhân với hệ số 6,25 (hay các hệ số tƣơng ứng trong từng trƣờng hợp cụ thể).

Một số điểm lƣu ý trong quá trình cất đạm:

 Trong quá trình cất đạm, dung dịch trong bình cất bị hút về phía bình thải

nếu nguồn cung cấp nhiệt cho hệ thống cất đạm không ổn định.

 Có thể thay thế chỉ thị tashiro bằng chỉ thị metyl đỏ 1% pha trong cồn.  Trong quá trình cất đạm nếu màu của dung dịch ở bình hứng chuyển sang màu xanh lục đối với chỉ thị Tashiro hoặc màu vàng đối với chỉ thị metyl đỏ thì có nghĩa lƣợng acid sulfuric bị thiếu, cần thêm một lƣợng acid sulfuric vào bình hứng.

4.5.3. Xác định hàm lƣợng protein

4.5.3.1. Phƣơng pháp Biure

a. Nguyên tắc Trong môi trƣờng kiềm, protein kết hợp với Cu2+ thành một phức chất màu tím (phản ứng Biure). Cƣờng độ màu tỷ lệ với số lƣợng mạch peptit và gần nhƣ không phụ thuộc vào những nồng độ tƣơng đối giữa albumin và globulin

b. Dụng cụ – Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thủy tinh thông thƣờng của phòng thí nghiệm

 Chất chuẩn protein 1000ppm

 Thuốc thử Biuret

 Dung dịch NaOH bão hòa

 Dung dịch NaOH 10%

 Nƣớc muối sinh lý

 Máy lắc ống nghiệm

 Máy quang phổ

c. Cách tiến hành

Chuẩn bị mẫu thử

Để trích ly protein hòa tan, có thể dùng nƣớc cất hoặc dùng dung dịch nƣớc muối sinh lý. Tiến hành cụ thể nhƣ sau:

Cân 2g mẫu (đối với thực phẩm rắn), tiến hành xay nhỏ mẫu. Sau đó trích ly bằng nƣớc cất ấm hoặc dung dịch nƣớc muối sinh lý ấm (nhiệt độ 40 – 450C). Làm nhiều lần cho đến khi mẫu đƣợc trích ly hoàn toàn protein (hết màu xanh đặc trƣng khi phản ứng với thuốc thử Biure). Thu lấy toàn bộ dung dịch trích ly, chuyển sang bình định mức 500ml, thêm nƣớc cất (hoặc nƣớc muối sinh lý) cho tới vạch định mức. Trong trƣờng hợp mẫu có quá nhiều protein, dung dịch sau khi định mức bị đục thì có thể pha loãng mẫu đến một nồng độ thích hợp.

Đối với mẫu lỏng, chỉ cần hút V (ml) mẫu (căn cứ vào hàm lƣợng protein trong

mẫu để xác định lƣợng mẫu phù hợp) rồi pha loãng đến một nồng độ thích hợp.

Bảng 4.3. Dãy chuẩn c a để xác định protein bằng phƣơng pháp Buire

0 1 2 3 4 5 6 7 M1 M2

0 1 2 3 4 5 6 7 0 0 Chuẩn protein 1000ppm

0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 Dung dịch mẫu

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Thuốc thử Biure

15 14 13 12 11 10 9 8 11 11 H2O muối sinh lý

d. Tính kết quả

Từ đồ thị của dãy chuẩn, tính toán hàm lƣợng protein có trong mẫu

4.5.3.2. Phƣơng pháp Nessler

a. Nguyên tắc

Amoniac tự do đƣợc định lƣợng nhờ phản ứng giữa amoniac với thuốc thử Nessler sinh ra một hợp chất mang màu. Cƣờng độ màu sắc phụ thuộc vào lƣợng NH3 có trong mẫu.

b. Dụng cụ – Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thủy tinh thông thƣờng của phòng thí nghiệm

 Dụng dịch muối kali – natri tactrat kiềm

 Thuốc thử Nessler

 Dung dịch NH4Cl tiêu chuẩn 1000ppm

 Máy lắc ống nghiệm

 Máy quang phổ

c. Cách tiến hành

Pha loạt mẫu nhƣ sau: (dung dịch mẫu là dung dịch sau khi đã vô cơ hóa)

Bảng 4.4. Dãy chuẩn để xác định protein bằng phƣơng pháp Nessler

0 1 2 3 5 Mẫu 1 Mẫu 2 4

0 1 2 3 5 0 0 4 Dung dịch NH4Cl 10ppm (ml)

Dung dịch mẫu (ml) 0 0 0 0 0 10 10 0

2 Dung dịch muối kali – natri tactrat kiềm (ml)

2 Thuốc thử Nessler

Nƣớc cất Thêm vừa đủ 25ml

Độ hấp thu A

Đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 520nm.

d. Tính kết quả

Từ đồ thị của dãy chuẩn, tính toán hàm lƣợng protein có trong mẫu

4.5.4. Xác định hàm lƣợng đạm formon bằng phƣơng pháp Sorensen

a. Nguyên tắc

Các acid amine trong dung dịch nƣớc thì trung tính. Khi gặp formon, các acid amine bị mất tính kiềm, tính acid của nhóm COOH trội lên. Do đó có thể định lƣợng nhóm COOH bằng một dung dịch kiềm chuẩn với điện cực chỉ thị

b. Dụng cụ – Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thủy tinh thông thƣờng của phòng thí nghiệm

 Formon trung tính

 Dung dịch Ba(OH)2 bão hòa

 BaCl2 khan

 Dung dịch Na2HPO4 0,1N

 Dung dịch phenolphthalein 1%

 Dung dịch Tashiro hoặc Alirazin natri sunfonat

 Giấy lọc

c. Cách tiến hành

Xử lý mẫu: Cân chính xác P (g) chất thử đã xay nhuy n (hoặc V ml dung dịch thử) cho vào bình định mức 100ml, với 50ml nƣớc cất, lắc mạnh trong 10 phút để hòa tan. Cho thêm 0,5ml dung dịch PP, 2g BaCl2, từng giọt Ba(OH)2 cho đến khi có màu hồng nhạt. Sau đó cho thêm 5ml Ba(OH)2 để kết tủa các muối photphat và cacbonat. Cho nƣớc cất vừa đủ, lắc đều và lọc.

Tiến hành

Bƣớc 1: Xác định lại nồng độ của NaOH bằng H2C2O4 0,1N với chỉ thị phenolphtalein

Bƣớc 2: Chuẩn độ

Hút 20ml dung dịch xác định cho vào bình tam giác 250ml. Thêm 20ml dung dịch formon trung tính. Chuẩn độ bằng NaOH 0,2N cho đến màu đỏ tƣơi

d. Tính kết quả

Đối với mẫu rắn

⁄ ( )

Đối với mẫu lỏng

( ⁄ )

0,0028: số g nitơ tƣơng ứng với 1ml NaOH 0,2N

n: số ml NaOH 0,2N đã sử dụng

m, V: số g hay số ml mẫu thử

Chú ý:

- Các muối amoni, thí dụ NH4Cl ở dung dịch trung tính, khi gặp formon cũng làm cho dung dịch trở thành axit nên ảnh hƣởng đến kết quả phân tích

- Đây là trƣờng hợp một axit yếu đƣợc chuẩn độ bằng kiềm mạnh nên điểm tƣơng đƣơng phải ở pH kiềm (pH = 9÷9,5) do đó phản ứng kết thúc khi PP chuyển màu đỏ tƣơi chứ không phải màu hồng (pH = 8,3 nhƣ thông thƣờng)

- Nếu trong chất thử có các muối photphat hoặc cacbonat, các muối này sẽ làm dung dịch trở thành dung dịch đệm và pH khó tăng đến 9÷9,5, làm ảnh hƣởng đến kết quả, do đó cần phải loại bỏ bằng cách kết tủa với BaCl2 và Ba(OH)2

- Điểm chuyển màu rất khó nhận vì khó xác định lúc nào là chuyển sang màu đỏ tƣơi. Do đó nên có dung dịch màu để so sánh. Ngƣời ta dùng 100ml dung dịch Na2HPO4 0,1N (pH =9,3) trộn đều với 0,5ml phenolphtalein 1% để có màu đỏ tƣơi làm mẫu so sánh màu của điểm tƣơng đƣơng

4.5.5. Xác định hàm lƣợng đạm thối trong bằng phƣơng pháp cất kéo hơi nƣ c

a. Nguyên tắc

Đẩy muối amoni ra thể tự do bằng một chất kiềm mạnh hơn amoniac nhƣng không mạnh lắm để tránh ảnh hƣởng đến thực phẩm, ví dụ nhƣ Mg(OH)2, Na2CO3…Dùng hơi nƣớc kéo amoniac đã đƣợc giải phóng ra thể tự do sang bình chuẩn độ và kết hợp với một lƣợng dƣ H2SO4 0,1N. Chuẩn độ lƣợng H2SO4 dƣ sau khi cất xong với chỉ thị tashiro.

2NH4Cl + Mg(OH)2 = 2NH3 + 2H2O +MgCl2 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 H2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H2O

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm

Tài liệu trích dẫn: TCVN 3706-90

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ, vật liệu thông thƣờng của phòng thí nghiệm

 Bộ cất đạm amoni

 MgO rắn

 Dung dịch NaOH 0,1N

 Dung dịch H2SO4 0,1N

 Dung dịch tashiro hoặc alirazin natri sunfonat 1%

 Giấy quỳ

Hình 4.6. Hệ thống cất đạm amoni

1. Bình cầu phát hơi nƣớc 3. Ống sinh hàn

2. Bình chứa mẫu thử 4. Bình hứng dịch cất

c. Tiến hành

 Bƣ c 1: Rửa bộ cất amoniac

+ Cho nƣớc cất vào bình (1) đến 2/3 thể tích bình

+ Thêm 2 giọt chỉ thị alizarin natrisunfonate 1%

+ Thêm H2SO4 0,1N từng giọt một cho đến khi có phản ứng axit (màu vàng). Amoniac hoặc muối amoni có trong nƣớc cất (nếu có) sẽ kết hợp với H2SO4 thành (NH4)2SO4 bền vững.

+ Cho nƣớc cất vào bình (2) đến hơn 1/2 thể tích bình.

+ Cấp nƣớc vào ống sinh hàn (3).

+ Đun sôi cả hai bình và cất kéo hơi nƣớc cho đến khi nƣớc ngƣng chảy ra trung tính.

 Bƣ c 2: Ti n hành cất amoniac

+ Cho vào bình hứng dịch cất (4) chính xác V1(ml) H2SO4 0,1N và 5 giọt chỉ thị tashiro 1%.

+ Cân chính xác m (g) hoặc V (ml) mẫu thực phẩm cho vào bình (2) với nƣớc trung tính đã cất kéo hơi nƣớc ở bƣớc 1.

+ Thêm 2 giọt chỉ thị alizarin natrisunfonate 1%

+ Cho từ từ bột MgO (hòa tan bột MgO với 1 ít nƣớc cất trƣớc khi cho vào bình cất) vào tới khi có phản ứng kiềm rõ rệt (màu tím).

+ Đun sôi, hơi nƣớc từ bình (1) qua bình đựng mẫu (2) kéo theo NH3 có trong mẫu thử đi qua ống sinh hàn (3) rồi ngƣng tụ vào bình hứng dịch cất (4) đã có V1 (ml) H2SO4 0,1N và chỉ thị màu.

+ Tiến hành cất cho đến khi thử với giấy quỳ không cho phản ứng kiềm thì dừng.

 Bƣ c 3: Chuẩn độ:

Chuẩn độ dung dịch trong bình hứng bằng dung dịch NaOH 0,1N đến màu xanh.

Ghi thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn (V2).

Rửa bộ cất amoniac bằng nƣớc cất hoặc dung dịch HCl 10%.

d. Tính kết quả

Hàm lƣợng NH3 tính bằng % theo công thức sau:

( ) ( )

Hàm lƣợng NH3 tính bằng g/l theo công thức sau:

( ) ( )

V1: là thể tích dung dịch H2SO4 0,1N cho vào bình hứng (ml) V2: là thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn trong chuẩn độ (ml) N: đƣợng lƣợng dung dịch NaOH 0,1N

F: là hệ số điều chỉnh dung dịch NaOH

V: là thể tích mang phân tích (ml)

m: là khối lƣợng mẫu cân (g)

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai kết quả thử song song, tính chính

xác đến 0,1%.Sai lệch giữa hai kết quả thử song song nhỏ hơn 0,5%.

4.6. Xác định hàm lƣợng lipide

4.6.1. Ý nghĩa c a việc xác định hàm lƣợng lipide

Lipide là tất cả các este của glyxerin với các acid béo khác. Các acid béo có thể là acid béo no, có thế là acid béo không no. Ngƣời ta cũng gọi là lipide những amit của các acid béo vì tính chất lý học và sinh học của nó giống nhƣ các este của các acid béo.

Tính chất của lipide: Hòa tan trong dung môi hữu cơ nóng không hòa tan trong nƣớc.

Phần lớn các nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm đều chứa một lƣợng chất béo nhất định. Vì vậy, việc xác định hàm lƣợng chất béo là rất cần thiết. Không những nó đánh giá chất lƣợng nguyên liệu mà trong một số trƣờng hợp cần phải xác định hàm lƣợng chất béo để đặt ra qui trình xử lý công nghệ.

Để đánh giá chất lƣợng của nguyên vật liêu hay sản phẩm ngƣời ta đi xác định một số chỉ số đặc trƣng cho tính chất của chất béo nhƣ: chỉ số peroxide, chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số iod, chỉ số ester...

Để xác định hàm lƣợng chất béo có thể dùng các phƣơng pháp sau:

 Xác định hàm lƣợng chất béo tự do bằng phƣơng pháp Soxhlet

 Xác định chất béo toàn phần theo Vaibun – Ston (Weibull – Stoldt)

 Xác định hàm lƣợng chất béo bằng phƣơng pháp nhanh chóng theo Ghecbe (Gerber) thƣờng dùng xác định bơ trong sữa

 Xác định hàm lƣợng chất béo theo phƣơng pháp Adam Rôzơ Gotliep (Adam – Rose – Gottlieb) thƣờng dùng xác định chất béo trong chất lỏng

4.6.2. Xác định hàm lƣợng lipide thô trong thực phẩm rắn bằng phƣơng pháp Soxhlet

Để xác định hàm lƣợng lipide tự do bằng phƣơng pháp Soxhlet, ngƣời ta thƣờng sử dụng 2 phƣơng pháp:

 Phƣơng pháp trực tiếp: Chiết chất béo ra khỏi mẫu thử, cân lƣợng chất béo thu đƣợc, tính hàm lƣợng chất béo trong thực phẩm.

 Phƣơng pháp gián tiếp: Chiết chất béo ra khỏi mẫu thử, cân lƣợng mẫu thử còn lại. Phƣơng pháp này đƣợc dùng khi cần xác định nhiều mẫu cùng một lúc. Phƣơng pháp này tốn ít thời gian hơn nhƣng kém chính xác hơn.

Trong phƣơng pháp Soxhlet chất béo đƣợc chiết bằng các dung môi hữu cơ. Vì thế cần lựa chọn dung môi đảm bảo các yêu cầu sau:

 Các dung môi phải hòa tan đƣợc các chất béo nhƣ dietyl ether, petrolium ether, benzen, n – hecxan, tertraclorua cacbon…

 Các dung môi chiết chất béo phải có trọng lƣợng riêng nhỏ nên độ bay hơi cao, nhiệt độ sôi thấp, cho phép chiết nhanh chóng chất béo. Nhiệt độ sôi của dung môi càng thấp, nó càng d loại bỏ ra khỏi chất béo sau khi chiết.

 Trong phòng thí nghiệm thƣờng dùng nhiều nhất là dietyl ether, n – hecxan vì nó có độ bay hơi cao, nhiệt độ sôi thấp, d tinh chế nhƣng nó có nhƣợc điểm d khuếch tán ra không khí và có mùi khó chịu, d gây ngủ.

 Dung môi phải thật khô và thật sạch, không còn chứa nƣớc cũng nhƣ mẫu thử phải khô.

Một số phòng thí nghiệm dùng các dung môi petrolium ether, n – hecxan. Chúng có nhiệt độ sôi cao sẽ tốn nhiên liệu đun nóng hơn, ƣu điểm ít bay hơi trong không khí hơn dietyl ete nhƣng độc hơn. Tốc độ và mức độ chiết chất béo hoàn toàn phụ thuộc vào mức độ nghiền nhỏ của mẫu thử, bản chất và độ thuần khiết của dung môi. a. Nguyên tắc

Dùng dung môi hữu cơ để hòa tan tất cả chất béo tự do có trong thực phẩm, sau đó đuổi dung môi hữu cơ, sấy khô và cân chất béo thu đƣợc và tính ra hàm lƣợng chất béo có trong thực phẩm.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm.

Tài liệu trích dẫn: TCVN 3703-90

Dƣới đây trình bày phƣơng pháp xác định hàm lƣợng chất béo bằng phƣơng pháp trực tiếp.

b. Dụng cụ - Hóa chất - Thiết bị

– Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm – Cối chày, máy xay mẫu – Đũa thủy tinh. – Ống giấy ép, giấy lọc. – Mặt kính đồng hồ. – Na2SO4 khan – Bình hút ẩm – Cân phân tích, chính xác đến 0,0001g. – Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ ở 105 o C – Bếp cách thủy, bếp điện gián tiếp có điều chỉnh nhiệt độ khoảng 40-500C. – Bộ chiết chất béo Soxhlet một bình hoặc nhiều bình hoặc chiết tự động

Hình 4.7. Hệ thống chi t Soxhlet 2. Ống chiết

5. Bình cầu chứa dung môi. 1. Ống sinh hàn. 3. Ống chuyển dịch chiết (xiphông) 4. Dung dịch chiết. 6. Dung môi bay hơi.

Nguyên lý hoạt động của bộ chiết Soxhlet: Dung môi trong bình đƣợc đun sôi nhẹ trên bếp cách thủy không quá 45oC – 50oC. Hơi dung môi theo ống chuyển dịch chiết lên trên ống chiết tới ống sinh hàn. Tại đây dung môi đƣợc làm lạnh, ngƣng tụ lại và chảy về ống chiết. Khi lƣợng dung môi trong ống chiết bằng độ cao của ống xiphông thì toàn bộ dung môi đã hòa tan chất béo trong ống chiết sẽ tràn về bình cầu. Hơi dung môi lại tiếp tục bay lên và chu trình chiết trên lại tiếp di n

c. Cách tiến hành

Bƣ c 1: Chuẩn bị bình cầu

- Rửa sạch bình cầu - Sấy bình cầu ở nhiệt độ 105oC đến khối lƣợng không đổi. - Làm nguội trong bình hút ẩm. - Cân khối lƣợng bình cầu, mo(g) - Trƣớc khi lắp bình cầu vào bộ chiết, cho dung môi đến khoảng 2/3 thể tích bình.

Bƣ c 2: Chuẩn bị mẫu

- Nghiền nhỏ mẫu bằng cối, chày hoặc máy xay đồng nhất mẫu. - Cân khoảng 5g mẫu chính xác đến 0,0001g vào chén sấy, m(g). - Sấy mẫu ở nhiệt độ 125oC từ 30 phút đến 1 giờ hoặc sấy ở 105oC trong 6 giờ hoặc đun trên bếp cách thủy khô cạn - Lấy mẫu ra làm nguội trong bình hút ẩm khoảng 30 phút và trộn với 5g

Na2SO4 khan.

- Nếu xác định chất béo tự do theo hàm lƣợng chất khô, cần phải sấy khô đến khối lƣợng không đổi trƣớc khi cân mẫu, có thể kết hợp xác định độ ẩm của mẫu.

- Chuyển mẫu vào ống giấy, dùng bông thấm dung môi lau sạch chén sấy rồi lấy miếng bông cho vào ống giấy cho vào ống chiết của bộ Soxhlet. Nếu không có ống giấy thì dùng giấy lọc gói cẩn thận mẫu và bông, cho vào ống chiết của bộ Soxhlet. - Rửa chén sấy bằng dung môi, rót dịch rửa qua ống giấy vào ống chiết.

Bƣ c 3: Chuẩn bị chi t

- Lắp bộ chiết:

+ Lắp ống chiết đã có ống giấy chứa mẫu vào bình cầu, + Rót dung môi vào ống chiết cho đến khi nó bắt đầu chảy qua ống dẫn vào bình cầu;

+ Nối ống sinh hàn với ống chiết, không đƣợc đậy kín ống sinh hàn; + Kiểm tra độ kín giữa các chỗ nối các bộ phận. Các bộ phận nối với nhau bằng các nối nhám nên có thể bôi nhẹ một chút vazoline. + Cố định thiết bị bằng giá đỡ và các kẹp càng cua có lót cao su hoặc giấy mềm.

Nối nguồn nƣớc:

+ Nối nguồn nƣớc vào vòi dƣới ống sinh hàn, vòi trên nối với ống nƣớc ra + Nếu lắp nhiều bình thì liên tiếp đầu ra của bình 1 sẽ là đầu vào của bình 2 + Mở nƣớc chảy đầy ống sinh hàn.

Bƣ c 4: Ti n hành chi t - Đun bình cầu trên bếp cách thủy đến nhiệt độ 450C – 50oC. - Tiến hành chiết 6 – 8 giờ với điều kiện trong 1 giờ không ít hơn 5 - 6 lần và không nhiều hơn 6 - 8 lần dung môi về bình cầu. Thời gian chiết tùy thuộc vào đặc tính của mẫu thực phẩm nhiều chất béo hay ít chất béo. - Chiết đến khi hoàn toàn hết lipide. Thử hết lipide bằng cách, nhấc ống sinh

hàn ra: + Lấy vài giọt dung môi ở ống chiết nhỏ lên mặt kính đồng hồ. + Quan sát mặt kính đồng hồ khi dung môi đã bay hơi hết.

+ Nếu còn vết loang thì dùng dung môi tráng mặt kính đồng hồ cho dịch tráng

vào bình cầu và tiếp tục chiết

+ Nếu không còn vết loang chất béo là đã chiết xong.

Bƣ c 5: Sấy chất béo đ n khối lƣợng không đổi

- Khi hoàn tất việc chiết, chờ cho dung môi chảy hết xuống bình cầu thì ngừng đun, để cho máy nguội bớt, tháo sinh hàn ra, lấy gói mẫu ra khỏi ống chiết. - Ngừng đun, khóa vòi nƣớc, lấy cẩn thận ống sinh hàn ra, tháo ống chiết ra nghiêng cho phần dung môi chảy qua ống dẫn vào bình cầu.

- Mang bình cầu đi chƣng cất thu hồi dung môi. - Sấy bình cầu có chất béo ở nhiệt độ 105oC trong 1 giờ. - Làm nguội trong bình hút ẩm và cân

- Tiếp tục sấy, làm nguội và cân đến khối lƣợng không đổi, thời gian mỗi lần

sấy tiếp theo là 30 phút.

- Ghi lại khối lƣợng bình cầu và chất béo sau khi sấy m1 (g)

d. Tính kết quả

Hàm lƣợng chất béo tính bằng % theo công thức:

(

m0 là khối lƣợng của bình cầu (g) m1 là khối lƣợng bình cầu và chất béo (g) m là khối lƣợng mẫu (g)

4.6.3. Xác định hàm lƣợng lipide trong thực phẩm lỏng bằng phƣơng pháp Adam Rose

a. Nguyên tắc

Ở môi trƣờng amoniac và cồn, chiết xuất lipide bằng ether và ether dầu hỏa. Để bay hơi hết ether và dầu hỏa, cân lipide và từ đó tính ra hàm lƣợng lipide trong 100g thực phẩm.

Amoniac có nhiệm vụ hòa tan protein, làm thay đổi sức căng mặt ngoài của các chất béo, cắt dây nối giữa chất béo và đạm để lipide hòa tan d dàng hơn.

Cồn có tính chất hút nƣớc làm cho lipid d hòa tan trong ether hơn, tham gia vào việc cắt dây nối giữa chất béo và đạm và sau cùng ete hỗn hợp với sữa d dàng hơn

Ether có tính chất hòa tan lipide, nhƣng cũng hòa tan các chất khác nhƣ nƣớc và các chất hòa tan trong nƣớc nhƣ: lactose, muối khoáng… Do đó ngƣời ta phải dùng thêm ether dầu hỏa. Ether dầu hỏa d hút nƣớc hơn ether thƣờng, có tính chất đẩy nƣớc và các chất hòa tan trong nƣớc ra khỏi ether thƣờng, làm cho ether thƣờng chỉ chứa chất béo và ether dầu hỏa.

Không thể dùng ete dầu hỏa thay cho ete thƣờng đƣợc vì dầu hỏa không thể hòa tan đƣợc các chất béo có chứa nƣớc.

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Bình chiết (bình lắng gạn)  Dung dịch cồn amoniac  Dung dịch ether  Dung dịch phenolphtalien  Tủ sấy

c. Cách tiến hành

 Cho vào bình lắng gạn: 96

 Thực phẩm: 10ml  Dung dịch cồn amoniac: 10ml  Ether: 11ml  Chỉ thị phenolphtalein: 2 giọt

 Lúc đầu lắc khẽ, sau lắc mạnh dần và cuối cùng lắc thật mạnh. Để yên trong

30 phút, trong bình sẽ chia làm 2 lớp:  Lớp dƣới là lớp amoniac hòa tan protide và các thành phần khác của thực phẩm

 Lớp trên là ether hòa tan chất béo và có lẫn một số chất khác.

 Tách lấy lớp ether, bỏ lớp dung dịch amoniac hoặc giữ lấy để định lƣợng protide theo phƣơng pháp kết tủa bởi acid.

 Cho thêm vào lớp ether 10ml ether dầu hỏa, lắc thật mạnh rồi để yên 15 phút, các chất không phải là chất béo sẽ tách ra và lắng xuống dƣới đáy bình lắng gạn, đƣợc dồn vào lớp dung dịch amoniac.

 Chuyển hết phần ether vào chén thủy tinh đã sấy khô, cân sẵn. Rửa bình lắng gạn 2 lần, mỗi lần với 5ml ether và dồn hết cả vào chén thủy tinh. Để bốc hết hơi ether ở nhiệt độ thƣờng, sau đó cho cả vào tủ sấy 1050C trong 30 phút, lấy ra để vào bình hút ẩm cho đến nguội và cân.

d. Tính kết quả

Hàm lƣợng chất béo tính theo công thức sau:

⁄ ( ) ( )

m1: trọng lƣợng chén và lipide (g) m0: trọng lƣợng chén (g) Vmẫu: Thể tích mẫu (ml)

4.6.4. Xác định chỉ số acid, chỉ số peroxide, chỉ số iod trong dầu mỡ động thực vật

4.6.4.1. Xác định chỉ số acid

Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid béo tự do chứa trong 1g chất thử.

Xác định chỉ số acid trong dầu mỡ động thực vật bằng phƣơng pháp trung hòa.

a. Nguyên tắc

Dùng dung dịch NaOH 0,1N để trung hòa các acid béo tự do trong chất cần thử và phenolphtalein làm chỉ thị màu.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các loại dầu mỡ động thực vật.

Tài liệu trích dẫn: TCVN 6127:2010

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ, vật liệu thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Dung dịch NaOH 0,1N

 Dung dịch cồn 98%  Dung dịch ete trung tính  Phenolphtalein 1%  Nồi nhôm  Bếp điện

c. Cách tiến hành

Cân chính xác khoảng 3-5g dầu mỡ, hòa tan trong 50ml hỗn hợp gồm 25ml cồn, 25ml ete trung tính. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi có màu hồng bền vững (trong 30s) với phenolphtalein làm chỉ thị.

Đối với các chất có chỉ số acid dƣới 1, định lƣợng bằng micro buret.

Đối với các loại tinh dầu có nhiều este d bị xà phòng hóa, dùng dung dịch NaOH 0,05N.

d. Tính kết quả

5,61: số mg KOH tƣơng ứng với 1ml dung dịch NaOH 0,1N

a: số ml dung dịch NaOH 0,1N đã sử dụng trong định lƣợng

b: trọng lƣợng chất thử để định lƣợng (g)

Chú ý:Khi dùng NaOH 0,05N để chuẩn độ thì chỉ số acid đƣợc tính theo công

thức:

4.6.4.2. Xác định chỉ số peroxide

a. Nguyên tắc

Ở môi trƣờng acid, peroxide giải phóng I2từ muối KI ở nhiệt độ nóng hoặc lạnh. Chuẩn độ iod đƣợc giải phóng ra thể tự do bằng dung dịch natri thiosulfate.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các loại dầu mỡ động thực vật.

Tài liệu trích dẫn: AOAC 965.33-2010

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ, vật liệu thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Dung dịch chloroform  Dung dịch acid acetic tinh khiết  Dung dịch KI bão hòa  Dung dịch Na2S2O3 0,002N  Hồ tinh bột  Hệ thống sinh hàn khí  Bếp điện

c. Cách tiến hành

Phương pháp lạnh:

Cho một luồng khí lạnh CO2 khô vào bình nón có nút nhám dung tích 250ml đã sấy khô, trong 10 – 15 phút. Cho ngay thật nhanh một lƣợng chất thử (khoảng 1g) cân trong một ống nghiệm nhỏ, đóng nhanh nút lại. Thêm 10ml cloroform (mỗi lần cho thêm thuốc thử đều phải đóng nhanh nút để tránh không khí vào bình thay thế khí CO2), lắc đều để hòa tan. Cho 15ml acid acetic và 1ml dung dịch bão hòa KI, lắc đều, đóng kín nút lại và để ở chỗ tối trong 5 phút. Sau đó, cho thêm 75ml nƣớc cất đã đun sôi (để loại oxy) để nguội, lắc thật mạnh, và chuẩn độ iod giải phóng ra thể tự do bằng dung dịch Na2S2O3 0,002N với chỉ thị hồ tinh bột. Gần cuối giai đoạn chuẩn độ, cứ nhỏ một giọt thuốc thử lại lắc thật mạnh.

Song song làm một mẫu trắng với những thuốc thử trong cùng một điều kiện thao tác nhƣ trên, nhƣng không có chất cần thử.

Phương pháp nóng:

Cho vào bình cầu của máy cất 10ml acid acetic và 10ml cloroform. Lắp ống sinh hàn và đặt lên nồi cách thủy sôi cho đến khi thấy hơi cloroform bay đến tận cổ dƣới của ống sinh hàn (mục đích là để đuổi hết không khí ra).

Cho 1ml dung dịch KI bão hòa từ phía trên ống sinh hàn xuống và tráng ống bằng 6 giọt nƣớc cất. Nhấc nhanh ống sinh hàn ra và cho nhanh 1g chất thử vào,đóng ống sinh hàn và tiếp tục đun trong vòng 5 phút. Lấy bình cầu ra và làm lạnh dƣới vòi nƣớc lạnh. Thêm 50ml nƣớc cất đã đun sôi để nguội và chuẩn độ iod đƣợc giải phóng ra bằng dung dịch Na2S2O3 0,002N với chỉ thị là hồ tinh bột.

Song song làm một mẫu trắng với những thuốc thử trong cùng một điều kiện thao tác nhƣ trên, nhƣng không có chất cần thử.

d. Tính kết quả

Chỉ số peroxide có thể tính bằng số ml Na2S2O3 0,002N cần thiết để chuẩn độ iod do peroxide của 1g chất thử giải phóng ra dạng tự do từ muối KI.

Chỉ số peroxide = (N - n)

N: số ml Na2S2O3 0,002N dùng để chuẩn độ mẫu thử n: số ml Na2S2O3 0,002N dùng để chuẩn độ mẫu trắng

Chỉ số peroxide có thể biểu thị bằng số mmol peroxide trong 1kg chất thử.

0.05: số mmol peroxide tƣơng ứng với 1ml Na2S2O3 1N N: số ml Na2S2O3 0,002N dùng để chuẩn độ mẫu thử n: số ml Na2S2O3 0,002N dùng để chuẩn độ mẫu trắng P: trọng lƣợng của mẫu thử dùng để định lƣợng (g)

500: chuyển từ dung dịch 0,002N sang dung dịch 1N

Chỉ số peroxide có thể biểu thị bằng số g iod đƣợc giải phóng ra thể tự do từ

muối KI bởi 100g chất thử bằng:

0,0002538 là số gam iod tƣơng ứng với 1ml dung dịch Na2S2O30,002N 4.6.4.3. Chỉ số iod

Những liên kết không bão hòa của các acid béo không no có khả năng gắn iod hoặc các halogen khác, do đó chỉ số iod xác định tổng quát các acid béo không no trong chất béo.

Chỉ số iod là số gam iod kết hợp với 100g chất béo.

Các phƣơng pháp xác định chỉ số iod: Có 3 phƣơng pháp xác định chỉ số iod:

 Phƣơng pháp Wijs dùng thuốc thử monoclorua iod  Phƣơng pháp Hanus dùng bromua iod  Phƣơng pháp Hubl dùng iod với xúc tác là HgCl2 a. Nguyên tắc

Nguyên tắc của 3 phƣơng pháp cũng giống nhau và nhƣ đã nói ở trên chỉ có thuốc thử khác nhau: cho chất béo hòa tan trong dung môi không có nƣớc, tiếp xúc với thuốc thử ở chỗ tối. Phần thuốc thử thừa cho kết hợp vơi KI sẽ giải phóng I2 dạng tự do. Định lƣợng iod bằng dung dịch Na2S2O3 chuẩn.

Cần tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện sau:

 Tiến hành thử ở chỗ tối, tránh ánh sáng mặt trời  Để thuốc thử tiếp xúc với chất béo trong một thời gian cần thiết.  Thuốc thử cần phải dƣ, lƣợng dƣ cần phải gần bằng nửa lƣợng cho vào.  Lƣợng thuốc thử bao giờ cũng cố định và bằng 25ml dung dịch 0.2N. Do đó, trọng lƣợng chất béo cần để định lƣợng phải tính sao cho tƣơng đƣơng với lƣợng thuốc thử, nghĩa là phải tùy theo chỉ số iod nhiều hay ít mà cân một lƣợng chất béo thích hợp.

 Lƣợng chất thử cần lấy cho mỗi mẫu có thể tính đƣợc bằng cách đem chia số 20 cho chỉ số iod dự đoán cao nhất của chất cần thử, thí dụ với mỡ heo, chỉ số iod cao nhất là 66. Vì vậy, có thể cân một lƣợng bằng 20:66 = 0,3g để xác định chỉ số iod.

Lƣợng chất thử cần lấy và thời gian cần thiết để thuốc thử tiếp xúc với chất béo có thể tham khảo bảng 4.4.

Bảng 4.5. Lƣợng chất thử và thời gian cần thi t để thuốc thử ti p xúc v i chất béo

Chỉ số iod Lƣợng chất thử (g) Thời gian cần thiết để thuốc thử tiếp xúc với chất béo (giờ)

0 – 30 1,0 6

100

30 – 50 0,6 8

50 – 100 0,3 12

100 – 150 0,2 18

150 - 200 0,1 24

Trong trƣờng hợp chỉ số iod cao hơn chỉ số dự tính, phải xác định lại với số lƣợng chất béo cần thử ít hơn.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các loại dầu mỡ động thực vật.

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ, vật liệu thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Thuốc thử Wijs  Thuốc thử Hanus  Thuốc thử Hubl  Dung dịch ete trong cồn 5%  Tetraclorua cacbon (CCl4)  Cloroform  Dung dịch KI bão hòa  Dung dịch Na2S2O3 0,1N  Hồ tinh bột

c. Cách tiến hành

Phương pháp Wijs:

Cho vào một bình khô và sạch dung tích 250 – 300 ml, có nút nhám: chất cần thử (lƣợng này tùy theo chỉ số iod, 3ml ete có chứa 5% cồn, lắc hòa tan thêm 25ml dung dịch clorua iod (thuốc thử Wijs).

Lắc trong 1 phút. Để yên trong tối, nhiệt độ 200C. Tùy theo thời gian tƣơng ứng với chỉ số iod dự kiến có trong mẫu thử, sau đó cho thêm theo thứ tự: 10ml dung dịch KI, 50ml nƣớc cất.

Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1N, gần cuối cho thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột và 2- 3ml cloroform, tiếp tục chuẩn độ cho đến khi mất màu hoàn toàn.

Song song làm một mẫu trắng với những thuốc thử trong cùng một điều kiện thao tác nhƣ trên, nhƣng không có chất cần thử.

Phương pháp Hanus:

Cho vào một bình khô và sạch dung tích 250 – 300ml, có nút nhám: chất cần thử (lƣợng này tùy theo chỉ số iod), lắc hòa tan thêm 10ml cloroform, 25ml dung dịch bromua iod (thuốc thử Hanus).

Đậy lọ bằng nút nhám đã nhúng trƣớc vào dung dịch KI, lắc cẩn thận theo chiều chuyển động quay và để trong tối (thời gian 30 phút cho những chất có chỉ số iod dƣới 100 và 1 giờ cho những chất có chỉ số iod trên 100). Sau thời gian này, chất lỏng trong 101

bình phải có màu nâu, nếu chất lỏng có màu nhạt hơn, phải làm lại với lƣợng chất cần thử nhỏ hơn. Sau đó cho thêm dần dần vào bình 20ml dung dịch KI 15%, 100ml nƣớc cất, rồi vừa lắc mạnh, vừa chuẩn độ bằng Na2S2O30,1N cho đến màu vàng nhạt thì cho thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột và 2-3ml cloroform, tiếp tục chuẩn độ cho đến khi mất màu hoàn toàn.

Song song làm một mẫu trắng với những thuốc thử trong cùng một điều kiện thao tác nhƣ trên, nhƣng không có chất cần thử.

Phương pháp Hubl:

Tiến hành thử nhƣ trên nhƣng hòa tan chất thử trong 10ml tetraclorua cacbon, dùng 25ml thuốc thử Hubl và để yên trong tối từ 12 – 24 giờ

d. Tính kết quả

Phương pháp Wijs:

( )

P: lƣợng thuốc thử để xác định (g)

n: số ml natri thiosulfonat 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu trắng

n’: số ml natri thiosulfonat 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thử

Phương pháp Hanus: Tính kết quả nhƣ phƣơng pháp Wijs

Phương pháp Hubl: Tính kết quả nhƣ phƣơng pháp Wijs

4.7. Phân tích một số phụ gia thực phẩm

4.7.1. Ý nghĩa c a việc phân tích một số phụ gia thực phẩm

Phụ gia thực phẩm là những chất không đƣợc coi là thực phẩm hoặc thành phần của thực phẩm. Phụ gia thực phẩm là chất ít hoặc không có giá trị dinh dƣỡng, đƣợc con ngƣời chủ động cho vào thực phẩm với mục đích đáp ứng nhu cầu công nghệ trong quá trình sản xuất, chế biến, xử lý, bao gói, vận chuyển, bảo quản thực phẩm nhằm giữ nguyên hoặc cải thiện đặc tính nào đó của thực phẩm.

Việc sử dụng phụ gia thực phẩm cần tuân theo quyết định số 3742/ 2001/QĐ- BYT ngày 31/8/2001. Trong quyết định này qui định có 337 hợp chất hóa học thuộc danh mục các chất phụ gia đƣợc phép sử dụng trong sản xuất, chế biến và bảo quản thực phẩm.

Việc sử dụng phụ gia thực phẩm là nhu cầu cần thiết của xã hội. Nếu dùng đúng theo qui định thì an toàn và không có hại cho sức khỏe, song nếu lạm dụng và sử dụng phụ gia ngoài danh mục cho phép thì sẽ có hại cho sức khỏe con ngƣời, nhất là hàn the, phẩm màu nằm ngoài danh mục của Bộ Y Tế cho phép.

4.7.2. Định danh phẩm màu hữu cơ tan trong nƣ c bằng phƣơng pháp sắc ký giấy

a. Nguyên tắc

Trong môi trƣờng acid, phẩm màu hữu cơ tổng hợp có tính acid đƣợc hấp phụ vào sợi len lông cừu nguyên chất màu trắng, rồi đƣợc chiết từ sợi len bằng dung dịch

102

amoniac, sau đó đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thu nguyên tử UV-VIS.

Phạm vi áp dụng: Đối với tất cả các loại thực phẩm.

Tài liệu trích dẫn: Thƣờng quy kỹ thuật kèm theo quyết định số 883/2001/QĐ - BYT

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Aceton  Ether thƣờng  n- hexan  Acid acetic 10%: đong 10ml acid acetic đậm đặc thêm nƣớc cất vừa đủ 100ml  Dung dịch amoniac 1,25%: đong 50ml dung dịch amoniac 25% thêm nƣớc cất vừa đủ 1000ml.

 Len lông cừu  Tartrazinne (102)  Sunset Yellow (110)  Carmoisin (122)  Amaranth (123)  Ponnceau 4R (124)  Erythrosin (127)  Indigocarmine (132)  Brilliant blue FCF (133)  Bình triển khai sắc ký  Giấy sắc ký  Nồi nhôm  Bếp điện

Phát hiện phẩm màu hữu cơ tổng hợp có tính kiềm không đƣợc phép dùng trong chế biến thực phẩm. Vì không đƣợc phép dùng trong thực phẩm bất kỳ một phẩm màu kiềm nào, cho nên trƣớc hết nên kiểm tra sự có mặt của nhóm này.

Tiến hành: Cho 5ml dung dịch thử vào ống nghiệm, thêm 5 giọt amoniac 25% và 5ml ether thƣờng. Lắc kỹ, rót lớp ether sang ống nghiệm khác, bỏ phần nƣớc. Dù lớp ether có màu hay không tiến hành nhƣ sau:

 Rửa lớp ether bằng cách lắc với nƣớc. Lấy lớp ether, bỏ phần nƣớc, lặp lại nhiều lần.

 Cho thêm 5ml dung dịch acid acetic 10% và lắc.

Đánh giá: dung dịch acid acetic bên dƣới có màu là phẩm kiềm không đƣợc phép sử dụng.

c. Cách tiến hành:

Bƣ c 1: Chuẩn bị mẫu

 Trƣờng hợp 1: Đối với các sản phẩm dƣới dạng lỏng nhƣ rƣợu, nƣớc giải khát...

103

+ Lấy chính xác 50ml dung dịch mẫu thử cho vào cốc 250ml. Đặt trên nồi cách thuỷ sôi 1000C để đuổi cồn hoặc khí CO2 có trong dung dịch thử, sau đó acid hoá bằng CH3COOH 10% đến pH = 5 (kiểm tra bằng giấy chỉ thị vạn năng)

+ Cho một sợi len lông cừu nguyên chất màu trắng dài khoảng 50cm vào mẫu thử, tiếp tục đun trên nồi cách thuỷ soi tới khi sợi len hấp thu hết phẩm màu từ dung dịch thử (dung dịch trong cốc không còn màu nữa, nếu dug dịch còn màu thì cho thêm len nhuộm tiếp). Vớt sợi len ra và rửa sạch dƣới vời nƣớc và tráng lại bằng nƣớc cất, vắt khô sợi len.

+ Cho sợi len vào cốc thuỷ tinh, thêm 10ml dung dịch amoniac 1,25% để chiết màu từ sợi len ra. Khi màu đã thôi ra dung dịch amoniac, chắt dung dịch màu này ra một cốc khác. Làm nhƣ vậy cho đến khi sợi len hết màu. Lúc này phẩm đã đƣợc thôi hết ra dung dịch amoniac.

+ Tập trung tất cả dịch chiết vào một cốc thuỷ tinh, làm bay hơi trên nồi cách thuỷ đến vừa cạn, cặn này dùng để định tính và định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thu nguyên tử UV-VIS.

Ghi chú: Khi cho dung dịch amoniac 1,25% vào, nếu sợi len chuyển thành màu xanh lục xỉn thì sản phẩm đã dùng màu tự nhiên để chế biến.

 Trƣờng hợp 2: Đối với các sản phẩm nhuộm màu dƣới dạng đƣờng bột nhƣ

kẹo.... + Cân chính xác khoảng 20g kẹo cùng màu cho vào cốc có mỏ dung tích 250ml, thêm 50ml nƣớc cất, ngâm cho thôi hết màu của kẹo ra. Gạn lấy dung dịch màu đem acid hoá bằng dung dịch CH3COOH 10% đến pH = 5. Tiếp tục tiến hành bƣớc nhuộm len và chiết màu từ len ra bằng dung dịch amoniac 1,25% nhƣ trƣờng hợp 1.

+ Đối với sản phẩm nhuộm màu dƣới dạng chất béo nhƣ mỡ, bơ, kem bánh ga tô...cân chính xác khoảng 20g mẫu cùng màu cho vào cốc có mỏ dung tích 250ml, thêm 50ml nƣớc cất, đặt trên bếp cách thuỷ sôi cho tan hết bơ mỡ... Tiếp tục đun thêm 15 phút nữa cho màu trong mẫu tan hoàn toàn trong nƣớc rồi làm lạnh trong tủ lạnh và vớt bỏ lớp chất béo đã đông lại. Phần dung dịch có màu đem acid hoá bằng dung dịch CH3COOH 10% đến pH = 5. Tiếp tục tiến hành bƣớc nhuộm len và chiết màu từ len bằng dung dịch amoniac 1,25% nhƣ trƣờng hợp 1.

 Trƣờng hợp 3: Đối với các sản phẩm nhƣ bánh qui, thịt, lạp xƣởng, sữa

chua.... + Cân chính xác 20g mẫu thử đã đƣợc đồng nhất vào cốc có mỏ dung tích 250ml, thêm 10ml nƣớc cất, cho thêm 30ml aceton, khuấy cho màu trong chất thử thôi ra. Lọc dịch chiết vào bình gạn. Chiết bã còn lại 2 lần nữa với aceton, mỗi lần 30ml. Tập trung tất cả dịch chiết vào ph u chiết. Thêm vào ph u chiết 30ml nƣớc cất, lắc đều rồi lại thêm 30ml n- hexan để loại bỏ chất béo có trong dịch chiết. Lắc kỹ nhẹ rồi để lắng cho tách thành 2 lớp.  Lớp trên là n- hexan có chứa chất béo  Lớp dƣới gồm phẩm màu tan trong nƣớc và aceton.

+ Rút phần dƣới ra cốc 250ml, để bay hơi dịch chiết trên bếp cách thuỷ sôi cho tới khi hết hơi dung môi rồi acid hoá bằng dung dịch CH3COOH 10%

104

đến pH = 5. Tiếp tục tiến hành bƣớc nhuộm len và chiết màu từ len bằng dung dịch amoniac 1,25% nhƣ trƣờng hợp 1.

Bƣ c 2: Chuẩn bị triển khai sắc ký

 Hòa cặn đã chiết đƣợc bằng dung dịch cồn : nƣớc (1: 1)  Chấm sắc ký giấy, cho vào bình sắc ký với dung dịch triển khai n-butanol : nƣớc : acid acetic (10:6:5)

 Tiến hành chạy sắc ký trong thời gian 2-3h  Lấy giấy sắc ký ra, để khô trong tủ sấy

d. Tính kết quả

Dựa vào các vệt màu trên sắc ký giấy, tính hệ số di chuyển Rf, từ đó rút ra kết luận cần thiết.

4.7.3. Xác định hàm lƣợng nitrite, nitrate trong thực phẩm

a. Nguyên tắc

Trong môi trƣờng acid (pH = 2) nitrite sẽ diazo hoá acid sulphanilic, sau đó kết hợp với alpha naphthylamin cho hợp chất naphthylamino azobenzen sulphonic có màu đỏ không bền.

Nitrate trong nƣớc, sản phẩm thịt và rau đƣợc cadimi khử thành nitrite. Đánh giá nitrite trƣớc và sau khi khử nitrate, tiếp theo tính toán hàm lƣợng nitrate bằng phép so sánh giữa nitrite trƣớc và sau khi khử.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các sản phẩm thịt, rau quả, nƣớc

Tài liệu trích dẫn: AOAC 157-160.1995

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm

 Máy đo phổ UV-VIS  Cân phân tích có độ chính xác 0,1mg  Máy xay hoặc máy đồng nhất.  Máy lắc  Giấy lọc  Dung dịch kali ferrocyanua trihydrat 10%: hoà tan 10,6g kali ferrocyanua

trihydrat vào nƣớc, pha loãng tới 100ml với nƣớc. (thuốc thử 1)

 Dung dịch kẽm acetat dihydrat 21,9%: hoà tan 21,9g kẽm acetat dihydrat trong nƣớc, thêm 2ml acid acetic băng và pha loãng tới 100ml với nƣớc. (thuốc thử 2)

 Dung dịch dinatri tetraborat decahydrat 5%: hoà tan 50g dinatri tetraborat decahydrat trong 1000ml nƣớc. (thuốc thử 3)

 Dung dịch chuẩn nitrite 1000ppm  Dung dịch sulphanilamid 0,2%: hoà tan 2g sulphanilamid trong 800ml nƣớc nóng, lọc, thêm 100ml acid hydrocloric đặc, khuấy kỹ và pha loãng tới 1000ml với nƣớc cất. (thuốc thử 4)

105

 Dung dịch N-1 naphthylethylen diamin dihydrochlorua 0,1%: hoà tan 0,25g N-1 naphthylethylen diamin dihydrochlorua trong nƣớc. Pha loãng tới 250ml với nƣớc cất. Bảo quản trong lọ nâu nút kín và giữ trong tủ lạnh. (thuốc thử 5)  Dung dịch acid HCl 18,9%: pha loãng 445ml acid hydrochloric đặc tới 1000ml với nƣớc. (thuốc thử 6)

 Dung dịch chuẩn gốc natri nitrite nồng độ 10000mg/l: hoà tan 1g natri nitrite trong nƣớc và pha loãng tới 100ml. (thuốc thử 7)

 Dung dịch làm việc natri nitrite nồng độ 50mg/l: pha loãng 5ml dung dịch gốc tới 1000ml với nƣớc. (thuốc thử 8)

 Dung dịch dihydrogen dinatri ethylen diamine tetra acetat dihydrat 1%: hoà tan 20ml acid hydrochloric đặc với 500ml nƣớc cất, thêm 10g dihydrogen dinatri ethylen diamine tetra acetat dihydrat và 55ml dung dịch amoniac đặc. Pha loãng tới 1000ml với nƣớc. Chỉnh pH=9,6 – 9,7. (thuốc thử 9)

 Cadimi kim loại.(thuốc thử 10)

c. Cách tiến hành

Bƣ c 1: Chuẩn bị mẫu (Chiết nitrite và nitratetừ sản ph m thịt)

Lấy 200g mẫu đại diện của mẫu, đồng nhất bằng cách cho qua máy xay. Cân chính xác khoảng 9g đến 10g (m) mẫu đã đồng nhất vào bình tam giác và thấm ƣớt với 5ml dung dịch thuốc thử borax (thuốc thử 3), 150ml nƣớc cất đun nóng (>700C). Đun trong nồi cách thuỷ sôi 30 phút. Để nguội, chuyển vào bình định mức 250ml và thêm tuần tự 2ml thuốc thử 1 sau đó 2ml thuốc thử 2 và lắc. Định mức tới vạch bằng nƣớc cất. Để dung dịch trong 30 phút sau đó chắt cẩn thận lớp chất lỏng ở trên, lọc qua giấy lọc (không có nitrate và nitrite), thu lấy dịch lọc trong.

Bƣ c 2: Xây dựng đƣờng chuẩn

Pha loãng nồng độ dãy chuẩn ta đƣợc dung dịch tham chiếu nhƣ sau:

Bảng 4.6. Bảng pha loãng nồng độ nitrite chuẩn

Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4 Bình 5

0 5 10 20 25

V(ml) dung dịch nitrit chuẩn 50mg/l

V(ml) nƣớc cất 100 95 90 80 75

độ nitrite 0 2,5 5,0 7,5 10

Nồng (mg/l)

Bảng 4.7. Dãy chuẩn để xác định nitrite, nitrate

Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4 Bình 5 Bình mẫu 1 Bình mẫu 2

V(ml) dung 10 10 10 10 10 10ml 20ml

106

tham

dịch chiếu

cất 50 Nƣớc (ml)

10 Thuốc thử 4 (ml)

6 Thuốc thử 6 (ml)

Để yên trong bóng tối 5 phút

2 Thuốc thử 5 (ml)

Để yên trong bóng tối 3 phút

Thêm nƣớc cất tới vạch

0 0,25 0,5 0,75 1,0 Cx1 Cx2 Nồng độ dãy chuẩn (mg/l)

Abs

Đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 538nm.

Bƣ c 3: Định lƣợng nitrite (Bình mẫu 1)

Hút 10ml dịch lọc từ sản phẩm thịt, rau cho vào bình định mức 100ml. Thêm khoảng 50ml nƣớc cất, 10ml thuốc thử 4 và 6ml thuốc thử 6. Để dung dịch này ở chỗ tối trong 5 phút. Thêm 2ml thuốc thử 5 trộn đều hỗn hợp và để dung dịch vào chỗ tối trong 3 phút. Pha loãng tới vạch mức với nƣớc cất, trộn kỹ hỗn hợp và đo ở bƣớc sóng 538nm. Căn cứ vào đƣờng chuẩn dung dịch đo đƣợc có nồng độ Cx1 (mg/l).

Bƣ c 4: Định lƣợng nitrate (Bình mẫu 2)

Hút 5ml thuốc thử 9 và một chút cadimi ƣớt (khoảng 1g) cho vào trong bình định mức 100ml, cho cadimi vào bình định mức bằng ph u nhỏ và sử dụng một lƣợng nhỏ nƣớc cất tráng ph u. Thêm 25ml của dịch lọc thu đƣợc từ dịch chiết trên, đậy nút và lắc 10 phút trên máy lắc. Pha loãng tới 100ml với nƣớc cất, trộn hỗn hợp thật kỹ và tiếp theo để lắng cadimi. Hút 20ml của dung dịch đã đƣợc xử lý cadimi vào trong bình định mức 100ml và tạo màu nhƣ xác định nitrite.

d. Tính kết quả

107

Căn cứ vào độ hấp thu của dung dịch mẫu từ đƣờng chuẩn, tính ra nồng độ

nitrate hoặc nitrite trong mẫu.

Hàm lƣợng nitrite (mg/kg) trong mẫu tính theo công thức sau:

) ( ⁄

Hàm lƣợng tổng nitrite (mg/kg) trong mẫu sau khi khử nitratetính theo công thức sau:

) ( ⁄

Hàm lƣợng nitrate trong mẫu = (tổng nitrite sau khi khử nitrate – nitrite trƣớc khi

khử nitrate)

: Nồng độ nitrite trong mẫu tính theo đƣờng chuẩn (mg/l) : Nồng độ tổng nitrite trong mẫu sau khi khử nitrate tính theo đƣờng chuẩn (mg/l)

m: khối lƣợng mẫu lấy phân tích (g)

4.7.4. Xác định chất bảo quản sorbic, benzoic bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp

a. Nguyên tắc

Acid sorbic, acid benzoic đƣợc tách ra khỏi thực phẩm bằng quá trình thuỷ phân với NaOH và chiết tách bằng methanol. Hàm lƣợng acid benzoic, acid sorbic sau đó đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA.

Phạm vi áp dụng: Qui trình này áp dụng cho các loại nƣớc giải khát, sản phẩm thịt, cá đóng hộp và các loại bột.

Tài liệu trích dẫn: AOAC 971.15-2000

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detector PDA  Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g  Cân kỹ thuật với độ chính xác 0,01g  Ống ly tâm dung tích 50ml  Dung dịch NaOH 1N: Cân 40g NaOH, hoà tan và định mức 1000ml bằng nƣớc cất

 Dung dịch NaOH 0,1N: cân 4g NaOH, hoà tan và định mức 1000ml bằng nƣớc cất

 Dung dịch H2SO4 10%  Dung dịch K3Fe(CN)6 0,32M: cân 10,6g K3Fe(CN)6, hoà tan bằng nƣớc cất và định mức 100ml

 Dung dịch (CH3COO)2Zn 1M: cân 21,9g (CH3COO)2Zn.2H2O, hoà tan và định mức 100ml bằng nƣớc cất.

108

 Dung dịch K2HPO4 0,2M: cân 4,56g K2HPO4.3H2O, hoà tan và định mức 100ml bằng nƣớc cất.

 Dung dịch K2HPO4 0,02M: cân 4,56g K2HPO4.3H2O, hoà tan và định mức 1000ml bằng nƣớc cất.

 Dung môi methanol: thuộc loại tinh khiết sắc ký  Dung dịch chuẩn gốc 1mg/ml (1000 ppm): cân chính xác 0,1g mỗi loại chuẩn vào cốc có mỏ 50ml, hoà trong 2-3 ml methanol cho tan hoàn toàn. Chuyển vào bình định mức 100ml, tráng rửa cốc và định mức vừa đủ 100ml bằng nƣớc cất. + Dung dịch chuẩn trung gian 100 ppm: hút chính xác 10ml hỗn hợp dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 100ml và định mức bằng nƣớc cất.

+ Dung dịch chuẩn làm việc: lấy chính xác lần lƣợt 1, 5, 10, 20, 50 ml dung dịch chuẩn trung gian 100ppm vào các bình 100ml, định mức đến vạch bằng nƣớc cất ta đƣợc dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ: 1, 5, 10, 20, 50ppm.

c. Cách tiến hành

Bƣ c 1: Xử lý mẫu

 Với mẫu dạng lỏng: hút chính xác 5-20 ml mẫu vào ống ly tâm 50ml. Thêm 2,5ml dung dịch NaOH 1N, lắc vortex.

 Với mẫu dạng rắn: cân chính xác 5-10g mẫu vào ống ly tâm, thêm 25ml dung dịch NaOH 0,1N, lắc vortex.

Sau đó, tất cả các mẫu đƣợc thuỷ phân cách thuỷ ở 70oC trong 30 phút, làm nguội về nhiệt độ phòng. Chỉnh pH = 8 với H2SO410% (dùng giấy chỉ thị màu). Thêm 2ml K3Fe(CN)6 0,32M, đậy nắp, lắc. Thêm 2ml (CH3COO)2Zn 1M, đậy nắp, lắc. Thêm 10ml K2HPO4 0,2M và chuyển toàn bộ mẫu vào bình định mức 100ml, tráng rửa ống ly tâm và định mức đến vạch bằng methanol. Lọc mẫu qua giấy lọc thƣờng, qua màng lọc 0,45µm trƣớc khi bơm vào HPLC.

Bƣ c 2: Cài đặt thông số cho máy HPLC

 Cột: C18 (150mm × 4,6mm × 5µm)  Pha động: Dung dịch K2HPO4 0,02M: MeOH (95:5)  Detector: PDA : λ = 193nm cho acid benzoic, 254nm cho acid sorbic và

230nm cho cả 2 acid  Tốc độ dòng: 1ml/phút  Nhiệt độ buồng cột: 30oC  Thể tích tiêm mẫu: 50µl.

Bƣ c 3: Lập đƣờng chuẩn

Lần lƣợt tiêm dãy chuẩn vào hệ thống HPLC. Xây dựng đồ thị mối liên hệ giữa nồng độ chuẩn và diện tích peak. Khi phân tích cả 2 acid, lấy diện tích peak ở bƣớc sóng 230nm.

d. Tính kết quả

Hàm lƣợng acid benzoic, acid sorbic trong mẫu đƣợc tính theo công thức sau:

109

Xi: hàm lƣợng acid benzoic hoặc acid sorbic có trong mẫu (mg/l hoặc mg/kg)

Ci : nồng độ acid benzoic hoặc acid sorbic tính theo đƣờng chuẩn V: thể tích định mức (100ml)

k: hệ số pha loãng

m: khối lƣợng mẫu (g hoặc ml)

4.8. Phân tích một số chất độc trong thực phẩm

4.8.1. Xác định hàn the bằng phƣơng pháp bán định lƣợng

Từ thập niên 60 trở về trƣớc, hàn the (H3B03 hoặc Na2B407) thƣờng đƣợc dùng làm phụ gia giữ và tăng tính ổn định nên sản phẩm sẽ có tính cứng, dai, giòn và để bảo quản thực phẩm với nồng độ 0.2 – 0,5%.

Tuy nhiên hàn the có tính độc rấtcao, acid boric có thể gây buồn nôn, nôn, tiêu chảy, đau co cứng cơ, chuột rút vùng bụng, nhịp tim nhanh, hoang tƣởng, co giật, hôn mê có thể bị tử vong. Hàn the còn có thể gây nhi m độc mãn tính ảnh hƣởng tới tiêu hóa, hấp thu, chuyển hóa, ảnh hƣởng không tốt tới chức năng gan, thận với biểu hiện ăn mất ngon, giảm cân, tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa, động kinh, suy thận.

Vì vậy đến thập niên 70 hầu hết các tổ chức quốc tế, khu vực và các quốc gia trên thế giới đã không còn xem hàn the là một chất phụ gia thực phẩm và không cho phép dùng hàn the trong chế biến thực phẩm.

Trong quyết định 3742 /2001/QĐ – BYT qui định về danh mục các phụ gia đƣợc phép sử dụng trong thực phẩm, hàn the không có trong danh mục phụ gia thực phẩm đƣợc phép sử dụng.

Để kiểm soát việc sử dụng hàn the trong thực phẩm ngƣời ta dựa vào tính chất H3B03 hoặc Na2B407 trong môi trƣờng acid sẽ tác dụng với curcumin tạo ra rosocyamine có màu đỏ.

a. Nguyên tắc

Mẫu thực phẩm đƣợc acid hóa bằng acid clohydric, sau đó đun nóng trên nồi cách thủy, acid boric (H3BO3) hoặc Natri borat (Na2B4O7) đƣợc phát hiện bằng giấy nghệ. Sự có mặt của H3BO3 hoặc Na2B4O7 sẽ chuyển màu của giấy nghệ sang màu đỏ cam.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho các loại thực phẩm nhƣ chả, nem, bún…

Tài liệu trích dẫn: Thƣờng quy kỹ thuật kèm theo quyết định số 3390/2000/QĐ – BYT.

b. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Giấy lọc  Dung dịch HCl đậm đặc

110

 Giấy quỳ xanh  Bột nghệ (bột Tumeric) hoặc nghệ tƣơi.  Dung dịch amoniac NH3 25%  Cồn 800 (đong 84 ml cồn 950 rồi cho nƣớc cất vừa đủ 100ml nếu chuẩn bị thuốc thử từ bột nghệ)

 Cồn 900 nếu chuẩn bị thuốc thử từ nghệ tƣơi  Nồi nhôm  Bếp điện  Máy ly tâm

Chuẩn bị giấy nghệ (giấy Tumeric) từ bột nghệ: cân 1,5 – 2 g bột nghệ cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm 100 ml Cồn 800 lắc mạnh cho tan hổn hợp rồi lọc qua giấy lọc. Cho dịch ra một khay thủy tinh nhúng giấy lọc vào dịch lọc, chờ thấm đều lấy ra phơi khô ở nhiệt độ phòng sau đó cắt thành những dải giấy có kích thƣớc 1x6cm. Giấy nghệ đƣợc bảo quản trong lọ kín tránh ánh sáng, ẩm và hơi CO2, SO2, NH3, NO…

Chuẩn bị dung dịch chuẩn:Dung dịch chuẩn acid boric có nồng độ 1%: cân chính xác 1g H3BO3 vào bình định mức dung tích 100ml thêm nƣớc cất vừa đủ 100ml. Lắc cho H3BO3 tan hết (có thể đun nóng nhẹ trên nồi cách thủy cho tan hoàn toàn)

c. Các bƣớc tiến hành

Bƣ c 1: Chuẩn bị mẫu thử

- Cho vào cóc có mỏ dung tích 200 ml:

+ 25g mẫu thực phẩm đã nghiền nhỏ trong cối sứ

+ 50 ml nƣớc cất

Dùng đũa thủy tinh trộn mẫu, acid hóa bằng 1,7ml HCl. Kiểm tra bằng giấy quỳ xanh (giấy quỳ phải chuyển sang màu đỏ). Đun cách thủy trong 30 phút, để lắng hoặc ly tâm, sau đó chắt lấy phần dịch trong để phân tích.

Ghi chú:

 Nếu mẫu có chất béo thì làm lạnh bằng nƣớc đá hoặc để trong tủ lạnh rồi vớt bỏ lớp chất béo đã đong lại.

 Nếu mẫu có màu thì loại màu bằng cách cho sợi len nguyên chất vào mẫu để hấp thu hết màu rồi lấy dịch trong không màu đem phân tích

Bƣ c 2: Định tính acid boric hoặc natri borat trong mẫu thử

 Nhúng dải giấy nghệ vào dịch thử cho thấm đều, lấy giấy ra để khô tự nhiên rồi đọc kết quả sau 1 giờ, nhƣng không quá 2 giờ

 Tiến hành đồng thời một mẫu trắng để so sánh (thay 25 g mẫu thực phẩm bằng 25 ml nƣớc cất và làm theo qui trình trên). Nếu mà của giấy nghệ chuyển từ vàng sang đỏ cam thì trong mẫu có H3BO3 hoặc Na2B4O7. Để khẳng định sự có mặt của H3BO3 hoặc Na2B4O7 thì tiếp tục hơ giấy này trên hơi Amoniac, màu đỏ cam sẽ chuyển thành màu xanh đen và chuyển lại màu đỏ hồng ở môi trƣờng acid (hơ trên miệng lọ acid HCl)

 Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp này là 0,001%

111

Bƣ c 3: Bán định lƣợng acid boric hoặc natri borat trong mẫu thử

 Tiến hành phản ứng lên màu: Dùng 9 ống nghiệm có nút dung tích 15ml, đánh số từ 1 đến 9 cho vào các hóa chất lần lƣợt theo bảng 4.5.

Bảng 4.8. Dãy chuẩn để xác định lƣợng hàm lƣợng borat

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ống

Hóa chất

0,0 0,1 0,2 0,5 0,75 1,0 2,5 5,0 0,0 H3BO3 1% (ml)

Nƣớc cất (ml) 10,0 9,9 9,8 9,5 9,25 9,0 7,5 5,0 10.0

0 1 2 5 7,5 10 25 50 0 Hàm lƣợng H3BO3 (mg/10ml của dãy chuẩn)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 Dung dịch mẫu thử (ml)

HCl 36% (ml) 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

0,00 0,02 0,04 0,10 0,15 0,2 0,5 1,0 X Nồng độ % H3BO3 trong mẫu thử

(Nồng độ % H3BO3 đƣợc tính kết quả theo bảng là dựa trên 25g mẫu thử đƣợc chiết bằng 50ml nƣớc cất sau đó lấy 10ml dịch chiết tƣơng ứng với 5g mẫu dùng cho thử nghiệm)

Chú ý: đậy nắp ống chuẩn tránh bay hơi, bảo quản sử dụng đƣợc trong 6 tháng.

 Tiến hành so màu:

+ Dùng giấy nghệ đã đƣợc đánh dấu một đầu (giấy số 9) nhúng đầu không đánh dấu vào dịch thử trên (1/2 chiều dài mẫu giấy) dùng kẹp lấy ra để khô trong không khí.

+ Đồng thời dùng những tờ giấy nghệ đƣợc đánh số từ 1 đến 8 theo dãy dung dịch chuẩn (có số tƣơng ứng) sau đó để khô nhƣ trên.

+ Đọc kết quả sau 1 giờ nhƣng không quá 2 giờ so sánh giấy mẫu thử (giấy số 9) với dãy chuẩn (giấy số từ 1 đến 8) trên một tờ giấy trắng làm nền, dƣới ánh sáng tự nhiên là tốt nhất để nhận biết.

d. Tính kết quả

Nếu màu của giấy mẫu thử tƣơng đƣơng màu của giấy chuẩn nào thì nồng độ H3BO3 trong dịch phân tích tƣơng đƣng với nồng độ H3BO3 của ống chuẩn tƣơng ứng với giấy chuẩn đó.

Nếu mẫu nằm giữa 2 chuẩn thì giá trị đƣợc ƣớc lƣợng giữa hai khoảng đó.

112

Nếu màu giấy mẫu thử vƣợt quá màu dãy giấy chuẩn thì phải làm lại thử nghiệm

với sự pha loãng của dịch thử và đánh giá kết quả theo dãy chuẩn nhƣ trên.

Ghi chú: Nồng độ H3BO3trong mẫu phân tích đƣợc tính theo công thức sau:

C: Số mg H3BO3trong 100g mẫu phân tích. A: Số mg H3BO3 trong 10 ml dung dịch ống chuẩn có màu bằng ống thử. 5: lƣợng mẫu thực phẩm tƣơng ứng với 10ml dịch chiết dùng cho thử nghiệm

4.8.2. Xác định aflatoxin

Aflatoxin đƣợc sinh ra bởi nấm mốc aspergilus flavus và aspergilus parasiticus. Aflatoxin có thể tím thấy trong nhiều sản phẩm nông nghiệp nhƣ ngô, lạc, lúa mạch, lúa mì, hạt bông…Có 4 chất thuộc nhóm aflatoxin có thể tìm thấy trong thực phẩm, đó là Aflatoxin B1, B2, G1, G2. Aflatoxin B1 là chất độc nhất, gây ung thƣ gan cho ngƣời và súc vật. Giới hạn tối đa cho phép độc tố vi nấm aflatoxin B1 trong thực phẩm nói chung là 5µg/kg. Giới hạn tối đa cho phép hàm lƣợng tổng độc tố vi nấm aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thực phẩm nói chung là 15µg/kg.

Chúng là những chất dị vòng có khả năng phát huỳnh quang ddawcj trƣng bởi nhân dihydrofuran hoặc tetrahydrofuran. Chúng phát huỳnh quang khi chiếu chùm tia cực tím (UV 366nm): B1, B2 chuyển thành màu xanh da trời; G1, G2 chuyển thành màu xanh lá cây. Chúng là những chất không phân cực, khối lƣợng phân tử thấp, chịu đƣợc hóa chất và các tính chất lý học, sinh học.

Một số kỹ thuật xác định aflatoxin trong thực phẩm:

 Xác định aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng  Xác định aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV hoặc detector huỳnh quang hoặc sắc ký lỏng ghép khối phổ.

Điều quan trọng là chiết xuất làm sạch mẫu aflatoxin trong thực phẩm, có nhiều phƣơng pháp chiết xuất làm sạch mẫu aflatoxin trong thực phẩm. Các phƣơng pháp chiết xuất làm sạch đang đƣợc áp dụng:

 Chiết xuất aflatoxin trong thực phẩm bằng dung môi hữu cơ và làm sạch bằng cột nhồi thủy tinh silicagen hoặc florisil

 Chiết xuất aflatoxin trong thực phẩm bằng dung môi hữu cơ và làm sạch bằng cột chiết pha rắn SPE/ LC-Si hoặc cột chiết pha rắn LC- CN

 Chiết xuất aflatoxin trong thực phẩm bằng dung môi hữu cơ và làm sạch bằng cột sác ký ái lực miển dịch tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid

Sau đây giới thiệu phƣơng pháp xác định aflatoxin bằng cột sắc ký ái lực mi n dịch.

a. Nguyên tắc

113

Aflatoxxin trong mẫu đƣợc chiết xuất bằng methanol. Sau đó đƣợc làm sạch bằng cột sắc ký ái lực mi n dịch và tạo dẫn xuất với với trifluro acetic acid (TFA) rồi xác định trên máy sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang.

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho các loại ngũ cốc, sữa, các thực phẩm có dầu.

Tài liệu trích dẫn: AOAC 994.08-1996; AOAC 986.16-2000.

b. Dụng cụ - Hóa chất - Thiết bị

 Giấy lọc thô  Ph u lọc  Bình tam giác 250ml  Cốc có mỏ  Ống đong 100, 250ml  Bình lọc 1 lít, phin lọc 0,45µm  Phin lọc mẫu 0,45µm  Syringe 3ml.  Bình khí nitơ  Micro pipette 20 - 200 µl  Micro pipette 20 - 200 µl  Cột sắc ký ái lực  Hệ thống chiết pha rắn SPE  Nƣớc cất siêu sạch  Metanol  Acetonitrile  NaCl  Trifluro acetic acid (TFA)  n- hecxane  Dung dịch chiết mẫu methanol : nƣớc (70:30)  Dung dịch acetonitril : nƣớc (10:90)  Dung môi pha động acetonitril: nƣớc (25:75), dung môi đƣợc lọc qua phin lọc 0.45µm, rung siêu âm đuổi khí.

 Dung dịch chuẩn gốc aflatoxin B1, B2, G1, G2 pha trong acetonitril : benzene (2:98)

 Hệ thống sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang có bƣớc sóng kích thích 360nm và bƣớc sóng phát xạ 440nm.

 Cột sắc ký lỏng Inertsil ODS – 3V 150 x 4mm  Máy xay, đồng nhất mẫu  Bơm chân không  Bể siêu âm  Máy lắc ngang

c. Cách tiến hành

Bƣ c 1: Chuẩn bị mẫu

114

 Cân khoảng 25g mẫu đã đƣợc đồng nhất, thêm vào 5g NaCl cho vào bình tam giác có nút, 125ml dung dịch chiết (methanol : nƣớc = 70 : 30), lắc trên máy lắc ngang 60 phút. Sau đó lọc qua giấy lọc thô.  Lấy 15ml dung dịch lọc, thêm vào 30ml nƣớc cất.  Cho tất cả dung dịch này qua cột sắc ký ái lực với vận tốc khoảng 6 ml/phút.  Rửa cột sắc ký ái lực 2 lần bằng nƣớc cất với vận tốc khoảng 6 ml/phút  Rửa rải aflatoxin bằng 2ml methanol  Thổi khô dung dịch mẫu kiểm tra aflatoxin bằng khí nitơ Bƣ c 2: Tạo dẫn xuất aflatoxin  Hòa tan chuẩn hoặc mẫu thử bằng 200µl n –hecxan  Thêm vào 50 µl trifluro acetic acid  Để tại nhiệt độ phòng 5 phút  Thêm vào mẫu 2 ml dung dịch acetonitril: nƣớc (10:90)  Lắc mạnh, để yên cho tách lớp.  Dùng syringe lấy lớp nƣớc ở dƣới  Lọc qua phin lọc mẫu 0,45 µm Bƣ c 3: Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc từ dung dịch 10ppb từ dung dịch chuẩn mẹ: Lấy 2ml dung dịch chuẩn 10ppb thổi khô bằng khói nitơ. Dung dịch này đƣợc sử dụng để tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid.

Bƣ c 4: Xác định aflatoxin trên hệ thống sắc ký lỏng  Bƣớc sóng kích thích 360nm, bƣớc sóng phát xạ 440nm  Tốc độ dòng 1,2ml/phút  Cột sắc ký Inertsil – ODS – 3V (RP18)  Thể tích tiêm mẫu 20 µl.  Thời gian chạy sắc ký 15phút  Thời gian lƣu của aflatoxin khoảng 5 – 15 phút.

d. Tính kết quả

Nồng độ aflatoxin (µg/kg):

m: Khối lƣợng cân (g)

Cc:Nồng độ chuẩn (ppb) Sm: Diện tích peak mẫu Sc: Diện tích peak chuẩn V: Thể tích cuối cùng để đo (ml)

Kiểm soát chất lƣợng: Kết quả cuối cùng bằng giá trị trung bình của hai phép thử song song. Giá trị thu đƣợc từ hai phép thử song song không đƣợc chênh lệch nhau quá 20% so với giá trị trung bình.

115

4.8.3. Xác định dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ bằng

phƣơng pháp sắc ký khí (GC-ECD)

Hóa chất bảo vệ thực vật là những hợp chất độc có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học đƣợc dùng để phòng và trừ sâu, bệnh, cỏ dại, chuột… hại cây trồng và nông sản.

Hóa chất bảo vệ thực vật gồm nhiều nhóm khác nhau:

 Hóa chất trừ sâu clo hữu cơ  Hóa chất bảo vệ thực vật nhóm lân hữu cơ (photpho) và carbanat.  Hóa chất từ sâu họ cúc tổng hợp (pyrethroit) và một số hợp chất khác.

Việc dùng hóa chất bảo vệ thực vật cho cây trồng và nông sản chƣa hết thời gian cách ly đã thu hoạch, ngƣời dùng nông sản có nguy cơ ngộ độc và có thể gây nguy hiểm đến tính mạng.

Giới hạn tối đa dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật cho phép trong thực phẩm đƣợc qui định trong quyết định 46/2007/QĐ – BYT tùy thuộc vào từng loại sản phẩm.

Hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ phân giải trong cây chậm, bền vững trong cơ thể động thực vật, tích lũy lâu trong mô mỡ, dầu thực vật, trong sữa…

Một số hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ: aldrin, dieldrin, heptacloepoxit, dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT), clodan, endrin, heptaclo, toxaphen, methoxyclo, linden.

a. Nguyên tắc

Dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ trong mẫu đƣợc chiết bằng aceton. Sau khi tách chiết và làm sạch, hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ đƣợc xác định bằng sắc ký khí với detector cộng kết điện tử.

Phạm vi áp dụng: Phƣơng pháp này áp dụng để phân tích dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ trong các sản phẩm rau, quả, củ.

b. Dụng cụ - Hóa chất - Thiết bị

 Dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm  Phểu chiết 500ml  Bình cô quay dung tích 250ml  Hệ thống GC 17A Verson 3  Cân phân tích d = 10-4g  Cân kỹ thuật d = 10-2g  Máy cô quay chân không  Máy nghiền mẫu  Cột nhồi sắc ký  Dichlormethane  Ether ethylic  Ether dầu hỏa  n-hexane  Na2SO4 khan  NaCl

116

 Chuẩn hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo  Florisil  Bông thủy tinh

c. Cách tiến hành

Bƣ c 1: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn: Tính toán và pha các dung dịch chuẩn.

Bƣ c 2: Chuẩn bị mẫu

 Cân chính xác khoảng 100g mẫu đã đƣợc thái nhỏ và trộn đều cho vào bình nón dung tích 500ml, thêm 200ml aceton và nghiền đồng nhất trong 1 phút.

 Lọc qua bộ lọc hút chân không, thu dịch chiết vào bình hứng 500ml  Lấy 80ml dich lọc mẫu cho vào ph u chiết 500ml, thêm 100ml ether dầu hỏa và 100ml diclomethan, lắc mạnh trong 1 phút rồi để yên chờ cho tách lớp.  Chuyển lớp nƣớc bên dƣới sang một ph u chiết 500ml khác, lớp hữu cơ bên trên của ph u chiết ban đầu đƣợc làm khô bằng cách cho chảy qua ph u lọc đƣờng kính 10cm có chứa Na2SO4 khan bên trên giấy lọc (khoảng 3 – 4cm), thu dịch lọc vào bình cô quay.

 Với ph u chiết chứa pha nƣớc, thêm 7g NaCl lắc mạnh trong 30s đến khi tan hết NaCl, thêm 100ml diclomethan, lắc mạnh trong 1 phút, lớp hữu cơ bên dƣới cho đi qua lớp Na2SO4 khan ở ph u lọc đƣờng kính 10cm bên trên.  Chiết lớp nƣớc ở trên lần 2 với 100ml diclomethan và làm khô nhƣ trên. Rửa

lớp Na2SO4 khan bằng 50ml diclomethan.

 Cô đặc và bay hơi chậm toàn bộ dịch chiết bằng máy cô quay chân không (khống chế nhiệt dộ dƣới 450C). Khi cô còn khoảng 2ml, thêm 10ml aceton và lại cô đến còn khoảng 2ml. Lặp lại việc đó lần 2 cới 10ml aceton (chú ý không cô khô để tránh phân hủy mẫu).

 Hòa tan dịch cô thu đƣợc ở trên đến 10ml bằng aceton, chuyển vào ống đong chia vạch 100ml, dùng etherdầu hỏa tráng rửa bình cô quay, trút dịch tráng vào ống đong, sau đó pha loãng đến 100ml bằng ether dầu hỏa.

 Chuẩn bị cột Florisil bằng cách cho một ít bông thủy tinh đã làm sạch vào đầu dƣới cột, sau đó cho Na2SO4 khan vào khoảng 2cm. Rót từ từ vào cột khoảng 50ml ether dầu hỏa. Cho từ từ Florisil đã hoạt hóa vào cột sắc ký đến khi đƣợc lớp Florisil khoảng 10cm. Phủ lên trên lớp florisil một lớp Na2SO4 khan dày khoảng 2cm. Trong quá trình nhồi cột chú ý không để có bọt khí trong cột bằng cách khi cho florisil và Na2SO4 khan vào phải từ từ, vừa cho vừa gõ nhẹ vào thành cột. Cột không đƣợc để khô, lớp ether dầu hỏa luôn phải cao hơn lớp Na2SO4 khan ở phía trên cột khoảng 2 – 5cm.

 Mở khóa cột điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 5ml/phút vào cốc hứng ở phía dƣới (nếu chảy chậm phải dùng bộ dụng cụ bơm hút chân không). Cho từ từ 100ml dung dịch mẫu ở trên vào cột Florisil, loại bỏ phần dung dịch chảy ra. Khi mặt trên của dung dịch mẫu cách lớp Na2SO4 khan phía trên cột khoảng 1 – 2cm, thêm 200ml dung dịch ether ethylic 15% trong ether dầu hỏa để rửa giải chất cần phân tích, thu lấy phần dung dịch này vào bình cô quay.  Cô hoàn toàn dung dịch đến thể tích 2ml (khống chế nhiệt dộ dƣới 450C).

Bƣ c 4: Điều kiện chạy máy

117

 Detector ECD (range = 0, current = 0.5nA)  Nhiệt độ detector: 3000C  Nhiệt độ Injector: 2800C  Cột sắc ký SPB – 5 (30m × 0.25μm × 0.32mm)  Chƣơng trình nhiết độ: 1000C (1 phút) tăng 200C/phút lên 1900C (0 phút), sau đó tăng 20C/phút lên 2800C (giữ trong 2 phút)

 Tốc độ dòng: 30cm/s  Thể tích bơm: 1μl  Chế độ bơm: chia dòng

d. Tính kết quả

So sánh thời gian lƣu của mỗi đỉnh peak so với peak chất chuẩn để định tính.

So sánh diện tích hoặc chiều cao của mỗi peak so với peak chuẩn tƣơng ứng để định lƣợng.

Hàm lƣợng của từng hóa chất bảo vệ thực vật trong mẫu thử đƣợc tính theo công thức sau:

X: Hàm lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật có trong mẫu thử (mg/kg).

Sm: Diện tích peak của hóa chất bảo vệ thực vật trong mẫu thử Sc: Diện tích peak của hóa chất bảo vệ thực vật trong mẫu chuẩn Cc: Nồng độ của chuẩn hóa chất bảo vệ thực vật (mg/l) V: Thể tích dịch chiết cuối (ml)

m: Khối lƣợng mẫu đem phân tích (g)

118

PHỤ LỤC I

LƢỢNG MẪU LẤY PHỤC VỤ KIỂM NGHIỆM

(Ban hành kèm theo Thông tư số 14/2011/TT-BYT ngày 01 tháng 4 năm 2011 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

TT Sản phẩm Lƣợng mẫu tối thiểu Lƣợng mẫu tối đa

1 Sữa và sản phẩm sữa 100 g (ml) 1,5 kg (lít)

500 ml (g) 6 lít (kg) 2 Đồ uống

03 (bao) 05 (bao) 3 Thuốc lá

4 Chè 100 g 1 kg

5 Gia vị 100 g 1 kg

6 Dầu mỡ động vật 100 g (ml) 1,5 kg (lít)

7 Kem và đá thực phẩm 150 g 2,5 kg

8 Rau quả và sản phẩm rau quả 150 g 2,5 kg

9 Các sản phẩm cacao và sôcôla 150 g 1 kg

10 Kẹo 100 g 1 kg

11 Bánh 100 g 1 kg

12 Ngũ cốc, đậu đỗ 100 g 1,5 kg

13 Thịt và sản phẩm thịt 150 g 1,0 kg

14 Thủy sản và sản phẩm thủy sản 150 g 1,5 kg

15 Trứng và sản phẩm trứng 150 g 1,5 kg

16 Đƣờng 100 g 1,5 kg

17 Mật ong và sản phẩm mật ong 100 g (ml) 1,5 kg (lít)

18 Thức ăn cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ 150 g (ml) 1,5 kg (lít)

19 Cà phê và sản phẩm cà phê 150 g (ml) 1,5 kg (lít)

20 Hạt có dầu và sản phẩm hạt có dầu 100 g 1,5 kg

21 Thực phẩm chức năng 100 g 1,5 kg

119

Ghi chú:

1. Lượng mẫu tối thiểu là lượng mẫu đủ để kiểm nghiệm một chỉ tiêu của sản phẩm. Tùy thuộc vào mục đích của quá trình thanh tra, kiểm tra lượng mẫu lấy có thể được tăng hay giảm và loại sản phẩm không có trong mục trên có thể được lấy theo quyết định của trưởng đoàn thanh tra, kiểm tra phù hợp với yêu cầu thanh tra, kiểm tra.

2. Trong trường hợp không đủ để lưu mẫu, mọi thay đổi cần ghi rõ trong Biên bản lấy mẫu và Biên bản bàn giao mẫu.

120

PHỤ LỤC II

Bảng xác định lƣợng đƣờng nghịch đảo

KMnO4 0,1N (ml) KMnO4 0,1N (ml) KMnO4 0,1N (ml) Đƣờng nghịch đảo (mg) KMnO4 0,1N (ml) Đƣờng nghịch đảo (mg) Đƣờng nghịch đảo (mg) Đƣờng nghịch đảo (mg)

10 3,24 33 10,1 56 16,6 79 22,6

11 3,55 34 10,4 57 16,9 80 22,9

12 3,87 35 10,7 58 17,2 81 23,2

13 4,17 36 11,0 59 17,4 82 23.4

14 4,49 37 11,3 60 17,7 83 23,7

15 4,80 38 11,6 61 18,0 84 23,9

16 5,12 39 11,9 62 18,2 85 24,1

17 5,43 40 12,2 63 18,5 86 24,3

18 5,73 41 12,5 64 18,8 87 24,6

19 6,05 42 12,7 65 19,0 88 24,8

20 6,36 43 13,0 66 19,3 89 25,1

21 6,67 44 13,3 67 19,5 90 25,3

22 6,96 45 13,6 68 19,8 91 25,6

23 7,27 46 13,9 69 20,1 92 25,9

24 7,57 47 14,1 70 20,3 93 26,1

25 7,84 48 14,4 71 20,5 94 26,3

26 8,14 49 14,7 72 20,8 95 26,6

27 8,45 50 15,0 73 21,1 96 26,8

28 8,74 51 15,2 74 21,3 97 27,0

29 9,03 52 15,5 75 21,6 98 27,3

30 9,33 53 15,8 76 21,8 99 27,5

121

PHỤ LỤC III

Bảng xác định lƣợng đƣờng glucose

Glucose(mg) KMnO4 Glucose (mg) Glucose (mg) Glucose (mg) KMnO4 0,1N (ml) 0,1N (ml) KMnO4 0,1N (ml) KMnO4 0,1N (ml)

10 3,21 33 10,1 56 16,6 79 22,8

11 3,52 34 10,3 57 16,9 80 23,0

12 3,83 35 10,7 58 17,2 81 23,2

13 4,14 36 10,9 59 17,5 82 23.5

14 4,45 37 11,2 60 17,7 83 23,8

15 4,75 38 11,5 61 18,0 84 23,0

16 5,07 39 11,8 62 18,3 85 24,2

17 5,39 40 12,2 63 18,6 86 24,5

18 5,72 41 12,4 64 18,8 87 24,7

19 5,99 42 12,7 65 19,1 88 25,0

20 6,31 43 13,0 66 19,4 89 25,2

21 6,61 44 13,3 67 19,6 90 25,5

22 6,91 45 13,6 68 19,9 91 25,7

23 7,38 46 13,8 69 20,2 92 26,0

24 7,52 47 14,1 70 20,4 93 26,2

25 7,81 48 14,4 71 20,7 94 26,5

26 8,09 49 14,7 72 21,0 95 26,7

27 8,39 50 15,0 73 21,2 96 27,0

28 8,70 51 15,2 74 21,4 97 27,3

29 8,97 52 15,5 75 21,7 98 27,5

30 9,30 53 15,9 76 22,0 99 27,7

122

PHỤ LỤC IV

PHƢƠNG PHÁP LẤY MẪU

(Ban hành kèm theo Thông tư số 14/2011/TT-BYT ngày 01 tháng 4 năm 2011 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

TT Đối tƣợng sản phẩm Số tiêu chuẩn/ quy chuẩn/ số hiệu tài liệu hƣ ng dẫn

1 Hƣớng dẫn lập chƣơng trình lấy mẫu TCVN 6663-1: 2002

2 Hƣớng dẫn lấy mẫu ở sông và suối TCVN 6663-6: 2008

TCVN 5995: 1995 3 Hƣớng dẫn lấy mẫu nƣớc uống và nƣớc dùng để chế biến thực phẩm và đồ uống

4 Hƣớng dẫn lấy mẫu nƣớc ngầm TCVN 6000: 1995

5 Hƣớng dẫn lấy mẫu ở hồ ao tự nhiên và TCVN 5994: 1995 nhân tạo

6 Hƣớng dẫn lấy mẫu nƣớc mƣa TCVN 5997: 1995

7 Bia - Qui tắc nghiệm thu và phƣơng pháp TCVN 5591: 1991 lấy mẫu

8 Sản phẩm thực phẩm và gia vị. Trình tự lấy TCVN 4886: 1989 mẫu để phân tích vi sinh vật

9 Gia vị. Lấy mẫu TCVN 4889: 1989

ISO 948: 1988

10 Sữa và các sản phẩm sữa. Hƣớng dẫn lấy TCVN 6400: 2010 mẫu ISO 707: 2008

11 Sữa và sản phẩm sữa. Lấy mẫu. Kiểm tra TCVN 6266: 2007

theo dấu hiệu loại trừ

12 Sữa và sản phẩm sữa. Lấy mẫu. Kiểm tra TCVN 6267: 1997 theo dấu hiệu định lƣợng ISO 8197: 1988

13 Thịt và sản phẩm thịt. Lấy mẫu và chuẩn bị TCVN 4833-1: 2002 mẫu thử. Phần 1: Lấy mẫu

14 Thuỷ sản. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu TCVN 5276: 1990

15 Chè. Lấy mẫu TCVN 5609: 2007

123

TT Đối tƣợng sản phẩm Số tiêu chuẩn/ quy chuẩn/ số hiệu tài liệu hƣ ng dẫn

ISO 1839: 1980

TCVN 4809: 1989 16 Xiên lấy mẫu cà phê nhân

TCVN 5702: 1993 17 Cà phê nhân. Lấy mẫu

TCVN 6539: 1999 18 Cà phê nhân đóng bao. Lấy mẫu

ISO 4072: 1998

19 Cà phê hoà tan – Phƣơng pháp lấy mẫu đối TCVN 6605: 2007 với bao gói có lót ISO 6670: 2002

TCVN 7521: 2005 20 Hạt cacao

ISO 2292: 1973

TCVN 4409: 1987 21 Đồ hộp

TCVN 4067: 1985 22 Kẹo

TCVN 4837: 2009 23 Đƣờng. Lấy mẫu

24 Ngũ cốc, đậu đỗ và sản phẩm nghiền – Lấy TCVN 5451: 2008 mẫu từ khối hàng tĩnh ISO 13690: 1999

TCVN 5102: 1990 25 Rau quả tƣơi. Lấy mẫu

ISO 874:1980

26 Dầu mỡ động vật và thực vật. Lấy mẫu TCVN 2625: 2007

ISO 5555: 2001

TCVN 5139: 2008

27 Phƣơng pháp khuyến cáo lấy mẫu để xác định dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật phù hợp với các giới hạn dƣ lƣợng tối đa (MRL)

Ghi chú: Căn cứ vào tình hình thực tế, trưởng đoàn thanh tra, kiểm tra có thể quyết định sử dụng các phương pháp lấy mẫu tương đương khác.

124

PHỤ LỤC V

TEM NIÊM PHONG MẪU

(Ban hành kèm theo Thông tư số 14/2011/TT-BYT ngày 01 tháng 4 năm 2011 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

Cán bộ lấy mẫu Đại diện cơ sở

TEM NIÊM PHONG MẪU (Ký, ghi rõ họ tên) đƣợc lấy mẫu

(Ký, ghi rõ họ tên,

Tên sản phẩm đóng dấu (nếu có))

.........................................

………………………….

…………………………. Trƣởng Đoàn kiểm tra

(Ký, ghi rõ họ tên)

Mã số mẫu

......................................... …., ngày…./.…/20… ..., ngày…./…./20…

Ghi ch : Mã số mẫu do cơ quan kiểm nghiệm đánh mã để kiểm soát trong quá trình kiểm nghiệm.

125

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Trần Tử An, Thái Nguy n Hùng Thu (2007), Hóa phân tích Tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

2. Bùi Thị Nhƣ Thuận, Nguy n Phùng Tiến, Bùi Minh Đức (1991), Kiểm nghiệm chất lượng và thanh tra vệ sinh an toàn thực phẩm Tập 1, Tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 3. Bùi Thị Nhƣ Thuận (1990), Kiểm nghiệm lƣơng thực thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.

4. Viện Dinh dƣỡng - Trung tâm Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm (2008), Tài liệu tập huấn nâng cao kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm, Hà Nội.

5. Viện Vệ sinh – Y tế công cộng thành phố Hồ Chí Minh (2011), Nâng cao kỹ thuật xét nghiệm về vệ sinh an toàn thực phẩm, hóa sinh, Thành phố Hồ Chí Minh.

6. Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN). 7. Association Of Official Analytical Chemists (AOAC), 1996. 8. Association Of Official Analytical Chemists (AOAC), 2000. 9. Food and Agriculture Organization (FAO), 1986. 10. S.Suzanne Nielsen (2010), Food Analysis Laboratory Manual Second edition, Springer, Purdue University West Lafayette IN USA.

126