8/30/2016
1
Thực hành
Vi sinh vật đại cương
Bài 1: Quan sát hình thái vi sinh vật
1. Giới thiệu kính hiển vi quang học
2. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm
3. Phương pháp nhuộm màu Gram
4. Quan sát tiêu bản nhuộm
Mục đích
•Làm quen với cấu tạo kính hiển vi quang
học. Nắm được cách sử dụng
•Học cách làm tiêu bản cố định và phương
pháp nhuộm Gram
•Quan sát một số hình thái cơ bản của vi
khuẩn, nấm men, nấm mốc
I. Sử dụng kính hiển vi quang học
(light microscope)
1.1. Cấu tạo kính hiển vi quang học
a. Phần cơ học
•Thân kính:dịch chuyển lên xuống nhờ núm điều chỉnh lớn để
đưa ảnh của vật quan sát vào đúng tiêu điểm
-Bàn xoay (mâm kính):gắn ở phía trên thân kính, nơi gắn các vật
kính
-Ống kính:Gắn ở phía trên thân kính, có thể xoay quanh một trục
thẳng đứng tùy theo vị trí quan sát. Phía trên ống kính có gắn thị
kính
-Bàn kính/khay kính:nơi để tiêu bản quan sát. Trên bàn kính có
các kẹp giữ tiêu bản.Dưới bàn kính có giá giữ bộ tụ quang kính.
-Đế kính (chân kính):cấu tạo vững chắc đỡ toàn bộ KHV
-Ốc điều chỉnh:gồm
+Ốc điều chỉnh tiêu bản;
+Ốc điều chỉnh vĩ cấp (điều chỉnh thô/điều chỉnh lớn);
+Ốc điều chỉnh vi cấp (điều chỉnh tinh/điều chỉnh nhỏ)
b. Phần quang học
Bộ phận chiếu sáng:
Tụ quang kính: gồm nhiều thấu kính ghép
lại với nhauhội tụ các tia sáng xuất phát
từ nguồn svà tụ quang kính nền đen
áng và được phản xạ lại qua gương
Có 2 loại tụ quang kính: Tụ quang kính nền
sáng và tụ quang kính nền đen
Tụ quang kính nền sáng Tụquang kính nền đen
8/30/2016
2
c. Vật kính
-gồm một hệ thống thấu kính hội
tụ có tiêu cự ngắn khoảng vài
mm, đặt trong một vỏ bọc kim
loại
-Chức năng: Tạo ảnh thực, phóng
đại, ngược chiều với vật quan
sát.
-Độ phóng đại của vật nghiên cứu
phụ thuộc vào tiêu cự và độ
cong của thấu kính ngoài cùng.
Độ cong càng lớn, thì tiêu cự
càng ngắnđộ phóng đại của
vật kính càng lớn
- Các vật kính: 8x, 10x, 40x, 60x
(vật kính khô), 100x (vật kính
dầu)
c. Thị kính
-Gồm 2 thấu kính: thấu kính
mắt phía trên, thấu kính tụ
phía dưới. Giữa hai thấu
kính có màn chắngiữ lại
các tia sáng xung quanh, chỉ
để các tia sáng gần với trục
quang đi qua hình rõ nét
hơn (phóng đại thêm ảnh
của vật kính-vai trò giống
kính lúp)
- Các loại thị kính: 7x, 10x,
15x, 20x
Độ phóng đại của mẫu
quan sát bằng tích số giữa
độ phóng đại của vật kính
với độ phóng đại của thị
kính
1.2 Giới thiệu một số loại kính hiển vi khác
a. Kính hiển vi điện tử
- KHV điện tử truyền qua (Transmission electron
microscope – TEM): sử dụng chùm điện tử có năng
lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng
các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (1.106
lần). Ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên
film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ
thuật số
- KHV điện tử quét (Scanning electron microscope –
SEM): là một loại kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng
khác với TEM: chùm điện tử không truyền qua mẫu mà
hội tụ thành một chùm hẹp và quét trên mẫu, do đó cho
phép ghi ảnh với độ phân giải rất cao
Nghiên cứu vi cấu trúc của vật rắn, nguyên tử, virus…
Scanning transmission electron microscope (STEM)
Phạm vi quan sát của KHV quang học và điện tử
SIGMA Advanced Analytical Scanning
Electron Microscope SEM
Kính HV điện tử truyền qua (TEM)
8/30/2016
3
KHV huỳnh quang
(fluorescence microscope) Kính hiển soi nổi
(stereoscopic microscope)
•Kính hiển vi phản pha
(Phase contrast
microscopy-Nobel prize
1953): Ánh sáng xuyên
qua các vật thể trong
suốt, không màutiêu
bản không cần nhuộm
•Kính hiển vi nền đen
(dark field microscope):
loại những chùm tia sáng
không phân tán từ ảnh
vật vùng xung quanh
vật quan sát thường tối
Trái: quan sát với KHV quanghọc.
Phải: với KHV phản pha (40x)
A. Nấm men quan sát vơi KHV quang học
B. Nấm men quan sát dưới KHV nền đen
C. Nấm men quan sát dưới KHV phản pha
D. Nấm men quan sát dưới KHV huỳnh quang
A
B
C
D
1.3. Cách sử dụng kính hiển vi quang học
a. Chuẩn bị:
- Kính hiển vi, dầu soi, dầu lau, sổ ghi chép, bút…
-Chuẩn bị tiêu bản quan sát
-Tư thế ngồi quan sát kính HV: ngồi ngay ngắn, đặt sổ ghi chép bên
tay phải (nếu thuận tay phải)
b. Quan sát với vật kính khô:
-Cắm điện và bật công tắc đèn
-Điều khiển kính tụ quang bằng bàn tay trái: Nâng lên ở mức hợp lý;
+ Mở hệ thống chắn sáng tối đa và điều chỉnh khi có tiêu bản để được
ảnh của mẩu vật đẹp nhất theo ý muốn.
-Đặt tiêu bản quan sát lên khay kính, điều chỉnh vị trí cần quan sát
trên tiêu bản
-Chọn vật kính quan sát: Ví dụ Nấm mốc 4x, 10x; Nấm men 40x
-Sử dụng ốc điều chỉnh vĩ cấp để nâng tiêu bản lên sát với vật kính;
Mắt nhìn vào thị kính, từ từ hạ vật kính xuống đến khi nhìn thấy chớp
ảnh thì sử dụng ốc điều chỉnh vi cấp để chỉnh độ nét của ảnh.
c. Quan sát với vật kính dầu
(100x)
-Nếu dùng vật kính dầu chú ý:
+ Nhỏ 1 giọt dầu soi kính vào vị trí
vùng định quan sát trên tiêu bản
(Hình A)
+ Hạ từ từ vật kính cho đến khi chạm
nhẹ vào giọt dầu (Hình B)
+ Nhìn vào thị kính, nhẹ nhàng điều
chỉnh ốc điều chỉnh vĩ cấp nâng vật
kính lên cho đến khi thấy chớp ảnh
trên vi trường
Khi nâng vật kính lên vẫn phải đảm
bảo đầu vật kính vẫn ngập trong dầu
soi (Hình C)
+ Điều chỉnh thêm ốc chỉnh vi cấp
cho rõ nét.
d. Bảo quản sau khi sử dụng kính
- Nâng vật kính lên lấy tiêu bản ra.
-Nếu là vật kính dầu thì dùng khăn
vải/giấy mềm tẩm dầu lau kính xylene
lau nhẹ vào đầu vật kính cho thật sạch.
-Đưa vật kính nhỏ nhất vào vị trí tiêu
bản.
-Tắt công tắc đèn, rút phích cắm khỏi
ổ điện.
- Cho kính vào hộp hay đậy kính bằng
bao nilon.
-Chuyển kính vào tủ lớn có hệ thống
đèn bật thường xuyên để chống mốc và
bụi bẩn.
8/30/2016
4
II. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm
(tiêu bản cố định)
- Tiêu bản cố định được nhuộm màu dùng để nghiên cứu các đặc
điểm hình thái học vsv, kiểm tra độ thuần khiết của giống…
- Tiêu bản này có thể bảo quản lâu dài
- VSV quan sát được giết chết trong quá trình xử lý an toàn
cho người quan sát
2.1 Các bước chuẩn bị:
-Chuẩn bị mẫu vật gồm:
+ Mẫu lỏng: dung dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic
+ Mẫu rắn: 01 ống thạch nghiêng nuôi cấy TB nấm men
-chuẩn bị dụng cụ gồm que cấy, đèn cồn, nước cất vô trùng, bút
viết kính, lam kính sạch
-Chuẩn bị lam kính: + chọn lam kính sạch, hơ qua lại trên ngọn
lửa đèn cồn để làm sạch.
+ Sử dụng bút viết kính ghi ký hiệu mẫu tiêu bản cần nhuộm
2.2. Các bước làm tiêu bản cố định
Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: Lấy lam kính đã tiệt trùng; sử dụng bút viết
kính vẽ lên một vòng tròn định vị vùng làm vết bôi.
Bước 2: Làm vết bôi
+ Đối với mẫu lỏng: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một giọt mẫu, đặt
lên vòng tròn trên lam kính và dàn mỏng ra.
+ Đối với mẫu rắn: Sử dụng que cấy vô trùng lấy 1-2 giọt nước cất
đặt lên vòng tròn; Tiệt trùng que cấy và tiếp tục lấy mẫu ở ống giống;
hòa tan cùng với giọt nước cất dàn mỏng ra
Bước 3:Làm khô: để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
Bước 4: Cố định vết bôi: kẹp chặt tiêu bản, hơ qua lại tiêu bản trên ngọn
lửa đèn cồn vài lần. Mục đích của bước cố định tiêu bản:
-Giết chết vsvan toàn cho người quan sát và giúp cho vsv bắt màu
tốt hơn
- Giúp cho vsv gắn chặt vào lam kính khi rửa không bị trôi đi
-Giữ nguyên hình dạng và kích thước khi nhuộm
Lưu ý: + tránh đun tiêu bản còn ướt trên ngọn lửa đèn cồn
+ Tiệt trùng que cấy ngay sau khi sử dụng
Tiêu bản sau khi cố định
Cố định tiêu bản
III. Phương pháp nhuộm Gram
3.1. Lịch sử:
- Là phương pháp nhuộm màu nhằm phân biệt vi khuẩn Gram
âm và Gram dương
- Do Christian Gram (1853-1938), nhà vật lý người Đan mạch
phát minh
3.2. Chuẩn bị thuốc nhuộm
- Dung dịch thuốc nhuộm thứ nhất: Tím gentian/ Crystal violet
- Dung dịch cố định màu: Dung dịch lugol
- Dung dịch tẩy màu: Cồn axeton
- Dung dịch thuốc nhuộm thứ hai: Đỏ phenol/ Fuchsin/
Safranin
-Nước rửa:Nước sạch
3.3. Các bước nhuộm Gram
Gồm 4 bước
Bước 1: Nhỏ dung dịch Tím gentian ngập vết bôi để 1-2 phút. Sau đó
rửa thuốc nhuộm thừa với nước sạch: Nghiêng lam kính 45o, cho
nước chảy từ đầu đến cuối lam kính, đến khi không còn màu tím
Bước 2: Cố định màu với dung dịch Lugol: nhỏ dung dịch ngập vết bôi,
để 1 phútRửa với nước sạch vẩy khô
Bước 3: Tẩy màu với cồn 95%: Nghiêng phiến kính 45o, tẩy cồn cho đến
khi không còn màu tím. Sau đó rửa lại ngay bằng nước sạch, vẩy khô.
Bước 4: Nhuộm màu với đỏ phenol: Nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi, để 1 phút
Rửa thuốc nhuộm thừa với nướclàm khô, sử dụng giấy thấm hoặc hơ
qua ngọn lửa đèn cồn
Lactobacillus sp. (gram +)
E. coli (gram -) Salmonella (gram -)
Pseudomonas (gram -)
Staphylococcus aureus (gram +) Bacillus cereus (gram +)
8/30/2016
5
Nấm men Saccharomyces
Nấm men nảy chồi (mũi tên)
Nấm men: giả khuẩn ty (mũi tên)
nảy chồi (mũi tên)
1. Quan sát tiêu bản làm sẵn
+ Tiêu bản vi khuẩn (E. coli, Staphylococcus…)
+ Tiêu bản nấm mốc (vật kính 4x, 10x)
2. Quan sát tiêu bản cố định
+ Tiêu bản vk lactic (vật kính 100x)
+ Tiêu bản nấm men (vật kính 100x)
3. Mô tả hình thái (yêu cầu vẽ hình)
•Hình thái: Hình que, cầu….
•Cách thức sắp xếp: đứng riêng rẽ, nối đôi, nối chuỗi …
•Tính chất bắt màu: Gram âm/dương
•Đặc điểm sinh sản (nấm men, nấm mốc): nảy chồi ?,
hình thành bào tử gì?
Yêu cầu báo cáo thực hành
Bài 2: Kỹ thuật ria cấy vi sinh vật
Nội dung:
•Giới thiệu các môi trường nuôi cấy vsv
•Kỹ thuật ria cấy trên thạch đĩa và thạch ống
•Quan sát hình thái khuẩn lạc
Mục đích
•Nắm được các kỹ năng, thao tác cơ bản về nuôi
cấy vi sinh vật trên các môi trường khác nhau
•Quan sát sự hình thành khuẩn lạc ở các môi
trường nuôi cấy khác nhau
2.1. Giới thiệu các môi trường nuôi cấy vsv
a. Môi trường đặc (rắn)
Môi trường có sử dụng các chất làm đông đặc môi trường: 1,5-2%
thạch (agar). Một số loại môi trường chủ yếu:
Môi trường dinh dưỡng:
•Môi trường đơn giản/MT cơ sở peptone + agar; môi trường
nước thịt peptone
•Môi trường phức tạp: có bổ sung các chất dinh dưỡng cao thịt,
cao nấm men, casein… + các chất khoáng hoặc các chất đặc hiệu
Môi trường chọn lọc: MT có chứa những thành phần ưu tiên sự
sinh trưởng của một số VSV và ức chế các VSV khác (ví dụ Mt
chọn lọc VK sinh protease có bổ sung gelatin/casein…)
Môi trường chẩn đoán/ phân biệt:Có các thành phần hoặc hóa
chất giúp phân biệt các vsv bằng mắt thường (Ví dụ: môi trường
MacConkey phân biệt E. coli và Salmonella)