CHƯƠNG I - CÁC KỸ THUẬT CHÍNH CỦA

CH

NG I - CÁC K THU T CHÍNH C A

Ủ

Ậ

ƯƠ Ỹ CÔNG NGH SINH H C HI N Đ I Ạ

Ọ

Ệ

BÀI 1 CÔNG NGH DNA TÁI T H P

Ổ Ợ

Ệ

h p, còn đ ượ ổ ợ Công ngh DNA tái t ệ

ộ ệ ồ

ừ ậ ậ

c g i là ọ , là nhân dòng gen hay nhân dòng phân t ử m t khái ni m bao quát g m m t s quy trình ộ ố thí nghi m d n đ n vi c chuy n thông tin di ể ệ ế ẫ ệ sinh v t này sang sinh v t truy n (DNA) t ề khác.

TH NÀO LÀ DNA TÁI T H P

Ổ Ợ

Ế

I. THU NH N GEN

Ậ

 Vào năm 1969, Becwitt, Shapiro đã thông báo operon lactose c a

ừ

ự

ng ơ ở ế ợ ổ ể ề ớ

 Có th thu nh n gen đ th c hi n k thu t tái

v công trình tách gen t ề E. coli d a trên c s k t h p các ph ươ pháp di truy n vi sinh c đi n v i các ph pháp v t lý đ tách và lai các phân t ậ

ủ ng ươ DNA. ậ ử ỹ ể ệ

h p DNA b ng ba ph ng pháp khác ể ự ươ ể ậ ằ

t ổ ợ nhau.

1.Tách đ an ADN ch a gen t

b gen:

ứ

ọ

ừ ộ

ữ

ượ

 Toàn b DNA đ ộ

ạ

ề

ỏ ươ

ặ

ắ

ằ ắ ạ

ơ ọ

ạ

c tách ra nh ng đo n nh có ng chi u dài 15.000 – 20.000 c p base b ng ph pháp l c c h c hay b ng enzyme c t h n ch . Sau ế ằ đó g n vào các vector mang gen t o thành plasmid tái t  Ph

ạ

ườ

ướ

ng cho các đo n DNA có c khác nhau và không xác đ nh chính xác ị ố Tuy nhiên ph ng pháp c dùng trong vi c t o ra th vi n gen ệ ạ

ươ ư ệ

ựơ

ắ h p. ổ ợ ng pháp này th ươ kích th đo n DNA ta mong mu n. ạ này v n đ ẫ hay ngân hàng gen.

2.T ng h p b ng ph ợ

ằ

ổ

ươ

ng pháp hóa h c ọ

 B ng hi u bi

t v trình t ằ ể ự ự ắ ế ề ế

ườ ợ

ể ổ ố ựơ ạ ằ

và s s p x p các nucleotide trên gen, các acid amin trong chu i ỗ i ta có th t ng h p polypeptide mà ng đ c các đo n gen mong mu n b ng ph ng pháp hóa h c. ươ ọ

3.Sinh t ng h p gen t

mARN t

ợ

ổ

ừ

ươ

ng ng ứ

 Nguyên t c c a ph

ủ ộ ắ ạ

ng pháp là d a vào kh ả ự ươ năng ho t đ ng c a enzyme phiên mã ủ ng c.ượ

ả ổ ợ

ộ ạ

ể ừ ộ

 Enzyme này có kh năng t ng h p nên DNA m t m ch (cDNA – complementary DNA) t ừ m t đo n khuôn mARN ho c cũng có th t ạ ặ c t quá trình polyribonucleotide thu nh n đ ựơ ừ t ng h p hoá h c. ọ ổ

ậ

ợ

II. VECTOR TÁCH DÒNG

ồ ề

ạ ư

ữ

ấ ị ạ ể ộ

ủ ể ặ

ủ ể ọ

Vector tách dòng (cloning vector) g m nhi u lo i nh plasmid, phage, cosmid, virus, ….M i lo i vector tách dòng có nh ng u, ư ỗ c c đi m nh t đ nh. Tùy thu c kích th nh ướ ượ c a gen tách dòng và đ c đi m c a lo i t ạ ế ủ bào ch đ ch n lo i vector tách dòng thích ạ h p.ợ

1. Các vector đ i v i E.coli

ố ớ

ấ ả ượ

 Các vector tách dòng đ n gi n nh t, đ ấ

ụ

ớ ẩ

E.coli.

ễ

ậ

c s ử ơ d ng r ng rãi nh t là d a trên các plasmid vi ự ộ khu n. M t l ng l n các vector plasmid khác ộ ượ nhau có th s d ng cho ể ử ụ  u đi m c a các vector này là: d làm s ch, ạ ủ Ư ể hi u qu bi n n p cao, các marker ch n l c ả ế ọ ọ ệ ạ h p, có kh thu n ti n cho bi n n p và tái t ả ạ ế ệ i 5kb. năng tách dòng các m u DNA l n t ẫ ổ ợ ớ ớ

PLASMID

ố ớ ấ

ấ

2. Vector đ i v i n m men và các n m khác:

 N m men

ữ

S.cerevisiae là m t trong nh ng c ơ ộ ọ ệ ấ

ấ th quan tr ng nh t trong công ngh sinh ể h c.ọ

3.Vector đ i v i th c v t b c cao:

ậ ậ

ố ớ

ự

ẩ

* Vector tách dòng là vi khu n A. tumefaciens:  A. tumefaciens là VK Gram (-), t o nên các n t ạ ố

ễ

ị  Vi c t o nên các n t s n chính là k t qu c a ố ầ ả ủ ế

ủ ể

s n trên cây tr ng khi b nhi m. ầ ồ ệ ạ vi c chuy n đo n T-DNA c a plasmid Ti vào b ộ ệ gen t bào th c v t. ạ ự ậ ế

ự ậ ấ

ầ ế ế ạ ỉ

* Vector tách dòng là virus Cauliflower mosaic: H u h t virus th c v t là virus RNA nên r t khó bi n n p, ch có Geminvirus và Caulimovirus (CaMV) là virus DNA.

4. Vector đ i v i t

bào đ ng v t có vú:

ố ớ ế

ậ

ộ

* Vector d a trên SV40: ự

ễ ả

ậ

ộ ố ộ ả

c vài trăm nucleotide. - SV40 (Simian virus) có kh năng gây nhi m m t s loài đ ng v t có vú. ộ - B gen c a SV40 nh (kho ng 5,2kb) và ch ỉ ỏ ủ dung h p đ ượ ợ

ộ

ậ ủ ế

* Vector virus khác c a đ ng v t có vú: ủ Bovine papilloma virus (BPV) ch y u gây ra ư ụ ễ

ế

m n cóc trên bò nh ng cũng gây nhi m trên các loài khác. Trong các t có nhi u b n sao 100 phân t bào chu t, BPV ộ bào. /t ử ế ề ả

Ớ Ạ

III. ENZYME GI ENZYME TH

I H N VÀ M T S Ộ Ố NG DÙNG

ƯỜ

i h n

ớ ạ

ệ c đ an c t dài hay ng n ắ ọ

ướ ố ượ ng đi m gi ể ớ ạ

1. Enzyme gi Enzyme gi i h n (Restriction enzyme – RE) có ớ ạ đ c tính c t DNA không đ c hi u loài. S ố ặ ắ ặ ng và kích th l ắ ượ i h n trên tùy thu c vào s l phân t

ộ DNA. ử

 M i dòng t

ỗ ẩ ệ ố

ề ệ ế

ệ

ủ ắ ạ

ế enzyme c t h n ch chuyên bi ắ ạ này có kh năng phân bi ả đo n DNA l ạ chính mình hay DNA đã thích nghi v i t bào và vi khu n đ u có h th ng t, các enzyme t DNA c a mình và , do đó nó không c t DNA c a ủ bào. ớ ế

a.Tên g i các enzyme: ọ

Tên enzyme

Chi, loài

Th t

Gi ngố

Ch ngủ

ứ ự

dòng

EcoRI

Escherichia

coli

Ry13

I

SmaI

Serratia

martesens

I

HaeIII

Hemophylus aegypticus

III

b. Các lo i enzyme gi i h n: ạ ớ ạ

i h n đ

ượ ậ ẩ

ả

Hi n nay có hàng nghìn enzyme gi c ớ ạ vi khu n. D a vào kh năng nh n ả ự đ c hi u kho ng 4 – 6 ự ặ ệ i h n i ta chia enzyme gi t và c t các trình t ườ ớ ạ

ệ ly trích t ừ bi ắ ế c p nucleotide ng ặ làm 3 lo i:ạ  Lo i th nh t: ấ  Lo i th hai:  Lo i th ba: ứ ứ ứ ạ ạ ạ

 M i enzyme gi

i h n: c.Các ki u c t c a enzyme gi ắ ủ ể ớ ạ

i h n nh n bi ế

nh ng v trí nh t đ nh. ỗ ệ ậ ữ ộ

t và c t đ c ị ắ ạ

ắ ặ ớ ạ hi u m t đo n DNA ạ ấ ị ở Có hai ki u c t khác nhau là c t t o đ u ầ ắ ể b ng và c t t o đ u so le. ắ ạ ầ ằ

ằ

ắ

ộ

ạ

ộ

ắ ạ ạ ằ

ố ắ k t h p tr l ở ạ

ả

– C t t o đ u b ng (Blunt ends): m t s RE c t 2 i cùng m t đi m. Sau khi c t, hai đ u ầ i. Đ n i ể ố ự ế ợ i ph i dùng enzyme T4 ligase.

ầ m ch DNA t ể b ng s không có kh năng t ẽ chúng l ạ

ả

– C t t o đ u dính (cohesive ends):

ầ

ị

m t s RE, v trí ng h p này, ợ

ạ

ể ắ ặ

ổ

ở ộ ố ắ ạ c t l ch nhau trên hai m ch. Trong tr ườ ắ ệ ở ạ i. các đ u dính b sung có th b t c p tr l ầ

 Đo n ADN l

ạ ắ

c c t b i cùng ở i ể ố ạ ượ ế ẽ ắ

và vector khi đ ạ m t l ai enzyme c t h n ch s có th n i l ạ ộ ọ v i nhau nh enzyme n i Ligase ố ớ  Ng i ta s d ng tính ch t này đ c t và ghép ấ ờ ử ụ ể ắ ườ

gen.

ườ

ng s d ng ử ụ

2. M t s enzyme th trong k thu t gen

ộ ố ỹ

ậ

ả ổ ợ

a. Enzyme polymerase: Là các enzyme xúc tác quá trình tái b n DNA, phiên mã t ng h p RNA.

- Enzyme DNA polymerase I (pol I) - Enzyme T4 DNA polymerase - Enzyme Taq polymerase - Enzyme RNA polymerase

b. Enzyme DNA ligase:

Enzyme ligase là các enzyme xúc tác hình

ế ạ ố

thành các liên k t, n i 2 đo n acid nucleic v i ớ nhau.

- Enzyme T4 DNA ligase: - Enzyme T4 RNA ligase:

c. Các enzyme nuclease:

- Enzyme DNase I - Nuclease S1 - RNase A - RNase H

IV. DNA TÁI T H P

Ổ Ợ

ậ

h p là t p h p các k ỹ ạ

ạ

h p đ ế

ế ớ ớ

Công ngh DNA tái t ổ ợ ệ ợ (các đo n thu t g n xen ho c n i các gen l ạ ố ặ ậ ắ t vào vector tách dòng, DNA ngo i lai) c n thi ầ ế h p h p, chuy n vector tái t t o vector tái t ổ ợ ể ổ ợ ạ c vào t bào ch đ vector tái t ượ ổ ợ ủ ể nhân lên v i m t l ng l n b n sao trong t ả ộ ượ bào ch .ủ

ờ

ạ ầ ạ

h p Các phương pháp t o DNA tái t ổ ợ ạ  N i các đo n DNA nh enzyme n i ố  C i ti n đ u dây nh các đo n linker ờ ng pháp t o đuôi homopolymer  Ph ố ả ế ươ ạ