KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO TẠO DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤ Y MÔ SẸO TẠO DI ̣CH HUYỀ N PHÙ CÂY

Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN

HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa : 2003-2007

Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ THU

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC **************************

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤ Y MÔ SẸO TẠO DI ̣CH HUYỀ N PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

Giáo viên hƣớng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGS.TS. BÙI VĂN LỆ HOÀNG THỊ THU TS. PHAN PHƢỚ C HIỀ N

ThS. QUÁCH NGÔ DIỄM PHƢƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2007

LỜ I CẢM ƠN

Khóa luận này đƣợc hoàn thành với s ự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các

thầy cô, các anh chị và các bạn. Em xin gƣ̉ i lờ i cảm ơn chân thành đến:

PGS.TS Bù i Văn Lê ̣ , ngƣờ i đã tâ ̣n tình hƣớ ng dẫn và ta ̣o mo ̣i điều kiê ̣n để

em thƣ̣c hiê ̣n khóa luâ ̣n này.

Thạc sĩ Quách Ngô Diễm Phƣơng, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ dạy và

luôn động viên em trong những hoàn cảnh khó khăn nhất. Đề tài này đƣợc hoàn

thành với rất nhiều nhiệt tình và tâm huyết của chị. Cảm ơn chị vì tất cả.

Em cảm ơn Tiến sĩ Phan Phƣớc Hiền, những chỉ dạy và giúp đỡ của thầy đã

giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.

Thạc sĩ Kiều Phƣơng Nam , ngƣời luôn gợi ý và cho em những lời khuyên bổ

ích.

, Em cảm ơn anh Điền , anh Hoàng, anh Cƣờ ng và các anh chi ̣ phòng sắc ký

Viê ̣n Công nghê ̣ Sin h ho ̣c và Công nghê ̣ Môi trƣờ ng , ĐH Nông Lâm TP . HCM.

Cảm ơn vì những giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị trong suốt thời gian chúng em

thƣ̣c tâ ̣p.

Cảm ơn anh Bình cùng toàn thể các bạn sinh viên năm tƣ trƣờng ĐH Khoa

học Tự nhiên , ĐH Mở luôn sẵn sàng giú p đỡ và đô ̣ng viên tôi nhƣ̃ng lú c gă ̣p khó

khăn trong đề tài.

Cảm ơn lớp CNSH 29 thân yêu và các ba ̣n thân đã cù ng tôi chia sẻ tất cả

nhƣ̃ng nỗi buồn vui suốt bốn năm đa ̣i ho ̣c.

Và trên hết , con cảm ơn bố m ẹ, chị gái và em trai yêu quý đã luôn chăm lo ,

ủng hộ, tin tƣở ng con , cảm ơn cả nhà vì đã cho con chỗ dựa vững chắc nhất trong

cuô ̣c sống.

Tháng 9/2007

iii

Hoàng Thị Thu

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cƣ́ u “Khả o sá t khả năng ƣ́ ng du ̣ng kỹ thuâ ̣t nuôi cấ y mô

sẹo, tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhâ ̣n hơ ̣p chấ t

anthraquinone” đƣơ ̣c tiến hành ta ̣i trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đa ̣i ho ̣c Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh và phòng sắc ký , Viê ̣n Công

nghê ̣ Sinh ho ̣c và Công nghê ̣ Môi trƣờ ng , Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí

Minh tƣ̀ tháng 3/2007 đến hết tháng 8/2007.

Kết quả thu đƣơ ̣c: - Mô se ̣o tƣ̀ mẫu lớ p mỏng tế bào cây D. burmanni Vahl đƣơ ̣c hình thành trên môi trƣờ ng khoáng cơ bản Gamborg’s B5 bổ sung: NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l), đƣờ ng 20 g/l, PVP (1,25 mg/l) ở pH 5,8, trong điều kiê ̣n ủ tối.

- Các kỹ thuật sắc ký cột , sắc ký bản mỏng đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng nhằm cô lâ ̣p và ly

trích hợp chất anthraquinone trong cây D. burmanni in vitro. Hơ ̣p chất này đ ƣợc sử

dụng nhƣ chất tham chiếu để định lƣợng anthraquinone trong các thành phần khác

nhau củ a cây Drosera burmanni Vahl.

: hàm - Kết quả đi ̣nh lƣơ ̣ng anthraquinone bằng kỹ thuâ ̣t HPLC cho thấy

lƣơ ̣ng anthraquinone trong rễ là 3,03% so vớ i tro ̣ng lƣơ ̣ng khô, nhiều hơn trong thân

lá (2,78%); ở cây không có sắc tố đỏ là 2,8% trong khi ở cây có sắc tố đỏ là 0,78%;

), trong khi trong sinh khối huyền phù tế bào là 0,02% ( so vớ i tro ̣ng lƣơ ̣ng tƣơi

không thấy có sƣ̣ hiê ̣n diê ̣n củ a anthraquinone trong di ̣ch môi trƣờ ng.

SUMMARY

The thesis “Study on application of callus and suspension cultures in

Drosera burmanni Vahl to produce anthraquinone compound” was carried out

at Plant Biotechnology lab, University of Natural Sciences; and Chromatography

room, Research Institute for Biotechnology and Enviromental Technology,

University of Agriculture and Forestry, HCM city from March to August, 2007.

Results:

- Callus of D. burmanni Vahl was cultured successfully by using

Gamborg’s B5 medium (modified) supplemented with NAA (0,2 mg/l),

2,4-D (0,2 mg/l), succrose (20g/l), PVP (1,25 mg/l), pH was adjusted to

5,8 before autoclaving.

- Column Chromatography and Thin Layer Chromatography were used to

purify anthraquinone compound in D. burmanni. This compound was

used as authentic sample for HPLC technique.

- Roots of D. burmanni contained 3,01% dry weight (DW) of anthraquinone,

larger than 2,78% in leaves.

- Anthraquinone content of red-leaf D. burmanni Vahl took 0,78% of DW,

compared with 2,78% DW in green-leaf trees.

- Biomass of D. burmanni’s suspension contained 0,02% of fresh weight of

anthraquinone, while no quantifiable amounts of anthraquinone has been

found in spent medium.

Ho Chi Minh city, September, 2007.

Hoang Thi Thu

MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG Trang tƣ̣a ..................................................................................................................... .i Lờ i cảm ơn ................................................................................................................. iii Tóm tắt ..................................................................................................................... iv Summary ..................................................................................................................... v Mục lu ̣c ..................................................................................................................... vi Danh sách các chƣ̃ viết tắt .......................................................................................... ix Danh sách các hình ..................................................................................................... x Danh sách các sơ đồ và biểu đồ ................................................................................ xii Danh sách các bảng .................................................................................................. xiii Chƣơng1: MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu .......................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ............................................................................................................ 2 1.4. Ý nghĩa đề tài .................................................................................................. 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl .......................................................... 3 2.1.1. Vị trí phân loại................................................................................................ 3 2.1.2. Phân bố ........................................................................................................... 3 2.1.3. Mô tả hình thái ............................................................................................... 4 2.1.4. Đặc tính sinh học ............................................................................................ 6 2.1.5. Đặc điểm sinh thái .......................................................................................... 7 2.1.6. Thành phần hóa học ....................................................................................... 8 2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống .............................................................................. 11 2.1.8. Tầm quan trọng ............................................................................................ 12 2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh thái ...................................................................................... 12 2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật ................................................. 12 2.1.8.3. Gía trị dƣợc tính ........................................................................................... 12 2.1.8.4. Ứng dụng trong công nghiệp ........................................................................ 14 2.1.8.5. Gía trị kinh tế................................................................................................ 15 2.1.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................................ 16 2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất thứ cấp ........................................................................................................ 17 2.2.1. Khái niệm hợp chất thứ cấp ......................................................................... 17 2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo ........................................................................................... 18 2.2.2.1. Khái niệm mô sẹo ......................................................................................... 18 2.2.2.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo .................................................................... 19 2.2.3. Nuôi cấy dịch huyền phù .............................................................................. 19 2.2.3.1. Khái niệm huyền phù tế bào ......................................................................... 19 2.2.3.2. Nguyên tắc tạo huyền phù ............................................................................ 19

vii

2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo huyền phù tế bào ............................... 20 2.2.3.4. Các phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù hiện nay ......................................... 20 2.2.3.5. Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp .................................................................................................. 22 2.2.4. Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù ........................................................................................................... 22 2.2.4.1. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy ..................................................................... 22 2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao ......................................... 22 2.2.4.3. Bổ sung tiền chất ......................................................................................... 22 2.2.4.4. Cố định tế bào ............................................................................................. 23 2.2.4.5. Cảm ứng sự phân hóa mô ............................................................................ 23 2.2.4.6. Nhân tố cảm ứng (elicitor) .......................................................................... 23 2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn .................................................... 24 2.3.1. Phƣơng pháp ly trích – thu nhận hợp chất .................................................. 24 2.3.1.1. Sắc ký cột .................................................................................................... 24 2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry Column Flash Chromatography) ..................... 26 2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế ........................................................................... 27 2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lƣợng hợp chất thứ cấp ..... 28 Chƣơng 3: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 31 Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................................................ 31 3.1. Nuôi cấy mô sẹo, tạo dịch huyền phù ......................................................... 31 3.1.1. Vật liệu ........................................................................................................ 31 3.1.2. Phƣơng pháp ................................................................................................ 33 3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 33 3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ........................................................................................... 34 3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ............................................................. 35 3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 36 3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 37 3.2. Ly trích và cô lâ ̣p hơ ̣p chất anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 38 3.2.1. Vật liệu ........................................................................................................ 38 3.2.2. Phƣơng pháp ................................................................................................ 39 3.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC .............. 40 3.3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 40 3.3.2. Phƣơng pháp ............................................................................................... 40 3.3.2.1. Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp......................................... 40 3.3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 41

viii

3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣợng hợp chất anthraquinone ........................................................................... 41 3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 43 3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ ............................................... 44 3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................ 45 3.4. Xử lý thống kê ............................................................................................. 45 Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................................................................. 46 4.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù ........................................................... 46 4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 46 4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ........................................................................................... 48 4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ............................................................. 49 4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 54 4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 56 4.2. Ly trích và cô lâ ̣p hơ ̣p chất anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 58 4.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC ............................. 59 4.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 59 4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣơ ̣ng hợp chất anthraquinone ................................................................................... 61 4.3.3. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 62 4.3.4. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ ...................................................... 64 4.3.5. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................. 66 Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ................................................................... 68 5.1. Kết luận ....................................................................................................... 68 5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù .......................................................... 68 5.1.2. Định lƣợng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC ......... 68 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70 PHỤ LỤC

DANH SÁ CH CÁ C CHƢ̃ VIẾ T TẮ T

2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

BAP : 6-benzylaminopurine

CRD : Completely Randomized Design (Hoàn toàn ngẫu nhiên)

ctv : cộng tác viên

HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng ao áp)

IAA : 3-indolyl-acetic acid

IBA : 3-indolebutyric acid

MS : Murashige & Skoog, 1962

NAA : naphthalene acetic acid

PVP : poly vinyl pyrrolidone

TCL : Thin Cell Layer (Lớ p mỏng tế bào)

TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký bản mỏng)

DANH SÁ CH CÁC HÌNH

TRANG

Hình 2.1. Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới .................. 4

Hình 2.2. Hình thái của Drosera burmanni Vahl .................................................... 4

Hình 2.3. Lá D. burmanni ........................................................................................ 5

Hình 2.4. D. burmanni Vahl ngoài tự nhiên. ........................................................... 7

Hình 2.5. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside ............ 10

Hình 2.6. Mô ̣t số loa ̣i Drosera có giá trị kinh tế cao trên thế giới ......................... 15

Hình 2.7. Hệ thống nuôi cấy gián đoạn qui mô nhỏ trên các máy lắc ................... 21

Hình 2.8. Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm ........................................... 21

Hình 2.9. Sắc ký cô ̣t ............................................................................................... 24 Hình 2.10. Mô hình sắc ký nhanh cô ̣t khô ............................................................. 26 Hình 2.11. Sắc ký lớp mỏng ................................................................................... 27

Hình 2.12. Sơ đồ hoa ̣t đô ̣ng các bô ̣ phâ ̣n củ a máy HPLC ...................................... 29

Hình 3.1. Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro ................................................ 31

Hình 4.1. Mô se ̣o đƣơ ̣c hình thành tƣ̀ mẫu lớ p mỏng cây D.burmanni trên môi trƣờ ng Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D vớ i nồ ng đô ̣ thay đổ i ..................................................................................................... 52

Hình 4.2. Mô se ̣o đƣơ ̣c hình thành tƣ̀ mẫu lớ p mỏng lóng thân cây D. burmanni trên môi trƣờ ng Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D vớ i nồng đô ̣ thay đổi ............................................................................................... 53 Hình 4.3.A. Mô sẹo nuôi trong môi trƣờng lỏng lắc .............................................. 55

Hình 4.3.B. Cụm tế bào quan dƣới kính hiển vi 40X. ........................................... 55

Hình 4.3.C. Tế bào đơn quan dƣới kính hiển vi 40X .............................................. 55

Hình 4.4. Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của

mô se ̣o cây D. burmanni ........................................................................................ 57

Hình 4.5. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm ................... 60

Hình 4.6. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm ................... 60

Hình 4.7. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm ................... 60

Hình 4.8. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm ................... 60

Hình 4.9. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở ở 70 ppm ................ 60

Hình 4.10. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo

quy trình A. ............................................................................................................ 61

Hình 4.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo

quy trình B .............................................................................................................. 61

Hình 4.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu rễ cây D. burmanni Vahl ........................... 63

Hình 4.13. Sắc ký đồ HPLC của mẫu thân lá cây D. burmanni Vahl .................... 63 Hình 4.14. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl có sắc tố đỏ. .......... 65

Hình 4.15. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl không

có sắc tố đỏ. ............................................................................................................ 65

Hình 4.16. Sắc ký đồ HPLC của mẫu dịch môi trƣờng sau khi lọc

sinh khối tế bào ...................................................................................................... 66

Hình 4.17. Sắc ký đồ HPLC của sinh khối tế bào từ dịch huyền phù. ................... 66

DANH SÁ CH CÁ C SƠ ĐỒ VÀ BIỂ U ĐỒ

TRANG

SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Con đƣờ ng tổng hơ ̣p các hơ ̣p chất thƣ́ cấp ở thƣ̣c vâ ̣t ........................ 18 Sơ đồ 3.1. Quy trình ly trích và cô lập hợp chất anthraquinone .......................... 39

Sơ đồ 3.2. Quy trình xƣ̉ lý mẫu ............................................................................ 42 Sơ đồ 3.3. Quy trình xƣ̉ lý di ̣ch huyền phù .......................................................... 45 Sơ đồ 3.4. Quy trình ly trích và cô lâ ̣p hơ ̣p chất anthraquinone (kết quả) ........... 58 BIỂ U ĐỒ

Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu lớp mỏng sống trên các loại môi trƣờng khác

nhau sau 14 ngày nuôi cấy ................................................................................... 46

Biểu đồ 4.2. Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy .... 54

ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1. Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone

xii

tham chiếu và giá trị diện tích peak ..................................................................... 59

DANH SÁ CH CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 2.1. Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và

7-methyljuglone ..................................................................................................... 8

Bảng 2.2. Các Naphthoquinone vi lƣợng đƣợc tách chiết từ Drosera ................... 9

Bảng 2.3. Dƣợc tính và một số hoạt tính ứng dụng khác của

dịch chiết Drosera ............................................................................................... .13

Bảng 3.1. Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng thành phần khoáng

và nồng độ đƣờng lên sự phát triển mẫu cấy lớ p mỏng ....................................... 33

Bảng 3.2. Bố trí nghiệm thức khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone

thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ............................................................... 34

Bảng 3.3. Bố trí nghiệm thức khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D

khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ..................................... 35

Bảng 3.4. Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy

lên sự tăng sinh khối mô sẹo ................................................................................ 36

Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng

lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo ................................................................... 37

Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong

các bộ phận khác nhau của cây in vitro ............................................................... 43

Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu

cây có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ ................................................................ 44

Bảng 4.1. Tỷ lệ mẫu sống ở các nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy ................... 46

Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của thành phần khoáng lên sự phát triển của

mẫu cấy lớp mỏng ................................................................................................ 47

Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy

lớp mỏng ............................................................................................................. 48

Bảng 4.4. Tỷ lệ tạo mô sẹo trên các môi trƣờng sử dụng kết hợp 2

xiii

loại hormone khác nhau ....................................................................................... 48

Bảng 4.5. Tỷ lệ mẫu tạo sẹo trên các môi trƣờng khác nhau sau 21

ngày nuôi cấy ....................................................................................................... 49

Bảng 4.6. Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg mô sẹo ban đầu sau 21 ngày

nuôi cấy trên các kiểu nuôi cấy khác nhau ......................................................... 54

Bảng 4.7. Kết quả ảnh hƣởng ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo .... 56

Bảng 4.8. Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak ............. 59

Bảng 4.9. Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác

nhau của cây in vitro ............................................................................................ 62

Bảng 4.10. Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các mẫu có và không có sắc tố đỏ ................................................................................................ 64

xiv

Bảng 4.11. Kết quả đi ̣nh lƣơ ̣ng anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù ....... 66

Chƣơng 1 MỞ ĐẦ U

1.1. Đặt vấn đề

Ngay từ buổi sơ khai, con ngƣời đã biết sử dụng thực vật không chỉ làm

nguồn thực phẩm mà còn cho nhiều mục đích khác, đặc biệt là trong y học. Ngƣời

ta sử dụng một số loại thực vật tƣơi để đắp lên vết thƣơng hoặc thực vật khô để sắc

thuốc trị bệnh. Cách đây hơn một thế kỷ, dựa vào y học cổ truyền các nhà khoa học

đã phát triển các quy trình cho phép tạo ra nhiều loại thuốc từ các hợp chất thứ cấp

chiết xuất từ cây trồng. Với tiến bộ khoa học, các phân tử hoá học trong cây đã

đƣợc tổng hợp nhân tạo để sản xuất dƣợc phẩm. Tuy nhiên việc tổng hợp nhân tạo

còn gặp nhiều khó khăn do con đƣờng tổng hợp các chất này vẫn chƣa đƣợc làm

sáng tỏ.

Từ những năm đầu thập niên 70 của thế kỷ XX đến nay, các nhà khoa học đã

công bố hàng loạt các công trình nghiên cứu về nuôi cấy tế bào đơn của nhiều loài

thực vật nhằm thu nhận sản phẩm thứ cấp. Nhƣ vậy việc áp dụng các kỹ thuật công

nghệ sinh học dựa trên các phƣơng pháp nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào in vitro

không những góp phần vào việc sản xuất và thu nhận mà còn giúp ta đảm bảo đƣợc

một cách chủ động số lƣợng các hợp chất có giá trị trị liệu.

Ở Việt Nam, ngƣời ta đã thu thập đƣợc 3 loài Drosera trong đó Drosera

burmanni Vahl gần đây đã đƣợc nghiên cứu về việc thu nhận hợp chất quinone từ

nuôi cấy in vitro, khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất này cũng nhƣ nhân giống

thành công bằng tạo chồi trực tiếp.

Do đó để hƣớng tới tự động hóa việc thu nhận và chủ động tăng sinh lƣợng

chất quinone đã đƣợc nghiên cứu thành công, đề tài:

“KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO

TẠO DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN

HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE ”

đã ra đời.

1.2. Mục tiêu

 Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ cây Drosera burmanni Vahl.

 Khảo sát khả năng tạo dịch huyền phù tế bào cây Drosera burmanni Vahl.

 Khảo sát hàm lƣợng hợp chất quinone thu đƣợc từ nuôi cấy dịch huyền phù.

1.3. Yêu cầu

 Tạo đƣợc mô sẹo và khởi đầu tạo dịch huyền phù cây D. burmanni Vahl.

 Phân tích định tính và định lƣợng đƣợc hàm lƣợng anthraquinone trong từng

thành phần khác nhau và trong dịch huyền phù cây D. burmanni bằng máy

HPLC.

1.4. Ý nghĩa của đề tài:

 Ý nghĩa khoa học: đây là một bƣớc tiến quan trọng và cần thiết trong qui

trình ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào D. burmanni Vahl để thu nhận hợp

chất quinone.

 Ý nghĩa thực tiễn: cung cấp quy trình tạo mô sẹo, dịch huyền phù D.

burmanni Vahl cho mục tiêu thu nhận quinone

Chƣơng 2 TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU

2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl

2.1.1. Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan [14]:

Giới: Plantae (Thực vật).

Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan).

Lớp: Magnoliopsida (Ngọc lan).

Phân lớp: Rosidae (Hoa hồng).

Bộ: Nepenthales.

Họ: Droseraceae.

Giống: Drosera.

Loài: Drosera burmanni Vahl.

Tên tiếng Anh: burmese sundew.

Tên thông thƣờng: cây bắt ruồi, cỏ trói gà, bèo đất, trƣờng lệ burman.

2.1.2. Phân bố

Drosera burmanni Vahl đƣợc tìm thấy ở đông bắc nƣớc Úc, Ấn Độ, Trung

Quốc, Nhật, Sri Lanka và Đông Nam Á nhƣ Malaysia, Myanmar, Thái Lan,Việt

Nam . . .(Hình 2.1) [33], [34].

Ở Việt Nam, Drosera burmanni Vahl đƣợc tìm thấy ở Thái Nguyên, Thanh

Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣớc Bửu tỉnh Bà

Rịa Vũng Tàu [1] và ở khu du lịch sinh thái Bắc Bình, Bình Thuận.

Ghi chú

Khu vực phân bố của

Drosera burmanni Vahl

Khu vực không có sự hiện

diện của Drosera burmanni

Vahl

Hình 2.1: Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới [30].

2.1.3. Mô tả hình thái

Drosera burmanni Vahl là loài cây cỏ, cao 5 - 30 cm, có nhiều màu sắc khác

nhau: xanh lá, xanh đậm, xanh có ánh vàng với lông tuyến màu đỏ hay toàn cây

màu đỏ [6], [15], [33], [35].

C

A

B

D

E

F

Hình 2.2: Hình thái của Drosera burmanni Vahl [33], [35].

 Thân (Hình 2.2 A, B, C)

Thân không phân nhánh, rất ngắn, có khi chỉ cao 1 cm khi tăng trƣởng trong

bóng râm, không hình thành thân củ dƣới đất. Thân mang nhiều phát hoa [31].

 Lá (Hình 2.3)

Lá hình muỗng, xếp thành hình hoa thị quanh thân, phiến lá dài khoảng 1,2

cm, rộng khoảng 0,4 cm, mặt lá phủ đầy lông tuyến.

Lá có tua cuốn với những giọt keo ở đầu gọi là dịch nhầy, côn trùng dính vào

và bị bẫy trong dịch này. Sau đó chất này sẽ tiêu hóa côn trùng mắc bẫy. Tua cuốn

trên lá uốn cong về phía con mồi bằng tính hƣớng tiếp xúc của nó. Drosera

burmanii Vahl là một trong những loài có chuyển động tua cuốn nhanh nhất [37].

A B

C D

Hình 2.3: Lá D. burmanni [42].

A: Lá; B: Các tua cuốn.

C, D: Cấu trúc một tua cuốn.

Tua cuốn là lông tiết đƣợc tạo bởi một cuống dài, nhỏ, có cấu trúc đa bào và

đầu mút tua cuốn đƣợc tạo bởi 2 lớp tế bào tuyến. Chất keo dính đƣợc tiết ra từ các

tuyến xuyên qua lớp biểu bì gián đoạn.

 Rễ

Hệ thống rễ tƣơng đối đơn giản: rễ chùm nhƣng chỉ có một vài nhánh. Chúng

đƣợc gọi là rễ giả vì chỉ có cơ quan hút nƣớc, cung cấp nƣớc cho cây.

 Hoa (Hình 2.2 D, E)

Cây ra hoa tháng 3 - 4. Hoa đều, lƣỡng tính, nhỏ, có nhiều màu sắc từ tím

nhạt tới vàng nhạt, màu đỏ, hồng và trắng. Hoa nằm trên một cuống chung dài, mọc

thẳng góc từ chồi nách hay chồi đỉnh gọi là phát hoa. Phát hoa cao 5 - 6 cm, mỗi

phát hoa có từ 5 đến 25 hoa, họp thành chùm hình bò cạp. Hoa đối xứng tròn, lá đài

5, cánh hoa 5, tiểu nhụy 5, noãn sào một buồng, đính phôi trắc mô, bầu 5 lá noãn

hàn liền nhau bởi mép bên [9], [14].

Hoa nở nhiều thời điểm khác nhau, tùy thuộc vào từng giai đoạn phát triển

của cây. Hoa thƣờng nở vào buổi sáng. Mỗi ngày nở một bông bắt đầu từ nụ thấp

nhất (nụ đƣợc hình thành sớm nhất). Hầu hết hoa tự thụ phấn nhờ côn trùng. Nếu sự

thụ phấn không diễn ra, hạt phấn và nhụy sẽ tự thụ phấn khi hoa khép cánh.

 Hạt (Hình 2.2 F)

Hạt thu đƣợc sau một tuần từ khi hoa nở. Hạt nằm trong nang hạt. Nang hạt

tròn, gồm 5 mảnh, chứa nhiều hạt. Nang hạt còn non có màu xanh, nang hạt chín có

màu đen. Hạt màu đen, đƣờng kính 0,1 mm.

2.1.4. Đặc tính sinh học

 Hình thức sinh sản

Cây sinh sản bằng hai hình thức hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng

cách nảy chồi con từ chồi bên hay từ đỉnh sinh trƣởng. Sinh sản hữu tính bằng hạt.

 Phƣơng thức bắt mồi

Hình thức: Sử dụng dịch nhầy để bắt dính con mồi (flypaper traps).

Cơ chế: Các lông tuyến bao phủ khắp bề mặt lá có vai trò nhƣ một cái bẫy

nhỏ. Các keo dính tiết ra từ lông tuyến nhìn nhƣ những giọt sƣơng và không bị khô

đi trong ánh mặt trời (vì vậy mà loài cây này còn đƣợc gọi là “sundew”). Giọt keo

dính này tác động nhƣ những giấy bắt mồi (flypaper). Các giọt keo thƣờng không

độc và có hƣơng thơm, nhờ vậy nó thu hút con mồi đậu xuống bề mặt lá và bắt dính

chúng. Khi đó những lông tuyến nhạy cảm với protein sẽ uốn cong, từ từ cuộn con

mồi lại và đẩy nó vào giữa lá. Tuyến tiết trên bề mặt lá lúc này sẽ ngừng tiết keo

dính mà tiết nhiều enzyme thủy phân tiêu hóa con mồi. Lá sẽ hấp thu chất dinh

dƣỡng mà cây không thể lấy từ môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng [25], [34], [35].

2.1.5. Đặc điểm sinh thái

Hình 2.4: D. burmanni Vahl ngoài tự nhiên [3], [40].

 Đất đai

Cây có thể sống đƣợc ở hầu hết các điều kiện: đất đầm lầy, sỏi, cát, đất acid

[37].

Đất trồng Drosera: hỗn hợp ¾ đất mùn + ¼ cát, cát sạch hoặc cát trộn bột

than gỗ.

 Độ ẩm

Độ ẩm từ trung bình đến cao (50 - 80%). Độ ẩm thấp hơn sẽ làm mất giọt

keo dính đầu lông tiết.

 Nhiệt độ

Cây sống đƣợc ở nhiệt độ 5 - 35OC, nhiệt độ thích hợp nhất 18 - 25OC. Dƣới

5 OC cây ngừng phát triển.

 Ánh sáng

Cây thích hợp với ánh sáng trực tiếp, tối thiểu từ 6 - 8 giờ chiếu sáng một

ngày. Khi cây sống ở nơi có cƣờng độ ánh sáng cao thì toàn bộ cây sẽ chuyển sang

màu đỏ. Nếu cây không nhận đủ ánh sáng thì tua cuốn sẽ có màu xanh.

2.1.6. Thành phần hóa học

Nhiều hợp chất naphthoquinone và các flavonoid đã đƣợc cô lập, xác định

cấu trúc và định lƣợng trong cây Drosera ngoài thiên nhiên cũng nhƣ in vitro.

 Naphthoquinone

Các loại Drosera thƣờng sản sinh 2 loại naphthoquinone chính là plumbagin

và 7-methyljuglone (Bảng 2.1) [21]. Ngoài ra còn có các naphthoquinone vi lƣợng

khác nhƣ droserone, hydroxydroserone và nhiều naphthoquinone glucoside (Bảng

2.2) mà không thể tìm thấy trong các loài cây khác [29].

Bảng 2.1: Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone [21]

Plumbagin 7 Methyljuglone

D. andersoniana D. adelae

D. auriculata D. aliciae

D. binata D. aliciae x capensis

D. bulbosa D. anglica

D. capensis D. auriculata

D. capillaris D. burkeana

D. cistiflora D. burmanii

D. dichotoma D. capensis

D. erythrorhiza D. cistiflora

D. intermedia D. cuneifolia

D. longifolia D. dielsiana

D. lunata D. filiformis

D. macrophylla D. hamiltonii

D. madagascariensis D. hilaris

D. microphylla D. indica

D. modesta D. intermedia

D. natalensis D. longifolia

D. peltata D. longifolia x rotundifolia

D. madagascariensis D. platypoda

D. ramentacea D. prolifera

D. regia D. pygmaea

D. rotundifolia D. regia

D. spathulata D. rotundifolia

D. stolonifera, spp. Stolonifera D. slackii

D. stolonifera, spp. Rupicola D. tracii

D. venusta D. trinervia

D. villosa D. villosa

Bảng 2.2: Các Naphthoquinone vi lƣợng đƣợc tách chiết từ Drosera [21]

Naphthoquinone Loài Kiểu nuôi cấy

D. whittakeri Droserone In vivo

D. rotundifolia In vivo

D. whittakeri Hydroxydroserone In vivo

D. rotundifolia In vivo

D. ramentaceae Biramentaceonea In vivo

Droserone-5-glucoside D. rotundifolia In vivo

Rossoliside D. rotundifolia In vivo

In vitro

D.spatulata In vitro

Hydroxydroserone-5-glucoside D.rotundifolia In vivo

D.rotundifolia In vitro

a: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiết với dung môi hữu cơ.

b: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiết với dung môi methanol.

2-Methylnaphtazarin-5-O- glucosideb D.spatulata In vitro

Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside tách

chiết từ các loài Drosera [21].

R1 R2 R3 R4 R5

H OH 7-Methyljuglone [1] CH3 H H

H [2] H Plumbagin CH3 H OH

H [3] H CH3 OH OH Droserone

[4] OH H CH3 OH OH Hydroxydroserone

H [5] H CH3 OH OGlc Droserone-5-glucoside

[6] OH H CH3 OH OGlc Hydroxydroserone-5-gluside

R6 R7

Rossoliside [7] CH3 H

OGlc

[8] H CH3 2-Methyl-hydrojuglone-4-glucoside

 Flavonoid

Drosera chứa phổ rất rộng các flavonoid, flavonoid glucoside nhƣ quercetin,

isoquercetin, kaempferol, astragalin, hyperin, gossypin và gossypitrin [20].

Quercetin Kaempferol

Myricetin Hyperin

Hình 2.5: Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside [29].

2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống

 Nhân giống tự nhiên [3]

Nhân giống bằng cách gieo hạt

Thời gian gieo hạt tốt nhất là cuối mùa đông. Hạt đƣợc gieo trên hỗn hợp đất

trồng thích hợp. Tốt nhất nên giữ hạt trong điều kiện mát và ẩm khoảng 6 tuần. Sau

đó cho hạt vào chậu đất có bọc túi nhựa và để trong điều kiện sáng. Đến khi hạt nảy

mầm thì bỏ túi nhựa ra và trồng các cây con vào chậu lớn.

Nhân giống bằng cách cắt rễ

Cây bắt ruồi có thể đƣợc nhân giống từ các rễ dày. Lấy những rễ khỏe từ cây

mẹ, cắt thành đoạn dài 5 cm và đặt nằm ngang trên hỗn hợp đất dày 6 cm, phủ

chúng với l lớp đất dày 1 cm. Bọc những chậu đất này lại và đặt trong điều kiện

sáng. Khi cây mới bắt đầu mọc lên thì không bọc nữa. Nhân giống bằng phƣơng

pháp cắt rễ tốt nhất vào đầu mùa tăng trƣởng của cây.

Nhân giống bằng cách cắt lá

Thời gian nhân giống tốt nhất là vào đầu mùa tăng trƣởng của cây. Lá đƣợc

cắt ở cuống lá rồi đặt lên trên hỗn hợp đất và cát sao cho lông tuyến hƣớng lên. Giữ

cuống lá ngập trong đất nhƣng không phủ lên các lông tuyến. Bọc chậu đất lại và

giữ trong điều kiện sáng. Sự phát triển của cây xảy ra trong vài tuần.

Nhân giống bằng cây mầm

Vào mùa thu, cây sẽ sản sinh ra những cây bé xíu (cây mầm). Thu thập

những cây mầm này và trồng thành những cây mới. Một cách để thu thập cây mầm

là giữ những chậu chứa cây trút ngƣợc xuống 1 tờ giấy và dùng tăm gạt cây mầm ra

khỏi cây mẹ. Gieo chúng trên hỗn hợp đất. Cây sẽ mọc rễ và phát triển thành cây

trƣởng thành.

 Nhân giống in vitro

Hầu hết những nghiên cứu trên thế giới về nuôi cấy mô Drosera đều cho

thấy nhiều loài Drosera có tiềm năng nhân giống rất cao khi đƣợc nuôi cấy trong

điều kiện in vitro thích hợp. Cho đến nay, rất nhiều loài Drosera đã đƣợc nuôi cấy

in vitro thành công. Hầu hết hạt, lá kết cụm nhƣ hoa, lá tách biệt, đôi khi cả rễ, hoa

và mầm cũng đƣợc sử dụng làm mẫu cấy để thiết lập quy trình nuôi cấy mô.

Trong nƣớc và trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về nhân giống in vitro

cây D. burmanni Vahl. Cây sinh trƣởng tốt nhất trên môi trƣờng MS 1/2

(Murashige Skoog, với lƣợng khoáng cơ bản giảm một nửa), bổ sung than hoạt tính

và casein hydrosylate 100 mg/l [3].

2.1.8. Tầm quan trọng

2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh thái

Drosera burmanni Vahl thƣờng mọc ở đất chua, vùng bạc màu nên là loài

chỉ thị cho vùng đất chua, bạc màu [14], [37].

2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật

Họ Droseraceae là một đối tƣợng điển hình cho các nghiên cứu về quá trình

tiến hóa ở thực vật, bao gồm những thí nghiệm về phát triển và sinh lý học nhằm

nghiên cứu vai trò chuyên biệt của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong tiến

hóa hình thái ở mức vĩ mô. Bên cạnh đó, giống Drosera bao gồm rất nhiều loài

thích nghi với từng điều kiện môi trƣờng khác nhau nên rất thích hợp cho những

nghiên cứu về sự thích nghi cấu trúc và chức năng (bao gồm dinh dƣỡng từ côn

trùng và sự sản sinh mầm) trong các điều kiện môi trƣờng khác nhau. Ngoài ra, hạt

phấn của giống cây này đƣợc tổ chức cố định thành bộ bốn, là trạng thái chuyển tiếp

từ hình thức giao phấn sang tự thụ phấn trong quá trình tiến hóa của hệ thống thụ

phấn ở thực vật.

2.1.8.3. Giá trị dƣợc tính

Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tiềm năng về giá trị dƣợc

tính của Drosera (Bảng 2.3). Trong đó quan trọng nhất là các quinone, đặc biệt là

plumbagin, 7-methyljuglone và các flavonoid.

Các hợp chất quinone đƣợc tìm thấy có khả năng chữa các căn bệnh hô hấp ở

ngƣời nhƣ: hen suyễn, viêm phổi, ho gà và lao. Chúng cũng có khả năng chống lại

các virus, nấm, khuẩn và chống ung thƣ. Tiêu biểu trong nhóm này là plumbagin và

7-methyljuglone [29].

Ngoài quinone, các flavonoid ly trích từ Drosera cũng có giá trị dƣợc tính

cao nhƣ khả năng ức chế enzyme và chống oxi hóa. Một số flavonoid có ảnh hƣởng

lớn đến chức năng của hệ miễn dịch. Tiêu biểu nhóm này có thể kể đến quercetin và

myricetin. Chúng là những chất ức chế hiệu quả các enzyme glyoxylase mà những

enzyme này giữ vai trò rất quan trọng trong việc điều hòa sự phân chia tế bào bằng

cách giải độc -ketoaldehyde. Trong y dƣợc, quercetin đƣợc sử dụng để ngăn ngừa

và điều trị ung thƣ, nó cũng có khả năng ức chế hoạt tính gây đột biến gen của

benzopyrene, một hydrocacbon nhiều nhân thơm gây ung thƣ tiêu biểu.

Bảng 2.3: Dƣợc tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera [29]

HOẠT TÍNH TÀI LIỆU THAM KHẢO

Chống lão hóa và xơ cứng động mạch Grieve (1959)

Harborne (1982) Ức chế độc tố

Frenzer (1980) Chống hen suyễn

Kreher và ctv (1990); Fujii và ctv (1992) Chống ung thƣ

Bhargava (1984); Bhagava và ctv (1985) Ngừa thai, phá thai

Békésiová (1997) Chống nhiễm nấm

Bokemo (1984) Ngừa hủi, phong

Lloyd và ctv (1994); Fujii và ctv (1992) Chống vi khuẩn

Farr và ctv (1985); Durga và ctv (1992) Chống đột biến

Fetterer và ctv (1991) Ngừa giun lãi

Juniper và ctv (1989) Chống co thắt

Walt (1972) Chống virut

Itoigawa và ctv (1991) Tim mạch

Dùng làm mỹ phẩm Slack (1980)

Kreher và ctv (1990) Miễn nhiễm

Gujar và ctv (1988); Joshi và ctv (1989) Diệt côn trùng

Gundidza và ctv (1990) Chống vi trùng lao

Weiss (1991); Ragazzi và ctv (1993) Chống ho gà

Ở Vân Nam (Trung Quốc) Drosera burmanni Vahl (tên thông thƣờng là cẩm

địa la) đƣợc dùng để chữa bệnh viêm ruột, lị, sƣng, đau họng, ho do phổi nóng,

khạc ra máu, đổ máu mũi và trẻ em bị cam tích. Ở Quảng Tây, cây dùng để trị đòn

ngã, tổn thƣơng và bệnh mề đay [15].

Năm 1958 - 1959, bệnh viện Vinh dùng D. burmanni Vahl dƣới nhiều dạng

khác nhau (rƣợu thuốc, xi-rô, thuốc hãm, thuốc cao) để chữa bệnh ho gà [2].

Drosera burmanni Vahl cũng đƣợc công nhận là có giá trị trong việc chữa

các bệnh kiết lị, lao hạch, cam tích (suy dinh dƣỡng nhƣng bụng chƣớng to ở trẻ

em) [9], [10].

2.1.8.4. Ứng dụng trong công nghiệp

Ở một số nơi trên thế giới, dịch chiết Drosera đƣợc dùng làm đông tụ sữa do

giàu hàm lƣợng acid hữu cơ và enzyme. Ngoài ra sắc tố của một số loài Drosera

còn đƣợc dùng để nhuộm vải [39].

2.1.8.5. Giá trị kinh tế

Sự đa dạng về giống loài, sự lạ mắt về hình thái khiến Drosera đem lại giá trị

kinh tế rất cao trong thị trƣờng hoa cảnh thế giới (Hình 2.6) [42].

D. capensis D. brevicornis D. capensis D. aliciae

D. sewelliae D. pulchella D. pulchella D. paleacea

D. fimbriata D. fimbriata D. villosa D. villosa

D. erythrorhiza D. binata D. binata D. falconeri

Hình 2.6: Mô ̣t số loa ̣i Drosera có giá trị kinh tế cao trên thế giới [42].

2.1.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc

 Trong nƣớc

Đỗ Đăng Giá p (2003) đã khảo sát, thu thập, thuần dƣỡng và thử nghiệm in

vitro những loài cây bắt mồi ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣớc Bửu [1].

Trần Thị Bích Chiêu (2004) khảo sát vòng đời và tái tạo chồi từ phát hoa cây

Drosera burmanni Vahl [13].

Quách Ngô Diễm Phƣơng (2006) hoàn thiện qui trình nuôi cấy in vitro cây

Drosera indica L và khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất naphthoquinone có

hoạt tính sinh học đƣợc tách chiết từ cây [12].

Hồ Thụy Bích Tuyền (2006) ly trích và khảo sát hoạt tính sinh học của hợp

chất quinone từ cây Drosera burmanni Vahl nuôi cấy in vitro [3].

(Drosera burmanni Nguyễn Đa ̣i Hải (2006) đã n uôi cấy mô cây bắt ruồi

Vahl) và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất chiết thô plumbagin [5].

 Thế giới

K. Javaram và M. N .V Prasad (2005) đã công bố nhân nhanh chồi cây

Drosera burmanni Vahl trong môi trƣờng MS có bổ sung 2 mg/l Kn và 1 mg/l BA.

Sự tái sinh cây hoàn chỉnh từ phát hoa cũng đƣợc quan sát trên môi trƣờng với nồng

độ Kinetin thấp hơn (1 mg/l). Sự ra rễ cũng đƣợc thực hiện thành công trên môi

trƣờng MS cơ bản [24].

Mejia Hersikorpi và các cộng sự (2002) đã nhân giống thành công cây

Drosera rotundifolia từ lá của nó và tạo ra đƣợc cụm chồi đạt 20 - 30 chồi trên môi

trƣờng MS có bổ sung 0,45 mg/l BA và 0,37 mg/l NAA [5].

Kawiak A., Królika A. và Lojokowska E. tái sinh D. anglica, D. binata đạt

số chồi lớn nhất trên môi trƣờng Vacin và Went không có chất điều hòa sinh

trƣởng, đối với D. anglica là môi trƣờng Fast bổ sung 0,05 M 6-benzyladenine

(BA) và 0,005 M -napthaleneacetic acid (NAA), còn môi trƣờng nhân chồi tối ƣu

cho D. cuneifolia MS 1/2 bổ sung 0,2 M BA và 0,2 M NAA. Môi trƣờng lỏng

làm gia tăng đáng kể khả năng nhân chồi của mẫu cấy D. anglica và D. binata [25].

Ingrid L. I. Hook (2001) đã nuôi cấy D. binata, D. rotundifolia, D. capensis

trong cả môi trƣờng MS lỏng và có agar; nuôi cấy dịch huyền phù D. rotundifolia

trên môi trƣờng Gamborg’s B5; nuôi dịch huyền phù D. capensis trong môi trƣờng

MS và McCowns Woody Plant (McC) [23].

Jozep Nahálka và cộng sự đã tạo mô sẹo và nuôi cấy thành công dịch huyền

phù để thu nhận plumbagin từ cây Drosophyllum lusitanicum trên môi trƣờng MS

bổ sung 1 mg/l IBA và 0,5 mg/l NAA [28].

2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất

thứ cấp

2.2.1. Khái niệm hợp chất thứ cấp

Hợp chất thứ cấp hay sản phẩm trao đổi bậc hai là những sản phẩm đƣợc tạo

ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào, sau đó chúng

thoát ra khỏi tế bào đi ra môi trƣờng ngoài.

Phần lớn các sản phẩm bậc hai thƣờng không có nhiều ý nghĩa sinh lý đối

với bản thân tế bào . Quá trình tạo ra các sản phẩm bậc hai chỉ thông qua những cơ

chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào, cũng có thể do sự sai lệch về thông tin di

truyền trong tế bào dẫn đến hiện tƣợng sinh tổ ng hợp thừa [7].

Các loại hợp chất thứ cấp bao gồm những nhóm chính sau:

Các hợp chất trao đổi thứ cấp chứa nitrogen gồm: alkaloid, các độc

chất chứa nitơ đã đƣợc glycosyl hóa, các amino acid không phải

protein,…

Các chất trao đổi có phenol, isoprenoid, các polyketide.

Con đƣờng tổng hợp ra chúng đƣợc trình bày trong sơ đồ 2.1 [43].

Hình các nhóm hợp chất thứ cấp chính trong thực vật

Sơ đồ 2.1: Con đƣờng tổng hợp các nhóm hợp chất thứ cấp chính ở thực vật [43].

2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo

2.2.2.1. Khái niệm mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ

quan đã phân hóa dƣới điều kiện đặc biệt (vết thƣơng, xử lý với các chất điều hòa

sinh trƣởng thực vật…).

Mô sẹo có thể đƣợc kích thích tạo ra trong ống nghiệm bằng cách đƣa một

mẫu nhỏ của cây lên môi trƣờng vô trùng có bổ sung hormone. Dƣới tác dụng của

các hormone kích thích nội sinh hoặc các hormone nhân tạo, quá trình trao đổi chất

của tế bào sẽ thay đổi và bắt đầu hoạt động phân bào. Vì vậy khi có sự mất cân bằng

về các nồng độ hormone sinh trƣởng trong thực vật thì mô sẹo hình thành. Khối mô

sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trƣờng không có

chất kích thích tạo mô sẹo [7].

2.2.2.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo

- Nhân giống in vitro các loài thực vật mà phƣơng pháp nhân giống đỉnh sinh

trƣởng ít hiệu quả hay khó thực hiện.

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan.

- Làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn cho chọn lọc dòng tế bào.

- Thu nhận các sản phẩm hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao.

- Nuôi cấy huyền phù tế bào.

2.2.3. Nuôi cấ y di ̣ch huyền phù 2.2.3.1. Khái niệm huyền phù tế bào

Huyền phù tế bào là một môi trƣờng lỏng đƣợc lắc liên tục, trong đó có sự

hiện diện của các tế bào soma cô lập hoặc những cụm nhỏ các tế bào có khả năng

sinh phôi có thể tái sinh thành một thực vật nguyên vẹn [7].

2.2.3.2. Nguyên tắc tạo huyền phù

Huyền phù đƣợc tạo ra từ những mảnh mô sẹo trong một môi trƣờng lỏng

đƣợc lắc liên tục. Muốn cho huyền phù đƣợc tốt thì phải tạo đƣợc mô sẹo tốt tức là

mô sẹo phải bao gồm các tế bào có khả năng sinh phôi. Trong quá trình tạo huyền

phù, những điều kiện sinh trƣởng nhƣ môi trƣờng dinh dƣỡng, ánh sáng, nhiệt độ

hay thành phần các chất kích thích cũng tƣơng tự nhƣ lúc tạo mô sẹo hoặc nếu có

thay đổi thì chỉ thay đổi rất ít.

Trong môi trƣờng lỏng, từ mô sẹo có thể phóng thích ra những tế bào riêng

lẻ hay những cụm tế bào từ vài chục đến cả trăm tế bào giúp tăng diện tích hấp thu

các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy. Ngoài ra hoạt động của máy lắc

cũng giúp cho sự trao đổi khí giữa môi trƣờng và tế bào đƣợc thuận lợi hơn.

Một huyền phù tế bào đƣợc cho là lý tƣởng khi nó là một dịch mịn, hầu nhƣ

gồm những yếu tố có khả năng sinh phôi, nói cách khác là những tế bào cô lập hay

hợp thành từng nhóm nhỏ từ vài đến khoảng 20 tế bào có khả năng duy trì tính toàn

năng và tiến hóa thành phôi soma trên môi trƣờng tái sinh trong điều kiện thích hợp.

2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo huyền phù tế bào [7]

- Hệ thống nuôi cấy.

- Ánh sáng, nhiệt độ.

- Mật độ tế bào khởi đầu.

- Môi trƣờng nuôi cấy.

- Vai trò của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật

- Sự tăng trƣởng và cấy chuyền huyền phù tế bào.

- Điều kiện môi trƣờng.

- Cụm tế bào trong dịch huyền phù.

2.2.3.4. Các phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù hiện nay [6], [20]

Có nhiều phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù tế bào khác nhau đã đƣợc phát

triển, nhƣng có hai phƣơng pháp chính :

 Nuôi cấy gián đoạn

Tế bào thực vật đƣợc nuôi trong một thể tích (100 ml - 10 lít) hỗn hợp môi

trƣờng. Trong giai đoạn phát triển của tế bào, số lƣợng tế bào ban đầu gia tăng cho

đến khi dinh dƣỡng trong môi trƣờng cạn kiệt hoặc có sự tích lũy chất trao đổi đến

mức kìm hãm. Các môi trƣờng nuôi cấy quy mô nhỏ đƣợc chuyển động liên tục trên

máy lắc hay trong bình phản ứng đƣợc phối trộn đều. Môi trƣờng trong bình chứa

thƣờng chiếm 1/5 thể tích. Máy lắc đƣợc điều chỉnh ở vận tốc 30 - 180 vòng/phút

biên độ 3 cm. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm.

Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là không sử dụng trong nghiên cứu dài hạn về

sự phát triển tế bào và sự trao đổi chất, khó nhận đƣợc sự ổn định trong sản xuất.

Các tế bào nuôi cấy gián đoạn không đồng nhất về kích thƣớc và cấu tạo. Để

đảm bảo yêu cầu nuôi cấy phải cấy chuyền thƣờng xuyên quần thể tế bào vào môi

trƣờng mới sau những khoảng thời gian bằng nhau.

Hình 2.7: Hệ thống nuôi cấy gián đoạn qui mô nhỏ trên các máy lắc [44].

 Nuôi cấy liên tục

Đây là một phƣơng pháp quan trọng đƣợc dùng để sản xuất hợp chất sơ cấp

hay thứ cấp trên quy mô lớn. Kỹ thuật này đòi hỏi phải có hệ thống thiết bị phức

tạp. Sự chuyển động của môi trƣờng nuôi cấy lớn trong các bồn phản ứng sinh học

đƣợc thực hiện bằng cách khuấy với một turbin và (hoặc) sục không khí vô trùng

vào môi trƣờng từ dƣới đáy. Phƣơng pháp nuôi cấy này cho phép giữ vô trùng cả hệ

thống trong một thời gian dài.

Hình 2.8: Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm [45].

2.2.3.5. Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất các

hợp chất thứ cấp

- Chất điều hòa sinh trƣởng (hormone thực vật) bao gồm các auxin nhƣ:

IAA, NAA, 2,4-D ; các cytokinin nhƣ: BAP, kinetin…

- Nguồn đạm.

- Nguồn carbon.

- Ánh sáng.

- Các yếu tố khác: pH môi trƣờng, nồng độ phosphate, các loại khí (O2, CO2, …)

2.2.4. Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy

huyền phù [22]

Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền

phù có thể kể đến:

2.2.4.1. Tối ƣu hoá điều kiện nuôi cấy

Khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào có thể chịu ảnh hƣởng

bởi nhiều yếu tố vật lý (nhƣ nhiệt độ, độ thông khí, tốc độ lắc, ánh sáng, pH…) và

hoá học (nhƣ chất điều hoà tăng trƣởng thực vật), thành phần các chất trong môi

trƣờng nuôi cấy…Tuỳ từng loại tế bào mà sự đáp ứng với các yếu tố kể trên sẽ khác

nhau. Khi xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu thì sự sản xuất và tích luỹ các

hợp chất thứ cấp trong tế bào in vitro sẽ cao hơn so với cây trồng ngoài thiên nhiên.

Phƣơng pháp này đã đạt đƣợc thành công lớn trong trƣờng hợp của shikonin

và berberine [31].

2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao

Hệ thống tế bào nuôi cấy là một quần thể tế bào có nhiều kiểu gen khác

nhau, do đó các đặc tính sinh lý của tế bào sẽ khác nhau. Phƣơng pháp chọn lọc

dòng tế bào là một kỹ thuật hữu hiệu để tăng sản lƣợng các hợp chất thứ cấp.

2.2.4.3. Bổ sung tiền chất

Sự bổ sung các tiền chất hữu cơ xuất phát từ quan niệm cho rằng những hợp

chất này có thể là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu của một con đƣờng sinh

tổng hợp các sản phẩm thứ cấp nào đó. Sự bổ sung các tiền chất của quá trình sinh

tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn vào môi trƣờng nuôi cấy giúp nâng cao

hiệu quả sản xuất của tế bào trong một số trƣờng hợp xác định. Phƣơng pháp này sẽ

có giá trị khi giá thành của các tiền chất không quá đắt.

2.2.4.4. Cố định tế bào

Trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận các sản phẩm thứ cấp, việc cố định tế bào giúp kéo dài thời gian sử dụng, đặc biệt là trong các hệ thống

phản ứng sinh học. Mặt khác, những tế bào cố định ít bị tác động bởi điều kiện môi

trƣờng hơn so với tế bào tự do. Tế bào cố định thƣờng là những tế bào có khả năng

tiết các sản phẩm thứ cấp ra môi trƣờng ngoài. Tế bào ở trạng thái cố định đôi khi

tạo ra đƣợc các hợp chất thứ cấp có sản lƣợng cao hơn tế bào ở trạng thái lơ lững tự

do. Các chất đƣợc sử dụng để cố định tế bào là agarose, carageenan, alginate, agar,

các sợi propylen,… Sự cố định tế bào giúp tăng sản xuất các hợp chất thứ cấp

nhƣng cũng không loại trừ khả năng chính những chất cố định lại là tác nhân kích

thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp.

2.2.4.5. Cảm ứng sự phân hoá mô

Dịch treo tế bào thƣờng đƣợc sử dụng để thu nhận các sản phẩm thứ cấp.

Tuy nhiên, gần đây, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc nuôi cấy những mô

đã phân hoá nhƣ nuôi cấy thân, chồi, hay rễ tơ,…nhằm thu nhận hợp chất thứ cấp.

Các nghiên cứu chứng minh rằng có mối quan hệ mật thiết giữa sự sản xuất các hợp

chất thứ cấp với sự phân hoá tế bào và sự phát sinh hình thái của thực vật.

2.2.4.6. Nhân tố cả m ƣ́ ng (elicitor)

Theo Rhoberts và Shuler (1999), tiến trình cảm ứng biểu hiện gene của các

enzyme xúc tác tổng hợp các chất biến dƣỡng thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật

đƣợc biết đến nhƣ là sự cảm ứng (elicitation) [26]. Elicitation trong sản suất hợp

chất thứ cấp của tế bào thực vật xảy ra do sự tiếp xúc giữa tế bào thực vật với các

biotic và abiotic elicitor. Thuật ngữ “elicitor” đƣợc sử dụng đầu tiên cho các tác

nhân kích thích bất kỳ dạng phản ứng phòng vệ nào của cây với các bệnh lý xuất

hiện trên đồng ruộng. Thực vật có thể sản xuất ra các chất kháng sinh biến dƣỡng

thứ cấp nhƣ các phytoalexin trong các phản ứng chống lại sự tấn công của vi khuẩn.

Do đó, các vi sinh vật (đặc biệt là nấm và các thành phần của chúng) đã đƣợc sử

dụng rộng rãi để cảm ứng sản xuất hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật [18].

2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn

2.3.1. Phƣơng pháp ly trích - thu nhận hợp chất [8]

2.3.1.1. Sắc ký cột

Luận văn sử dụng hệ thống sắc ký cột hở với chất hấp thụ là silica gel trong

qui trình ly trích và thu nhận hợp chất anthraquinone (Hình 2.9).

 Khái niệm

Sắc ký cột hở là một hệ thống vật lý trong đó có một cột đƣợc nạp chặt chẽ

bởi một chất hấp thụ và có một pha lỏng di động chảy xuyên ngang qua. Tùy thuộc

và loại chất hấp thu để nạp cột và pha động, ngƣời ta phân biệt một số cơ chế tách:

sắc ký hấp thu, sắc ký phân chia, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực…

Hình 2.9: Sắc ký cô ̣t [47].

 Nguyên tắc của sắc ký cột

Sắc ký cột căn cứ trên khả năng mà phân tử chất tan có thể tƣơng tác với

pha tĩnh. Những tƣơng tác này sẽ lần lƣợt làm chậm sự di chuyển của những chất

tan khác nhau, khi chúng di chuyển xuyên qua chất hấp thụ để ra khỏi cột. Các

tƣơng tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể là nối hydrogen, nối Val der

Waal, tƣơng tác lƣỡng cực - lƣỡng cực, tƣơng tác acid - bazơ, sự tạo phức. . .

 Chất hấp thụ silica gel

Silica gel là polimer ba chiều của những tứ diện oxid silicon SiO2.H2O. Đây

là những nguyên liệu có lỗ rỗng. Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cột có diện tích

bề mặt khoảng 100 - 800 m2/g, đƣờng kính hạt trung bình là 40 - 200 m và các lỗ

rỗng trên bề mặt có đƣờng kính trung bình 40 - 300 A0.

Trên bề mặt các hạt silica gel có mang những nhóm silanol-OH. Đây là trung

tâm hoạt động có thể tạo nên những nối hydrogen mạnh với những hợp chất đƣợc

sắc ký. Vì thế, những hợp chất nào có khả năng tạo nối hydrogen mạnh hợp chất đó

sẽ bị silica gel giữ mạnh lại trong cột. Nhƣ vậy những hợp chất phân cực mạnh có

chứa nhóm chức acid carboxilic, amin, amid sẽ hấp thụ mạnh vào silica gel trong

khi những hợp chất kém phân cực nhƣ alkan, terpen (những hợp chất không chứa

các nhóm chức có thể tạo nối hydrogen) sẽ ít bị giữ. Ngoài ra một hợp chất có thể bị

silica gel giữ lại mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi ly giải.

 Nguyên tắc cơ bản khi sử dụng sắc ký cột

Lựa chọn dung môi giải ly: trong loại sắc ký cột hấp thu, hợp chất không

phân cực sẽ đƣợc ly giải khỏi cột trƣớc, hợp chất phân cực đƣợc giải ly sau. Thông

thƣờng ngƣời ta bắt đầu bằng dung môi không phân cực để loại tƣơng đối các hợp

chất không phân cực ra khỏi cột và tăng dần độ phân cực của dung môi giải ly để

đuổi các hợp chất có tính phân cực mạnh hơn. Nhƣng nếu thay đổi dung môi phân

cực hơn một cách đột ngột sẽ làm gãy cột.

Kích thƣớc cột và lƣợng mẫu chất: Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lƣợng

mẫu chất cần phân tách. Kích thƣớc cột cần đạt tỷ lệ về chiều cao – đƣờng kính là

8:1. Trọng lƣợng chất hấp thụ và trọng lƣợng mẫu phải tuân theo một tỷ lệ tƣơng

ứng. Trung bình thì trọng lƣợng chất hấp thụ phải lớn hơn 25 - 50 lần trọng lƣợng

của mẫu cần sắc ký (tính theo trọng lƣợng). Tuy nhiên, với những hỗn hợp mà các

hợp chất không dễ dàng tách riêng thì cần sử dụng cột lớn hơn với số lƣợng chất

hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100 - 500 lần).

2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry – Column Flash Chromatography) [8]

 Khái niệm

Sắc ký nhanh cột khô là một biến đổi của sắc ký cột nhanh, sử dụng áp suất

kém để gia tăng vận tốc ly giải của pha động. Kỹ thuật này khác với sắc ký nhanh là

cột sắc ký đƣợc rút khô sau mỗi phân đoạn thu đƣợc.

 Chất hấp thụ

Sử dụng silica gel loại dùng cho sắc ký lớp mỏng (Merk 60H hoặc 60 G; tức

40 - 15 m hoặc alumina loại dùng cho sắc ký lớp mỏng (10 m, diện tích bề mặt

riêng lớn: 500 m2.g-1).

 Mô tả hệ thống

- Phễu lọc xốp bằng thủy tinh. Độ xốp của lỗ thuộc loại 3 hoặc loại D. Phễu

có đủ kích cỡ lớn nhỏ (loại 100; 150; 250; 500 ml…) thích hợp với lƣợng mẫu cần

sắc ký (Bảng 1.4).

- Bình tam giác.

- Hệ thống tạo áp suất bằng vòi nƣớc (20 - 70 mmHg; chỉ cần áp suất vừa

phải).

Hình 2.10: Mô hình sắc ký nhanh cô ̣t khô [8].

2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế [8]

 Khái niệm

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), là kỹ

thuật phân bố rắn - lỏng, trong đó pha động là chất lỏng đƣợc cho đi ngang qua một

lớp chất hấp thụ trơ (ví dụ silica gel hay alumina) chất hấp thu này đƣợc tráng thành

một bản mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng nhƣ tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm

plastic.

Do chất hấp thụ đƣợc tráng thành một lớp mỏng nên phƣơng pháp này gọi là

sắc ký bản mỏng.

Một hợp chất tinh chất khi sắc ký bản mỏng sẽ cho một vết, với giá trị Rf

không đổi trong một hệ dung môi ly giải xác định, bởi bảng sắc ký của một lô sản

xuất nhất định.

Với: Khoảng cách di chuyển của hợp chất Rf = Khoảng đƣờng di chuyển của dung môi Giá trị Rf không bao giờ lớn hơn 1 và thay đổi tùy theo: loại chất hấp thu

dùng để tráng bản mỏng, thành phần dung môi giải ly, độ bão hòa dung môi, kỹ

thuật ly giải.

Hình 2.11: Sắc ký lớp mỏng [46].

 Ƣu điểm

Ƣu điểm của sắc ký bản mỏng điều chế với sắc ký cột là: nhanh, dễ tìm đƣợc

dung môi thích hợp để giải ly tách tốt các chất; các vùng có chứa chất cần thiết sẽ tụ

lại thành lớp mỏng dễ dàng phát hiện, dễ dàng cô lập chất. Sở dĩ sắc ký lớp mỏng

tách tốt là nhờ tỷ lệ lớn giữa “chất tách : chất hấp thụ silica gel” (1:1000 đến 1:

10.000) trong khi tỷ lệ này ở sắc ký cột là 1:50.

 Nhƣợc điểm

Chỉ sử dụng đƣợc sắc ký điều chế khi hỗn hợp chất cần tách chỉ chứa khoảng

4 thành phần chính và có trọng lƣợng nhỏ vài trăm miligram; còn nếu có một mẫu

chất vài gram thì nên sử dụng sắc ký cột vì các bảng sắc ký điều chế rất đắt tiền.

2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lƣợng hợp chất thứ cấp

 Nguyên tắc

Nguyên tắc của kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC (High Performance Liquid

Chromatography) dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai chất lỏng không trộn

lẫn vào nhau khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua một chất lỏng đứng

yên (pha tĩnh). Pha tĩnh bị hấp thụ trên bề mặt chất rắn (chất mang). Thông thƣờng

pha tĩnh là dung môi phân cực, pha động thƣờng là nƣớc hoặc dung môi hữu cơ.

Đôi khi pha tĩnh là các chất lỏng ít phân cực lúc đó pha động phải là dung môi ít

phân cực hơn.

 Các bộ phận chính của máy HPLC

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ hoạt động các bộ phận của máy HPLC  Ứng dụng của sắc ký lỏng cao áp

Phƣơng pháp HPLC có khả năng tách các chất đặc thù nhƣ:

- Các hợp chất cao phân tử, ion thuộc đối tƣợng nghiên cứu y học, sinh học.

- Các hợp chất tự nhiên không bền, các chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ.

- Tách các acid nucleic, dƣợc phẩm, steroit, vitamine, chất bảo quản thực

phẩm, chất bảo vệ thực vật, các phenol, các hydrocacbon trong dầu mỏ…

 Ƣu điểm

Ngoài những ứng dụng rộng rãi đã nêu ở trên, HPLC còn có những ƣu điểm

hơn sắc ký lỏng cổ điển nhƣ tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, cột tách dùng

đƣợc nhiều lần, mẫu chất thu lại dễ dàng vì hầu hết các detector không phá hủy

mẫu.

Xét về đầu tƣ trang thiết bị lẫn phí tổn vận hành, HPLC là một kỹ thuật đắt tiền.

 Nhƣợc điểm

Chƣơng 3

3. VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP

 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: từ tháng 3/2007 đến hết tháng 8/2007.

Địa điểm: các thí nghiệm nuôi cấy mô đƣợc thực hiện tại trại thực nghiệm

sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đa ̣i ho ̣c Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.

Các thí nghiệm định lƣợng hợp chất anthraquinone trong cây D. burmanni

Vahl đƣợc thực hiện tại phòng sắc ký , Viê ̣n Công nghê ̣ Sinh học và Công nghệ môi

trƣờ ng, Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh.

3.1. Nuôi cấ y mô se ̣o, tạo dịch huyền phù

3.1.1. Vật liệu

 Nguồn giống

Nguyên liệu dùng cho thí nghiệm là cây Drosera burmanni Vahl, do phòng

công nghệ sinh học thực vật, Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh

cung cấp. Các mẫu thí nghiệm đồng nhất về mặt di truyền (Hình 3.1).

Hình 3.1: Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro.

 Môi trƣờng

- Môi trƣờng muối khoáng MS (Murashige Skoog, 1962) (Phụ lục 1) với

thành phần khoáng đa lƣợng giảm 1/2 (ký hiệu là MS 1/2) bổ sung:

- Đƣờng: 30 g/l.

- Agar: 7 g/l.

- Than hoạt tính: 1 g/l.

- Casein hydrosylate: 100 mg/l.

- pH = 5,8 ± 0,1 (trƣớc khi hấp khử trùng). - Hấp khử trùng bằng autoclave ở 1210 C, 1 atm, 20 phút.

- Môi trƣờng muối khoáng Gamborg’s B5 (phụ lục) bổ sung :

- Vitamin B1= 0,4 mg/l.

- Vitamin B6 = 0,5 mg/l.

- Vitamin PP = 0,5 mg/l.

- PVP = 1,25 mg/l.

- Casein hydrosylate: 100 mg/l.

- Hormone tăng trƣởng thực vật: NAA, 2,4-D, BA, IBA có nồng độ thay đổi.

 Điều kiện nuôi cấy

- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày.

- Cƣờng độ chiếu sáng: 3000 lux. - Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 22 – 250 C.

- Độ ẩm trung bình: 70 %.

 Trang thiết bị và dụng cụ

- Trang thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, máy đo pH, cân phân tích.

- Dụng cụ: chai nƣớc biển, đĩa petri, dao, kẹp cấy,…

3.1.2. Phƣơng pháp

3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ

đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng

Mục đích thí nghiệm

Xác định thành phần khoáng và nồng độ đƣờng thích hợp để duy trì sự phát

triển của mẫu cấy lớp mỏng TCL.

Bố trí nghiệm thức

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, gồm 12

nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 20 mẫu và đƣợc lập lại ba lần. Kết quả là trị số

trung bình của 3 lần lập lại.

Bảng 3.1: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng thành phần khoáng và nồng độ

đƣờng lên sự phát triển mẫu cấy lớp mỏng

Loại môi trƣờng Nồng độ đƣờng (g/l)

5 10 20 30

A1 A2 A3 A4 MS

A5 A6 A7 A8 MS 1/2

A9 A10 A11 A12 Gamborg’s B5

Chỉ tiêu theo dõi

Theo dõi kết quả sau 14 ngày dựa trên chỉ tiêu là tỷ lệ (%) số mẫu còn sống.

Chỉ tiêu này đƣợc xác định theo công thức:

Số mẫu còn sống Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy

Phƣơng pháp tiến hành

Các bộ phận gồm thân, lá non (lớp lá thứ nhất hay thứ hai) và phát hoa của

cây Drosera burmanni Vahl in vitro đƣợc cắt thành các lớp mỏng (từ 0,2 - 0,5 mm),

cấy vào các nghiệm thức nhƣ đã bố trí.

3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc

kích ứng tạo mô sẹo

Mục đích thí nghiệm

Tìm sự kết hợp của các loại hormone thích hợp nhất cho việc tạo mô sẹo.

Bố trí nghiệm thức

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố,

gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức tiến hành trên 45 mẫu và đƣợc lập lại 3 lần,

kết quả là trị số của 3 lần lập lại.

Bảng 3.2: Bố trí nghiệm thức khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho

việc kích ứng tạo mô sẹo

NAA (0,2) NAA (0,5) NAA (1) Các loại hormone 2,4-D (0,1) IBA (1) BA (0,2) kết hợp (mg/l) [12], [23] [28] [5]

Nghiệm thức B1 B2 B3

Chỉ tiêu theo dõi

Theo dõi kết quả sau 14 ngày nuôi cấy dựa trên chỉ tiêu là tỷ lệ mẫu cấy tạo

mô sẹo, với:

Tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy

Cách thực hiện

- Mẫu cắt lớp mỏng cây D. burmanni Vahl đƣợc đƣa vào các nghiệm thức

trong đó môi trƣờng có thành phần khoáng và nồng độ đƣờng tối ƣu với mẫu cấy

lớp mỏng đã tìm đƣợc từ thí nghiệm 1.

- Ủ tối trong các thùng carton.

3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp với

NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo

Mục đích thí nghiệm

Tìm nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm

ứng tạo mô sẹo bằng phƣơng pháp lớp mỏng tế bào TCL.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố, gồm 6

nghiệm thức trên mỗi loại vật liệu, mỗi nghiệm thức thực hiện trên 12 mẫu và đƣợc

lập lại 3 lần. Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại.

Bảng 3.3: Bố trí nghiệm thức khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp

với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo

Vật liệu đầu Nồng độ 2,4-D (mg/l)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

C1 C2 C3 C4 C5 C6 Phát hoa TCL

C1’ C2’ C3’ C4’ C5’ C6’ Thân TCL

C1” C2” C3” C4” C5” C6” Lá TCL

Chỉ tiêu theo dõi

Ghi nhận kết quả sau 21 ngày nuôi cấy vớ i các chỉ tiêu sau:

- Tỷ lệ mô sẹo tạo thành

- Hình thái mô sẹo

Với Số mẫu tạo sẹo

Tỷ lệ mẫu tạo sẹo (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy

Phƣơng pháp tiến hành

Mẫu cắt lớp mỏng của phát hoa, thân, lá non đƣợc đƣa vào môi trƣờng có

nồng độ 2,4-D thay đổi và ủ tối 21 ngày trong các thù ng carton.

3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng

sinh khối mô sẹo

Mục đích

Tìm kiểu nuôi cấy thích hợp cho việc tăng sinh khối mô sẹo.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố và

gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức tiến hành trên 1 bình, 3 lần lập lại. Kết quả là

giá trị trung bình của 3 lần lập lại.

Bảng 3.4: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng

sinh khối mô sẹo

Rắn Bán rắn Lỏng tĩnh Lỏng lắc Kiểu nuôi cấy

D1 D2 D3 D4 Nghiệm thức

Chỉ tiêu theo dõi

Chỉ tiêu theo dõi là khối lƣợng mô sẹo gia tăng sau 21 ngày nuôi cấy quy về

1 mg. Chỉ tiêu này đƣợc tính bằng công thức:

Δm = [(m21 - m0)/m0] (mg)

Trong đó :

Δm: khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1mg ban đầu.

m0: khối lƣợng mô sẹo ban đầu.

m21: khối lƣợng mô sẹo sau 21 ngày nuôi cấy.

Phƣơng pháp tiến hành

Mô sẹo đƣợc cấy vào môi trƣờng với các kiểu nuôi cấy khác nhau, bổ sung

hormone tăng trƣởng là 2,4-D và NAA với sự kết hợp hai nồng độ tối ƣu ở thí

nghiệm 3. Các mô sẹo này đều đƣợc cân khối lƣợng trƣớc khi cấy. Sau 21 ngày

nuôi cấy cân lại khối lƣợng mô sẹo và ghi nhận kết quả.

Các kiểu nuôi cấy gồm:

- Kiểu nuôi cấy dạng rắn: môi trƣờ ng có bổ sung agar (7 g/l).

- Kiểu nuôi cấy bán rắn: môi trƣờng lỏng, có bông gòn làm giá thể, không

lắc.

- Kiểu nuôi cấy lỏng tĩnh: môi trƣờng lỏng, không lắc.

- Kiểu nuôi cấy lỏng lắc: môi trƣờ ng lỏng, lắc với tốc độ 150 vòng/phút.

3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắ c

tố đỏ của mô sẹo

Mục đích: Bƣớc đầu ghi nhận ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc

tố đỏ ở mô sẹo.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố

gồm 2 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức thực hiện trên 10 mẫu mô sẹo, lập lại 3 lần.

Kết quả là trị số trung bình của 3 lần lập lại.

Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành

sắc tố đỏ ở mô sẹo

Điều kiện nuôi cấy Chiếu sáng 16h/ngày Ủ tối hoàn toàn

Nghiệm thức E1 E2

Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhận tỷ lệ hình thành sắc tố đỏ ở mô se ̣ o sau 21 ngày

nuôi cấy.

Số mô sẹo hình thành sắc tố đỏ x 100

Tỷ lệ mô sẹo hình thành sắc tố đỏ (%) = Tổng số mẫu cấy

Phƣơng pháp tiến hành

Các mô sẹo đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung hormone NAA và 2,4-D

ở nồng độ kết hợp tối ƣu (Thí nghiệm 3) trong hai điều kiện ủ tối hoàn toàn và chiếu

sáng 16 giờ/ ngày.

3.2. Ly trích và cô lâ ̣p hơ ̣p chấ t anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl 3.2.1. Vật liệu

 Nguồn mẫu

- Cây D. burmanni Vahl in vitro.

 Hóa chất

- Silica gel (Merck)

- Benzene (Trung Quốc)

- Chloroform (Trung Quốc)

- Ether dầu hỏa (Trung Quốc)

- Diethyl ether (Trung Quốc)

- Methanol (Trung Quốc)

- Thuốc thử Borntraeger ( KOH 5% trong methanol).

 Trang thiết bị và dụng cụ

- Thiết bi ̣: máy cô quay chân không, tủ hút hóa chất, tủ sấy, cô ̣t sắc ký, sắc

ký bản mỏng (Merck) …

- Dụng cụ: giấy lọc, ống vi quản, chai bi, đũa thủy tinh, bao tay, khẩu trang,..

3.2.2. Phƣơng pháp tiến hành

Hợp chất anthraquinone đƣợc ly trích và cô lập theo quy trình của Hồ Thị

Bích Tuyền (2006) [3].

Cây tƣơi

Sấy ở 500C

Cây khô

Nghiền

Bột cây

Ngâm dầm trong ethanol ít nhất 24 giờ, Lọc, cô quay chân không.

Cao thô ethanol

Sắc ký nhanh cột khô với đơn dung môi benzene

Phân đoạn cao benzene

Sắc ký cột ƣớt vớ i hệ dung môi ether dầu hỏa:chloroform (95:5) Phân đoạn chứa hợp chất anthraquinone

Sắc ký bản mỏng điều chế nhiều lần Hệ dung môi benzene:chloroform (3:7)

Hợp chất anthraquinone tinh khiết tƣơng đối

Sơ đồ 3.1: Quy trình ly trích và cô lâ ̣p hơ ̣p chất anthraquin one.

Hơ ̣p chất anthraquinone sau khi ly trích và tinh chế đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng làm chất

tham chiếu trong các thí nghiê ̣m đi ̣nh lƣơ ̣ng bằng HPLC.

3.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu nuôi cấy in

vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC

3.3.1. Vâ ̣t liê ̣u

 Nguồn mẫu

- Cây D. burmanni Vahl các loa ̣i.

- Dịch huyền phù cây D. burmanni Vahl ta ̣o đƣơ ̣c từ thí nghiệm 4.

 Hóa chất

- Methanol (Prolabo)

- Acid acetic (Merck)

- Triethylamine (Merck)

- Anthraquinone (đã đƣơ ̣c ly trích và tinh chế trong phần 3.2.)

 Trang thiết bi ̣ và du ̣ng cu ̣

- Thiết bi ̣: máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC), máy đánh sóng siêu âm, máy

nghiền mẫu khô, tủ sấy, máy ly tâm, cân phân tích,…

- Dụng cụ: giấy lọc, đầu lọc 0,2 m, cối sứ, bao tay, khẩu trang,…

3.3.2. Phƣơng phá p

So sánh trực tiếp diện tích peak của mẫu thử với diện tích peak của mẫu

anthraquinone tham chiếu tƣơng ứng có nồng độ xác định. Yêu cầu của phƣơng

pháp này là việc tiến hành sắc ký HPLC mẫu tham chiếu và mẫu thử phải tiến hành

trong cùng điều kiện sắc ký và về nguyên tắc thời gian thực hiện hai mẫu không

cách xa nhau.

3.3.2.1. Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp

Dựa trên các thông số , điều kiện mà Quá ch Ngô Diễm Phƣơng (2006) [12] đã sử dụng để khảo sát hàm lƣợng plumbagin trong cây D. indica L bằng HPLC,

chúng tôi đã chọn các điều kiện thông số thích hợp để chạy HPLC nhƣ sau:

- Cột C18 ODS-Hypersil (25 cm x 4 mm).

- Pha động: 55% methanol, 45% acid acetic (0,02 M) đƣợc điều chỉnh đến

pH 6 bằng triethylamine [17].

- Tốc độ dòng 0,4 ml/l.

- Nhiệt độ cột bằng nhiệt độ phòng.

- Detector phát hiện ở bƣớc sóng ở 254 nm.

3.3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn

Cân chính xác khối lƣợng anthraquinone và pha loãng trong methanol tuyệt

đối thành các nồng độ sau 14 ppm, 28 ppm, 42 ppm, 56 ppm, 70 ppm. Tiến hành

sắc ký để thu đƣợc các peak chuẩn ở các nồng độ trên. Xây dựng đƣờng chuẩn

tuyến tính biểu hiện sự biến thiên của nồng độ anthraquinone theo diện tích peak.

3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định

lƣợng hợp chất anthraquinone

Mục đích

- Tìm cách xử lý mẫu thích hợp cho qui trình chạy HPLC.

Bố trí nghiệm thức

- Hai mẫu đƣợc xử lý theo hai cách A và B (Sơ đồ 3.2) đƣợc đem định lƣợng

bằng HPLC.

Chỉ tiêu theo dõi

- Theo dõi khả năng tạo tín hiệu trong sắc ký đồ của 2 mẫu đƣợc xử lý theo

quy trình A và B.

Phƣơng pháp tiến hành

- Cây D. Burmanni Vahl in vitro đƣợc chia thành hai nhóm.

- Một nhóm đƣợc xử lý theo quy trình A, một nhóm xử lý theo qui trình B

trƣớc khi chạy HPLC (Sơ đồ 3.2).

Sơ đồ 3.2. Quy trình xử lý mẫu [32].

3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các

bộ phận khác nhau của cây in vitro

Mục đích

- Xác định bộ phận cho lƣợng anthraquinone nhiều nhất.

Bố trí thí nghiệm

Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong

các bộ phận khác nhau của cây in vitro

Mẫu định lƣợng Mẫu thân lá Mẫu rễ

X1 X2 Nghiê ̣m thƣ́ c

Chỉ tiêu theo dõi

- Ghi nhận sắc ký đồ và so sánh hàm lƣợng anthraquinone (% so vớ i tro ̣ng

lƣơ ̣ng khô) trong mẫu thân lá và mẫu rễ, theo công thƣ́ c: m1 Hàm lƣợng anthraquinone (%) = x 100

Với:

m1: trọng lƣợng hợp chất anthraquinone trong dung dịch mẫu đem đo (mg).

m2: trọng lƣợng khô mẫu đem đo (mg).

Phƣơng pháp tiến hành

- Cây in vitro đƣợc chia thành hai phần: phần thân lá và phần rễ.

- Cây tƣơi mỗi loại đƣợc xử lý theo quy trình thích hợp tìm đƣợc từ thí

nghiệm 6.

- Tiến hành định lƣợng bằng HPLC.

3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các

mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ

Mục đích

- Bƣớc đầu tìm hiểu mối liên hệ giữa sắc tố đỏ của cây và hàm lƣợng hợp

chất quinone.

Bố trí nghiệm thức

Bảng 3.7: Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu cây

có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ

Mẫu phân tích Mẫu có sắc tố đỏ Mẫu không có sắc tố đỏ

Y1 Y2 Nghiê ̣m thƣ́ c

Chỉ tiêu theo dõi

- Ghi nhận sắc ký đồ và so sánh diện tích peak, hàm lƣợng anthraquinone của

hai mẫu cây có và không có sắc tố đỏ.

Phƣơng pháp tiến hành

- Cây D. burmanni đƣợc chia làm 2 loại: loại có sắc tố đỏ và không có sắc tố

đỏ.

- Cây tƣơi mỗi loại đƣợc xử lý theo quy trình xử lý mẫu thích hợp tìm đƣợc

từ thí nghiệm 6.

- Tiến hành định lƣợng bằng HPLC

3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu dịch

huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4

Mục đích.

- Định lƣợng sơ bộ anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù.

Dịch huyền phù

Ly tâm

Dịch môi trƣờng

Sinh khối tế bào và mô sẹo

Lọc qua đầu lọc 0,2 m

Nghiền trong methanol tuyệt đối

3 lần

Định lƣợng bằng HPLC

Đánh sóng siêu âm 30 phút

Dịch chiết

Xác tế bào và mô sẹo

Lọc qua đầu lọc 0,2 m

Định lƣợng bằng HPLC

Cách xử lý mẫu

Sơ đồ 3.3: Quy trình xử lý dịch huyền phù.

3.4. Xử lý thống kê

Số liệu thu đƣợc từ tất cả các thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê bằng phần

mềm Stagraphic 7.0.

Chƣơng 4

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

4.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù

4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng

độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng

Tỷ lệ sống của các mẫu lớp mỏng từ cây D. burmanni trên các môi trƣờng

khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy đƣợc ghi nhận ở bảng 4.1, và biểu đồ 4.1.

Bảng 4.1: Tỷ lệ mẫu sống ở các nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy

Loại môi trƣờng Nồng độ đƣờng (g/l)

5 10 30 20

MS 16,67 11,67 10 11,67

MS 1/2 8,33 18,33 18,33 11,67

Kết quả trích từ phụ luc 2.1

Gamborg’s B5 13,33 20 13,33 36,67

Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ mẫu lớp mỏng sống trên các loại môi

trƣờng khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy.

Nhận xét

Từ kết quả ở bảng 4.1, chúng tôi tiến hành phân tích thống kê cho từng yếu

tố nhƣ sau:

Về thành phần khoáng

Thống kê bảng 4.2 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa việc sử dụng môi

trƣờng Gamborg’s B5 với 2 loại môi trƣờng MS và MS 1/2. Môi trƣờng Gamborg’s

B5 cho tỷ lệ mẫu sống trung bình cao nhất (20,83%) và thấp nhất là môi trƣờng MS,

với tỷ lệ mẫu sống trung bình là 12,5%. Kết quả này cũng phù hợp với một số

nghiên cứu trên thế giới chọn môi trƣờng Gamborg’s B5 là môi trƣờng cơ bản để

tạo mô sẹo ở một số loài Drosera [12], [23].

Bảng 4.2: Ảnh hƣởng thành phần khoáng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng

Loại môi trƣờng Nghiệm thức

MS 1, 2, 3, 4

MS 1/2 5, 6, 7, 8

Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống

nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05).

Gamborg’s B5 9,10,11, 12 Tỷ lệ mẫu sổng 12,50 a 14,17a 20,83 b

Về nồng độ đƣờng

Qua bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ đƣờng 20 g/l mẫu lớp mỏng

sống và phát triển đƣợc (20% mẫu sống) trong khi ở nồng độ đƣờng quá cao và quá

thấp mẫu mô đều chết. Một đặc điểm thƣờng gặp ở phƣơng pháp lớp mỏng tế bào là

mẫu mô khá nhạy cảm với áp suất thẩm thấu. Ghi nhận thực tế cho thấy, khi sử

dụng nồng độ đƣờng cao các mẫu mô sẽ bị chết đen và có xu hƣớng hơi co lại do

mất nƣớc.

Bên cạnh đó, kết quả bảng 4.1 và biểu đồ 4.1 cũng cho thấy tỷ lệ mẫu sống

thấp nhất ở nghiệm thức A5 (8,33%) (khi kết hợp sử dụng loại môi trƣờng MS 1/2

với nồng độ đƣờng 5 g/l); trong khi tỷ lệ mẫu sống cao nhất ở nghiệm thức A11

(36,67 %) (Môi trƣờng Gamborg’s B5 với nồng độ đƣờng 20 g/l).

Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng

Nồng đồ đƣờng Nghiệm thức

5 1, 5, 9

10 2, 6, 10

20 3, 7, 11

Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau

không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05).

30 4, 8, 12 Tỷ lệ mẫu sổng 12,78 a 16,67 b 20,00 c 13,89 ab

Nhƣ vậy khi kết hợp cả hai yếu tố ảnh hƣởng đến mẫu mô chúng tôi chọn

mỏng cây bắt ruồi là môi trƣờng đƣợc môi trƣờng tốt nhất cho mẫu cấy lớ p

Gamborg’s B5 với nồng độ đƣờng 20 g/l.

4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc

kích ứng tạo mô sẹo

Sau 2 tuần nuôi cấy, kết quả sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cây D.

burmanni vahl trên môi trƣờng có nồng độ đƣờng và thành phần khoáng chọn từ thí

nghiệm 1, bổ sung các loại hormone khác nhau đƣợc ghi nhận và trình bày trong

bảng 4.4.

Bảng 4.4: Tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trƣờng có kết hợp 2 loại hormone khác nhau

Các loại hormone NAA (0,2) NAA (0,5) NAA (1)

kết hợp (mg/l) 2,4-D (0,1) IBA (1) BA (0,2)

Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về

mặt thống kê (p < 0,05).

Tỷ lệ mẫu tạo sẹo 25,17 c 2,93 b 0 a

Nhận xét

Kết quả từ bảng 4.4 cho thấy có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê

giữa các nghiệm thức sử dụng hormone NAA/2,4-D; NAA/IBA; NAA/BA. Trong

đó sự kết hợp 2 loại NAA/BA cho kết quả thấp nhất (không có sự tạo thành mô sẹo

mà chỉ có sự hình thành chồi trực tiếp từ các mẫu thân) và sự kết hợp 2 loại

hormone NAA/2,4-D cho kết quả tạo mô sẹo tốt nhất (25,56%).

Sự kết hợp cùng lúc 2 loại auxin để tạo mô sẹo ở một số loài Drosera đã

đƣợc ghi nhận trong một số nghiên cứu cả trong và ngoài nƣớc [12], [23], [28].

Thông thƣờng mô sẹo đƣợc tạo thành khi có sự tác động đồng thời của cả 2 loại

hormone auxin và cytokinin, trong đó hàm lƣợng auxin nhiều hơn. Tuy nhiên ở một

số đối tƣợng, lƣợng auxin nội sinh thấp, mẫu mô cần lƣợng lớn hơn auxin để cảm

ứng hình thành mô sẹo.

Tổng hợp các ghi nhận và phân tích, chúng tôi chọn sự kết hợp 2 loại

hormone NAA/2,4-D cho việc cảm ứng hình thành mô sẹo từ lớp mỏng các bộ phân

cây D. burmanni Vahl.

4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp với

NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo

Bảng 4.5: Tỷ lệ mẫu tạo sẹo trên các môi trƣờng khác nhau sau 21 ngày nuôi cấy

Nồng độ Tỷ lệ Loại vật Nghiệm 2,4-D mẫu tạo Hình thái mô sẹo liệu đầu thức (mg/l) sẹo

Mô sẹo hơi phình, đặc. C1 0 5,53 (Hình 4.1A)

Mô sẹo xốp, đỏ, ít. C2 0,1 22,23 (Hình 4.1B) Phát

Mô sẹo xố p, vàng xanh, phình hoa C3 0,2 52,77 to (Hình 4.1C).

C4 0,3 36,10 Mô sẹo xốp, vàng xanh.

C5 0,4 19,47 Mô sẹo hơi chai.

C6 0,5 22,23 Mô sẹo chai cứng (Hình 4.1D).

C1’ 0 0 Mẫu cấy hóa nâu. Thân Mô sẹo vàng xanh, phần mẫu C2’ 0,1 38,90 cảm ứng ít (Hình 4.2A).

Mô sẹo xố p , vàng trắ ng có ít

C3’ 0,2 72,23 đốm đỏ, phình to (Hình 4.2 B,

E).

Mô sẹo xốp, vàng xanh vài mẫu C4’ 0,3 55,53 có đốm đỏ

Mô sẹo vàng trắng, có đốm đỏ C5’ 0,4 50 hơi đặc . (Hình 4.2C).

Mô sẹo vàng xanh, hơi chai cứng C6’ 0,5 22,23 (Hình 4.2D).

C1” 0 8,30 Mô sẹo đỏ, phần mẫu cảm ƣ́ ng ít (Hình 4.1E)

Mô sẹo xốp, màu vàng xanh C2” 0,1 16,70 nhƣng ít.

Mô sẹo xố p, màu vàng xanh, C3” 0,2 27,77 phình to (Hình 4.1F). Lá Mô sẹo đă ̣c, màu vàng xanh xen C4” 0,3 22,23 đốm đỏ (Hình 4.1G)

Mô sẹo vàng xanh có đốm đỏ , C5” 0,4 13,90 hơi chai cứng.

Kết quả được trích từ phụ lục 2.3

Mô sẹo đỏ, chai cứng. C6” 0,5 13,90 (Hình 4.1H)

Nhận xét

Kết quả bảng 4.5 cho thấy, đối với cả 3 loại vật liệu đầu tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo

đều thấp nhất ở nghiệm thức có môi trƣờng chỉ bổ sung NAA (0,2 mg/l). Trong khi

ở nghiệm thức bổ sung NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l) tỷ lệ tạo sẹo lớn nhất ở cả

3 loại mẫu: 52,77% ở mẫu phát hoa TCL, 72,23% ở mẫu thân TCL, 27,77% ở mẫu

lá TCL.

Các auxin đƣợc biết đến là có khả năng kích thích mạnh sự phân chia tế bào,

nên chúng thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ loại hormone sơ cấp để sản xuất mô sẹo. Các

auxin thông dụng hiện nay bao gồm IAA, IBA, NAA, 2,4-D có mức độ ảnh hƣởng

tăng dần, trong đó 2,4-D là chất sử sụng hiệu quả nhất trong trong việc hình thành

mô sẹo [16]. Các kết quả thực nghiệm cũng cho thấy 2,4-D thƣờng cảm ứng tạo mô

sẹo xốp hơn là NAA. Điều này có lẽ là do 2,4-D cảm ứng sự phân chia tế bào mạnh,

các tế bào phân chia liên tục trong thời gian ngắn không kịp để tổng hợp vật chất

nên nó thƣờng lỏng lẻo. Vì mục đích thí nghiệm là tạo mô sẹo để nuôi dịch huyền

phù về sau (cần mô sẹo xốp) và do không đủ thời gian để dò nồng độ của cả hai loại

hormone, chúng tôi chọn 2,4-D là loại hormone chính để tạo mô sẹo.

Bên cạnh đó bảng kết quả 4.5 cũng cho thấy, các mẫu lớ p mỏng từ lóng thân

cho tỷ lệ tạo sẹo lớn nhất trong khi các mẫu lá thấp nhất. Kết quả này có lẽ là do đặc

điểm hình thái của cây D. burmanni Vahl: bề mặt lá của chúng mang nhiều tua cuốn

khiến chúng khó tiếp xúc với môi trƣờng; các tua cuốn này lại chứa chất nhầy và

nhiều loại enzyme thƣờng gây ảnh hƣởng không tốt đến các mẫu mô.

Với những nhận xét trên, chúng tôi chọn nồng độ kết hợp tối ƣu cho việc tạo

mô sẹo là NAA 0,2 mg/l và 2,4-D 0,2 mg/l cho mọi loại vật liệu đầu từ lớp mỏng

cây D. burmanni Vahl.

Hình 4.1: Mô sẹo đƣợc hình thành từ mẫu lớp mỏng cây D. burmanni Vahl trên môi trƣờng Gamborg’s B5, bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng độ thay đổi:

Hình 4.2: Mô sẹo đƣợc hình thành từ mẫu lớp mỏng lóng thân cây D. burmanni Vahl trên môi trƣờng Gamborg’s B5, bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng độ thay đổi:

A: 0,1 mg/l B: 0,2 mg/l C: 0,4 mg/l D: 0,5 mg/l E: 0,2 mg/l (quan sát dƣới KHV 10 X)

4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng

sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù

Bảng 4.6: Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg mô sẹo ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy

trên các kiểu nuôi cấy khác nhau

Kiểu nuôi cấy Rắn Bán rắn Lỏng tĩnh Lỏng lắc

Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau không có sự

khác biệt về mặt thống kê (p > 0.05)

Độ tăng khối lƣợng 2,01 a 2,35 b 1,97 a 2,91 c mô sẹo (mg)

Biểu đồ 4.2: Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21

ngày nuôi cấy.

Nhận xét

Bảng 4.6 và biểu đồ 4.2 cho thấy có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống

kê ở độ tăng khối lƣợng mô sẹo trên 4 kiểu nuôi cấy khác nhau. Độ tăng khối lƣợng

mô sẹo ở kiểu nuôi cấy lỏng lắc là tốt nhất 291% khối lƣợng ban đầu, kế đến là

kiểu nuôi cấy bán rắn 235%, môi trƣờng rắn 201%, cuối cùng là môi trƣờng lỏng

tĩnh 197%.

Nhƣ vậy, ở các môi trƣờng dạng lỏng mô sẹo dễ hấp thụ chất dinh dƣỡng

hơn môi trƣờng dạng rắn. Tuy nhiên môi trƣờng ở dạng lỏng tĩnh do các mẫu mô

sẹo hoàn toàn ngập trong dịch môi trƣờng, thiếu oxi nên sau một thời gian chúng

ngừng tăng trƣởng và có dấu hiệu bị hóa đen. Trái lại, ở kiểu nuôi cấy lỏng lắc, mô

sẹo vừa hấp thu chất dinh dƣỡng dễ dàng vừa có sự trao đổi khí tốt hơn nên trọng

lƣợng mô sẹo tăng lớn nhất.

Bên cạnh đó, nhận thấy rằng khi mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng

lỏng mà có thêm chuyển động lắc liên tục, các mô sẹo xốp sẽ bị tách rời, tạo các

cụm tế bào và tế bào đơn trong dịch nuôi cấy. Đây chính là dạng khởi đầu của dịch

huyền phù tế bào (Hình 4.3). Tuy nhiên do giới hạn về thời gian thực hiện chúng tôi

chƣa nghiên cứu đƣợc những yếu tố khác để tối ƣu hóa dịch huyền phù này mà mới

chỉ ở bƣớc đầu tạo đƣợc dịch huyền phù.

Tóm lại qua thí nghiệm trên chúng tôi chọn kiểu nuôi cấy lỏng lắc là kiểu

nuôi cấy tốt nhất để tăng sinh khối mô sẹo cũng nhƣ tạo dịch huyền phù tế bào.

A

B

C

Hình 4.3. A: Mô sẹo nuôi trong môi trƣờng lỏng lắc. .

B: Cụm tế bào quan sát dƣới kính hiển vi 40X.

C: Tế bào đơn quan sát dƣới kính hiển vi 40X.

4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành

sắ c tố đỏ của mô sẹo

Bảng 4.7: Kết quả ảnh hƣởng ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo

Điều kiện nuôi cấy Chiếu sáng 16h/ngày Ủ tối hoàn toàn

Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về

mặt thống kê (p < 0.05).

Tỷ lệ mẫu mô sẹo có sắc tố đỏ 100 a 0 b

Nhận xét

Kết quả ở bảng 4.7 và hình 4.4 cho thấy 100% các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi

trong điều kiện chiếu sáng đều có sắc tố đỏ trong khi nuôi hoàn toàn trong tối thì

không thấy có sự hình thành sắc tố đỏ.

Kết quả này bƣớc đầu cho thấy mối liên hệ giữa ánh sáng với sắc tố đỏ ở cây

bắt ruồi và giải thích đƣợc một phần lý do ngoài tự nhiên cây D. burmanni thƣờng

có màu đỏ hơn so với cây nuôi cấy mô.

Các loại sắc tố ở thực vật ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh

vực nhƣ công nghiệp nhuộm, màu thực phẩm và cả dƣợc phẩm. Do vậy, việc tìm ra

điều kiện hình thành sắc tố đỏ trên mô sẹo cây bắt ruồi sẽ là tiền đề cho những

nghiên cứu sau trong việc điều khiển sắc tố đỏ ở cây bắt ruồi với nhiều ứng dụng

hữu ích.

B B

A

B

C

D

E

F

Hình 4.4: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ

của mô sẹo cây D. burmanni.

A, C, E: Mô sẹo đƣợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày.

B, D, F: Mô sẹo nuôi trong điều kiện ủ tối hoàn toàn.

Cây D. burmanni 4.2. Ly trích và cô lâ ̣p hơ ̣p chấ t anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl in vitro

-Sấy ở 500C, xay thành bột mịn -Ngầm dầm trong ethanol -Cô quay

Cao thô ethanol

Sắc ký cột khô vớ i dung môi benzene

Phân đoa ̣n cao benzene

Thuốc thử Borntraeger

Sắc ký cột ƣớt Hệ dung môi ether dầu hỏa:chloroform (95:5)

Định tính anthraquinone trong các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng

Sắc ký điều chế nhiều lần vớ i hệ dung môi benzene:chloroform (3:7)

Hợp chất anthraquinone

Sơ đồ 4.1: Quy trình ly trích và cô lập hợp chất anthraquinone.

Hợp chất anthraquinone sau khi đƣợc cô lập từ sơ đồ 4.1, sẽ đƣợc sử dụng

nhƣ chất tham chiếu cho các thí nghiệm định lƣợng bằng HPLC về sau, với độ tinh

khiết ƣớc tính đạt khoảng 70%.

4.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro

khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC

4.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn

Bảng 4.8: Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak

Nồng độ chất tham chiếu Diện tích peak

(ppm) (mAU*S)

14 67,75

28 140,87

42 218,84

56 294,46

70 361,14

Kết quả được trích từ phụ lục 3

Đồ thị 4.1: Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone

tham chiếu và giá trị diện tích peak.

Hình 4.5: Sắc ký đồ HPLC của Hình 4.6: Sắc ký đồ HPLC của

anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm

.ppm ppm

Hình 4.8: Sắc ký đồ HPLC của Hình 4.7: Sắc ký đồ HPLC của

anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm

pm pm

Hình 4.9: Sắc ký đồ HPLC của

anthraquinone tham chiếu ở 70 ppm.

Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng có hệ số tƣơng quan giữa nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak là R2 ~ 1. Đây là một giá trị đáng tin cậy để khẳng định rằng

nồng độ anthraquinone trong một mẫu chất có mối quan hệ tuyến tính với giá trị

diện tích peak trong điều kiện chạy HPLC nhất định. Mối quan hệ này đƣợc thể

hiện bằng phƣơng trình y = 5,2884x – 5,5029. Do đó đƣờng chuẩn này đƣợc sử

dụng để tính hàm lƣợng anthraquinone trong các mẫu cần phân tích ở các thí

nghiệm sau.

4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣơ ̣ng

hợp chất anthraquinone

anthraquinone

Hình 4.10: Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình A.

Hình 4.11: Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình B.

Qua ghi nhận sắc ký đồ (Hình 4.10, 4.11) của hai mẫu cây đƣợc x ử lý theo 2

cách A, B (Sơ đồ 3.2) chúng tôi rút ra các nhận xét sau:

Các mẫu cây qua giai đoạn sấy khô trƣớc khi xử lý mẫu sẽ cho các tín hiệu

kết quả HPLC rõ ràng hơn các mẫu cây tƣơi: ở các mẫu cây tƣơi có xuất hiện tƣợng

peak đôi trong khi các mẫu khô thì không. Nguyên nhân của hiện tƣợng này là do

các chất nhớt trong mẫu tƣơi tạo độ nhớt cao cho dung dịch sắc ký. Độ nhớt này ảnh

hƣởng đến tốc độ ly giải của cột cũng nhƣ độ hấp thu của mẫu phân tích. Ở các mẫu

khô giai đoạn sấy đã làm mất đi phần lớn chất nhớt trong cây nên kết quả ghi nhận

cải thiện đáng kể.

Do giới hạn đề tài chƣa đủ thời gian để tối ƣu hơn nữa quy trình xử lý mẫu

nhằm loại bớt các chất không quan tâm trong mẫu định lƣợng, kết quả sắc ký đồ

còn lẫn nhiều tạp chất. Tuy nhiên, quy trình xử lý mẫu B sẽ làm tiền đề để có thể

nghiên cứu hơn nữa cách loại tạp sau này.

4.3.3. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ

phận khác nhau của cây in vitro

Bảng 4.9: Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau

của cây in vitro

Mẫu phân tích Mẫu thân lá Mẫu rễ

Trọng lƣợng khô (mg) 300 300

Thể tích dung dịch phân tích (ml) 60 70

Y= giá trị diện tích peak (mAU*S) 728,70 682,27

X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 138,83 130,05

Hàm lƣợng anthraquinone (% so với trọng lƣợng khô) 2,78 3,03

anthraquinone

Hình 4.12: Sắc ký đồ HPLC của mẫu rễ cây D. burmanni Vahl.

Hình 4.13: Sắc ký đồ HPLC của mẫu thân lá cây D. burmanni Vahl.

4.9 và sắc ký đồ hì nh 4.12, 4.13 cho thấy hơ ̣p chất Kết quả ở bảng

D. burmanni vớ i hàm anthraquinone hiê ̣n diê ̣n trong tất cả các bô ̣ phâ ̣n củ a cây lƣợng tƣơng ứng là 2,78% (so vớ i tro ̣ng lƣơ ̣ng khô ) ở mẫu thân lá và 3,03% ở mẫu rễ. So sánh vớ i nhƣ̃ng công bố trƣớ c đây về hàm lƣơ ̣ng các hơ ̣p chất quinone ở mô ̣t

số loài Drosera thì hàm lƣợng này khá cao : theo Repcák và Galambosi (1994) [27],

hàm lƣợng 7-methyljuglone trong cây D. rotundifolia là 2,7% trọng lƣợng khô và

trong cây D. anglica là 2,1%; Krenn (1995) [21] cũng cho biết hàm lƣợng

plumbagin trong 2 mẫu D. peltata là 0,569% và 0,305% so với trọng lƣợng khô;

hàm lƣợng plumbagin trong 11 mẫu D. madagascariensis dao động trong khoảng

0,002 - 0,01% so với trọng lƣợng cây khô.

viê ̣c nuôi cấy in vitro Tóm lạ i, kết quả này cho thấy tiềm năng rất cao củ a

cây D. burmanni Vahl trong thu nhâ ̣n hơ ̣p chất quinone.

Bên ca ̣nh đó , bảng 4.9 cũng cho thấy hàm lƣợng anthraquinone trong rễ lớn

, đã đƣơ ̣c áp du ̣ng khá thành công trên thế

hơn trong thân lá . Kết quả này đã mở ra mô ̣t hƣớ ng nghiên cƣ́ u có nhiều tiềm năng trong thu nhâ ̣n hơ ̣p chất thƣ́ cấp : nuôi cấy rễ . Kỹ thuật nuôi cấy rễ t hƣ̣c vâ ̣t, nhằm thu nhâ ̣n các hơ ̣p chất có nhiều trong rễ giớ i, chẳng ha ̣n nhƣ năm 2001, Verma và ctv đã sƣ̉ du ̣ng Agrobacterium rhizogenes để kích thích tạo rễ khi nuôi cấy Plumbago zeylanica giúp thu đƣợc hàm lƣợng

plumbagin cao gấp 2,5 lần so vớ i khi nuôi cấy ở điều kiê ̣n bình thƣờ ng [30].

4.3.4. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các

mẫu có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ

Bảng 4.10: Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các mẫu có và không

có sắc tố đỏ

Mẫu phân tích Mẫu có sắc tố Mẫu không có

đỏ sắc tố đỏ

Trọng lƣợng khô (mg) 300 300

Thể tích dung dịch phân tích (ml) 60 60

Y= giá trị diện tích peak (mAU*S) 201,13 734,68

X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 39,07 139,96

Hàm lƣợng anthraquinone (% so với trọng lƣợng 0,78 2,80

khô)

anthraquinone

Hình 4.14: Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl có sắc tố đỏ.

Hình 4.15: Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl không có sắc tố đỏ.

Bảng 4.10 và hình 4.14, 4.15 cho thấy, hàm lƣợng anthraquinone trong các

mẫu cây có sắc tố đỏ chỉ chiếm 0,78% so vớ i trọng lƣợng khô, trong khi ở cây

không có sắc tố đỏ là 2,8%. Kết quả này cũng trùng hợp với công bố của Repcák và

Galambosi (1994) trên cây D. rotundifolia và D. anglica: ở những cá thể có nhiều sắc tố đỏ hàm lƣợng các quinone sẽ rất thấp [29]. Do vâ ̣y nếu đƣơ ̣c nghiên cƣ́ u tiếp

về mu ̣c tiêu thu nhâ ̣n hơ ̣p chất anthraquinone , chúng ta nên tiến hành khảo sát điều

khiển viê ̣c ƣ́ c chế ta ̣o sắc tố đỏ trong cây.

4.3.5. Thí nghiệm 9: Xác định hàm lƣợng anthraquinnone trong mẫu dịch

huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4

Bảng 4.11: Kết quả đi ̣nh lƣơ ̣ng anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù

Dịch môi trƣờng Sinh khối tế bào Mẫu phân tích

Trọng lƣợng tƣơi (mg) 22.000 600

Thể tích dung dịch phân tích (ml) 20 20

Y= giá trị diện tích peak (mAU*S) 0 21,70

X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 0 5,14

Hàm lƣợng anthraquinone (% so với trọng 0 0,02

lƣợng tƣơi)

anthraquinone

Hình 4.16: Sắc ký đồ HPLC của mẫu dịch môi trƣờng sau khi lọc sinh khối tế bào.

Hình 4.17: Sắc ký đồ HPLC của sinh khối tế bào từ dịch huyền phù.

Ghi nhận từ bảng 4.11, hình 4.16, 4.17 cho thấy không có sự hiện diện của

anthraquinone trong dịch môi trƣờng mà chỉ có trong sinh khối tế bào, điều này

chứng tỏ anthraquinone có lẽ là một hợp chất thứ cấp nội bào.

So sánh với một số nghiên cứu trên thế giới về sản xuất các hợp chất quinone

bằng nuôi cấy huyền phù tế bào, thì kết quả này khá thấp (chỉ chiếm 0,02% so vớ i

trọng lƣợng tƣơi) trong khi ở nuôi cấy huyền phù cây D. muscipula sự sản xuất

plumbagin đạt 2,59%, và ở cây D. capensis sự sản xuất 7-methyljuglone cũng đạt

0,33% [23]. Tuy nhiên , kết quả này là do chú ng ta chƣa áp du ̣ng các điều kiê ̣n tối ƣu trong nuôi cấy huyền phù nhƣ : ánh sáng, nhiê ̣t đô ̣, tốc đô ̣ lắc, chƣa điều khiển ƣ́ c chế hình thành sắc tố đỏ ,…

Chƣơng 5 KẾ T LUẬN - ĐỀ NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù

Môi trƣờng cơ bản thích hợp nhất để tạo mô sẹo từ mẫu cắt lớ p mỏng là môi

trƣờng khoáng Gamborg’s B5 và nồng độ đƣờng là 20 g/l.

Sự kết hợp hai loại hormone NAA và 2,4-D sẽ thích hợp nhất để cảm ứng tạo

mô sẹo. Với nồng độ kết hợp tối ƣu là NAA (0,2 mg/l )/2,4-D (0,2 mg/l).

Các mô sẹo xốp khi đƣợc nuôi trong môi trƣờng ở dạng lỏng kết hợp chuyển

động lắc liên tục (lỏng lắc) sẽ tạo dịch huyền phù tế bào, đồng thời là kiểu nuôi cấy

làm tăng sinh khối mô sẹo nhanh nhất.

Khi nuôi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, các mô sẹo đều hóa đỏ.

5.1.2. Định lƣợng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC

Mẫu định lƣợng cho kết quả HPLC với các tín hiệu tốt hơn nếu đƣợc sấy khô

khi xử lý.

Hàm lƣợng anthraquinone trong rễ là 3,03%, lớn hơn trong thân lá: 2,78 %

so vớ i tro ̣ng lƣơ ̣ng khô.

Hàm lƣợng anthraquinone trong cây có sắc tố đỏ (0,78% so vớ i tro ̣ng lƣơ ̣ng

khô) ít hơn trong cây không có sắc tố đỏ (2,8%)

Lƣợng anthraquinone đƣợc tạo ra bằng nuôi cấy dịch huyền phù chiếm 0,02

% so vớ i trọng lƣợng khô và tập trung trong sinh khối tế bào, không tiết hoặc tiết rất

ít ra môi trƣờng bên ngoài

5.2. ĐỀ NGHỊ

Khảo sát thêm các điều kiện điều khiển việc tạo sắc tố đỏ trong nuôi cấy D.

burmanni Vahl.

Cảm ứng tạo rễ D. burmanni Vahl nhằm nghiên cƣ́ u ta ̣o nguồn nguyên liê ̣u

có hàm lƣợng hợp chất anthraquinone cao.

Tối ƣu hóa các điều kiê ̣n nuôi cấy dịch huyền phù tế bào để thu nhận lƣợng

lớn hơn anthraquinone bao gồm các yếu tố: hormone, ánh sáng, tốc độ lắc…

Nghiên cƣ́ u tƣ̣ đô ̣ng hóa nuôi cấy sinh khối tế bào D. burmanni Vahl trong

các bình nuôi cấy điểu khiển tự động nhƣ bioreactor .

Thử nghiệm các phƣơng pháp tăng sinh hơ ̣p chất anthraquinone trong nuôi

cấy di ̣ch huyền phù , tế bào đơn nhƣ:

- Chọn lọc dòng tế bào cho năng suất cao.

- Bổ sung tiền chất.

- Sƣ̉ du ̣ng các nhân tố cảm ƣ́ ng (elicitor).

- Gây đô ̣t biến,…

Tìm các điều kiện để tối ƣu quy trình định lƣợng anthraquinone bằng kỹ

thuật HPLC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt:

1. Đỗ Đăng Giá p , 2003. Khảo sát, sưu tập, thuần dưỡng và thử nghiệm in vitro trên những loài cây bắt mồi ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu. Khóa luận cử nhân khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đa ̣i ho ̣c Quố c gia TP. Hồ Chí Minh.

2. Đỗ Tất Lợi, 1999. Cây thuố c và vi ̣ thuố c Viê ̣t Nam . Nhà xuất bản Y học , TP.

Hồ Chí Minh.

3. Hồ Thu ̣y Bích Tuyền , 2006. Ly trích và khả o sá t hoạt tính sinh học củ a hợp chấ t quinone từ cây Drosera burmanni Vahl nuôi cấ y in vi tro. Khóa luận cử nhân khoa ho ̣c . Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tƣ ̣ nhiên , ĐH Quố c gia TP. Hồ Chí Minh.

4. Lê Trần Đƣ́ c. Cây thuố c Viê ̣t Nam – trồng, hái, chế biến, trị bệnh đau đầu.

5. Nguyễn Đa ̣i Hả i , 2006. Nuôi cấ y mô cây bắ t ruồi (Drosera burmanni Vahl ), khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất chiết thô Plumbagin . Luâ ̣n văn tố t nghiê ̣p kỹ sƣ công nghê ̣ sinh ho ̣c, ĐH Nông Lâm, TP. HCM.

6. Nguyễn Đƣ́ c Lƣơ ̣ng , 1998. Công nghê ̣ sinh học , Đa ̣i ho ̣c Kỹ thuâ ̣t , TP. Hồ Chí Minh.

7. Nguyễn Đƣ́ c Lƣơ ̣ng , Lê Thi ̣ Thủ y Tiên , 2002. Công nghê ̣ tế bào . Nhà xuất bản Đại học Quố c gia, TP. Hồ Chí Minh. 376 trang.

8. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2001. Các phương pháp nhận danh, trích ly và cô lập các hợp chất hữu cơ. Giáo trình cao học chuyên ngành Hóa hữu cơ , Đa ̣i học Khoa học Tự nhiên, TP. HCM.

9. Nguyễn Thanh Bảo, 2003. Vi khuẩn học, Bộ Y tế , ĐH Y-Dƣợc TP. Hồ Chí Minh, tr. 40-93.

10. Phạm Hoàng Hộ, 1993. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Giáo dục , TP. Hồ Chí Minh.

11. Phạm Hoàng Hộ, 1994. Cây có vị thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Y học ,

TP. Hồ Chí Minh.

12. Quách Ngô Diễm Phƣơng , 2006. Khảo sát hợp chất naphthoquinone có hoạt . nuôi cấ y in tính sinh học được tách chiết từ cây bắt ruồi Drosera indica L vitro. Luâ ̣n văn tha ̣c sỹ khoa ho ̣c. Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tƣ ̣ nhiên, Đa ̣i ho ̣c Quố c gia TP. Hồ Chí Minh.

13. Trần Thi ̣ Bích Chiêu, 2004. Khảo sát vòng đời và tái tạo chồi từ phát hoa cây bắ t ruồi in vitro (Drosera burmanni Vahl). Khóa luận cử nhân khoa học . Đa ̣i học Khoa học Tự nhiên, TP. Hồ Chí Minh.

14. Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến, 1978. Phân loại thực vật bậc cao, Nhà xuất bản Giáo dục, TP. HCM, tr. 342-346.

15. Võ Văn Chi, Trần Hợp, 1999. Cây cỏ có ích ở Việt Nam. Nhà xuất bản Giá o

dục, TP. Hồ Chí Minh, tr. 342-346.

16. Vũ Văn Vụ, 1999. Sinh lý thực vật ứ ng dụng. Nhà xuất bản Giáo dục. Tài liệu tiếng Anh:

17. Crouch I. J., Finnie J. F., van Staden J., 1990. Studies on the isolation of

plumbagin from in vivo and in vitro grown Drosera species. Plant Cell Tiss Org Cult 21: 78-82.

18. Dicosmo F., Misawa M., 1985. Elicitation secondary metabolismin plant cell cultures.Trends Biotechnol 3: 318-322.

19. Dipanjan G., 2003, Project Lifescape – 11: Hunter Plants. Resonance: 64 – 70.

20. George E. F., 1993. Plant propagation on by tissue culture, Biotechnology exegietics Ltd: 14-25.

21. Harborne J. B., 1967. Comparative biochemistry of flavonoid-IV.

Phytochemistry 6: 1415-1428.

22. Hazra B., Sarma D. M., Sanyal U., 2004. Seperation methods of quinonoid

constituents of plants used in Oriental traditional medicines. Journal of Chromatography B 812: 259-275.

23. Hook L. I. Ingrid, 2001. Naphthoquinone contents of in vitro cultured

plants and cell suspensions of Dionaea muscipula and Drosera species. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 67 (3): 281-285.

24. Jayaram K., Prasad M. N. V., 2005. Rapidly in vitro multipled Drosera as

reliable source for plumbagin bioprospection. Current science 89: 447-448.

25. Kawiak A., Krolicka A., LoJkowska E., 2003. Direct regeneration of Drosera from leaf explants and shoot tips. Plant cell, Tissue and Organ Culture 75: 211-214.

26. Ketchum R. E. B., Gibson D. M., Croteau R. B., Shuler M. L., 1999. The kinetics of taxoid accumulation in cell suspension cultures of Taxus following elicitation with methyljasmonate. Biotechnology Bioeng 62: 97- 105.

27. Kitanov G. M., Pashankov P. P., 1994. Quantitative investigation on the dynamics of plumbagin in Plumbago europea L. roots and herb by HPLC. Pharmazie 49 (6): 462.

28. Nahálka J ., Blanárik P ., Geimeiner P ., Matúsová E ., Partlová I ., 1996. Production of plumbagin by cell suspension cultures of Drosophyllum lusitanium Link. Journal of Biotechnology 49: 153-161.

29. Samaj J., Blehová A., Repcák M., Ovecka M., and Bobák M., 1999.

Drosera Species (Sundew): In vitro culture and the production of plumbagin and other secondary metabolites. Biotechnology in Agriculture and Forestry 43: 105-135.

in Plumbago

30. Verma P.C., Singh D., Rahman L.u., Gupta M.M., Banerjee S., 2002. In vitro-studies zeylanica: rapid micropropagation and establishment of higher plumbagin yielding hairy root cultures. Journal of Plant Physiology 159: 547-552.

31. Verpoorte R., Van der Heijden R., Hoge J. H. C., and Hoopen H. J. G., 1994. Plant cell biotechnology for production of secondary metabolites. Pure & Appl. Chem 66: 2307-2310.

and High-Performance Electrophoresis 32. Wu-Che Weng and Shuenn-Jyi Sheu, 1999. Separation of Anthraquinones Liquid by Capillary Chromatography. Journal of High Resolution chromatography 23: 134-148.

Tài liệu từ internet:

33. http://www.carnivorousplants.org/ICPS Seed Bank.html.

34. http://sea.unep-wcmc.org/isdp/Taxonomy/tax-species-

result.cfm?Genus=Drosera&Species=burmanni&source=plants&tabname= all~main

35. http://dionee.gr.free.fr/bulletin/txt/d_45_d.htm&h=414&w=621&sz=71&tb nid=6A16urs1FQA_hM:&tbnh=89&tbnw=134&hl=vi&start=10&prev=/im ages%3Fq%3DDrosera%Burmanni%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%261r %3D%26sa%3DG

36. http://www.efloras.org./florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=210000486

37. http://www.answers.com/main/ntquery?method=4&dsid=2222&dekey=Sun

dew&gwp=8&curtab=2222_1&linktext=Drosera

38. http://www.thegardenhelper.com/sundew.htm

39. http://www.rdrop.com/contents/descriptions.htm.

40. http://florabase.calm.wa.gov.au/science/timage/3093ic1.jpg&imgrefurl=http ://florabase.calm.wa.gov.au/browse/flora%3Ff%3D143%26level%3Ds%26i d%3D3093&h=384&w=512&sz=36&hl=vi&start=2&um=1&tbnid=N4xmzI

41. http://www.ctu.edu.vn/coursewares/supham/phanloaitv/ch5(3).htm

42. http://www.plantarara.com/carnivoren_galerie/drosera/drosera.htm

43. http://www.uky.edu/~dhild/biochem/26/lect26.html

44. http://www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/shaker.gif

45. http://www.cf.gu.se/digitalAssets/736125_Bioreactor.jpg

46. http://www.waters.com/WatersDivision/ContentD.asp?watersit=JDRS- 5LTGBH

47. http://www.uni- regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/

Keusch/D-CC-e.htm

48. http://www.utricularia.de/bilder/drosera/burmanni_DROS63_004.html

PHỤ LỤC

Phụ lục 1

Thành phần môi trƣờng nuôi cấy thƣ̣c vâ ̣t Đơn vị: mg/l

Thành phần Gamborg’s B5 (1968)

134 2.500 150 250 130,5 27,8 37,26 10 2,0 3,0 0,75 0,25 0,025 0,025 100 1,0 1,0 10 MS (Murashige and Skoog, 1962) 1.650 1.900 440 370 170 27,8 37,26 22,3 8,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025 100 0,5 0,5 0,1 2,0

ĐA LƢỢNG NH4NO3 (NH4 )2 SO4 KNO3 CaCl2.2H2 O MgSO4.7H2 O KH2PO4 NaH2PO4.H2O VI LƢỢNG FeSO4.7 H2O NaEDTA MnSO4. 4H2O MnSO.H2O . ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4 .2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O VITAMINS Myo-inositol Nicotinic acid Pyridoxine.HCl Thiamine.HCl Glycine Phụ lục 2 Phụ lục 2.1: Thí nghiệm 1 Analysis of Variance for ASTTTHU.KETQUA - Type III Sums of Squares

-------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:ASTTTHU.LOAIMOITRU 466.66667 2 233.33333 25.846 .0000 B:ASTTTHU.NONGDODUON 280.55556 3 93.51852 10.359 .0001 INTERACTIONS AB 1111.1111 6 185.18519 20.513 .0000 RESIDUAL 216.66667 24 9.0277778 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 2075.0000 35 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for ASTTTHU.KETQUA -------------------------------------------------------------------------------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean -------------------------------------------------------------------------------- GRAND MEAN 36 15.833333 .5007710 14.799547 16.867120 A:ASTTTHU.LOAIMOITRU 1 12 12.500000 .8673608 10.709429 14.290571 2 12 14.166667 .8673608 12.376095 15.957238 3 12 20.833333 .8673608 19.042762 22.623905 B:ASTTTHU.NONGDODUON 1 9 12.777778 1.0015420 10.710204 14.845351 2 9 16.666667 1.0015420 14.599093 18.734240 3 9 20.000000 1.0015420 17.932426 22.067574 4 9 13.888889 1.0015420 11.821315 15.956463 AB 1 1 3 16.666667 1.7347217 13.085524 20.247809 1 2 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809 1 3 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809 1 4 3 10.000000 1.7347217 6.418857 13.581143 2 1 3 8.333333 1.7347217 4.752191 11.914476 2 2 3 18.333333 1.7347217 14.752191 21.914476 2 3 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809 2 4 3 18.333333 1.7347217 14.752191 21.914476 3 1 3 13.333333 1.7347217 9.752191 16.914476 3 2 3 20.000000 1.7347217 16.418857 23.581143 3 3 3 36.666667 1.7347217 33.085524 40.247809 3 4 3 13.333333 1.7347217 9.752191 16.914476 -------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for ASTTTHU.KETQUA by ASTTTHU.NONGDODUON -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 9 12.777778 X 4 9 13.888889 XX 2 9 16.666667 X 3 9 20.000000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -3.88889 2.92399 * 1 - 3 -7.22222 2.92399 * 1 - 4 -1.11111 2.92399 2 - 3 -3.33333 2.92399 * 2 - 4 2.77778 2.92399 3 - 4 6.11111 2.92399 * --------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference.

Multiple range analysis for ASTTTHU.KETQUA by ASTTTHU.LOAIMOITRU -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 12 12.500000 X 2 12 14.166667 X 3 12 20.833333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -1.66667 2.53225 1 - 3 -8.33333 2.53225 * 2 - 3 -6.66667 2.53225 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 2.2: thí nghiệm 2

One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: LOAIHOR.KETQUA Level codes: LOAIHOR.LOAIHORMON Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1136.2867 2 568.14333 504.767 .0000 Within groups 6.7533 6 1.12556 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 1143.0400 8 0 missing value(s) have been excluded.

Table of means for LOAIHOR.KETQUA by LOAIHOR.LOAIHORMON -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 25.166667 .7666667 .6125236 24.106540 26.226793 2 3 2.933333 .7333333 .6125236 1.873207 3.993460 3 3 .000000 .0000000 .6125236 -1.060127 1.060127 -------------------------------------------------------------------------------- Total 9 9.366667 .3536407 .3536407 8.754602 9.978731 Multiple range analysis for LOAIHOR.KETQUA by LOAIHOR.LOAIHORMON -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 3 .000000 X 2 3 2.933333 X 1 3 25.166667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 22.2333 2.12025 * 1 - 3 25.1667 2.12025 * 2 - 3 2.93333 2.12025 * -------------------------------------------------------------------------------- Mục lục 2.3: Thí nghiệm 3 One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: PHATHOA.ketqua Level codes: PHATHOA.nghiemthuc Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 3922.5044 5 784.50089 22.714 .0000 Within groups 414.4533 12 34.53778 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 4336.9578 17 Table of means for PHATHOA.ketqua by PHATHOA.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 5.533333 2.7666667 3.3930212 .304514 10.762153 2 3 22.233333 2.7666667 3.3930212 17.004514 27.462153 3 3 52.766667 2.7666667 3.3930212 47.537847 57.995486 4 3 36.100000 2.8000000 3.3930212 30.871181 41.328819 5 3 19.466667 2.7666667 3.3930212 14.237847 24.695486 6 3 22.233333 5.5333333 3.3930212 17.004514 27.462153 -------------------------------------------------------------------------------- Total 18 26.388889 1.3851951 1.3851951 24.254232 28.523545

Multiple range analysis for PHATHOA.ketqua by PHATHOA.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 5.533333 X 5 3 19.466667 X 2 3 22.233333 X 6 3 22.233333 X 4 3 36.100000 X 3 3 52.766667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -16.7000 10.4576 * 1 - 3 -47.2333 10.4576 * 1 - 4 -30.5667 10.4576 * 1 - 5 -13.9333 10.4576 * 1 - 6 -16.7000 10.4576 * 2 - 3 -30.5333 10.4576 * 2 - 4 -13.8667 10.4576 * 2 - 5 2.76667 10.4576 2 - 6 0.00000 10.4576 3 - 4 16.6667 10.4576 * 3 - 5 33.3000 10.4576 * 3 - 6 30.5333 10.4576 * 4 - 5 16.6333 10.4576 * 4 - 6 13.8667 10.4576 * 5 - 6 -2.76667 10.4576 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: THAN.ketqua Level codes: THAN.nghiemthuc Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 9890.8050 5 1978.1610 128.438 .0000 Within groups 184.8200 12 15.4017 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 10075.625 17 0 missing value(s) have been excluded.

Table of means for THAN.ketqua by THAN.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 .000000 .0000000 2.2658087 -3.491727 3.491727 2 3 38.900000 2.8000000 2.2658087 35.408273 42.391727 3 3 72.233333 2.7666667 2.2658087 68.741606 75.725060 4 3 55.533333 2.7666667 2.2658087 52.041606 59.025060 5 3 50.000000 .0000000 2.2658087 46.508273 53.491727 6 3 22.233333 2.7666667 2.2658087 18.741606 25.725060 -------------------------------------------------------------------------------- Total 18 39.816667 .9250125 .9250125 38.391175 41.242158

Multiple range analysis for THAN.ketqua by THAN.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 .000000 X 6 3 22.233333 X 2 3 38.900000 X 5 3 50.000000 X 4 3 55.533333 X 3 3 72.233333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -38.9000 6.98345 * 1 - 3 -72.2333 6.98345 * 1 - 4 -55.5333 6.98345 * 1 - 5 -50.0000 6.98345 * 1 - 6 -22.2333 6.98345 * 2 - 3 -33.3333 6.98345 * 2 - 4 -16.6333 6.98345 * 2 - 5 -11.1000 6.98345 * 2 - 6 16.6667 6.98345 * 3 - 4 16.7000 6.98345 * 3 - 5 22.2333 6.98345 * 3 - 6 50.0000 6.98345 * 4 - 5 5.53333 6.98345 4 - 6 33.3000 6.98345 * 5 - 6 27.7667 6.98345 * --------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference.

One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: LA.ketqua Level codes: LA.nghiem_thu Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 714.60667 5 142.92133 9.224 .0008 Within groups 185.93333 12 15.49444 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 900.54000 17

Table of means for LA.ketqua by LA.nghiem_thu -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 8.300000 .0000000 2.2726229 4.797772 11.802228 2 3 16.700000 .0000000 2.2726229 13.197772 20.202228 3 3 27.766667 2.7666667 2.2726229 24.264438 31.268895 4 3 22.233333 2.7666667 2.2726229 18.731105 25.735562 5 3 13.900000 2.8000000 2.2726229 10.397772 17.402228 6 3 13.900000 2.8000000 2.2726229 10.397772 17.402228 -------------------------------------------------------------------------------- Total 18 17.133333 .9277944 .9277944 15.703555 18.563112 Multiple range analysis for LA.ketqua by LA.nghiem_thu -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 8.300000 X 5 3 13.900000 XX 6 3 13.900000 XX 2 3 16.700000 XX 4 3 22.233333 XX 3 3 27.766667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -8.40000 7.00446 * 1 - 3 -19.4667 7.00446 * 1 - 4 -13.9333 7.00446 * 1 - 5 -5.60000 7.00446 1 - 6 -5.60000 7.00446 2 - 3 -11.0667 7.00446 * 2 - 4 -5.53333 7.00446 2 - 5 2.80000 7.00446 2 - 6 2.80000 7.00446 3 - 4 5.53333 7.00446 3 - 5 13.8667 7.00446 * 3 - 6 13.8667 7.00446 * 4 - 5 8.33333 7.00446 * 4 - 6 8.33333 7.00446 * 5 - 6 0.00000 7.00446 -------------------------------------------------------------------------------- Phụ lục 2.4: thí nghiệm 4 One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: SG4KIEU.ketqua Level codes: SG4KIEU.nghiemthuc Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.7196917 3 .5732306 42.858 .0000 Within groups .1070000 8 .0133750 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 1.8266917 11

Table of means for SG4KIEU.ketqua by SG4KIEU.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 2.0100000 .0208167 .0667708 1.9010937 2.1189063 2 3 2.3466667 .0676593 .0667708 2.2377604 2.4555729 3 3 1.9666667 .0726483 .0667708 1.8577604 2.0755729 4 3 2.9133333 .0868588 .0667708 2.8044271 3.0222396 -------------------------------------------------------------------------------- Total 12 2.3091667 .0333854 .0333854 2.2547135 2.3636198 Multiple range analysis for SG4KIEU.ketqua by SG4KIEU.nghiemthuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 3 1.9666667 X 1 3 2.0100000 X 2 3 2.3466667 X 4 3 2.9133333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.33667 0.21781 * 1 - 3 0.04333 0.21781 1 - 4 -0.90333 0.21781 * 2 - 3 0.38000 0.21781 * 2 - 4 -0.56667 0.21781 * 3 - 4 -0.94667 0.21781 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO TẠO DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤ Y MÔ SẸO TẠO DI ̣CH HUYỀ N PHÙ CÂY

Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN

HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa : 2003-2007

Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ THU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC **************************

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤ Y MÔ SẸO TẠO DI ̣CH HUYỀ N PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

Giáo viên hƣớng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGS.TS. BÙI VĂN LỆ HOÀNG THỊ THU TS. PHAN PHƢỚ C HIỀ N

ThS. QUÁCH NGÔ DIỄM PHƢƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh

LỜ I CẢM ƠN

TÓM TẮT

SUMMARY

MỤC LỤC

DANH SÁ CH CÁ C CHƢ̃ VIẾ T TẮ T

DANH SÁ CH CÁC HÌNH

DANH SÁ CH CÁ C SƠ ĐỒ VÀ BIỂ U ĐỒ

DANH SÁ CH CÁC BẢNG

Chƣơng 1 MỞ ĐẦ U

 Ý nghĩa thực tiễn: cung cấp quy trình tạo mô sẹo, dịch huyền phù D.

Chƣơng 2 TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU

2.1.3. Mô tả hình thái

C

A

B

D

E

F

Chƣơng 3

3. VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP

3.4. Xử lý thống kê

Chƣơng 4

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

Hình 4.1: Mô sẹo đƣợc hình thành từ mẫu lớp mỏng cây D. burmanni Vahl trên môi trƣờng Gamborg’s B5, bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng độ thay đổi:

A

B

C

B B

A

B

C

D

E

F

Chƣơng 5 KẾ T LUẬN - ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt:

Tài liệu từ internet:

PHỤ LỤC

Phụ lục 1

Phụ lục 3

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Chế tạo và nghiên cứu tính chất điện, từ của vật liệu multiferroic Ba₀.₇Ca₀.₃TiO₃/ NiFe₂O₄

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu vật liệu biến hóa dạng chuỗi một chiều chế tạo từ kim loại đồng trên đế FR-4 hoạt động tại tần số MHz ứng dụng trong truyền năng lượng không dây

Luận văn Thạc sĩ: Đánh giá khả năng tác động tới môi trường biển của việc xả nước thải từ sự cố nhà máy điện hạt nhân Fukushima sử dụng công cụ ERICA

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mô hình đầu dò nơtron và gamma sử dụng nhấp nháy EJ-276 ghép nối với mảng nhân quang silicon

Luận văn Thạc sĩ: Đánh giá khả năng ảnh hưởng của bức xạ ion hóa đến sức khỏe cư dân khu vực mỏ đất hiếm Đông Pao, xã Bản Hon, huyện Tam Đường, tỉnh Lai Châu

Luận văn Thạc sĩ: Sử dụng phương pháp nhiễu xạ neutron khảo sát cấu trúc tinh thể và pha trật tự từ trong vật liệu Pr2FeCrO6

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính ức chế NO của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi nấm biển Aspergillus sp. CL251

Luận văn Thạc sĩ: Phân tích một số hợp chất bisphenol thôi nhiễm từ bao bì nhựa lên một số mẫu thực phẩm nền tinh bột

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của loài hoa mộc (Osmanthus fragrans (Thunb.) Lour.) ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng viêm của loài côi Turpinia montana (Blume) Kurz

Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đặc trưng tính chất vật liệu composite có cấu trúc nano chitosan–cyclodextrin/TiO₂–Ag

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu chế tạo và khảo sát một số tính chất của màng phủ trên cơ sở nhựa epoxy gốc nước và khung cơ kim - ZIF

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất napthoquinone chứa nguyên tố flo bằng phản ứng đa thành phần

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu điều chế vật liệu Bioglass và tổ hợp lai với polymer ALG-F127 định hướng ứng dụng trong điều trị nội nha

Luận văn Thạc sĩ: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase trên một số hợp chất phân lập từ thịt quả bình bát nước (Annona glabra L.).

Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống ung thư của hợp chất lai chứa khung tetrahydro-β-carboline và imidazo[1,5-a]pyridine

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất của benzazole

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu chiết tách lignin từ vỏ sầu riêng Ri6 (Durio zibethinus Murr.) và tổng hợp vật liệu biocomposite định hướng ứng dụng trong bảo quản sau thu hoạch

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hạt nano bạc phủ acid hyaluronic mang doxorubicin định hướng ứng dụng trong điều trị ung thư

Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của loài rau dừa nước (Ludwigia adscendens)

Tài liêu mới

Đề cương đồ án tốt nghiệp: Thành lập bản đồ địa chính khu vực xã Mỹ Lạc, huyện Thủ Thừa, tỉnh Long An bằng công nghệ GNSS-RTK