B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O
Ộ Ộ
Ụ Ụ
Ạ Ạ
TR TR
ƯỜ ƯỜ
NG Đ I H C M TP.H CHÍ MINH Ở NG Đ I H C M TP.H CHÍ MINH Ở
Ạ Ọ Ạ Ọ
Ồ Ồ
KHOA CÔNG NGH SINH H C KHOA CÔNG NGH SINH H C
Ọ Ọ
Ệ Ệ
Ch đủ ề Ch đủ ề
K THU T CHUY N GENE TH C V T Ể K THU T CHUY N GENE TH C V T Ể
Ự Ậ Ự Ậ
Ậ Ậ
Ỹ Ỹ
ộ
ộN i dung N i dung
• Khái ni mệ Khái ni mệ
• M t s nguyên t c chuy n gene M t s nguyên t c chuy n gene
ộ ố ộ ố
ể ể
ắ ắ
• Các k thu t chuy n gene th c v t Các k thu t chuy n gene th c v t ự ậ ự ậ
ể ể
ậ ậ
ỹ ỹ
• GMOGMO
• D án chuy n gene D án chuy n gene
ự ự
ể ể
Các khái ni mệ
ư ộ
Ệ Ể ủ ơ ể h u h t các t c truy n l bào và đ ặ ở ầ ế ượ ế
CÔNG NGH CHUY N GEN : là đ a m t đo n DNA ngo i ạ ạ lai vào gen c a c th đa bào, sau đó DNA ngo i lai này s ẽ ạ có m t i cho th h ế ệ ề ạ sau.
ạ
c chuy n t GEN CHUY NỂ :(transgene) là gen ngo i lai đ ể ừ ề m t c th sang m t c th m i b ng k thu t di truy n. ộ ơ ể ớ ằ ộ ơ ể ượ ậ ỹ
GMP (genetically modified plant): th c v t bi n đ i gen ự ậ ế ổ
ộ ố ộ ố ự ự ệ ệ ể ể ắ ắ
M t s nguyên t c trong chuy n công ngh chuy n gene th c ể M t s nguyên t c trong chuy n công ngh chuy n gene th c ể v tậv tậ bào đ u th hi n tính toàn năng (totipotency) ể ệ ộ ế ề
- Không ph i toàn b t ả - Các cây khác nhau có ph n ng không gi ng nhau v i s xâm nh p c a ậ ủ ớ ự ả ứ ố
ộ
các t ể ế bào có kh năng tái sinh và kh ả ả
m t gen ngo i lai ạ ế ạ ậ ự ậ ả
ể ế ộ ố ộ ố ấ ề ư ầ ỉ bào có kh năng khác nhau. C n bào có kh năng bi n n p ả ầ ế ạ ế
- Cây bi n n p ch có th tái sinh t ừ ỉ năng thu nh n gen bi n n p vào genome ế ạ - Mô th c v t là h n h p các qu n th t ỗ ợ xem xét m t s v n đ nh : ch có m t s ít t và tái sinh cây.
c xác đ nh b i loài, ki u gen, ể ế ượ ầ ể
- Thành ph n c a các qu n th t ở ủ t ng c quan, t ng giai đo n phát tri n c a mô và c quan. ừ ừ bào đ ể ủ ầ ạ ị ơ ơ
- Thành t bào ngăn c n s xâm nh p c a ADN ngo i lai. ế ậ ủ ả ự ạ
- Kh năng xâm nh p n đ nh c a gen vào genome không t l ủ ị v i s ỷ ệ ớ ự
ậ ổ bi u hi n t m th i c a gen ả ệ ạ ờ ủ ể
ậ ấ ậ ấ
Các khâu c a k thu t c y ủ ỹ Các khâu c a k thu t c y ủ ỹ gen gen
ỹ
ủ ế
ậ ấ
bào cho và tách plasmid ra kh i t
bào vi
ỏ ế
bào cho vào ADN plasmid
ắ
ố đo n ADN c a t
ủ ế
ở
K thu t c y gen g m 3 khâu ch y u: ồ Tách ADN NST c a t ủ ế khu n.ẩ C t và n i nh ng đi m xác đ nh t o nên ADN tái t
h p.
ữ
ể
ổ ợ
h p vào t
ờ enzim c tắ (restrictaza) ờ enzim n iố (ligaza) bào nh n và t o đi u ki n cho ạ
ề
ế
ệ
ậ
ạ ạ ị • Vi c c t nh ệ ắ • Vi c n i nh ệ ố Chuy nể ADN tái t ổ ợ c bi u hi n. gen đã ghép đ ệ ể
ượ
ả ả
ể ể
ự ự
Vì sao ph i phát tri n công Vì sao ph i phát tri n công ngh chuy n gene th c ể ệ ngh chuy n gene th c ể ệ v t?ậv t?ậ
III) Các k thu t bi n đ i gene: ậ III) Các k thu t bi n đ i gene: ậ
ế ổ ế ổ
ỹ ỹ
K thu t b n gene ậ ắ K thu t b n gene ậ ắ
ỹ ỹ
K thu t siêu âm ậ K thu t siêu âm ậ
ỹ ỹ
K thu t đi n xung K thu t đi n xung
ệ ệ
ậ ậ
ỹ ỹ
K thu t vi tiêm ậ K thu t vi tiêm ậ
ỹ ỹ
K thu t chuy n gene qua ng ph n ấ K thu t chuy n gene qua ng ph n ấ
ể ể
ậ ậ
ố ố
ỹ ỹ
K thu t PEG ậ K thu t PEG ậ
ỹ ỹ
K thu t chuy n gene b ng s c nhi K thu t chuy n gene b ng s c nhi
ể ể
ậ ậ
ằ ằ
ố ố
ỹ ỹ
t ệ t ệ
KỹKỹ thu tậthu tậ tr cựtr cự ti pếti pế
ể ể
Chuy n gen nh ờ Chuy n gen nh ờ Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
K ỹK ỹ thu tậthu tậ chuy nể chuy nể genegene
KỹKỹ thu tậthu tậ giángián ti pếti pế Chuy n gen nh virus và phage ờ Chuy n gen nh virus và phage ờ ể ể
K thu t b n gene ậ ắ K thu t b n gene ậ ắ
ỹ ỹ
Đâu là súng b n gene? Đâu là súng b n gene?
ắ ắ
Chính xác Chính xác
K thu t b n gene ậ ắ K thu t b n gene ậ ắ ỹ ỹ
ắ ế ị ử ụ
ề ạ
ượ ượ ự ầ ậ
Corrnell ứ ở ớ
t b s d ng đ đ a thông tin di Súng b n gen (Gene gun) là m t thi ể ư ộ c thi truy n vào t t k đ u tiên cho bi n n p DNA ngo i lai vào bào, đ ế ế ạ ế ế ầ c phát tri n vào đ u th p niên 1980 do các nhà th c bào th c v t và đ t ể ự ậ ế v t h c Ð i h c Corrnell cùng v i các nhà nghiên c u ậ ọ ở ạ ọ Nanofabrication Facility, Newyork, USA.
c bán trên th tr ng vào năm 1990. Súng b n gen đ ắ ượ ị ườ
ầ ủ ủ ắ
c ệ ố ỹ ườ ượ ậ
ố ạ ng đ ữ ữ ả ơ
ộ ọ ự ắ Tên chính xác và đ y đ c a súng b n gen là h th ng phân ph i h t biolistics (biolistic particle delivery system) và k thu t này th g i m t cách đ n gi n là biolistics (s k t h p gi a hai thu t ng biology ậ ự ế ợ ọ (sinh h c) và ballistics (s b n tung)).
ng pháp này là s d ng áp l c xung c a khí ủ ử ụ ự ủ
ể ố Nguyên lý chung c a ph ươ ạ helium đ gia t c các h t.
K thu t b n gene ậ ắ K thu t b n gene ậ ắ ỹ ỹ
C u t o súng b n gen: C u t o súng b n gen: ấ ạ ấ ạ ắ ắ
c ắ ằ ỉ ướ
Súng b n gen bao g m hai bu ng b ng thép không g , kích th ồ ồ 6″x7″x10″ n i v i hai b m chân không. ố ớ ơ
ấ ườ ạ ở ả ỏ
c s d ng nh ng không th ư đây là các h t tungsen có đ ạ ạ ứ ượ ử ụ ườ
ở
ắ ề ng v i t c đ khi m t c v i t c đ 1300 food/s, t ng đ 1000psi làm cho cái đĩa b n v phía ộ ớ ố ộ ươ ươ
ng kính r t nh , kho ng Đ n 1μm ch a DNA ngo i lai (các kim lo i năng khác nh vàng và ư ạ b c cũng đ ng xuyên do giá c ả ạ đ t). ắ S bùng n khí helium ổ ự tr ướ ớ ố ộ viên đ n r i kh i nòng súng. ỏ ạ ờ
K thu t b n gene ậ ắ K thu t b n gene ậ ắ ỹ ỹ
K thu t b n gene ậ ắ K thu t b n gene ậ ắ ỹ ỹ
Ắ
CÁC LO I SÚNG B N Ạ GEN
Sauter1991 Sauter1991
PDS-1000 PDS-1000
PDS-1000He PDS-1000He
K thu t b n gene ậ ắ K thu t b n gene ậ ắ ỹ ỹ
bào bào
bào nuôi c y, t bào nuôi c y, t bào mô bào mô * u đi m Ư ể * u đi m Ư ể - Thao tác d dàng, b n m t l n đ ắ - Thao tác d dàng, b n m t l n đ ắ - Nguyên li u đ b n đa d ng (h t ph n, t ạ ể ắ - Nguyên li u đ b n đa d ng (h t ph n, t ạ ể ắ ộ ầ ượ ộ ầ ượ ạ ạ c nhi u t c nhi u t ấ ấ ề ế ề ế ế ế ễ ễ ệ ệ ấ ấ ế ế
hóa và mô phân sinh) hóa và mô phân sinh)
ấ ấ ơ ữ ơ ữ ệ ệ ầ ầ ộ ộ
- T n xu t thành công khá cao( cây m t lá m m). H n n a vi c ở - T n xu t thành công khá cao( cây m t lá m m). H n n a vi c ở thi thi ầ ầ t k vector khá đ n gi n. ế ế t k vector khá đ n gi n. ế ế ả ả ơ ơ
ượ ượ
c đi m ể c đi m ể ầ ố ế ạ ổ ầ ố ế ạ ổ ư ư ế ế ị ị t ệ t ệ
* Nh * Nh - T n s bi n n p n đ nh th p vì th theo Potrykus thì u vi ấ - T n s bi n n p n đ nh th p vì th theo Potrykus thì u vi ấ ng pháp này là nghiên c u các gen t m th i. c a ph ờ ủ ng pháp này là nghiên c u các gen t m th i. c a ph ờ ủ ươ ươ ứ ứ ạ ạ
ữ ữ ầ ầ
Tuy nhiên, nh ng năm g n đây ph Tuy nhiên, nh ng năm g n đây ph mía, đu đ , bông đã kh ng đ nh tính u vi mía, đu đ , bông đã kh ng đ nh tính u vi ng pháp này. ng pháp này. t c a ph t c a ph ng pháp này đã thành công trên lúa, ươ ng pháp này đã thành công trên lúa, ươ ư ư ệ ủ ệ ủ ươ ươ ủ ủ ẳ ẳ ị ị
K thu t siêu âm ậ K thu t siêu âm ậ
ỹ ỹ
ượ ử ượ ử
ệ ệ
c x lý nh b ng siêu Sau khi tách, protoplast đ Nguyên t cắ :: Sau khi tách, protoplast đ ẹ ằ c x lý nh b ng siêu Nguyên t cắ ẹ ằ âm có hi n di n c a DNA ngo i lai. Sóng siêu âm giúp DNA đi ạ ệ ủ âm có hi n di n c a DNA ngo i lai. Sóng siêu âm giúp DNA đi ệ ủ ạ vào t vào t bào và th hi n. bào và th hi n. ể ệ ể ệ ế ế
Cách ti n hành: ế Cách ti n hành: ế
Các b
K thu t siêu âm ậ K thu t siêu âm ậ ỹ ỹ
c:ướ
ươ
ử
Là m t ph ộ phân c c vào trong t
ơ ọ s d ng đ đ a các phân t ử ụ bào ch qua màng t
bào
ng pháp c h c ủ ế
ể ư ế
ự
ộ
ệ
ệ
ả
ắ đi n th cao (200 ế có
ầ
M t xung đi n cao th trong kho nh kh c ế – 400 V/cm) trong kho ng th i gian 4 - 5 ph n nghìn giây ờ ả kh năng làm r i lo n c u trúc màng kép phospholipid ạ ấ
ả
ố
ạ
ờ
ỗ ủ môi tr
DNA bào.
T o ra các l ngo i lai t ừ ạ
th ng t m th i cho phép các phân t ử ạ ng xâm nh p vào bên trong t ế ậ
ườ
K thu t đi n xung K thu t đi n xung ệ ệ ậ ậ ỹ ỹ
c th c hi n trong cuvett chuyên ệ ự ượ
ệ ng nuôi c y thích h p, môi tr ườ
ượ
ng ườ c bi n n p. ế ạ ấ invitro, tái sinh cây và ch n ọ
Quá trình đ d ng. Sau quá trình xung đi n, đem protoplast nuôi ụ trong môi tr ợ ấ ch n l c đ tách các protoplast đã đ ọ ọ ể Ti p theo là nuôi c y ế l c cây chuy n gen. ọ ể
ạ ạ
ỗ ạ ỗ ạ
t m th i ờ t m th i ờ
S đ plasmid ch a DNA ngo i lai đi qua các l ứ ơ ồ S đ plasmid ch a DNA ngo i lai đi qua các l ứ ơ ồ trên màng bào ch tấ trên màng bào ch tấ
K thu t đi n xung K thu t đi n xung ệ ệ ậ ậ ỹ ỹ
Máy xung đi n ệ Máy xung đi n ệ
K thu t vi tiêm ậ K thu t vi tiêm ậ
ỹ ỹ
Là ph ng pháp tiêm các đ i phân t vào trong t ươ ạ ử ế bào th c v t ự ậ
ứ ằ ớ
ng pháp vi tiêm, ươ
ợ ự
các gen chuy n đã tích h p và có kh ả ệ . Vào năm 1982, l n đ u tiên s thay đ i ki u ổ ể ầ c mô t chu t nh t chuy n gen đã đ ả ể ầ ắ ấ ở ượ ể ộ
Brinster, 1981; Costantini và Lacy; 1981 đã ch ng minh r ng v i ph năng bi u hi n ể hình có th nhìn th y ể (Palmiter, 1982).
Brinster
K thu t vi tiêm ậ K thu t vi tiêm ậ
ỹ ỹ
ng nh DNA đ ươ ỏ
ộ ượ ặ ế ầ c tiêm ượ bào nguyên v n m t cách ộ ẹ
i kính hi n vi. Nguyên t cắ ph tr c ti p vào nhân t ự ế c h c d ơ ọ ướ ng pháp vi tiêm là m t l bào phôi tr n ho c t ế ể
K thu t vi tiêm ậ K thu t vi tiêm ậ
ỹ ỹ
ng pháp vi tiêm tr c h t ph i ế bào b ng ph ằ ươ ướ ế ả
Ð bi n n p gen vào t ch t o kim tiêm và kim gi ể ế ạ ế ạ . ữ
ượ ạ ừ ữ ố ườ ẻ
trong nh h th ng thi ng kính 0,1- t b làm c t o ra t ợ ằ nh ng ng thu tinh d o capillar đ ờ ệ ố ế ị
Kim đ ỷ 1,5 mm có s i b ng wolfram m nh ả ở kim.
đ ng (pipette puller), máy mài ệ ố ự ộ
H th ng này g m có máy kéo kim t ồ kim và máy gia c kim. ố
ố
1.Máy gia c kim Microforge 2. Máy mài kim ự 3. Máy kéo kim t đ ng Pipette Puller ộ
K thu t vi tiêm ậ K thu t vi tiêm ậ
ỹ ỹ
c ể ượ
Kính hi n vi dùng cho m c đích này là kính hi n vi soi ng ể (v t kính xoay ng ượ ậ ụ c lên)
ộ ạ ộ ế
Ð phóng đ i thích h p cho vi c ti n hành vi tiêm vào phôi cá m t t ệ ế bào là kho ng t ừ ả ợ ầ 40-60 l n.
ầ ố
ỉ
Máy vi thao tác g m 2 ph n gi ng ồ c b trí hai bên kính h t nhau đ ượ ố ệ hi n vi, m t dùng đ đi u ch nh kim ể ề ộ ể tiêm, m t dùng cho kim gi . ữ ộ
ủ
ề
Tính năng c a máy này là cho phép đi u ch nh các kim theo không gian ỉ 3 chi u. ề
c l p vào
ằ ấ
Kim tiêm và kim gi máy vi thao tác và đ n i v i syringe qua ng b ng ch t ố ớ d o đ ẻ ượ ạ đ ữ ượ ắ c ượ ố c n p đ y d u parafin. ầ ầ Máy vi thao tác Olympus (Hãng Narishige) 1. Kính hi n vi soi ng ể ỉ ề c ượ 2. Máy vi đi u ch nh
S đ t o đ ng v t chuy n gen ơ ồ ạ ộ ể ậ
Vi tiêm ngo i lai ti n nhân c a tr ng th tinh ụ ủ ứ ề ạ
K thu t vi tiêm ậ K thu t vi tiêm ậ
ỹ ỹ
Ư ể u đi m
bào ư
ượ ư ộ ng ADN đ a vào t ế c đ a ADN vào lo i t ạ ế ậ bào nào ậ
bào có c u trúc nh nh h t ph n và t bào ti n phôi m c ề ặ ấ
dù h n ch v s l ế ỏ ư ạ ng cũng có th tiêm chính xác ể
quan sát đ - Các t ạ - Có th nuôi riêng l bào vi tiêm và bi n n p đ các t c vào m i - Có th t i u l ể ố ư ượ - Quy t đ nh đ ế ị - Có th đ a m t cách chính xác th m chí vào t n nhân và có th ể ể ư c ượ ấ ế ế ề ố ượ ể ế ạ ượ ế ẻ ọ
ố gi ng cây
Nh ượ ể c đi m
c m t phát tiêm và ch v i m t t bào ỗ ầ ỉ ượ ộ ế ộ
ỏ ộ - M i l n tiêm ch đ ỉ ớ - Thao tác trong khi làm đòi h i đ chính xác cao
K thu t chuy n gene qua ng ph n ấ K thu t chuy n gene qua ng ph n ấ ố ố ể ể ậ ậ ỹ ỹ
ng pháp chuy n gen qua ng ph n là ph ng ươ ể ấ ố
Ph pháp chuy n gen không qua nuôi c y mô ể ấ ươ invitro.
c nhóm Ray Wu đ i h c ươ ượ ạ ọ
ng pháp này đ ỹ
ổ
Trung Qu c Duan và Chen (1985). Ph Cornell (M ) báo cáo thành công trên cây lúa, ti p ế theo các công trình s b v i ADN t ng h p c a ợ ủ ơ ộ ớ hai tác gi ố ả
Ray Wu 1988
K thu t chuy n gene qua ng ph n ấ K thu t chuy n gene qua ng ph n ấ ố ố ể ể ậ ậ ỹ ỹ
ạ ể
ầ ụ ầ ố
ạ ấ
ấ
ự ụ
ợ ử ư ế
bào h p t ể
ỉ ả ấ ụ
ẽ Nguyên t cắ ADN ngo i lai chuy n vào cây theo đ u ng ph n, chui vào b u nh y ấ cái. Th i gian chuy n gen là vào lúc h t ph n ể ờ m c qua vòi nh y và lúc b t đ u đ a tinh ắ ầ ư ụ ọ t nh t là s chuy n gen t vào th tinh, t ể ử ố ụ noãn x y ra đúng khi quá trình th tinh ở ả và cho t ch a phân chia. Nh ư m t t v y, s chuy n gen ch x y ra ở ộ ế ự ậ bào sinh d c cái duy nh t và khi tái sinh ể ả cây s không hình thành th kh m.
K thu t chuy n gene qua ng ph n ấ K thu t chuy n gene qua ng ph n ấ ố ố ể ể ậ ậ ỹ ỹ
Cách ti n hành ế Cách ti n hành ế
ồ ệ ướ ế
c, phân, nhi ỏ ấ ợ
t đ , chi u - Lúa tr ng trong ch u v i các đi u ki n n ậ ớ ệ ộ ề sáng thích h p. Khi lúa tr , ch n các hoa có hai v tr u m hoàn toàn ở ỗ và đánh d u đ kh i nh m l n v i các hoa khác. ầ ọ ẫ ớ ể ỏ ấ
ờ ở ờ ắ
, c t 2/3 ho c 3/4 ph n trên c a hoa lúa ủ ầ ng kính 0,2mm đ a ắ ặ ỏ ườ ả
ư h p mang gen mong mu n vào đ u ng nh y ầ ố ụ
ổ ợ ả ồ
ị ị ắ - Bao bông lúa l ờ - Phân tích và xác đ nh k t qu chuy n gen th h sau - Sau th i gian hoa n 1- 2 gi - Sau khi c t hoa, dùng ng mao qu n nh có đ ố dung d ch ADN tái t ố ổ ợ m g/ml) đã b c t (n ng đ ADN tái t h p kho ng 50 ộ i, ch lúa chín thu hái ạ ể ở ế ệ ế ả ị
(Chuy n gen b ng ph ể ằ ươ ọ ng pháp hóa h c) K thu t PEG ậ K thu t PEG ậ ỹ ỹ
ằ ươ ể
ng pháp chuy n gen ể ọ bào protoplast nh các ch t hóa h c nh poly-1-ornithin ho c ế ươ ư ặ ấ ọ
ng pháp hóa h c là ph Chuy n gen b ng ph vào t ờ polyethylen glycol (PEG)
K thu t PEG ậ K thu t PEG ậ ỹ ỹ
ươ ể ể ằ ấ
ụ ớ ầ ố ớ ể ư ả
Ph ng pháp chuy n gen b ng hóa ch t có th áp d ng v i nhi u ề loài th c v t nh ng kh năng chuy n gen v i t n s chuy n gen ể ự ậ ấ r t th p. ấ
ng l n protoplast, do v y kh c ậ ắ
Tuy nhiên, v i kh năng t o ra s l ạ ả c h n ch c a ph ph c đ ế ủ ớ ụ ượ ạ ươ ớ ố ượ ng pháp này.
Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens
ờ ờ
ể ể
ệ
ư ở
ở
ộ ố ệ
Khi ệ
ả ư
ữ
ả
cây. ệ ở
ư
ặ
Agrobacterium là nhóm các vi khu n đ t Gram âm gây ra các tri u ẩ ấ , gây ung th trong đ t s sinh đ c t ấ ẽ ch ng b nh ứ th c v t, gây ra b nh kh i u hình chóp và b nh lông r ự ậ ễ ở ố nhi u loài cây c nh và cây ăn qu nh ng mang nh ng plasmid ề l n đ c tr ng. ớ
. Agrobacterium g m có các loài:
ồ - A.tumefaciens - A.rubi - A.rhizogenes - A.radiobacter
c s d ng ph bi n cho chuy n gen ượ ử ụ ổ ế ể
Trong đó A.tumefaciens đ vào th c v t ự ậ
ng pháp hi u qu và ph bi n nh t hi n nay nh vào ổ ế ả ờ
ấ ự ậ ươ ắ ệ ạ ệ ộ
Đây là ph kh năng g n gen ngo i lai vào h gen th c v t m t cách chính xác ệ và n đ nh. ả ổ ị
Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens
ờ ờ
ể ể
Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens
ờ ờ
ể ể
ẩ Agrobacterium tumefaciens ẩ ạ t o ra. Agrobacterium tumefaciens t o ra. ạ
ộ ố ộ ố ố ố ồ ồ
Hình :M t s kh i u do vi khu n ố Hình :M t s kh i u do vi khu n ố A: m t kh i u r t l n hình thành trên thân cây hoa H ng A: m t kh i u r t l n hình thành trên thân cây hoa H ng ấ ớ ấ ớ B: m t dãy kh i u n m trên nhánh c a cây Nho ằ B: m t dãy kh i u n m trên nhánh c a cây Nho ằ ộ ộ ộ ộ ủ ủ ố ố
Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens
ờ ờ
ể ể
ng, kích thích hình thành các ng, kích thích hình thành các ươ ươ
Acetosyringon, Hydroxyl Acetosyringon, Hydroxyl ẩ ẩ ấ ộ ấ ộ ấ ấ
Vi khu n xâm nhi m vào ch v t th ỗ ế ễ Vi khu n xâm nhi m vào ch v t th ỗ ế ễ ch t đ c có b n ch t phenolic ( ả ch t đ c có b n ch t phenolic ( ả acetosyringon). ). acetosyringon
ng, v a là k t h p ch t ấ ng, v a là k t h p ch t ấ ươ ươ
ạ ạ ậ ậ
ộ ộ
i vùng b trái và b ph i) đ g n vào genom th c v t. i vùng b trái và b ph i) đ g n vào genom th c v t. Ch t này có tác d ng làm lành v t th ừ ế ụ ấ Ch t này có tác d ng làm lành v t th ừ ế ấ ụ i có vai trò nh m t ch t kích ho t d n d vi khu n xâm nh p , l ạ ư ộ ẩ ẫ ụ d n d vi khu n xâm nh p , l i có vai trò nh m t ch t kích ho t ạ ư ộ ẩ ẫ ụ vùng gen vir thu c Ti-plasmid kích thích cho s c t đo n T-ADN ự ắ vùng gen vir thu c Ti-plasmid kích thích cho s c t đo n T-ADN ự ắ (t ể ắ (t ể ắ ế ợ ế ợ ấ ấ ạ ạ ự ậ ự ậ ờ ả ờ ả ạ ạ ờ ờ
ự ự ứ ứ ọ ọ ị ị
Trong T-ADN có ch a 3 vùng gen quan tr ng quy đ nh s hình Trong T-ADN có ch a 3 vùng gen quan tr ng quy đ nh s hình thành kh i u. thành kh i u. ố ố
ự ự
kích thích cho s hình thành iaah kích thích cho s hình thành và iaah Đó chính là vùng gen iaamiaam và Đó chính là vùng gen kích thích cho s hình thành xytokinin. T l IAA và vùng gen iptipt kích thích cho s hình thành xytokinin. T l ỷ ệ ự IAA và vùng gen ỷ ệ ự kích thích s hình thành callus t o lên các kh i u. auxin/xytokinin kích thích s hình thành callus t o lên các kh i u. ố auxin/xytokinin ố ự ự ạ ạ
Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens
ờ ờ
ể ể
Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens
ờ ờ
ể ể
Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens
ờ ờ
ể ể
Ti Plasmid Ti Plasmid
b gen c a ủ ộ b gen c a ủ ộ vi khu nẩ vi khu nẩ
tumefaciens tumefaciens
Vi khu n đ t A. ẩ Vi khu n đ t A. ẩ
ấ ấ
Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens
ờ ờ
ể ể
c s d ng trong công ngh ệ ượ ử ụ
Các plasmid c a ủ Agrobacterium đ gen th c v t g m có 2 lo i: vector liên h p và vector nh th . ị ể ự ậ ồ ạ ợ
ng ườ
ị ỉ
t ẩ E.coli, bào th c ự ị plasmid c a vi khu n ủ ố ừ ọ ọ ạ ộ c ượ ở ế ự
Vector liên h p d a trên s tái t h p c a 2 plasmid. M t ợ ự ộ ổ ợ ủ vector liên h p g m có: v trí đ ghép các gen quan tâm, th ể ồ ợ v trí này có ngu n g c t ẩ E.coli. ồ ị Gen ch th kháng sinh giúp cho ch n l c trong vi khu n Agrobacterium và gen ch n l c ho t đ ng đ ọ ọ v t.ậ
t: m t cung ị ể ệ ộ
ố
Vector nh th là h th ng dùng 2 plasmid riêng bi c p T-ADN đã m t đ c tính gây kh i u, plasmid kia là Ti plasmid ấ có kh năng thâm nh p vào t bào th c v t (mang các gen vir). ệ ố ấ ộ ậ ự ậ ế ả
Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens
ờ ờ
ể ể
Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens
ờ ờ
ể ể
ể ể
ờ ờ
Quy trình chuy n gen Quy trình chuy n gen nh vi khu n ẩ nh vi khu n ẩ A.tumefaciens A.tumefaciens
1.Thi
t k vector mang gen
ế ế
2. Nhân dòng vector nh vi ờ khu n ẩ E.coli.
ạ ừ E.coli sang
ế
3. Chuy n vector mang gen ể bi n n p t A.tumefaciens.
ứ
ớ ế
ạ
ể
4. Lây nhi m ễ A.tumefaciens ch a gen bi n n p v i t bào, ế mô th c v t đ ti n hành quá ự ậ ể ế trình chuy n gen sang mô, t ế bào đích.
ế
ượ
ạ
5. Ch n l c các mô, t bào ọ ọ đ c bi n n p thành công. ế bào bi n n p 6. Tái sinh mô, t ạ ế ế thành cây bi n n p hoàn ch nh. ạ
ế
ỉ
Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens Chuy n gen nh Agrobacterium tumefaciens
ờ ờ
ể ể
c hi n t ng c ố ượ ượ ệ ượ ứ
ả ch l n nhau và câm l ng l n nhau. u đi m Ư ể - Gen ít b đào th i ả ị ng b n sao ít h n. Do đó tránh đ - S l ơ ẫ ế ẫ ặ
ặ
IS ổ ợ ượ
i b n v ng trong c th th c v t do s ph thu c - T n t ự ụ ơ ể ự ậ ộ ồ ạ ề ữ ng pháp nh ng ph ch t ch vào h th ng protein Vir, còn ươ ở ữ ệ ố ẽ t nh hai trình t khác gen m c tiêu đ h p chuyên bi ự ờ ệ hai đ u nh ng d dàng b tách ra ngay sau đó. c tái t ị ụ ư ễ ầ
ượ
i h n ớ ạ
và cây hai lá m m nh ng l i ư ầ ạ
c đi m Nh ể - Có ph t n công gi ổ ấ - Gây kh i u cho c cây kh a t ả ố không gây kh i u cho cây m t lá m m ố ỏ ự ầ ộ
bào trên nh ng th c
ễ
ế
ự
ữ
Virrus d dàng bám và lây nhi m vào t ễ v t nguyên v n. ậ
ẹ
ự ậ ừ ị
ễ
M t s Virrus lây nhi m vào th c v t t chuy n acid nucleic c a nó vào m i t ỗ ế
ộ ố ể
ễ ủ
v trí xâm nhi m và bào s ng c a ký ch . ủ ủ
ố
3 -105
ồ ạ
ể
i kho ng 10 ả
Virrus có th sao chép vài ngàn l n và t n t b n sao trong m i t ả
ầ bào th c v t. ự ậ
ỗ ế
c đi kh p n i và vì v y có bi u hi n
ủ
ượ
ệ
ể
ậ
ắ
ơ
Gen c a Virrus đ m nh.ạ
Chuy n gen nh virus Chuy n gen nh virus ờ ờ ể ể
Chuy n gen nh virus Chuy n gen nh virus ờ ờ ể ể
Tuy nhiên, virus làm vector chuy n gen c n ph i có các tiêu chu n ể ẩ ả ầ
sau:
ả ệ ủ
t bào này sang t bào khác qua ể ừ ế ế
các l ả bào
c đo n ADN (gen) m i, sau đó chuy n ượ ạ ể ớ
ế
vách t ả gen này vào t ổ ề
- H gen c a virus ph i là ADN - Virus có kh năng di chuy n t ỗ ở ế - Có kh năng mang đ bào th c v t ự ậ - Có ph ký ch r ng (trên nhi u loài cây) ủ ộ ự ậ - Không gây tác h i đáng k cho th c v t ạ ể
ế ệ ạ c s ượ ử
Đ i chi u các tiêu chu n trên, hi n nay có hai lo i virus đ ố d ng làm vector chuy n gen là caulimovirus và geminivirus. ụ ẩ ể
ệ ử ụ
th c v t còn ít ở ự ậ ể c s d ng vì ADN virus khó ghép n i v i h gen c a th c ủ ể ố ớ ệ ự
Tuy nhiên, vi c s d ng virus đ chuy n gen đ ượ ử ụ v t.ậ
GMOGMO
ế ế
ậ ậ ố ố
Sinh v t bi n đ i ổ Sinh v t bi n đ i ổ gene s ng (LMO- gene s ng (LMO- Living Modified Living Modified Organism) Organism)
ớ ừ ớ ừ ươ ươ ệ ệ
Sinh v t bi n đ i ổ ế ậ Sinh v t bi n đ i ổ ế ậ gene (GMO- gene (GMO- Genetically Modified Genetically Modified Organism) Organism) thu t ng ch các sinh v t ti p ỉ ữ ậ ậ ế thu t ng ch các sinh v t ti p ỉ ữ ậ ậ ế t c các sinh v t còn s ng có t ậ ấ ả ố t c các sinh v t còn s ng có t ậ ấ ả ố d ng i S khác nhau c b n c a GMO và LMO: LMO t n t ồ ạ ở ạ ơ ả ủ ự các sinh nh n nh ng gen m i t ữ ậ các sinh nh n nh ng gen m i t ậ ữ h p v t ch t di truy n ch a t ề ấ ứ ổ ợ ậ ch a t h p v t ch t di truy n ề ứ ổ ợ ậ ấ s ng, còn GMO có th t n t d ng s ng hay không s ng. i ố ố ể ồ ạ ở ạ ố ng pháp v t khác thông qua ph ậ ng pháp v t khác thông qua ph ậ m i do s d ng công ngh sinh ử ụ ớ m i do s d ng công ngh sinh ử ụ ớ thí chuy n gen ể chuy n gen thí ể h c hi n đ i. ạ ệ ọ h c hi n đ i. ạ ệ ọ nghi m.ệ nghi m.ệ
trong phòng trong phòng
L ch s xu t hi n GMO L ch s xu t hi n GMO ử ấ ử ấ ệ ệ ị ị
ừ ụ ệ ể
ạ t c các m t c a nghiên c u khoa h c và ng d ng s n xu t. - T khi Công ngh sinh h c phát tri n m nh m , nh ng ng d ng tác đ ng vào t ấ ộ ữ ứ ứ ọ ặ ủ ấ ả ẽ ọ ụ ứ ả
ữ ầ ạ ố ố
t, đáp ng nhu c u ngày càng cao c a con ng i. - Trong đó, m i quan tâm hàng đ u là lai t o ra nh ng gi ng cây, con có nhi u tính tr ng t ầ ườ ứ ủ ề ạ ố
ữ ấ
ọ ấ ề ể ạ
ầ ng ra không ế c d t đi m, nhu c u s l ề ề ị ượ ứ ạ ầ ố ượ ỏ ố ệ
- Nh ng v n đ m i phát sinh ngày càng nhi u: thi u đ t canh tác tr m ề ớ tr ng, nhi u sâu b nh h i không tr đ ệ ngày càng l n… trong khi các bi n pháp lai t o truy n th ng t hi u qu , đ c bi t đ i v i v t nuôi. ệ ố ớ ậ ớ ả ặ ệ
ổ ợ ượ ề ấ ầ
ậ ở ụ
ứ ệ ạ ở
ụ ụ ề ả ệ ạ ố
c đ xu t l n đ u h p (Recombinant DNA) đ Kĩ thu t DNA tái t ầ tiên b i Peter Lobban và A. Dale Kaiser (C c hóa sinh, ĐH Stanford, ng lai cho vi c nghiên c u lai t o California, Hoa Kỳ ) đã m ra m t t ộ ươ các gi ng m i, ph c v n n s n xu t nông nghi p hi n đ i, đó chính là ệ ấ c s cho s xu t hi n c a các sinh v t bi n đ i gene (GMO) ngày nay ơ ở ớ ự ấ ệ ủ ế ậ ổ
GMO đ GMO đ c hình thành nh th nào? c hình thành nh th nào? ượ ượ ư ế ư ế
ậ ổ
ượ ng pháp DNA tái t ơ ở ứ ụ h p( recombinant DNA Sinh v t bi n đ i gene đ ế thu t chuy n gene, ph ươ ể ậ c hình thành trên c s ng d ng k ỹ ổ ợ )
ắ
Dùng enzyme c t gene mong mu n ( ố ở đây là Bt)
ể
ể
T o vector chuy n gene(vector bi u ạ hi n): ệ G n đi m kh i đ u và k t thúc vào gene ắ
ở ầ
ể
ế
c vào
mong mu n, đ nó có th đ a đ ể ố plasmid vi khu n và đ ẩ
ể ư ượ c bi u hi n ệ ể
ượ
c đ a
ố ượ ư
Vector mang gene mong mu n đ vào Plasmid c a vi khu n. ủ
ẩ
c đ a vào h gene
ạ
ượ ư
ệ
Gene ngo i lai đ c a ủ Ngô, nh s xâm nhi m c a vi khu n.
ờ ự
ủ
ễ
ẩ
bào Ngô ch a gene ngo i lai,
ạ
ứ
ng pháp nuôi c y mô t
ế
ấ
T t ừ ế b ng ằ ph bào, hình ươ thành cây hoàn ch nh mang gene mong ỉ mu n, hoàn toàn khác cây ban đ u.
ầ
ố
Thành t u v GMO ự ề Thành t u v GMO ự ề
ẽ ạ
K thu t chuy n gene đã tác đ ng m nh m vào các lo i gi ng cây ậ tr ng, đ c bi ặ ạ ng th c, th c ph m, d ượ ự ộ ể t là các lo i cây l ươ ố c li u. ệ ỹ ồ ự ệ ẩ ạ
ồ ố ượ ữ ớ ị
ư ứ ệ ố ị
ặ
ớ i quy t đ ng cây tr ng mang các gene m i quy đ nh nh ng tính ổ ừ ỏ t là qu c ố ng ươ ệ c v n đ an ninh l ề ố ế ượ ấ ả ầ
Ngày nay, s l tr ng nh kháng sâu b nh, kháng thu c tr c , ch a gene quy đ nh t ng ạ h p Protein, vitamin… vô cùng l n, giúp các qu c gia đ c bi ợ gia đang phát tri n ph n nào gi ể th c.ự
Thành t u v GMO ự ề Thành t u v GMO ự ề
ệ ế ấ ổ
ồ ớ ự ủ ơ ầ
Di n tích đ t canh tác: di n tích đ t canh tác cây tr ng bi n đ i gene trên ấ quy mô toàn c u đ t ng ệ 10 tri u nông dân ệ ng 100 tri u hectare v i s tham gia c a h n ạ ưỡ 22 qu c gia. ố ở ệ
ẫ ầ ớ ứ ệ ớ
ệ
Hoa Kỳ d n đ u v i 54,6 tri u hectare, Argentina đ ng th hai v i 18 tri u hectare, Brazil có 11,5 tri u hectare, Canada có 6,1 tri u hectare, n Ấ Đ 3,8 tri u hectare và Trung Qu c x p th sáu v i 3,8 tri u hectare. ố ế ứ ệ ệ ệ ộ ứ ệ ớ
Thành t u v GMO ự ề Thành t u v GMO ự ề
c gieo tr ng th ng m i ố ế ổ ồ ượ ồ ươ ạ
ng cây tr ng bi n đ i gene chính đ ng, ngô, bông và c i d u. B n đ i t ố ượ bao g m đ u t ồ ả ầ ậ ươ
c s d ng ph bi n hi n nay là tính tr ng kháng thu c ạ ượ ử ụ ổ ế ệ ố
ạ ả
Hai tính tr ng đ t c và kháng côn trùng. Trong đó, các cây tr ng có kh năng kháng di ệ ỏ thu c di ệ ộ ố ồ c canh tác trên di n r ng nh t. ấ t c đ ệ ỏ ượ
c chuy n vào cây tr ng nông ấ ề ượ
quy ể ớ ượ ệ ồ c tr ng ở ồ
Ngoài ra, r t nhi u tính tr ng khác cũng đ ạ nghi p. Tuy nhiên, các gi ng bi n đ i gene này m i đ ố mô nh ho c ch a đ c th ỏ ặ ổ ế ng m i hóa. ạ ư ượ ươ
Thành t u v GMO ự ề Thành t u v GMO ự ề
ố t c ệ ỏ
• Lúa kháng thu c di • Lúa ch a ít acid Phytic ứ • Ch a nhi u beta-caroten ề • G o vàng ngăn ng a s ừ ự
thi u h t vitamin. ứ ạ ế ụ
ế ụ ễ ắ t đ ệ ượ
ấ
ễ ẽ ế
• B p GM giúp tuy n trùng di c sâu đ c r • Cây phát ra tín hi u b ng ệ ằ h p ch t bay h i thu hút ơ ợ côn trùng • Sâu ăn r s ti t ra E-beta-carophyllene đ ể h p d n tuy n trùng ế ấ ẫ
Thành t u v GMO ự ề Thành t u v GMO ự ề
ế
các n ượ ướ ồ
t c , ệ ỏ ị
• Cây c i d u đ c bi n đ i gen ổ ả ầ ượ ng v i m c đích c i thi n ch t l ụ ấ ượ ệ ả ớ dinh d ng, đ c bi ng t là hàm l ượ ệ ặ ưỡ ch t béo hòa tan ấ • Đ c tr ng c khác ở c a châu Âu và Australia. Cây c i ả ủ c bi n đ i gen mang các d u đ ổ ầ ượ tính tr ng ch ng ch u thu c di ạ có hàm l ế ố ng ượ ố laurate và oleic acid cao. laurate và oleic acid cao.
S ti p nh n TG v GMO ự ế S ti p nh n TG v GMO ự ế ề ề ậ ậ
S ti p nh n TG v GMO ự ế S ti p nh n TG v GMO ự ế ề ề ậ ậ
ữ ệ ể ố ộ
Tuy nhiên, có nh ng qu c gia, đ c bi minh Châu Âu (EU) l ố i r t dè d t trong vi c đ a vào s d ng ạ ấ t là các qu c gia phát tri n thu c liên ử ụ ệ ư ặ ặ
S ti p nh n TG v GMO ự ế S ti p nh n TG v GMO ự ế ề ề ậ ậ
ị
ng m i c đã thông qua Ngh đ nh th Cartagena, đã ị ạ ư ể ươ ự ệ ệ ấ
- Tuy nhiên, sau khi 133 n xu t hi n m t s xu h ướ cây tr ng và s n ph m bi n đ i gene. ẩ ướ ng tích c c trong vi c phát tri n và th ế ộ ố ả ổ ồ
ố
c châu Âu cu i cùng đã đ ng ý nh p kh u s n ph m bi n đ i ổ c dán ẩ ả ồ t c các s n ph m này ph i đ ẩ ẩ ế ả ượ ệ ấ ả ậ ả ề ớ
- Các n ướ gene c a Hoa Kỳ, v i đi u ki n t ủ nhãn.
ấ
ẩ ế ả ẩ ự ổ ị
- Các B tr ng nông nghi p EU đã nh t trí quy đ nh, các s n ph m có ị ệ ộ ưở thành ph n bi n đ i gene d i 0.9% không b coi là th c ph m bi n đ i ế ổ ướ ầ gen và không c n ph i dán nhãn. ầ ả
L i ích và t m quan trong c a c a GMO L i ích và t m quan trong c a c a GMO ủ ủ ủ ủ ợ ợ ầ ầ
ng th c trên th gi ự ươ ng th c và h giá thành l ạ ươ ự i ế ớ
ả ả ồ
ầ ả
ng ệ
ườ ng khí gây hi u - Đ m b o an ninh l ả - B o t n đa d ng sinh h c ọ ạ - Góp ph n xoá đói gi m nghèo - Gi m tác h i c a các ho t đ ng nông nghi p đ i v i môitr ạ ộ ạ ủ - Gi m thi u tác h i c a bi n đ i khí h u và gi m l ế ố ớ ượ ả ạ ủ ả ả ể ậ ổ ệ
ng nhà kính (GHG) ứ
ệ ọ
- Tăng hi u qu s n xu t nhiên li u sinh h c ấ - Góp ph n n đ nh các l i ích kinh t ệ ầ ổ ả ả ị ế ợ
Tác h i c a GMO ạ ủ
Đ i v i s c kh e con ng Đ i v i s c kh e con ng ố ớ ứ ố ớ ứ ỏ ỏ i ườ i ườ
ọ ề ề ạ
n nhi u nguy c nh h ư ả
ề ị ứ
ấ
đ ộ c ề ỉ ượ s chuy n ể ữ ỏ ượ ằ c t ượ ừ ự ứ
GMO, theo nhi u nhà khoa h c th gi ự ế ớ ng lâu dài t ỏ ộ ơ ả ẩ ưở gây d ng, làm nh n kháng sinh, có th t o ra đ c t ộ ố ờ c th ... Đây là m t trong nh ng tranh lu n ch y u và v n đ ch đ ơ ể ủ ế ộ tháo g khi ch ng t ả ỡ ị ứ đ i gene không ph i là ch t gây d ng ả ổ i, thì lo i th c ph m này cũng ti m ẩ i s c kh e c ng đ ng, nh kh năng ồ ớ ứ và gây đ c lâu dài cho ể ạ ậ c r ng s n ph m protein có đ ẩ ấ
ạ ủ
Tác h i c a GMO Đ i v i đa d ng sinh h c ạ Đ i v i đa d ng sinh h c ạ ố ớ ố ớ ọ ọ
Nguy c có th phát tán nh ng gene bi n đ i sang h hàng ơ ể ế ọ ổ
ủ
ố ị
ơ ệ ố ớ ố ớ ặ ả ộ ủ ữ
ữ hoang dã c a chúng, sang sâu b nh có nguy c làm tăng tính kháng ệ t c ho c c a chúng đ i v i đ c tính ch ng ch u sâu b nh, thu c di ệ ỏ ặ ố ủ làm tăng kh năng gây đ c c a GMC đ i v i nh ng loài sinh v t có ậ ích.
ồ
ả ướ t các lo i côn trùng ạ ng đ n chu i th c ăn ỗ ưở ế
ả ư ưở ệ ứ ả ng đ n đa d ng sinh h c nói chung. Vi c tr ng ọ ệ ạ ồ
nh vi c ph bi n r ng rãi m t s gi ng năng su t ng t ự ư ệ ổ ế ộ ộ ố ố ươ ấ
ệ ạ ả
ấ và h sinh thái c a vi sinh Cây tr ng kháng sâu có kh năng tiêu di h u ích khác nh ong, b m, v.v... làm nh h ữ t nhiên, nh h ế ự GMC đ i trà, t ạ cao trên di n tích r ng l n, s làm m t đi b n ch t đa d ng sinh h c c a ấ ớ ẽ ng đ n chu trình nit vùng sinh thái, nh h ưở ọ ủ ủ ộ ả ế ệ ơ
v t đ t. ậ ấ
Tác h i c a GMO ạ ủ
Đ i v i môi tr Đ i v i môi tr ng ng ố ớ ố ớ ườ ườ
ơ ầ ệ ả
Nguy c đ u tiên là làm m t cân b ng h sinh thái và làm gi m tính đa ằ ấ d ng sinh h c c a loài cây đ ọ ủ ạ c chuy n gene ể ượ
t c có ệ ỏ ệ
ơ ứ ể ụ ấ ớ ố ầ
Nguy c th hai là vi c GMC mang các gene kháng thu c di th th ph n v i các cây d i cùng loài hay có h hàng g n gũi, làm lây lan gene kháng thu c di t c trong qu n th th c v t. ầ ọ ể ự ậ ạ ệ ỏ ố
cây tr ng vào các vi ơ ố ừ ệ ồ
Nguy c cu i cùng là vi c chuy n gene t khu n trong đ t. Tuy nhiên, kh năng x y ra đi u này là vô cùng nh ả ể ả ề ẩ ấ ỏ
D ÁN ỰD ÁN Ự CÂY DÂU TÂY ( Fragaria vesca L.) Ở CÂY DÂU TÂY ( Fragaria vesca L.) Ở Ẩ Ẩ
CHUY N N P GEN Ạ Ể CHUY N N P GEN Ạ Ể NH VI KHU N Agrobacterium tumefaciens NH VI KHU N Agrobacterium tumefaciens Ờ Ờ K T H P X LÝ SÓNG SIÊU ÂM K T H P X LÝ SÓNG SIÊU ÂM Ế Ợ Ử Ế Ợ Ử
i thi u i thi u Ph n Gi ầ Ph n Gi ầ ớ ớ ệ ệ
i Pháp du nh p vào Vi ườ ệ ậ
vesca L., là k t qu c a s lai gi ng gi a t Nam đ u nh ng năm 1930, ữ ầ ố ả ủ ự ữ ế
ộ
-Cây dâu tây do ng có tên khoa h c là Fragaria ọ (Fragaria chiloens is Duch và Fragaria virginiana Duch) thu c nhóm hai lá m m, h Rosacea. ọ ầ
thi t y u cho con ng ầ ả ố ế ế
ị i nh A, B1, B2 và đ c bi ứ t là sinh t ề C. - Trong ph n th t qu dâu tây có ch a nhi u sinh t ặ ườ ư ệ ố
c ch n và ọ ạ
ượ ỹ ươ ươ ư ậ ở
ng m i cao đã đ Lâm Đ ng nh dòng M Đá, M H ng (nh p ỹ ủ ậ ả ứ
- Do đó, nh ng dòng dâu tây mang tính th ữ tri n khai canh tác đ i trà ồ ạ kh u b i các Công ty nghiên c u gi ng), dòng HO c a Nh t B n (Phân ố Vi n Sinh h c Đà L t)… ọ ể ẩ ở ệ ạ
Ph n Nguyên li u Ph n Nguyên li u ệ ệ ầ ầ
ấ ạ ọ
ả c (1x1) ỹ nhân gi ng in vitro đ ố ướ ạ ớ
- Gi ng dâu M Đá do Phân vi n Sinh h c Đà L t cung c p. M nh lá dâu ố tây t ừ cm, dùng làm nguyên li u đ chuy n n p gen. ệ ệ c c t theo d ng đĩa v i kích th ượ ắ ể ể ạ
nuôi c y: khoáng ng ườ ấ ngượ (Murashige và Skoog,
đa l - Môi tr 1962), vitamin B5 (Gamborg, 1968), đ ng 30g/l, pH 5,8. ngượ , vi l ườ
ng: ấ ưở
ề + TDZ (Thidiazuron), +2,4-D (2,4 Dichlorophenoxyacetic acid). ứ ẩ
ng AB (Chilton, ắ ẩ ỉ
- Ch t đi u hòa sinh tr - Dòng vi khu n Agrobacterium tumefaciens ch a plasmid pCAMBIA 2301, mang gen nptII mã hóa enzyme neomycine phosphotransferase, gen ch th gusA. ị 1974), ch a kh áng sinh ch n Nuôi l c vi khu n qua đêm trên môi tr ọ ọ l c kanamycin n ng đ 50mg/l. ườ ộ ứ ồ
Ph Ph ng pháp nghiên c u ng pháp nghiên c u ươ ươ ứ ứ
ng pháp chuy n n p gen nh vi khu n Agrobacterium tumefaciens ng pháp chuy n n p gen nh vi khu n Agrobacterium tumefaciens ẩ ẩ ờ ờ ể ạ ể ạ
c ngâm chung v i vi khu n trong 20 ượ ẩ ớ
ằ
ượ ử ừ c x lý b ng sóng siêu âm trong 3 giây hãng Elma, sau đó ngâm chung v i ớ
Ph ươ Ph ươ ửx lý sóng siêu âm ế ợ x lý sóng siêu âm k t h p ử k t h p ế ợ - Thí nghi m 1: đĩa lá (1x1) cm đ ệ phút. - Thí nghi m 2: đĩa lá (1x1) cm đ ệ b ng thi t b siêu âm Transsonic 660 t ế ị ằ vi khu n trong 20 phút. ẩ
ẩ
c nuôi c y chung v i vi khu n 2 ngày trên ng TDZ ẫ ừ ườ thí nghi m 1 và 2 đ ệ ng tái sinh ch i có b sung t ồ ớ h p ch t đi u hòa sinh tr ề ưở ấ
- M u t môi tr 1,5mg/l và 2,4-D 0,2 mg/l (vi ấ ổ ợ t MSDT). ượ ổ t t ế ắ
ướ ấ
ượ ử ạ ng tái sinh ch i nh trên, có b sung kháng sinh di c c t vô trùng, và chuy n sang ệ ề ầ ằ ư ể t khu n ẩ ồ
- Đĩa lá đ môi tr ườ Cefotaxime 500mg/l và kháng sinh ch n l c mô chuy n gen kanamycin 20mg/l. C y truy n sang môi tr ể ng m i 2 tu n/l n. c r a s ch nhi u l n b ng n ổ ọ ọ ớ ầ ầ ườ ề ấ
0C
Ph Ph ng pháp nghiên c u ng pháp nghiên c u ươ ươ ứ ứ
ấ ệ ệ ộ
ộ
- Đi u ki n nuôi c y: nhi t đ 25 - Th i gian chi u sáng 12g/ngày. ế - C ng đ chi u sáng 3.000 lux. ế - M i công th c thí nghi m g m 50 m u lá, l p l ệ ề ờ ườ ỗ ứ ẫ ồ ặ ạ i thí nghi m 3 l n. ệ ầ
Ph Ph ươ ươ ng pháp phân tích s hi n di n c a gen chuy n n p ể ạ ng pháp phân tích s hi n di n c a gen chuy n n p ể ạ ệ ủ ệ ủ ự ệ ự ệ
ồ
ị ỉ qua đêm ằ 0C. - Hóa mô: ki m tra gen ch th gusA b ng cách ngâm ch i con trong ể 37 Gluc. dung d ch X- ị Ủ ở
t DNA nhi m ễ s c th ắ ể ế
ng pháp c a Dellaporta (1983) và s d ng c p m i (primer) ặ ồ ươ ử ụ ủ
ệ
- PCR (Polymerase Chain Reaction): tách chi ừ mô lá theo ph t đ c hi u cho gen kháng kháng sinh kanamycin (nptII): ặ * Primer (f): 5 ACA CGC TGA AAT CAC CAG TCT C 3 * Primer (r): 3 CTC GTC CTG CAG TTC ATT C 5
0C / 1 phút
0C / 1 phút
0C / 2 phút
ở ầ
0C / 7 phút
* Kh i đ u - 940C/5phút trong 35 chu kỳ - Tách s i DNA : 94 ợ - G n m i: 55 ồ - T ng h p DNA: 72 ợ * K t thúc: 72 ắ ổ ế
K T QU VÀ TH O LU N K T QU VÀ TH O LU N Ậ Ậ Ả Ả Ả Ả Ế Ế
ử
ng do b c ch m nh b i kháng sinh kanamycin ở ẩ ộ
ố ị ứ h hình thái ch i không di n ra. Đa ph n mô s o h ình thành ngay n ng đ 20mg/l, nên ở ồ ẹ ứ ế ạ ồ ễ ầ
- Các đĩa lá đ i ch ng (không x lý v i sóng siêu âm và vi khu n) trên môi ớ tr ườ s phát sin ự ấ . v t c t, hóa nâu ch t sau 45 ngày nuôi c y ế ắ ế
ủ ở ồ ả
ẫ
n ng đ 20mg/l lên kh năng tái c ướ ng ộ ồ ủ ể h p ch t đi u h òa sinh tr ề ộ ẫ ử ấ ổ ợ
ườ ể
ẫ ử ệ
c trên môi n cu ng lá, rìa lá xung quanh v t c t đĩa lá, d n hóa nâu và ch t. ế ắ ồ ấ
ng ch a kháng sinh ch n l c. - Tác đ ng c a kháng sinh kanamycin sinh ch i c a m u lá đã x lý chuy n gen và m u x lý sóng siêu âm tr ử ể ng b sung t khi chuy n gen trên môi tr ưở ổ ườ TDZ, 2,4-D sau 45 ngày: ng MSDT cho th y s tăng sinh mô + M u x lý chuy n gen trên môi tr ấ ự s o rõ r t trê ế ầ ố ẹ Ch thu nh n duy nh t 1 m u lá tái sinh ch i và phát tri n đ ể ượ ẫ tr ọ ọ ỉ ườ ậ ứ
ườ
ẫ ử ự c và chuy n gen sau đó trên môi tr ướ ồ ấ
ng ể v trí cu ng lá, rìa lá. S ơ ố ệ ở ị ng ch n l c sau 45 ọ ọ ườ ậ ẫ ồ
+ M u x lý sóng siêu âm tr MSDT, s phát sinh hình thái ch i xu t hi n kh i thu nh n 2 m u lá tái sinh ch i trên môi tr ở ngày.
: T n s tái sinh ch i c a thí nghi m 1 và 2 trên môi tr ng ch n ầ ố ệ ườ ọ
B ng 1ả l c ch a kanamycin n ng đ 20 mg/l sau 45 ngày ứ ọ ồ ủ ộ ồ
ng nuôi
T l
tái sinh ch i
ố ẫ
ỉ ệ
ồ
ườ c y MSDT
(%)
Môi tr ấ
S m u lá thí nghi mệ
S m u lá tái ố ẫ sinh ch iồ
150
1
0,66
Thí nghi m 1ệ
150
2
1,33
Thí nghi m 2ệ
v trí cu ng lá
ồ ở ị
ể ố
ẫ ử ể
ồ ở
ấ ẫ ng MSDT+ ườ
ể v trí cu ng lá ố
ồ ở ị
Hình 1: M u nuôi c y trên môi tr kanamycin 20 mg/l sau 45 ngày A. M u đ i ch ng ứ ố ẫ B. M u x lý chuy n gen tái ẫ ử sinh ch i C. M u x lý sóng siêu âm và chuy n gen tái sinh ch i v trí rìa lá. ị D. M u x lý chuy n gen tái ẫ ử sinh ch i
c sóng siêu âm: c sóng siêu âm: - K t qu phân tích m u chuy n gen có x lý tr ẫ - K t qu phân tích m u chuy n gen có x lý tr ẫ ử ử ế ế ể ể ả ả ướ ướ
ả ế ự ể
ẩ S bi u hi n t m th i c a gen gusA thông qua ph ờ ủ ng pháp hóa mô ệ ạ ươ
K t qu đo gen kháng kanamycin (nptII). TC: Thang chu n DNA (1kb). 0: Plasmid pCAMBIA 2301. 1: M u không chuy n gen. ể 2,3: M u chuy n gen ẫ ẫ ể
K T LU N K T LU N Ậ Ậ Ế Ế
c kanamycin đ 20 mg/l ở ộ
ng t ộ ố ồ in vitro kháng đ ượ ái sinh b sung TDZ 1,5mg/l, 2-4D 0,2mg/l, thông qua
ng ph áp chuy n gen nh vi khu n ẩ Agrobacterium k t h p x lý ế ợ ử ể ờ
gusA. ả óa mô cho th y s hi n di n c a gen ấ ự ệ ệ ủ ế
- Đã thu nh n m t s ch i ậ trên môi tr ổ ườ ph ươ sóng siêu âm. - K t qu h - Gen npt II mã hóa cho enzyme neomycine phosphotransferase, t o tạ ính kháng kanamycin đã đ c ki m tra b ng k thu t PCR. ượ ể ằ ậ ỹ
