K THU T ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENTỸ Ậ
ASSAY) TRONG XÁC Đ NH CH NG MYCOBACTERIA VÀỊ Ủ
TRONG CH N ĐOÁN SÀNG L C B NH LAO I. NGUYÊNẨ Ọ Ệ
T C: K thu t ELISAẮ ỹ ậ
K THU T ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) Ỹ Ậ
TRONG XÁC Đ NH CH NG MYCOBACTERIA Ị Ủ
VÀ TRONG CH N ĐOÁN SÀNG L C B NH LAO Ẩ Ọ Ệ
I. NGUYÊN T C:Ắ
K thu t ELISA s d ng kháng th đ c hi u đ xác đ nh kháng nguyên – tác nhân gây b nh trong nuôiỹ ậ ử ụ ể ặ ệ ể ị ệ
c y s m ho c tr c ti p trong b nh ph m b nh nhân và ng c l i, s d ng kháng nguyên đã bi t đấ ớ ặ ự ế ệ ẩ ệ ượ ạ ử ụ ế ể
phát hi n kháng th đ c hi u trong huy t thanh ho c d ch ti t c a c th b nh nhân, qua đó đánh giáệ ể ặ ệ ế ặ ị ế ủ ơ ể ệ
đ c tình tr ng nhi m b nh c a c th . Ph c h p kháng nguyên-kháng th s đ c nh n bi t b iượ ạ ễ ệ ủ ơ ể ứ ợ ể ẽ ượ ậ ế ở
c ng h p kháng huy t thanh t ng ng g n v i enzyme peroxidaza ho c phosphataza… gây chuy n m uộ ợ ế ươ ứ ắ ớ ặ ể ầ
c ch t phù h p. K t qu ph n ng đ c đo b ng thi t b đo quang ph và thông qua đ đ m đ c khácơ ấ ợ ế ả ả ứ ượ ằ ế ị ổ ộ ậ ặ
nhau c a m u s c mà đánh giá m c đ ph n ng c a m u xét nghi m.ủ ầ ắ ứ ộ ả ứ ủ ẫ ệ
II. NGUYÊN V T LI U C B N:Ậ Ệ Ơ Ả
1. Máy đ c ELISAcó b c sóng 450nmọ ướ
2. B n nh a 96 gi ng đáy ph ng(c a hãng NUNC, Denmark )ả ự ế ẳ ủ
3. Pipetman lo i20, 200, 1000 microlit và đ u côn t ng ngạ ầ ươ ứ
4. Kháng nguyên Mycobacterium tuberculosis
5. Huy t thanh b nh nhân: l y kho ng 2mlmáu c a b nh nhân ch t l y huy t thanh b o qu n –20ế ệ ấ ả ủ ệ ắ ấ ế ả ả ở 0
C.
6. Dung d ch đ m g nb n: PBS, pH=7,2ị ệ ắ ả
Thành ph n c a PBS:ầ ủ - Na2HPO4 12 H2O = 1,72g
Ho c Naặ2HPO4 2 H2O = 0,85gr
- KH2PO4 = 0,254 gr
- NaCl = 8,5gr
- N c c t 2 l nướ ấ ầ = 1000 ml
7. Dung d ch đ m r a b n: PBS -Tween 0,05 % ( PBS-T),ị ệ ử ả pH= 7,2
Thành ph n c a PBS-T 0,05%: Hoà tan 500 ul Tween 20 trong 1000 ml PBS.ầ ủ
8. Dung d ch c ch t TMB (Tetramethyl benzidine)ị ơ ấ
Thành ph n: ầ - TMB = 6 mg
- C n Ethanol 700 Cồ = 5ml
- Citrat buffer pH 5 = 5ml
- H2O2 = 5ml
9. C ng h p kháng huy t thanh dêộ ợ ế kháng IgM, IgG ng i có g n menườ ắ Peroxydaza(Sanofi Diagnostic,
Pasteur, Pháp).
10.C ng h p kháng huy t thanh dê kháng IgG th g n men peroxidaza (Sanofi Diagnostic, Pasteur, Pháp)ộ ợ ế ỏ ắ
11.Kháng huy t thanh th kháng ế ỏ M.tuberculosis(Sanofi Diagnostic, Pasteur, Pháp)
12.Kháng th đ n clôn kháng đ c hi u ể ơ ặ ệ M.tuberculosis ho c khángLipoarabinomannan (LAM)ặ
13.Dung d ch d ng ph n ng : Hị ừ ả ứ 2SO4 1N
14.Huy t thanh b nh nhân: l y kho ng 2mlmáu c a đ i t ng nghiên c u ch t l y huy t thanh, b oế ệ ấ ả ủ ố ượ ứ ắ ấ ế ả
qu n –20ả ở 0 C đ s d ng. ể ử ụ
III. QUY TRÌNH TH C HI N ELISAỰ Ệ
III.1 K thu t elisa tr c ti p đ nh lo i ỹ ậ ự ế ị ạ m t s mycobacteria gây b nhộ ố ệ
Nguyên t c: S d ng các kháng th đ n clôn đ c hi u v i ch ng Mycobacteria đ nh n bi t ch ngắ ử ụ ể ơ ặ ệ ớ ủ ể ậ ế ủ
t ng ng phân l p t b nh ph m b nh nhân. ươ ứ ậ ừ ệ ẩ ệ
III.1.1. Chu n b h n d ch vi khu n ph b n:ẩ ị ỗ ị ẩ ủ ả
- Nuôi c y m u b nh ph m c a b nh nhân trên môi tr ng Lowenstein trong 8 tu n 37ấ ẫ ệ ẩ ủ ệ ườ ầ ở 0C
- L y m t l ng vi khu n t khu n l c m c trên môi tr ng b ng kho ng 1/3 -1/2 ấ ộ ượ ẩ ừ ẩ ạ ọ ườ ằ ả vòng tròn đ uầ
que c y, hoà đ u trong 0,35 ul PBS. V i ch ng chu n cũng ti n hành t ng tấ ề ớ ủ ẩ ế ươ ự
- Đun nóng h n d ch vi khu n 80ỗ ị ẩ ở oC trong 5 phút đ gi t vi khu nể ế ẩ
- Nghi n (sonicate) s b h n d ch trong 3 giây đ làm tan c m vi khu n trong h n d chề ơ ộ ỗ ị ể ụ ẩ ỗ ị