Lai ADN – Phần 4
+ Phân tích RELPs với kỹ thuật lai ADN.
Giới thiệu phương pháp:
Như đã trình bày, sự phức tạp trong kỹ thuật RELP đã tạo ra những khó khăn
cho việc xác định các tác nhân gây bệnh trong các nghiên cứu về dịch tễ học. Điều
này còn khó khăn và phức tạp hơn trong khi so sánh các kết quả thu được trên các
bản gel khác nhau hoặc tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Nguyên nhân là do số
lượng các băng ADN lớn tới mức không thể xác định kích thước của chúng hay
các băng thu được không lặp lại các kết quả nghiên cứu.
Mặc dù vậy, theo phương pháp này các phổ ADN phức tạp sau khi xử lý với
enzym cắt hạn chế sẽ được làm biến tính và chuyển lên màng nitroxenluloza hay
nylon. Màng sẽ được lai với mẫu dò thích hợp, kết quả phổ phép lai sẽ rõ và
không quá phức tạp do nó chỉ hiển thị các mảnh ADN bắt cặp với mẫu dò. Với
một số lượng không lớn các mảnh hiển thị thu được sau phép lai sẽ cho phép xác
định được chính xác hơn về kích thước. Điều này làm cơ sở cho so sánh giữa các
gel với nhau cũng như kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau.
Khi sử dụng phương pháp này cần chú ý một số mẫu dò sau:
1, Mẫu dò có thể là đoạn RNA ribosom từ một loài sinh vật nào đó: ví dụ
rRNA của E.coli có thể được các công ty thương phẩm cung cấp (Boeringer
Mannheim), đây là mẫu dò khá thuận lợi và được đánh dấu phóng xạ hay với các
cơ chất huỳnh quang. Ưu điểm chính của mẫu dò này ở chỗ phần RNA là đoạn
khá bảo thủ do đó mẫu dò có thể dùng lai với các sản phẩm xử lý enzym cắt hạn
chế của nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Có một số loài khi lai với mẫu dò chỉ cho
một kết quả giống nhau trong khi đó ở loài khác khi lai các chủng với mẫu dò thì
lại thu được kết quả khác nhau. Đây là cơ sở cho phương pháp ribotyping.
2, Mẫu dò có thể là đoạn ADN ngẫu nhiên có chức năng không xác định
(Tompkins et al., 1986). Mẫu dò này thường được dùng cho các loài có chứa chính
các đoạn ADN này. Sử dụng các mẫu dò này đôi khi rất có ý nghĩa trong việc phân
biệt các mẫu sau khi tiến hành phương pháp ribotyping (Saunders et al., 1990).
3. Một cách khác nữa cũng được dùng là sử dụng mẫu dò là một đoạn ADN
tách dòng từ một gene đã biết. Ví dụ dùng đoạn gene mã hoá cho độc tố ngoại bào
(exotoxinA) sử dụng để định typ Pseudomonas aeruginosa (Ogle et al., 1987).
Mẫu dò dùng gene mã hoá cho độc tố Cholera được dùng để xác định các typ cho
các chủng thuộc họ phảy khuẩn sinh độc tố (Yam, Li Lung & Ng, 1989). Việc sử
dụng bất kỳ loại mẫu dò nào cũng tạo ra phổ đặc trưng của phép lai có ý nghĩa cho
so sánh giữa các chủng với nhau.
Hạn chế chính của kỹ thuật này ở chỗ kết quả thu nhận chỉ khu trú phần gene
bắt cặp với mẫu dò mà không đặc trưng cho cả hệ gene.
Bảng 1.6. Kết quả thu được khi thực hiện kỹ thuật RFLP với dùng các mẫu dò
không phải là ribosom.
Đối tượng Tác giả nghiên cứu và tài liệu dẫn
Aeromonas spp Altwegg an Luthyhottenstein (1991)
Borrelia burgorferi Wallich et al (1992)
Candida albicans Schmid et al (1992)
Chlamydia trachomatis Scieux et al (1992)
Corynebacterium diphtheriae Groman et al (1993)
Cryptococcus noeformans Spitzer (1992)
Escherichia coli Bohm ADN Karch (1992)
Hemophilus influenzae Forbes et al (1992)
Histoplasma capsulatum Leathet al (1992)
Lactobacillus helveticus Delostreyesgavilan et al (1992)
Mycobacterium tuberculosis Mazurek et al (1991)
Pseudomonas aeruginosa Tompkins(1991)
Salmonella spp Sodati ADN Piffaretti (1991)
Staphylococcus aureus Goh et al (1992)
- Kỹ thuật ribotyping:
Như đã trình bày ở trên mọi mẫu dò đều cho các kết quả có sức thuyết phục
tuy nhiên kỹ thuật dùng mẫu dò là đoạn RNA của ribosom đã đưa ra một cách tiếp
cận mới trong nghiên cứu dịch tễ phân tử với các vi khuẩn có sự khác biệt lớn
trong khi đó các mẫu dò khác chỉ giới hạn với một loài hay chỉ có ý nghĩa cho các
chủng trong cùng một loài. Kỹ thuật này lần đầu tiên được Grimont mô tả năm
1986 và nhanh chóng trở thành phương pháp hữu hiệu hiện nay cho nghiên cứu
dịch tễ học vi sinh vật ở mức độ phân tử.
Tính hợp lý cho việc sử dụng kỹ thuật này là ở chỗ gene mã hoá cho RNA
ribosom có độ bảo thủ cao. Cũng có thể phát hiện thấy những thay đổi chút ít
trong quá trình tiến hoá đối với các chuỗi ADN trong các vi khuẩn nghiên cứu.
Gene RNA ribosom được tổ chức thành các operon mà các gene riêng rẽ mã cho
các RNA kích thước 5S, 16S và 23S chúng được cách nhau bằng các đoạn ADN
spacer không mã cho gene nào. Nếu dùng mẫu dò hỗn hợp giữa 16S và 23S thì kết
quả phép lai sẽ hiển thị các mảnh tương ứng với phần của gene này trong khi dùng
mẫu dò là đoạn của các gene đã được tách dòng có thể đưa đến kết quả hiển thị cả
phần gene tương đồng và chuỗi spacer. Như vậy sự khác nhau của kết quả phụ
thuộc vào loại mẫu dò sử dụng.
- Yêu cầu kỹ thuật:
Để thu được kết quả tối ưu cần có các yêu cầu kỹ thuật cụ thể cho từng bước
thực hiện.
Đầu tiên là phải tạo ra được phổ dấu vân tay thu được sau khi xử lý mẫu
với enzym cắt hạn chế. Phổ vân tay tối ưu khi các mảnh cắt phải được tách