Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Đánh giá khả năng chống oxi hóa, kháng viêm trên mô hình chuột Swiss của cao chiết thực vật từ một số bài thuốc trị Gout cổ truyền

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

N u n T n

Đ NH GI KHẢ N NG CH NG OXI H A KH NG VIÊM TRÊN M H NH CHU T SWISS CỦA CAO CHI T T M T S THỰC V T TRONG

C C I THU C TR GOUT CỔ TRUY N

LU N V N THẠC SĨ KHOA HỌC

H N I - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

N u n T n

Đ NH GI KHẢ N NG CH NG OXI H A KH NG VIÊM TRÊN M H NH CHU T SWISS CỦA

CAO CHI T T M T S THỰC V T TRONG C C I THU C TR GOUT CỔ TRUY N

Chuy n ng nh: Sinh học th c nghi m Mã số: 8420101.14

LU N V N THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ ƣớn dẫn: TS. Đỗ Min Hà

H N I - 2020

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Minh Hà, người thầy đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Trịnh Hồng Thái, TS. Trịnh Tất Cường đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất cũng như tinh thần trong suốt quá trình tôi học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Lưu Thị Thu Phương BM Sinh lý học và sinh học người, Th.S. Nguyễn Thị Vân Khánh BM Sinh học Tế bào, CN Dương Đức

Thiện đã luôn giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, anh chị và các bạn sinh viên đã và đang làm việc và học tập tại Phòng Proteomic và Sinh học cấu trúc

thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzyme và Protein và Bộ môn Sinh

lý học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội vì đã giúp đỡ,

hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công

nghệ Enzyme và Protein, và Trung tâm Khoa học Sự sống, Khoa sinh học, PTN Hóa dầu, Khoa Sinh học và TT Khoa học vật liệu, Khoa Vật lý trường Đại học Khoa học

Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp tôi trong hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn toàn thể các anh chị và các bạn học viên lớp K26 cao học

Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè,

những người đã luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn này.

Tôi xin cảm ơn đề tài QG.18.11 đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu này.

Hà Nội, tháng 02 năm 2020

Học viên

Nguyễn Thị Ân

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1

Ch ng 1: T NG QUAN ........................................................................................... 3

1.1. nh gout ......................................................................................................... 3

1.1.1. Khái quát chung về b nh gout ................................................................... 3

1.1.2. Nguy n nhân v biểu hi n lâm s ng .......................................................... 3

1.1.2.1. Nguyên nhân ...................................................................................... 3

1.1.2.2. iểu hi n lâm s ng: ............................................................................ 4

1.1.3. C chế sinh b nh: ...................................................................................... 5

1.1.3.1. C chế hình th nh acid uric ............................................................... 5

1.1.3.2. C chế gây vi m bởi MSU ở b nh Gout ............................................ 8

1.1.3.3. ROS v qu trình ho t h a th thể vi m NLRP3 ............................. 10

1.1.4. C c h ớng điều trị hi n t i d a tr n c chế phân tử của b nh ................ 11

1.1.4.1. C c chất ức chế Xanthine oxidase ................................................... 11

1.1.4.2. C c thuốc uricosuric – Thuốc lợi tiểu .............................................. 11

1.1.4.3. C c thuốc kh ng vi m ...................................................................... 11

1.2. Điều trị gout trong y học c truyền ................................................................ 12

1.2.1. C c b i thuốc dân gian dùng trong điều trị Gout ..................................... 12

1.2.2. Một số lo i d ợc li u trong c c b i thuốc Nam đ ợc sử d ng trong điều

trị gout ........................................................................................................... 13

1.2.2.1. G m Gnetum parvifolium) .............................................................. 13

1.2.2.2. T a t Perilla ocymoides L) ............................................................ 14

1.2.2.3. Dâu tằm Morus alba) ...................................................................... 15

1.3. C c hợp chất t nhi n trong điều trị gout ...................................................... 16

1.3.1. Alkaloid ................................................................................................... 16

1.3.2. Phenolic ................................................................................................... 18

Ch ng 2: NGUY N LI U VÀ PH NG PH P .................................................. 21

2.1. Nguy n li u .................................................................................................... 21

2.1.1. V t li u nghi n cứu .................................................................................. 21

2.1.2. H a chất ................................................................................................... 23

2.1.3. Thiết bị ..................................................................................................... 24

2.2. Ph ng ph p: ................................................................................................. 25

2.2.1. T ch chiết m u d ợc li u: ....................................................................... 25

2.2.2. S c ký bản mỏng Thin Layer Chromatography - TLC) ......................... 26

2.2.3. Ph ng ph p s c k lỏng ph khối l ợng Liquid chromatography - Mass

spectrometry – LC - MS) .................................................................................. 27

2.2.4. Định l ợng khả năng chống oxi h a t ng số bằng ph ng ph p quét gốc

t do DPPH [42] ................................................................................................ 28

2.2.5. Gây b nh tr n m hình chuột Swiss v thử nghi m thuốc tr n chuột ..... 29

2.2.6. Đ nh gi tình tr ng vi m tr n chuột th nghi m ...................................... 29

2.2.7. Đ nh gi tình tr ng stress oxi h a tr n chuột th nghi m ........................ 31

2.2.7.1. Đ nh gi t nh tr ng stress oxi h a ở m u gan [56] ........................ 31

2.2.7.2. Đ nh gi t nh tr ng stress oxi h a ở m u m u [56] ....................... 32

2.2.8. Phân t ch số li u ....................................................................................... 33

Ch ng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 34

3.1. Đ nh giá kết quả t ch chiết c c m u d ợc li u .............................................. 34

3.1.1. X c định thành phần có trong dịch chiết d a vào ph hấp th ............... 34

3.1.2. X c định thành phần có trong các dịch chiết bằng ph ng ph p S c ký

bản mỏng (TLC):............................................................................................... 36

3.1.3. X c định th nh phần c trong c c cao chiết bằng ph ng ph p Thin layer

chromatography (TLC): .................................................................................... 38

3.1.4. Đ nh gi khả năng chống oxy h a của c c m u dịch chiết ..................... 39

3.1.5. Định danh một số ho t chất c trong cao bằng ph ng ph p khối ph .. 39

3.2. Đ nh gi kết quả xây d ng m hình động v t bị gout................................. 42

3.2.1. Chỉ số hình th i ....................................................................................... 42

3.2.2. Đ nh gi tình tr ng vi m của m hình động v t khi đ ợc gây gout bởi

MSU ........................................................................................................... 45

3.3. Đ nh gi t c động của cao chiết l n động v t ............................................. 46

3.3.1. Chỉ số hình th i ....................................................................................... 46

3.3.2. Đ nh gi tình tr ng vi m của chuột khi uống cao chiết .......................... 48

3.3.3.Đ nh gi t c động của cao chiết đối với c c c quan chuột .................... 49

3.4. Đ nh gi t c động của cao chiết l n m hình động v t gout ....................... 49

3.4.1. Chỉ số hình th i ....................................................................................... 50

3.4.2. Đ nh gi tình tr ng stress oxy h a ở m hình chuột bị gây b nh gout khi

đ ợc thử nghi m uống cao chiết ....................................................................... 53

3.4.2.1. Đ nh gi h m l ợng MDA trong m u ........................................... 53

3.4.2.2. Đ nh gi h m l ợng MDA trong m u m gan .............................. 54

3.4.2.3. Đ nh gi h m l ợng MDA trong m u m c chân tr i, chân phải55

3.4.3. Đ nh gi tình tr ng vi m của m hình chuột bị gây b nh gout khi đ ợc

thử nghi m uống cao chiết ................................................................................ 58

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 60

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 61

TÀI LI U THAM KHẢO ......................................................................................... 62

DANH MỤC H NH

Hình 1. C chế hình th nh acid uric............................................................................ 6

Hình 2. C chế t c động của MSU ............................................................................. 8

Hình 3. G m Gnetum parvifolium) [6] .................................................................... 14

Hình 4. Tía tô (Perilla ocymoides L.) [6] ................................................................. 15

Hình 5. Dâu tằm Morus alba) [6] ............................................................................ 16

Hình 6. Ho t t nh chống vi m của một số lo i alkaloids [72] .................................. 18

Hình 7. ản ch y s c ký bản mỏng TLC .................................................................. 26

Hình 8. S đồ cấu t o đ n giản của h thống khối ph ............................................ 28

Hình 9. Ph hấp th của dịch chiết ........................................................................... 35

Hình 10. S c ký đồ TLC của một số dịch chiết với h dung m i TEAF .................. 37

Hình 11. S c ký đồ TLC của một số dịch chiết với h dung m i CEF ..................... 37

Hình 12. ản s c ký th nh phần c trong dịch chiết, cao chiết T a t , Dâu tằm, G m

với h dung m i CEF ................................................................................................ 38

Hình 13. S c ký đồ khối ph ..................................................................................... 41

Hình 14. C c ho t chất c trong cao chiết ................................................................ 42

Hình 15. Chân chuột tr ớc v sau khi ti m MSU ..................................................... 43

Hình 16. C c c quan nội t ng chuột th nghi m ...................................................... 49

DANH MỤC IỂU ĐỒ

iểu đồ 1. Nồng độ IL-1β trong huyết thanh chuột tr n 3 nh m ĐC SH, ĐC Âm v

ĐC D ng ................................................................................................................. 45

iểu đồ 2.Nồng độ IL-1β trong huyết thanh chuột khi uống c c cao chiết .............. 48

iểu đồ 3.H m l ợng MDA trong m u chuột .......................................................... 54

iểu đồ 4.H m l ợng MDA trong m u m gan chuột ............................................. 55

iểu đồ 5. H m l ợng MDA trong m u m c chân chuột ...................................... 56

iểu đồ 6. H m l ợng MDA trong m u m c chân tr i chuột ............................... 57

iểu đồ 7. Nồng độ IL-1β trong huyết thanh của c c nh m chuột ........................... 58

DANH MỤC ẢNG

ảng 1. Ký hi u c c nh m chuột đ ợc sử d ng trong nghi n cứu .......................... 22

ảng 2. H a chất sử d ng trong nghi n cứu ............................................................ 23

ảng 3. Thiết bị đ ợc sử d ng trong nghi n cứu ..................................................... 24

ảng 4. Hi u suất chống oxy h a của c c m u dịch chiết ....................................... 39

ảng 5. Chỉ số cân nặng t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: gam) .............. 42

ảng 6. K ch th ớc chân chuột t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: mm3) . 44

ảng 7. Chỉ số cân nặng t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: gram) ............ 46

ảng 8. K ch th ớc chân chuột t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: mm3) . 47

ảng 9. Chỉ số cân nặng t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: gram) ............ 50

ảng 10. K ch th ớc chân chuột t i c c thời th nghi m Đ n vị t nh: mm) .......... 52

DANH MỤC T VI T TẮT

MSU Natri urat (monosodium urate)

UA Axit uric (uric acid)

SUA Axit uric huyết thanh

XOR xanthine oxidoreductase

XDH xanthine dehydrogenase

XO xanthine oxydase

NO nitric oxide

IL-1β Interleukin 1 beta

IL-8 Interleukin 8

TNFα Yếu tố ho t tử khối u α

CXCL-1 Chemokine ligand 1

IL-6 Interleukin 6

NLR Th thể d ng NOD (NOD-like receptor)

CPPD Calcium pyrophosphate dehydrate

TLRs Họ th thể d ng Toll (Toll-like receptor)

ROS Gốc t do chứa oxy

NSAIDs Thuốc chống viêm không steroid

HPLC S c ký lỏng hi u năng cao

TLC S c ký bản mỏng

MAPK mitogen-activated protein kinase

NF-κ Nuclear factor kappa B - Yếu tố nhân kappa B

MS Mass spectrometry - Ph ng ph p ph khối l ợng

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

MỞ ĐẦU

Gout l một b nh rối lo n chuyển h a l m tăng h m l ợng acid uric trong c

thể, biểu hi n bằng nh ng c n s ng đau d dội khớp, đặc bi t l khớp ng n chân c i. nh th ờng gặp ở c c n ớc ph t triển, chiếm 0,5 dân số, trong đ 95 l

nam giới t độ tu i 40-60 tu i. T i M , b nh gout đ ợc b o c o l một trong nh ng

b nh khớp ph biến ở độ tu i tr ởng th nh chiếm 3,9 ), theo c c nghi n cứu t i

Anh tỷ l gout đã tăng t 0,14 năm 1975 l n 1,4 năm 2005. Tỉ l m c b nh c xu h ớng gia tăng v trầm trọng h n do lối sống, chế độ ăn uống kh ng đ ợc kiểm

so t. T i Vi t Nam nh ng năm gần đây, cùng với s ph t triển về kinh tế v xã hội

tỉ l m c b nh gout ng y c ng gia tăng nhanh ch ng, đặc bi t l ở ng ời tr tu i,

b nh xuất hi n cả ở th nh thị v n ng th n, mức tu i ph biến đã nới rộng t 20-60

tu i.

Hi n nay c rất nhiều lo i thuốc Tây y đã v đang đ ợc sử d ng để điều trị

gout c t c d ng kh hi u quả nh : colchicin, allopuriol, probenecid,

glucocorticoid, c c thuốc kh ng vi m Tuy nhi n, do b nh c t nh chất m n t nh,

b nh nhân phải th ờng xuy n sử d ng thuốc. Vi c sử d ng c c thuốc n y trong thời

gian d i rất hay gặp c c t c d ng ph nh loét d d y, suy gan, suy th n, gây độc với tủy x ng v c thể gây ra hi n t ợng shock phản v Trong khi đ Vi t Nam

l i c một t i nguy n v cùng đa d ng về th c v t m khả năng ứng d ng v o d ợc

học l v cùng phong phú. Nh ng vi c sử d ng th c phẩm chức năng, thuốc một

c ch tùy ti n đặc bi t l trong Đ ng y để chống l i b nh gout v n đang l một vấn

đề cần đ ợc giải quyết. Vì v y, vi c nghi n cứu tìm ra c c thuốc trị gout c nguồn

gốc t t nhi n, h n chế c c t c d ng kh ng mong muốn l một vi c l m c ý ngh a

v hết sức cần thiết. Do đ , chúng t i th c hi n nghi n cứu: Đ nh gi khả năng

chống oxi h a, kh ng vi m tr n m hình chuột Swiss của cao chiết th c v t t một số b i thuốc trị Gout c truyền” nhằm:

1. T o cao, t ch chiết v phân t ch th nh phần c trong dịch chiết của một số

d ợc li u đ ợc sử d ng trong điều trị gout c truyền.

2. Thử nghi m đ nh gi khả năng chống oxy h a, kháng viêm của c c cao chiết d ợc li u in vivo tr n m hình động v t đ ợc gây vi m bởi tinh thể

monosodium urate (MSU)

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Nghi n cứu n y đ ợc th c hi n t i c c phòng Th nghi m thuộc Trung tâm

Khoa học S sống, M Tế b o học, M Sinh lý học v Sinh học ng ời – Khoa Sinh

học, PTN Phân t ch h a dầu – Khoa H a học, TT Khoa học v t li u – Khoa V t lý v t i Phòng th nghi m Trọng điểm C ng ngh Enzyme v Protein KLEPT), Đ i

học Khoa học T nhi n, Đ i học Quốc Gia H Nội.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

C ƣơn 1: TỔNG QUAN

1.1. n out 1.1.1. Khái quát chung về bệnh gout

Gout l b nh lý chuyển h a li n quan đến tăng nồng độ acid uric trong m u.

Đặc tr ng của b nh l nh ng đợt vi m khớp cấp hoặc vi m khớp m n t nh do

s l ng đọng tinh thể monosodium urat (MSU) trong c c khớp v m li n kết bởi

nồng độ axit uric trong m u tăng cao. Tinh thể n y gây ra phản ứng vi m cấp t nh v c thể gây t n th ng m v nh viễn, đ ợc đặc tr ng bởi s xuất hi n của c c

loét s n khớp, loãng x ng bi n, t n th ng, x i mòn v vi m m ng ho t dịch m n

tính, bên c nh đ c c tinh thể n y cũng c nguy c l ng đọng trong kẽ th n gây sỏi

th n [4]. T khi c s xuất hi n của tăng nồng độ acid uric trong m u đến c n gout

đầu ti n c thể kéo d i 20 - 30 năm, c tới 40 - 50 trở th nh b nh gout và khoảng

10 - 40 số b nh nhân gout c c n đau quặn th n cả tr ớc khi xuất hi n dấu hi u

vi m khớp [2]. Đây l b nh vi m khớp ph biến nhất ở nam giới v c tỷ l m c

b nh ng y c ng gia tăng [18] [1] [7] [23]. Hi n nay, tỷ l nam/n m c b nh hi n l

3 - 4/1. Độ tu i m c b nh chủ yếu l ở độ tu i trung ni n đến cao tu i đối với nam giới v ở giai đo n sau mãn kinh đối với n giới. Tỷ l m c b nh tăng dần theo tu i,

chiếm 7 ở nam giới tr n 65 tu i v 3 ở n giới tr n 85 tu i. nh đang c xu

h ớng khởi ph t ở lứa tu i tr h n 20 - 30 tu i) tăng l n, với tỷ l đ ng kể 5 -

7%). Nam giới m c b nh ở tu i c ng tr thì b nh c ng nặng. Tỷ l m c b nh tr n

to n thế giới l 1 - 10 v c s kh c bi t kh lớn gi a c c quốc gia. Tỷ l m c

b nh cao khoảng 10 ) th ờng gặp ở c c n ớc ph t triển nh : M , Canada, Hy

L p, Anh, Tây an Nha, H Lan, Australia, New Zealand, Đ i Loan, Hồng K ng v

Singapore [59].

1.1.2. Nguyên nhân và biểu hiện lâm sàng

1.1.2.1. Nguyên nhân

- nh gout do c c bất th ờng về enzym

nh gout do c c bất th ờng về enzyme, là thể b nh di truyền do thiếu h t ho n to n hay một phần enzym Hypoxanthine Phosphoribosyl – transferase (HPRT) hoặc tăng ho t t nh enzym Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase (PRPP). nh

Lesch - Nyhan do thiếu enzym HPRT rất hiếm gặp v rất nặng. L ợng acid uric tăng cao ngay t nhỏ v c c c biểu hi n to n thân, thần kinh, th n v khớp [5].

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

B nh gout nguy n ph t l thể b nh ch a rõ nguy n nhân gây ra. Đây l thể

b nh th ờng gặp nhất chiếm 95 c c tr ờng hợp). nh c li n quan với c c yếu

tố gia đình, lối sống - chế độ ăn v một số b nh rối lo n chuyển h a kh c đ i th o đ ờng, rối lo n lipid m u, b nh lý tim m ch ) [4].

- nh gout thứ ph t

B nh gout thứ ph t l thể b nh xuất hi n sau một số b nh lý kh c d n đến tăng sản xuất acid uric trong m u hoặc giảm đ o thải acid uric hoặc cả hai, c thể

nh sau:

+ Suy th n v c c b nh lý l m giảm độ thanh thải acid uric của th n [3].

+ C c b nh lý huyết học c t nh nh b nh đa hồng cầu, một số b nh thiếu

m u do tan m u, l -xê-mi cấp thể tủy, hodgkin u lympho hodgkin), sarcoma h ch,

đa u tủy x ng, c sử d ng c c tác nhân di t tế b o h a chất, ph ng x ) gây ph

hủy nhiều tế b o, t chức, d n đến tho i h a purin nội sinh [4].

+ Sử d ng một số thuốc nh steroid, thuốc kh ng lao, thuốc gây độc tế b o

để điều trị c c b nh c t nh hay thuốc lợi tiểu furosemid, thiazid ) gây tăng acid

uric m u, c thể d n đến b nh gout [5].

+ Chế độ ăn th c phẩm c chứa nhiều purin nh : thịt v nội t ng động v t

gan, th n), hải sản t m, cua) , uống nhiều r ợu, bia, n ớc ngọt l nguy n nhân

l m nặng th m b nh [4].

+ Một số nguy n nhân hiếm gặp kh c cũng c thể gây b nh gout thứ ph t

bao gồm: b nh th n do thai nghén, suy tuyến gi p, gan nhiễm glycogen, c ờng c n

giáp [5].

1.1.2.2. Biểu hiện lâm sàng:

Gout cấp tính:

Khoảng 50 b nh nhân c c c dấu hi u b o tr ớc nh đau khớp, rối lo n ti u h a, nhức đầu, m t mỏi, đi tiểu nhiều v n ng buốt, sốt nhẹ [5]. C n gout cấp

th ờng xuất hi n đột ngột ban đ m, b nh nhân thức d y do đau ở khớp, th ờng gặp ở khớp b n - ng n chân c i chiếm 60 - 70 ). Khớp s ng to, đỏ, phù nề, căng b ng, n ng, đau d dội v ng y c ng tăng, ngay cả khi va ch m nhẹ. Thứ t đau lần l ợt thay đ i theo c c vị tr : b n chân, c chân, gối, b n tay, c tay, khuỷu, hiếm thấy ở khớp h ng, vai, cột sống. Lúc đầu, b nh nhân chỉ vi m khớp một khớp sau đ c thể

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

vi m nhiều khớp. Ngo i khớp ra, túi dịch, gân, bao khớp cũng c thể bị th ng t n

[2-3]. C c dấu hi u vi m c thể kéo d i nhiều ng y, th ờng khoảng 5 - 7 ngày, sau

đ , c c dấu hi u vi m giảm dần: đỡ đau, đỡ nề v bớt đỏ. Sau khi hết c n gút cấp, khớp trở l i ho n to n bình th ờng [5]. n c nh thể điển hình, còn c thể tối cấp,

với khớp vi m s ng tấy d dội v b nh nhân đau nhiều. Trong một số tr ờng hợp

cũng c thể gặp thể nhẹ, k n đ o, b nh nhân đau t dễ bị bỏ qua. C n gout cấp dễ t i

ph t khi c điều ki n thu n lợi, tần suất xuất hi n c khi tr n 10 năm [3].

Gout mạn tính:

Gout m n t nh biểu hi n bằng dấu hi u n i c c c c u tophi) v vi m đa khớp

m n t nh, do đ còn đ ợc gọi l gout l ng đọng”[5]. Đây l giai đo n cuối của

b nh gout, với biểu hi n đặc tr ng l tinh thể muối urat b m ch c v o t chức khớp, t o th nh c c h t tophi trồi l n bề mặt d ới da, gây biến d ng ở tay, chân , l m suy

giảm chức năng v n động. Khi h t tophi bị vỡ ra, vết th ng sẽ kh l nh, c thể gây

nhiễm trùng m u. Ngo i ra, ng ời b nh cũng rất dễ gặp phải c c biến chứng nặng

nề kh c nh : suy th n, tai biến m ch m u não, t n phế

1.1.3. Cơ chế sinh bệnh:

1.1.3.1. Cơ chế hình thành acid uric

Acid uric là nguy n nhân tr c tiếp gây ra b nh gout. Acid uric l sản phẩm

ph của qu trình gi ng h a purin trong c thể, đây l một acid yếu n n th ờng

đ ợc ion h a th nh muối urat hòa tan trong huyết t ng v dịch ngo i b o. Nồng độ

bão hòa của muối natri urat (MSU) trong huyết t ng ở điều ki n sinh lý th ng

th ờng là < 415 μmol/l ở nồng độ cao h n tinh thể urat sẽ bị kết tủa. Trong

n ớc tiểu, acid uric dễ d ng hòa tan v đ ợc thải ra ngo i, pH n ớc tiểu c ảnh

h ởng tới s hòa tan acid uric. Ở pH 5,0, nồng độ bão hòa của acid uric l 390 - 900 μmol/l hay 6 - 15 mg/dl) còn ở pH 7,0 nồng độ bão hòa của acid uric l 9480 -

12000 μmol/l hay 158 - 200mg/dl). L ợng acid uric thải ra trong n ớc tiểu bình th ờng khoảng tr n 800mg/dl [4].

Trong tr ờng hợp h m l ợng purin trong c thể tăng, qu trình chuyển h a purin th nh acid uric tăng. Khi c thể t o ra qu nhiều acid uric hoặc thải acid n y ra n ớc tiểu qu t, nồng độ acid uric trong m u tăng l n [5]. Tăng acid uric máu có

thể xuất ph t t c c nguy n nhân nội sinh hoặc ngo i sinh. C c nguy n nhân nội sinh bao gồm tăng t ng hợp purin hoặc tăng phân hủy nhân tế b o. C c tr ờng hợp

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

tăng ngo i sinh th ờng gặp h n v th ờng xuất ph t t c c nguy n nhân nh tăng

phân hủy c c thức ăn gi u purin, giảm đ o thải acid uric khỏi c thể acid uric ni u

< 800mg/24h) hoặc do kết hợp cả tăng t ng hợp acid uric v giảm thải acid uric máu [4]. Tăng acid uric m u d n đến t ch lũy tinh thể urat t i m , t o n n c c

microtophi. Khi c c h t microtophi t i s n khớp bị vỡ sẽ khởi ph t c n gout cấp.

C c vi tinh thể còn ho t ho yếu tố Hageman d n đến hình thành kallicrein và kinin

c vai trò gây vi m khớp; ho t ho c c b thể v plasminogen, d n đến hình thành một số sản phẩm cũng c vai trò trong vi m khớp [2]. S l ng đọng vi tinh thể c nh

khớp, trong m ng ho t dịch, trong m s n v m x ng sẽ d n đến b nh x ng

khớp m n t nh do gout; s c mặt vi tinh thể urat t i m mềm, bao gân t o n n h t

tophi v cuối cùng vi m th n kẽ b nh th n do gout) l do tinh thể urat l ng đọng t i t chức kẽ của th n. Acid uric ni u tăng v s toan h a n ớc tiểu d n đến sỏi tiết

ni u trong b nh gout [4].

Hình 1. Cơ c ế ìn t àn acid uric

S tho i biến c c purin c thể xảy ra ở mức độ base t do, nucleosid v nucleotid. Ở ng ời, acid uric l sản phẩm cuối cùng của qu trình tho i biến purin [6] [7]. C c purin nucleotid đầu ti n bị t ch nh m phosphat d ới t c d ng của 5’-

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

nucleotidase. T adenylat adenosin monophosphat) sẽ t o th nh adenosin, chất n y

tiếp t c khử amin thủy phân th nh inosin bởi adenosin deaminase. Inosin tiếp t c bị

thủy phân t o th nh base hypoxanthin v D-ribose. Hypoxanthin tiếp t c bị oxy hóa th nh xanthin rồi th nh acid uric, bởi xanthin oxidase. Tho i biến của guanosin

monophosphat cũng t o n n sản phẩm cuối l acid uric. Guanosin monophosphat

đầu ti n bị thủy phân t o th nh nucleosid l guanosin. Guanosin bị phân c t th nh

guanin, tiếp theo guanin khử amin thủy phân th nh xanthin v biến đ i th nh acid uric nhờ xanthin oxidase.

Ở ng ời acid uric đ ợc đ o thải ra n ớc tiểu. N còn l sản phẩm b i tiết ở

lo i nguy n sinh, chim, lo i nhai l i, c n trùng v một số động v t kh c. Tuy nhi n

ở c c động v t c x ng sống kh c, acid uric bị tho i biến th nh sản phẩm b i tiết allantoin d ới t c d ng của urat oxidase. L ợng acid uric ở ng ời chỉ chủ yếu đ ợc

đ o thải qua đ ờng n ớc tiểu khoảng 0,6 g/ 24 giờ 3,6 mmol/ 24 giờ). Nồng độ

acid uric trong m u ở ng ời bình th ờng dao động trong khoảng 180 – 420 μmol/l.

Tăng nồng độ acid uric m u v n ớc tiểu l đặc tr ng của b nh gout. Khi acid uric

trong m u tăng, do t tan, d n đến ứ đọng c c tinh thể muối urat natri) ở c c khớp

nhỏ gây vi m khớp, ứ đọng ở d ới da gây c c nốt phồng vi m nhiễm v ứ đọng ở

th n gây sỏi th n v đ ờng tiết ni u [9]. Theo Taniguchi v cộng s 2008): hầu hết

c c lo i động v t c vú c enzym urat oxidase làm tho i biến urat và do đ c nồng

độ urat m u thấp. Tuy nhi n ở ng ời, phần gen mã h a cho enzym urat oxidase bị

đột biến, khiến cho enzym n y bị bất ho t [74]. Còn theo Álvarez- Lario v cộng s

2010): acid uric l sản phẩm cuối cùng của qu trình chuyển h a purin ở ng ời li n

quan đến s mất ho t động của uricase bởi nh ng đột biến kh c nhau của gen

uricase trong suốt kỷ Miocene, d n đến con ng ời c mức acid uric cao h n động

v t c vú kh c. H n n a, 90 acid uric lọc qua th n đ ợc t i hấp thu, thay vì b i

tiết. C c nh nghi n cứu đã nh n thấy nh ng lợi thế tiến h a c thể c của vi c mất uricase v s gia tăng tiếp theo của mức acid uric. Một số t c giả cho rằng do ho t

động chống oxy h a m nh mẽ của acid uric v lợi ch tiến h a n y c thể l tăng tu i thọ của con ng ời. Đối với c c t c giả kh c, s mất m t của uricase v s gia tăng acid uric c thể l một c chế để duy trì huyết p trong thời gian ăn muối rất thấp. Giả thiết lâu đời nhất li n quan đến s gia tăng acid uric l s th ng minh h n của lo i ng ời – gout l b nh đặc thù của giới tinh h a, triết gia, ho ng tộc. Cuối cùng, acid uric c t c d ng bảo v chống l i một số b nh tho i h a thần kinh [12].

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

1.1.3.2. Cơ chế gây vi m i ệnh Gout

Gout l b nh rối lo n chuyển h a do nồng độ acid uric trong m u tăng cao thúc đẩy s hình th nh v l ng đọng của c c tinh thể monosodium urate (MSU) bên trong c c khớp v m [23]. C c tinh thể MSU k ch ho t c c cytokine tiền vi m nh IL-8, IL-6, interferon IFN) - , v IL-1β bằng c ch k ch ho t th thể NLRP3 thuộc họ inflammasome NOD-like [25] [53]. C c t c động của MSU chủ yếu l hình th nh c c gốc t do ROS), ho t h a NLRP3 [43, 72], v k ch ho t c c enzyme NADPH oxyase, xanthine oxyase, nitric oxide synthase. Điều n y sẽ giúp tế b o tăng sinh l ợng một l ợng lớn ROS m điển hình nh hydro peroxide H2O2 ), - ) v nitric oxide NO), NO sẽ thúc đẩy vi c t o ra superoxide anion (O2 peroxynitrite (ONOO-)- đây l gốc t do c thời gian b n hủy kh d i v đã đ ợc chứng minh l l m tăng qu trình apoptosis, tho i h a c c m li n kết v gây t n th ng khớp [70] [84]. Nghi n cứu của Trevisan v cs 2014) đã b o c o rằng ROS nội sinh đ ợc sản xuất qu mức trong c c b nh gout cấp t nh, cho thấy rằng stress oxy h a g p phần gây ra c c c n gout cấp t nh khi c mặt của tinh thể MSU [75] [83]

Hình 2. Cơ c ế tác độn của MSU

IL- 1 β và quá trình gây viêm

Quá trình viêm l một phản ứng của c thể với s xâm nh p của một t c nhân truyền nhiễm, kh ng nguy n hoặc t n th ng tế b o. Vi m l dấu hi u b nh th ờng gặp nhất v cũng l một qu trình sinh học c bản li n quan đến c c con

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

đ ờng phức t p th ờng đ ợc gây ra bởi c c sản phẩm của s tho i h a vi khuẩn t

c c vi sinh v t kh c nhau nh : lipopeptide, lipopolysacarit, peptidoglycans,

formylmethionyl peptide, flagellin, microbial DNA), nấm zymosans), virus RNA sợi đ i), hoặc th m ch l tế b o của ch nh c thể khi bị t n th ng v tử vong[71].

C c th thể nh n d ng, ph t hi n vị tr nhiễm trùng hoặc chấn th ng, sau đ b t

đầu một qu trình đ p ứng miễn dịch m đỉnh điểm l s b i tiết cytokine để d n

truyền c c tế b o miễn dịch đến vị tr vi m. Inflammasome l phức hợp đa protein c vai trò điều hòa s b i tiết của c c cytokine gây vi m IL-1β v IL-18 [77]. Theo

một số c c nghi n cứu, khi c c tinh thể MSU đ ợc ti m v o m hình động v t, n

đã gây ra vi c sản xuất c c cytokine tiền vi m nh interleukin-1β IL-1β) xuất hi n

ở c c vị tr khớp của động v t [66]. Mặc dù MSU đ ợc x c định l t c nhân gây b nh trong b nh gout, tuy nhi n c c c chế gây vi m do tinh thể MSU chỉ mới b t

đầu đ ợc hiểu một v i năm gần đây [44]. C c cytokine tiền vi m đ ng một vai trò

quan trọng trong phản ứng vi m gây ra bởi tinh thể MSU [63]. Một số nghi n cứu

đã chứng minh rằng IL-1 l dấu hi u b nh lý của vi m cấp t nh, l một cytokine tiền

vi m c vai trò quan trọng trong vi c điều tiết b nh gout, thúc đẩy b ch cầu trung

t nh tr n v o synovium v dịch khớp [30, 57]. H n n a, IL-1β cũng đ ng một vai

trò quan trọng trong vi c thúc đẩy qu trình chuyển t giai đo n gout cấp t nh sang

giai đo n m n t nh [33]. Vi c sản xuất cytokin tiền vi m IL-1β xảy ra ở b nh gout

ph thuộc v o s ho t h a phức h NLRP3 inflammasome do t ng t c của c c

tinh thể MSU với đ i th c b o. Khi NLRP3 inflammasome đ ợc hình th nh v

ho t h a, n thúc đẩy s ho t h a Procaspase-1 th nh caspase-1, t đ ho t h a pro-

IL-1β th nh IL-1β d ng ho t động v gây ra hi n t ợng vi m ở khớp, l nguy n

nhân gây ra c c đợt gout cấp t nh [54]. Nhiều bằng chứng cho thấy rằng tinh thể

MSU gây vi m th ng qua th c b o k ch ho t c c NLRP3 inflammasome, d n đến

tiết IL-1β t c c đ i th c b o [58]. n c nh MSU, một nh m c c chất kh c k ch ho t NLRP3 li n quan đến b nh gout nh b i silica, amiăng v muối nh m cũng đã

đ ợc chứng minh th ng qua qu trình k ch ho t s phân t ch caspase-1 v sản xuất IL-1β. Qu trình n y c thể l m tăng l ợng IL-1β v c c chất trung gian gây vi m kh c, đồng thời thúc đẩy s ho t h a của c c tế b o m ng ho t dịch v th c b o [13, 84].

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

1.1.3.3. Stress oxi hóa và qu trình hoạt h a thụ thể viêm NLRP3

Th thể vi m NLRP3 l c c phức hợp đa protein đ ợc hình th nh trong tế

b o chất, c vai trò ho t ho t c c cytokine tiền vi m nh interleukin-1β IL-1β) v IL-18, v k ch ho t một số d ng vi m tế b o, gây chết tế b o. L m rõ c c c chế

phân tử d n đến vi c k ch ho t c c c chế gây vi m nội b o n y c thể cung cấp

nh ng hiểu biết mới về căn nguy n v c c con đ ờng d n đến c c b nh ở ng ời. S

k ch ho t của th thể vi m NLRP3, hi n đang l c chế phân tử quan trọng đối với nhiều b nh tho i h a. C rất nhiều con đ ờng ho t h a th thể vi m NLRP3 bằng

c c t n hi u nội sinh v ngo i sinh. C c yếu tố ngo i sinh gây ho t ho NLRP3 nh :

t n hi u nguy hiểm t virus cúm, adenovirus, vi khuẩn Staphylococcus

aureus , Escherichia coli, Neisseria gonorrhoe , và Candida albicans . C c con

đ ờng ho t h a th thể vi m NLRP3 nội sinh nh m hình k nh v n chuyển ion K + efflux, m hình th ng qua tăng tiết lysosome, canxi nội b o, ubiquitination, microRNA, v đặc bi t l s bất th ờng về tăng sinh l ợng gốc t do ROS) nội,

ngo i b o. Ng y c ng c nhiều nghi n cứu chỉ ra rằng c c d ng gốc ROS c thể

đ ng vai trò nh l c c tác nhân k ch ho t th thể vi m NLRP3 [10].

ROS c nguồn gốc ch nh t ty thể. Chuỗi v n chuyển đi n tử trong m ng trong của ty thể rất quan trọng trong vi c t o ra năng l ợng, trong đ oxy đ ng vai

trò l chất nh n đi n tử. Khi chuỗi v n chuyển đi n tử bị ph vỡ, ROS c thể t ch

lũy đến mức gây độc cho c c tế b o. Một số nghi n cứu đã chỉ ra rằng ROS đ ợc

sản xuất bởi ATP- v tinh thể monosodium urate MSU), sau đ chúng đ ng vai trò

l chất k ch ho t c c inflammasomes [26]. ROS đ ợc t o ra trong qu trình th c

b o của c c h t silica v amiăng c khả năng k ch ho t s hình th nh tế b o NLRP3

trong c c đ i th c b o.Theo một số nghi n cứu cho rằng, khi điều trị đ i th c b o

bằng thuốc ức chế ROS N -acetyl- l -cystine hoặc 2 R , 4 R ) -4-aminopyrrolidine- 2,4-dicarboxylate (APDC) [32] c thể ức chế s hình th nh hồng cầu NLRP3 do

silica v amiăng gây ra. Vì v y, khi c s hình th nh ROS đủ lớn sẽ thúc đẩy qu trình k ch ho t hồng cầu NLRP3, cho thấy ROS ty thể l một chất k ch ho t tr c tiếp th thể vi m NLRP3[36].

Theo nghi n cứu của Wu v cộng s 2013) đã kết lu n đ ợc rằng ROS c

nguồn gốc t ty thể l cần thiết cho vi c k ch ho t th thể vi m NLRP3 . Một số

nghi n cứu v o cuối th p nhi n tr ớc đã b o c o tầm quan trọng của ROS c nguồn

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

gốc oxy h a NADPH trong vi c k ch ho t NLRP3 để đ p ứng với ATP, amiăng v

silica [79].

1.1.4. C c hướng điều trị hiện tại dựa tr n cơ chế phân tử của bệnh

Gout l tình tr ng b nh lý li n quan đến s gia tăng l ợng uric acid trong

huyết thanh. C c c n đau gout cấp th ờng khởi đầu t qu trình vi m do c c t nh

thể uric acid. Do đ , th ng th ờng c 3 ph ng ph p ch nh để điều trị gout, một l

giảm hi n t ợng vi m trong c n đau gout, hai l tăng khả năng b i tiết uric acid của th n, v cuối cùng l ức chế phản ứng chuyển purine th nh uric acid th ng qua ức

chế xanthine oxidase.

1.1.4.1. Các chất ức chế Xanthine oxidase

L ợng uric acid trong c thể bị h n chế th ng qua vi c ức chế enzyme

xanthine oxidase, nh đã đề c p ở tr n, enzyme n y sẽ chuyển hypoxanthine th nh

xanthine v cuối cùng th nh uric acid. ằng c chế n y, c c thuốc ức chế enzyme

xanthine oxidase cũng đ ợc sử d ng trong điều trị gout. Allopuriol sẽ bị chuyển h a

th nh oxypurinol alloxanthine) nhờ xanthine oxidase, sản phẩm của phản ứng n y

l một chất ức chế enzyme v khiến cho enzyme kh ng thể ph c hồi đ ợc. n

c nh đ , febuxostat cũng l một chất ức chế phi purine của xanthine oxidase v c

t nh chọn lọc cao h n allopurinol v alloxanthine [16].

1.1.4.2. Các thuốc uricosuric – Thuốc lợi tiểu

Th ng th ờng, 90 uric acid trong c thể sẽ đ ợc lọc ở th n v t i hấp th ở

ống l ợn gần. C c thuốc thuộc dòng uricosuric probenecid, sulfinpyrazone) l c c

axit yếu v c nh tranh t i hấp th với uric acid ở ống l ợn gần, nhờ đ , hỗ trợ b i

tiết uric acid. So với c c thuốc NSAIDs v colchicine, c c thuốc lợi tiểu t để l i t c

d ng ph cho c thể ng ời b nh, nh ng do chúng đều l c c sulfonamide n n c thể gây ra tr ng th i dị ứng thuốc.

1.1.4.3. Các thuốc kháng viêm

Do bản chất của nh ng c n đau do gout l s tấn c ng của h thống miễn dịch, gây ra tr ng th i vi m n n rất nhiều dòng thuốc kh ng vi m đ ợc sử d ng trong điều trị gout. C c thuốc chống vi m kh ng steroid NSAIDs) v d nh indomethacin l một trong nh ng dòng thuốc hi u quả trong điều trị gout cấp t nh.

C c thuốc n y c t c d ng l m giảm s hình th nh prostaglandin. Trong khi đ , colchicine cũng l lo i thuốc th ờng đ ợc sử d ng nhằm l m giảm sản xuất

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

leukotriene 4 v giảm hình th nh gốc t do. NSAIDs v glucocorticoid đều c t c

d ng l m giảm qu trình vi m ở ho t dịch khớp do chúng phản ứng với tubulin v

ức chế hình th nh c c sợi vi ống, mặc dù cũng c t c d ng t ng t nh colchicine, tuy nhiên nó l một chất gây độc cho qu trình nguy n phân. Về t c d ng ph ,

NSAIDs c thể gây ra c c th ng t n cho th n, đặc bi t l indomethacin c thể ph

hủy cấu trúc x ng. Đối với c c glucocorticoid, trong li u trình ng n c thể gây mất

cân bằng glucose trong m u. Ri ng đối với colchicine, đây l một lo i thuốc c nhiều t c d ng ph nhất, đặc bi t l cho gan, th n, v d d y do đ , khi sử d ng cần

rất chú ý về thời gian v liều l ợng sử d ng.

Hi n nay c một số b i b o đã chứng minh rằng Colchicine c khả năng ức

chế qu trình ho t h a th thể vi m NLRP3 [29, 52], vì thế h ớng nghi n cứu s ng lọc, t ng hợp c c hợp chất h u c nguồn gốc t t nhi n c t nh chất t ng t

colchicine nh ng mang l i t t c d ng ph đang đ ợc c c nh khoa học tr n thế giới

quan tâm v nghi n cứu nhằm thay thế ph ng ph p điều trị gout thế h cũ. Trong

đ , Vi t Nam l n ớc c nguồn th c v t dồi d o v nguồn y học c truyền lâu đời,

vì v y h ớng tiếp c n n y l th ch hợp, hứa hẹn nh ng triển vọng mới trong phòng

v điều trị gout.

1.2. Đi u tr out tron c cổ tru n 1.2.1. Các bài thuốc dân gian dùng trong điều trị Gout

- Bài thuốc cố thận trong dược học cổ truyền: Trong y d ợc c truyền giới thi u b i thuốc cố th n, l m cho th n khỏe

m nh, dùng cho c c tr ờng hợp di tinh, mộng tinh bằng c ch tía tô t n bột uống

mỗi lần 4 gram với r ợu [1], b i thuốc đ ợc cho l tăng b i tiết, giảm vi m ở ng ời

bị b nh th n v gout.

- Bài thuốc của người Tày ở Lục Yên:

Ng ời T y vùng L c Y n đã sử d ng cao dâ ắm l m thuốc điều trị c c

tri u chứng của b nh gout. Thân cây đ ợc chặt về, rửa s ch, th i nhỏ, sao kh . Thân

cây đ ợc ninh nh bằng n ớc trong 72 giờ li n t c, tinh lọc, c đặc li n t c để t o

ra cao g m. Ng ời T y sử d ng cao g m để pha n ớc uống h ng ng y hoặc ngâm

với r ợu uống.

- Bài thuốc chữa đau khớp của Hải Thượng Lãn Ông:

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Trong bộ Hải Th ợng Y T n Tâm L nh, t c giả đã giới thi u b i r ợu thuốc

ch a c c chứng phong xâm nh p v o x ng tủy, ứ huyết, kh p mình t đau, eo l ng

đầu gối đau nhức, tay chân t d i, li t nửa ng ời, b i thuốc gồm: R ắm 160g,

chân chim 100g, rễ rung túc 80g, rễ b m b ớm 60g, rễ chi ng chiềng 60g, đ ng

quy 40g, d ợc 40g, mấn đỏ 40g, cỏ x ớc 40g, rễ b ởi bung 40g, rễ cỏ chỉ 80g, cỏ

roi ng a 20g, rễ chỉ thi n 20g, tầm gửi 40g. Tất cả sao qua, t n th , cho v o một túi

vải v cho hũ r ợu, đun n ng trong 20 phút rồi ch n xuống dất 72 giờ [6].

- Bài thuốc Sâm tô ẩm:

Theo y học c truyền, b i thuốc Sâm t ẩm, với th nh phần ch nh l tía tô,

dâu tằm v nhân sâm c t c d ng ch a đau c c khớp x ng, tr phong thấp, tốt

cho ng ời bị b nh gout. C thể, b i thuốc gồm c c th nh phần sau: L t a t , nhân

sâm, trần bì, chỉ x c, c t c nh, cam thảo, mộc h ng, b n h , can kh ng, tiền hồ

[6].

1.2.2. t số loại dược liệu trong c c ài thuốc Nam được sử dụng trong điều trị

gout

1.2.2.1. m netum parvifolium

Còn đ ợc gọi l dây s t, dây mấu, dây gấm lốt, v ng t n.

T n khoa học l Gnetum parvifolium, thuộc họ Dây g m Gnetaceae.

ộ ph n sử d ng l m d ợc li u: thân

Theo Đ ng y, dây g m c vị đ ng, t nh bình, c t c d ng khu phong, tr

thấp, th cân ho t huyết, giải độc, ti u vi m, s t trùng. Rễ v thân dây g m th ờng đ ợc dùng l m thuốc giảm đau, ch a phong t thấp, sản h u gầy mòn, giải độc s n,

r n c n.

n c nh c c t i li u về y học c truyền, một số nghi n cứu gần đây cũng

cho thấy một số hợp chất c trong thân, h t, rễ dây g m co khả năng l m giảm acid

uric huyết thanh SUA). V d trong nghi n cứu của Hiroyuki Konno v cộng s 2013) khi th nghi m kiểm tra t ch động của dịch chiết h t g m đến c thể đã cho thấy th nh phần trans-resveratrol v c c d n xuất của n trong dịch chiết c t c d ng l m giảm l ợng uric acid trong m u chỉ trong 4 tuần. n c nh đ , nghi n cứu cũng chỉ ra khả năng thúc đẩy qu trình chuyển h a lipid trong c thể, nhờ v y l m tăng chỉ số HDL cholesterol trong m u [6].

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Hình 3. m netum parvifolium [6]

1.2.2.2. T a t erilla ocymoides L)

Còn gọi l tử t , tử t tử, t ng nh, t di p.

T n khoa học Perilla ocymoides L., thuộc họ Hoa m i Lamiaceae.

ộ ph n sử d ng l m d ợc li u: L

Trong Đ ng y, t a t l vị thuốc c vị cay, t nh ấm, quy v o hai kinh tỳ v

phế, chủ trị trong giải cảm h n, ki n vị chỉ n n, khử đờn chỉ ho, h nh kh an thai, cố

th n, giải độc s t khuẩn [6].

Ngo i y học c truyền, c c nghi n cứu hi n đ i cũng đã chứng minh đ ợc t c d ng điều trị gout. Nghi n cứu của Li-Na Huo v cộng s 2015) đã tiến h nh thử nghi m khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase t dịch chiết t ng số t l tía tô.

Kết quả cho thấy, khi cho chuột uống dịch chiết th của l t a t , l ợng SUA giảm rõ r t v gần nh t ng đ ng với ng ỡng bình th ờng. Nh m đã tiến h nh t ch v phân t ch một số th nh phần c trong dịch chiết, c thể gồm axit caffeic, vinul caffeate, axit rosmarinic, methyl rosmarinate và apigenin, và thấý rằng, d a tr n gi trị IC 50, c c chất vinyl caffeate, methyl rosmarinate v apigein c khả năng ức chế enzyme XO, trong khi c c chất caffeic acid v rosmarinic acid c khả năng ức chế enzyme thấp h n khi so s nh với allopuriol [48].

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Ở Vi t Nam, cũng đã c một số nghi n cứu về khả năng điều trị gout bằng

dịch chiết l t a t . Năm 2017, Đặng Kim Thu v cộng s đã nghi n cứu T c d ng

ức chế enzyme xanthine oxidase v h uric acid m u của dịch chiết l t a t (Perilla frutescens L.)”. Kết qu phân t ch IC 50 cho thấy cao chiết ethanol 50 của l t a t

c t c d ng ức chế enzyme XO với gi trị IC 50 l 25,32 µg/ml), đồng thời, khi sử

d ng cao t a t với liều 200 mg/kg, l ợng SUA giảm một c ch đ ng kể và có ý

ngh a thống k [8].

Hình 4. Tía tô (Perilla ocymoides L.) [6]

1.2.2.3. Dâu tằm (Morus alba)

Dâu tằm còn có tên gọi l m y m n, dâu cang, tầm cang.

T n khoa học l Morus alba L., thuộc họ Dâu tằm Moraceae. Trong nghiên

cứu n y, chúng t i sử d ng dâu tằm tang di p - Folium Mori) l đối t ợng nghi n

cứu ch nh.

Cây dâu c chiều cao t 2-3 m, l mọc so le, hình bầu d c, nguy n hoặc chia

th nh 3 thùy, c l kèm, đầu l nhọn hay h i tù, ph a cuối h i tròn hoặc h i bằng, mép c răng c a to. T cuống l tỏa ra 3 gân rõ r t. Hoa đ n t nh kh c gốc, hoa đ c

mọc th nh b ng, c 4 l đ i, 4 nhị, hoa c i cũng mọc th nh khối hình cầu, c 4 l đ i. Quả mọng n ớc v mọc th nh quả phức m u đỏ hoặc m u đen s m, quả c thể

ăn đ ợc v l m thuốc. Cây dâu đ ợc trồng ở nhiều n i tr n n ớc ta, t p trung nhiều ở c c khu v c nu i tằm hoặc nh ng v ờn d ợc li u.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Trong dâu tằm c chất caroten, tanin, rất t tinh dầu, vitamin C, cholin,

adenin, trigonenlin. Ngo i ra còn c pentozan, đ ờng, canxi malat và canxi

carbonate [6].

Hình 5. Dâu tằm (Morus alba) [6]

Nghi n cứu của Thanh Mai v cộng s 2004) cho thấy, dịch chiết methanol

100 , 50 v n ớc của dâu tằm đều c khả năng ức chế ho t động của enzyme

XO, khả năng n y gần nh kh ng thay đ i nhiều ở tất cả c c mức nồng độ sử d ng,

100µg/ml, 50µg/ml, 25µg/ml, 10µg/ml [50].

1.3. Các hợp chất tự n iên tron đi u tr gout 1.3.1. Alkaloid

C c sản phẩm t nhi n t lâu đã đ ợc c ng nh n l một nguồn quan trọng

của c c lo i thuốc c hi u quả trị li u. Th c v t sản xuất v l u tr nhiều hợp chất h u c nh axit amin, protein, carbohydrate, chất béo v alkaloid. C c alkaloid đ i di n cho lớp chất chuyển h a thứ cấp lớn nhất của th c v t. Chúng c một ph m vi ho t động d ợc lý đ ng chú ý. Một số nghi n cứu đã chứng minh ho t động chống vi m của c c alkaloids, li n quan đến s ức chế hoặc điều chỉnh c c chất trung gian

gây vi m quan trọng nh NF-κ , COX-2 và iNOS [61, 80]. Ho t t nh chống oxy

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

h a của c c alkaloid cũng đã đ ợc trình b y trong c c m hình th nghi m hoặc điều

ki n b nh lý kh c nhau [27, 67].

Các alkaloid đầu ti n cho vi c sử d ng thuốc đ ợc phân l p v o đầu thế kỷ 19, bởi Derosne opium salt, narcotine) v Sertürner principium somniferum,

morphine). Vi c x c định morphin đ ợc th c hi n v o năm 1923, bởi Robinson v

Gulland. Cho đến nay, c h n 20000 lo i alkaloid đ ợc x c định v một số trong số

chúng đã đ ợc đặt một vai trò quan trọng trong th c h nh lâm s ng. Nhiều alkaloid c ho t t nh sinh học đối với con ng ời. Tuy nhi n, c c alkaloid v c c hợp chất t

nhi n cần phải phân t ch c c ho t động d ợc lý của chúng bằng một số ph ng

ph p th nghi m v chứng minh mối t ng quan cấu trúc/ho t động của chúng.

Trong h ng ng n năm, c c chất chiết xuất t th c v t c chứa alkaloid đã đ ợc sử d ng l m thuốc v chúng đã đ ợc chứng minh l c d ợc t nh m nh. Các alkaloid

c t c d ng kh ng khuẩn, giảm đau, gây t c c bộ, th i mi n, h ớng tâm thần,

kh ng khuẩn v chống ung th . Ng y nay, c c alkaloid t th c v t v n rất đ ợc

các nh h a học, nh sinh học, nh h a sinh v d ợc s quan tâm. Ngo i ra, c c

alkaloid còn c t c d ng ức chế t o axit uric, t c d ng chống vi m hoặc cả hai.

Colchicine, lo i thuốc ch a gout ph biến hi n nay, đ ợc FDA ph duy t để điều trị

b nh gout năm 2009, cũng l một alkaloid c cấu trúc bất th ờng [14].

Colchicine l một d ng thuốc lâm s ng đ ợc l u h nh cho b nh vi m khớp,

nh ng cũng c rất nhiều c c hợp chất kh c thuộc nh m chất alkaloid đã đ ợc b o

c o với hi u quả đ ng kể trong khả năng chống vi m. Isoquinoline, indole v

diterpene l c c alkaloid đ ợc nghi n cứu nhiều nhất về ho t động của chúng đối

với tình tr ng vi m. Aconitine v c c alkaloid kh c t chi Aconitum đ ợc s ng lọc

ho t động chống vi m. Chúng c hi u quả tr n c c xét nghi m kh c nhau bao gồm

phù chân do carrageenan, vi m khớp. Một số alcaloid nhóm isoquinoline berbamine, berberine, cepharanthine v tetrandine) đã đ ợc kiểm tra về ho t động

chống vi m [39, 60, 78, 82]. C khoảng 500 lo i Aconitum v lo i n y đã đ ợc nghi n cứu chuy n sâu về ho t t nh d ợc lý của c c alkaloid của chúng. Vì c c đặc t nh chống thấp khớp c li n quan đến lo i cây n y, một số nghi n cứu đã đ ợc th c hi n đối với ho t động chống vi m của c c alkaloid trong Aconitum [14].

Theo nghi n cứu của Souto v cộng s năm 2011, đ nh gi ho t t nh chống

vi m của 49 lo i alkaloid thì c đến 40 lo i c ho t t nh chống vi m[71].

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Hình 6. Hoạt tín c ốn viêm của một số loại alkaloids [72]

D a tr n s đa d ng h a học của c c alkaloids v c c ho t động sinh học của

chúng đ ợc b o c o tr ớc đây, c c hợp chất alkaloids đang n i l n nh l t c nhân

tiềm năng đầy hứa hẹn trong vi c s ng lọc cho ứng d ng trong điều trị b nh gout

mà tiền đề l khả năng kh ng vi m.

1.3.2. Phenolic

C c hợp chất phenolic cũng là nhóm chất chuyển h a thứ cấp của th c v t,

Phenolic đ ng một vai trò quan trọng trong th c v t [21]. Phenolic ở b n ngo i của

th c v t bảo v chúng khỏi c c b ớc s ng năng l ợng cao gây tử vong bằng c ch

hấp th chúng tr ớc, n i c ch kh c, c c phần gi u đi n tử nh li n kết π của phenol

hấp th b ớc s ng tr ớc khi tấn c ng c c phần quan trọng của c c tế b o. C c hợp

chất phenolic v polyphenolic c thể đ ợc phân lo i th nh nhiều phân nhóm, c thể

là axit phenolic, flavonoid, stilben, coumarin, lignin và tannin.

Các phenolic acid t o th nh một phân nhóm hợp chất phenolic ch nh trong c c nguồn t nhi n nh ngũ cốc, c c lo i đ u v c c lo i h t kh c, trong đ chúng đ ng vai trò l v t li u xây d ng của chất nền th nh tế b o bằng cách hình thành các cầu nối với c c đ i phân tử nh cellulose, hemiaellulose v pectin, do đ hỗ trợ vi c xây d ng c c cấu trúc tế b o nhỏ gọn. Vì v y, chúng th ờng tồn t i ở c c d ng li n

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

hợp kh c nhau ngo i lo i t do. Axit phenolic đ ợc chia th nh hai nhóm, axit

hydroxycinnamic và axit hydroxybenzoic. Axit hydroxycinnamic bao gồm axit p -

coumaric, caffeic, ferulic v sinapic, trong khi axit hydroxybenzoic bao gồm p- hydroxybenzoic, protocatechuic, vanillic, syringic v gallic acid. S kh c bi t l

trong c c nh m thay thế v chức năng, c thể l c c nh m hydroxyl v methoxy,

quyết định s kh c bi t c nhân của t ng axit phenolic.

Flavonoid, một lo i phenolic kh c c cấu trúc ba vòng ở d ng C6–C3–C6 , t o th nh c c phân lớp kh c nhau của c c hợp chất nh flavon, flavonol, flavanon,

flavanonol, flavanol, isoflavon, và anthocyanidin. C c hợp chất n y c thể c c c

m u thay thế kh c nhau với c c nh m hydroxyl v methoxy. Flavonoid c ho t t nh

sinh học đ ng chú ý nh chống ung th , chống vi m v t c d ng chống virus cũng nh giảm c c b nh tim m ch v tiểu đ ờng lo i 2.

Stilbene, còn đ ợc gọi l 1,2-diphenylethene, sở h u bộ x ng carbon C6–

C2–C6 v cho thấy ho t t nh sinh học m nh mẽ nh t c d ng kh ng

khuẩn. Resveratrol, c nhiều trong nho v r ợu vang, l một v d điển hình của

stilbene, cho thấy nhiều ho t t nh sinh học nh chống vi m, chống u b ớu v t c

d ng bảo v tim m ch [15].

Coumarin đ ợc gọi l benzopyrone với bộ x ng C6 - C3 và một dị vòng

oxy trong đ n vị C3. Coumarin cho thấy một lo t c c ho t t nh sinh học nh chống

vi m, kh ng khuẩn, kh ng vi-rút, chống oxy h a, chống ung th , chống suy nh ợc,

chống trầm cảm, chống HIV v chống Alzheimer [46]

Vi c ức chế sản xuất qu mức c c cytokine gây vi m l rất quan trọng để

ngăn ng a c c b nh li n quan. Chất phytochemical t c c c ng thức c nguồn gốc

t th c v t đã đ ợc sử d ng rộng rãi để điều trị vi m v c c rối lo n li n quan t

thời c đ i. Phenolics l c c hợp chất cần thiết cho vi c ức chế vi m gi a c c chất phytochemical, v c c t i li u gần đây đã tiết lộ khả năng chống vi m m nh mẽ của

chúng. Pragasam v cộng s [62] đã nghi n cứu t c d ng chống vi m của axit p- coumaric bằng c ch theo dõi biểu hi n của yếu tố ho i tử khối u TNF-α) trong m của chuột bị vi m khớp v ho t t nh chống vi m m nh của axit p-coumaric đã đ ợc tìm thấy bằng c ch h thấp biểu hi n của chất trung gian gây vi m TNF-a. Ho t động chống vi m của axit caffeic v axit ellagic cũng đ ợc tìm thấy bởi Chao v

cộng s [20] . C c axit caffeic v ellagic đ ợc cung cấp cho chuột bằng c ch trộn

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

v o chế độ ăn của chúng với tỷ l 2,5 v 5,0 , v vi c điều trị c c axit phenolic đ

l m giảm biểu hi n của c c chất trung gian gây vi m nh IL-6, IL-1β, yếu tố ho i tử

khối u TNF) - α. da Cunha v cộng s [28] đã kh m ph khả năng chống vi m của axit caffeic v c c d n xuất của n , v s ức chế m nh mẽ của chúng đối với

lipopolysacarit LPS) do nitric oxide synthase iNOS) t o ra trong đ i th c b o

RAW 264.7 đã đ ợc tìm thấy. Hamalainen v cộng s [37] đã điều tra c c ho t

động chống vi m của c c flavonoid đ i di n nh naringenin, quercetin, kaempferol, isorhamnetin, daidzein v genistein cũng nh pelargonidin anthocyanidin). Tất cả

c c hợp chất đ ợc li t k ở tr n đã ức chế protein iNOS bằng c ch ức chế yếu tố h t

nhân-κ NF- κ ), đây l yếu tố phi n mã ch nh cho iNOS.

Với c sở l c c nghi n cứu đã c ng bố về ứng d ng cũng nh tiềm năng to lớn của c c hợp chất phenolic trong vi c ức chế c c yếu tố gây vi m đã đặt nền tảng

cho vi c nghi n cứu vai trò, t c động của c c hợp chất phenolic trong vi c phòng v

điều trị b nh gout, hứa hẹn mang l i nhiều tiềm năng trong t ng lai.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

C ƣơn 2: NGUYÊN LI U V PHƢƠNG PH P

2.1. Nguyên li u 2.1.1. ật liệu nghi n cứu

- Mẫu dược liệu: M u đ ợc sử d ng trong nghi n cứu n y l c c m u d ợc li u lấy t một số

b i thuốc ch a b nh gout của ng ời Vi t nh : dây G m Gnetum parvifolium), T a

tô (Perilla ocymoides), dâu tằm (Morus alba) đ ợc thu t i N ng tr i h u c ECO Ho ng Mai, H Nội . C c m u đ ợc định danh v so s nh với d li u v m u l u

trong Hebarium của ảo t ng Sinh học HNU bởi ThS. Nguyễn Anh Đức M Khoa

học th c v t – tr ờng ĐHKHTN – ĐHQGHN

Tất cả c c m u d ợc li u sau khi thu đ ợc sấy kh ở 600C trong 24 giờ, sau

đ m u đ ợc xay nhỏ v bảo quản ở nhi t độ phòng.

- Mẫu động vật Nghi n cứu đ ợc th c hi n tr n chuột đ c dòng Swiss tr ng c cân nặng t

17-19g, đ ợc cung cấp bởi Vi n V sinh Dịch tế Trung ng.

Gồm c c nh m:

- Nh m đối chứng sinh học: Chuột đ ợc ti m P S ở chi sau ( n=6) - Nhóm đối chứng sinh học Chuột ti m P S) và uống cao chiết: Chuột đ ợc

ti m P S ở chi sau v đ ợc uống cao chiết (mỗi nh m n=4)

- Nh m đối chứng âm: Chuột đ ợc ti m MSU ở chi sau (n=6) - Nh m đối chứng d ng: Chuột đ ợc ti m MSU ở chi sau v cho uống

colchicine với liều l ợng 0,5μg/ g thể trọng (n=6)

- Nh m th nghi m: Chuột đ ợc ti m MSU ở c c chi sau v cho uống cao d ợc li u ở c c nồng độ kh c nhau. Mỗi cao chiết, đ ợc thử nghi m tr n c c liều

l ợng kh c nhau nh : 200mg/kg thể trọng, 100 mg/kg thể trọng, 50 mg k/g thể trọng v 25 mg/kg thể trọng (mỗi nh m n=6).

C c nh m chuột n y đ ợc ký hi u nh trong bảng:

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

ản 1. Ký i u các n óm c uột đƣợc sử dụn tron n iên cứu

STT

Nhóm

Ký i u n óm

ĐC SH

Đối chứng sinh học

ĐC Âm

Đối chứng âm

Đối chứng d ng

ĐC D ng

Chuột ti m P S v uống T a t 50mg/kg thể trọng

PBS+ TT50

Chuột ti m P S v uống T a t 100mg/kg thể trọng

PBS+ TT100

Chuột ti m P S v uống Dâu tằm 50mg/kg thể trọng

PBS+ LD50

Chuột ti m P S v uống Dâu tằm 100mg/kg thể trọng

PBS+ LD100

Chuột ti m P S v uống G m 25mg/kg thể trọng

PBS+ G25

Chuột ti m P S v uống G m 50mg/kg thể trọng

PBS+ G50

Chuột ti m P S v uống G m 100mg/kg thể trọng

PBS+ G100

Chuột ti m P S v uống G m 200mg/kg thể trọng

PBS+ G200

Chuột ti m MSU v uống T a t 50mg/kg thể trọng

MSU+ TT50

Chuột ti m MSU v uống T a t 100mg/kg thể trọng

MSU+ TT100

Chuột ti m MSU v uống Dâu tằm 50mg/kg thể trọng

MSU+ LD50

Chuột ti m MSU v uống Dâu tằm 100mg/kg thể trọng

MSU+ LD100

Chuột ti m MSU v uống G m 25 mg/kg thể trọng

MSU+ G25

Chuột ti m MSU v uống G m 50 mg/kg thể trọng

MSU+ G50

Chuột ti m MSU v uống G m 100 mg/kg thể trọng

MSU+ G100

Chuột ti m MSU v uống G m 200 mg/kg thể trọng

MSU+ G200

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

2.1.2. a chất

C c h a chất sử d ng trong nghi n cứu đ ợc li t k trong bảng

ản 2. Hóa c ất sử dụn tron n iên cứu

STT Tên óa c ất N uồn ốc

1 Tấm s c ký bản mỏng Merck Đức)

2 Mouse IL-1 beta ELISA Invitrogen (Úc)

3 Ethanol 1000 Fisher Chemical (EU)

4 Methanol Fisher Chemical (EU)

5 n-Hexane Fisher Chemical (EU)

6 Acetic acid Fisher Chemical (EU)

7 Ethyl acetate Fisher Chemical (EU)

8 Chloroform Fisher Chemical (EU)

9 Merck (EU) Dipotassium phosphate (K2HPO4)

10 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck (EU)

11 Potassium chloride (KCl) Merck (EU)

12 Merck (EU) Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)

13 Sodium chloride (NaCl) Analar (EU)

Xilong chemical (TQ) 14 n-Butanol Fisher Chemical (EU)

15 Sodium dodecyl sulfate (SDS) USB (USA)

16 Thiobarbituric acid (TBA) Alfa Aesar (USA)

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Hydrochloric acid (HCl) Sigma (USA) 17

Acetic acid Merck (Đức) 18

Trichloroacetic acid (TCA) Gaoshen Trung Quốc) 19

Merck (EU) 20 Othor-Phosphoric acid (H3PO4)

Trifluoroacetic acid (TFA) TCI (Nh t ản) 21

1, 1-Diphenyl –2-picrylhydrazyl (DPPH) Sigma (USA) 22

Ascobic acid (vitamin C) Alfa Aesar (USA) 23

Uric acid sodium Sigma (USA) 24

Trung Quốc 25 Magie clorua (MgCl2)

Tris Bio Basic (Canada) 26

Butylated hydroxytoluen (BHT) Sigma (USA) 27

Merck (EU) 28 Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 Sigma (USA) 29 diphenyltetrazolium bromide tetrazolium

2.1.3. Thiết ị

C c thiết bị c bản đ ợc sử d ng trong nghi n cứu đ ợc li t k trong bảng

ản 3. T iết b đƣợc sử dụn tron n iên cứu

STT Tên t iết b N uồn ốc

M y đo quang ph hấp th iomate 3 Thermo Electron (USA) 1

Tủ an to n sinh học Nuaire (USA) 2

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

3 Máy ly tâm Sigma 3K30 Sartoryus Đức)

4 M y ly tâm l nh Eppendorf Đức)

5 ể n nhi t ED5 Julabo Đức)

6 Tủ hút Esco Vi t Nam)

7 Tủ sấy Memmert Đức)

8 Máy sonicate 3510 ranson H n Quốc)

9 M y nghiền đồng thể IKA T10 Turrax IKA Đức)

10 M y đo quang ph SpectraMax 384 Plus Molecular Devices (USA)

11 Máy HPLC Waters Alliance e2685 Waters (Pháp)

12 Tủ âm sâu -800C MDF-C8V1 Panasonic Nh t)

13 Nguồn soi UV Trung Quốc

14 M y cất quay chân kh ng RV-10 Ika Đức)

Th ớc kẹp k thu t độ ch nh x c 15 Ika Đức) 0,05mm)

2.2. P ƣơn p áp: 2.2.1. T ch chiết m u dược liệu:

M u d ợc li u sau khi thu đ ợc phân lo i, xử lý s ch v sấy kh ở 600C

trong 24h sau đ m u đ ợc t n nhỏ tr ớc khi chiết.

1. Cho m u v o dung dịch ethyl acetat 1:10, g/ml), ủ m u ở 600C trong 2h

2. Lọc cặn v bỏ dịch n i.

3. Phần cặn tiếp t c đ ợc b sung dung dịch n-hecxan 1:10, g/ml), ủ m u ở 600C trong 2h

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

4. Lọc cặn v thu bỏ dịch n i.

5. Tiếp t c b sung ethanol 80 1:10, g/ml), l c m u ở 600C trong 8h.

6. Lọc cặn, thu dịch n i

7. Dung dịch m u thu đ ợc đ ợc bảo quản ở 40C.

2.2.2. S c ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)

S c ký bản mỏng TLC) l một k thu t s c ký đ ợc dùng để t ch c c chất

trong hỗn hợp. Ph ng ph p s c ký lớp mỏng bao gồm pha t nh l một lớp mỏng

c c chất hấp ph , th ờng l silica gel, aluminium oxit, hoặc cellulose đ ợc phủ tr n

một mặt phẳng chất tr . Pha động bao gồm dung dịch cần phân t ch đ ợc hòa tan

trong một dung m i th ch hợp v đ ợc hút l n bản s c ký bởi mao d n, t ch dung

dịch th nghi m d a tr n t nh phân c c của c c th nh phần trong dung dịch.

- Quy trình chạy sắc ký bản mỏng :

ản gel đ ợc c t với chiều d i 6 cm, trong đ , khoảng c ch t đ y đến điểm

ch y l 1,0 cm, v ch d ng c ch c nh tr n của bản gel 1,0 cm. C c giếng đ ợc chấm

cách nhau 1,0 cm v c ch lề 2 b n 0,5 cm.

Hình 7. ản c ạ sắc ký bản mỏn TLC

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Tr ớc khi tra m u, bản gel đ ợc rửa với c c th nh phần của dung m i pha

động, v để kh ở nhi t độ phòng trong 20 phút.

Tra 0,5 µl mỗi m u v o c c giếng tr n bản s c ký. Sau khi tra m u, bản gel

đ ợc để kh ở nhi t độ phòng trong 10 phút tr ớc khi cho v o ch y.

ể s c ký tr ớc khi ch y đ ợc b sung pha động, sao cho ng p to n bộ phần

d ới bể v l ợng dung m i ng p kh ng qu 1 cm v kh ng đ ợc ch m v o vị tr tra

m u. Pha động đ ợc sử d ng trong nghi n cứu n y gồm h s c ký dung m i đặc thù cho phân t ch hợp chất Phenolics t ng số nh :

H dung m i CEA: Cloroform:Ethyl acetat: Acid Formic (5:3:0,4 (v/v))

V h s c ký dung m i đặc thù cho Alkaloids t ng số nh :

H dung m i TEAF: Toluence: Ethyl acetat: Acetone: Acid Formic (5:2:2:1

(v/v))

Sau khi pha động ngấm đến v ch d ng, nhấc bản gel ra khỏi bể s c ký, để

kh trong 20 phút ở nhi t độ phòng. Quan s t c c băng xuất hi n tr n bản s c ký

d ới nh s ng UV c λ=254 nm [24]. S c ký đồ sẽ đ ợc scan l i v phân t ch hình

ảnh bẳng phần mềm ImageJ theo h ớng d n của Vi n nghi n cứu sức khỏe Hoa Kỳ

NIH.

2.2.3. hương ph p s c kí lỏng phổ khối lượng (Liquid chromatography - Mass

spectrometry – LC - MS)

Ph ng ph p s c ký lỏng khối ph định l ợng (LC- MS) l một k thu t

phân t ch h a học giúp x c định lo i chất h a học c trong một m u bằng c ch đo tỷ

l khối l ợng tr n đi n t ch v số l ợng của c c ion pha kh . Đây l k thu t phân t ch đo ph về khối l ợng của c c phân tử t ch đi n khi chúng di chuyển trong đi n

tr ờng. M u đ ợc ion h a trở th nh c c phân tử t ch đi n kh c nhau v đ ợc phân t ch d a v o s sai kh c về gi trị m/z. D li u ph khối đ ợc t động ghi l i v sử

d ng để nh n d ng ho t chất.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Hình 8. Sơ đồ cấu tạo đơn iản của t ốn k ối p ổ

2.2.4. Định lượng khả năng chống oxi hóa tổng số bằng phương ph p quét gốc

tự do DPPH [42]

Trong ph ng ph p thử khả năng chống oxi h a bằng DPPH, c c chất c

ho t t nh kh ng oxi h a sẽ trung hòa gốc DPPH bằng c ch cho một nguy n tử

hydro, t đ l m giảm c ờng độ hấp th t i b ớc s ng 517 nm của dung dịch, màu

của dung dịch sẽ dịch chuyển t t m m u đặc tr ng của DPPH) sang v ng.

Đầu ti n, 4,3 mg DPPH đ ợc pha trong 3,3 ml Ethanol 1000. Hỗn hợp phản ứng gồm 3,5 ml Ethanol 1000, 250 µl DPPH v 250 µl m u. Hỗn hợp đ ợc cho chung v o ống epp, l c m nh v để ủ ở nhi t độ phòng trong 15 phút. Sau khi ủ,

hỗn hợp đ ợc đem đo gi trị hấp th ở b ớc s ng 517 nm. M u chuẩn đ ợc sử d ng

ở đây l vitamin C đ ợc pha th nh nhiều nồng độ t 0.01 mM đến 10 mM. T gi

trị hấp th kết hợp với đ ờng chuẩn vitamin C c thể đ nh gi khả năng chống oxi

h a của m u t ng đ ng với bao nhi u mM vitamin C. Ngo i ra, c thể d a v o

c ng thức sau để x c định khả năng chống oxi h a:

Trong đ :

ABlank: Gi trị hấp th m u tr ng

Am u: Gi trị hấp th của m u c chứa dung dịch chất chống oxy h a

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

2.2.5. Gây bệnh trên mô hình chu t Swiss và thử nghiệm thuốc trên chu t

- Nuôi ổn định chuột trước khi gây bệnh

Chuột sau khi nh n về t Vi n V sinh Dịch tễ Trung ng sẽ đ ợc nu i n định trong 7 ng y tr ớc khi tiến h ng gây b nh. Chuột đ ợc nu i theo quy trình chăm s c: Chuột đ ợc ăn 2 lần trong ng y, lúc 8 giờ s ng v 16 giờ chiều, thời gian chiếu s ng d i 12 giờ/ng y. Chuột đ ợc nu i bằng thức ăn đ ợc cung cấp bởi Vi n V sinh Dịch tễ Trung ng. Trong thời gian nu i n định, c c chỉ số cân nặng, k ch th ớc chân của chuột đ ợc ghi l i t i thời điểm 12 giờ tr a h ng ng y và các thời điểm tr ớc uống thuốc 1 giờ, tr ớc ti m 1 giờ v sau ti m 24 giờ. K ch th ớc chân chuột đ ợc x c định th ng qua đ ờng k nh khớp gối chân chuột bằng th ớc kẹp k thu t với độ sai số ± 0,05mm.

- Gây bệnh trên mô hình chuột: Chuẩn bị dung dịch MSU chuẩn theo tỷ l 1:10 w/v) trong dung dịch P S.

Chuột đ c Swiss tr ng đ ợc nu i n định điều ki n v thúc đẩy cân nặng t

17 g l n đến 30±2 g. Tr ớc khi ti m MSU, chuột đ ợc đo c c chỉ ti u sinh lý nh

trọng l ợng, k ch th ớc khớp 2 chi sau v cố định c c chi. Sử d ng kim ti m 30 ½

G để hút dung dịch MSU v ti m v o vùng khớp chi sau của chuột với l ợng

50µl/chi. Trong hai chi sau, chỉ ti m v o một chi của chuột, chi còn l i kh ng tiêm.

Sau khi ti m 24h, tiến h nh kiểm tra c c chỉ ti u sinh lý của chuột một lần n a tr ớc

khi m giải ph u c c c quan.

- Thử nghiệm thuốc trên chuột: T kết quả c c th nghi m định t nh v định l ợng, c c dịch chiết đ ợc chọn ra. Tr ớc khi cho chuột uống, tất cả c c dịch chiết đều đ ợc đem đi t o cao ở 600C trong 12 giờ. Sau khi tất cả dung m i đã bay h i hết, b sung n ớc v o trong falcon

với l ợng t ng đ ng với dung m i đã sử d ng. Sau đ , tất cả c c m u đ ợc bảo quản ở nhi t độ 40C.

Tr ớc khi tiến h nh ti m MSU 24 giờ, chuột th nghi m đ ợc cho uống d ợc

li u cao với c c liều l ợng: 200 mg/kg thể trọng, 100 mg/kg thể trọng, 50 mg /kg thể trọng v 25 mg/kg thể trọng.

2.2.6. Đ nh gi tình trạng vi m tr n chu t th nghiệm

Tr ớc khi ti m MSU chuột đ ợc đo chỉ ti u về k ch th ớc của 2 khớp chi sau. Sau 24h, tiến h nh đo l i k ch th ớc 2 khớp chi sau tr ớc khi m . So s nh s thay đ i về k ch th ớc của:

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

- Cùng một nh m chuột tr ớc v sau khi ti m MSU.

- Nh m đ ợc ti m MSU v nh m đối chứng.

- Nh m đối chứng v nh m th nghi m.

Đ nh gi tình tr ng vi m bằng KIT ELISA định l ợng IL-1beta trên các m u

huyết thanh của chuột th nghi m.

Quy trình thực hiện:

1. Th m v o mỗi giếng 100 µL / giếng Capture Antibody. Ni m phong đ a v ủ

qua đ m ở 4 °C.

2. Rửa 3 lần với > 250 µL / giếng bằng Wash uffer. L m kh tấm tr n giấy

thấm.

3. lock c c giếng với 200 µL dung dịch pha loãng ELISA / ELISASPOT 1X).

Ủ ở nhi t độ phòng trong 1 giờ.

4. Rửa t nhất một lần bằng Wash uffer.

5. D ng đ ờng chuẩn:

sung 100 µL dung dịch pha loãng ELISA / ELISASPOT 1X) v o c c

giếng để l i giếng đầu ti n trống. Th m 200 µL / giếng Standard đầu ti n v o c c

giếng rỗng đầu ti n A1/A2. Chuyển 100 µL Standard đầu ti n t giếng A1 / A2

sang giếng 1 / 2. Trộn giếng 1 v 2 bằng c ch hút /nhả li n t c v chuyển 100

µL đến c c giếng C1 / C2. Tiếp t c quy trình n y 5 lần.

6. Th m 100 µL m u / giếng v o c c giếng th ch hợp. Th m 100 µL dung dịch ELISA / ELISASPOT 1X) v o giếng trống. Ni m phong đ a v ủ ở nhi t độ

phòng trong 2 giờ hoặc qua đ m ở 4 ° C để c độ nh y tối đa).

7. Hút v rửa nh trong ớc 2, lặp l i 3-5 lần. L m kh tấm tr n giấy thấm.

8. Th m 100 µL/ giếng Detection Antibody v o tất cả c c giếng. Ni m phong

đ a v ủ ở nhi t độ phòng trong 1 giờ.

9. Hút v rửa nh trong ớc 2, lặp l i 3-5 lần. L m kh tấm tr n giấy thấm.

10. Th m 100 µL / giếng Avidin-HRP v o tất cả c c giếng. Ni m phong đ a v ủ

ở nhi t độ phòng trong 30 phút

11. Hút v rửa nh trong ớc 2, lặp l i 5-7 lần.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

12. Th m 100 µL / giếng Dung dịch TM 1X. Ủ ở nhi t độ phòng trong 15 phút

13. Th m 50 µL / giếng của Stop solution, sau đ đo ở b ớc s ng 450 nm.

2.2.7. Đ nh gi tình trạng stress oxi hóa trên chu t thí nghiệm

T kết quả về khả năng chống oxy h a cũng nh đồ thị HPLC của c c dịch

chiết, nh m nghi n cứu tiến h nh thử nghi m cao dịch chiết m u d ợc li u l n

chuột đã bị gây vi m bằng MSU, đối chứng đ ợc sử d ng l colchicine với liều

l ợng 0,5mg/kg thể trọng.

2.2.7.1. Đ nh gi t nh trạng stress oxi hóa m u gan [56]

M u gan đ ợc thu lấy sau khi m . M u đ ợc rửa s ch bằng dung dịch muối sinh lý v bảo quản ở nhi t độ -200C tr ớc khi tiến h nh th nghi m. Trong tr ờng hợp cần phải v n chuyển v bảo quản lâu d i, m u đ ợc ngâm trong dung dịch đ m

bảo quản bao gồm 125mM NaCl, 3mM KCl, 1mM MgCl2, 40mM Tris v gi ở nhi t độ -80oC. Khi tiến h nh th nghi m, m u đ ợc chia nhỏ th nh c c phần c khối l ợng 50mg. M u đ ợc chia trong tr ng th i đ ng cứng v h n chế tối đa s

ch nh l ch nhi t độ trong to n bộ qu trình chia m u. M u gan đ ợc đem cân, chia

nhỏ v b sung đ m bảo quản theo tỷ l 1:10 w/v). Sau khi b sung đ m, m u đ ợc

nghiền đồng thể bằng m y nghiền trong 2 phút.

Dung dịch phản ứng bao gồm 2,0ml HCl pH 3,0), 1,0ml T A 0,06 , 0,5ml

SDS 5 v 0,5ml dịch nghiền đồng thể. Sau khi b sung đầy đủ c c th nh phần, hỗn hợp đ ợc đem ủ ở 98oC trong 45 phút. Dịch phản ứng sau khi ủ sẽ đ ợc để nguội ở nhi t độ phòng trong 10 phút, sau đ b sung n- utanol với tỷ l 1:1 v/v). Hỗn hợp dịch phản ứng v n- utanol đ ợc đem đi l c m nh tr ớc khi ly tâm 3000

xg, trong 15 phút ở nhi t độ phòng nhằm lo i bỏ c c th nh phần kh c. Sau khi ly tâm, thu dịch n i. Dịch chiết sau khi ly tâm đ ợc đem đi định l ợng bằng ph ng

ph p quang ph hấp th ở b ớc s ng 535nm v x c định nồng độ th ng qua c ng thức: Sau khi đo, l ợng MDA trong m u đ ợc t nh to n d a tr n c ng thức:

Trong đ :

mMDA: l l ợng MDA c trong m u

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

A535: độ hấp thu ở b ớc s ng 535 nm

ε= 1.65x105

L: quang trình (= 1cm)

V: thể t ch m u đo 2 mL)

M= 72,07 g/mol

2.2.7.2. Đ nh gi t nh trạng stress oxi hóa m u máu [56]

- Tách chiết màng hồng cầu từ máu: M u t ng số của đ ợc lấy về v l u tr ở 40C. M u m u đ ợc ly tâm 1000 xg để t ch huyết t ng v l u tr ở -200C, lấy 300-400 µl m u v o ống falcol. Tiếp đ , b sung đ m P S Phosphate uffer Saline) theo tỷ l 1:10 v/v), đảo nhẹ ống. Tiếp t c ly tâm m u 600 xg, ở 40C, sau đ hút bỏ dịch n i.

- Phá vỡ tế bào và thu màng tế bào hồng cầu: Tế b o hồng cầu thu đ ợc, b sung đ m Phosphate theo tỷ l 1:10 v/v), voltex m nh, ủ ở -200C, sau đ li tâm hỗn hợp ở 20000 xg, 40C, trong 10 phút, hút bỏ dịch n i. Thao t c tr n đ ợc lặp l i 3 lần. Cuối cùng, khi đã lo i bỏ đ ợc ho n

to n hemogloin trong hỗn h p, tiến h nh thu m ng hồng cầu v o một ống epp 1,5ml v l u tr ở 40oC.

- Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford: C sở ph ng ph p: Cho protein phản ứng với thuốc thử Coomassie riiliant

lue sẽ hình th nh hợp chất m u c khả năng hấp th nh s ng ở b ớc s ng 595 nm. T gi trị độ hấp th quang t i b ớc s ng 595 nm A595) sẽ x c định đ ợc l ợng protein c trong dung dịch.

- Xác định hàm lượng MDA bằng phương pháp TBARS: Chuẩn bị dung dịch T A 0,75 trong HCl 0,3N v dung dịch TCA 1 , pha

trộn hai dung dịch tr n theo tỷ l 1:1 v/v). T nh to n thể t ch dung dịch m ng cần lấy cho 1 phản ứng bằng c ng thức:

Trong đ :

V0,25: Thể t ch m ng hồng cầu cho 1 phản ứng chứa 0,25mg/ml protein t ng

số tr n m ng hồng cầu.)

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

C: Nồng độ mg/ml) protein t ng số.

Th nh phần một phản ứng bao gồm:

Pha trộn hỗn hợp phản ứng nh tr n trong một ống eppendorf 1,5 ml. Mỗi

m u, pha 3 phản ứng với th nh phần nh nhau. Hỗn hợp đ ợc đem đi voltex, ủ ở 980C, trong 30 phút. Cứ sau 10 phút, đảo ống v i lần. Sau khi ủ, ly tâm ở 1000 xg, trong 10 phút v thu dịch n i. Dịch thu đ ợc đo t i b ớc s ng 535 nm bằng m y đo

quang ph , lấy gi trị OD trung bình của 3 lần đo. D a v o h m số:

Trong đ :

A : gi trị OD thu đ ợc

ε : H số hấp th đi n tử

l : Chiều d i nh s ng truyền qua

C : Nồng độ mol của chất hấp th .

T c ng thức t nh h m l ợng MDA tham gia phản ứng:

T đây ta c khối l ợng MDA tr n 1mg Protein t ng số đ ợc t nh bằng:

2.2.8. Phân tích số liệu

Số li u đ ợc xử lý tr n phần mềm Minitab Ver.18, SPSS Statistics 23 v đ ợc biểu diễn d ới d ng Gi trị trung bình ± Sai số chuẩn Mean ± SE). Các ký

hi u thống k :

*: p < 0,05 **: p < 0,01

***: p < 0,001

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

C ƣơn 3: K T QUẢ V THẢO LU N

3.1. Đán giá kết quả tách chiết các mẫu dƣợc li u

Sau khi tham khảo c c b i thuốc trị Gout c truyền chúng t i đã l a chọn c c m u d ợc li u nh : Dây g m (Gnetum parvifolium), Tía tô (Perilla ocymoides L.),

Dâu tằm (Morus alba L.) để đ a v o t ch chiết và nghiên cứu.

3.1.1. Xác định thành phần có trong dịch chiết dựa vào phổ hấp thụ

T hình 14, có thể thấy các dịch chiết vùng hấp th t p trung chủ yếu ở dải t 250-400 nm, đây l vùng hấp th m nh của nhiều ho t chất nhóm alkaloids. C thể, ở dịch chiết tía tô, phồ đồ ghi nh n c 2 đỉnh hấp th m nh ở 275 nm và 340 nm. Theo nghiên cứu của Sangster và Stuart (1965), 2 vùng n y đều là vùng hấp m nh của các hợp chất nhóm Tropane ví d nh atropine sulfate (264nm), cocaine (274 nm), cocaine hydrochloride (274 nm), colchicine (355 nm), demecolcine (355 nm), isocolchicine 345 nm), [64]. Ngoài ra, theo Dong-seon Kim và cộng s (2014), trong dâu tằm còn chứa nhiều các hợp chất thuộc nh m flavonoid nh rutin (3,1 mg/g) và astragalin (2,4 mg/g) [31].

Trong khi đ , ph hấp th của các dịch chiết dâu tằm chỉ t p trung chủ yếu trong khoảng t 220-300 nm, đây l vùng hấp th của các alkaloid thuộc nhóm Lumicolchicines nh β-Lumicolchicine 225 nm), -Lumicolchicine (225 nm) và Lumiisocolchicine (218 nm) [64].

Đặc bi t, đối với dịch chiết dây g m, ph hấp th chỉ thu đ ợc một vùng hấp th duy nhất t 200-350 nm và một đỉnh hấp th c c đ i l 250 nm. Đỉnh này cho thấy, các ho t chất có trong dịch chiêt Dây g m có thể thuộc cùng một nhóm có vùng hấp th t ng t nhau. Trong nghiên cứu của Tang và cộng s 2019) cũng tr n đối t ợng thân Dây g m, nh m đã t ch chiết thành công bốn ho t chất Piceatannol, Rhaponiticin, Resveratrol và Isorhapontigenin. Cả bốn hợp chất này đều c đỉnh hấp th t 210-250 nm, trùng với vùng hấp th của dịch chiết thu đ ợc trong nghiên cứu n y. Đặc bi t, 4 dịch chiết thu đ ợc đều có khả năng chống oxy hóa cao và ức chế ho t động của enzyme xanthine oxidase [73].

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Hình 9. P ổ ấp t ụ của d c c iết

(A): D c c iết tía tô ( ): D c c iết dâu tằm (C): D c c iết ắm

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

3.1.2. X c định thành phần có trong các dịch chiết bằng phương ph p S c ký bản mỏng (TLC):

ớc đầu x c định các thành phần có trong dịch chiết chúng t i đã tiến hành

s c ký định tính các thành phần này trên bản mỏng silicagel một số m u chiết d ợc li u với các h s c ký dung môi đặc thù cho phân tách hợp chất Phenolics t ng số

nh :

HDMT1: Cloroform:Ethyl acetat: Acid Formic (CEF): 5:3:0,4 (v/v)

Và h s c ký dung m i đặc thù cho Alkaloids t ng số nh :

HDMT2: Toluence: Ethyl acetat: Acetone: Acid Formic (TEAF): 5:2:2:1

(v/v)

Sau đ bản s c ký đ ợc sấy kh v đo d ới nh s ng UV c λ=254 nm [24]

cho kết quả nh sau:

D a v o hình ảnh s c ký bản mỏng Hình 10) với h dung m i ch y đặc

tr ng cho hợp chất Alkaloids, chúng t i nh n thấy tr n đ ờng ch y của dịch chiết

xuất hi n c c băng s ng kh c nhau, điều đ cho thấy s c mặt của c c th nh phần

c trong hợp chất alkaloids của c c m u dịch chiết, kh c nhau ở t ng lo i dịch chiết

cũng nh c c bộ ph n trong m u th c v t. n c nh đ c c m u dịch chiết nh t a

tô, dâu tằm đều xuất hi n băng s ng rất rõ r t ở vị tr c gi trị Rf = 0,8, đây đ ợc

coi l gi trị Rf đặc tr ng cho hợp chất Alkaloids. Kết quả n y t ng đ ng với kết

quả của Handriani Kristanti v cộng s 2013), gi trị Rf = 0,8 l gi trị đ i di n cho

hợp chất Alkaloids [38].

Khi ch y s c ký bản mỏng với h s c ký dung m i đặc tr ng cho hợp chất Phenol, chúng t i nh n đ ợc kết quả nh Hình 11, xuất hi n c c băng s ng kh c

nhau tr n đ ờng ch y. Điều đặc bi t l hầu hết c c m u dịch chiết đều xuất hi n c c băng s ng ở vị tr c gi trị Rf= 0,7. Theo nghi n cứu của Allanny A. Furtado và

cộng s năm 2016 cho thấy gi trị Rf= 0,7 l gi trị đ i di n cho c c hợp chất Phenol c trong dịch chiết [34]. Vì v y ban đầu chúng t i c thể khẳng định đ ợc rằng s c mặt của hợp chất Phenol trong c c dịch chiết nh t a t , dâu tằm.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Hình 10. Sắc ký đồ TLC của một số d c c iết với dun môi TEAF

(A): Sắc ký đồ dƣới án sán t ƣờn ( ): Sắc ký đồ dƣới án sán UV λ=254 nm

Giến 1 (TT): D c c iết tía tô; Giến 2 (LD): D c c iết dâu tằm; Giến 3 (G): D c c iết ắm

Hình 11. Sắc ký đồ TLC của một số d c c iết với dun môi CEF Giến 1 (TT): D c c iết tía tô; Giến 2 (LD): D c c iết dâu tằm; Giến 3 (G): D c c iết ắm

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

3.1.3. X c định thành phần có trong các cao chiết bằng phương ph p Thin layer

chromatography (TLC):

Tr ớc khi thử nghi m c c m u d ợc li u tr n động v t, c c dịch chiết sẽ

đ ợc t o cao c đặc bằng ph ng ph p c quay chân kh ng v pha loãng trở l i với n ớc. Tuy nhi n, vi c c quay chân kh ng rất c thể l m thay đ i h m l ợng cũng

nh s c mặt của c c ho t chất c trong m u dịch chiết ban đầu. Vì v y, chúng t i tiến h nh th nghi m n y để so s nh c c th nh phần c trong cao chiết với dịch chiết

ban đầu, kết quả thu đ ợc đ ợc thể hi n trong bản s c ký TLC d ới đây (Hình 12).

Hầu hết c c băng ở m u cao chiết đều c vị tr t ng đồng với vị tr c c băng ở m u

dịch chiết ban đầu. Điều đ cho thấy, qu trình t o cao kh ng l m ảnh h ởng đến

c c th nh phần c trong dịch chiết ban đầu, đảm bảo rằng c c hợp chất phenolic cũng nh hợp chất alkaloids đ ợc quan tâm kh ng bị biến đ i sau qu trình t o cao

để tiếp t c c c th nghi m tr n động v t. n c nh đ , sử d ng ph ng ph p phân

t ch bản TLC bằng phần mềm ImageJ, chúng t i ghi nh n kh ng c s kh c bi t về

h m l ợng c c chất c trong cao chiết v dịch chiết Kết quả trong Ph l c 1).

Hình 12. ản sắc ký t àn p ần có tron d c c iết cao c iết Tía tô Dâu tằm, Gắm với dun môi CEF

(A) Sắc ký đồ dƣới án sán t ƣờn ( ) Sắc ký đồ dƣới án sán UV λ=254 nm

Giến 1 (TT): D c c iết tía tô; Giến 2 (TTH20): Cao c iết tía tô; Giến 3 (LD): D c c iết dâu tằm; Giến 4 (LDH20): Cao c iết dâu tằm;

Giến 5 (G): D c c iết ắm; Giến 6 (GH20): Cao c iết ắm.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

3.1.4. Đ nh gi khả năng chống oxy hóa của các m u dịch chiết

Trong nghi n cứu n y, chúng t i tiến h nh thử khả năng chống gốc t do

DPPH của c c cao chiết t a t , dâu tằm, g m với chất đối chứng d ng l vitamin C. Kết quả đ ợc chỉ ra sau đây.

T kết quả bảng 4 cho thấy, hi u suất phản ứng của hầu hết c c m u dịch

chiết đều cao, trong đ dịch chiết g m, t a t , dâu tằm c hi u suất chống oxy h a >

75 , kết quả n y gần nh t ng đ ng so với hi u suất của vitamin C (86 ± 0,6 %). Kết quả n y t ng đ ng với kết quả nghiên cứu của Yizhong Cai và cộng s (2004) khi khảo sát khả năng chống oxi hóa của 112 lo i d ợc li u cho thấy hi u suất chống oxy h a của dâu tằm là 88,62 ± 0,13 %, lá tía tô là 80,67 ± 0,17% khi

th c hi n phản ứng với DPPH [19].

ản 4. Hi u suất c ốn ox óa của các mẫu d c c iết

STT

Mẫu dƣợc li u (0.1g/ml)

Hi u suất (%)

M u đối chứng

Vitamin C (0.1µg/ml)

86 ± 0,6%

Tía tô

76 ± 0,6%

Dâu tằm

75 ± 0,2%

G m

85 ± 0,1%

Đối với t a t , Meng và cộng s 2008) cho rằng, khả năng chống oxy hóa

của t a t l do chúng chứa h m l ợng lớn c c chất thuộc nh m polyphenolic nh

anthocyanins, c c d n xuất của cinnamic nh Rosmarinic acid, Caffeic acid, c c d n

xuất của flavone nh Luteolin, Apigenin, Scutellarein [55]. Tuy nhiên, trong nghiên

cứu n y ở c c th nghi m tiếp theo chúng t i đã định danh trong th nh phần cao t a

t , chúng t i chỉ thu đ ợc duy nhất Beta-caryophyllene l thuộc nh m flavonoid. Trong nghi n cứu của Dahham và cộng s 2015), kh ng chỉ c khả năng kh ng

vi m v giảm đau, eta-caryophyllene cũng đồng thời c t nh chống oxi h a. Khi so s nh với Vitamin C, nh m t c giả ghi nh n, gi trị IC50 của eta-caryophyllene thấp h n của vitamin C 1,25±0,06 v 1,5±0,03 µg/ml).

3.1.5. Định danh m t số hoạt chất có trong cao bằng phương ph p khối phổ

T c c cao d ợc li u đã đ ợc s ng lọc bằng ph ng ph p Uv-vis, TLC, DPPH, cũng thử nghi m tr n tế b o của nh m nghi n cứu t tr ớc đ , chúng t i đã

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

gồm Sesquicitronellene, eta-caryophyllene,

tiến h nh gửi một số m u cao dịch chiết nhằm định danh c c th nh phần ho t chất bằng ph ng ph p s c ký kết hợp khối ph . Kết quả thu đ ợc cho thấy, trong các m u cao chiết đ ợc gửi đi, ngo i một số chất c thể đ ợc định danh (Hình 14) thì v n còn một số chất ch a c trong th vi n. Do đ , đòi hỏi cần c nh ng nghi n cứu chuy n sâu h n nhằm x c định đ ợc c c ho t chất c trong cao chiết. C thể, ở m u cao t a t , c t ng cộng 5 chất đ ợc x c định, trong đ c 4 chất đ ợc định danh, 4-(prop-1-en-2- yl)cyclohexanecarbaldehyde, (10E,13E)-2-methoxynonadeca-1,10,13-triene. Trong 4 ho t chất đ ợc định danh, c 1 chất thuộc nh m flavonoid l eta-caryophyllene, đây l chất c khối l ợng phân tử l 204,35 g/mol v c khả năng chống vi m tốt. Nghi n cứu của Cho v cộng s 2007) tr n đối t ợng chuột bị vi m mi ng đã ghi nh n, ở 2 nh m chuột đ ợc uống eta-caryophyllene với liều l ợng 30 v 300 mg/kg thể trọng, đều c s giảm m nh so với nh m b nh, t 3,2/4,0 của nh m b nh xuống còn 2,0/4,0 của nh m uống với liều 30 mg/kg thể trọng v xuống thấp nhất còn 1,8/4,0 khi chuột uống với liều 300 mg/kg thể trọng. n c nh đ , l ợng interleukin trong huyết thanh chuột cũng c s giảm đ ng kể t 3,1 pg/ml ở nh m b nh xuống còn 1,5 pg/ml của nh m uống 300 mg/kg thể trọng [22]. Ngoài ra, nhiều nghi n cứu kh c cũng đã chứng minh khả năng giảm đau của eta- caryophyllene [35, 41, 45].

Cao dâu tằm c 4 chất đ ợc x c định v chỉ c 1 chất đ ợc định danh l Phytol. Trong nghi n cứu của Santos v cộng s 2013), phytol đ ợc xem l chất c tính chông oxi hóa m nh. n c nh đ , Silva v cộng s (2013) đã chứng mình đây cũng đồng thời l một chất c khả năng chống vi m khi thử tr n m hình chuột [65, 68].

Cuối cùng, c 4 ho t chất đ ợc định danh trong m u cao dây g m gồm Homocatechol, Methyl inositol, Pentadecanoic acid, Dioctyl isophthalate, và còn 2 ho t chất ch a đ ợc định danh. Trong số 4 chất đ ợc định danh chỉ c duy nhất Homocatechol thuộc nh m c c chất phenolic.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Hình 13. Sắc ký đồ k ối p ổ của eta-caryophyllene

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Hình 14. Các oạt c ất có tron cao c iết

(A) Các oạt c ất tron cao tía tô ( ) Các oạt c ất tron cao dâu tằm, (C) Các oạt c ất tron cao ắm

3.2. Đán iá kết quả xây dựn mô ìn động vật b gout

Trong nghi n cứu n y, chúng t i chia chuột th nh 3 lô ch nh, trong đ l đối chứng sinh học bị k ch th ch bởi P S, đối chứng âm đ ợc tiêm MSU, đối chứng

d ng đ ợc ti m MSU v uống colchicine với nồng độ 0,5 mg/kg thể trọng). Chuột đ ợc gây vi m bằng c ch ti m MSU t i vị tr khớp gối chi trái, tiêm 50µL

MSU với nồng độ 1mg/1µL trong PBS sau khi cho uống thuốc 24 giờ. Sau đ

chúng t i đ nh gi , so s nh mức độ thay đ i gi a c c nh m chuột d a tr n c c chỉ

ti u về hình th i, tình tr ng vi m v stress oxy hóa. C c m u d ợc li u đ ợc sử

d ng để thử nghi m tr n chuột bao gồm: Dây g m Gnetum parvifolium), Tía tô

(Perilla ocymoides L.), Dâu tằm Morus alba L.)

3.2.1. Chỉ số hình thái

C c chỉ số hình th i trong nghi n cứu n y chúng t i ghi nh n th ng qua chỉ

số cân nặng, k ch th ớc chân ở c c thời điểm tr ớc khi uống thuốc, tr ớc khi ti m

sau khi uống thuốc 24 giờ) và sau khi tiêm sau khi uống thuốc 48 giờ). Kết quả

đ ợc thể hi n qua c c bảng số li u d ới đây:

ản 5. C ỉ số cân nặn tại các t ời điểm t í n i m (Đơn v tín : ram)

STT Nhóm

Trƣớc k i uốn t uốc 1 iờ 23,5±1,1 Trƣớc k i tiêm 1 iờ 24,4±1,2 Sau khi tiêm 24 iờ 24,9±1,1

ĐC SH (n=6) ĐC Âm (n=6) 1 2 22,7±0,8 24,4±0,6 23,4±0,9

3 23,4±0,1 21,4±0,1 20,9±0,2 ĐC D ng (n=6)

T kết quả về chỉ số cân nặng đ ợc thể hi n tr n bảng 5, cho thấy chuột ở nh m đối chứng sinh học khi chỉ c s k ch th ch của P S c xu h ớng tăng theo

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

thời gian. Trong khi đ , chuột ở nh m đối chứng âm mặc dù v n c xu h ớng tăng t ng y đầu đến ngày tr ớc khi tiêm, tuy nhiên sau ngày tiêm (khi đã đ ợc kích th ch vi m bằng MSU) thì cân nặng kh ng c s thay đ i của tr ớc ti m v sau ng y ti m, điều đ chứng tỏ yếu tố gây vi m MSU c nh ng t c động nhất định tới khả năng sinh tr ởng v ph t triển của chuột. Ở nh m đối chứng d ng khi chuột đ ợc cho uống bằng Colchicine thì cân nặng đ ợc giảm rõ r t ngay sau ng y uống, cho thấy đã c s t c động của Colchicine l n chuột. Kết quả n y t ng t với c ng bố của nh m iomodels về xây d ng m hình gout. Nh m cũng ghi nh n s tăng k ch th ớc v cân nặng của nh m đối chứng sinh học trong 48 giờ kể t khi b t đầu thì nghi m. Đây ho n to n l qu trình tăng tr ởng t nhi n của chuột. Trong khi ở nh m đ ợc ti m MSU, chỉ số cân nặng của chuột kh ng c s thay đ i nhiều v th m ch l c s giảm nhẹ ở 24 giờ đầu ti n [17]. Ng ợc l i, trong nghi n cứu của nhóm Marcotti và cộng s 2018), k ch th ớc v cân nặng của nh m chuột đối chứng sinh học đ ợc duy trì gần nh kh ng đ i sau 8 tiếng th nghi m, trong khi đ , ở hai nh m chuột uống v ti m MSU, chỉ số n y tăng m nh trong 3 giờ đầu ti n v sau đ giảm nhẹ t i thời điểm 8 giờ sau ti m [51].

Tr ớc khi ti m Sau khi ti m 24 giờ

Hình 15. C ân c uột trƣớc và sau khi tiêm MSU

Tiếp theo chúng t i đ nh gi s thay đ i của chuột d a tr n chỉ số k ch th ớc chân chuột Bảng 6), cho thấy rằng kh ng c s thay đ i nhiều k ch th ớc đ ờng k nh chân chuột gi a c c ng y tr ớc khi uống thuốc v tr ớc khi ti m ở cả chân trái v chân phải. n c nh đ , độ d i đ ờng k nh gi a chân tr i v chân phải c s t ng đ ng nhau trong cùng một con chuột. Tuy nhi n k ch th ớc đ ờng k nh chân trái (chân đ ợc ti m) c s thay đ i ở hầu hết c c nh m sau ng y ti m. Nh m chuột đối chứng sinh học đ ợc k ch th ch bằng P S, k ch th ớc chân kh ng c s thay đ i nhiều, còn nh m chuột đ ợc k ch vi m bằng MSU k ch th ớc đ ờng k nh

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

chân tr i l i c s tăng rõ r t. Đặc bi t ở nh m đối chứng âm, nh m chỉ đ ợc k ch vi m bằng MSU v kh ng c điều trị cho thấy k ch th ớc đ ờng k nh chân chuột tăng rất m nh với p < 0,05, điều đ chứng tỏ rằng đã c s t c động gây vi m của MSU l n vị tr khớp vị tr ti m) của chuột. Đối với chân phải, chân kh ng bị ti m trong th nghi m n y thì kh ng thấy c s thay đ i về k ch th ớc chân trong tất cả c c nh m gi a c c ng y v gi a c c nh m với nhau. Đối với nh m đối chứng d ng bị k ch vi m bằng MSU v đ ợc điều trị bằng Colchicine, k ch th ớc chân kh ng c s thay đ i vì v y b ớc đầu c thể đ nh gi rằng Colchincine đã tham gia v o qu trình giảm s ng vi m ở chuột bị gây gout. Trong nghi n cứu của Yao v cộng s 2012), k ch th ớc chân ti m của nh m chuột đối chứng sinh học c s tăng nhẹ, s tăng n y l do s tăng k ch n ớc to n thân của chuột trong qu trình sinh tr ởng của chuột. trong khi đ , ở nh m chuột m hình, k ch th ớc chân bị gây viêm gout của chuột c s tăng m nh về k ch th ớc trong 24 giờ sau ti m [81]. T ng t , trong một khảo cứu của nh m iomodels, k ch th ớc chân nh m chuột gây m hình tăng rất m nh trong 48 giờ dầu ti n sau ti m v sau đ giảm dần theo thời gian. Hi n t ợng n y l do trong c thể chuột lu n c sẵn c c enzyme giúp chuyển h a acid uric v đ o thải qua đ ờng n ớc tiểu. Do đ , nh m đ a ra khuyến cao, n n th c hi n c c th nghi m thử thuốc trong 48 giờ kể t khi ti m MSU để gây mô hình. Trong khi đ , ở nh m chuột đối chứng sinh học, cũng c s tăng nhẹ về k ch th ớc chân trong 48 giờ đầu ti n, nh ng sau 72 giờ, k ch th ớc chân chuột trở về tr ng th i ban đầu [17].

ản 6. Kíc t ƣớc c ân c uột tại các t ời điểm t í n i m (Đơn v tín : mm3)

Trƣớc k i uốn t uốc

Trƣớc k i tiêm

Sau khi tiêm

STT

Nhóm

1 iờ

24 iờ

Chân trái C ân p ải Chân trái C ân p ải Chân trái C ân p ải

ĐC SH (n=6)

3,1±0,1

3,2±0,09

3,2±0,1

3,2±0,08

3,3±0,09

ĐC Âm (n=6)

3,2±0,11

3,1±0,1

3,2±0,07

3,2±0,08

4,3±0,09

3,2±0,1

3,2±0,07

3,3±0,1

3,3±0,09

3,3±0,07

3,2±0,09

3,2±0,1

ĐC D ng (n=6)

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

3.2.2. Đ nh gi tình trạng viêm của m hình đ ng vật khi được gây gout b i MSU

Ở th nghi m n y, tình tr ng vi m của chuột đ ợc đ nh gi th ng qua chỉ số IL-1β c trong huyết thanh. Theo đ , ở nh m chuột ĐC âm, l ợng IL-1β cao h n hẳn so với 2 nh m còn l i p<0,001) iểu đồ 1). Kết quả n y chứng minh l ợng MSU ti m v o c đùi chuột kh ng chỉ l m thay đ i hình th i chân m đồng thời gây ra tr ng th i vi m m nh đúng nh d đo n. Tiếp đ , khi đ ợc uống colchicine trong 24 giờ, tình tr ng vi m của chuột c dấu hi u giảm so với nh m ĐC âm p<0,001) nh ng v n cao h n nh m chuột đối chứng p<0,001), kết quả n y c thể l do thời gian sử d ng thuốc v n còn qu ng n, mới chỉ d ng l i sau 24 giờ. Kết quả t ng t cũng đ ợc ghi nh n trong nghi n cứu của Lanzhou v cộng s (2017). Trong nghiên cứu của mình, Lanzhou cũng sử d ng chuột l m đối t ợng nghi n cứu v ph t hi n rằng, chỉ số IL-1β ở nh m chuột m hình gout cao h n nhiều so với c c nh m đối chứng sinh học v nh m đối chứng d ng. Tuy nhi n, khi cho chuột uống colchicine với liều l ợng 0,3mg/kg, chỉ số IL-1β của nh m gây b nh quay trở l i tr ng th i bình th ng v o t ng đ ng với nh m đối chứng sinh học [47].

Với c c kết quả phân t ch s thay đ i hình th i v tình tr ng vi m của chuột, chúng t i kết lu n, đã xây d ng th nh c ng m hình viêm tr n đối t ợng chuột đ c SWISS tr ng v c thể sử d ng m hình n y để thử nghi m d ợc t nh chống gout của c c lo i cao d ợc li u.

iểu đồ 1. Nồn độ IL-1β tron u ết t an c uột trên 3 n óm ĐC SH ĐC m và ĐC Dƣơn

(***: p<0,001)

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

3.3. Đán iá tác động của cao chiết lên động vật 3.3.1. Chỉ số hình thái

Th nghi m n y nhằm phân t ch s thay đ i hình th i của chuột khi đ ợc uống các lo i cao d ợc li u. Kết quả bảng 7 v 8 ghi nh n, ở c c nh m chuột uống cao d ợc li u, chuột c s tăng nhẹ về chỉ số cân nặng t ng t nh nh m đối chứng sinh học. Đặc bi t l nh m chuột uống cao chiết dâu tằm, chuột tăng tối đa 18,8 cân nặng so với thời điểm tr ớc khi uống thuốc Ở nh m chuột uống cao chiết tía tô, cân nặng của chuột cũng tăng 23,6 so với thời điểm b t đầu th nghi m. Nh m chuột cuối cùng uống cao chiết dây g m cũng c s tăng m nh về chỉ số cân nặng tăng 17,0 ), trong khi ở nh m đối chứng âm, chuột chỉ tăng 5,9 cân nặng so với thời điểm t ớc khi uống. C c số li u ghi nh n, vi c cho chuột uống cao chiết kh ng l m thay đ i qu trình trình sinh tr ởng của chuột, c thể l ở qu trình tăng k ch th ớc v cân nặng.

ản 7. C ỉ số cân nặn tại các t ời điểm t í n i m (Đơn v tín : ram)

Trƣớc k i uốn t uốc

Trƣớc k i tiêm

Sau khi tiêm

STT

Nhóm

1 iờ

24 iờ

ĐC SH (n=6)

23,5±1,1

24,4±1,2

24,9±1,1

ĐC Âm (n=6)

22,7±0,8

24,4±0,6

23,4±0,9

ĐC D ng (n=6)

23,4±0,1

21,4±0,1

20,9±0,2

PBS+ TT50 (n=4)

20,5±0,77

22,5±0,89

23,2±0,76

PBS+ TT100 (n=4)

18,6±0,70

21,3±0,90

23,0±0,83

PBS+ LD50 (n=4)

19,1±1,11

22,5±1,09

22,7±1,23

PBS+ LD100 (n=4)

20,0±0,60

20,3±0,76

21,5±0,65

PBS+ G25 (n=4)

23,8±0,77

26,5±0,64

28,3±0,89

PBS+ G50 (n=4)

24,5±1,06

26,4±0,98

28,8±1,08

PBS+ G100 (n=4)

21,7±0,77

23,3±0,89

25,4±0,93

PBS+ G200 (n=4)

22,7±0,98

24,5±0,76

26,5±0,85

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Trong nghi n cứu n y, chúng t i cũng tiến h nh đ nh gi chỉ số k ch th ớc chân của chuột t i c c thời điểm tr ớc khi uống thuốc, tr ớc khi ti m v sau khi ti m 24 giờ. Kết quả t bảng 8 cho thấy, chân phải chân kh ng đ ợc ti m) của chuột, c s tăng nhẹ về k ch th ớc, tuy nhi n, c thể đây l s tăng h l y của qu trình tăng k ch th ớc v cân nặng của chuột trong qu trình th nghi m. C thể, ở nh m chuột đối chứng sinh học, chân phải chỉ tăng 3,1 , t ng t nh v y, ở nh m đối chứng âm, chỉ số n y cũng chỉ tăng 3,2 . Kết quả n y cũng lặp l i ở c c nh m chuột đ ợc uống cao d ợc li u.

Tr i ng ợc với chân phải, ở chân tr i chân đ ợc ti m), c s biến động m nh về k ch th ớc ở c c nh m chuột. Theo đ , nh m đối chứng sinh học tăng 6,4 , trong khi nh m đối chứng âm, đúng nh kỳ vọng, k ch th ớc chân c s tăng m nh, tới 34,3 . Ở c c nh m chuột đ ợc uống cao d ợc li u, k ch th ớc chân c s tăng nhẹ gi a c c thời điểm đo, th m ch ở một số nh m, kh ng ghi nh n s tăng k ch th ớc chân ở c c thời điểm đo, v d nh ở nh m uống cao chiết dây g m liều 100 mg/kg, trong khi ở c c nh m uống cao chiết còn l i, k ch th ớc chân tr i chỉ tăng trong khoảng t 5-8%.

Nh v y, về mặt hình th i, với hai chỉ số k ch th ớc chân v cân nặng, chúng t i ghi nh n, c c cao chiết n y kh ng gây c c biến đ i trong qu trình sinh tr ởng của chuột.

ản 8. Kíc t ƣớc c ân c uột tại các t ời điểm t í n i m (Đơn v tín : mm3)

Trƣớc k i tiêm

Sau khi tiêm

STT

Nhóm

1 iờ

24 iờ

Trƣớc k i uốn t uốc 1 iờ

Chân trái C ân p ải Chân trái C ân p ải Chân trái C ân p ải

ĐC SH n=6)

ĐC Âm n=6)

3,1±0,1 3,2±0,09 3,2±0,1 3,2±0,08 3,3±0,09 3,3±0,09 1

ĐC D ng n=6)

3,2±0,11 3,1±0,1 3,2±0,07 3,2±0,08 4,3±0,09 3,2±0,1 2

PBS+ TT50 (n=4)

3,2±0,07 3,3±0,1 3,3±0,09 3,3±0,07 3,2±0,09 3,2±0,1 3

PBS+ TT100 (n=4) 2,9±0,09 2,9±0,08 3,0±0,07 3,0±0,11 3,1±0,07 3,1±0,09

2,8±0,08 2,8±0,09 3,0±0,08 2,9±0,09 3,2±0,08 3,0±0,08 4

PBS+ LD50 (n=4)

2,8±0,11 2,9±0,09 3,0±0,07 3,0±0,1 3,1±0,08 3,1±0,11 6

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

PBS+ LD100 (n=4) 2,9±0,07

PBS+ G25 (n=4)

7 3,0±0,1 2,9±0,09 3,0±0,09 3,0±0,08 3,0±0,1

PBS+ G50 (n=4)

8 3,1±0,09 3,1±0,12 3,1±0,08 3,2±0,09 3,2±0,09 3,2±0,1

PBS+ G100 (n=4)

9 3,2±0,08 3,3±0,08 3,2±0,1 3,3±0,07 3,2±0,11 3,2±0,09

PBS+ G200 (n=4)

10 3,2±0,09 3,1±0,08 3,2±0,07 3,1±0,09 3,2±0,11 3,2±0,08

11 3,1±0,1 3,1±0,11 3,2±0,09 3,2±0,1 3,2±0,1 3,3±0,09

3.3.2. Đ nh gi tình trạng viêm của chu t khi uống cao chiết

Trong th nghi m n y, chuột đ ợc đ nh gi tr ng th i vi m th ng qua chỉ số IL-1β. T biểu đồ 2, kết quả cho thấy, ở c c nh m chuột uống cao d ợc li u, chỉ số IL-1β kh ng c s kh c bi t so với nh m đối chứng sinh học p=0,33). Trong khi ở nh m đối chứng âm, chỉ số n y tăng m nh v kh c bi t ho n to n so với tất cả c c nh m còn l i p<0,001).

Các kết quả hình th i v tr ng th i vi m cho thấy, cao chiết d ợc li u kh ng gây ra c c bất th ờng về hình th i cũng nh tr ng th i dị ứng, vi m của động v t th nghi m.

( ***: p<0,001)

iểu đồ 2.Nồn độ IL-1β tron u ết t an c uột k i uốn các cao c iết

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

3.3.3. Đ nh gi t c đ ng của cao chiết đối với c c cơ quan chu t

Đối chứng sinh học Đối chứng âm Đối chứng d ng Nh m uống cao tía tô Nh m uống cao dâu tằm Nh m uống cao g m

T ng thể

Th n

Gan

Hình 16. Các cơ quan nội tạn c uột t í n i m

Trong nghi n cứu n y, một ng y sau ti m, chúng t i giải ph u, đ nh gi t c

động thay đ i hình th i của c c t c nhân th nghi m l n c c c quan nội t ng tất cả

chuột th nghi m nh : Gan, th n, d d y, ruột . ở tất cả c c nh m nhóm: nhóm

đối chứng sinh học, đối chứng âm, đối chứng d ng v nh m th nghi m nh m

cho uống cao chiết). Nh n thấy rằng, hình th i của c c c quan nội t ng chuột ho n

to n bình th ờng, kh ng c s kh c bi t gi a c c nh m chuột. Vì v y ban đầu c

thế đ nh gi đ ợc rằng, MSU cũng nh cao chiết c c m u d ợc li u ch a ph hủy

hình thái các c quan nội t ng chuột.

3.4. Đán iá tác động của cao chiết lên mô ìn động vật gout

Trong nghi n cứu này, chúng t i chia chuột th nh 4 lô ch nh, trong đ l đối chứng sinh học bị k ch th ch bởi P S, đối chứng âm đ ợc ti m MSU, đối chứng d ng đ ợc ti m MSU v uống colchicine với nồng độ 0.5 mg/kg thể trọng), lô còn l i đ ợc ti m MSU v cho uống cao chiết t c c d c li u t a t , dâu tằm, g m với c c nồng độ kh c nhau). Chuột đ ợc gây vi m bằng c ch ti m MSU t i vị tr khớp gối chi tr i, ti m 50µL MSU huyền phù trong P S với nồng độ 1mg/1µL sau khi cho uống thuốc 24 giờ. Sau đ chúng t i đ nh gi , so s nh mức độ thay đ i gi a

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

c c nh m chuột d a tr n c c chỉ ti u về stress oxy h a v tr ng th i vi m th ng qua

chỉ số IL-1β trong huyết thanh.

3.4.1. Chỉ số hình thái

C c chỉ số hình th i trong nghi n cứu n y chúng t i ghi nh n th ng qua chỉ

số cân nặng, k ch th ớc chân v khả năng di chuyển ở c c thời điểm tr ớc khi uống

thuốc, tr ớc khi ti m sau khi uống thuốc 24 giờ) v sau khi ti m sau khi uống

thuốc 48 giờ). Kết quả đ ợc thể hi n qua c c bảng số li u d ới đây:

ản 9. C ỉ số cân nặn tại các t ời điểm t í n i m (Đơn v tín : ram)

ĐC SH n=6)

Sau khi tiêm Trƣớc k i uốn Trƣớc k i tiêm STT Nhóm 24 iờ t uốc 1 iờ 1 iờ

ĐC Âm n=6)

23,5±1,1 24,4±1,2 24,9±1,1 1

ĐC D ng n=6)

22,7±0,8 24,4±0,6 23,4±0,9 2

MSU+ TT50 (n=6)

23,4±0,1 21,4±0,1 20,9±0,2 3

19,5±0,6 22,6±0,7 23,7±0,6 4

MSU+ LD50 (n=6)

5 MSU+ TT100 (n=6) 18,9±1,0 21,7±1,0 22,7±1,0

6 19,0±1,1 20,4±1,0 22,6±1,1

MSU+ G25 (n=6)

7 MSU+ LD100 (n=6) 19,0±1,0 21,0±1,0 22,0±1,1

MSU+ G50 (n=6)

24,7±1,1 26,0±1,1 28,0±1,0 8

24,2±0,6 24,5±0,6 26,9±0,7 9

10 MSU+ G100 (n=6) 22,0±1,2 24,0±1,1 25,8±1,0

11 MSU+ G200 (n=6) 25,1±0,6 25,7±0,8 27,1±0,80

T kết quả về chỉ số cân nặng đ ợc thể hi n tr n bảng 9, cho thấy chuột ở nh m đối chứng khi chỉ c s k ch th ch của P S c xu h ớng tăng theo thời gian. Trong khi đ , chuột ở nh m đối chứng âm mặc dù v n c xu h ớng tăng t ng y

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

đầu đến ng y tr ớc khi ti m, tuy nhi n sau ng y ti m khi đã đ ợc k ch th ch vi m

bằng MSU) thì cân nặng kh ng c s thay đ i của tr ớc ti m v sau ng y ti m, điều

đ chứng tỏ yếu tố gây vi m MSU c nh ng t c động nhất định tới khả năng sinh tr ởng v ph t triển của chuột. Ở nh m đối chứng d ng, khi chuột đ ợc cho uống

bằng Colchicine thì cân nặng đ ợc giảm rõ r t ngay sau ng y uống, cho thấy đã c

s t c động của Colchicine l n chuột. n c nh đ , nh ng nh m chuột đ ợc cho

uống dịch chiết thì cân nặng v n c xu h ớng tăng theo thời gian mặc dù c s t c động k ch vi m của MSU, điều đ cho thấy c c dịch chiết ban đầu đã c nh ng t c

động t ch c c đến c thể chuột.

Theo nh kết quả đ ợc thể hi n ở ảng 10, cho thấy rằng kh ng c s thay

đ i nhiều k ch th ớc đ ờng k nh chân chuột gi a c c ng y tr ớc khi uống thuốc v tr ớc khi ti m ở cả chân tr i v chân phải. n c nh đ , độ d i đ ờng k nh gi a

chân tr i v chân phải c s t ng đ ng nhau trong cùng một con chuột. Tuy

nhi n k ch th ớc đ ờng k nh chân tr i chân đ ợc ti m) c s thay đ i ở hầu hết

các nhóm sau ngày tiêm. Nh m chuột đ ợc k ch vi m bằng MSU k ch th ớc đ ờng

k nh chân tr i l i c s tăng rõ r t. Đặc bi t ở nh m đối chứng d ng, nh m chỉ

đ ợc k ch vi m bằng MSU v kh ng c điều trị cho thấy k ch th ớc đ ờng k nh

chân chuột tăng rất m nh với p < 0,05, điều đ chứng tỏ rằng đã c s t c động gây

vi m của MSU l n vị tr khớp vị tr ti m) của chuột. Đối với chân phải, chân kh ng

bị ti m trong th nghi m n y thì kh ng thấy c s thay đ i về k ch th ớc chân trong

tất cả c c nh m gi a c c ng y v gi a c c nh m với nhau. an đầu c thể đ nh gi

đ ợc đã t o th nh c ng m hình chuột bị gout. Đối với nh m đối chứng d ng bị

k ch vi m bằng MSU v đ ợc điều trị bằng Colchicine thì thấy rằng k ch th ớc

chân kh ng c s thay đ i, còn đối với nh m chuột th nghi m khi đ ợc điều tri

bằng dịch chiết d ợc li u, k ch th ớc đ ờng k nh chân tr i chuột c xu h ớng tăng nhẹ tuy nhi n thấp h n rất nhiều so với nh m đối chứng âm chỉ ti m MSU, điều đ cho thấy c c dịch chiết d ợc li u đã l m giảm qu trình vi m đối với chuột bị gout.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

ản 10. Kíc t ƣớc c ân c uột tại các t ời t í n i m (Đơn v tín : mm)

Trƣớc k i tiêm Sau khi tiêm STT Nhóm

1 iờ 24 iờ Trƣớc k i uốn t uốc 1 iờ

Chân trái C ân p ải Chân trái C ân p ải Chân trái C ân p ải

ĐC SH n=6)

ĐC Âm n=6)

3,1±0,1 3,2±0,09 3,2±0,1 3,2±0,08 3,3±0,09 3,3±0,09 1

3,2±0,11 3,1±0,1 3,2±0,07 3,2±0,08 4,3±0,09 3,2±0,1 2

ĐC D ng (n=6)

3,2±0,07 3,3±0,1 3,3±0,09 3,3±0,07 3,2±0,09 3,2±0,1 3

MSU+ TT50 (n=6)

4 3,0±0,09 2,8±0,08 3,0±0,07 2,9±0,09 3,5±0,1 3,1±0,1

MSU+ TT100 (n=6)

5 2,9±0,09 2,6±0,09 3,0±0,1 3,0±0,08 3,7±0,11 3,1±0,11

MSU+ LD50 (n=6)

6 2,9±0,1 2,8±0,09 3,0±0,09 3,0±0,08 3,5±0,1 3,0±0,09

MSU+ LD100 (n=6)

7 3,0±0,08 2,9±0,09 3,0±0,1 3,0±0,11 3,5±0,11 3,0±0,09

MSU+ G25 (n=6)

8 3,5±0,09 3,3±0,08 3,4±0,07 3,5±0,08 3,5±0,1 3,2±0,11

MSU+ G50 (n=6)

9 3,3±0,08 3,4±0,09 3,3±0,1 3,2±0,08 3,6±0,09 3,3±0,1

MSU+ G100 (n=6)

10 3,4±0,1 3,3±0,08 3,3±0,08 3,3±0,11 3,5±0,11 3,1±0,09

MSU+ G200 (n=6)

11 3,3±0,09 3,3±0,08 3,1±0,09 3,2±0,1 3,6±0,11 3,2±0,1

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

3.4.2. Đ nh gi tình trạng stress oxy hóa mô hình chu t bị gây bệnh gout khi được thử nghiệm uống cao chiết

Trong nghi n cứu n y, chúng t i tiếp t c đ nh gi khả năng chống oxy của

c c m u cao chiết d ợc li u tr n m hình động v t th ng qua tình tr ng stress oxy hóa đ ợc đ nh gi bởi h m l ợng MDA trong m u m u, m u m gan v m u m c

chân. MDA (Malondialdehyd) là kết quả của quá trình peroxy hóa lipid, đ ợc biết đến l sản phẩm thứ sinh đ ợc sử d ng nh một dấu ấn sinh học dùng để đ nh gi

tình tr ng peroxi h a lipid cũng nh stress oxi h a trong c thể ng ời v động v t

[49].

3.4.2.1. Đ nh gi hàm lượng MDA trong máu

Tình tr ng stress oxy h a trong m u chuột đ ợc đ nh gi th ng qua h m l ợng MDA trong m u m u, kết quả đ ợc thể hi n nh trong biểu đồ 3. Mặc dù với

c c nh m chuột uống cao chiết dây g m c l ợng IL-1β cao nhất trong cả 3 nh m

cao chiết đ ợc thử nghi m, nh ng đây l i l nh m c tr ng th i stress oxi h a ở

m u thấp nhất với l ợng MDA lần l ợt l 0,082±0,002, 0,157±0,009, 0,219±0,026,

và 0,186±0,015 µg/mg protein ứng với chiều tăng của liều l ợng sử d ng. Kết quả

này có thể là do khả năng chống oxi hóa của cao chiết dây g m. Nh đã đề c p ở

trên, dịch chiết dây g m có khả năng chống oxi hóa rất cao, th m chí tốt h n cả

vitamin C.

Ở hai nhóm uống cao chiết tía tô với liều l ợng 50 và 100 mg/kg thể trọng,

tình tr ng stress oxi hóa có dấu hi u giảm m nh theo chiều tăng liều l ợng sử d ng

với p=0,01 (0,878±0,126 và 0,685±0,016 µg/mg protein). Khi so sánh với l ợng

MDA ở nh m đối chứng âm, kết quả ghi nh n, tình tr ng stress oxi hóa không có

dấu hi u giảm ở cả hai liều l ợng cao sử d ng (p>0,05).

T ng t nh nh m chuột uống cao tía tô, nhóm chuột uống cao dâu tằm cũng c tr ng thái stress oxi hóa rất cao, lần l ợt là 1,017±0,107 và 0,814±0,03

µg/mg protein t ng ứng với nồng độ 50 và 100 mg/kg thể trọng (p=0,002). Đặc bi t, tr ng thái stress oxi hóa của nhóm chuột uống cao dâu tằm với liều 50 mg/kg thể trọng còn đ t giá trị cao nhất trong tất cả các nhóm chuột thí nghi m.

Kết quả này cho thấy, các cao chiết của dây g n có tác d ng tốt trong vi c làm giảm tình tr ng stress oxi h a to n c thể chuột, giảm stress oxi hóa về t ng đ ng nh m đối chứng sinh học. Trong khi đ , c c cao chiết tía tô và dâu tằm đều l m tăng tr ng th i stress oxi h a to n c thể chuột.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

(**: p<0,01; ***: p<0,001)

iểu đồ 3.Hàm lƣợn MDA tron máu c uột

3.4.2.2. Đ nh gi hàm lượng MDA trong m u mô gan

T kết quả đ ợc thể hi n trong biểu đò 4, cho thấy rằng ở nh m chuột đối

chứng âm, l ợng MDA ở gan cao h n rất nhiều so với c c nh m kh c

20,887±0,762 mg/kg m u) v s kh c bi t n y c ý ngh a thống k với p<0,001.

ằng kiểm định Turkey, nh m n y đ ợc phân ra th nh nh m ri ng, kh c ho n to n

với tất cả c c nh m còn l i. Trong khi đ , nh m đối chứng sinh học c l ợng MDA

ở gan t ng đ ng với nh m chuột m hình v đ ợc uống cao chiết dây g m c c

nồng độ p=0,10). Kết quả n y cho thấy, ở tất cả c c liều l ợng sử d ng, cao chiết

dây g m c t c d ng tốt trong vi c giảm stress oxi h a ở gan v đ a về ng ỡng sinh

lý bình th ờng v c hi u quả t ng đ ng với colchicine p=0,09).

Ở hai nh m chuột uống cao chiết t a t . Ng ợc với d đo n, mặc dù đây l 2 nh m c l ợng MDA ở gan thấp nhất trong số c c nh m đ ợc điều trị bằng cao d ợc li u p=0,00), nh ng ở liều l ợng thấp h n, 50 mg/kg thể trọng, tr ng th i stress oxi h a ở gan chỉ đ t 11,456±0,190 mg/kg m u, thấp h n khi cho chuột uống liều cao, 100 mg/kg thể trọng với l ợng MDA l 14,673±0,538 mg/kg thể trọng với p<0,001.

Đối với nh m chuột uống cao dâu tằm, t ng t nh c c nh m uống cao

chiết dây g m, chúng t i kh ng ghi nh n s kh c bi t về tr ng th i stress oxi h a ở gan khi thay đ i liều l ợng d ợc li u thử tr n chuột p=0,37). L ợng MDA ở nh m

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

uống 50 v 100 mg/kg thể trọng lần l ợt l 13,740±0,208 v 13,399±0,316 mg/kg

m u. ằng kiểm định Turkey, c thể thấy l ợng MDA ở c c nh m uống dâu tằm và

nh m chuột uống cao t a t l kh ng c s kh c bi t, v đều l nh ng nh m chuột c tr ng th i stress oxi h a ở gan thấp nhất. Để giải th ch cho hi n t ợng n y, trong

nghi n cứu của Trinh v cộng s 2015), trong dịch chiết dâu tằm c chứa một

l ợng lớn Astilbin, đây l một flavonoid v c t nh chống oxi h a rất cao [76]. Bên

c nh đ , nghi n cứu của Igarashi v cộng s 1996) đã chứng minh khả năng chống oxi h a gan của Astilbin chỉ trong 24 giờ sau khi uống [40]. Nghi n cứu n y lý giải

vì sao chỉ trong 24 giờ, nh ng l ợng MDA ở gan của nh m chuột uống cao chiết

dâu tằm l i c s giảm stress oxi h a đ ng kể.

Kết quả định l ợng MDA gan ở c c nh m chuột cho thấy, c c cao chiết d ợc

li u đ ợc sử d ng tr n chuột đều l m giảm c c t n th ng gan do MSU gây ra.

(***:p<0,001)

iểu đồ 4.Hàm lƣợn MDA tron mẫu mô an c uột

3.4.2.3. Đ nh gi hàm lượng MDA trong m u m cơ chân tr i, chân

phải

Về tr ng th i stress oxi h a ở c c m c , c thể thấy l ợng MDA ở chân phải lu n nhỏ h n l ợng MDA ở chân tr i, nh m chân đ ợc ti m. C thể, ở nh m chuột

đối chứng sinh học, l ợng MDA ở chân tr i v phải lần l ợt l 14,523±0,229 mg/kg m u v 14,201±0,379 mg/kg m u. S kh c bi t về tr ng th i stress oxi h a gi a hai

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

chân không có ý ngh a thống k p>0,10). Kết quả n y cho thấy, h nh động ti m

kh ng l m ảnh h ởng đến tr ng th i stress oxi h a của chuột.

Tuy nhi n, ở nh m chuột đối chứng âm, đây l nh m c l ợng MDA ở 2 chân lớn nhất. Trong đ , l ợng MDA ở chân tr i, hay chân đ ợc ti m lớn h n chân

phải v s kh c bi t n y c ý ngh a thống k p<0,001). Mặc dù bản thân MSU l

một chất c khả năng chống oxi h a cao, n n theo lý thuyết, tr ng th i stress oxi h a

ở chân tr i nh m chuột đối chứng sẽ l thấp nhất, nh ng tr n th c tế, đây l i l vị tr c l ợng MDA cao nhất trong tất cả c c nh m. Lý giải hi n t ợng n y, Akahoshi v

cộng s 1997) đã cho rằng, dù MSU l chất c thể l m giảm tr ng th i stress oxi

h a nh ng th ng t n do tinh thể gây ra cho tế b o cũng nh c c stress trong qu

trình tiêm là nguyên nhân l m cho b ch cầu trung t nh ở vị tr ti m đồng lo t tiến vào apoptosis. Ch nh hi n t ợng n y đã l m cho tr ng th i stress oxi h a ở khu v c

ti m tăng m nh [11]. n c nh đ , l ợng MDA ở chân phải v ở m u của nh m

chuột n y cũng đồng thời cao h n tất cả c c nh m còn l i, hi n t ợng n y c thể l

do vi c c mặt của c c tinh thể MSU khiến c c tế b o b ch cầu trung t nh t i vị tr

ti m đi v o apoptosis, kết quả của vi c n y l c thể sẽ đ p ứng v tăng c ờng sản

sinh b ch cầu trung t nh, t đ sẽ t o ra tr ng th i stress oxi h a tr n to n c thể.

Khiến l ợng MDA ở cả m u v chân phải đều c s tăng l n so với c c nh m còn

l i [69].

(***:p<0,001)

iểu đồ 5. Hàm lƣợn MDA tron mẫu mô cơ c ân c uột

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

(***:p<0,001)

iểu đồ 6. Hàm lƣợn MDA tron mẫu mô cơ c ân trái c uột

Ở chân tr i, chân đ ợc ti m MSU, kết quả ghi nh n tr ng th i stress oxi h a

của tất cả c c nh m đ ợc điều trị với colchicine v cao d ợc li u đều thấp h n

nh m đối chứng âm p=0,001). Đặc bi t, ở một số nh m, l ợng MDA thu đ ợc còn

thấp h n so với nh m đối chứng sinh học, c thể l ba nh m uống cao t a t với liều

l ợng 50 mg/kg thể trọng v uống cao dây g m với liều l ợng 25 v 100 mg/kg thể

trọng, p=0,04.

C thể thấy, ở hai nh m chuột uống cao chiết t a t , l ợng MDA thu đ ợc c

xu h ớng tăng dần theo chiều giảm liều l ợng sử d ng (11,241±0,502 và

15,210±0,214 mg/kg m u). Kết quả n y c thể l do khả năng của chống oxi h a của eta-caryophyllene c trong cao chiết t a t .

Trong khi đ , ở nh m uống cao dâu tằm, chúng t i kh ng ghi nh n s thay đ i về tình tr ng stress oxi h a khi thay đ i liều l ợng sử d ng p=0,06). Tuy nhiên,

l ợng MDA trong m u c chân chuột đã c s giảm m nh về trở về gần với ng ỡng bình th ờng, s giảm tình tr ng stress oxi h a n y c thể b t nguồn t l ợng phytol c trong m u cao d ợc li u. Trong nghi n cứu của Silva v cộng s (2013), khi cho chuột bị vi m chân uống phytol với liều 500µg/kg thể trọng, l ợng MDA thu đ ợc ở nh m đ ợc điều trị thấp h n nhiều so với nh m đối chứng v thấp h n cả ng ỡng sinh lý [68].

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Kết quả định l ợng MDA chân gây vi m gout ở c c nh m chuột cho thấy,

c c cao chiết d ợc li u đ ợc sử d ng tr n chuột đều l m giảm c c t n th ng gout

do MSU gây ra.

3.4.3. Đ nh gi tình trạng viêm của mô hình chu t bị gây bệnh gout khi được thử nghiệm uống cao chiết

Để đ nh gi hi u quả kh ng vi m của c c cao chiết, chúng t i so s nh gi a nh m chuột đ ợc uống cao chiết với nồng độ nh : T a t , dâu tằm 50 mg/kg,

100mg/kg thể trọng) v g m 25mg/kg, 50 mg/kg, 100mg/kg, 200mg/kg thể trọng)

với nh m đối chứng uống Colchicine nồng độ 0,5mg/kg thể trọng. 24 giờ sau uống,

chuột đ ợc ti m 10µL MSU trong P S nồng độ 1mg/1µL, 2 nh m đối chứng lần

l ợt đ ợc ti m P S v MSU với l ợng t ng t . 24 giờ sau ti m, lấy huyết thanh

chuột v đo nồng độ IL1-β bằng kit ELISA.

(***:p<0,001)

iểu đồ 7. Nồn độ IL-1β tron u ết t an của các n óm c uột

T biểu đồ 7, c thể thấy l ợng IL-1β của c c nh m chuột uống cao chiết t a

tô và dâu tằm t ng đ ng với gi trị IL-1β trong nh m đối chứng sinh học (p=0,25). Điều n y cho thấy, tình tr ng vi m của c c nh m chuột n y đã c s giảm m nh v trở l i với mức sinh lý bình th ờng. Đối với c c nh m chuột uống cao chiết dây g m, mặc dù chỉ số IL-1β của c c nh m n y đã c s giảm m nh so với nh m đối chứng âm v đối chứng d ng nh ng v n còn duy trì ở mức kh cao

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

(p<0,001). Kết quả n y b ớc đầu cho thấy c c cao chiết đều c t c d ng chống

vi m m nh, thấm ch tốt h n so với Colchicine.

C thể, ở nh m chuột uống cao chiết t a t với hai liều l ợng đ ợc sử d ng là 50 và 100 mg/kg thể trọng. Kết quả ghi nh n l ợng IL-1β của 2 nh m n y t ng

đ ng nhau 0,056±0,003 v 0,068±0,008 pg/ml) v kh ng c kh c bi t nhiều so

với nh m đối chứng sinh học (0,063±0,000 pg/ml)). ằng kiểm định ANOVA, khi

so s nh với c c nh m đối chứng, ba nh m uống cao chiết t a t v đối chứng sinh học kh c bi t c ý ngh a thống k với nh m đối chứng âm 0,252±0,001 pg/ml) v

đối chứng d ng 0,162±0,004 pg/ml) với p<0,001.

Kết quả t ng t cũng đ ợc với 2 nh m chuột uống cao chiết dâu tằm với

liều l ợng đ ợc sử d ng l 50 v 100 mg/kg thể trọng. Kết quả ghi nh n l ợng IL- 1β của 2 nh m n y t ng đ ng nhau 0,058±0,002 v 0,061±0,003 pg/ml) v

không có kh c bi t nhiều so với nh m đối chứng sinh học 0,063±0,000 pg/ml). Kết

quả n y c thể do khả năng chống vi m của c c ho t chất c trong cao chiết, đặc

bi t l Phytol. T ng t , năm 2013, nghi n cứu của Silva v cộng s 2013) cũng

ghi nh n khả năng chống vi m v chống oxi h a của ho t chất n y tr n đối t ợng

chuột vi m chân với l ợng IL-1β trong huyết thanh chuột giảm m nh so với nh m

bị vi m [68].

Đối với cao chiết dây g m, trong nghi n cứu n y, 4 liều l ợng đ ợc l a chọn

để thử nghi m tr n chuột l 25, 50, 100 v 200 mg/kg thể trọng. Kh c với d kiến,

l ợng IL-1β kh ng giảm theo chiều tăng của liều l ợng cao sử d ng. Thay v o đ ,

l ợng IL-1β thấp nhất ở c c nh m uống cao với liều l ợng 100 mg/kg thể trọng

0,072±0,002 pg/ml) v 50 mg/kg thể trọng 0,093±0,004 pg/ml), trong khi đ , ở

hai liều l ợng, 25 v 200 mg/kg thể trọng, dù l ợng IL-1β c s giảm m nh so với

nh m đối chứng âm v đối chứng d ng p=0,001) nh ng v n cao h n nh m đối chứng sinh học p=0,001). Cho thấy s ph thuộc kh ng tuyến t nh của nồng độ cao

chiết g m l n m hình động v t bị gout với chỉ ti u đ p ứng vi m của chuột. C thể nồng độ cao g m ~25mg/kg thể trọng l nồng độ c khả năng giảm vi m gout tốt nhất tr n m hình chuột n y.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

K T LU N

T kết quả nghi n cứu, chúng t i c nh ng kết lu n sau:

I. - Đã tách v t o đ ợc 6 cao chiết chứa nh m hợp chất alkaloids và phenolics t 3 m u d ợc li u c trong các b i thuốc trị gout c truyền: Dây g m

(Gnetum parvifolium), Tía tô (Perilla ocymoides L.), Dâu tằm (Morus alba L).

- Các cao chiết n y đều có ho t t nh m nh chống oxy h a rất cao, với nồng độ 0,1mg/ml cao c hi u suất phản ứng với DPPH l trên 75 , gần nh t ng đ ng so với hi u suất chống oxy h a của vitamin C (0.1 µg/ml) (86 ± 0.6%)

- Đã định danh đ ợc c c hợp chất h a học ở m u cao t a t đã định danh

đ ợc 4/5 hợp chất h a học gồm: Beta-caryophyllene, Sesquicitronellene, 4-(prop 1-

en-2-yl)cyclohexanecarbaldehyde,(10E,13E)-2-methoxynonadeca-1,10,13-triene.

Trong 4 ho t chất đ ợc định danh, c 1 chất thuộc nh m flavonoid l eta-

caryophyllene. Cao dâu tằm c 4 chất đ ợc x c định v chỉ c 1 chất đ ợc định

danh là Phytol. 4/6 ho t chất đ ợc định danh trong m u cao dây g m gồm

Homocatechol, Methyl inositol, Pentadecanoic acid, Dioctyl isophthalate. Trong đ

duy nhất Homocatechol thuộc nh m c c chất phenolic.

II. - Đã xây d ng th nh c ng mô hình gây viêm gout bằng MSU tr n chuột

Swiss tr ng v đã thử nghi m c c cao chiết t Dây g m (Gnetum parvifolium), Tía

tô (Perilla ocymoides L.), Dâu tằm (Morus alba L) trên mô hình này. C c cao chiết

đều c khả năng kh ng vi m tr n m hình chuột bị gây gout. Nồng độ IL-1β ở c c

nh m cho uống cao chiết t a t , dâu tằm ở cả hai nồng độ 50mg/kg, 100mg/kg),

g m 100mg/kg thấp h n so với nh m chuột uống đối chứng âm v cả nh m đối ch ng d ng c sử d ng Colchicine với p < 0,001.

- C c cao chiết Dây g m (Gnetum parvifolium), Tía tô (Perilla ocymoides L.), Dâu tằm (Morus alba L) đều c khả năng chống oxy h a tr n m hình chuột bị

gây viêm gout bằng MSU, h m l ợng MDA ở c c nh m đ ợc cho uống cao chiết đều cho thấy xu h ớng thấp h n so với nh m đối chứng d ng. Nhóm tía tô, dâu tằm 100mg/kg) v g m 25mg/kg h m l ợng MDA trong m u, m u m gan v cả m u m c chân tr i t ng đ ng với nh m đối chứng đ ợc uống Colchicine với p < 0,001.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

KI N NGH

Chúng t i cũng đ a ra một số kiến nghị sau:

1. Cần c nh ng nghi n cứu tiếp theo nhằm định danh, phân tích các hợp

chất c trong cao chiết ch a c t n trong th vi n.

2. Ph t triển, ho n thi n c c b i thuốc trị gout bằng cao chiết.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

T I LI U THAM KHẢO

Tài li u Tiến Vi t

1. Trần Ngọc Ân 2004), " nh thấp khớp. ". Nhà xuất bản y học., pp. 231-236.

2. ộ m n Nội - Đ i học Y H Nội 2014), " i giảng b nh học nội khoa". NXB Y học, T p 2.

3. ộ Y tế 2014), "H ớng d n chẩn đo n v điều trị c c b nh c x ng khớp".

4. Ho ng Thị Kim Huyền, J. R. . J. . 2012), "D ợc lâm s ng, nh ng nguy n lý c bản v sử d ng thuốc trong điều trị". Tập 2, pp. 459-480.

5. Ph m Ngọc Kh i, P. T. D. 2019), "T i li u h ớng d n cộng đồng tham gia phòng chống b nh gút,". Trường đại học y Thái Bình.

6. Đỗ Tất Lợi 2004), "Nh ng cây thuốc v vị thuốc Vi t Nam". NXB Y học.

7. Nguyễn V nh Ngọc 2012), " nh gút. i giảng b nh học nội khoa. T p 2". pp. 171-187.

8. Đặng Kim Thu, N. T. K. T., ùi Thanh Tùng 2017), "T c d ng ức chế enzym xanthin oxidase v h acid uric m u của dịch chiết l t a t Perilla frutescens L.)". Tạp chí Dược học, 11, tr. 57.

9. Đo n Trọng Ph 2010), "Acid nucleic v sinh t ng hợp protein, H a sinh y học". Nhà xuất bản quân đội nhân dân Hà Nội, pp. 217 – 291.

Tài li u Tiến Anh

10. Abais, J. M.; Xia, M.; Zhang, Y.; Boini, K. M.; Li, P. L. (2015), "Redox regulation of NLRP3 inflammasomes: ROS as trigger or effector?". Antioxid Redox Signal, 22 (13), pp. 1111-29.

11. Akahoshi T, N. T., Namai R, Sekiyama N, Kondo H (1997), "Prevention of neutrophil apoptosis by monosodium urate crystals". Rheumatology International, 16 (6), pp. 231-235.

12. Alvarez-Lario, B.; Macarron-Vicente, J. (2010), "Uric acid and evolution". Rheumatology (Oxford), 49 (11), pp. 2010-5.

13. Amaral, F. A.; Costa, V. V.; Tavares, L. D.; Sachs, D.; Coelho, F. M.; Fagundes, C. T.; Soriani, F. M.; Silveira, T. N.; Cunha, L. D.; Zamboni, D. S.; Quesniaux, V.; Peres, R. S.; Cunha, T. M.; Cunha, F. Q.; Ryffel, B.; Souza, D. G.; Teixeira, M. M. (2012), "NLRP3 inflammasome-mediated neutrophil recruitment and hypernociception depend on leukotriene B(4) in a murine model of gout". Arthritis Rheum, 64 (2), pp. 474-84.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

14. Barbosa-Filho, J. M.; Piuvezam, M. R.; Moura, M. D.; Silva, M. S.; Lima, K. V. B.; da-Cunha, E. V. L.; Fechine, I. M.; Takemura, O. S. (2006), "Anti- inflammatory activity of alkaloids: A twenty-century review". Revista Brasileira de Farmacognosia, 16 (1), pp. 109-139.

15. Baur, J. A.; Sinclair, D. A. (2006), "Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence". Nature reviews Drug discovery, 5 (6), pp. 493.

16. Bertram G. Katzung, M. K.-H., Anthony J. Trevor (2015), "Katzung & Trevor's Pharmacology: Examination & Board Review, 12e". pp.

17. Biomodels: Fast, I., Predictive Gout.

18. Bose, A.; Keharia, H. (2014), "Phorbol ester degradation in Jatropha seedcake using white rot fungi". 3 Biotech, 4 (4), pp. 447-450.

19. Cai, Y.; Luo, Q.; Sun, M.; Corke, H. (2004), "Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer". Life Sci, 74 (17), pp. 2157-84.

20. Chao, C. Y.; Mong, M. C.; Chan, K. C.; Yin, M. C. (2010), "Anti‐ glycative and anti‐ inflammatory effects of caffeic acid and ellagic acid in kidney of diabetic mice". Molecular nutrition & food research, 54 (3), pp. 388-395.

21. Cheynier, V.; Comte, G.; Davies, K. M.; Lattanzio, V.; Martens, S. (2013), "Plant phenolics: recent advances on their biosynthesis, genetics, and ecophysiology". Plant Physiology and Biochemistry, 72, pp. 1-20.

22. Cho JY, C. H., Lee SK, Kim HJ, Hwang JK, Chun HS (2007), "Amelioration of dextran sulfate sodium-induced colitis in mice by oral administration of beta-caryophyllene, a sesquiterpene". Life Science, 80 (10), pp. 932-939.

23. Choi, H. K.; Niu, J.; Neogi, T.; Chen, C. A.; Chaisson, C.; Hunter, D.; Zhang, Y. (2015), "Nocturnal risk of gout attacks". Arthritis Rheumatol, 67 (2), pp. 555-62.

24. Congbing Fang, X. W., Changjun Jiang, Haiqun Cao (2005), "Comparison of HPTLC and HPLC for Determination of Isoflavonoids in Several Kudzu Samples". Journal of Planar Chromatography, 18, pp. 73-77.

25. Cronstein, B. N.; Terkeltaub, R. (2006), "The inflammatory process of gout

and its treatment". Arthritis Res Ther, 8 Suppl 1, pp. S3.

26. Cruz, C. M.; Rinna, A.; Forman, H. J.; Ventura, A. L.; Persechini, P. M.; Ojcius, D. M. (2007), "ATP activates a reactive oxygen species-dependent oxidative stress response and secretion of proinflammatory cytokines in macrophages". J Biol Chem, 282 (5), pp. 2871-9.

27. Czapski, G. A.; Szypuła, W.; Kudlik, M.; Wileńska, .; Kania, M.; Danikiewicz, W.; Adamczyk, A. (2014), "Assessment of antioxidative activity

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

of alkaloids from Huperzia selago and Diphasiastrum complanatum using in vitro systems". Folia neuropathologica, 52 (4), pp. 394-406.

28. Da Cunha, F. M.; Duma, D.; Assreuy, J.; Buzzi, F. C.; Niero, R.; Campos, M. M.; Calixto, J. B. (2004), "Caffeic acid derivatives: in vitro and in vivo anti- inflammatory properties". Free radical research, 38 (11), pp. 1241-1253.

29. Demidowich, A. P.; Davis, A. I.; Dedhia, N.; Yanovski, J. A. (2016), "Colchicine to decrease NLRP3-activated inflammation and improve obesity- related metabolic dysregulation". Medical hypotheses, 92, pp. 67-73.

30. Dinarello, C. A. (2010), "How interleukin-1beta induces gouty arthritis". Arthritis Rheum, 62 (11), pp. 3140-4.

31. Dong-Seon Kim, Y. M. K., Wen Yi Jin, Yoon-Young Sung, Goya Choi, Ho Kyoung Kim (2014), "Antioxidant activities and polyphenol content of Morus alba leaf extracts collected from varying regions". Biomedical Reports, 2 (5), pp. 675-680.

32. Dostert, C.; Petrilli, V.; Van Bruggen, R.; Steele, C.; Mossman, B. T.; Tschopp, J. (2008), "Innate immune activation through Nalp3 inflammasome sensing of asbestos and silica". Science, 320 (5876), pp. 674-7.

33. Ferraccioli, G.; Bracci-Laudiero, L.; Alivernini, S.; Gremese, E.; Tolusso, B.; De Benedetti, F. (2010), "Interleukin-1beta and interleukin-6 in arthritis animal models: roles in the early phase of transition from acute to chronic inflammation and relevance for human rheumatoid arthritis". Mol Med, 16 (11-12), pp. 552-7.

34. Furtado, A. A.; Torres-Rego, M.; Lima, M.; Bitencourt, M. A. O.; Estrela, A. B.; Souza da Silva, N.; da Silva Siqueira, E. M.; Tomaz, J. C.; Lopes, N. P.; Silva-Junior, A. A.; Zucolotto, S. M.; Fernandes-Pedrosa, M. F. (2016), "Aqueous extract from Ipomoea asarifolia (Convolvulaceae) leaves and its phenolic compounds have anti-inflammatory activity in murine models of edema, peritonitis and air-pouch inflammation". J Ethnopharmacol, 192, pp. 225-235.

35. Ghelardini C, G. N., Di Cesare Mannelli L, Mazzanti G, Bartolini A (2001), "Local anaesthetic activity of beta-caryophyllene". Farmaco, 56 (5-7), pp. 387-389.

36. Gurung, P.; Lukens, J. R.; Kanneganti, T. D. (2015), "Mitochondria: diversity in the regulation of the NLRP3 inflammasome". Trends Mol Med, 21 (3), pp. 193-201.

37. Hämäläinen, M.; Nieminen, R.; Vuorela, P.; Heinonen, M.; Moilanen, E. (2007), "Anti-inflammatory effects of flavonoids: genistein, kaempferol, quercetin, and daidzein inhibit STAT-1 and NF-κ activations, whereas flavone, isorhamnetin, naringenin, and pelargonidin inhibit only NF-κ

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

activation along with their inhibitory effect on iNOS expression and NO production in activated macrophages". Mediators of inflammation, 2007, pp.

38. Handriani Kristanti , W. A. S. T. (2013), "Detection of Alkaloid, Flavonoid, and Terpenoid compounds in bread (Artocarpus communis Forst.) leaves and puplps".

39. Hikino, H.; Konno, C.; Takata, H.; Tamada, M. (1980), "Antiinflammatory principle of Ephedra herbs". Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 28 (10), pp. 2900-2904.

40.

Igarashi K, U. Y., Murakami N, Mizutani K, Masuda H (1996), "Effect of astilbin in tea processed from leaves of Engelhardtia chrysolepis on the serum and liver lipid concentrations and on the erythrocyte and liver antioxidative enzyme activities of rats". Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 60 (3), pp. 513-515.

opioid and in 41. Katsuyama S, M. H., Kuwahata H, Komatsu T, Nagaoka K, Nakamura H, Bagetta G, Sakurada T, Sakurada S (2013), "Involvement of peripheral cannabinoid β-caryophyllene-induced receptors antinociception". European Journal of Pain, 17 (5), pp. 664-675.

42. Kedare, S. B.; Singh, R. P. (2011), "Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay". Journal of food science and technology, 48 (4), pp. 412-22.

43. Kim, S. K.; Choe, J. Y.; Park, K. Y. (2016), "Rebamipide Suppresses Monosodium Urate Crystal-Induced Interleukin-1beta Production Through Regulation of Oxidative Stress and Caspase-1 in THP-1 Cells". Inflammation, 39 (1), pp. 473-482.

44. Kingsbury, S. R.; Conaghan, P. G.; McDermott, M. F. (2011), "The role of the NLRP3 inflammasome in gout". J Inflamm Res, 4, pp. 39-49.

45. Klauke AL, R. I., Pradier B, Markert A, Zimmer AM, Gertsch J, Zimmer A (2014), "The cannabinoid CB₂ receptor-selective phytocannabinoid beta- caryophyllene exerts analgesic effects in mouse models of inflammatory and neuropathic pain". European Neuropsychopharmacology, 24 (4), pp. 608-620.

46. Kostova, I.; Bhatia, S.; Grigorov, P.; Balkansky, S.; S Parmar, V.; K Prasad, A.; Saso, L. (2011), "Coumarins as antioxidants". Current medicinal chemistry, 18 (25), pp. 3929-3951.

47. Lanzhou Li, M. T., Yange Liu, Yidi Qu, Yuanzhu Zhang, Feng Lin, Di Wang (2017), "Anti-Gouty Arthritis and Antihyperuricemia Effects of Sunflower (Helianthus annuus) Head Extract in Gouty and Hyperuricemia Animal Models". BioMed Research International, 2017 (5852076), pp.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

48. Li-Na Huo, W. W., Chun-Yu Zhang, Hai-Bo Shi, Yang Liu, Xiao-Hong Liu, Bing-Hua Guo, Dong-Mei Zhao, Hua Gao (2015), "Bioassay-Guided Isolation and Identification of Xanthine Oxidase Inhibitory Constituents from the Leaves of Perilla frutescens". Molecules, 20, pp. 17848-17859

49. Lykkesfeldt, J. (2007), "Malondialdehyde as biomarker of oxidative damage to lipids caused by smoking". Clin Chim Acta, 380 (1-2), pp. 50-8.

50. Mai Thanh Thi NGUYEN, S. A., Yasuhiro TEZUKA, Quan Le TRAN, Hiroshi WATANABE, Shigetoshi KADOTA (2004), "Xanthine Oxidase Inhibitory Activity of Vietnamese Medicinal Plants". Biol. Pharm. Bull. , 27 (9), pp. 1414-1421.

51. Marcotti A, M. A., Dominguez E, Pascual E, Gomis A, Belmonte C, de la Peña E (2018), "Joint nociceptor nerve activity and pain in an animal model of acute gout and its modulation by intra-articular hyaluronan". PAIN, 159 (4), pp. 739-748.

52. Martinez, G. J.; Celermajer, D. S.; Patel, S. (2018), "The NLRP3 inflammasome and the emerging role of colchicine to inhibit atherosclerosis- associated inflammation". Atherosclerosis, 269, pp. 262-271.

53. Martinon, F.; Petrilli, V.; Mayor, A.; Tardivel, A.; Tschopp, J. (2006), "Gout- associated uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome". Nature, 440 (7081), pp. 237-41.

54. McGettrick, A. F.; O'Neill, L. A. (2013), "NLRP3 and IL-1beta in macrophages as critical regulators of metabolic diseases". Diabetes Obes Metab, 15 Suppl 3, pp. 19-25.

55. Meng L, L. Y., Gaydou EM, Li B (2008), "Antioxidant activities of polyphenols extracted from Perilla frutescens varieties". Molecules, 14 (1), pp. 133-140.

56. Mihara, M.; Uchiyama, M. (1978), "Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test". Analytical biochemistry, 86 (1), pp. 271-8.

57. Mitroulis, I.; Skendros, P.; Ritis, K. (2010), "Targeting IL-1beta in disease; the expanding role of NLRP3 inflammasome". Eur J Intern Med, 21 (3), pp. 157- 63.

58. Murakami, Y.; Akahoshi, T.; Hayashi, I.; Endo, H.; Kawai, S.; Inoue, M.; Kondo, H.; Kitasato, H. (2006), "Induction of triggering receptor expressed on myeloid cells 1 in murine resident peritoneal macrophages by monosodium urate monohydrate crystals". Arthritis Rheum, 54 (2), pp. 455-62.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

59. Neogi T., J. T. L., et al. (2015), "Gout classification criteria: an American of Rheumatology/European League Against Rheumatism College collaborative initiative". Ann Rheum Dis

pp. 1789- 98.

60. Ono, M. (1994), "Inflammation inhibitors containing cepharanoline or berbamine". Patent-Japan Kokai Tokkyo Koho-06, 211, pp. 661.

61. Pacheco de Oliveira, M. T.; de Oliveira Ramalho, T. R.; Paiva Ferreira, L. K. L.; Araújo Lima, A. L.; Barbosa Cordeiro, M.; Ferreira Costa, H.; Rodrigues, L. C.; Piuvezam, M. R. (2015), "Synthesis, toxicity study and anti- inflammatory effect of MHTP, a new tetrahydroisoquinoline alkaloid". Immunopharmacology and immunotoxicology, 37 (4), pp. 400-412.

62. Pragasam, S. J.; Venkatesan, V.; Rasool, M. (2013), "Immunomodulatory and anti-inflammatory effect of p-coumaric acid, a common dietary polyphenol on experimental inflammation in rats". Inflammation, 36 (1), pp. 169-176.

63. Punzi, L.; Scanu, A.; Ramonda, R.; Oliviero, F. (2012), "Gout as autoinflammatory disease: new mechanisms for more appropriated treatment targets". Autoimmun Rev, 12 (1), pp. 66-71.

64. Sangster AW, S. K. (1965), "Ultraviolet Spectra of Alkaloids". Chemical Reviews, 65 (1), pp. 69-130.

65. Santos CC, S. M., Mota VG, Costa LM, de Almeida AA, de Oliveira GA, Costa JP, de Sousa DP, de Freitas RM, de Almeida RN (2013), "Antinociceptive and Antioxidant Activities of Phytol In Vivo and In Vitro Models". Journal of Neuroscience, 2013 (949452), pp.

66. Schiltz, C.; Liote, F.; Prudhommeaux, F.; Meunier, A.; Champy, R.; Callebert, J.; Bardin, T. (2002), "Monosodium urate monohydrate crystal-induced inflammation in vivo: quantitative histomorphometric analysis of cellular events". Arthritis Rheum, 46 (6), pp. 1643-50.

67. Shirwaikar, A.; Shirwaikar, A.; Rajendran, K.; Punitha, I. S. R. (2006), "In vitro antioxidant studies on the benzyl tetra isoquinoline alkaloid berberine". Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29 (9), pp. 1906-1910.

68. Silva RO, S. F., Damasceno SR, Carvalho NS, Silva VG, Oliveira FR, Sousa DP, Aragão KS, Barbosa AL, Freitas RM, Medeiros JV (2014), "Phytol, a diterpene alcohol, inhibits the inflammatory response by reducing cytokine production and oxidative stress". Fundamental and Clinical Pharmacology, 28 (4), pp. 455-464.

69. So A, D. S. T., Revaz S, Tschopp J (2007), "A pilot study of IL-1 inhibition by anakinra in acute gout". Arthritis Research & Therapy, 9 (2), pp. R28.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

70. So, A.; Thorens, B. (2010), "Uric acid transport and disease". J Clin Invest, 120 (6), pp. 1791-9.

71. Souto, A. L.; Tavares, J. F.; da Silva, M. S.; Diniz Mde, F.; de Athayde-Filho, P. F.; Barbosa Filho, J. M. (2011), "Anti-inflammatory activity of alkaloids: an update from 2000 to 2010". Molecules, 16 (10), pp. 8515-34.

72. Stamp, L. K.; Turner, R.; Khalilova, I. S.; Zhang, M.; Drake, J.; Forbes, L. V.; Kettle, A. J. (2014), "Myeloperoxidase and oxidation of uric acid in gout: implications for the clinical consequences of hyperuricaemia". Rheumatology (Oxford), 53 (11), pp. 1958-65.

73. Tang X, T. P., Ma L, Liu L (2019), "Screening and Evaluation of Xanthine Oxidase Inhibitors from Gnetum parvifolium in China". Molecules, 24 (14), pp. 2671.

74. Taniguchi, A.; Kamatani, N. (2008), "Control of renal uric acid excretion and gout". Curr Opin Rheumatol, 20 (2), pp. 192-7.

75. Trevisan, G.; Hoffmeister, C.; Rossato, M. F.; Oliveira, S. M.; Silva, M. A.; Silva, C. R.; Fusi, C.; Tonello, R.; Minocci, D.; Guerra, G. P.; Materazzi, S.; Nassini, R.; Geppetti, P.; Ferreira, J. (2014), "TRPA1 receptor stimulation by hydrogen peroxide is critical to trigger hyperalgesia and inflammation in a model of acute gout". Free Radic Biol Med, 72, pp. 200-9.

76. Trinh TTV, V. V., Pham TH, Pham VC, Nguyen NQ (2015), "Antioxidant Activity of Extracts and Astilbin from the Root of Smilax glabra of Vietnam". Malaysian Journal of Chemistry, 17 (1), pp.

77. Virreira Winter, S.; Zychlinsky, A. (2018), "The bacterial pigment pyocyanin inhibits the NLRP3 inflammasome through intracellular reactive oxygen and nitrogen species". J Biol Chem, 293 (13), pp. 4893-4900.

78. Wong, C.; Seow, W.; O'Callaghan, J.; Thong, Y. (1992), "Comparative effects of tetrandrine and berbamine on subcutaneous air pouch inflammation induced by interleukin-1, tumour necrosis factor and platelet-activating factor". Agents and actions, 36 (1-2), pp. 112-118.

79. Wu J, Y. Z., Schwartz DE, Yu J, Malik AB, Hu G. (2013), "Activation of NLRP3 inflammasome in alveolar macrophages contributes to mechanical stretch-induced lung inflammation and injury". Journal of Immunology, 190 (7), pp. 3590-3599.

80. Yang, C.-W.; Chen, W.-L.; Wu, P.-L.; Tseng, H.-Y.; Lee, S.-J. (2006), "Anti- inflammatory mechanisms of phenanthroindolizidine alkaloids". Molecular pharmacology, 69 (3), pp. 749-758.

81. Yao L, D. W., Lu F, Liu S (2012), "An improved acute gouty arthritis rat model and therapeutic effect of rhizoma Dioscoreae nipponicae on acute gouty

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

arthritis based on the protein-chip methods". The American Journal of Chinese Medicine, 40

(1), pp. 121-134.

82. Yasukawa, K.; Akasu, M.; Takeuchi, M.; Takido, M.

(1993), tumor promotion by 12-O- inhibit "Bisbenzylisoquinoline alkaloids tetradecanoylphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin". Oncology, 50 (2), pp. 137-140.

83. Zamudio-Cuevas, Y.; Martinez-Flores, K.; Fernandez-Torres, J.; Loissell- Baltazar, Y. A.; Medina-Luna, D.; Lopez-Macay, A.; Camacho-Galindo, J.; Hernandez-Diaz, C.; Santamaria-Olmedo, M. G.; Lopez-Villegas, E. O.; Oliviero, F.; Scanu, A.; Cerna-Cortes, J. F.; Gutierrez, M.; Pineda, C.; Lopez- Reyes, A. (2016), "Monosodium urate crystals induce oxidative stress in human synoviocytes". Arthritis Res Ther, 18 (1), pp. 117.

84. Zheng, S. C.; Zhu, X. X.; Xue, Y.; Zhang, L. H.; Zou, H. J.; Qiu, J. H.; Liu, Q. (2015), "Role of the NLRP3 inflammasome in the transient release of IL-1beta induced by monosodium urate crystals in human fibroblast-like synoviocytes". J Inflamm (Lond), 12, pp. 30.

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

PHỤ LỤC

A. Kết quả phân tích hình ảnh sắc ký đồ TLC bằng ImageJ

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

B. Kết quả phân tích khối phổ

Cao tía tô

4-(prop-1-en-2-yl)cyclohexanecarbaldehyde

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

beta-caryophyllene

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân

Sesquicitronellene

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân