Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Quần Đầu khỉ (Polyalthia simiarum benth. & Hook. F.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN …………………… ĐOÀN THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY QUẦN ĐẦU KHỈ (POLYALTHIA SIMIARUM Benth. & Hook. f.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN …………………… ĐOÀN THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY QUẦN ĐẦU KHỈ (POLYALTHIA SIMIARUM Benth. & Hook. f.) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 60440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THỊ MINH HẰNG Hà Nội – Năm 2014

LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Minh

Hằng đã giao đề tài, trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo cũng như giúp đỡ

em trong suốt thời gian thực hiện luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Hóa học và các thầy cô trong

bộ môn Hóa hữu cơ của trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã

giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các bác, các chú, các anh chị, các bạn, các

em sinh viên ở Trung tâm nghiên cứu và Phát triển thuốc - Viện Hóa Sinh biển

- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã động viên, thảo luận và

tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời gian em thực hiện luận văn.

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn là nguồn

động viên lớn lao đối với em trong cuộc sống, trong học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 15 tháng 01 năm 2015

Học viên

Đoàn Thị Hương

MỤC LỤC

30 31

1 MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu sơ lược về họ Na (Annonaceae)………………………………. 3 1.1.1. Thực vật học của họ Na………………………………………………… 3 1.1.2. Một số nghiên cứu về họ Na…………………………………………. 3 1.2. Giới thiệu về chi Quần đầu (Polyalthia)…………………………………. 10 1.2.1. Thực vật hoc……………………………………………………………. 10 1.2.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học………….. 10 1.3. Cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum Benth. & Hook. f.)……..……… 22 1.3.1. Thực vật học……………………………………………………………. 22 1.3.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học………….. 22 23 CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật………………………………………………………………. 23 2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu………………………………………….. 23 2.3. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật………………………………………………………………… 2.4. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ các mẫu thực vật nghiên cứu………………………………………….. 2.5. Phương pháp thử hoạt tính sinh học………………………………………. 24 2.5.1. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào……………………………… 24 2.5.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định………………... 24 CHƢƠNG 3 - THỰC NGHIỆM 25 3.1. Tách chiết, phân lập các chất từ lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)……………………………………………………………………… 3.1.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết xuất………………………………………. 25 3.1.2. Phân lập chất từ các cặn chiết của lá cây Quần đầu khỉ………………... 26 3.1.3. Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất đã phân lập…………... 29 3.2. Tách chiết, phân lập các chất từ vỏ cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)……………………………………………………………………… 3.2.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách………………………………………. 3.2.2. Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất đã phân lập………….. 3.3. Hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất được phân lập……………………………………………………………. 31 3.3.1. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định……………………….. 3.3.2. Thử hoạt tính gây độc tế bào…………………………………………… 32 34 CHƢƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Các hợp chất được phân lập từ lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum) 34 4.1.1. Rutin (POS2)…………………………………………………………… 34 37 4.1.2. Kaempferol-3-O-rutisoside (POS1)……………………………………. 4.1.3. Indole-3-aldehyde (QDK1)…………………………………………….. 40 4.1.4. 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl-β-carboline (POS3)................... 40 4.2. Các hợp chất được phân lập từ vỏ cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)……………………………………………………………………… 4.2.1. Ent-halima-1(10),13E-dien-15-oic acid (SP1)......................................... 43

4.2.2. β-Sitosterol (POS5)..................................................................................

44 4.2.3. β-Sitosterol glucoside (POS6)……………………………………..…… 46 4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất được phân lập……………………… 46 4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất được phân lập……………… 47 4.3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất được phân lập…………………….. 48 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NMR: Nucleur Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) 1H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13C-NMR: Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C)

COSY: Correlated Spectroscopy (Phổ COSY)

DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (Phổ DEPT)

HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ HMBC)

HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence (Phổ HMQC)

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence (Phổ HSQC)

s: singlet b: broad

d: doublet dd: double doublet

t: triplet dt: double triplet

q: quartet dq: double quartet

H, C: Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm: parts per million (phần triệu)

MS: Mass Spectrometry (Phương pháp khối phổ)

ESI-MS: Electron Spray Ionizatio (Phổ khối phun bụi điện tử)

APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization (Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển)

Đnc: Điểm nóng chảy

Kt: Kết tinh

TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí bản mỏng)

CC: Column Chromatography (Sắc kí cột thường)

DMSO: Dimethylsulfoxide

MeOH: Metanol

EtOAc: Etylacetat

IC50: Inhibition concentration at 50% (Giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát)

Tên riêng của các hợp chất tự nhiên phân lập được được viết theo nguyên bản tiếng Anh cho tiện tra cứu.

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ

26 Sơ đồ 3.1. Quá trình chiết xuất lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)

27 Sơ đồ 3.2. Quá trình phân lập các chất từ cặn alkaloit

28 Sơ đồ 3.3. Quá trình phân lập các chất từ cặn etyl axetat

29 Sơ đồ 3.4. Quá trình phân lập các chất từ cặn metanol

30 Sơ đồ 3.5. Quá trình chiết xuất vỏ cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)

31 Sơ đồ 3.6. Quá trình phân lập các chất từ cặn n-hexan

37 Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của POS2

38 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của POS1

40 Bảng 4.3. Dữ kiện phổ của hợp chất QDK1

43 Bảng 4.4. Dữ kiện phổ của hợp chất POS3

Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của SP1 44

45 Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của POS5

47 Bảng 4.7. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của SP1

48 Bảng 4.8. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của POS3 và QDK1

48 Bảng 4.9. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

35 Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của POS2

36 Hình 4.2. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của POS2

39 Hình 4.3. Phổ 1H-NMR của POS1

41 Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của POS3

41 Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của POS3

42 Hình 4.6. Phổ HMBC của POS3

MỞ ĐẦU

Từ thời xa xưa, cây thuốc giữ vai trò trọng yếu trong việc duy trì sức khỏe của loài người. Ví dụ như cây lanh (Linum usitatissimum) cung cấp cho những người thu hoạch chúng một loại dầu thực phẩm giàu dinh dưỡng, chất đốt, mỹ phẩm chăm sóc da và sợi để dệt vải. Vào thời điểm đó, người ta sử dụng cây này để trị các chứng như viêm phế quản, viêm đường hô hấp, ung nhọt và một số vấn đề về tiêu hóa [1,2]. Nhờ có những lợi ích đối với cuộc sống mà cây này và nhiều loài cây khác được quan tâm.

Ngày nay, con người vẫn tiếp tục dựa vào dược tính của các loại thảo mộc để bào chế khoảng 75% các loại thuốc. Tính chất đa dạng và phong phú của các loài cây cỏ đã được sử dụng vào mục đích y học, đặc biệt là kết hợp với các liệu pháp chữa trị đã mang lại những kết quả đáng ngạc nhiên, đạt hiệu quả tương đương với các loại thuốc chính thống nhưng lại ít có tác dụng phụ hơn.

Hàng ngàn loại cây sinh trưởng trên khắp thế giới có nhiều công dụng y học, chúng chứa những thành phần hoạt chất có tác động trực tiếp lên cơ thể, được dùng trong việc bào chế cả dược thảo lẫn các loại thuốc thông thường. Chúng có các lợi ích mà dược phẩm Tây y thường không có, giúp con người chống lại bệnh tật và hỗ trợ cho cơ thể phục hồi sức khỏe.

Các loài thực vật chứa hàng trăm, hoặc hàng nghìn những chất hóa học tương tác theo những cách phức tạp. Chúng ta thường không biết chi tiết cách tác động của một loại thảo mộc nào đó, ngay khi tác dụng chữa bệnh của nó đã được chứng minh rõ ràng. Việc đi sâu nghiên cứu thành phần hóa học để hiểu rõ nguồn gốc hoạt tính của các loại cây thuốc chữa bệnh có vai trò rất quan trọng, vì điều này đã dẫn đến việc bào chế ra các loại thuốc hiệu quả nhất. Sự hiểu biết về những thành phần hóa học chứa trong thực vật sẽ giúp chúng ta hiểu được chúng hoạt động như thế nào bên trong cơ thể con người.

Ở Việt Nam việc sử dụng các loại cây cỏ, hoa lá trong tự nhiên để chữa trị bệnh tật đã tạo nên ngành y học cổ truyền dân tộc gọi là Đông y. Tuy nhiên, sự kết hợp hài hòa giữa các vị thuốc cây cỏ trong Đông y chủ yếu dựa trên các kinh nghiệm dân gian về công dụng của các loài thảo dược. Việt Nam có một hệ thực vật phong phú và đa dạng. Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên rất quý báu của đất nước có tác dụng lớn đối với sức khỏe của con người đồng thời mở ra tiềm năng nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên từ các loài thực vật của Việt Nam. Còn rất nhiều loài thực vật của Việt Nam còn chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.

Các loài thực vật họ Na đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học về thành phần hóa học. Các nghiên cứu cho thấy sự đa dạng về

thành phần hóa học ở các loài thuộc họ Na bao gồm steroit, flavonoit, alkaloit và các acetogenin đều thể hiện những hoạt tính sinh học phong phú như hoạt tính gây độc tế bào, chống khối u, trừ sâu, chống nấm, kháng trùng sốt rét, kháng lao và hoạt tính chống oxi hóa [3].

Rất nhiều loài thuộc họ Na còn chưa được nghiên cứu. Với mục tiêu tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật họ Na, chúng tôi lựa chọn loài Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum) làm đối tượng nghiên cứu của luận văn với mục tiêu: (1) Nghiên cứu thành phần hóa học cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum) nhằm phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học. (2) Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của một số chất đã phân lập được tạo cơ sở khoa học định hướng cho nghiên cứu tiếp theo về loài cây và các hợp chất này.

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu sơ lƣợc về họ Na (Annonaceae)

1.1.1. Thực vật học của họ Na

Họ Na (danh pháp khoa học Annonaceae) còn được gọi là họ Mãng cầu, là họ lớn nhất của bộ Mộc lan (Magnoliales) với 120-130 chi và 2.300-2500 loài, được phân bổ chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, chỉ ít loài sinh sống ở vùng ôn đới. Khoảng 900 loài ở Trung và Nam Mỹ, 450 loài ở châu Phi, và các loài khác ở châu Á [5,25]. Đây là một họ thực vật có hoa bao gồm các loại cây thân gỗ, cây bụi hay dây leo thường được sử dụng như bài thuốc cổ truyền ở Đông Nam Á. Một số loài được trồng làm cây cảnh, đặc biệt là Polythia longifolia var. pendula (lá bó sát thân). Các loài cây thân gỗ còn dùng làm củi. Một số loài có quả lớn, nhiều thịt, ăn được bao gồm các loài của chi Annona (na, na Nam Mỹ, mãng cầu xiêm) hay chi Asimina (đu đủ Mỹ) hoặc chi Rollinia. Bên cạnh đó, một số loài như Hoàng lan (Cananga odorata) còn chứa tinh dầu thơm và được sử dụng trong sản xuất nước hoa hay đồ gia vị. Vỏ cây, lá và rễ của một số loài được sử dụng trong y học dân gian chữa bệnh nhiễm trùng, bệnh ho, bệnh gan, bệnh vàng da do gan, bệnh tiêu chảy, …. Các nghiên cứu dược lý đã tìm thấy khả năng kháng nấm, kháng khuẩn và đặc biệt là khả năng sử dụng trong hóa học trị liệu của một số thành phần hóa học của lá và vỏ cây [63].

Hầu hết các dạng sống chủ yếu được thấy ở các loài trong họ Na, chỉ trừ các cây thân cỏ và các dạng sống phụ sinh hay ký sinh. Đối với các loài cây mọc đứng thường gặp ở dạng cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ. Trong khi đó nhiều loài khác thuộc chi Polyathia và hàng loạt các chi khác lại gặp những cây gỗ to lớn [1,5].

Hình thái chung của cây họ Na có những đặc điểm sau: Lá của tất cả các loài họ Na đều không có lá kèm, mọc cách, đơn, nguyên, mép lá nguyên với gân lông chim. Hoa của các loài họ Na thường là hoa lưỡng tính. Hoa mọc đơn độc hoặc hợp thành các dạng cụm hoa khác nhau, ở nách lá hoặc ngoài nách lá, ở đỉnh cành hoặc hoa mọc trên thân già không lá. Đặc điểm này thường được dùng để phân biệt các chi trong họ Na. Nhị trong họ Na có hai kiểu chính: “kiểu Uvarioid” với trung đới khá dầy và dài vượt qua bao phấn để tạo thành mào trung đới, “kiểu Miliusoid” có trung đới mỏng và hẹp, làm cho bao phấn lồi lên so với trung đới. Phần lớn các loài họ Na có bộ nhụy gồm các lá noãn rời. Mỗi lá noãn được chia thành bầu, vòi nhụy và núm nhụy [2,4].

1.1.2. Một số nghiên cứu về họ Na

Các loài thực vật họ Na đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học về thành phần hóa học. Số lượng công trình nghiên cứu là rất lớn,

đang ngày càng nhiều lên theo các hướng tìm kiếm các chất có khả năng chống ung thư, chống ôxi hóa, chống HIV. Nguyên nhân chính là do sự đa dạng về thành phần hóa học ở các loài thuộc họ Na bao gồm các hợp chất alkaloit, non-alkaloit và các acetogenin có nhiều tác dụng dược lý đang trong giai đoạn đánh giá lâm sàng để điều trị các bệnh parkinson, bệnh tim mạch và nhiễm vi rút [11,42,63]. Sự xuất hiện của acetogenins trong Annonaceae đã gây nên sự chú ý để phát hiện chất chống ung thư mới. Từ đó có thể thấy Annonaceae chứa nhiều tiềm năng để nghiên cứu các loại thuốc trong tương lai.

Các kết quả nghiên cứu về họ Na trước đây rất có giá trị đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu cần được tiếp tục theo chiều sâu. Một trong các hướng đó là nghiên cứu về các hợp chất alkaloit dạng isoquinoline có hoạt tính kháng khuẩn và tác dụng kháng viêm.

Có 150 chất isoquinoline alkaloit đã được phân lập và nghiên cứu tác dụng sinh học từ các chi khác nhau của họ Na tiêu biểu như: salsolinol, benzyltetrahydroisoquinoline, bisbenzylisoquinoline, protoberberine và aporphine.

Salsolinol (1) được phân lập từ lá và thân cây Annona recticulata [12] và corydaldine (2) từ vỏ thân cây Enantia polycarpa [6] là 2 trong số các hợp chất isoquinoline có nhiều triển vọng nhất cho đến nay. Sasolinol (1) có ảnh hưởng đáng kể đến sự cân bằng giữa dopamine và acetylcholine bằng cách làm suy yếu hệ thống cholinergic cũng như hệ thống dopaminergic. Nhiều khả năng sự phá vỡ cân bằng giữa dopamine và acetylcholine là một trong các nguyên nhân quan trọng gây ra bệnh parkinson. Các nghiên cứu trước đây cho thấy, rõ ràng là salsolinol không chỉ ảnh hưởng đến hệ dopaminergic bằng cách ức chế các enzym có liên quan trong quá trình tổng hợp hay trao đổi chất của dopamine mà còn làm suy yếu hệ thống cholinergic bằng cách khử hoạt tính acetylcholinesterase. Cả hai hiện tượng này sẽ dẫn đến sự phá vỡ cân bằng giữa dopamine và acetylcholine là nguyên nhân gây ra bệnh parkinson.

Corydaldine (2) Salsolinol (1)

Hầu hết các benzyltetrahydroisoquinoline (3) được phân lập từ một số loài của chi Annona và Xylopia. Một trong những hợp chất đó là reticuline (4), làm giảm nhịp tim và huyết áp ở chuột, ức chế phenylephrine và KCl gây ra các cơn co thắt của vòng động mạch chủ ở chuột, và đối kháng Ca2+ do co thắt gây ra. Các reticuline ức chế cơ trơn loại L qua con đường Ca2+ [45]. Dựa trên các thí nghiệm

ở chuột và các nghiên cứu ban đầu khác, có thể kết luận rằng reticuline là hợp chất hóa học có những ứng dụng tích cực cho việc nghiên cứu phát triển các loại thuốc mới có tính năng bảo vệ tim mạch sau này.

Benzyltetrahydroisoquinoline (3) Reticuline (4)

Nhiều nghiên cứu dược lý đã chỉ ra rằng bisbenzylisoquinoline có nguồn gốc từ isoquiloline đơn giản với thành phần hoạt tính sinh học quan trọng đã được tìm thấy trong các chi khác nhau của họ Na [10,59]. Các hợp chất bisbenzylisoquinoline chủ yếu được phân lập từ các chi Crematosperma, Guatteria, Isolona, Phaeanthus, Popowia, và Uvaria. Bisbenzylisoquinoline chủ yếu có tác dụng đối kháng với một số tác dụng của Ca2+ trên cơ trơn mạch máu, các tế bào nội mô mạch máu và tuyến thượng thận. Chúng cũng được chứng minh là có khả năng tự hủy, chống oxy hóa và chống viêm [18]. Các đặc tính có giá trị nhất của các hợp chất này là khả năng chống plasmodial. Ngoài ra, các tetrahydrobenzylisoquiloline có cấu trúc bão hòa hoàn toàn tương đương với cấu trúc của bisbenzylisoquinoline, thực hiện một chức năng quan trọng trong sản xuất bán tổng hợp sinh hóa.

Bisbenzylisoquinoline (5)

Protoberberine và aporphine được biết đến như là các dẫn xuất đơn giản nhất của bisbenzylisoquinoline và tetrahydrobenzylisoquinoline tương ứng. Hầu hết các protoberberine có bộ khung cơ bản như trong hình (6). Những alkaloit này đã cho thấy một mảng đáng chú ý của tính chất dược lý và được biết đến với khả năng chống vi khuẩn, chống virus, và các hoạt động gây độc tế bào của chúng. Palmatine và berberine ức chế hoạt động enzym sao chép ngược trong ống nghiệm.

Hơn nữa, palmatine, berberine, jatrorrhizine, và dihydroberberine, ức chế sự tăng trưởng của bệnh Babesia gisboni với liều lượng khác nhau, từ 1 đến 100 mg/ml trong ống nghiệm. Protoberberine ức chế sự tăng trưởng của 38 dòng tế bào ung thư ở người [35].

Protoberberine (6)

Aporphine (7) có cấu trúc tương tự protoberberine được phân lập từ các chi khác nhau của họ Na. Đặc điểm thú vị của aporphine là cấu trúc hóa học lập thể hai chiều của chúng. Một trong những hợp chất như thế là anonaine (8) - là aporphine được phân lập nhiều nhất ở họ Na. 7-Hydroxydehydrothalicsimidine, thalisimidine, norpurpureine, lirinidine, và N-methylasimilobine được phân lập từ lá của Annona purpurea thể hiện khả năng ức chế đáng kể axit arachidonic, collagen, và tiểu cầu kích hoạt yếu tố gây ra kết tập tiểu cầu [24]. Điều đáng nói là aporphine, đặc biệt là những hợp chất có chứa một nhóm 1,2-methylenedioxy, là có hiệu lực hơn để chống lại các dòng tế bào ung thư.

Aporphine (7) Anonaine (8)

Các flavonoit ở họ Na có hoạt tính chống oxi hóa rất đáng quan tâm. Hơn 70 chất flavonoit đã được phân lập từ họ Na, trong đó taxifolin (9) hay dihydroquercetin là một trong các chất thường gặp nhất, ngoài ra còn có apigenin- 7-O-apiosyl (1→2) glucoside, quercetin …

Taxifolin (9) có phổ biến ở loài Angiosperms và được biết đến là một chất chống oxy hóa mạnh, chống đái tháo đường, chống khối u, và là tác nhân chống viêm [30,44]. Taxifolin là chất bảo vệ đáng tin cậy chống lại yếu tố môi trường gây ra xơ cứng động mạch, tim, gan, và bệnh phổi. Taxifolin cũng đã được chứng minh là có lợi cho sức khỏe tim mạch, da, chức năng nhận thức, viêm, cũng như sức khỏe của bệnh nhân tiểu đường [34].

Taxifolin (9)

Apigenin-7-O-apiosyl (1→2) glucoside (10) là một flavonol được tìm thấy trong cây Artabotrys hexapetalus. Flavonoit này dọn sạch các dạng oxy hoạt động và kết quả thu được từ trong cơ thể và trong các thử nghiệm in vitro cho thấy nó có tác dụng bảo vệ gan [53].

Apigenin-7-O-apiosyl (1 → 2) glucoside (10)

Quercetin (11) là một flavonol phổ biến trong các loại trái cây, rau, lá, và ngũ cốc. Nó được sử dụng như một thành phần trong chất bổ sung, đồ uống, hoặc các loại thực phẩm. Trong họ Na, quercetin xuất hiện trong lá của Annona senegalensis. Quercetin đã thể hiện hoạt tính kháng viêm đáng kể bằng cách ức chế trực tiếp một số quá trình ban đầu của viêm. Ví dụ, nó dễ dàng ức chế cả sự sản xuất và giải phóng histamin cũng như quá trình trung gian gây viêm hoặc dị ứng khác. Thêm vào đó, nó có tác dụng chống oxy hóa mạnh và đặc tính chống khối u. Quercetin có tác dụng tích cực trong việc chống lại hoặc giúp đỡ để ngăn ngừa ung thư, viêm tuyến tiền liệt, bệnh tim, đục thủy tinh thể, dị ứng/viêm, và bệnh đường hô hấp như viêm phế quản và hen suyễn. Nó cũng đã thể hiện đặc tính chống trầm cảm [22]. Hơn nữa, quercetin 3-rhamnoside (12) hủy bỏ sự sao chép của virus cúm A bằng cách giảm sự tổng hợp mRNA [31]. Flavonoit của họ Na (Annonaceae) có phản ứng rất mạnh đối với các gốc tự do và việc thăm dò các hoạt tính của chúng vẫn đang được tiếp tục.

Quercetin 3-rhamnoside (12) Quercetin (11)

Các acetogenin họ Na thể hiện hoạt tính chống ung thư, chống oxi hóa, và chống HIV ở nồng độ rất thấp nên có thể sẽ ít gây ra tác dụng phụ. Chính các chất acetogenin này là nét đặc trưng tiêu biểu của các loài thực vật họ Na. Đã có hơn 400 chất acetogenin được phân lập từ các loài họ Na. Đây là một lớp chất chuyển hóa thứ cấp đặc biệt có nhiều hoạt tính như chống ung thư, gây độc tế bào, diệt ký sinh trùng, diệt côn trùng và tác dụng ức chế miễn dịch và được xem là một nguồn tiềm năng để phát triển thuốc, điển hình như các chất:

Montalicin G (13) được phân lập từ cây Annona montana ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư: MCF-7 (ung thư vú), HCT-8 (ung thư máu), SKMEL-2 (ung thư da), KB (ung thư biểu mô miệng ở người), KB-VIN (KB kháng vincristine), U-87-MG (u nguyên bào đệm), CAKI (ung thư thận), PC-3 (ung thư tiền liệt tuyến) cũng như là 1A9 (ung thư buồng trứng) và PTX10 (dòng tế bào ung thư buồng trứng với -tubulin đột biến) với giá trị ED50 lần lượt là 4,8; 11,5; 5,8; 12,7; 12,8; 9,2; 2,0; 3,5; 1,3 và 4,6 µg/ml [17].

Motalicin G (13)

Asimicin (14) được chiết xuất từ các cây Annona cornifolia, Annona bullata và Annona triloba [13]. Acetogenin này có khả năng chống oxi hóa có thể so sánh với vitamin C.

Asimicin (14)

Annonacin (15) được tìm thấy trong các loại trái cây của Anona muricata (mãng cầu xiêm). Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng khi cho chuột sử dụng annonacin hằng ngày sẽ gây ra tổn thương não dẫn đến bệnh parkinson [8]. Cùng với acetogenin khác, annonacin được khuyến cáo để ngăn chặn NADH dehydrogenase, có vai trò cho việc chuyển đổi NADH thành ADN và sự tích tụ của một gradient proton qua màng bên trong ti thể. Điều này có tác dụng vô hiệu hóa khả năng của các tế bào để tạo ra ATP thông qua con đường oxy hóa, cuối cùng buộc tế bào tự tiêu hủy hoặc gây hoại tử.

Annonacin (15)

Uvaricin (16) là một axit béo bis(tetrahydrofuranoid) lactone được phân lập từ cây Uvaria accuminata. Đây là chất acetogenin có khả năng gây độc tế bào đầu tiên được tìm thấy từ họ Na. Chất này tiêu diệt tế bào bằng cách ức chế enzym dehydrogenase NADH trong ty thể [46].

Uvaricin (16)

Ngoài ra, còn một loại acetogenin cũng có hoạt tính sinh học đáng lưu ý đó là purpuacenin (cis) và annoglaucin (trans) hình (17) đã được phân lập từ A.purpurea. Purpuracenin và annoglaucin có hoạt tính gây độc tế bào mạnh trong ống nghiệm đối với các dòng tế bào MCF-7 (ung thư vú) và A-549 (ung thư phổi) với giá trị ED50 tương ứng là 10; 1,56, và 4,8x10-2; 1,08 mg/ml [21].

Purpuracenin và annoglaucin (17)

Chính các hợp chất acetogenin đã tạo nên nét đặc trưng tiêu biểu của các cây họ Na và đã cuốn hút các nhà khoa học nghiên cứu tìm kiếm các tác nhân chống ung thư mới từ các loài trong họ này.

Các tài liệu về Annonaceae đã phát triển đáng kể trong thập kỷ qua. Đây

chính là tài liệu có giá trị để mở rộng và phát triển nghiên cứu trong tương lai.

1.2. Giới thiệu về chi Quần đầu (Polyalthia)

1.2.1. Thực vật học

Chi Polyalthia được gọi là chi Quần đầu hay chi Nhọc thuộc họ Na (Annonaceae). Vị trí của chi này trong hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt như sau [2,1]: Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan) Lớp: Magnoliopsida (Ngọc lan) Bộ: Magnoliales (Mộc lan) Họ: Annonaceae (Na)

Chi Quần đầu là một chi lớn trong họ Na (Annonaceae), có khoảng 150 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới Châu Phi, Châu Á và miền Bắc Úc, số lớn các loài tập trung ở Đông Nam Á. Ở Việt Nam có 27 loài và phân loài, phân bố khắp các vùng trong cả nước [3].

Cây gỗ thẳng đứng thường xanh, có chiều cao từ 6 đến 25m, tán tròn hoặc hẹp, đường kính tán cây lớn khoảng 3m. Vỏ cây màu xám đậm, bong ra thành từng mảng lớn, dưới lớp vỏ bị bong ra là màu trắng hồng. Nhánh non màu xanh lục có nhiều đốm nhỏ màu trắng, già có màu nâu đỏ. Lá nhẵn hoặc hơi có lông, đối xứng, không có lá kèm. Lá của các cây trong chi Polyalthia đều đơn, bìa nguyên, mọc cách, mép lá có gân nổi rõ. Lá có hình bầu dục thuôn dài 10-15cm, rộng 3- 5cm, mềm, nhọn hai đầu, cuống lá dài 1-2cm. Hoa thường là hoa lưỡng tính hợp thành các dạng cụm hoa ở nách lá hoặc ngoài nách lá, có 6 cánh với 2 lớp. Cánh hoa bên ngoài hơi nhỏ hơn hoặc lớn hơn cánh hoa bên trong và có hình dạng khác nhau (bằng phẳng hoặc trải rộng). Nhị hoa nhiều, bao phấn hình thoi hoặc hình cầu, lá noãn rời. Mỗi lá noãn được chia thành bầu, vòi nhụy và núm nhụy không có hình dạng xác định (hình chữ nhật, góc cạnh hoặc hình trụ). Quả dạng bầu dục. Hạt thường là hạt đơn có rãnh [3,1].

Các cây thuộc chi Polyalthia đều có tốc độ sinh trưởng khá nhanh. Cây ưa khí hậu ẩm ướt, đất tơi xốp, thoát nước tốt và cần che bóng râm khi còn nhỏ. Cây mọc khỏe, dễ trồng, xanh quanh năm [1].

1.2.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

a) Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Cho đến nay, trên thế giới có khoảng gần 20 loài Polyalthia đã được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Polyalthia longifolia là cây được nghiên cứu nhiều nhất trong chi này.

Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của chi này rất đa dạng bao gồm các hợp chất alkaloit, tecpenoit, flavonoit, acetogenin và một số lớp chất khác.

Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài Polyalthia như sau: Cây Polyalthia longifolia ở Nigieria đã được Ogunbinu A. O. và cộng sự

nghiên cứu về tinh dầu. Thành phần chính bao gồm (Z)--aromadendren (19,7%),

caryophyllen oxit (14,4%) và -caryophyllen (13,0%) trong lá; trong vỏ là -

copaen (8,7%), -muurolol cùng (8,7%), -selinen (8,6%), viridifloren (8,1%), -

guaien (7,8%), aromadendren (7,4%) và -cadinen (7,0%) [3].

là 16-hydroxycleroda-3,13-dien-16,15-olide

Noriyuki Hara và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu dịch chiết n-hexan của vỏ thân cây Polyalthia longifolia, thu được 14 hợp chất clerodane và ent- (18), 16- halimane ditecpen hydroxycleroda-3(18),13-dien-16,15-olide (19), 16-hydroxy-ent-halima-5(10),13- dien-16,15-olide (20), cleroda-3,13E-dien-15-oic acid (21), cleroda-4(18),13E- dien-15-oic acid (22), ent-halima-5(10),13E-dien-15-oic acid (23), ent-halima- 1(10),13E-dien-15-oic acid (24), 16-oxocleroda-3,13E-dien-15-oic acid (25), 16- oxocleroda-4(18),13E-dien-15-oic acid (26), 16-oxo-ent-halima-5(10),13E-dien- 15-oic acid (27), cleroda-3,13-dien-16,15-olide (28), cleroda-4(18),13-dien-16,15- olide (29), ent-halima-5(10),13-dien-16,15-olide (30), ent-halima-1(10),13-dien- 16,15-olide (31) [47].

Trong năm 2014, nhóm nghiên cứu của Tung-Ho Wu tiếp tục phân lập được 3 chất clerodane ditecpen mới là (4→2)-abeo-cleroda-2,13E-dien-2,14-dioic acid (32), (4→2)-abeo-2,13-diformyl-cleroda-2,13E-dien-14-oic acid (33), và 16(R&S)-methoxycleroda-4(18),13-dien-15,16-olide (34) cùng với 5 chất đã biết là solidagonal acid (35), 16-hydroxycleroda-4(18),13-dien-15,16-olide (36), 16- hydroxycleroda-3,13-dien-15,16-olide (37), 16-oxocleroda-3,13-dien-15-oic acid (38) và (3β,5β)-16-trihydroxyhalima-13-en-15,16-olide (39) từ quả cây Polyalthia longifolia var. pendula.

Năm 2007, Xiu-Feng He và cộng sự đã phân lập được các chất (3β,22α)- 3,22-dihydroxytaraxast-20-en-30-al (40), 2-hydroxyonychine (41) và nemoralisin (42) từ cành nhỏ và lá cây Polyalthia nemoralis [61].

Năm 2008, Zi-Ming Lu và cộng sự đã phân lập được các hợp chất ankaloit polynemoralines A (43), B (44), C (45) và D (46) từ cành và lá cây Polyalthia nemoralis [64].

(47) và

Năm 1994, Ma X. và cộng sự đã phân lập được 2 clerodane ditecpen mới là (3β,16α)-dihydroxycleroda-4(18),13(14)Z-dien-15,16-olide (4β,16α)- dihydroxyclerod-13(14)Z-en-15,16-olide (48) cùng với 16α-hydroxycleroda- 3,13(14)Z-dien-15,16-olide từ dịch chiết etyl axetat của vỏ thân cây Polyalthia barnesii. [60]

Năm 1996, Connolly và cộng sự đã phân lập được hai chất alkaloit 7,7’- bisdehydroaporphine mới là 7,7’-bisdehydro-O-methylisopiline (49) và 7- dehydronornuciferine-7’-dehydro-O-methylisopiline (50), cùng với chất alkaloit bisdehydroaporphine là urabaine (51) từ vỏ thân cây Polyalthia abullata [19].

Năm 2010, Pumsalid Kanchana và cộng sự đã phân lập được chất 6,8- dihydroxy-7-methoxy-1-methyl-azafluorenone (52) từ cặn chiết etyl axetat của rễ cây Polyalthia cerasoides [52].

Năm 2007, một hợp chất alkaloit dạng dime aporphine là bidebiline E (53) và chất octadeca-9,11,13-triynoic acid (54) cùng với 3 sesquitecpen là α-humulene (55), caryophyllene oxide (56), and (-)-α-cadinol (57) và 4 isoquinoline alkaloit laudanosine (58), codamine (59), laudanidine (60), and reticuline (61) đã được Kanokmedhakul Somdej và cộng sự phân lập từ rễ cây Polyalthia cerasoides [37].

Năm 2012, hai chấtbenzophenone glucosides là iriflophenone 2-O-β- glucoside (62), iriflophenone 3-C-β-glucoside (63), mộtxanthone C-glucoside là mangiferin (64), và hai chất C-β-glucosides flavonoitlà vitexin (65) và isovitexin (66) đã được T. Kanchanapoom phân lập từ lá và cành cây Polyalthia cerasoides [36].

Hai chất alkaloit 7,8-dihydro-8-oxoprotoberberine là cerasodine (67) và cerasonine (68) đã được M. C. Gonzalez và cộng sự phân lập từ vỏ thân cây Polyalthia cerasoides vào năm 1997 [28].

Năm 1995, M. Carmen Gonzalez và cộng sự đã phân lập được polycerasoidin (69) và polycerasoidol (70) từ vỏ thân cây Polyalthia cerasoides [47].

Các dẫn xuất prenyl benzopyran là (6E,10E)-isopolycerasoidol (71) và polycerasoidin Me ester (72) cũng đã được M. C. Gonzalez và cộng sự phân lập từ cặn chiết metanol của vỏ thân cây Polyalthia cerasoides [27].

Cặn chiết etyl axetat của lá và cành nhỏ cây Polyalthia crassa, P. Tuchinda và cộng sự đã phân lập bốn styryl-lactones mới là crassalactone A-D (73-76) và 7 hợp chất đã biết khác là (+)-3-acetylaltholactone, (+)-altholactone,aristolactam AII, cinnamic acid, (+)-goniofufurone, (+)-goniopypyrone, and (+)-howiinol A [50].

Năm 2013, Kanokmedhakul S. và cộng sự đã phân lập được 4 chất dime aporphinoid là bidebilines A-D (77-80), bis-7,7’-dehydroanonaine (77), 7- dehydroanonaine-7’-dehydro-8’-methoxyanonaine (78), bis-7,7’-dehydro-8,8’- dimethoxyanonaine (79), và bis-7,7’-dehydro-10,10’-dimethoxyanonaine (80) [38].

Năm 2009, Prachayattikul S. và cộng sự đã phân lập được 2 azafluorenone

alkaloit là onychine (81) và 7-methoxyonychine (82) cùng với hỗn hợp của β-sitosterol và stigmasterol từ cặn chiết clorofoc của rễ cây [57].

Năm 2010, Panthana N. và cộng sự đã phân lập được 6 polyacetylenic C25

và C27 acetogenins tên là debilisones A-F (83-88) từ dịch chiết metanol [49].

Từ vỏ thân cây Polyalthia lamcilimba, năm 1998, Y. P. Lue và cộng sự đã phân lập được 2 chất tritecpen 4 vòng 24-methylene là 24-methylenelanosta- 7,9(11)-dien-(3β,15α)-diol (89) và 24-methylenelanosta-8-en-(2β,3β)-21-triol (90) [62].

Năm 1990, khi nghiên cứu thành phần alkaloit của các loài họ Na ở Malaysia, Lavaut M. và cộng sự đã phân lập được (-)-oliveroline, (-)-N- oxyoliverine, liriodenine và (-)-coclaurine từ Polyalthia macropoda; liriodenine (91), oxostephanine (92), (-)-discretamine (93), isoursuline (94) và một chất alkaloit mới là (-)-thaipetaline (95) từ cây Polyalthia stenopetala [40].

Năm 1991, Richomme P. và cộng sự cũng đã phân lập được một chất labdane ditecpen là (4S,9R,10R) Me 18-carboxy-labda-8,13(E)-diene-15-oate (96) từ vỏ thân cây Polyalthia macropoda [55]

Các nghiên cứu trước đã chỉ ra sự có mặt của alkaloit trong cây Polyalthia nitidissimal. Năm 1983, Jossang A. và cộng sự đã phân lập được 13 isoquinoline alkaloit trong đó có 4 chất dime mới là N,N’-dimethyllindoldhamine (97), isodaurisoline (98), 7-O-methyllindoldhamine (99) và 7’-O-methyllindoldhamine (100) từ các bộ phận khác nhau của cây này [7].

Năm chất alkaloit 1,2,3-trimethoxy-10,11-methylenedioxynoraporphine và được gọi là polygospermine (101), noroconovine (102); xylopinine; kikemanine; và một chất 2,3-dimethoxylated tetrahydroprotoberberine mới được phân lập từ vỏ thân cây Polyalthia oligosperma [29].

Thành phần chính của cây Polyalthia oliveri là các hợp chất alkaloit. Năm 1977, Hamonniere M. và cộng sự đã tìm thấy các aporphine alkaloit là oliveridine (103), nor-oliveridine (104), oliveroline (105), oliverine (106), pachypodanthine (107), N-oxy oliveroline (108), N-oxy N-methyl pachypodanthine (109) từ lá và vỏ cây này [32].

Năm 2014, Kouam S. F. và cộng sự cũng đã phân lập được 3 indolosesquiterpene alkaloit mới có tên 8α-polyveolinone (110), N-acetyl-8α- polyveolinone (111) và N-acetyl-polyveoline (112), cùng với 3 chất đã biết là dehydro-O-methylisopiline (113), N-methylurabaine (114) and polycarpol (115) từ vỏ thân cây Polyalthia oliveri [56].

Các nghiên cứu trước đây đã cho biết thành phần chính của cây Polyalthia suaveolens là các hợp chất alkaloit như isopolyalthenol và neopolyalthenol (116), polyavolinamide (117), polyveoline (118) [33].

(119), lanuginosine liriodenine

Các nghiên cứu về cây Polyalthia suaveolens đã phân lập được các alkaloit là oxostephanine, (3,10,11-trihydroxy-1,2- methylene dioxy noraporphine) (120) và asimilobine (2-hydroxy-1-methoxy noraporphine) (121) được phân lập từ thân cây, cùng với các chất 1-aza-9,10- dimethoxy-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydroanthracene (kalasinamide) (122), N-trans- feruloyltyramine và N-trans-coumaroyltyramine cũng được phân lập từ thân cây [48]. Một chất tritecpen C31 khung lanostane là suberosol (123) cũng đã được phân lập từ loài cây này.

Từ loài Polyalthia cheliensis, Hao, Xiao-Jiang và cộng sự đã phân lập hai chất ditecpen khung clerodane mới là 16α-hydroxy-cleroda-4(18),13(14)Z-dien- 15,16-olide (124) và cleroda-4(18),13(14)E-dien-15-oic acid (125) cùng với 2 chất đã biết là 16α-hydroxy-cleroda-3,13(14)Z-dien-15,16-olide (126) và cleroda- 3,13(14)E-dien-15-oic acid (127) [16].

(129), polybeccarine

6a,7-dehydroaporphine mới

Nghiên cứu vỏ thân cây Polyalthia cauliflora var. cauliflora, A. Jossang và cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất alkaloit mới trong đó có 4 bisaporphine mới (130), và (128), beccapolinium là beccapoline là chất và một (131) beccapolydione dehydropredicentrine (132) từ vỏ thân cây.

3,7-dimethoxy-5-hydroxyflavone (133), là

Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Ghani, N.A. đã phân lập được 5 chất flavone 5,8-dihydroxy-6,7- dimethoxyflavone (134), tectochrysin (135), 6,7-dimethoxy-5-hydroxyflavone (136) và alnustin (137) từ vỏ thân cây Polyalthia cauliflora var. cauliflora [14].

Năm 2014, các nhà khoa học Trung Quốc Liu-Kai Wang và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học của cây Polyalthia oblique và tìm thấy 2 chất tritecpen thuộc khng lanostane là 20-hydroxyeuphorbol-7-one (138) và 15α- hydroxyeuphorbol-7,11-dione (139), cùng với 4 chất tritecpen đã biết là euphorbol-7-one (140), friedelin (141), stigmast-4-ene-6α-ol-3-one (142) và stigmasta-4-en-3,6-dione (143) trong cặn chiết etanol của lá và cành cây.

Từ cây Polyalthia plagioneura, năm 2010, Bingjing Liu và cộng sự đã phân

lập được marcarine A (144) từ cặn chiết etyl axetat của thân cây.

Các loài Polyalthia cũng đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm

nghiên cứu về hoạt tính sinh học đặc biệt là cây Polyalthia longifolia.

Cho đến nay, có tới hàng trăm công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các cặn chiết và chất được phân lập từ cây Polyalthia longifolia đã được nghiên cứu về các tác dụng dược lý như kháng khuẩn, chống oxi hóa, kháng viêm, kháng bệnh leishmania, kháng nấm, chống tiểu đường, chống sốt, kháng u, kháng ung nhọt và chống ung thư, chống mối mọt và bảo vệ gan [51].

Chất 6,8-dihydroxy-7-methoxy-1-methyl-azafluorenone từ cặn chiết etyl axetat của rễ cây Polyalthia cerasoides có hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 trong khoảng 2.64-3.58 μg.ml-1 đối với các tế bào A549, GLC4 và GLC4/Adr. Nó cũng thể hiện khả năng ức chế rất mạnh đối với chủng vi khuẩn M. tuberculosisvới MIC bằng 0.78 μg.mL-1, tương đương với ofloxacin là một trong bốn thuốc kháng sinh được dùng làm chất đối chứng dương [52].

b) Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cho tới nay mới chỉ có duy nhất một công trình công bố về kết quả nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu của lá và vỏ 3 loài Polyalthia harmandii, Polyalthia jucunda và Polyalthia thorelli [23].

Trong tất các mẫu đều có chứa α-pinene (0.2-3.2%), myrcene (0.3-4.1%), (E)-β-ocimene (0.2-9.6%), bicycloelemene (0.2-18.0%), β-elemene (0.3-4.9%), β-caryophyllene (0.1-17.8%), germacrene D (4.4-20.1%), bicyclogermacrene (4.2- 27.9%) and δ-cadinene (0.2-4.5%). Bên cạnh các thành phần chủ yếu là benzyl benzoate (9.7%) và ishwarane (8.0%) trong lá và thân cây Polyalthia harmandii. Các thành phần δ-3-carene (8.2%), α-amorphene (6.5%), β-phellandrene (5.5%) và β-pinene (5.1%) được tìm thấy trong lá Polyalthia jucunda, trong khi sabinene

(30.9%) và β-phellandrene (10.2%) có trong thân cây. Trong khi γ-elemene (22.3% and 12.3%), germacrene D (10.5% and 6.9%) và spathulenol (9.1% and 11.8%) có trong cả tinh dầu lá và thân cây Polyalthia thorelii, thì α-terpinene (7.8%) và β-gurjunene (5.2%) lại chỉ có trong lá cây.

1.3. Cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum Benth. & Hook. f.)

1.3.1. Thực vật học

Quần đầu khỉ là loài thực vật có hoa thuộc họ Na (Annonaceae). Loài này được Buch Ham. Ex Hook. F. et. Thomson Benth miêu tả khoa học đầu tiên năm 1862 với tên gọi Polyalthia simiarum Benth. Hook. f.

Cây gỗ trung bình, cao 15-20 m, vỏ cây màu trắng xám, nhánh non có lông mịn. Lá có phiến bầu dục, dài 15-18 cm, rộng 5-8 cm, không lông, trừ ở gân chính; mặt dưới nâu đỏ; gân bên 15-17 đôi; cuống lá dài 6-8 mm, không có lông. Hoa xếp thành xim bó 2-4 cái ở nhánh già; cánh hoa hẹp, dài đến 4 cm, thường tiếp tục phát triển; nhị nhiều; lá noãn không lông. Quả không lông, có cuống dài; hạt đơn, màu xám, nhẵn. Cây thường ra hoa từ tháng 3 đến tháng 5, có quả từ tháng 5 đến tháng 7 [1,4].

Cây mọc rải rác trong rừng ở các vùng khí hậu nhiệt đới, tập trung ở Đông Nam Á như Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Myanmar; ngoài ra còn có ở Butan, Ấn Độ, Trung Quốc. Tại Việt Nam cây được tìm thấy nhiều ở Đồng Nai (Biên Hòa) [1,4].

1.3.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Theo kinh nghiệm dân gian phần vỏ của cây Quần đầu khỉ thường được sử

dụng. Ở Ấn Độ, vỏ của cây được dùng làm thuốc trị bò cạp đốt.

Trên thế giới mới có duy nhất một công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của vỏ cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum). Kết quả cho thấy: vỏ ở thân cây cây chứa một loại bisnor clerodane diterpenoid mới là 2-oxo-14,15-bisnor- 3,11E-kolavadien-13 (145), và ba dẫn xuất clerodane đã biết trước đây, acid kolavenic (146); 16β-hydroxycleroda-3,13(14)Z-dien-15,16-olide (147) và 16- oxocleroda-3,13(14)E-dien-15-oic acid (148) [58].

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mẫu thực vật

Mẫu cây Quần đầu khỉ được thu hái ngày 12/9/2013 tại Sơ Pai-K’Bang-Gia Lai gồm 2 bộ phận lá và vỏ. Mẫu đã được TS. Nguyễn Quốc Bình-Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật định tên khoa học là Polyalthia simiarum (Quần đầu khỉ) thuộc chi Polyalthia, họ Annonaceae. Mẫu tiêu bản VN 1751 được lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu

Vỏ cây được thái nhỏ, lá để nguyên. Các bộ phận này được phơi riêng trong bóng râm cho đến khô, sấy ở nhiệt độ 50oC - 55oC rồi nghiền nhỏ. Mẫu dưới dạng bột khô được ngâm chiết theo quy trình chung. Chiết bằng phương pháp ngâm mẫu ở nhiệt độ phòng trong metanol 4 lần, 24h/lần. Gộp các dịch chiết đã lọc, cất loại bớt dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch chiết MeOH cô đặc. Từ dịch chiết metanol này sẽ điều chế các cặn chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần theo phương pháp chiết phân bố.

2.3. Phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật

Để phân tích và phân tách các cặn chiết của cây cũng như phân lập các chất sạch nhóm nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) và sắc ký rây phân tử (sephadex LH-20).

Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp mỏng điều chế đều được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 của Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai là một hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng như n-hexan, diclometan, etyl axetat, axeton, metanol.

Sắc ký cột thường với pha tĩnh là silicagel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230-

400 mesh) của Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như: n-hexan/diclometan, n-hexan/etyl axetat, n-hexan/axeton, diclometan/metanol, …với tỉ lệ thích hợp.

Sắc ký sephadex LH-20 được rửa giải bằng dung môi metanol hoặc hỗn

hợp metanol/diclometan (9:1, 8:2, …).

2.4. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ các mẫu thực vật nghiên cứu

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp của các dữ kiện thu được từ các phương pháp phổ như: phương pháp phổ khối phun bụi điện tử

(ESI-MS), phổ khối ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI-MS) và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY).

Độ quay cực của các hợp chất được đo bằng máy Jasco P-2000 của hãng Jasco Mỹ và điểm nóng chảy được đo trên máy MEL TEMP 3.0 của hãng Thermo Scientific-Mỹ tại Viện Hóa sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học

2.5.1. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute-NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks.

2.5.2. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck và McKane L. & Kandel. Các chủng vi sinh vật kiểm định được hoạt hóa và pha loãng tới nồng độ khoảng 0,5 đơn vị Mc Fland. Các phiến thí nghiệm để trong tủ ấm ở 37oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ cho nấm. Các mẫu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ 5-10 thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.

CHƢƠNG 3 - THỰC NGHIỆM 3.1. Tách chiết, phân lập các chất từ lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)

3.1.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết xuất

Lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum) sau khi thu hái được phơi khô trong bóng râm và sấy ở nhiệt độ 50-55oC trong vòng 2h. Lá cây khô (1,54 kg) được nghiền thành bột mịn rồi ngâm chiết trong MeOH (4 lần, 24h/lần). Gộp các dịch chiết MeOH lại với nhau, cất loại dung môi xuống còn khoảng 1/15 thể tích ban đầu. Pha loãng dịch chiết còn lại bằng nước cất, chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexan và etyl axetat. Làm khô các dịch chiết bằng Na2SO4 khan, cất loại dung môi để thu được các cặn chiết tương ứng n-hexan (PSH; 4,0 g), etyl axetat (PSE; 10,0 g) và metanol (PSM; 13,5 g). Phần bã sau khi ngâm chiết bằng MeOH tiếp tục được ngâm với dung dịch HCl 1,5% (10 lít) trong vòng 24h. Lọc lấy phần nước, thêm dung dịch NaOH 5% cho đến khi pH đạt 9-10. Gạn bớt phần nước ở trên, chiết phần nước có chứa tủa còn lại bằng CH2Cl2 (3 lần, 300 ml/lần). Gom các dịch chiết CH2Cl2 và cất loại dung môi thu được cặn chiết alkaloit (PSA; 1,3 g).

Hàm lượng các cặn chiết được tính theo công thức:

x 100% H% = mc mdl

Trong đó: H%: hàm lượng cặn thu được mc: khối lượng cặn thu được (g) mdl: khối lượng dược liệu đem chiết (g) Như vậy, hàm lượng các cặn chiết thu được lần lượt là: cặn n-hexan

(0,26%), etyl axetat (0,65%), metanol (0,84%), alkaloit (0,084%).

Dưới đây là quy trình xử lý và chiết xuất các cặn từ lá cây Quần đầu khỉ:

3.1.2. Phân lập chất từ các cặn chiết của lá cây Quần đầu khỉ

Phân tách cặn chiết alkaloit (PSA; 1,3 g) trên cột silicagel, rửa giải theo phương pháp gradient hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (0→20% MeOH) thu được 5 nhóm phân đoạn A1-A5. Tinh chế nhóm phân đoạn A3 (30 mg) trên cột Sephadex LH-20, rửa giải bằng dung môi MeOH thu được 3 phân đoạn A3.1-A3.3. Phân đoạn A3.2 (9,8 mg) có chất kết tinh, rửa phân đoạn này bằng axeton và kết tinh lại phần chất rắn trong hốn hợp CH2Cl2/MeOH thu được chất POS3 (4 mg).

A1 300 mg

A5 200 mg

A4 100 mg

A2 150 mg

Cặn alkaloit (PSA) (1,3 g) CC, silica gel, CH2Cl2/MeOH (0→20% MeOH) A3 30 mg Sephadex LH-20 dung môi MeOH A3.2 9.8 mg

A3.1 10 mg

A3.3 7 mg

Rửa bằng axeton Kt. axeton/CH2Cl2 POS3 4 mg

Sơ đồ 3.2. Quá trình phân lập các chất từ cặn alkaloit

Cặn chiết etyl axetat (PSE; 10,0 g) được phân tách trên cột silica gel, rửa giải bằng phương pháp gradient hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (0→ 20% MeOH) để thu được 5 phân đoạn E1-E5.

Phân đoạn E4 tiếp tục được tinh chế bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (9:1) thu 5 phân đoạn, E4.1-E4.5. Sau khi cất loại hết dung môi ở phân đoạn E4.3 thu được chất rắn màu vàng, kết tinh lại trong hỗn hợp n-hexan/CH2Cl2 (1:1) thu được chất QDK1 (9,5 mg).

Phân đoạn E5 và E6 sau khi cất loại hết dung môi thu được chất rắn màu vàng, rửa chất rắn này bằng axeton thu được chất rắn màu trắng, kết tinh lại trong hốn hợp CH2Cl2/MeOH thu được chất POS5 (2,2 g).

Cặn etyl axetat (PSE) (10,0 g)

CC, silica gel, CH2Cl2/MeOH (0→20% MeOH)

E5 1,4 g

E1 1,9 g

E4 1,7 g

E2 1,5 g

E3 1,3 g

E6 1,7 g

E7 0,8 g

CC, Silica gel, CH2Cl2/MeOH (9:1)

Rửa bằng axeton Kt. CH2Cl2/MeOH

E4.3 50 mg

E4.4 0,5 g

POS5 2,2 g

E4.2 0,3 g

E4.1 0,5 g

Kt. CH2Cl2/MeOH

QDK1 9,8 mg

Sơ đồ 3.3. Quá trình phân lập các chất từ cặn etyl axetat

Cặn MeOH (PSM; 13,0 g) được phân tách trên cột diaion HP-20, rửa cột lần lượt với 100% H2O, H2O/MeOH (1:1) và 100% MeOH để thu được 3 phân đoạn M1-M3. Phân đoạn M3 (4,0 g) được phân tách trên cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/H2O (8:2:0,2) để thu được 3 nhóm phân đoạn M3.1-M3.3. Sau khi cất loại lần lượt hết dung môi ở nhóm phân đoạn M3.2 và M3.3 thu được hai chất rắn màu vàng. Kết tinh lại các chất rắn này trong hỗn hợp MeOH/H2O lần lượt thu được các chất POS1 (35,0 mg) và POS2 (20,0 mg).

Cặn metanol (PSM) (13,0 g)

CC, Diaion HP-20, 100% H2O, 50% MeOH, 100% MeOH

M2 2,3 g

M3 4,0 g

CC, silica gel, CH2Cl2/MeOH/H2O (8:2:0,2)

M3.2 0,12 mg

M3.1 1,5 g

M3.3 0,10 mg

Rửa, kết tinh lại

POS1 35 mg

POS2 20 mg

Sơ đồ 3.4. Quá trình phân lập các chất từ cặn metanol

3.1.3. Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất đã phân lập

Indole-3-carbaldehyde (QDK1): Tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 180-181oC. 1H-NMR (500 MHz, MeOD) H ppm: 7,25 (1H, dt, J=1,0; 7,0 Hz, H-5); 7,29 (1H, dt, J=1,0; 7,0 Hz, H-6); 7,49 (1H, d, J=7,5 Hz, H-7); 8,11 (1H, s, H-2); 8,17 (1H, d, J=7,5 Hz, H-4); 9,90 (1H, s, 3-CHO). 13C-NMR (500 MHz, MeOD) C ppm: 113,12 (C-7), 120,13 (C-3); 122,38 (C-4); 123,61 (C-5); 124,99 (C-6); 125,72 (C-9); 138,94 (C-8); 139,67 (C-2); 187,40 (-CHO) (xem Bảng 4.3).

(POS3): Tinh 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl-β-carboline

thể không màu, nóng chảy ở 186-187oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) H ppm: 2,54 (3H, s, N-CH3); 2,86 (4H, s, 2H-3 và 2H-4); 3,68 (2H, s, H-1); 6,98 (1H, td, J=1,0; 8,0 Hz, H-6); 7,05 (1H, td, J=1,0; 8,0 Hz, H-7); 7,28 (1H, br d, J=8,0 Hz, H-8); 7,40 (1H, br d; J=8,0 Hz, H-5). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) C ppm: 53,19 (C- 1); 54,12 (C-3); 22,19 (C-4); 107,60 (C-4a); 128,27 (C-4b); 118,46 (C-5); 119,70 (C-6); 121,95 (C-7); 111,81 (C-8); 137,99 (C-8a); 132,44 (C-9a); 45,61 (N-CH3). ACPI-MS: 203 [M+H]+ (xem Bảng 4.4).

Rutin (POS2) (Quercetin-3-O-rutinoside): Tinh thể hình kim, màu vàng,

nóng chảy ở 214-215oC. 1H-NMR và 13C-NMR (xem Bảng 4.1).

Kaempferol-3-O-rutinoside (POS1): Tinh thể hình kim, màu vàng, nóng

chảy ở 162-164oC. 1H-NMR và 13C-NMR (xem Bảng 4.2). 3.2. Tách chiết, phân lập các chất từ vỏ cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)

3.2.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách

Mẫu vỏ cây Quần đầu khỉ tươi được thái nhỏ, phơi khô, sấy ở 50-55oC trong 2-3h, sau đó xay thành bột thu được 1,8 kg. Nguyên liệu dưới dạng bột (1,8 kg) được ngâm chiết với MeOH bốn lần (5 lít/lần, 24h/lần). Gộp các dịch chiết lại và cất loại bớt dung môi dưới áp suất giảm đến còn khoảng 1/15 thể tích ban đầu. Pha loãng dịch chiết metanol đã cô đặc bằng nước cất theo tỉ lệ 1/1. Sau đó tiến hành chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexan, etyl axetat, mỗi dung môi chiết 3 lần (500ml/lần). Gộp dịch chiết của 3 lần và làm khô bằng Na2SO4 khan. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng là n-hexan (7,5 g), etyl axetat (13,6 g), metanol (16,5 g).

Hàm lượng cặn n-hexan, etyl axetat và metanol tương ứng là: 0,42%,

0,75% và 0,92%.

Cặn n-hexan (PVH; 7,5 g) được phân tách sơ bộ bằng phương pháp sắc ký

cột trên chất hấp phụ silicagel thường với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexan/axeton (0→100%) thu được các phân đoạn từ VH1-VH5.

Phân đoạn VH1 được tinh chế qua cột silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/axeton (100:0, 99:1) thu 3 phân đoạn VH1.1-VH1.3. Rửa phân

tinh

trong hỗn hợp dung môi

lại đoạn VH1.2 bằng axeton và kết n-hexan/axeton (7:3) thu được chất SP1 (0,35 g).

Phân đoạn VH3 được kết tinh trong CH2Cl2/MeOH (9/1) thu được chất có

Rf trùng với POS5 (50 mg).

Sơ đồ 3.6. Quá trình phân lập các chất từ cặn n-hexan

3.2.2. Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất đã phân lập

Ent-halima-1(10),13E-dien-15-oic acid (SP1): tinh thể hình kim, không 25 +67.5 (MeOH, c 0,62). 1H-NMR và

màu. Nhiệt độ nóng chảy 112-113oC. [α]D 13C-NMR (xem Bảng 4.5). ESI-MS m/z: 305 [M+H]+

β-sitosterol (POS5): Tinh thể dạng phiến, màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy

135-136oC. 1H-NMR và 13C-NMR (xem Bảng 4.6).

Sitosterol-3-O-β-glucopyranoside (POS6): Chất rắn dạng vô định hình,

màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy 273-274oC. 3.3. Hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất đƣợc phân lập

3.3.1. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính

kháng sinh của các mẫu thử.

Các chủng vi sinh vật kiểm định: - Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922) và Pseudomonas

aeruginosa (ATCC 25923)

- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis (ATCC 11774) và Staphylococcus aureus

subsp. Aureus (ATCC 11632)

- Nấm sợi: Aspergillus niger (439) và Fusarium oxysporum (M42) - Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754) và Saccharomyces cerevisiae

(SH 20)

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane L. & Kandel (1996).

- Chứng dương tính là Streptomycin cho vi khuẩn Gr (+), tetracyclin cho vi khuẩn Gr(-) và Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men. Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp.

- Chứng âm tính là vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử. - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Môi trường duy trì và bảo tồn giống là Saboraud Dextrose Broth (SDB-Sigma) cho nấm men và nấm mốc, và Trypcase Soya Broth (TSB-Sigma) cho vi khuẩn. Môi trường thí nghiệm là Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn và Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.

- Tiến hành thí nghiệm:

+ Các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng tới nồng đọ 0,5 đơn vị

Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm.

+ Các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37 oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48

giờ đối với nấm sợi và nấm men.

- Tính kết quả: Các mẫu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, để tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ mà ở đó vi sinh vật bị ức chế gần như hoàn toàn. Mẫu thô có MIC ≤ 200 µg/ml, mẫu tinh có MIC ≤ 50 µg/ml là có hoạt tính.

3.3.2. Thử hoạt tính gây độc tế bào

a) Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

- Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO).

- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm

CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.

b) Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)

TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks [9,20,39,41,54]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD-Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 20 g/ml. Chất thử có hoạt tính được xác định IC50 nhờ dải nồng độ 20 g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml; 0,16 g/ml.

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm

để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi

trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180 l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid-TCA.

- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.

- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

% ức chế = 100% - % sống sót

- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml.

- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50  4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT.

CHƢƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Các hợp chất đƣợc phân lập từ lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)

Từ các cặn chiết của lá cây Quần đầu khỉ đã phân lập được 04 hợp chất sau:

4.1.1. Rutin (POS2)

Chất POS2 nhận được dưới dạng chất kết tinh dạng kim màu vàng chanh đặc trưng của một flavonoit. Các phổ NMR của hợp chất này cho thấy đây là một flavon-glycozit.

Phổ 1H-NMR (Hình 4.1) của POS2 xuất hiện các tín hiệu của 5 proton vòng thơm trong đó có hai proton được xác định ở vị trí meta với nhau [δ 6,23 và 6,42 (1H, d, J=2,0 Hz)] và 3 proton còn lại được xác định thuộc vào một vòng thơm có hệ tương tác ABX [δ 7,69 (1H, d, J=2,0 Hz); 6,89 (1H, d, J=8,5 Hz); 7,64 (1H, dd, J=2,0; 8,5 Hz)]. Các dữ kiện phổ trên cho phép dự đoán sự có mặt của cấu trúc khung flavonoit dạng quercetin. Sự xuất hiện của các proton anome tại δ 5,12 (1H, d, J=7,5 Hz) và 4,54 (1H, d, J=1,5 Hz) xác định sự tồn tại của hai phân tử đường. Ngoài ra, sự xuất hiện các tín hiệu của một nhóm oximetilen tại δ 3,83 (1H, dd, J=11,0 và 1,0 Hz, Ha) và 3,41 (1H, dd, J=11,0 và 6,0 Hz, Hb), và một nhóm metyl bậc hai tại δ 1,13 (3H, d, J=6,5 Hz), cùng với giá trị hằng số tương tác của các proton anome tương ứng cho phép dự đoán sự có mặt của đường β-D- glucopyranose và α-L-rhamnopyranose trong phân tử.

Phổ 13C-NMR (Hình 4.2) của POS2 xuất hiện tín hiệu của 27 cacbon trong đó có 15 cacbon thuộc khung flavon và 12 cacbon thuộc vào hai phân tử đường. Giá trị độ chuyển dịch hóa học của các cacbon của phân tử đường thứ nhất xuất hiện tại δ 104,71 (C-1”); 75,72 (C-2”); 78,19 (C-3”); 71,40 (C-4”); 77,22 (C-5”); 68,55 (C-6”) khẳng định đây là đường β-D-glucopyranose. Các giá trị độ dịch chuyển hóa học của cacbon của đơn vị đường còn lại tại δ 102,41 (C-1”’); 72,10 (C-2”’); 72,25 (C-3”’); 73,94 (C-4”’); 69,70 (C-5”’); 17,86 (C-6”’) xác định đơn vị đường α-L-rhamnopyranose. Sự tăng mạnh độ chuyển dịch hóa học của cacbon oximetilen C-6’’ ( 68,55) của đơn vị đường glucose cho phép xác định vị trí liên kết của đường rhamnose tại cacbon này.

Các tương tác trên phổ HSQC và HMBC đưa đến nhận định, chất này có

thể là rutin.

Từ các phân tích trên, số liệu phổ 13C-NMR của POS2 được so sánh với giá trị tương ứng đã được công bố của hợp chất rutin. Sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ 13C-NMR giữa hai hợp chất (bảng1) cùng với sự có mặt của pic giả ion phân tử [M+Na]+ tại m/z 633 trên phổ ESI-MS tương ứng với công thức phân tử là C27H30O16 cho phép khẳng định cấu trúc hóa học của POS2 là quercetin-3-O-[α-L- là rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside], chất này còn được gọi

quercetin-3-O-rutinoside hay rutin

Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của POS2

Hình 4.2. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của POS2

Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của POS2

a,b

H

#C 158,52 135,62 179,44 162,98 99,95 166,01 94,87 159,35 105,66 123,15 117,69 145,84 149,81 116,06 123,55 104,69 75,74 78,20 71,42 77,25 68,56

C 158,52 135,62 179,41 162,98 99,97 166,09 94,88 159,33 105,61 123,13 117,69 145,84 149,80 116,06 123,55 104,71 75,72 78,19 71,40 77,25 68,55

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1” 2” 3” 4” 5” 6”

DEPT C C C C CH C CH C C C CH C C CH CH CH CH CH CH CH CH2

102,42 72,12 72,26 73,94 69,71 17,87

102,41 72,10 72,25 73,94 69,70 17,86

a,c (m, J=Hz) - - - - 6,23 (d, 2,0) - 6,42 (d, 2,0) - - - 7,69 (d, 2,0) - - 6,89 (d, 8,5) 7,64 (dd, 2,0; 8,5) 5,12 (d, 7,5) 3,49 (dd, 7,7; 9,0) 3,43 (t, 9,0) 3,30 (t, 9,0) 3,35 (m) 3,83 (dd, 1,0; 11,0) 3,41 (dd, 6,0; 11,0) 4,54 (d, 1,5) 3,65 (dd, 1,5; 3,2) 3,55 (dd, 3,2; 9,5) 3,32 (m) 3,47 (m) 1,13 (d, 6,5)

1’” 2’” 3’” 4’” 5’” 6’”

CH CH CH CH CH CH3

ađo trong metanol-d4, b125MHz, c500MHz, m: multiplicity, #C của rutin.

4.1.2. Kaempferol-3-O-rutinoside (POS1)

Chất POS1 cũng nhận được dưới dạng chất kết tinh hình kim, màu vàng, nóng chảy ở 161-162oC. Các phổ 1H-NMR và 13C-NMR của POS1 rất giống với phổ của POS2. Phổ 1H-NMR của POS1 xuất hiện các tín hiệu của 6 proton vòng thơm trong đó có hai proton được xác định ở vị trí meta với nhau [(δ 6,24 và 6,43; (1H, d, J=2,0 Hz)] và 4 proton còn lại được xác định thuộc vào một vòng thơm thế 2 lần ở vị trí para [δ 8,08 (2H, d, J=9,0 Hz); 6,91 (2H, d, J=9,0 Hz)]. Các dữ kiện phổ này cho phép dự đoán sự có mặt của cấu trúc khung flavonoit dạng kaempferol. Tương tự như POS2, trên phổ 1H-NMR xuất hiện các proton anome tại δH 5,14 (1H, d, J=7,5 Hz) và 4,53 (1H, d, J=1,5 Hz), một nhóm oximetilen tại δ 3,82 (1H, dd, J=11,0 và 1,5 Hz, Ha)/3,44 (1H, dd, J=11,0 và 6,0 Hz, Hb), và một nhóm metyl bậc hai tại δ 1,13 (3H, d, J=6,5 Hz) cho phép dự đoán sự có mặt của

đường β-D-glucopyranose và α-L-rhamnopyranose trong phân tử của POS1. Phổ 13C-NMR của POS1 cũng xuất hiện tín hiệu của 27 cacbon trong đó có 15 cacbon thuộc khung flavon và 12 cacbon thuộc vào hai phân tử đường tương tự như của POS3. Từ các phân tích trên có thể dự đoán 4 là kaempferol-3-O-rutinoside. Trên cơ sở đó, số liệu phổ 13C-NMR của POS1 được so sánh với giá trị tương ứng đã được công bố của hợp chất kaempferol 3-rutinoside [15]. Sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ 13C-NMR giữa hai hợp chất (Bảng 4.2) cùng với sự xuất hiện của pic [M-H]- tại m/z 593 trên phổ ESI-MS tương ứng với công thức phân tử C27H30O15 cho phép khẳng định cấu trúc hóa học của hợp chất POS1 là kaempferol-3-O-[α- L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside] hay kaempferol-3-O-rutinoside.

Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của POS1

a,b

H

C 161,50 135,51 179,43 163,02 100,01 166,09 94,94 158,58 105,68 122,77 132,37 116,16 159,47 116,16 132,37 104,58 75,75 78,15 71,46 77,23 68,59

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1” 2” 3” 4” 5” 6”

*C 161,49 135,51 179,43 163,01 99,96 166,02 94,91 158,56 105,68 122,76 132,37 116,13 159,44 116,13 132,37 104,58 75,76 78,15 71,46 77,22 68,57

DEPT C C C C CH C CH C C C CH CH C CH CH CH CH CH CH CH CH2

102,43 72,09 72,31 73,90 69,74 17,90

a,c (m, J=Hz) - - - - 6,24 (d, 2,0) - 6,43 (d, 2,0) - - - 8,08 (d, 9,0) 6,91 (d, 9,0) - 6,91 (d, 9,0) 8,08 (d, 9,0) 5,14 (d, 7,5) 3,44 (dd, 7,5; 9,0) 3,41 (t, 9,0) 3,27 (t, 9,0) 3,30 (m) 3,82 (dd, 1,5; 11,0) 3,44 (dd, 6,0; 11,0) 4,53 (d, 1,5) 3,64 (dd, 1,5; 3,5) 3,53 (dd, 3,5; 9,5) 3,30 (m) 3,46 (m) 1,14 (d, 6,5)

1’” 2’” 3’” 4’” 5’” 6’”

102,42 72,09 72,30 73,89 69,73 17,91

CH CH CH CH CH CH3

ađo trong metanol-d4, b125MHz, c500MHz, m: multiplicity, *C của kaempferol-3-O-rutinoside.

Hình 4.3. Phổ 1H-NMR của POS1

4.1.3. Indole-3-carbaldehyde (QDK1)

Một số tương tác HMBC (H→C) của QDK1

Chất QDK1 được phân lập dưới dạng tinh thể màu trắng, nóng chảy ở 180- 181oC. Trên phổ 1H-NMR của QDK1 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng dưới dạng singlet rất đặc trưng cho một proton thuộc nhóm andehit tại  9,90; 4 proton của một vòng benzen thế 1,2 [ 7,25 (1H, dt, J=1,0; 7,0 Hz); 7,29 (1H, dt, J=1,0; 7,0 Hz); 7,49 (1H, d, J=7,5 Hz) và 8,18 (1H, d, J=7,5 Hz)] và một proton olephin [ 8,11 (1H, s)]. Trên phổ 13C-NMR có tín hiệu của 9 cacbon trong đó cacbon của nhóm andehit xuất hiện tại  187,40. Phổ HSQC cho phép gắn kết các proton với cacbon tương ứng. Các tín hiệu tương tác trên phổ HMBC giữa H-5/C-7,C-9, H- 6/C-8, C-4, C-7, H-4/C-6, C-8, H-7/C-5, C-9, H-2/C-3, C-9 và C-8 cho phép thiết lập khung indol. Tương tác của proton nhóm –CHO ( 9,90) với C-3, C-9 cho biết nhóm –CHO gắn vào khung indol tại vị trí C-3. Từ các dữ liệu phổ trên xác định được cấu trúc của QDK1 là indole-3-carbaldehyde.

Bảng 4.3. Dữ kiện phổ của hợp chất QDK1

a,b

a,c

H

1 2

3.33 (s) 8.11 (s)

C 139.67

COSY

HSQC H-2/C-2

3 4 5

H-4/C-4 H-5/C-5

HMBC H-2/C-3, C-8, C-9, -CHO H-4/C-6, C-8 H-5/C-7, C-9

H-6/C-6

H-6/C-4, C-7, C-8

H-7/C-7

H-7/C-5, C-9

7 8 9 -CHO

- 8.17 (d, J= 7.5 Hz) 7.25 (dt, J= 1.0; 7.0 Hz) 7.29 (dt, J= 1.0; 7.0 Hz) 7.49 (d, J= 7.5 Hz) - - 9.90 (s)

120.13 122.38 H-4/H-5 123.61 H-5/H-6 H-5/H-4 124.99 H-6/H-7 H-6/H-5 113.12 H-7/H-6 138.94 125.72 187.40

H(-CHO)/-CHO H(-CHO)/C-3, C-9

ađo trong CDCl3, b125MHz, c500MHz.

4.1.4. 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl-β-carboline (POS3)

Chất POS3 nhận được dưới dạng tinh thể không màu, nóng chảy ở 186-

187oC. Phổ 1H-NMR của POS3 có tín hiệu cộng hưởng của 14 proton, trong đó có 4 proton thuộc một vòng thơm thế ở vị trí 1,2 [  6,98 (1H, td, J=1,0; 8,0 Hz); 7,05 (1H, td, J=1,0; 8,0 Hz); 7,28 (1H, br d, J=8,0 Hz); 7,40 (1H, br d; J=8,0 Hz)]; các proton còn lại thuộc về một nhóm metyl [ 2,54 (3H, s)] và 3 nhóm metylen [2,86 (2x2H, s); 3,68 (2H, s)].

Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của POS3

Phổ 13C-NMR và DEPT của POS3 có tín hiệu cộng hưởng của 12 cacbon trong đó có 1 nhóm metyl, 3 nhóm metylen, 4 nhóm metin vòng thơm và 4 cac bon bậc bốn.

Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của POS3

Để thiết lập bị trí gắn kết của các cacbon và proton trong phân tử chúng tôi đã tiến hành phân tích phổ HSQC và HMBC. Dạng khung 1,2,3,4-tetrahydro-β- carboline của POS3 được xác định thông qua các tương tác trên phổ HMBC của H-5/C-7, C-8a, C-4a; H-6/C-4b, C-8; H-7/C-5, C-8a; H-8/C-6, C-4b; H-1/N-9, C- 4a, C-3, N-CH3; H-3/C-1, C-4, C-4a, N-CH3; H-4/C-4a, C-4b, C-3. Nhóm metyl được xác định gắn vào khung ở nguyên tử N vị trí số 2 nhờ vào tương tác của các proton nhóm này với C-1 và C-3, C-9a.

Hình 4.6. Phổ HMBC của POS3

Một số tương tác trên phổ HMBC (H→C) của POS3

Phổ ACPI-MS của POS3 xuất hiện pic [M+H]+ tại m/z 203 suy ra công thức phân tử của POS3 là C12H14N2O. Phần khung 1,2,3,4-tetrahydro-2-methyl-β- carboline có công thức phân tử là C12H14N2, như vậy khối lượng phân tử còn dư 16 mu tương ứng với một nguyên tử O. Do đó, nguyên tử N ở vị trí số 9 phải gắn với một nhóm hydroxy (-OH). Các dữ liệu phổ đã phân tích cho phép xác định POS3 là 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl-β-carboline. Đây là lần đầu tiên chất này được phân lập từ các nguồn thiên nhiên. Trước đây, 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy- 2-methyl-β-carboline đã được tổng hợp dưới dạng chất trung gian trong quá trình tổng hợp toàn phần (±)-coerulescine [43].

Bảng 4.4. Dữ kiện phổ của hợp chất POS3

a,b

H

1 2

3.68 (s) -

C 53.19 -

a,c

HMBC H-1/C-9a, C-4a, C-3, N-CH3

3 4 4a 4b

2.86 (s) 2.86 (s) - -

54.12 22.19 107.60 128.27

H-3/C-1, C-4, C-4a, N-CH3 H-4/C-4a, C-4b, C-3, C-9a

7.40 (br d, J= 8.0 Hz)

118.46

H-5/C-4a, C-7, C-8a

6.98 (dt, J= 1,0; 8,0 Hz) 7.05 (dt, J= 1,0; 8.0 Hz) 7.28 (br d, J= 8,0 Hz) - - - 2.54 (s)

119.70 121.95 111.81 137.99 132.44 45.61

6 7 8 8a 9 9a -CH3

H-6/C-4b, C-8 H-7/C-5, C-8a H-8/C-6, C-4b H(-CH3)/ C-1, C-3, C-9a

ađo trong CDCl3, b125MHz, c500MHz

4.2. Các hợp chất đƣợc phân lập từ vỏ cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)

4.2.1. Ent-halima-1(10),13E-dien-15-oic acid (SP1)

Chất SP1 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 112-113oC. Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của một nhóm metyl dạng doublet tại  0,82 (3H, d, J= 7.0 Hz) cùng với 4 nhóm metyl

dạng singlet tại  0,84 (s); 0,89 (s); 0,91 (s) và 2,15 (s), hai proton dạng olephin xuất hiện tại  5,33 (1H, t, J=3,5 Hz) và  5,66 (1H, br s). Ngoài ra, trên phổ 1H- NMR còn xuất hiện tín hiệu của proton thuộc các nhóm metylen và metin trong vùng  1,11-2,05. Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT của SP1 cho thấy tín hiệu của 20 cacbon trong đó có hai nhóm metin dạng olephin tại δ 120,32 và 114,55; hai

nhóm metin tại  39,16 và 43,51, sáu nhóm metylen tương ứng với δ 23,12; 33,25; 23,63; 29,10; 37,20 và 36,29; năm nhóm metyl tại δ 15,65; 19,46; 22,29; 26,01;

28,23 cùng với ba cacbon bậc bốn tại  31,44; 141,18 và 164,91 và một nhóm cacboxyl tại δ 171,81. Phổ khối lượng APCI-MS xuất hiện pic 305 [M+H]+ (positive).

Qua các dữ liệu phổ trên có thể nhận định SP1 là một hợp chất axit thuộc lớp chất ditecpenoit và có khung ent-halimane có công thức phân tử là C20H32O2.

Từ các phân tích trên, số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của SP1 được so sánh với các giá trị tương ứng của đã được công bố của hợp chất ent-halima-1(10),13E- dien-15-oic acid [23]. Sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ giữa hai hợp chất (Bảng 4.5) cho phép khẳng định cấu trúc hóa học SP1 là ent-halima-1(10),13E- dien-15-oic acid.

Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của SP1

a,c

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

a,b C 120,32 23,12 33,25 31,44 43,51 23,63 29,10 39,16 43,0 141,18 37,20 36,29 164,91 114,55 171,81 19,46 15,65 28,23 26,01 22,29

a,c H 5,33 (t, 3,5) 5,66 (s) 2,15 (s) 0,82 (d, 6,5) 0,89 (s) 0,84 (s) 0,91 (s)

*C a,b 120,3 23,1 33,2 31,4 43,5 23,6 29,1 39,2 43,0 141,1 37,2 36,3 164,8 115,1 172,4 19,5 15,6 28,2 26,0 22,3

*H 5,33 (t, 3,8) 5,67 (s) 2,16 (s) 0,82 (d, 6,4) 0,89 (s) 0,84 (s) 0,91 (s)

ađo trong CDCl3, b125MHz, c500MHz, C, H của ent-halima-1(10),13E-dien-15-oic acid 4.2.2. β-Sitosterol (POS5)

Chất POS5 thu được dưới dạng tinh thể dạng phiến, màu trắng, nóng chảy ở 135-136oC. Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của một proton dạng olephin [δH 5,34 (1H, brd, J=5,0 Hz, H-6) và của 6 nhóm metyl trong đó có 2 nhóm cộng hưởng dưới dạng singlet [δH 0,68 (3H, s, H-18) và 1,00 (3H, s, H-19)] và 4 nhóm cộng hưởng dạng doublet [δH 0,81 (3H, d, J=7,0 Hz, H-27); 0,83 (3H, d,

J=7,0 Hz, H-26); 0,85 (3H, d, J=7,5 Hz, H-29); 0,92 (3H, d, J=6,5 Hz, H-21)]. Tín hiệu cộng hưởng của một nhóm hydroxymetin xuất hiện dưới dạng multiplet [δH 3,52 (1H, m, H-3)]. Ngoài ra còn có tín hiệu cộng hưởng của proton của các nhóm metin và metylen khác ở vùng trường cao [δH 1,04-2,31].

Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của POS5

#

a,b

H

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

C 37,7 32,3 72,2 42,8 141,2 122,1 32,1 32,3 50,6 36,9 21,5 40,2 42,8 57,2 24,7 28,7 56,5 12,4 19,8 36,6 19,2 34,4 26,5 46,2 29,6 20,2 19,5 23,5 12,3

a,c (dạng pic, J=Hz) 3,52 (m) 5,34 (m, H-6) 0,68 (3H, s) 1,00 (s) 0,92 (d, J= 6,5 Hz) 0,83 (d, J= 7,0 Hz) 0,81 (d, J= 7,0 Hz) 0,85 (d, J= 7,5 Hz)

DEPT CH2 CH2 CH CH2 C CH CH2 CH CH C CH2 CH2 C CH CH2 CH2 CH CH3 CH3 CH CH3 CH2 CH2 CH CH CH3 CH3 CH2 CH3

# của β-sitosterol

C 37,27 31,68 71,83 42,32 140,77 121,73 31,93 31,93 50,17 36,52 21,10 39,80 42,35 56,79 24,31 28,25 56,09 11,87 19,40 36,16 18,79 33,98 26,13 45,87 29,19 19,82 19,05 23,10 11,99 ađo trong CDCl3, b125MHz, c500MHz, C

Phổ 13C-NMR của POS5 có tín hiệu cộng hưởng của 29 nguyên tử cacbon bao gồm một liên kết đôi [δC 121,73 (C-6); 140,78 (C-5)], 6 nhóm metyl [δC 11,87 (C-18); 11,99 (C-29); 18,79 (C-21); 19,05 (C-27); 19,40 (C-19); 19,82 (C-26)], 8 nhóm metin, 11 nhóm metylen và 2 cacbon bậc bốn. Sự có mặt của một liên kết đôi, 2 nhóm metyl bậc 2 và 2 cacbon bậc bốn trong phân tử POS5 cho biết chất này có chứa khung steroit và được nhận định có thể là β-sitosterol.

Số liệu phổ 13C-NMR của POS5 được so sánh với các giá trị tương ứng đã được công bố của hợp chất β-sitosterol [26]. Sự phù hợp về số liệu phổ NMR giữa

hai hợp chất (Bảng 4.6) cho phép khẳng định cấu trúc của POS5 là β-sitosterol. β- sitosterol là chất sterol phổ biến nhất trong các loài thực vật bậc cao. Chất này không chỉ có mặt trong rất nhiều loài thực vật mà còn được tìm thấy ở cả các loài sinh vật biển.

POS5

4.2.3. β-Sitosterol glucoside (POS6)

POS6 được phân lập dưới dạng chất vô định hình màu trắng, nóng chảy ở 273-274oC. Khi chấm so sánh POS6 với chất chuẩn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng đã xác định được POS6 là sitosterol-3-O-β-D-glucoside.

4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất đƣợc phân lập

Rutin đã được biết đến từ lâu là chất có tác dụng làm tăng sự bền vững của hồng cầu, làm giãn cơ trơn, chống co thắt và có tác dụng hiệp đồng với vitamin C. Rutin có tác dụng làm bền thành mạch, tăng độ dẻo dai và đàn hồi mạch máu, đặc biệt là các tĩnh mạch và mao mạch nhỏ, ngăn ngừa các triệu chứng xuất huyết, tai biến về mạch như xuất huyết nội tạng, xuất huyết dưới da, da bần tím ban đỏ, cũng như ngăn ngừa giảm thiểu các chứng xuất huyết đối với người mắc bệnh sốt xuất huyết, và nó có khả năng ngăn ngừa chứng phình tĩnh mạch của hậu môn tạo ra đám rối tĩnh mạch (búi trĩ) gây lòi dom, chảy máu trong các bệnh trĩ nội, trĩ ngoại, đi ngoài dính máu. Rutin đã có mặt trong thành phần của một số thuốc điển hình như Rutin C, rutinsuperC…

Kaempferol-3-O-rutinoside đã được biết là chất có hoạt tính chống oxi hóa

mạnh.

Bên cạnh rutin (POS2) và kaempferol-3-O-rutinoside (POS1) đã được nghiên cứu nhiều về các hoạt tính sinh học thì một số chất đã phân lập còn chưa được nghiên cứu. Do đó, các chất này đã được đáng giá hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.

4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất đƣợc phân lập

Chất SP1 đã được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 7 dòng tế bào ung thư ở người gồm ung thư phổi (Lu-1), ung thư gan (HepG2), ung thư tiền liệt tuyến (LNCap), ung thư vú (MCF7), ung thư buồng trứng (SW626), ung thư đại tràng (SW480) và ung thư biểu mô miệng (KB). Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và dữ liệu.

Kết quả cho thấy SP1 thể hiện hoạt tính đối với tất cả 7 dòng tế bào ung thư nằm trong khoảng 13,93- thử nghiệm nhưng hoạt tính không mạnh, giá trị IC50 25,05 µg/ml. Trong 7 dòng tế bào thử nghiệm, SP1 có tác dụng tốt nhất đối với các dòng tế bào ung thư buồng trứng SW626.

Bảng 4.7. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của SP1

% Ức chế

Lu-1

HepG2

LNCap

MCF7

Nồng độ (µg/ml)

SP 1 Ellipticine SP 1 Ellipticine

80.14

92.80

98.30

90.22

91.35

89.53

88.75

86.23

100

58.40

78.73

53.23

71.74

63.28

70.68

75.14

50.64

20

13.83

56.70

27.08

50.77

12.51

59.67

53.54

10.50

4

3.39

10.47

4.89

10.90

2.03

11.23

22.32

3.72

0.8

19.74

0.50

16.16

0.51

16.35

0.54

0.44

25.05 % Ức chế

SW480

SW626

KB

IC50 Nồng độ (µg/ml)

SP 1

SP1

Ellipticine

88.54

92.65

88.47

92.85

98.35

99.77

100

53.35

78.04

58.45

78.38

49.35

76.43

20

16.09

51.19

26.88

57.19

1.86

40.58

4

7.21

17.53

6.03

18.83

0.87

12.78

0.8

21.18

0.48

13.93

0.41

19.95

0.57 IC50

Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Các kết quả trên là chính xác với r2 ≥ 0,99.

Các chất POS3 và QDK1 cũng được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 02 dòng tế bào ung thư biểu mô da (KB) và ung thư gan (Hep G2). Kết quả cho thấy cho thấy, chất QDK1 có hoạt tính đối với dòng tế bào KB (IC50 là 7,3 µg/ml) mạnh hơn so với dòng tế bào Hep G2 (IC50 31,29 µg/ml). POS3 thể hiện hoạt tính ở mức độ yếu trên cả 2 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với IC50 là 28,87 µg/ml và 76,23 µg/ml.

Bảng 4.8. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của POS3 và QDK1

STT Tên mẫu Giá trị IC50 (µg/ml)

KB Hep G2

1. POS3 28,87 76,23

2. QDK1 7,3 31,29

Ellipticine 0,31 0,40

4.3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất đƣợc phân lập

Các chất QDK1, SP1 và POS3 đã được đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên 04 chủng vi khuẩn, 02 chủng nấm mốc và 02 chủng nấm men. Kết quả cho thấy chỉ có chất QDK1 thể hiện hoạt tính kháng chủng nấm mốc A. niger với giá trị MIC là 50 µg/ml và POS3 thể hiện hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Gram (+) S. aureus với giá trị MIC là 50 µg/ml.

Bảng 4.9. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC µg/ml)

Kí hiệu mẫu

Nồng độ mẫu (µg/ml)

Vi khuẩn Gr(-)

Vi khuẩn Gr(+)

Nấm mốc

Nấm men

STT

E. coli

P. aeruginosa

B. subtilis

S. aureus

A. niger

F. oxysporum

S. cerevisiae

C. albicans

QĐK1

(-)

SP1

(-)

POS3

(-)

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận:

- Từ lá cây Quần đầu khỉ đã phân lập và xác định được cấu trúc của 04 hợp chất là rutin (POS2), kaempferol-3-O-rutinoside (POS1), indole-3-carbaldehyde (QDK1), 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl-β-carboline (POS3).

- Từ vỏ cây đã phân lập và xác định được cấu trúc của 03 hợp chất là Ent- halima-1(10),13E-dien-15-oic acid (SP1), β-sitosterol (POS5) và sitosterol-3-O-β- D-glucoside (POS6 ).

- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của chất SP1 trên 07 dòng tế bào ung thư ở người là Lu-1, HepG2, LNCap, MCF7, SW626, SW480 và KB. Kết quả cho thấy chất này có hoạt tính gây độc đối với cả 7 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 trong khoảng 13,93-25,05 µg/ml và có hoạt tính mạnh nhất đối với các dòng tế bào ung thư buồng trứng SW626.

- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của chất POS3 và QDK1 trên các dòng tế

bào KB, Hep G2.

- Các chất QDK1, SP1, POS1 và POS3 đã không thể hiện hoạt tính trên hầu hết các vi sinh vật kiểm định, chỉ có chất QDK1 có hoạt tính kháng chủng nấm mốc A. niger với giá trị MIC là 50 µg/ml và POS3 có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Gram (+) S. aureus với giá trị MIC là 50 µg/ml.

Kiến nghị:

- Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của các cặn chiết còn lại. - Nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính gây độc tế bào của chất SP1 và nghiên cứu

thêm các hoạt tính sinh học khác của SP1 cũng như của các chất đã phân lập. CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1. Đoàn Thị Hƣơng, Cao Thị Huệ, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Thị Minh Hằng, “Một số hợp chất được phân lập từ lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum Benth.&Hook.f.) ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 52(5A), 330-335 (2014).

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Tiến Bân (2000), Thực vật chí Việt Nam-Tập 1. Họ Na, NXB Khoa

học và Kỹ thuật, Hà Nội.

2 Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng-Tập 2, NXB Khoa học và

Kỹ thuật, Hà Nội.

3 Nguyễn Thị Chung, Lê Thị Thùy, Nguyễn Hoa Du, Trần Đình Thắng, Đỗ Ngọc Đài (2009), “Thành phần hóa học của tinh dầu lá cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia var. pendula Hort. ở Nghệ An”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Sinh thái và Tài nguyên sinh vật lần thứ 3-Viện ST&TNSV-Viện KH&CN Việt Nam.

4 Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam-Quyển 1, NXB Trẻ, Hà Nội. 5 Nguyễn Văn Hùng (2011), Họ Na (Annonaceae)-Hóa học và hoạt tính sinh học của các loài Desmos rostrata, Goniothalamus tamirensis, Fissistigma villosissium-Quyển 1, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội. 6 A. Jossang, M. Leboeuf, A. Cavé, M. Damak, and C. Riche (1977), Planta

Med., 32, pp. 249.

7 A. Jossang, M. Leboeuf, P. Cabalion, A. Cave (1983), “Alkaloids from Annonaceae. XLV: Alkaloids of Polyalthia nitidissima”, Planta Medica, 49(1), pp. 20-4.

8 A. Lannuzel, PP. Michel, G.U. Hoglinger, P. Champy, A. Jousset, F. Media, A. Lombes, F. Darios, C. Gleye, A. Laurens, R. Hocquemiller, E.C. Hirsch, and M. Ruberg (2003), Neuroscience, 121, pp. 287-289.

9 A. Monks, D. Scudiero, P. Skehan, R. Shoemake, K. Paull, D. Vistica, C. Hose, J. Langley, P. Cronise, H. Campbell, J. Mayo, M. Boyd. (1991), “Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines”, Journal of National Cancer Institute, 83(11), pp. 757-766.

10 A. R. de Arias, A. Inchausti, M. Ascurrat, N. Fleitas, E. Rodriguez, and A.

Fournet (1994), Phytother. Res, 8, pp. 141-144.

11 A. Suedee, I.O. Mondranondra, A. Kijjoa, M. Pinto, N. Nazareth, M.S.J. Nascimento, A.M.S. Silva, and W. Herz (2007), Pharm. Biol., 45, pp. 575- 577.

12 A. Touché, J.F. Desconclois, H. Jacquemin, Y. Lelièvre, and P. Forgacs

(1981), Planta Med. Phytoth., 15, pp. 4.

13 A. Villar, M. Mares, J.L. Rios, E. Canton, and M. Gobernado (1987),

Pharmaze., 42, pp. 248.

14 Ab. Ghani, Nurunajah, Ahmat, Norizan, Ismail, Nor Hadiani, Zakaria, Ishak (2011), “Flavonoid constituents from the stem bark of Polyalthia cauliflora

var. cauliflora”, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 5(8), pp. 154-158.

15 Assem El-Shazly and Michael Wink (2003), “Tetrahydroisoquinoline and β- (Cav.) Bunge from Haloxylon articulatum alkaloids

carboline (Chenopodiaceae)”, Z. Naturforsch., 58c, pp. 477- 480.

16 By Hao, Xiao-Jiang, Yang, Xiao-Sheng, Zhang, Zheng, Shang, Li-Jian (1995), “Clerodane diterpenes from Polyalthia cheliensis“, Phytochemistry, 39(2), pp. 447-8.

17 C.C. Liaw, F.R. Chang, S.L. Chen, C.C. Wu, K.H. Lee, and Y.C. Wu (2005),

Bioorg. Med. Chem., 13, pp. 4767.

18 C.Y. Kwan and F.I. Achike (2002), Acta Pharmacol. Sin., 23, pp. 1057-1060. 19 Connolly, D. Joseph, Haque, Enamul, A.A. Kadir (1996), “Two 7,7’- bisdehydroaporphine alkaloids from Polyalthi abullata”, Phytochemistry, 43(1), pp. 295-297.

20 D. A. Scudiero, R. H. Shoemaker, K. D. Paull, A. Monks, S. Tierney, T. H. Nofziger, M. J. Currens, D. Seniff, M. R. Boyd. (1988)., “Evaluation of a soluble Tetrazolium/Formazan assay for cell growth and drug sensivity in culture using human and other tumor cell lines”, Cancer Research, 48, pp. 4827-4833.

21 D. Chavez and R. Mata (1999), Phytochemistry, 50, pp. 823. 22 D.A. Shoskes, S.I. Zeitlin, A. Shahed, and J. Rajfer (1999), Urology, 54, pp.

960-963.

23 Dai do N, Thang TD, Ogunwande IA. (2014), “Chemical composition of essential oils from the leaves and stem barks of Vietnamese species of Polyalthia harmandii, Polyalthia jucunda and Polyalthia thorelii”, Nat Prod Res., 28(8), pp. 555-632.

24 F. Chang, J. Wei, C. Teng, and Y. Wu (1998), Phytochemistry, 49, pp. 2015-

2017.

25 F.Q. Alali, X.X. Liu, and J.L. McLaughlin (1999), “Annonaceous Acetogenins: Recent progress”, Journal of Natural Products, 62, pp. 504- 540.

26 Firouz Matloubi Moghaddam, Mahdi Moridi Farimani, Sabah Salahvarzi, and Gholamreza Amin (2007), “Chemical Constituents of Dichloromethane Extract of Cultivated Satureja khuzistanica”, Evid Based Complement Alternat Med., 4(1), pp. 95-98.

27 Gonzalez, M. Carmen, Sentandreu, Miguel Angel, Rao, K. Sundar, Zafra- Polo, M. Carmen, Cortes, Diego (1996), “Prenylated benzopyran derivatives from two Polyalthia species”, Phytochemistry, 43(6), pp. 1361- 1364.

28 Gonzalez, M. Carmen, Zafra-Polo, M. Carmen, M. Blazquez, Amparo, Serrano, Angel, Cortes, Diego (1997), “Cerasodine and Cerasonine: New

Oxoprotoberberine Alkaloids from Polyalthia cerasoides”, Journal of Natural Products, 60(2), pp. 108-110.

29 H. Guinaudeau, A. Ramahatra, M. Leboeue, A. Cave (1978), “Annonaceae alkaloids. XXII. Alkaloids from Polyalthia oligosperma (Danguy) Diels and Polyalthia emarginata Diels”, Plantes Medicinales et Phytotherapie, 12(3), pp. 166-72.

30 H. Haraguchi, Y. Mochida, S. Sakai, H. Masuda, and Y. Tamura (1996),

Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, pp. 945-947.

31 H. J. Choi, J. H. Song, K.S. Park, and D.H. Kwon (2009), Eur. J. Pharm.

Sci., 37, pp. 329-332.

32 Hamonniere, Michele, M. Leboeuf, Michel, A. Cave, Andre (1977), “Alkaloids from Annonaceae. Part 15. Aporphine alkaloids and terpenoid compounds from Polyalthia oliveri”, Phytochemistry (Elsevier), 16(7), pp. 1029-34.

33 Hocquemiller, Reynald, Dubois, Genevieve, M. Leboeuf, Michel, A. Cave, Andre, Kunesch, Nicole, Riche, Claude, Chiaroni, Angele (1981), “Alkaloids of the Annonaceae. Part XXXI. Polyveoline, a new indolosesquiterpene isolated from Polyalthia suaveolens, Annonaceae”, Tetrahedron Letters, 22(50), pp. 5057-60.

34 J.Q. Gu, S. Ikuyama, P. Wei, B. Fan, J. Oyama, T. Inoguchi, and J.

Nishimura (2008), Am. J. Physiol. Endocrinol. Meta.b, 295, pp. 390-394.

35 K. Iwasa, M. Moriyasu, T. Yamori, T. Turuo, D.U. Lee, and W. Eiegrebe

(2001), J. Nat. Prod., 64, pp. 896-901.

36 Kanchanapoom, Tripetch, Sommit, Jarunee, Kasai, Ryoji, Otsuka, Hideaki, Yamasaki, Kazuo (2002), “Chemical constituents of Thai medicinal plant, Polyalthia cerasoides”, Natural Medicines, 56(6), pp. 268-271.

37 Kanokmedhakul, Somdej, Kanokmedhakul, Kwanjai, Lekphrom, Ratsami (2007), “Bioactive Constituents of the Roots of Polyalthia cerasoides”, Journal of Natural Products, 70(9), pp. 1536-1538.

38 Kanokmedhakul,

Somdej, Kanokmedhakul, Kwanjai, Yodbuddee, Daungrudee, Phonkerd, Nutchanat (2003), “New Antimalarial Bis- dehydroaporphine Alkaloids from Polyalthia debilis”, Journal of Natural Products, 66(5), pp. 616-619.

39 L. B. S. Kardono, C. K. Angerhofer, S. Tsauri, K. Padmawinata, J. M. Pezzuto, A. D. Kinghorn (1991), “Cytotoxic and antimalarial constituents of the roots of Eurycoma longifolia”, J. Nat. Prod., 54(5), pp. 1360-1367.

40 Lavault, Marie, Guinaudeau, Helene, Bruneton, Jean, Sevenet, Thierry, Hadi, A. Hamid (1990), “(-)-Thaipetaline, a tetrahydroprotoberberine from Malaysian Annonaceae”, Phytochemistry, 29(12), pp. 3845.

41 M. C. Alley, D. A. scudiero, A. Monks, M. L. Hursey, M. J. Czerwinski, D. L. Fine, B. J. Abbott, J. G. Mayo, R. H. Shoemaker, M. R. Boyd. (1998).,

“Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay”. Cancer Research., No. 48, pp. 589-601. 42 M. Cuendet, C.P. Oteham, R.C. Moon, W.J. Keller, P.A. Peaden, and J.M

(2008), Pezzuto, Pharm. Biol., 46, pp. 3-9.

43 M. Somei, K. Noguchi, R. Ymagami, Y. Kawada, K. Yamada, and F. Yamada (2000), “Preparation and a novel rearrangement reaction of 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-β-carboline, and their applications for thetotal synthesis of (±)-coerulescine”, Heterocycles, 53(1), pp. 7-10.

44 M.A. Devia and N.P. Das (1993), Cancer Lett., 69, pp. 191-193. 45 M.A. Medeiros, X.P. Nunes, J.M. Barbosa-Filho, V.S. Lemos, J.F.Pinho, D. Roman-Campos, I.A. Medeiros, D.A. Araújo, and J.S. Cruz (2009), Naunyn Schmie-deberg’s Arch, 379, pp. 115-119.

46 M.C. Zafra-Polo, M.C. Gonzales, E. Estornell, S. Sahpaz, and D. Cortes

(1996), Phytochemistry, 42, pp. 252-255.

47 Noriyuki Hara, Hitomi Asaki, Yoshinori Fujimoto, Yogesh Kumar Gupta, Ashish Kumar Singh and Mahendra Sahai (1995), “Clerodane and ent- halimane diterpenes from polyalthia longifolia”, Phytochemistry, 38(1), pp. 189-194.

48 P. Tuchinda, M. Pohmakotr, B. Munyoo, V. Reutrakul, T. Santisuk (2000), “An azaanthracene alkaloid from Polyalthia suberosa”, Phytochemistry, 53(8), pp. 1079-82.

49 Panthama, Natcha, Kanokmedhakul, Somdej, Kanokmedhakul, Kwanjai (2010) ,“Polyacetylenes from the Roots of Polyalthi adebilis”, Journal of Natural Products, 73(8), pp. 1366-1369.

50 Patoomratana Tuchinda, Bamroong Munyoo, Manat Pohmakotr, Pongchan Thinapong, Samaisukh Sophasan, Thawatchai Santisuk, and Vichai Reutrakul (2006), “Cytotoxic Styryl-Lactones from the Leaves and Twigs of Polyalthia crassa”, Journal Nat. Prod., 69, pp. 1728-1733.

51 Prateek Dixit, Tripti Mishra, Mahesh Pal, T. S. Rana and D. K. Upreti (2014), “Polyalthia longifolia and its pharmacological activities: review”, International Journal of Scientific and Innovative Research, 2(1), pp. 17- 25.

52 Pumsalid, Kanchana, Thaisuchat, Haruthai, Loetchutinat, Chatchanok, Nuntasaen, Narong, Meepowpan, Puttinan, Pompimon, Wilart (2010), “A new azafluorenone from the roots of Polyalthia cerasoides and its biological activity”, Natural Product Communications, 5(12), pp. 1931-1934. 53 Q.S. Zheng, X.L. Sun, B. Xu, G. Li, and M. Song (2005), Biomed. Environ.

Sci., 18, pp. 65-67.

54 R. H. Shoemaker, D. A. Scudiero, E. A (2002). “Suasville Application of to anticancer drug screening

high-throughput, molecular-targeted discovery”, Curr. Top. Med. Chem., 3(2), pp. 229-246.

55 Richomme, Pascal, Godet, Marie Chantal, Foussard, Francoise, Toupet, Loic, Sevenet, Thierry, Bruneton, Jean (1991), “A novel leishmanicidal labdane from Polyalthia macropoda”, Planta Medica, 57(6), pp. 552.

56 S. F. Kouam, A. W. Ngouonpe, M. Lamshoft, F.M. Talontsi, J.O. Bauer, C. Strohmann, B.T. Ngadjui, H. Laatsch, M. Spiteller (2014), “Indolosesquiterpene alkaloids from the Cameroonian medicinal plant Polyalthia oliveri (Annonaceae)”, Phytochemistry (Elsevier), 105, pp. 52- 59.

57 S. Prachayasittikul, P. Manam, M. Chinworrungsee, C. Isarankura-Na- (2009), “Bioactive Ayudhya, S. Ruchirawat, V. Prachayasittikul Azafluorenone Alkaloids from Polyalthia debilis (Pierre) Finet & Gagnep”, Molecules, 14(11), pp. 4414-4424.

58 Selina Kabir, Mohammad. S.Rahman, A. M. Sarwaruddin Chowdhury, C. M. Hasan and M. A. Rashid (2010), “An unusual bisnor-clerodane diterpenoid from Polyalthia simiarum”, Natural product communications, 5(10), pp. 1543-1546.

59 Valentin, F. Benoit-Vical, C. Moulis, E. Stanislas, M. Mallié, I. Fouraste, and J. Bastide (1997), Antimicrob. Agents Chemother, 41, pp. 235-237. 60 X. Ma, I.S. Lee, H.B. Chai; K. Zaw, N.R. Farnsworth, D.D. Soejarto, G.A. Cordell, J.M. Pezzuto, A.D. Kinghorn (1994), “Cytotoxic clerodane diterpenes from Polyalthia barnesii”, Phytochemistry, 37(6), pp. 1659-62.

61 Xiu-Feng He, Xiao-Ning Wang,Cheng-Qi Fan, Li-She Gan, Sheng Yin, and Jian-Min Yue (2007), “Chemical constituents of Polyalthia nemoralis”, Helvetica Chimica Acta, 90, pp. 783-791.

62 Y . P . Lue, Q . Mu, H . L. Zheng and C. M. Li (1998), “24-methylen e tetracy clic triterpenes from Polyalthia lancilimba”, Phytochemistry, 49(7), pp. 2053-2056.

63 Y. Caia, Q. Luob, M. Sunc, and H. Corkea (2004), Life Sci., 74, pp. 2157. 64 Zi-Ming Lu, Qing-Jian Zhang, Ruo-Yun Chen and De-Quan Yu (2008), “ Four new alkaloids from Polyalthia nemoralis (Annonaceae)”, Journal of Asian Natural Products Research, 10(7), pp. 656-664.

PHỤ LỤC PHỔ NMR, COSY, HMBC, HSQC, MS

Phụ lục 1-1. Phổ 1H-NMR của Rutin (Quercetin-3-O-rutinoside)

Phụ lục 1-2. Phổ 13C-NMR và DEPT của Rutin (Quercetin-3-O-rutinoside)

Phụ lục 1-3. Phổ HMBC của Rutin (Quercetin-3-O-rutinoside)

[M+Na] +

Phụ lục 1-4. Phổ HSQC của Rutin (Quercetin-3-O-rutinoside)

Phụ lục 1-5. Phổ MS của Rutin (Quercetin-3-O-rutinoside)

Phụ lục 1-6. Phổ 1H-NMR của Kaempferol-3-O-rutinoside

[ M - H ] -

Phụ lục 1-7. Phổ 13C-NMR của Kaempferol-3-O-rutinoside

Phụ lục 1-8. Phổ ESI-MS negative của Kaempferol-3-O-rutinoside

Phụ lục 1-9. Phổ 1H-NMR của Indole-3-carbaldehyde

Phụ lục 1-10. Phổ 13C-NMR của Indole-3-carbaldehyde

Phụ lục 1-11. Phổ COSY của Indole-3-carbaldehyde

Phụ lục 1-12. Phổ HSQC của Indole-3-carbaldehyde

Phụ lục 1-13. Phổ HMBC của Indole-3-carbaldehyde

Phụ lục 1-1. Phổ 1H-NMR của Rutin (Quercetin-3-O-rutinoside) Phụ lục 1-1. Phổ 1H-NMR của Rutin (Quercetin-3-O-rutinoside) Phụ lục 1-1. Phổ 1H-NMR của Rutin (Quercetin-3-O-rutinoside) Phụ lục 1-1. Phổ 1H-NMR của Rutin (Quercetin-3-O-rutinoside) Phụ lục 1-14. Phổ 1H-NMR của 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl-β- carboline

Phụ lục 1-15. Phổ 13C-NMR của 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl-β- carboline

Phụ lục 1-16. Phổ HMBC của 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl-β-carboline

Phụ lục 1-17. Phổ HSQC của 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl-β-carboline

Phụ lục 1-18. Phổ APCI-MS positive của 1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl- β-carboline

Phụ lục 1-19. Phổ 13H-NMR của Ent-halima-1(10),13E-dien-15-oic acid

Phụ lục 1-20. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của Ent-halima-1(10),13E-dien-15-oic acid

Phụ lục 1-21. Phổ APCI-MS positive của Ent-halima-1(10),13E-dien-15-oic acid

Phụ lục 1-22. Phổ 1H-NMR của β-sitosterol

Phụ lục 1-23. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của β-sitosterol

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Quần Đầu khỉ (Polyalthia simiarum benth. & Hook. F.)

LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Minh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƢƠNG 3 - THỰC NGHIỆM 3.1. Tách chiết, phân lập các chất từ lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)

Cặn alkaloit (PSA) (1,3 g) CC, silica gel, CH2Cl2/MeOH (0→20% MeOH) A3 30 mg Sephadex LH-20 dung môi MeOH A3.2 9.8 mg

Cặn etyl axetat (PSE) (10,0 g)

POS5 2,2 g

QDK1 9,8 mg

Cặn metanol (PSM) (13,0 g)

POS1 35 mg

POS2 20 mg

CHƢƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

a,b

#C 158,52 135,62 179,44 162,98 99,95 166,01 94,87 159,35 105,66 123,15 117,69 145,84 149,81 116,06 123,55 104,69 75,74 78,20 71,42 77,25 68,56

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1” 2” 3” 4” 5” 6”

DEPT C C C C CH C CH C C C CH C C CH CH CH CH CH CH CH CH2

a,b

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1” 2” 3” 4” 5” 6”

*C 161,49 135,51 179,43 163,01 99,96 166,02 94,91 158,56 105,68 122,76 132,37 116,13 159,44 116,13 132,37 104,58 75,76 78,15 71,46 77,22 68,57

DEPT C C C C CH C CH C C C CH CH C CH CH CH CH CH CH CH CH2

a,b

a,c

1 2

COSY

HSQC H-2/C-2

HMBC H-2/C-3, C-8, C-9, -CHO H-4/C-6, C-8 H-5/C-7, C-9

a,b

HMBC H-1/C-9a, C-4a, C-3, N-CH3

a,c

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

a,b C 120,32 23,12 33,25 31,44 43,51 23,63 29,10 39,16 43,0 141,18 37,20 36,29 164,91 114,55 171,81 19,46 15,65 28,23 26,01 22,29

a,c H 5,33 (t, 3,5) 5,66 (s) 2,15 (s) 0,82 (d, 6,5) 0,89 (s) 0,84 (s) 0,91 (s)

*C a,b 120,3 23,1 33,2 31,4 43,5 23,6 29,1 39,2 43,0 141,1 37,2 36,3 164,8 115,1 172,4 19,5 15,6 28,2 26,0 22,3

*H 5,33 (t, 3,8) 5,67 (s) 2,16 (s) 0,82 (d, 6,4) 0,89 (s) 0,84 (s) 0,91 (s)

ađo trong CDCl3, b125MHz, c500MHz, *C, *H của ent-halima-1(10),13E-dien-15-oic acid 4.2.2. β-Sitosterol (POS5)

#

a,b

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

a,c (dạng pic, J=Hz) 3,52 (m) 5,34 (m, H-6) 0,68 (3H, s) 1,00 (s) 0,92 (d, J= 6,5 Hz) 0,83 (d, J= 7,0 Hz) 0,81 (d, J= 7,0 Hz) 0,85 (d, J= 7,5 Hz)

DEPT CH2 CH2 CH CH2 C CH CH2 CH CH C CH2 CH2 C CH CH2 CH2 CH CH3 CH3 CH CH3 CH2 CH2 CH CH CH3 CH3 CH2 CH3

% Ức chế

Lu-1

HepG2

LNCap

MCF7

Nồng độ (µg/ml)

SP 1 Ellipticine SP 1 Ellipticine

SP 1 Ellipticine SP 1 Ellipticine

100

20

4

0.8

19.74

0.50

16.16

0.51

16.35

0.54

0.44

25.05

% Ức chế

SW480

SW626

KB

IC50 Nồng độ (µg/ml)

SP 1

SP 1

SP1

Ellipticine

Ellipticine

Ellipticine

100

20

4

0.8

ađo trong CDCl3, b125MHz, c500MHz, C, H của ent-halima-1(10),13E-dien-15-oic acid 4.2.2. β-Sitosterol (POS5)