Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch kháng ung thư phổi của exosome tế bào tua máu dây rốn trữ đông

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

------------------------------------------

Lê Thị Huyền

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH

KHÁNG UNG THƢ PHỔI CỦA EXOSOME

TẾ BÀO TUA MÁU DÂY RỐN TRỮ ĐÔNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội, tháng 12 năm 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

------------------------------------------

Lê Thị Huyền

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH

KHÁNG UNG THƢ PHỔI CỦA EXOSOME

TẾ BÀO TUA MÁU DÂY RỐN TRỮ ĐÔNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Mã số: 8420101.4

Chuyên ngành: sinh học thực nghiệm

Cán bộ hƣớng dẫn:

TS. Nguyễn Xuân Hƣng

PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Đại học Quốc gia Hà Nội đã tài trợ

kinh phí cho đề tài với mã số QG.18.09 để đề tài được thực hiện và tiến hành đúng

tiến độ.

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Hưng và PGS. TS.

Hoàng Th Mỹ Nhung người hướng dẫn trực tiếp của tôi đã giúp tôi rất nhiều

trong quá trình hoàn thành nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn hai người

hướng dẫn đã tận tình giúp đỡ tôi trong đ nh hướng nghiên cứu, giải đáp thắc mắc,

khó khăn đồng thời chỉ dạy tôi những bài học quý giá. Nếu không có sự hướng

dẫn và giúp đỡ này, luận văn này của tôi sẽ không được hoàn thành một cách trọn

vẹn.

Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. BS. Nguyễn Thanh Liêm - Viện trưởng

Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec, ThS. Bùi Việt Anh –

Trưởng nhóm Liệu pháp miễn d ch - Trung tâm công nghệ cao - Bệnh viện Đa

khoa quốc tế Vinmec đã tạo điều kiện cho tôi có cơ hội được thực tập tại phòng thí

nghiệm hiện đại bậc nhất Việt Nam được tiếp cận với những kỹ thuật, trang thiết

b tiên tiến.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Trần Th Tuyết Trinh, ThS.

Chu Th Thảo, TS. Thân Th Trang Uyên, ThS. Nguyễn Văn Phòng ThS.

Nguyễn Đắc Tú, CN. Hoàng Hương Diễm, CN. Trần Trung Nghĩa CN Bùi Th

Hồng Huế CN. Đỗ Th Hoài Thu, CN. Phạm Th Cường và những cán bộ của

Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec đã hỗ trợ nhiệt tình cho

tôi trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.

Bên cạnh đó tôi gửi lời cảm ơn tới ThS. Bùi Th Vân Khánh cùng các bạn,

anh, ch tại phòng thí nghiệm Ung thư thực nghiệm – Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội vì sự giúp đỡ và khuyến khích tôi trong suốt

thời gian làm việc cùng nhau.

Ngoài ra, tôi xin cảm ơn trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học

Quốc gia Hà Nội nơi đã cho tôi không chỉ kiến thức về Sinh học mà còn có một

tầm nhìn mới về nhận thức Khoa học sự sống và các thầy cô bộ môn Sinh học Tế

bào, những

người kiên nhẫn dạy cho tôi kiến thức cơ bản cũng như truyền đạt cho tôi những

kinh nghiệm, giúp tôi có thể trở thành một nhà khoa học thực sự.

Cuối cùng, tôi gửi lời biết ơn chân thành nhất tới gia đình và bạn bè thân

yêu đã tin tưởng, cho tôi nguồn động lực dồi dào thúc đẩy tôi vượt qua mọi khó,

thử thách.

Hà Nội, tháng 12 năm 2019

Học viên

Lê Th Huyền

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ đầy đủ Từ Tiếng Việt

BSA Bovine serum albumin Albumin từ huyết thanh bê

BCA Bicinchoninic acid Axit bicinchoninic

CBMC Cord blood mononuclear cell Tế bào đơn nhân máu cuống rốn

CD Cluster of differeniation Cụm biệt hóa

Carboxyfluorescein succinimidyl CFSE Thuốc nhuộm huỳnh quang ester

CTL Cytotoxic T lymphocyte Tế bào T gây độc

DC Dendritic cell Tế bào tua

Dex Dexosome Exosome tiết từ tế bào tua

Endosomal sorting complex Phức hệ vận chuyển được ESCRT required for transport yêu cầu

Cục Quản lý Thực phẩm và FDA Food and Drug Administration Dược phẩm Hoa Kỳ

Granulocyte-macrophage colony- Yếu tố kích thích tạo cụm GM-CSF stimulating factor dòng hạt-mono

iDC Immature dendritic cell Tế bào tua chưa trưởng thành

Các chồi mọc phía bên trong ILVs Intraluminal vesicels Endosome

IL Interleukin Interleukin

mDC Mature dendritic cell Tế bào tua trưởng thành

MDSCs Myeloid-derived suppressor cells Tế bào ức chế có nguồn gốc tủy xương

moDC Monocyte-derived Dendritic cell Tế bào tua có nguồn gốc từ tế bào mono

Major Histocompatibility Phức hệ phù hợp tổ chức MHC Complex chính

MNC Mononuclear cell Tế bào đơn nhân

Multivesicular bodies Thể đa bào MVBs

Natural killer Tế bào giết tự nhiên NK

Ung thư phổi không tế bào NSCLC Non small cell lung cancer nhỏ

Optical density Mật độ quang OD

Performance status Thể trạng bệnh nhân PS

SCLC Small cell lung cancer Ung thư phổi tế bào nhỏ

Transporter associated with Bộ máy vận chuyển kháng TAP antigen processing nguyên đặc hiệu

T helps Tế bào T bổ trợ Th

TNF - α Tumor necrosis factor alpha Yếu tố hoại tử khối u alpha

Treg Regulatory T cells Tế bào T điều hòa

Thuốc nhuộm huỳnh quang 7AAD 7-amino-actinomycin D 7ADD

MỤC LỤC

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ....................................................................................... 3

1.1. Thực trạng ung thƣ phổi .............................................................................................. 3

1.1.1. Thực trạng ung thư phổi............................................................................................ 3

1.1.2. Đáp ứng miễn d ch trong ung thư phổi ..................................................................... 4

1.1.3. Các phương pháp điều tr ung thư phổi .................................................................... 7

a) Điều tr đích .................................................................................................................... 7

b) Liệu pháp miễn d ch ....................................................................................................... 8

1.2. Tế bào tua ...................................................................................................................... 9

1.2.1. Đ nh nghĩa tế bào tua .................................................................................................... 9

1.2.2. Con đường trình diện kháng nguyên của tế bào tua ................................................... 11

1.2.3. Cơ chế biệt hóa tế bào tua in vitro .............................................................................. 12

1.3. Exosome ....................................................................................................................... 14

1.3.1. Đ nh nghĩa Exosome ................................................................................................... 14

1.3.2. Cơ chế hình thành Exosome ....................................................................................... 15

a) Cơ chế hình thành Exosome phụ thuộc ESCRT ........................................................... 16

b) Cơ chế hình thành Exosome không phụ thuộc ESCRT ................................................ 17

1.3.3. Chức năng trình diện kháng nguyên của Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua ......... 18

a) Khả năng trình diện kháng nguyên lớp MHC-I của Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua ...................................................................................................................................... 18

b) Khả năng trình diện kháng nguyên lớp MHC-II của Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua ...................................................................................................................................... 19

1.4. Ứng dụng của tế bào tua và Exosome trong điều trị ung thƣ ................................. 21

1.4.1. Ứng dụng tế bào tua trong điều tr ung thư tại Việt Nam ........................................... 21

1.4.2. Ứng dụng Exosome trong điều tr ung thư ................................................................. 22

1.5. Máu cuống rốn trữ đông – nguồn cung cấp tế bào mono........................................ 24

Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................26

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................................. 26

2.2. Hóa chất và thiết bị ..................................................................................................... 28

2.2.1. Hóa chất ...................................................................................................................... 28

2.2.2. Thiết b ........................................................................................................................ 29

2.2.3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao .......................................................................................... 30

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 31

2.3.1. Nuôi cấy dòng tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi A549 ..................................... 31

2.3.2. Tách chiết và xác đ nh nồng độ protein tổng số từ dòng tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi A549 ..................................................................................................................... 31

2.3.3. Rã đông máu cuống rốn trữ đông ............................................................................... 33

2.3.4. Phân lập tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn trữ đông ................................................ 33

2.3.5. Nuôi cấy, biệt hóa và trưởng thành tế bào đơn nhân thành tế bào tua ........................ 34

2.3.6. Thu hoạch tế bào tua DC và môi trường nuôi cấy tế bào tua DC ............................... 35

a) Thu hoạch môi trường nuôi cấy tế bào tua DC ............................................................. 35

b) Thu hoạch tế bào tua ..................................................................................................... 35

2.3.7. Thu nhận Exosome từ môi trường nuôi cấy tế bào tua máu cuống rốn trữ đông ....... 36

2.3.8. Phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi ....................................... 36

a) Phân lập tế bào đơn nhân máu ngoại vi ........................................................................ 36

b) Phân lập tế bào Lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi ....................................... 37

2.3.9. Đánh giá ảnh hưởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trưởng của tế bào lympho T ............................................................................................................................................ 38

2.3.10. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi A549 của tế bào lympho T đã cảm ứng ........................................................................................................... 40

2.3.11. Phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy ......................................................... 41

2.3.12. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 42

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................43

3.1. Kết quả thu nhận protein tổng số từ dòng tế bào ung thƣ A549 ............................ 43

3.2. Rã đông máu cuống rốn trữ đông ............................................................................. 44

3.3. Phân lập tế bào mono từ máu cuống rốn trữ đông .................................................. 44

3.4. Kết quả biệt hóa tế bào mono thành tế bào DC ....................................................... 47

3.4.1. Hình thái tế bào ........................................................................................................... 47

3.4.2. Các dấu ấn bề mặt tế bào ............................................................................................ 49

3.5. Kết quả phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi .................... 52

3.6. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trƣởng của tế bào lympho T ........................................................................................................................... 53

3.7. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thƣ biểu mô phế nang phổi A549 của tế bào lympho T đã cảm ứng ........................................................................................... 56

Chƣơng 4 - KẾT LUẬN.........................................................................................59

Chƣơng 5 - KIẾN NGHỊ .......................................................................................60

Chƣơng 6 – TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................61

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cơ chế ung thư phổi thoát khỏi giám sát miễn d ch [29] .......................... 4

Hình 1.2: Vai trò của PD1 và CTLA-4 trong đáp ứng miễn d ch kháng khối u. ...... 7

Hình 1.3: Các phương pháp điều tr ung thư phổi ..................................................... 8

Hình 1.4: Sự hình thành các quần thể tế bào tua [69] ..............................................10

Hình 1.5: Con đường trình diện kháng nguyên của tế bào tua ................................12

Hình 1.6 : GM-CFS điều hòa sự phát triển của DC qua các tín hiệu phân từ khác

nhau [86] ..................................................................................................................13

Hình 1.7: Qúa trình giải phóng Exosome từ thể đa bào MVEs [24] .......................15

Hình 1.8: Cơ chế hình thành Exosome theo con đường phụ thuộc ESCRT [30] ....17

Hình 1.9: Con đường trình diện kháng nguyên của Exosome từ tế bào tua [47] ....21

Hình 2.1: Mẫu máu cuống rốn trữ đông tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec ..26

Hình 2.2: Bản tự nguyện chấp thuận tham gia hiến tặng mẫu sinh học tại Bệnh

viện Đa khoa Quốc tế Vinmec .................................................................................27

Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm .................................................................................31

Hình 2.4: Máu cuống rỗn trữ đông chia làm 4 phần sau ly tâm với Ficoll ..............34

Hình 2.4: Máu ngoại chia làm 4 phần sau ly tâm với Ficoll....................................37

Hình 3.1: Tế bào trên buồng đếm hồng cầu khi nhuộm với thuốc nhuộm Turck ...45

Hình 3.2: Tế bào đơn nhân trước và sau khi loa bỏ tế bào trôi nổi sau 2 giờ nuôi

cấy ............................................................................................................................46

Hình 3.3: Quần thể tế bào trước và sau khi phân lập tế bào mono ..........................47

Hình 3.4: Hình thái tế bào mono biệt hóa thành tế bào DC.....................................49

Hình 3.5: Phân tích theo phương pháp dòng chảy tế bào các dấu ấn bề mặt tế bào

vào ngày D1, D6 và D7 ............................................................................................50

Hình 3.6: Tỷ lệ trung bình các dấu ấn bề mặt. .........................................................52

Hình 3.8: Sự tăng sinh tế bào lympho T CD3+ khi nhuộm CSFE. .........................54

Hình 3.9: Hoạt tính gây độc lên tế bào A54 của tế bào Lympho T. ........................57

Hình 3.10: Tỷ lệ hoạt tính gây độc tế bào (mẫu 1) ..................................................58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Một số thử nghiệm về biệt hóa tế bào tua với các tổ hợp cytokine khác

nhau ..........................................................................................................................14

Bảng 1.2: So sánh tiềm năng liệu pháp miễn d ch dựa trên DC và Dex .................22

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ..........................................................28

Bảng 2.1: Thiết b sử dụng trong thí nghiệm ...........................................................29

Bảng 2.2: Dụng cụ và vật tư sử dụng trong thí nghiệm ...........................................30

Bảng 2.3: Chuẩn b mẫu chuẩn dung d ch protein ...................................................32

Bảng 2.5: Thiết kế thí nghiệm tế bào Lympho T cảm ứng với DC và Exosome ....39

trên đĩa 12 giếng .......................................................................................................39

Bảng 2.6: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng gây độc tế bào A549 của ..........40

tế bào Lympho T ......................................................................................................40

Bảng 2.7: Kháng thể sử dụng trong phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy

..................................................................................................................................41

Bảng 3.1: Số lượng MNC thu được từ máu cuống rỗn trữ đông .............................45

Bảng 3.2: Hiệu suất phân lập tế bào mono ..............................................................47

Bảng 3.3: Giá tr trung bình các dấu ấn bề mặt biểu hiện trên tế bào tua ở giai đoạn

nuôi cấy ngày (Đơn v : %) ......................................................................................51

MỞ ĐẦU

Tại Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung, gánh nặng ung thư ngày càng

trở nên nghiêm trọng đòi hỏi sự quan tâm đặc biệt của toàn xã hội. Theo ghi nhận Tổ

chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (International Agency for Research on Cancer,

IARC) năm 2018, mỗi năm ở nước ta có khoảng 164.671 ca mới mắc, tỷ lệ mới mắc

trên 100.000 dân là 151 4; đứng thứ 130 trên 186 quốc gia có báo cáo số liệu ung thư.

Trong đó tỷ lệ mắc mới ung thư phổi chiếm thứ hai với 14 4% sau ung thư gan. Phần

lớn người b bệnh ung thư phổi đến khám và điều tr ở giai đoạn muộn nên việc điều tr

càng khó khăn tốn kém và thời gian sống ngắn. Các phương pháp điều tr ung thư

truyền thống hiện nay như phẫu thuật, xạ tr , hóa tr … thường gây ra các tác dụng phụ

đối với người bệnh như: đau đớn, mệt mỏi chán ăn khó thở, ho, thiếu máu, rụng tóc,

chất lượng cuộc sống giảm. Vì vậy, thực tế này đòi hỏi những phương pháp điều tr mới

hiệu quả hơn ít tác dụng phụ, cải thiện chất lượng sống và kéo dài thời gian sống cho

người bệnh hơn so với các hình thức điều tr truyền thống.

Hiện nay, liệu pháp miễn d ch được chú trọng đặc biệt, ngày càng trở thành

phương thức điều tr ứng dụng rộng rãi trong điều tr ung thư sau khi thực hiện thủ thuật

loại bỏ khối u, xạ tr , hóa tr . Liệu pháp này giúp tăng cường hệ miễn d ch của cơ thể,

nhận diện được những kháng nguyên của khối u mà trước đó không được phát hiện. Khi

các tế bào ung thư này được phát hiện, hệ thống miễn d ch sẽ loại bỏ chúng ra khỏi cơ

thể một cách hiệu quả. Hơn thế nữa, liệu pháp sử dụng tế bào miễn d ch không gây xâm

lấn và ít gây đau đớn cho người bệnh. Đây là một liệu pháp đầy hứa hẹn trong việc điều

tr ung thư.

Tế bào tua là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp gây đáp ứng miễn

d ch tế bào T ngăn chặn sự phát triển khối u. Và trong những thập kỷ gần đây vắc xin

dựa trên tế bào tua đã và đang trở thành một chiến lược quan trọng trong liệu pháp miễn

d ch điều tr ung thư. Tuy nhiên sử dụng tế bào tua trong điều tr ung thư có một số

nhược điểm như các tế bào tua thường khó lưu trữ và phải đòi hỏi quá trình thu nhận

phức tạp cũng như cần nhiều kỹ thuật đánh giá chất lượng tế bào. Gần đây các exosome

tiết từ tế bào tua (Dex) chỉ ra những chức năng đáp ứng miễn d ch tương tự và được

phát triển để sử dụng như là một cách thay thế. Giống như DC Dex biểu hiện các phức

hệ phù hợp tổ chức chính (MHC lớp 1, MHC lớp 2), các phân tử đồng kích thích và các

thành phần khác tương tác với các tế bào miễn d ch. Trong những năm gần đây liệu

pháp ghép tế bào tua đồng loài đã được nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng và tế bào

máu dây rốn chính là một nguồn thay thế đầy tiềm năng trong liệu pháp miễn d ch đồng

loài điều tr ung thư. Sử dụng các exosome phân lập từ các tế bào tua máu dây rốn làm

vắc xin phòng chống ung thư chính là hướng nghiên cứu mới, khắc phục được các

nhược điểm của các phương pháp khác.

Dựa trên cơ sở đó chúng tôi thực hiện đề tài: “nghiên cứu khả năng kích thích

miễn dịch kháng ung thƣ phổi của exosome tế bào tua máu dây rốn trữ đông” để

đánh giá khả năng kích thích miễn d ch chống ung thư in vitro của các Exosome thu

nhận từ tế bào tua được phân lập và nhân nuôi từ máu dây rốn người. Các kết quả

nghiên cứu sẽ là tiền đề cho việc phát triển liệu pháp vắc xin mới phòng chống ung thư phổi.

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN

1.1. Thực trạng ung thƣ phổi

1.1.1. Thực trạng ung thƣ phổi

Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất và cũng là nguyên nhân gây tử vong

hàng đầu trên thế giới do chẩn đoán muộn và điều tr hạn chế ở cả nam giới và nữ giới

[31]. Dựa trên ước tính của GLOBOCAN 2018, có khoảng 2,1 triệu trường hợp mắc

mới (chiếm 11,6% tổng số trường hợp ung thư mới) và 1,7 triệu trường hợp tử vong liên

quan đến ung thư phổi (chiếm 18,4% tổng số trường hợp tử vong). Hầu hết các trường

hợp ung thư phổi được chẩn đoán ở giai đoạn cuối khi khối u đã di căn khi đó chi phí

điều tr tốn kém nhưng hiệu quả thấp, tỷ lệ tái phát cao. Hút thuốc là yếu tố nguy cơ

hàng đầu gây nên ung thư phổi và chiếm đến 80% cái chết do ung thư phổi [74]. Thời

gian sử dụng thuốc lá cũng như số lượng tiêu thụ thuốc lá/ngày tỷ lệ thuận với nguy cơ

mắc ung thư phổi. Bên cạnh đó tiếp xúc với radon (khí ga tự nhiên-chất gây ung thư tự

nhiên), ami-ăng asen không khí ô nhiễm… cũng là những yếu tố tăng nguy cơ ung thư

phổi. Ngoài ra, một số yếu tố liên quan đến ung thư phổi di truyền cũng đã được chứng

minh như đột biến soma trong gen TP53 đột biến gene EGFR, gen mã hóa cho thụ thể

nicotine acetylcholine [30, 47].

Ung thư phổi được chia làm hai loại dựa theo theo loại tế bào b ảnh hưởng: ung

thư phổi tế bào nhỏ chiếm 15% (small cell lung cancer (SCLC)) và phần lớn là ung thư

phổi không tế bào nhỏ (non-small cell lung cancer (NSCLC)) chiếm 85% bao gồm các

loại: ung thư biểu mô tuyến (chiếm 40%) ung thư biểu mô vẩy (25-30%) và ung thư tế

bào lớn (5-10%) [74]. Tùy thuộc vào loại ung thư cũng như giai đoạn bệnh mà bệnh

nhân có các phác đồ điều tr khác nhau. Tuy nhiên, mặc dù có nhiều tiến bộ trong chẩn

đoán và điều tr ung thư phổi vẫn là căn bệnh gây ra nhiều thách thức cho các bác sỹ

lâm sàng do đáp ứng bệnh không tốt, tỷ lệ bệnh nhân ung thư phổi sống trên 5 năm là

dưới 5% [51]. Vì vậy, nhu cầu làm rõ cơ chế gây bệnh, áp dụng phối hợp các phương

pháp điều tr là cần thiết để có thể nâng cao hiệu quả chữa bệnh và kéo dài thời gian

sống của bệnh nhân.

1.1.2. Đáp ứng miễn dịch trong ung thƣ phổi

Một trong số các loại tế bào miễn d ch có chức năng quan trọng việc tiêu diệt khối

u là tế bào lympho T gây độc (CTL - cytotoxic T Lymphocytes). Tế bào CTL hoặc tế

bào giết tự nhiên NK (Natural killer cell) được huy động nhờ sự trình diện các kháng

nguyên ung thư chủ yếu bởi tế bào tua (Dendritic cell-DC) và đại thực bào. Tuy nhiên,

chức năng trình diện kháng nguyên trong ung thư ác tính thường b suy giảm. Chức

năng phòng thủ chống ung thư được cân bằng và sau đó vượt quá mức do điều hòa đáp

ứng miễn d ch.

Ung thư phổi trốn thoát khỏi giám sát miễn d ch nhờ vào các tế bào gây ức chế miễn d ch trong vi môi trường khối u: tế bào T điều hòa Treg, tế bào ức chế có nguồn gốc tủy xương MDSCs, đại thực bào hoặc ức chế hoạt hóa tế bào T thông qua các chốt kiểm soát miễn d ch

Hình 1.1: Cơ chế ung thƣ phổi thoát khỏi giám sát miễn dịch [22]

Vai trò bảo vệ cơ thể cũng như quá trình phát triển khối u là kết quả tương tác

giữa các tế bào ung thư và hệ thống miễn d ch được gọi là ―chỉnh sửa miễn d ch‖

(immunoediting) bao gồm ba pha riêng biệt: loại trừ, cân bằng và trốn thoát [70]. Trong

giai đoạn loại trừ đáp ứng miễn d ch cấp tính, bao gồm hệ miễn d ch bẩm sinh và đáp

ứng, nhận diện và tiêu diệt các tế bào ung thư thông qua một quá trình gọi là giám sát

miễn d ch trước khi chúng phát triển thành một khối u [70]. Các dòng tế bào ung thư

thoát khỏi pha loại trừ duy trì trạng thái không hoạt động trong pha cân bằng tiếp theo,

trong thời gian này, sự phát triển khối u không xảy ra nhưng khả năng miễn d ch của

các tế bào khối u tiếp tục được đ nh hình dưới áp lực miễn d ch chọn lọc từ hệ miễn

d ch đáp ứng. Hệ quả của áp lực chọn lọc là quá trình ức chế miễn d ch trung gian khối

u làm thay đổi quần thể tế bào khối u, dẫn đến trốn thoát miễn d ch và tăng trưởng khối

u [70]. Các tế bào khối u bước vào pha trốn thoát miễn d ch có thể tạo ra trạng thái ức

chế miễn d ch trong vi môi trường khối u bao gồm: tế bào ung thư nguyên bào sợi, tế

bào nội mô đại thực bào, tế bào tua, tế bào lympho và các chất ngoại bào với nhiều chất

trung gian như cytokine chemokine các yếu tố tăng trưởng và enzyme [55].

Các loại tế bào gây ức chế miễn d ch chính được tìm thấy trong vi môi trường

khối u là tế bào T điều hòa (regulatory T cells (Treg)), tế bào ức chế có nguồn gốc tủy

xương (myeloid-derived suppressor cells (MDSCs)) và các đại thực bào liên quan đến

khối u (tumor-associated macrophages (TAM)) [42, 55].

- Tỷ lệ cao Treg trong các khối u liên quan đến tiên lượng xấu ở nhiều loại ung thư

khác nhau bao gồm: ung thư phổi không tế bào nhỏ ung thư dạ dày, tế bào gan, tụy,

tế bào thận ung thư vú và ung thư cổ tử cung. Treg (biểu hiện các marker bề mặt

CD4, CD25 và yếu tố phiên mã Foxp3) ức chế chức năng và sự tăng sinh của các tế bào T CD4+, CD8+ đặc hiệu khối u và tế bào NK. Dựa theo nghiên cứu của

Shigematsu và cộng sự (2012), quần thể tế bào Treg có tỷ lệ cao hơn đáng kể trong

khối u và các hạch lympho so với máu ngoại vi trong ung thư phổi [56]. Tương tự,

sự biểu hiện của Foxp3 có trong khoảng một phần ba người bệnh mắc NSCLC và tỷ

lệ Foxp3/CD8 là chỉ số dự đoán đáp ứng hóa tr ở người bệnh giai đoạn tiến triển

[38].

- Trong NSCLC, MDSCs được xác đ nh bằng các dấu ấn bề mặt: CD11+CD14- CD15+CD33+. MDSCs cảm ứng các tế bào Treg, hạn chế sự tăng sinh tế bào T chức

năng (effector T cell) thông qua sản xuất các phân tử ức chế miễn d ch khác nhau.

MDSCs hoạt hóa arginase, tổng hợp oxit nitric (NO), tạo các gốc oxy tự do (radical

oxygen species ROS) và tiêu thụ cystein làm ức chế hoạt hóa các tế bào T và biệt

hóa các loại tế bào nhớ [46]. Ở bệnh nhân ung thư phổi, MDSCs có khả năng tạo ra

IL-10 MMP9 và TGFβ kích thích sự hình thành mạch và di căn. Sự biểu hiện quá

mức COX2 trong ung thư phổi và quá trình chuyển tiếp trung biểu mô (epithelial-

mesenchymal transition EMT) có vai trò quan trọng trong ức chế đáp ứng miễn d ch

kháng khối u của MDSCs.

- TAM là các đại thực bào tập trung tại các khối u rắn, có vai trò trong sự tăng trưởng,

tiến triển và di căn của khối u, bao gồm đại thực bào phân cực M1 (kháng khối u) và

đại thực bào M2 (thúc đẩy tăng trưởng và di căn khối u). Nghiên cứu của Ma J và

cộng sự đã chỉ ra rằng mật độ M1 có trong khối u ở nhóm người mắc NSCLC có tỷ

lệ sống dài cao hơn so với nhóm người có có tỷ lệ sống thấp [41]. Trong khi đó sự

biểu hiện của IL-17 và prostaglandin E2 (PGE2) trong vi môi trường khối u kích

thích M2 biệt hóa và chiếm ưu thế [40].

Ngoài ra, ức chế miễn d ch còn xảy ra thông qua hai chốt kiểm soát miễn d ch

CTLA-4 (T-lymphocyte-associated protein 4) và PD-1(Programmed death 1). CTLA-4

là phân tử có cấu trúc tương đồng với thụ thể đồng kích thích CD28, cạnh tranh liên kết

với các phối tử CD80/CD86 biểu hiện trên bề mặt tế bào trình diện kháng nguyên [49].

Nhờ có ái lực cao, CTLA-4 ngăn cản thụ thể CD28 liên kết với CD80/CD86, do đó

cung cấp tín hiệu ức chế đến tế bào T ngăn cản quá trình tế bào T hoạt hóa. Ghi nhận ở

người mắc NSCLC cho thấy tỷ lệ CTLA4 nội bào cao hơn so với tỷ lệ tế bào lympho T CD4+ [24]. Giống như CTLA-4, PD-1 cũng ức chế hoạt động của tế bào T thông qua

giảm tín hiệu đồng hoạt hóa của thụ thể CD28 nhưng không cạnh tranh trong tương tác

với CD80/CD86, mà ức chế hoạt tính của thụ thể CD28. PD-1 biểu hiện trên bề mặt tế

bào T đã hoạt hóa liên kết với các phối tử PD-L1/PD-L2 biểu hiện trên bề mặt ở các tế

bào ung thư dưới tác động IFN-γ do tế bào Th đã tiết ra, cung cấp tín hiệu ức chế trong

pha chức năng (effector phase) đáp ứng tế bào T, giảm sản xuất cytokine tăng sinh tế bào [14].

CTLA-4(A) cạnh tranh liên kết với phân tử CD28 trong liên kết với phân tử đồng kích thích

CD80/86 và PD-1(B) giảm hoạt tính CD28 khi liên kết với PD-L1 hoặ PD-L2 [60].

Hình 1.2: Vai trò của PD1 và CTLA-4 trong đáp ứng miễn dịch kháng khối u.

1.1.3. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ phổi

SCLC ít phổ biến trong ung thư phổi nhưng khả năng lây lan sang các v trí khác

trong cơ thể cao. Vì vậy, hóa tr là phương pháp ưu tiên trong SCLC. Phẫu thuật hiếm

khi sử dụng đôi khi được áp dụng để lấy các mẫu sinh thiết mô xác đ nh loại ung thư

phổi mắc phải. Trong khi đó NSCLC chiếm phần lớn trong ung thư phổi, có xu hướng

phát triển chậm và mất nhiều thời gian để xâm lấn nên các phương pháp điều tr cục bộ:

phẫu thuật và/hoặc xạ tr , hóa tr là phương pháp điều tr chính. Tuy nhiên, các phương

pháp điều tr truyền thống trên thường gây ra nhiều tác dụng phụ cho người bệnh như:

giảm sức khỏe, gây mệt mỏi chán ăn rụng tóc... Vì vậy hiện nay, một số phương pháp

mới trong điều tr ung thư đang được tập trung nghiên cứu và phát triển, nổi bật là

phương pháp điều tr đích và liệu pháp miễn d ch.

a) Điều trị đích

NSCLC thường liên quan đến mức độ biểu hiện thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì

EGFR (Epidermal growth factor receptor) với tần xuất cao, chiếm khoảng 40-80% bệnh

nhân. Dựa theo hai con đường hoạt hóa chính: PI3K / AKT / mTOR và RAS / RAF /

MEK / MAPK, EGFR kích thích tăng trưởng khối u, xâm lấn cục bộ, tạo mạch, tự thực

bào (autophagy), và chuyển hóa tế bào [35]. Do đó điều tr đích là phương pháp sử

dụng thuốc nhắm vào các phân tử đích để ngăn chặn con đường thúc đẩy khối u tiến

triển và kiểm soát bệnh tốt trong khoảng thời gian dài. Có khoảng 22 loại thuốc điều tr

đích đã được Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ FDA (U.S. Food and

Drug Administration) công nhận trong điều tr ung thư phổi bằng cách ức chế các gene

đảm nhận các nhiệm vụ khác nhau như: EGFR, VEGF (vascular endothelial growth

factor-yếu tố tăng trưởng nội mô thành mạch) TP53 ALK ROS1 BRAF…

Phẫu thuật

Liệu pháp miễn d ch Xạ tr

Phương pháp

điều tr

Ung thư phổi

Hóa tr Điều tr đích

Phẫu thuật, xạ tr , hóa tr điều tr đích và liệu pháp miễn d ch.

Hình 1.3: Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ phổi

b) Liệu pháp miễn dịch

Mặc dù đã có những tiến bộ mạnh mẽ trong điều tr NSCLC, hầu hết các bệnh

nhân đều trải qua giai đoạn tiến triển của bệnh đáp ứng không tốt sau hai hoặc nhiều hơn

hai chu kỳ hóa tr liệu, nên việc phát triển các phương pháp điều tr mới là cần thiết. Liệu

pháp miễn d ch chính là một bước ngoặt mới, là lựa chọn thay thế và bổ sung cho điều tr

ung thư phổi. Hiện nay, một số liệu pháp miễn d ch như vắc-xin peptide cá thể

(personalized peptide vaccines - PPV) [52], bất hoạt điểm kiểm soát miễn d ch (immune

checkpoint blockade - ICB), hoặc vắc xin DC tế bào tua… đã được áp dụng trong các

thử nghiệm lâm sàng [34]. PPV sản xuất cho từng người bệnh nhưng vẫn tồn tại nhược

điểm do giới hạn số lượng các loại peptide [52]. Đối với liệu pháp ICB, nhiều loại thuốc

như nivolumab và atezolizumab đã được FDA chấp thuận cho tất cả bệnh nhân mắc

NSCLC tiến triển thực hiện một chu trình hóa tr , có tác dụng bất hoạt lần lượt các chốt

miễn d ch PD-1 và PD-L1. Gần đây vắc xin DC được nghiên cứu sâu rộng do đặc điểm

sinh học cũng như chức năng trong cơ thể. Vắc-xin DC được phân loại nguồn tế bào

như: tế bào đơn nhân (monocytes) tự thân nuôi cấy in vitro và ex vivo và DC được cảm

ứng kháng nguyên trước khi truyền vào cơ thể [48]. Liệu pháp miễn d ch dựa trên DC là

an toàn và có thể thúc đẩy phản ứng miễn d ch chống ung thư và kéo dài sự sống của

người bệnh. Hơn thế nữa, DC có vai trò trong cả đáp ứng hệ miễn d ch bẩm sinh và đáp

ứng, bắt đầu phản ứng miễn d ch bằng cách kích thích các tế bào T tiêu diệt tế bào ung

thư và kích hoạt các tế bào bộ nhớ ngăn ngừa ung thư tái phát. Tuy nhiên sử dụng vắc

xin tế bào tua trong điều tr ung thư có một số nhược điểm. Gần đây các nghiên cứu về

Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua cũng chỉ ra những chức năng đáp ứng miễn d ch

tương tự và được phát triển để sử dụng như là một vắc-xin thay thế [50].

1.2. Tế bào tua

1.2.1. Định nghĩa tế bào tua

Tế bào tua là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp, có khả năng bắt giữ

và thực bào trước khi trình diện các kháng nguyên của vi rút, vi khuẩn và quan trọng

hơn là các kháng nguyên của tế bào ung thư cao và mạnh hơn những tế bào miễn d ch

thông thường khác như đại thực bào hoặc tế bào lympho B [58]. Tế bào tua gây đáp ứng

miễn d ch tế bào T, kích thích khả năng tăng sinh và biệt hóa các tế bào naive T. Tế bào

tua cũng đóng góp vào các chức năng của các tế bào lympho B và giúp duy trì trí nhớ

miễn d ch bằng cách tiết các cytokine để thúc đẩy hoạt hóa tế bào lympho B (IL-1, IL-6,

TNF-a...), hoặc theo các phương thức khác nhau như phụ thuộc hoặc không phụ thuộc

vào tín hiệu tăng sinh CD40 [72].

Tế bào tua gồm hai quần thể chính: tế bào tua dòng tủy (Langerhans DC, Interstitial DC,

Myeloid DC) và dòng lympho (Plasmocytoid DC) có nguồn gốc từ tế bào gốc tạo máu.

Hình 1.4: Sự hình thành các quần thể tế bào tua [53]

DC là một quần thể phân bố rộng rãi, có nguồn gốc từ bạch cầu tủy xương hình

thái tua dài được mô tả lần đầu tiên bởi Steinman và Cohn vào năm 1973. Trong cơ thể

người, DC tồn tại với nhiều quần thể khác nhau: DC dòng tủy và DC dòng lympho có nguồn gốc từ tế bào gốc tạo máu CD34+. DC dòng tủy gồm các tế bào Langerhans

(quần thể DC đặc biệt) được tìm thấy trong biểu mô và các tế bào Interstitial DC là các

DC kẽ tìm thấy trong các mô khác [18]. Ngoài ra, quần thể Myeloid DC (mDC) biểu hiện cao CD14+ được cho là có nguồn gốc từ tế bào mono. Plasmacytoid DC (pDC) là tế

bào DC dòng tủy gây cảm ứng rất mạnh cho phản ứng miễn d ch gây độc tế bào, bởi

chúng tiết ra một lượng lớn IFN loại 1. Trong máu và các mô cơ quan bạch huyết, pDC

và mDC được tìm thấy nhiều nhất. Trong môi trường In vitro, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng DC chức năng cao có thể được biệt hóa từ các tế bào mono CD14+

bằng cách nuôi cấy trong môi trường có GM-CSF và IL-4 [61]. Sự trưởng thành của các

DC này có thể đạt được bằng cách nuôi cấy bổ sung với yếu tố hoại tử khối u (TNF-

cùng sự kích thích của kháng nguyên [43]. Ngoài ra, vào năm 2016 Taieb J và cộng

sự đã mô tả một loại tế bào DC mới được gọi là interferon-producing killer DC (IKDC)

ở chuột có khả năng trực tiếp giết các tế bào đích, biểu hiện tương tự chức năng tế nào

NK và DC [62]. Cho đến nay, ở người IKDC nói chung cũng chưa được xác đ nh [54].

1.2.2. Con đƣờng trình diện kháng nguyên của tế bào tua

Để thực hiện các chức năng trên tế bào tua bắt giữ và chế biến các protein từ các

tế bào nhiễm virut hoặc từ các tế bào khối u, trình diện kháng nguyên với các tế bào

lympho T thông qua hai con đường: nội sinh và ngoại sinh.

Trong con đường trình diện kháng nguyên nội sinh, các tế bào biểu hiện kháng

nguyên MHC lớp I. Protein được phân cắt trong bào tương bởi proteosome (một phức

hợp các protein có hoạt tính phân giải protein), hoặc bằng protease khác sau đó các

mảnh peptide được vận chuyển qua màng của mạng lưới nội chất bởi các kênh protein

vận chuyển. Tại đây sự tổng hợp và lắp ráp chuỗi nặng và beta 2 microglobulin của

MHC lớp I xảy ra, kết hợp với peptid hình thành một phức hợp ổn đ nh rồi được vận chuyển đến bề mặt tế bào và được trình diện với các tế bào T CD8+ [33]. Đối với con

đường trình diện kháng nguyên ngoại sinh, protein ngoại sinh được đưa vào trong tế bào

bởi quá trình thực bào và được phân cắt thành các mảnh bởi các protease trong

endosome. Khi đó các chuỗi alpha và beta của MHC lớp II được tổng hợp, lắp ráp

trong mạng lưới nội sinh chất đi qua bộ máy Golgi và trans-Golgi để đến endosome,

liên kết với các peptid rồi cuối cùng được vận chuyển đến bề mặt tế bào được nhận diện bởi tế bào T CD4+ [15]. Đối với con đường tế bào chất, kháng nguyên ngoại sinh

từ các khoang nội bào được giải phóng vào tế bào chất, phân hủy trong proteasome và

vận chuyển phụ thuộc phân tử vận chuyển gắn với xử lý kháng nguyên (transporter

associated with antigen processing (TAP)) đến lưới nội chất hạt. Từ đây quá trình trình

diện kháng nguyên diễn ra tương tự như con đường trình diện kháng nguyên nội sinh.

Con đường khác theo không bào, các phân tử MHC lớp I gặp và liên kết với các peptide

ngoại sinh trong bộ máy Golgi hoặc endolysosome giống như các phân tử MHC lớp II

trước khi được vận chuyển đến bề mặt tế bào. Và sự trình diện chéo trong khoang

endolysosome là độc lập với TAP [12].

Tế bào tua trình diện kháng nguyên nội sinh thông qua phức hệ phù hợp tổ chức chính lớp I (MHC lớp I) và trình diện kháng nguyên ngoại sinh bằng phức hệ phù hợp tổ chức chính lớp II (MHC lớp II). Ngoài ra, tế bào tế tua còn xảy ra trình diện kháng nguyên chéo theo con đường tế bào chất và không bào

Hình 1.5: Con đƣờng trình diện kháng nguyên của tế bào tua [75]

1.2.3. Cơ chế biệt hóa tế bào tua in vitro

Nhiều thử nghiệm đã chứng minh biệt hóa DC từ các tế bào đơn nhân MNC sử

dụng tổ hợp cytokine: GM-CFS, IL-4 kết hợp với TNF-α LPS… (Bảng 1.1) ở các nồng

độ khác nhau. Trong quá trình biệt hóa này, GM-CFS đóng vai trò kích hoạt các tín hiệu

nội bào theo các con đường khác nhau: chuyển đổi tín hiệu kinase Janus và hoạt hóa yếu

tố phiên mã (janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT)),

hoạt hóa kinase mitogen-activated protein MEK, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K),

và yếu tố phiên mã NF-кB. Các tín hiệu này hoạt động đồng thời, thực hiện các chức

năng riêng biệt: tăng sinh biệt hóa và duy trì khả năng sống trong quá trình điều hòa,

phát triển DC [67].

Dưới sự kích hoạt GM-CFS, STAT5 là yếu tố quan trọng nhất trong quá trình biệt hóa. Tín hiệu PI3K/PKB thúc đẩy sự tăng sinh khả năng duy trì sự sống của các tế bào tiền thân DC. Trong khi đó hoạt hóa các yếu tố phiên mã MEK/ERK và NF-кB liên quan mật thiết đến quá trình biệt hóa và duy trì khả năng sống của tế bào.Viết tắt: GM-CFS: Granulocyte-macrophage colony- stimulating factor, ERK: extracellular signal-regulated kinases, PI3K: phosphatidylinositol 3- kinase, NF-кB:Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B, STAT: Signal transducer and activator of transcription

Hình 1.6 : GM-CFS điều hòa sự phát triển của DC qua các tín hiệu phân từ khác nhau [67]

Theo kết quả nghiên cứu của Sahana Holla vào năm 2014 về vai trò của IL-4 trong

sự biệt hóa DC, khi không có sự kết hợp với IL-4, GM-CFS gần như không có khả năng

biệt hóa DC từ tế bào mono người dù cơ chế phân tử chưa được làm sáng rõ [29]. Tương

tự, TNF-α chiếm một vai trò quan trọng trong quá trình thúc đẩy sự trưởng thành của DC.

Thời gian thích hợp nhất khi bổ sung TNF-α vào môi trường biệt hóa DC hiện nay vẫn

chưa rõ ràng tuy nhiên, hiệu quả biệt hóa DC từ MNC máu cuống rốn cao hơn khi được

bổ sung TNF-α sớm [23].

Bảng 1: Một số thử nghiệm về biệt hóa tế bào tua với các tổ hợp cytokine khác nhau

Thời gian

Tên bài báo

GM-CFS

IL-4

Yếu tố khác

800 U/ml

2012

Isolation and Generation of Human Dendritic Cells

500 U/ml

TNF-a (100 U/ml)

50ng/ml

2015

30ng/ml TNF-a (50ng/ml) LPS (100ng/ml) CD40L (100ng/ml)

Umbilical cord blood-derived CD11c(+) dendritic cells could serve as an alternative allogeneic source of dendritic cells for cancer immunotherapy.

500U/ml

40ng/ml LPS (100ng/ml)

2016

Effect of sampling media and culture conditions on dendritic cell generation: ion depleted plasma negatively influences the survival of monocyte- derived dendritic cells

50ng/ml

2017

50ng/ml SCF: 50ng/ml LPS: 100ug/ml IFN-γ: 10 ng/ml

Diversity of dendritic cells generated from umbilical cord or adult peripheral blood precursors

1.3. Exosome

1.3.1. Định nghĩa Exosome

Exosome là bóng bào hình cầu màng kép phospholipid với đường kính trung bình

từ 30 đến 150 nm, khối lượng riêng đẩy nổi (buoyant density) khoảng từ 1.10-1.14g/ml,

là túi ngoại bào duy nhất được hình thành từ sự xâm lấn khoang nội bào là thể đa bào

(MVBs-multivesicular bodies hoặc MVEs - multivesicular endosome) và được giải

phóng trong mạng lưới nội bào [39]. Sau khi dung hợp thể đa bào với bề mặt tế bào

(màng tế bào), các thông tin nội bào được giải phóng vào gian ngoại bào và hình thành

nên Exosome. Exosome được tìm thấy trong các d ch lỏng, bao gồm máu, huyết tương

nước bọt nước tiểu nước ối, d ch tràn màng phổi.

Các phân tử MHC và protein được mô tả là các marker điển hình nhận diện

Exosome như: protein sốc nhiệt 70-kDa và Flotillin 1 được tìm thấy hầu hết ở các phân

lớp Exosome được phân lập, trong khi nhiều protein khác được làm giàu chọn lọc để

phân biệt các phân lớp Exosome cụ thể. Exosome biểu hiện cao các marker nội bào như

CD63, CD81, syntenin 1 và TSG101 (tumor susceptibility gene 101) thường kích thước

nhỏ tương đối đồng nhất. Sự phân bố của các Exosome được chứng minh rõ ràng thông

qua hình ảnh chụp từ kính hiển vi điện tử miễn d ch tĩnh cho thấy sự dung hợp của

MVBs với màng tế bào chất, giải phóng Exosome có kích thước từ 60 đến 100nm mang

các phân tử MHC và các phân tử tetraspanin là đặc điểm của Exosome như CD63

CD81 và CD9 [13].

1.3.2. Cơ chế hình thành Exosome

Quá trình trưởng thành từ thể Endosome sớm sang Endosome muộn tích lũy các

ILVs (intraluminal vesicels), là các chồi mọc phía bên trong Endosome. Do đặc điểm

hình thái nên chúng thường được gọi là Endosome đa bào hoặc MVBs (hình 1.7).

Trong khi các bóng bào kích thước micro (Microvesicles) mọc chối trực tiếp từ màng tế bào, exosome được tạo thành từ các bóng bào nhỏ khác nhau về kích thước có nguồn gốc từ các các chồi mọc phía bên trong Endosome (ILV) và thể đa bào (MVEs). Exosome được giải phóng ra khỏi tế bào nhờ sự dung hợp giữa MVE và màng tế bào

Hình 1.7: Qúa trình giải phóng Exosome từ thể đa bào MVEs [17]

Trong hầu hết các tế bào, MVBs chủ yếu hợp nhất với lysosome, là khoang axit

chứa enzyme lysosomal hydrolase đảm bảo sự phân cắt xảy ra. Để hình thành MVBs và

ILVs, một phức hệ vận chuyển được yêu cầu là ESCRT (endosomal sorting complex

required for transport) gồm khoảng 30 protein tập hợp thành 4 phức hệ (ESCRT-0, -I, -

III -III) với protein khác (VPS4, VTA1, ALIX (ALG2 interacting protein X)). Tuy

nhiên, một vài bằng chứng chỉ ra rằng sự hình thành MVBs và ILVs mà không cần sự

tham gia của ESCRT. Sự bất hoạt đồng thời của bốn protein trong bốn phức hệ ESCRT

khác nhau không loại trừ sự hình thành MVB [59].

a) Cơ chế hình thành Exosome phụ thuộc ESCRT

Chức năng của protein ESCRT trong sự hình thành Exosome được đề xuất bắt

đầu từ việc nghiên cứu proteomic thấy sự hiện diện của TSG101 và ALIX trong

Exosome tiết từ nhiều loại tế bào khác nhau. ALIX cũng liên quan đến tiết Exosome

trong hồng cầu lưới, khi liên kết với tế bào chất của TfR, ALIX cạnh tranh gắn kết với

HSC70 và thúc đẩy thụ thể transferrin (transferrin receptor (TfR)) biểu hiện lên ILVs.

Vào năm 2012 Baiettietal đã chứng minh Exosome được tiết từ khối u có chứa

syndecan, syenin và ALIX. Sự biểu hiện quá mức của syenin gây ra việc tăng tiết

Exosome phụ thuộc ALIX, bao gồm sự tăng của các marker nội bào CD63 và HSP70,

trong khi giảm biểu hiện của syndecan, syenin, hoặc ALIX dẫn đến việc giảm tiết

Exosome. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích RNA, Exosome được xác đ nh là túi

tiết ngoại bào đồng kích thích mang đồng thời hai protein là CD63 và MHC class II.

Khi bất hoạt các gene ESCRT-0 (HGS, STAM1) hoặc gen ESCRT-1 thì TSG101 giảm

tiết và các Exosome tiết ra chứa ít CD63 và MHC lớp II trong khi đó bất hoạt VPS4B

làm tăng tiết Esoxome mà không thay đổi thành phần trên [20]. Mặc dù mối liên hệ giữa

sự hình thành các Exosome phụ thuộc vào ESCRT và các kênh vận chuyển chưa được

xác đ nh rõ ràng nhưng gợi ý rằng TSG101 và STAM1 tham gia vào quá trình vận

chuyển xuyên màng trong Exosome.

Exosome được tiết theo nhiều con đường khác nhau. Đối với sự tiết phụ thuộc vào thể đa bào MBV, các protein liên kết với Ras trong họ RAB: RAB11, RAB35, RAB7, và RAB27 thúc đẩy sự tiết Exosome theo đường nội tiết. Đối với các Exosome nguồn gốc từ màng tế bào, yếu tố ARF6 là một thành phần quan trọng trong hình thành sự nảy chổi (bao gồm cả ALIX và TSG101). Viết tắt: ALIX, ALG2-interacting protein X; PLP, proteolipid protein; TSG101, tumor susceptibility gene 101; Wnt, Wingless/Int-1 family of proteins

Hình 1.8: Cơ chế hình thành Exosome theo con đƣờng phụ thuộc ESCRT[20]

b) Cơ chế hình thành Exosome không phụ thuộc ESCRT

Sự hình thành Exosome có thể xảy ra thông qua cơ chế không phụ thuộc ESCRT

đã được chứng minh ở dòng tế bào thần kinh đệm ít gai oligodendroglial. Ức chế

enzyme thủy phân sprialomyelin thành ceramide (nSMase) cùng với GW4869 làm giảm

tiết Exosome gắn Protein proteolipid (Proteolipid protein (PLP). Tương tự, giảm bài tiết

của các protein ngoại bào điển hình (CD63, CD81, or TSG101) và/hoặc miRNA cũng

đã được quan sát khi thay đổi GW4869. Do đó việc sắp xếp PLP trong ILVs không phụ

thuộc ESCRT mà yêu cầu sự tổng hợp ceramide. Một cơ chế khác liên quan đến hình

thành Exosome là cơ chế phụ thuộc CD63. Trong các tế bào HEK293, sự biểu hiện quá

mức CD9 hoặc CD82 (mà không phải CD63) đã được chứng minh là gây ra sự bài tiết

catenin bởi Exosome thông qua cơ chế phụ thuộc ceramide. Các vùng giàu CD81 đã

được đề xuất, giải thích cho sự biểu hiện các protein ngoại bào, không phụ thuộc

ESCRT và hình thành quần thể ILVs. Một protein màng tích hợp Lysosome và

Endosome muộn được gọi là SIMPLE (small integral membrane protein of lysosomes

and late endosomes) đã chứng minh tiết Exosome chứa ít CD63 và ALIX ở người mắc

bệnh teo cơ Mác. Tương tác với ubiquitin ligase Nedd4 có khả năng liên quan đến hình

thành và tiết Exosome, bởi vì protein xuyên màng có thể liên kết Nedd4 đã được chứng

minh là thúc đẩy tiết Exosome như chất ức chế khối u [20].

1.3.3. Chức năng trình diện kháng nguyên của Exosome có nguồn gốc từ tế

bào tua

Exosome được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1980 khi nghiên cứu các tế bào

hồng cầu non là các túi tiết của tế bào được giải phóng vào môi trường ngoại bào. Nó

tồn tại ở trong d ch cơ thể như máu nước tiểu nước bọt, sữa mẹ nước ối, d ch tủy, d ch

mật, tinh d ch và chứa protein, lipid và RNA, chất truyền thông tin trung gian giữa các

loại tế bào khác nhau trong cơ thể [26]. Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng DC cũng tiết ra

các Exosome mang phức hệ peptide MHC lớp I, có thể thúc đẩy phản ứng miễn d ch tế bào lympho T CD8+ ở chuột. Những kết quả này đặt cơ sở cho giả thuyết rằng Exosome

có thể đóng vai trò tích cực trong giao tiếp giữa các tế bào, ít nhất là trong hệ thống

miễn d ch và thúc đẩy nỗ lực đầu tiên sử dụng chúng trong điều tr như một loại vắc xin

chống ung thư mới ở người [8]. Bằng nghiên cứu thử nghiệm, nhóm nghiên cứu Zitvoge

và cộng sự đã chứng minh rằng các tế bào tua cũng tiết các Exosome trình diện kháng

nguyên. Các Exosome là cần thiết cho sự trình diện kháng nguyên như MHC lớp I,

MHC lớp II, và các phân tử đồng kích thích cũng như các phân tử liên kết. Tương tự

như tế bào tua, Exosome cũng xảy ra quá trình trình diện chéo khi hấp thụ kháng

nguyên tạo ra peptide có thể liên kết với phân tử MHC-II và được chuyển sang phân tử

MHC nội bào [7].

a) Khả năng trình diện kháng nguyên lớp MHC-I của Exosome có nguồn gốc từ tế

bào tua

Zitvoge và đồng nghiệp của đã quan sát thấy Exosome phân lập từ môi trường

nuôi cấy DC chuột chưa trưởng thành có thể trình diện đáp ứng tế bào T CD8, bao gồm

cả in vitro và in vivo [36]. Các Exosome phân lập từ tế bào tua có nguồn gốc từ tế bào

tế bào mono(Monocyte-derived dendritic cell (moDC)) moDC người đã hoạt hóa có thể

kích thích tế bào T CD8 ngoại vi trong in vitro, thể hiện khả năng kích thích nội sinh

của Exosome [1]. Tuy nhiên trong trường hợp vắng DC, Exosome chỉ có thể kích hoạt

các tế bào T cảm ứng mà không phải các tế bào naive T. Ở chuột, kích hoạt tế bào T

CD8 in vitro bằng Exosome mang phức hệ nhận diện peptide-MHC (peptide-MHC-

I complexes (pMHC-I)) được hỗ trợ bởi các tế bào DC. Hiệu quả miễn d ch của việc

trình diện chéo bằng Exosome đã được thể hiện trong các thí nghiệm mà tại đó các

pMHC-I vận chuyển bởi các Exosome phân lập từ môi trường nuôi cấy DC người có thể

cung cấp cho DCnon khả năng trình diện các tế bào T CD8 đặc hiệu khối u ác tính trong

chuột chuyển gen HLA-A2 [4]. Trình diện chéo MHC-I bằng Exosome nội bào hy vọng

sẽ mang lại hiệu quả tốt nhất tại các v trí có mật độ tế bào miễn d ch hoạt động cao, ví

dụ như ở lách và hạch bạch huyết. Trạng thái Exosome được tiết ra từ DC cũng rất quan

trọng, vì Exosome thu được từ DC trưởng thành có thể kích thích sự tăng sinh tế bào T

CD8 in vitro và in vivo mạnh hơn so với Exosome từ DC chưa trưởng thành và hơn nữa

gây ra đáp ứng CTLs (cytotoxic T lymphocytes) đặc hiệu kháng nguyên, tế bào T CD8

nhớ và miễn d ch kháng khối u [27]. Thí nghiệm trên chuột vivo đã chứng minh rằng

việc vận chuyển phức hệ pMHC-I chủ yếu xảy ra theo phương thức một chiều từ DC

đến hạch lymph hay hoặc lá lách [3]. DC hoạt hóa bởi kháng nguyên nội bào trong các

mô ngoại vi, trình diện chéo với phân tử MHC-I và di chuyển đến các mô bạch huyết, là

nơi tiết Exosome mang phức hệ pMHC và phân tử đồng kích thích để tương tác chéo

hoặc DC di chuyển đến các mô lympho gần nhất.

b) Khả năng trình diện kháng nguyên lớp MHC-II của Exosome có nguồn gốc từ tế

bào tua

Các thí nghiệm in vitro và in vivo đã chứng minh rằng Exosome được phân lập từ

DC dung nạp kháng nguyên có thể kích thích cả tế bào T CD4 cảm ứng và dòng tế bào

T CD4 nhưng kém hiệu quả trong việc kích thích tế bào naïve T [36]. Việc kích hoạt

các tế bào naïve T CD4 phụ thuộc vào sự hiện diện DC trưởng thành và các phân tử

đồng kích thích của CD80 và CD86 trên bề mặt DC cho thấy Exosome có nguồn gốc

DC có thể khuếch đại đáp ứng tế bào T CD4 thông qua trình diện chéo DC mà không

tiếp xúc trực tiếp kháng nguyên [28]. Các nghiên cứu in vivo đã khẳng đ nh các

Exosome tiết từ DC trưởng thành đã dung nạp kháng nguyên có hiệu quả hơn trong việc

bảo vệ, chống lại sự lây nhiễm so với Exosome tiết từ DCnon đã dung nạp kháng

nguyên [17]. Hoạt hóa, dung nạp kháng nguyên, sự di chuyển của DC đã chỉ ra rằng

Exosome đi đến lá lách nơi DC tập trung, có thể hoạt hóa các tế bào T CD4. Exosome

tiết từ DC hoạt hóa giàu ICAM-1 (một phối tử cho integrin LFA-1 trên bề mặt các tế

bào DC và T) giải thích lý do tại sao chúng hiệu quả hơn trong đáp ứng tế bào T so với

Exosome tiết từ DCnon [28]. Các nghiên cứu in vivo đã chứng minh rằng Exosome

được tiết từ DC có thể tạo ra đáp ứng miễn d ch d ch thể [20]. Những báo cáo khác chỉ

ra rằng các Exosome được tiết từ DC tiêm vào cơ thể cũng có hiệu quả tương đương với

các DC được dung nạp kháng nguyên trong cả đáp ứng miễn d ch d ch thể và đáp ứng

miễn d ch tế bào chống lại kí sinh trùng Toxoplasmagondii [10]. Khi được chuyển đến

DC, Exosome có thể vẫn duy trì liên kết với màng tế bào hoặc dung hợp, tích hợp các

protein màng và thành phần tế bào chất của Exosome vào các khoang tương ứng của tế

bào nhận. Giả thiết có lẽ được chứng minh một cách thuyết phục nhất là việc truyền

miRNA từ Exosome có thể ức chế các mRNA đích trong DC nhận. Tập hợp miRNA

khác nhau được tích hợp vào Exosome từ DC chưa trưởng thành so sánh với DC trưởng

thành được di chuyển đến DC điều chỉnh phản ứng miễn d ch [36].

1: Qúa trình thực bào và nhập bào các tác nhân ngoại bào. 2, 3: Trình diện kháng nguyên chéo MHC lớp 1 theo con đường tế bào chất (2) hoặc không bào(3). 4: Hình thành phức hệ MHC lớp 2 trong bóng nhập bào (endosome) và chuyển đến màng tế bào. 5: MV chứa phức hệ peptide MHC lớp 1 và 2 hình thành chồi trên màng tế bào chất. 6, 7: Sau khi hình thành chồi, MV duy trì sự gắn kết trên màng tế bào (6) hoặc giải phóng ra môi trường ngoại bào (7). 8: ILV mang phức hệ peptide MHC lớp 1 và 2 được hình thành trong các MVEs. 9: Exosome mang phức hệ peptide MHC lớp 1 và 2 được giải phóng ra môi trường ngoại bào khi xảy ra sự dung hợp giữa MVEs và màng tế bào. 10: Exosome có thể duy trì gắn kết với màng tế bào. Viết tắt: ER, endoplasmic reticulum; ILV, intraluminal vesicle; MVE, multivesicular endosome.

Hình 1.9: Con đƣờng trình diện kháng nguyên của Exosome từ tế bào tua [37]

1.4. Ứng dụng của tế bào tua và Exosome trong điều trị ung thƣ

1.4.1. Ứng dụng tế bào tua trong điều trị ung thƣ tại Việt Nam

Từ năm 1992 Steinman cùng với các đồng nghiệp ở châu Âu và Nhật Bản đã

phát triển phương pháp để tạo ra một số lượng lớn các tế bào tua cho tới nay đã có gần

100.000 báo cáo khoa học về tế bào tua với những kết quả có ý nghĩa quan trọng về

nghiên cứu và ứng dụng tr liệu đặc biệt là nhiều nghiên cứu về ứng dụng tế bào tua tr

liệu ung thư. Tại Việt Nam, nhiều nhóm nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu tế bào tua

như “Nghiên cứu quy trình sản xuất tế bào tua (dendritic cell-DC) trong trị liệu và

bước đầu thử nghiệm trên động vật” do Viện Pasteur TP. HCM chủ trì và TS. Cao Th

Bảo Vân là chủ nhiệm đề tài năm 2011. Bên cạnh đó liệu pháp miễn d ch tế bào tua này

đã được tiến hành nghiên cứu thử nghiệm trên chuột mang ung thư vú tại Phòng thí

nghiệm Nghiên cứu và ứng dụng Tế bào gốc (Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học

Quốc gia TP.HCM). Kết quả cho thấy, khi không kết hợp với các phương pháp điều tr

khác như phẫu thuật, hóa tr hay xạ tr , việc ghép tế bào tua đã làm khối u vú của chuột

giảm kích thước đến 87,5% so với khối u ban đầu. Ngoài ra, nghiên cứu của TS. Phạm

Văn Phúc về ―Nghiên cứu phân lập và sử dụng tế bào miễn d ch (tế bào tua) trong điều

tr ung thư vú‖ thực hiện trên mô hình chuột người hóa (humanized mouse model). Tuy

nhiên, do tồn tại một số thách thức trong liệu pháp miễn d ch tế bào tua, gần đây các

Exosome tiết từ tế bào tua được phát triển để sử dụng như là một cách thay thế trong

liệu pháp vắc xin, khắc phục những khó khăn. (Bảng 1.2) [50]

Bảng 1.2: So sánh tiềm năng liệu pháp miễn dịch dựa trên DC và Dex

Dendritic cells (DC)

DC-derived Exosome (Dex)

Xác đ nh thành phần phân tử

Thành phần phân tử xác đ nh nghiêm ngặt ở mỗi bệnh nhân

Thành phần phân tử có thể thay đổi, khó xác đ nh trong kiểm tra chất lượng

Phức hệ peptide MHC lớp II bề mặt tế bào ít năng suất thấp

Sự biểu hiện phức hệ peptide MHC lớp II bề mặt Sự ổn đ nh vacxin

Lưu trữ và ổn đ nh tế bào sống trong thời gian dài

Kích thích miễn d ch tế bào NK Đáp ứng ức chế miễn d ch

Giàu phức hệ peptide MHC lớp II bề mặt tế bào, gấp 10-100 lần so với DC. Thành phần lipid của Dex cho phép ổn đ nh tế bào > 6 tháng tại -80°C Biểu hiện trên màng các phối tử thụ thể NK Không đáp ứng tới các phân tử ức chế miễn d ch

DC có thể không biểu hiện đủ các phối tử thụ thể tế bào NK Nhạy với các phân tử ức chế miễn d ch và điều hòa miễn d ch trong vi môi trường khối u (7)

1.4.2. Ứng dụng Exosome trong điều trị ung thƣ

Vào năm 1996 báo cáo đầu tiên về Exosome được tiết từ tế bào lympho B có thể trình diện hiệu quả các phức hệ peptide MHC lớp II (pMHC-II) cho các tế bào T CD4+

in vitro [66]. Sau đó Thery và đồng nghiệp phát hiện ra rằng khi tiêm Exosome có gắn

phức hệ pMHC-II vào chuột cũng tạo nên hiệu ứng in vivo, dẫn đến việc hoạt hóa các tế

bào T CD4 non đặc hiệu kháng nguyên [65]. Bên cạnh đó Zitvogel và đồng nghiệp

(1998) đã chứng minh rằng các Exosome được tiết bởi tế bào tua có nguồn gốc từ tủy

xương mang các phân tử MHC-I, MHC-II và các phân tử đồng kích thích tế bào T [64].

Phân tử MHC-I trên Exosome tiết từ môi trường nuôi cấy tế bào tua trình diện peptide

đặc hiệu khối u, có thể gây đáp ứng các tế bào lympho T gây độc đặc hiệu khối u và ức

chế sự phát triển khối u trong cơ thể. Ba nghiên cứu mang tính bước ngoặt này đã tạo

tiền đề cho nhiều cứu nghiên cứu về vai trò và ứng dụng của Exosome trong liệu pháp

miễn d ch.

Việc sử dụng các Exosome có nguồn gốc từ DC (thường được gọi là vắc-xin ung

thư DExosome hoặc Dex) gần đây đã xuất hiện như một biện pháp thay thế có thể vượt

qua một số nhược điểm trong vắc-xin DC. Đầu tiên, thành phần phân tử Dex dễ xác

đ nh hơn do đó tạo điều kiện xác đ nh chặt chẽ hơn về các thông số kiểm soát chất

lượng. Dex cũng chứa một số lượng lớn các phức hệ MHC loại II-peptide mang lại hiệu

suất cao. Khi so sánh với DC Dex cũng có lợi thế lớn trong việc lưu trữ, với thời gian

bảo quản dài đến 6 tháng khi trữ đông -80 độ C [5].

Trong thập kỷ qua, một số thử nghiệm đánh giá tính khả thi, an toàn và hiệu quả

của vắc-xin ung thư dựa trên Dex đã được thực hiện và kết quả nhìn chung rất đáng

khích lệ. Vào năm 2016 Benjamin và cộng sự thực hiện thử nghiệm lâm sàng pha I sử

dụng Exosome thu từ DC được trưởng thành bằng TLR4L hoặc Interferon IFN gamma

trên 22 bệnh nhân NSCLC trong khoảng thời gian tháng 5/2010 đến tháng 4/2013 [11].

Kết quả cho thấy 22 bệnh nhân có đáp ứng sau 4 lần truyền, thời gian sống không tiến

triển (progression-free survival (PFS)) trung bình là 2.2 tháng. Trong số đó 7 trong 10

bệnh nhân trải qua 9 lần truyền được đánh giá có PFS 4 tháng là 32%. Tỷ lệ sống toàn

bộ (overall survial (OS)) tất cả bệnh nhân là 15 tháng. Một thử nghiệm khác được tiến

hành trên chuột C57BL/6 vào năm 2018 bởi nhóm nghiên cứu Shisheng Chen đã chứng

minh hiệu quả của Dex [16]. EV có nguồn gốc từ DC tủy xương chuột kích thích tăng sinh tế bào T CD8+ cũng như giải phóng cytokine IFN-y sau 48 giờ đồng nuôi cấy DC với T CD8+. Nhóm nghiên cứu đã chứng minh khả năng gây độc đối với tế bào ung thư TC-1 (dòng ung thư biểu mô phổi ở chuột) của T CD8+ sau khi ủ với EV đã qua xử lý

với các kháng nguyên khác nhau. Sử dụng Dex tiêm vào tĩnh mạch chuột cho thấy khả

năng sống kéo dài đáng kể cũng như sự tăng tiết IL-2 và IFN-y từ tế bào lách chuột so

với mẫu đối chứng. Tiến hành tiêm thêm EV vào chuột cho thấy khả năng ức chế sự

tăng trưởng khối u cũng như kéo dài tuổi thọ ở chuột.

1.5. Máu cuống rốn trữ đông – nguồn cung cấp tế bào mono

Vào năm 1974 máu cuổng rốn đã được công bố là nguồn giàu tế bào gốc tạo máu

và tế bào tiền thân được coi là giải pháp điều tr hữu ích cho các bệnh về di truyền, ung

thư máu và suy giảm miễn d ch… Vào năm 1988 ca ghép máu cuống rỗn trữ đông đầu

tiên cho trẻ sơ sinh b mắc bệnh thiếu máu Fancoini được thực hiện tại Pháp [26]. Máu

cuống rốn là máu còn lại trong dây rốn và nhau thai sau khi sinh con, có chứa tất cả các

thành phần của máu gồm: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và huyết tương. Đặc biệt, tỷ lệ

quần thể tế bào mono trong máu cuống rốn đã được chứng minh tương tự với quần thể mono trong máu ngoại vi người trưởng thành, với tỷ lệ phần trăm tế bào CD14+CD16-

trong monocyte lên tới 94%, so với 92% trong máu vi người trưởng thành [57]. Cho đến

nay, một số lượng lớn nghiên cứu được công bố chứng minh tiềm năng tái sinh của các

quần thể tế bào có nguồn gốc từ máu cuống rốn, cùng với đó là hệ thống toàn cầu gồm

485 ngân hàng máu cuống rốn tại 97 quốc gia được thiết lập.

Liệu pháp vắc xin sử dụng exosome từ tế bào tua đã và đang được nghiên cứu trong các thử nghiệm lâm sàng. Việc phân lập các dexosome tự thân đòi hỏi phải lấy một lượng máu lớn từ chính cơ thể người bệnh và các vắcxin tự có thể không phát huy được hết khả năng của các tế bào miễn d ch do các cơ chế lẩn trốn miễn d ch của các tế bào ung thư trên cơ thể người bệnh.

Mỗi ngày có hàng nghìn mẫu máu cuống rốn được sản xuất có thể ứng dụng cho

mục đích y tế. Vì vậy, máu cống rốn là nguồn máu sẵn có để cung cấp tế bào mono cho

liệuu pháp Dexosome, tuy nhiên, khó có thể thu được các mẫu tươi đã phân lập vận

chuyển đến các đơn v cần sử dụng. Hơn thế nữa, việc sử dụng ghép tế bào gốc máu

cuống rốn làm giảm khả năng đào thải do miễn d ch tăng cao sự tương thích HLA giữa

người cho và người nhận [63]. Do đó việc thực hiện các bước phân lập, xử lý, bảo quản

lạnh tế bào là bắt buộc để đảm bảo chất lượng tế bào trong nghiên cứu, thử nghiệm lâm

sàng và điều tr tốt nhất.

Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn bốn đơn v máu cuống rốn trữ đông từ

những người mẹ tình nguyện hiến tặng được lưu trữ trong tủ ni tơ hơi - ngân hàng máu

cuống rốn trữ đông - Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec trong khoảng thời gian từ

tháng 1/2019 đến tháng 6/2019. Tất cả các mẫu máu được xử lý và thực hiện nuôi cấy tại

Trung tâm Công nghệ cao - Bệnh viện đa khoa quốc tế Vinmec. Người mẹ đã được

thông báo đầy đủ về mục đích của nghiên cứu khi đồng ý hiến tặng mẫu máu cuống rốn

theo bản: ―Tự nguyện chấp thuận tham gia hiến tặng mẫu sinh học‖ hình 2.2. Mẹ và trẻ

sơ sinh đều khỏe mạnh và không nhiễm các virus gây bệnh như HIV HBV HCV HPV

CMV… Mỗi một đơn v máu cuống rốn có thể tích khoảng 25ml.

Bốn mẫu máu ngoại vi của người khỏe mạnh tình nguyện hiến tặng cũng được thông

báo đầy đủ về mục đích nghiên cứu. Mẫu máu ngoại v được thu thập độc lập tại Bệnh

viện đa khoa Quốc tế Vinmec sau thời điểm rã đông máu cuống rốn trữ đông 7 ngày.

Hình 2.1: Mẫu máu cuống rốn trữ đông tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec

Hình 2.2: Bản tự nguyện chấp thuận tham gia hiến tặng mẫu sinh học tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec

2.2. Hóa chất và thiết bị

2.2.1. Hóa chất

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

Corning, China

STT Tên hóa chất Hãng sản xuất

Lymphocyte Serum-free Medium, KBM 551

DMEM Medium

Gibco, Mỹ

Ficoll-Paque PLUS 1,077 mg/ml

GE Healthcare Life Sciences, USA

Peprotech, USA

Recombinant Human IL-2

Peprotech, USA

Recombinant Human GM-CFS

Peprotech, USA

Recombinant Human IL-4

Peprotech, USA

Recombinant Human TNF-α

PBS (Phosphate Buffered Saline)

Gibco, Mỹ

Abliance, France

Turck

Gibco, Mỹ

Trypan blue

Gibco, Mỹ

Trypsin/EDTA

Dojindo, Nhật Bản

Calcein-AM

Kháng thể kháng anti HLADR – FITC

Beckman Coulter, Mỹ

Kháng thể kháng CD40 – PE

Beckman Coulter, Mỹ

Kháng thể kháng CD80 – PE

Beckman Coulter, Mỹ

Kháng thể kháng CD86 – PE

Beckman Coulter, Mỹ

Kháng thể kháng CD14 – PC7

Beckman Coulter, Mỹ

Kháng thể kháng CD11c – APC

Miltenyi Biotech Đức

Kháng thể kháng CD123 – APC750

Miltenyi Biotech Đức

Isotye control IgG1 – FITC

Beckman Coulter, Mỹ

Isotye control IgG1 – PE

Beckman Coulter, Mỹ

Isotye control IgG1 – PC7

Beckman Coulter, Mỹ

Isotye control IgG1 – APC

Miltenyi Biotech Đức

Isotye control IgG1 – APC750

Miltenyi Biotech Đức

CD4 Microbeads human

Miltenyi Biotech, Mỹ

CD8 Microbeads human

Miltenyi Biotech, Mỹ

Fetal Bovinve Serum

Gibco, Mỹ

Thermo Scientific, Mỹ

DCN 90

Merck Đức

27 CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit

Ni tơ lỏng

Việt Nam

2.2.2. Thiết bị

Bảng 2.1: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Bể ổn nhiệt

Memmert Đức

Bình chứa nito lỏng

Taylor-Wharton, Mỹ

Hệ thống Terascan VCP2

Minervatech, Nhật Bản

Kính hiển vi soi ngược

Olympus, Nhật Bản

Glomax

Promega, Mỹ

Máy ly tâm

Beckman Coulter, Mỹ

Máy siêu ly tâm XPN 100

Beckman Coulter, Mỹ

Máy phân tích tế bào theo dòng chảy Navios

Beckman Coulter, Mỹ

Tủ an toàn sinh học cấp II

Thermo Scientific, Mỹ

Tủ nuôi cấy tế bảo

Thermo Scientific, Mỹ

Tủ 4oC

Panasonic, Nhật Bản

Tủ âm -20oC

Panasonic, Nhật Bản

Tủ âm -80 oC

Panasonic, Nhật Bản

Macs Separator

Miltenyi Biotech Đức

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất

Vortex

Dragonlab, Trung Quốc

2.2.3. Dụng cụ và vật tƣ tiêu hao

Bảng 2.2: Dụng cụ và vật tƣ sử dụng trong thí nghiệm

STT Vật tƣ tiêu hao Hãng sản xuất

Falcon, Mỹ 1

Chai nuôi cấy 25cm2 Chai nuôi cấy 75cm2 Falcon, Mỹ

2 Ống ly tâm (1,5ml, 15ml, 50ml, 200ml) Falcon, Mỹ

Pipette (5ml, 10ml, 25ml, 50ml) Falcon, Mỹ 3

Pipetman (10μl 100μl 200μl 1000μl) Eppendorf Đức 4

Đầu tip (10μl 100μl 200μl 1000μl) Labcon, USA 5

Pipet aid Eppendorf Đức 6

Xylanh (10ml, 50ml) Terumo, Nhật Bản 7

Kim 18G Terumo, Nhật Bản 8

Đĩa 96 giếng Corning, Mỹ 9

Ống eppendorf (1,8ml, 5ml) Corning, Mỹ 10

Ống lưu trữ tế bào Cryotube Corning, Mỹ 11

Buồng đếm tế bào Incyto, Hàn Quốc 12

Màng lọc 0.22µm Corning, Mỹ 13

LS Column Miltenyi Biotech Đức 14

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện như quy trình sau đây:

Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm

2.3.1. Nuôi cấy dòng tế bào ung thƣ biểu mô phế nang phổi A549

- Tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ A549 (ATCC) được nuôi cấy trong môi trường DMEM chứa 10% FBS về thể tích, tại 370C. Mật độ nuôi cấy: 5.000 tế bào/cm2

- Tế bào được thu hoạch hoặc cấy chuyển khi đạt mật độ bao phủ chai nuôi cấy từ 80-

90%. Khi nuôi cấy thay hoàn toàn môi trường mỗi hai ngày/lần.

2.3.2. Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số từ dòng tế bào ung

thƣ biểu mô phế nang phổi A549

- Chuẩn b 50×106 tế bào A549 trong 5ml PBS 1X trong ống ly tâm 15ml

- Làm lạnh (trong ni tơ lỏng) 5 phút và rã đông (trong bể ổn nhiệt 37 oC) 5 phút, thực

hiện chu kỳ làm lạnh – rã đông ít nhất 10 lần

- Kiểm tra tỷ lệ sống chết của tế bào bằng trypan blue. Tại chu kỳ làm lạnh/rã đông

cuối cùng tỷ lệ chết của tế bào phải đạt 100%

- Ly tâm ở 2.000×g, 10 phút, 4oC

- Thu d ch nổi, loại bỏ phần xác tế bào.

- Đ nh lượng protein bằng phương pháp Bradford: dựa trên nguyên tắc về sự thay đổi

- Lọc dung d ch qua màng lọc 0,22µm thu được protein cần tách chiết

bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức

với protein. Trong dung d ch tính axit, thuốc nhuộm hấp thụ cực đại bước sóng 465

nm. Khi kết hợp với protein, phức hợp thuốc nhuộm – protein có bước sóng hấp thụ

tại 595 nm. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong

- Xác đ nh nồng độ protein trong mẫu: dựa theo đường chuẩn dung d ch protein đã

mẫu. Tiến hành đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ kế xác đ nh giá tr OD

biết trước nồng độ (albumin từ huyết thanh bê (Bovine surem albumin – BSA)). Dải

chuẩn protein được thực hiện theo như bảng dưới:

Bảng 2.3: Chuẩn bị mẫu chuẩn dung dịch protein

Ống

Thể tích PBS thêm vào (μl) 240

Thể tích BSA (μl) 60 (stock)

Nồng độ BSA sau pha loãng (μg/ml) 2000

Thể tích BSA sau pha loãng (μl) 300

255 45 (stock) 1500 300 B

270 30 (stock) 1000 300 C

150 150 (B) 750 300 D

150 150 (C) 500 300 E

150 150 (E) 250 300 F

150 150 (F) 125 300 G

240 60 (G) 25 300 H

- Pha loãng protein tổng số A549 10 lần bằng PBS

- Hút 30 BSA ở các nồng độ hoặc protein tổng số đã pha loãng vào các ống, mỗi

điều kiện lặp lại 3 lần

- Bổ sung vào mỗi ống 1,5ml Bradford và trộn đều. Lưu ý trước đó phải hút đủ lượng

Bradford cần dùng ra 1 ống và để ở nhiệt độ phòng ít nhất 15 phút

- Ủ hỗn hợp trên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng trước khi tiến hành đo quang phổ

- Đo quang phổ tại bước sóng 595 nm bằng máy và phân tích kết quả trên máy, dựng

đường chuẩn từ kết quả của protein chuẩn và tính toán nồng độ protein A549

- Bảo quản protein tổng số ở -80oC để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.3. Rã đông máu cuống rốn trữ đông

- Đơn v máu cuống rốn trữ đông sau khi đưa ra khỏi tủ ni tơ hơi ngay lập tức được đưa vào bể ủ nhiệt 37oC rã đông nhanh nhất có thể (thường ít hơn 2 phút) và không

hoàn toàn

- Bổ sung dung d ch RPMI 1640 chứa 20% FBS theo thể tích để pha loãng lượng máu chứa trong túi. Lưu ý dung d ch RPMI 1640 được để ở tủ lạnh 4oC trước khi sử

dụng

- Hỗn hợp dung d ch được chia thành 2 ống, ly tâm tại 400×g trong 10 phút ở 4oC

- Loại bỏ d ch nổi, hòa tan phần tế bào lắng dưới đáy ống bằng dung d ch PBS chứa

20% FBS theo thể tích, chuẩn b cho bước phân lập tế bào đơn nhân. Lưu ý dung d ch PBS được để ở tủ lạnh 4oC trước khi sử dụng

2.3.4. Phân lập tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn trữ đông

- Dung d ch thu được ở trên được cho vào ống đã có sẵn dung d ch Ficoll theo tỷ lệ

2:1 về thể tích.

- Ly tâm ở 840×g trong 20 phút tăng tốc chậm, không phanh. Sau ly tâm, dung d ch

trong ống sẽ phân thành 4 lớp như hình 2.4.

- Lớp trên cùng màu đỏ nhạt: dung d ch RPMI 1640. Lớp thứ hai là Buffy coat chứa

tế bào đơn nhân gồm tế bào mono và lympho. Lớp màu trắng trong đó là dung d ch

Ficoll và lớp cuối cùng là các tế bào hồng cầu bám dưới đáy ống.

- Thu lớp tế bào đơn nhân: Sử dụng pipet hút lớp tế bào đơn nhân vào ống mới. Lưu ý

hút vòng quanh và chậm để lấy được toàn bộ lớp tế bào đơn nhân tránh sục với lớp

Ficoll phía dưới

Hình 2.4: Máu cuống rỗn trữ đông chia làm 4 phần sau ly tâm với Ficoll

- Rửa tế bào đơn nhân: Bổ sung PBS vào ống chứa tế bào đơn nhân đã thu để đạt thể

tích 45ml mỗi ống và ly tâm 640×g trong 10 phút

- Sau ly tâm loại bỏ d ch nổi, bổ sung PBS để đạt thể tích 40ml mỗi ống, ly tâm

270×g trong 8 phút, thu tế bào dưới đáy ống

- Xác đ nh số tế bào đơn nhân: Nhuộm tế bào thu được với thuốc nhuộm Turck theo tỉ

MNC =

2 Thể tích (ml)

lệ 1:1 về thể tích và đếm trên buồng đếm tế bào. Số lượng tế bào được tính như sau:

2.3.5. Nuôi cấy, biệt hóa và trƣởng thành tế bào đơn nhân thành tế bào

tua

- Tế bào đơn nhân được nuôi cấy trong môi trường Lymphocyte serum-free KBM 551

với mật độ 2×106 tế bào/ml trong vòng 2 giờ ở 37oC, 5% CO2

- Sau thời gian 2 giờ, loại bỏ các tế bào không bám dính, thu nhận các tế bào bám

dính.

- Bổ sung các cytokine GM-CSF và IL-4 vào môi trường KBM 551 theo nồng độ lần

lượt là 1000 U/ml và 500 U/ml nuôi cấy tế bào bám dính.

- Tế bào được chăm sóc 3 ngày 1 lần. Vào này thứ 3, thay 50% thể tích môi trường

bằng môi trường mới

- Vào ngày thứ 5, bổ sung hoặc không bổ sung kháng nguyên A549 với nồng độ

protein là 50 µg/ml ủ qua đêm.

- Ngày tiếp theo bổ sung cytokine TNF-α với nồng độ 500 U/ml vào môi trường nuôi

cấy, ủ tế bào thêm một ngày sau đó thu hoạch.

2.3.6. Thu hoạch tế bào tua DC và môi trƣờng nuôi cấy tế bào tua DC

a) Thu hoạch môi trƣờng nuôi cấy tế bào tua DC

- Thu toàn bộ môi trường nuôi cấy tế bào DC ra các ống mới

- Ly tâm tại 270×g trong 8 phút

- Loại bỏ xác tế bào, thu d ch nổi, chuẩn b cho phân lập Exosome

b) Thu hoạch tế bào tua

- Chai nuôi cấy tế bào DC sau khi hút môi trường nuôi cấy ra được rửa bằng PBS 2

lần để loại bỏ hoàn toàn môi trường

- Bổ sung trypsin, phủ toàn bộ bề mặt chai nuôi cấy (3ml trypsin với chai T75) - Ủ ấm chai nuôi cấy tại 37oC, 5% CO2 trong 3 phút, kiểm tra cho đến khi thấy tế bào

bắt đầu bong ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy, bổ sung 3ml môi trường RPMI 1640 để

bất hoạt trypsin

- Thu toàn bộ tế bào ra các ống mới, ly tâm tại 270×g trong 8 phút để loại d ch nổi,

thu tế bào.

- Đếm tế bào: Nhuộm tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo tỉ lệ 1:1 về thể tích và

đếm trên buồng đếm tế bào. Số lượng tế bào được tính như sau:

Số lượng tế bào DC = 2 Thể tích (ml)

- Tế bào thu được gồm tế bào tua có cảm ứng với kháng nguyên DC và tế bào tua

không cảm ứng kháng nguyên DCno

2.3.7. Thu nhận Exosome từ môi trƣờng nuôi cấy tế bào tua máu cuống

rốn trữ đông

- Phân lập Exosome: Môi trường nuôi cấy DC/DCno được thu vào các ống ly tâm

(khoảng 45ml), sử dụng phương pháp siêu ly tâm để phân lập Exosome.

- Ly tâm môi trường thu được tại 270×g trong 8 phút tại 20oC để loại bỏ cặn là xác tế

bào và các mảnh vỡ tế bào, thu phần d ch nổi.

- D ch nổi được ly tâm tiếp tại 2.500×g trong 20 phút tại 4oC để loại cặn tế bào là các

thể Apototic, thu phần d ch nổi vào các ống siêu ly tâm, cân chính xác (sai số

±0,001g)

- Ly tâm siêu tốc phần d ch nổi tại 16.500×g trong 30 phút tại 4oC loại cặn là các

bóng bào kích thước micro (Microvesicle), thu d ch vào các ống siêu ly tâm mới,

cân chính xác (sai số ±0,001g)

- Ly tâm siêu tốc phần d ch nổi trên tại 100.000×g trong 90 phút tại 4oC, loại bỏ phần

d ch nổi. Dùng pipet hút từ từ, nhẹ nhàng để lại phần d ch 200 µl, thu cặn là

Exsosome vào ống siêu ly tâm mới

- Bổ sung 2ml môi trường KBM 551 vào ống siêu ly tâm mix đều, ly tâm siêu tốc

100.000×g trong 90 phút tại 4oC để rửa, loại bỏ các protein có trong ống

- Sau ly tâm, dùng pipet hút nhẹ nhàng để loại bỏ d ch nổi để lại phần d ch 200µl,

mix, hút chuyển sang ống 1,5ml để sử dụng cho bước tiếp theo hoặc lưu trữ và bảo quản tại -20oC hoặc -80oC

- Exosome thu được gồm hai loại: Exosome từ môi trường nuôi cấy DC là Exo và

Exosome từ môi trường nuôi cấy DCno là Exono.

2.3.8. Phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi

a) Phân lập tế bào đơn nhân máu ngoại vi

- 15ml máu ngoại vi người khỏe mạnh sau khi được pha loãng với PBS, ly tâm cùng

với Ficoll theo tỷ lệ 2:1 về thể tích tại 840×g trong 20 phút, gia tốc chậm, không

phanh.

- Sau ly tâm, dung d ch chia làm 4 phần như hình 2.5: Lớp trên cùng màu vàng nhạt:

hỗn hợp dung d ch plasma và PBS. Lớp thứ hai là Buffy coat chứa tế bào đơn nhân

gồm tế bào mono và lympho. Lớp màu trắng trong đó là dung d ch Ficoll và lớp

cuối cùng là các tế bào hồng cầu

Hình 2.4: Máu ngoại chia làm 4 phần sau ly tâm với Ficoll

- Thu lớp tế bào đơn nhân: Sử dụng pipet hút lớp tế bào đơn nhân vào ống mới. Lưu ý

hút vòng quanh và chậm để lấy được toàn bộ lớp tế bào đơn nhân tránh sục với lớp

Ficoll phía dưới

- Rửa tế bào đơn nhân: Bổ sung PBS vào ống chứa tế bào đơn nhân đã thu để đạt thể

tích 45ml mỗi ống và ly tâm 640×g trong 10 phút

- Sau ly tâm loại bỏ d ch nổi, bổ sung PBS để đạt thể tích 40ml mỗi ống, ly tâm

300×g trong 10 phút, thu tế bào dưới đáy ống

- Xác đ nh số tế bào đơn nhân: Nhuộm tế bào thu được với thuốc nhuộm Turck theo tỉ

MNC =

2 Thể tích (ml)

lệ 1:1 về thể tích và đếm trên buồng đếm tế bào. Số lượng tế bào được tính như sau:

b) Phân lập tế bào Lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi

- Các tế bào đơn nhân thu được sau ly tâm được hòa tan trong dung d ch PBS chứa

0,5% FBS về thể tích tại 2-8oC theo tỷ lệ 80µl/107 tế bào

- Bổ sung 20µl CD4 và 20µl CD8 Microbead vào ống tế bào trên với tỷ lệ 20 µl/107 tế

bào mix đều và ủ trong 15 phút tại 2-8oC

- Bổ sung thêm dung 2ml dung d ch đệm mix đều và ly tâm ống tế bào tại 300×g

trong 10 phút. Lọai bỏ d ch nổi, thu cặn tế bào.

- Bổ sung dung d ch đệm để đạt mật độ 108 tế bào/500µl

- Nhỏ toàn bộ tế bào trên từ từ đi qua cột từ LS (Miltenyi Đức) được cố đ nh trên giá

từ. Lưu ý: cột từ phải được rửa bằng dung d ch đệm rửa trước khi cho tế bào đi qua.

Tại đây các tế bào được gắn marker CD4 và CD8 sẽ được giữ lại trên cột từ.

- Rửa cột bằng dung d ch rửa 3 lần (3ml/lần) để loại bỏ các thành phần bám trên cột

từ không đặc hiệu.

- Đưa cột từ ra khỏi giá từ, nhỏ 5ml dung d ch rửa lên cột từ dùng pittong đẩy mạnh,

d ch chảy qua là dung d ch chứa tế bào Lympho T cần phân tách.

- Ly tâm ống tế bào chứa tế bào Lympho T tại 270×g trong 8 phút, loại bỏ d ch nổi và

thu cặn tế bào, sử dụng cho các bước thí nghiệm tiếp theo.

2.3.9. Đánh giá ảnh hƣởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trƣởng

của tế bào lympho T

- Tế bào Lympho T phân lập từ máu ngoại vi được nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh

quang carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE-Thermo Scientific) trước khi cảm ứng với DC và Exosome trong đĩa nuôi cấy 12 giếng với mật độ 5mM/106 tế

bào.

- Tế bào Lympho T cảm ứng với DC/DCno theo tỷ lệ tế bào Lympho T:DC/DCno = 4:1 trong môi trường KBM 551 chứa 50U/ml IL-2 với mật độ 6×105 tế bào/giếng.

Lặp lại mỗi giếng 3 lần (Bảng 2.5)

- Exosome cũng được cảm ứng với cùng số lượng tế bào lympho T cảm ứng với

DC/DCno theo tỷ lệ 1:4 về thể tích. Lặp lại mỗi giếng 3 lần (Bảng 2.5)

- Tế bào được nuôi cấy 4 ngày tại 37oC trong 5% CO2, bổ sung thêm 1/2 môi trường

ban đầu nuôi cấy mỗi hai ngày/lần.

- Kết thúc nuôi cấy đo cường độ tín hiệu huỳnh quang CFSE là cách chỉ th gián tiếp

số lần phân chia tế bào Lympho T trên máy phân tích tế bào theo dòng chảy

Navious

Bảng 2.5: Thiết kế thí nghiệm tế bào Lympho T cảm ứng với DC và Exosome

trên đĩa 12 giếng

Đĩa 1:

Med Tcell-DC Tcell-DCno DC only

Đĩa 2:

Tcell-Exo Tcell-Exono Tcell only

Trong đó:

 Tcell-DC: Tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DC cảm ứng kháng

nguyên

 Tcell-DCno: Tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DC không cảm ứng

kháng nguyên

 Tcell-Exo: Tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exo từ môi trường nuôi

cấy DC có cảm ứng kháng nguyên

 Tcell-Exono: Tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exo từ môi trường

nuôi cấy DC không cảm ứng kháng nguyên

 DC only: Môi trường nuôi cấy chỉ chứa tế bào DC

 Tcell only: Môi trường nuôi cấy chỉ chứa tế bào Lympho T

 Med: Môi trường nuôi cấy

2.3.10. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thƣ biểu mô phế nang phổi

A549 của tế bào lympho T đã cảm ứng

- Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của các tế bào lympho T sau cảm ứng với

DC/DCno và Exo/Exono được thực hiện trên đĩa 96 giếng, thể tích mỗi giếng

V=150µl

- Tế bào ung thư phổi A549 đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Calcein-AM

(DoJindo, Japan), cấy lên đĩa với mật độ ban đầu là 3.000 tế bào/giếng

- Tế bào lympho T sau khi cảm ứng với DC/DCno và Exo/Exono được bổ sung vào

đĩa với các tỷ lệ tế bào lympho T/A549 lần lần là 12,5:1, 25:1, 50:1 trong môi

trường RPMI 1640. Mỗi tỷ lệ được lặp lại 3 lần.

- Sau thời gian 2 giờ ủ trong 37ºC, 5% CO2, tế bào được ly tâm tại 50×g, 2 phút. Hút bỏ 80µl môi trường cũ bổ sung 80µl môi trường mới mix đều sau đó ly tâm tại

50×g, 2 phút

Bảng 2.6: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng gây độc tế bào A549 của tế

B Med

Pos

Tcell-DC

Tcell-DCno

Tcell only

Pos

C Med

D Med

Pos

12.5

Tcell-Exo

Tcell-Exono

Neg

G Neg

Neg

12.5

bào Lympho T

Trong đó:

 Med: Giếng chỉ chứa môi trường



 Pos=positive control: Giếng chứa tế bào A549 trong môi trường RPMI 1640 sau đó được bổ sung DCN90 Neg=negative control: Giếng chứa tế vào A549 trong môi trường RPMI 1640

- Tỷ lệ chết của tế bào ung thư được xác đ nh bằng cường độ tín hiện huỳnh quang

trước và sau khi ủ bằng máy đo huỳnh quang Terascan VPC2 (Minervatech - Nhật

% cytotoxicity =

x 100

Bản) theo công thức:

2.3.11. Phƣơng pháp phân tích tế bào theo dòng chảy

- Tại thời điểm ngày 0, ngày 5, ngày 7 DC được xác đ nh tỷ lệ kháng nguyên bề mặt

bằng các kháng thể gắn huỳnh quang và máy đếm dòng chảy tế bào bao gồm CD14,

CD40, CD56, CD80, CD86, HLA-DR

- Tế bào Lympho T máu ngoại vi được phân tích các kháng nguyên bề mặt gồm CD3,

CD4, CD8 (Miltenyi Biotec) sau khi phân lập bằng máy đếm dòng chảy tế bào

- Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm FlowJo v.X.0.7

- Các bước tiến hành:

 Chuẩn b tế bào: Ly tâm tế bào tại 300×g trong 5 phút, loại bỏ d ch nổi. Pha

loãng tế bào bằng PBS để đạt mật độ 106 – 3×106 tế bào/ml

 Chuẩn b các ống chứa kháng thể như bảng 2.7

Bảng 2.7: Kháng thể sử dụng trong phƣơng pháp phân tích tế bào theo dòng chảy

(Ghi chú: KT - Kháng thể)

Mẫu

Ống IgG

Ống 1

Ống 2

Ống 3

Isotype control IgG1-FITC

KT kháng HLA.DR-FITC

Isotype control IgG1-PE

KT kháng CD80- PE

KT kháng CD40-PE

KT kháng CD86-PE

1. MNC phân lập từ máu xuống rốn 2. mDC

KT kháng CD14- PC7

Isotype control IgG2a-PC7 Isotype control IgG-APC Vio

1. MNC phân lập từ máu ngoại vi

KT kháng CD4-APC Vio

Isotype control IgG1-FITC

KT kháng CD8-FITC

Isotype control IgG2a-PC7

KT kháng CD3-Vioblue

4µl mỗi loại

Thể tích 4µl mỗi loại 4µl mỗi loại  Bổ sung 100 μl tế bào vào mỗi ống chứa kháng thể, trộn đều và ủ trong tối

15-30 phút

 Bổ sung dung d ch ly giải hồng cầu đối với mẫu MNC phân lập từ máu

cuống rỗn trữ đông và máu ngoại vi

 Bổ sung vào mỗi ống chứa tế bào 2ml PBS 1X, trộn đều và ly tâm ở 300×g

trong 5 phút, loại bỏ d ch nổi, thu tế bào.

 Bổ sung 300μl PBS trộn đều và đưa các ống vào máy flow cytometry và

chạy chương trình phân tích

2.3.12. Phƣơng pháp xử lý số liệu

- Kết quả dấu ấn bề mặt tế bào được phân tích bằng phần mềm Flowjo vX.07

- Các dữ liệu được phân tích theo phương pháp thống kê Student‘s t-test. Tr số p <

0,05 biểu th sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả thu nhận protein tổng số từ dòng tế bào ung thƣ A549

- Thu nhận protein tổng số từ dòng tế bào ung thư A549 được thực hiện sau 10 chu kỳ làm lạnh trong nito lỏng và rã đông trong bể ổn nhiệt 37oC, tiến hành nhuộm tế bào

với trypan blue theo tỷ lệ 1:1 và kiểm tra dưới kính hiển vi để xác đ nh tỷ lệ sống

chết. Kết quả quan sát thấy tỷ lệ chết của tế bào đạt 100%, tuy nhiên vẫn còn một số

tế bào chưa b phá vỡ màng

- Ly tâm để thu lấy d ch nổi chứa protein tổng số tế bào. D ch nổi được lọc qua màng

lọc 0 2 µm để loại bỏ vi khuẩn và các yếu tố gây nhiễm, nếu có.

- Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 595nm để lập đường chuẩn và tính nồng độ

protein A549.

- Kết quả tách chiết protein tổng số trong 3 lần thực hiện thí nghiệm như sau:

 Lần 1: 1,518 μg/ml

 Lần 2: 1,910 μg/ml

 Lần 3: 1,403 μg/ml

- Sau khi tách chiết, dung d ch protein được chia nhỏ vào các ống eppendorf 1,5ml và

được bảo quản trong PBS ở -80 oC để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.

- Một số nghiên cứu sử dụng peptide thương mại với mục đích cảm ứng kháng

nguyên đặc hiệu với tế bào tua cũng như Exosome tiết từ tế bào tua.. Tuy nhiên liệu

pháp này vẫn còn một số nhược điểm như việc sử dụng các peptide thương mại

không bao quát được hết các kháng nguyên ung thư cũng như không hoạt hóa được

các tế bào miễn d ch T và B. Một số nghiên cứu đã cho thấy chính các Dex cảm ứng

với protein ung thư chứ không phải Dex cảm ứng bằng peptide, mới có khả năng

kích thích đáp ứng miễn d ch ở tế bào TCD4+ và tế bào B [45]. Vì vậy để khắc

phục nhược điểm trên, trong nghiên cứu này các tế bào tua sẽ được cảm ứng với các

protein ung thư thay vì các peptide ung thư.

3.2. Rã đông máu cuống rốn trữ đông

- Bốn mẫu máu cuống rốn trữ đông được rã đông tại các thời điểm khác nhau, sử

dụng phương pháp ly tâm theo tỷ trọng với Ficoll để thu lớp Buffy coat. Tỷ trọng

của Ficoll (1 077) cao hơn tỷ trọng của tế bào đơn nhân nhưng nó lại thấp hơn tỷ

trọng của hồng cầu. Vì vậy, trong quá trình ly tâm, hồng cầu sẽ lắng xuống đáy ống

ly tâm, tế bào đơn nhân sẽ nằm ở mặt trên lớp Ficoll. Số lượng tế bào đơn nhân sau

khi phân lập từ máu cuống rốn trữ đông được kiểm tra tỷ lệ sống chết bằng thuốc

nhuộm Trypan Blue.

- Kết quả tỷ lệ tế bào sống ở các lần rã đông máu cuống rốn như sau:

 Lần 1: 24,29%

 Lần 2: 22,06%

 Lần 3: 37,7%

 Lần 4: 27,6%

- Kết quả tỷ lệ sống tế bào đơn nhân sau bốn lần rã đông tương tự nhau, khoảng 30%.

 Sau khi rã đông máu cuống rốn trữ đông tỷ lệ tế bào sống đạt 27.9  6.9 %

Tuy nhiên, kết quả này còn tương đối thấp so với kết quả nghiên cứu trước đây của

Antoniewicz-papis và cộng sự (2013) [6]. Quan sát màu sắc lớp Buffy coat sau ly

tâm máu cuống rốn trữ đông nhận thấy lớp này có màu đỏ nhạt (Hình 2.4), là màu

sắc của tế bào hồng cầu. Sự xuất hiện của tế bào hồng cầu (tế bào chết trong quá

trình rã đông) trong lớp Buffy coat làm tăng giả số lượng tế bào đơn nhân vì vậy

giảm tỷ lệ sống tế bào thu được sau quá trình rã đông.

3.3. Phân lập tế bào mono từ máu cuống rốn trữ đông

- Tế bào đơn nhân MNC sau khi xác đ nh tỷ lệ sống chết được nhuộm với thuốc

nhuộm Turck để xác đ nh số lượng tế bào. Dung d ch Turck chứa chất nhuộm màu

tím gentian và 1-2% axit acetic, có tác dụng phá hủy màng tế bào hồng cầu và bắt

màu với nhân của các tế bào bạch cầu. Vì vậy, MNC sẽ bắt màu tím, các tế bào

hồng cầu không nhân không bắt màu thuốc nhuộm (hình 3.1)

Hình 3.1: Tế bào trên buồng đếm hồng cầu khi nhuộm với thuốc nhuộm Turck

Mũi tên đỏ: tế bào MNC bắt nhuộm thuốc màu tím; Mũi tên vàng: hồng cầu không

bắt màu thuốc nhuộm; Mũi tên xanh: các mảnh vỡ xác tế bào hoặc tiểu cầu.

- Số lượng MNC thu được kết quả như sau: (Bảng 3.1)

Bảng 3.1: Số lƣợng MNC thu đƣợc từ máu cuống rỗn trữ đông

Tỷ lệ (%)

Mẫu

MNC/tế bào sống

Số lượng tế bào sống (× 106)

Số lượng MNC (× 106)

48,29 1 323 156

44,94 2 316 142

45,53 3 850 387

47,91 4 263 126

- Dựa theo kết quả thí nghiệm, MNC chiếm tỷ lệ từ 44 94% đến 48,29% trong tổng

số tế bào lớp Buffy coat, còn lại là một lượng lớn tế bào hồng cầu, quan sát rõ ràng

- Gieo tế bào đơn nhân vào chai nuôi cấy với mật độ 2×106 tế bào/ml môi trường

trên buồng đếm tế bào (Hình 3.1)

KBM 551. Sau 2 giờ, thu tế bào bám dính và loại bỏ d ch nổi môi trường nuôi cấy.

Dựa theo quan sát, một lượng lớn tế bào trôi nổi đã được loại bỏ là các tế bào

lympho, hồng cầu và tế bào mono không bám dính. Phần tế bào quan sát trên chai

nuôi cấy là các tế bào mono đã bám dính (Hình 3.2)

Hình 3.2: Tế bào đơn nhân trƣớc và sau khi loaị bỏ tế bào trôi nổi sau 2 giờ nuôi cấy

A: Tế bào đơn nhân nuôi cấy trước khi loại bỏ d ch nổi; B: Tế bào mono bám

dính sau 2 giờ nuôi cấy được loại bỏ d ch nổi µ

- Để xác đ nh tỷ lệ phân lập tế bào đơn nhân bằng phương pháp bám dính tế bào đơn

nhân trước và d ch nổi tế bào sau khi phân lập được phân tích dòng chảy tế bào

(Flow cytometry). Dựa theo hai chỉ số: kích thước tế bào (forward scatter – FSC) và

độ phức tạp nhân (side scatter – SSC), tỷ lệ tế bào mono bám dính được xác đ nh là

hiệu số tế bào đơn nhân trước phân lập và tế bào đơn nhân từ d ch nổi môi trường

nuôi cấy (Hình 3.3) bằng phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy. Cụ thể,

phần trăm tế bào mono được xác đ nh trước thời gian ủ 2 giờ trong môi trường

KBM 551 chiếm tỷ lệ cao hơn so với phần trăm tế bào mono có trong d ch nổi tế

bào.

- Hiệu suất phân lập tế bào mono qua quá trình phân lập bằng phương pháp bám dính

Hiệu suất = (

)

là 35,8±11,3 (bảng 3.2) theo công thức:

Monocytes_pre: tế bào mono trước khi phân lập. Monocytes_post: tế bào mono từ

d ch nổi tế bào

Hình 3.3: Quần thể tế bào trƣớc và sau khi phân lập tế bào mono

Bảng 3.2: Hiệu suất phân lập tế bào mono

GTTB: giá tr trung bình

ĐLC: độ lệch chuẩn

Tỷ lệ tế bào mono

Hiệu suất phân lập

Mẫu

dịch nổi tế bào (%)

monocytes (%)

trƣớc khi phân lập (%)

10,1

6,1

40,1

1

11.8

5.8

50,8

2

28,4

20,5

27,8

3

16,9

9,5

43,8

4 Trung bình

19,0±8,5

11,9±7.6

35,8±11,3

(GTTB ĐLC)

3.4. Kết quả biệt hóa tế bào mono thành tế bào DC

3.4.1. Hình thái tế bào

- Tế bào mono trong quá trình nuôi cấy được quan sát hình thái ở 3 giai đoạn để thấy

rõ sự thay đổi về hình dạng tế bào mono trong môi trường biệt hóa thành tế bào DC:

 Giai đoạn 1: Ngày 1, sau khi phân lập tế bào mono

 Giai đoạn 2: Ngày 6, sau 6 ngày nuôi cấy biệt hóa tế bào mono thành

DC chưa trưởng thành (iDC) (chưa bổ sung TNF-α) quan sát hình thái

của DC, DCno và so sánh với tế bào mono.

 Giai đoạn 3: Ngày 7, sau 7 ngày nuôi cấy biệt hóa tế bào mono thành

DC (bổ sung TNF-α) quan sát hình thái của DC/DCno và so sánh với

iDC

- Tế bào mono là tế bào có dạng hình cầu khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét

sẽ thấy rõ các gờ trên bề mặt. Trong nghiên cứu này, khi quan sát hình thái tế bào

dưới kính hiển vi vào ngày 0, tế bào mono là các tế bào bám dính, có dạng tròn,

không có màu kích thước khá đồng nhất đường kính trung bình 10µm (Hình

3.2B). Sau 3 ngày nuôi cấy tế bào trong môi trường KBM 551 có chứa GM-CSF và

IL-4, một nửa môi trường mới được bổ sung thay thế cho một nửa môi trường cũ.

Tại thời điểm này, xuất hiện tế bào lớn về kích thước không đồng đều ở cả bề mặt

bám dính và trong d ch nổi. Sau 24 giờ tiếp theo, tế bào được bổ sung (hoặc không

bổ sung) protein tổng số từ dòng tế bào ung thư biểu mô phổi A549. Vào ngày thứ

6 dưới sự kich thích của protein đóng vai trò là các kháng nguyên, tế bào được cảm

ứng có kích thước lớn hơn xuất hiện các tua ngắn đường kính khoảng 25µm là

các DC chưa trưởng thành (Hình 3.4A). Tiếp tục bổ sung vào môi trường nuôi cấy

TNF-α. Tại ngày thứ 7, một lượng lớn tế bào xuất hiện dạng mỏng có hai đuôi dài

rõ rệt, trong khi một số tế bào xuất hiện hình thái với nhiều tua dài không đồng nhất

như hình sao (Hình 3.4B 3.4C). Sau 24 giờ nuôi cấy dưới sự kích thích của TNF-α

quá trình tưởng thành DC từ iDC thành mDC đã diễn ra với sự gia tăng về kích

thước tế bào cũng như chiều dài các tua (trung bình từ 10-40µm).

Hình 3.4: Hình thái tế bào mono biệt hóa thành tế bào DC

A: tế bào DCnon với kích thước lớn, tua ngắn (ngày thứ 6); B, C: tế bào DC

trưởng thành vào ngày thứ 7 với (B) kích thước lớn, hai tua dài hoặc (C) kích

thước lớn, nhiều tua ngắn.

- Trong nghiên cứu này, DC biệt hóa từ tế bào mono máu cuống rốn trữ đông có dạng

mỏng đuôi dài tương tự như DC được mô tả bởi Alia M. Aldahlawi và cộng sự

miêu tả vào năm 2016 khi nuôi cấy tế bào trong môi trường KBM 551 có bổ sung

GM-CSF và IL-4 [2]. Các tế bào hình sao đã được miêu tả ở những báo cáo trước

trong nghiên cứu của Smita Nair, Hui-Jun Yi và Guang-Xiu Lu, Nowruz Delirezh

và cộng sự [21, 44, 73]. Dựa trên các loại và nồng độ cytokine được sử dụng cũng

như thời gian nuôi cấy, hình thái DC có sự đa dạng khác nhau.

3.4.2. Các dấu ấn bề mặt tế bào

- Để xác đ nh sự biệt hóa của tế bào đơn nhân thành tế bào tua, ngoài việc quan sát

hình thái tế bào qua kính hiển vi, tại thời điểm nuôi cấy tế bào mono ngày đầu tiên,

tế bào iDC ngày 6 và tế bào mDC ngày 7, tế bào được xác đ nh các dấu ấn bề mặt

CD123 bằng phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy (Hình 3.5B). Dựa vào hai

bởi các kháng thể bề mặt bao gồm CD14, CD80, HLA-DR, CD40, CD56, CD11c,

chỉ số FSA và FSW để loại bỏ các tế bào chết và các tế bào kích thước lớn hơn tế

bào đơn nhân. Sau đó phân biệt quần thể tế bào lympho và quần thể tế bào mono

dựa vào chỉ số Forward scatter – FSC và Side scatter – SSC, quần thể tế đã có sự

thay đổi rõ rệt về kích thước cũng như độ phức tạp nhân (Hình 3.5A). Các tế bào

mono ngày D1 tập trung trong một vùng nhất đ nh trong khi đó quần thể tế bào ngày

D7 phân bố rộng không đồng nhất.

A

Hình 3.5A: Tập hợp tế bào đơn được xác đ nh bằng hai chỉ số FSA và FSW và phân biệt tế

bào lympho và tế bào mono bằng FSC và SSC. Hình 3.5B: Mức độ phần trăm biểu hiện các

dấu ấn bề mặt lần lượt như: CD14, CD80, HLA-DR, CD40, CD56, CD86, CD11c, CD123.

Viết tắt: CD: Cluster of differentiation.

Hình 3.5: Phân tích theo phƣơng pháp dòng chảy tế bào các dấu ấn bề mặt tế bào vào ngày D1, D6 và D7

- Dựa theo kết quả nghiên cứu, tỷ lệ trung bình các dấu ấn bề mặt được biểu hiện như

bảng. So với tế bào mono ngày D1, iDC và mDC cho thấy sự gia tăng đáng kể trong

biểu hiện của các dấu bề mặt như HLA-DR, CD11c, CD40, CD80 và CD86, giảm biểu

hiện marker CD14 (dấu ấn bề mặt tế bào mono) và CD56 (dấn ấn bề mặt tế bào NK).

Vào ngày D7, các tế bảo biểu hiện cao các dấu ấn CD40, CD80, CD86, HLA-DR và

CD11c như bảng 3.3 . Kết quả này cũng tương tự như các kết quả của một số nghiên

cứu khác [32].

Bảng 3.3: Giá trị trung bình các dấu ấn bề mặt biểu hiện trên tế bào tua ở giai đoạn nuôi

cấy ngày (Đơn vị: %)

CD11c CD123

Day 1 Day 6_iDc Day 7_mDc

19,02 47,3 79,2

CD14 4,78 2,56 1,55

CD80 HLR-DR 2,37 62,6 80,4

CD40 CD56 11,6 39,3 41,9

8,2 6,06 5,31

CD86 4,47 67,12 80,6

1.02 25,9 40,9

1,56 6,36 8,21

- Xét về hình thái và kháng nguyên bề mặt DC đã được biệt hóa thành công từ tế bào

mono máu cuống rốn trữ đông. Tuy nhiên hình thái và mức độ biểu hiện các marker

bề mặt là khác nhau, tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, yếu tố kích thích, và thời

gian nuôi cấy. Ví dụ độ biểu hiện của HLA-DR trong quá trình biệt hóa DC là cao

hơn khi sử dụng đồng thời hai yếu tố kích thích TNF-α và MCM so với sử dụng

TNF-α một mình [21]. Magdalena Szarynska đã chứng minh rằng nồng độ LPS

hoặc IFN-γ được sử dụng càng cao thì mức độ biểu hiện CD80 càng lớn trong quá

trình biệt hóa và trưởng thành DC tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi và máu cuống

rốn [61].

Tỷ lệ trung bình dấu ấn bề mặt

120

100

ì

t ặ m ề b n ấ u ấ d n ệ i h u ể i b h n b g n u r t

%

HLR-DR

CD14

CD11c

CD80

CD40

CD86

CD56

CD123

ệ l ỷ T

Ngày 1

Ngày 6_iDc

Ngày 7_mDc

Tế bào đơn nhân máu cuống rốn trữ đông được nuôi cấy trong 7 ngày và phân tích bằng các dấu hiệu ấn bề mặt khác nhau bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Sai số chuẩn trung bình được

Hình 3.6: Tỷ lệ trung bình các dấu ấn bề mặt.

biểu hiện trong mỗi cột 3.5. Kết quả phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi

- Tế bào mono máu ngoại vi người khỏe mạnh được phân lập dựa theo phương pháp

ly tâm theo tỷ trọng bằng Ficoll. Từ tế bào mono, phân tách quần thể tế bào lympho

T bằng bộ kit Microbeads Human Kit MACS (Miltenyi Biotec, Inc., Germany) theo

phương pháp lựa chọn dương tính hai dấu ấn bề mặt tế bào lympho là CD4 và CD8,

để đánh giá mức độ tăng sinh độc tính của của tế bào Lympho T khi đồng nuôi cấy

- Quần thể tế bào thu được sau khi phân tách bằng cột gắn từ được kiểm tra tỷ lệ sống

với các điều kiện kích thích khác nhau.

chết và độ tinh sạch bằng phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy. Thuốc

nhuộm 7-amino-actinomycin D (7AAD) dùng để phân biệt tỷ lệ sống chết của tế

bào. Là một loại thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết với DNA sợi đôi trong tế bào tại

vùng giàu cặp bazo nito G-C, 7ADD bắt màu với tế bào chết do không bắt cặp DNA

khi màng tế bào còn nguyên vẹn. Sau đó các dấu ấn CD3 (dấu ấn đặc trưng cho tế

bào Lympho T) CD4 CD8 được dùng để xác đ nh độ tinh sạch cũng như quần thể

tế bào T gây độc (CTLs) và T bổ trợ (Th) trong tổng số tế bào thu được (Hình 3.7).

- Theo kết quả phân tích từ nghiên cứu, quần thể tế bào lympho T có độ tinh sạch rất

cao với tỷ lệ CD3 chiếm 98,7 ± 0,5%.

Hình 3.7 Phân tích quần thể tế bào lympho T bằng phƣơng pháp

tế bào theo dòng chảy

Phân tích tế bào đơn dựa trên hai chỉ số FSA và FSH. Tỷ lệ tế bào sống sau đó được xác

đ nh là các tế bào dương tính với 7-AAD trong quần thể tế bào Lympho. Các tế bào T CD4+ và CD8+ được phân biệt với nhau trong quần thể tế bào T CD3+. Các số hiển th

trên hình ảnh là tỷ lệ phần trăm của quần thể tế bào.

3.6. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trƣởng của

tế bào lympho T

- Để xác đ nh khả năng kích thích tăng sinh tế bào lympho T của các Exosome phân

lập từ môi trường nuôi cấy DC và DCno, các tế bào lympho T máu ngoại vi người

khỏe mạnh được nhuộm với thuốc nhuộm Carboxyfluorescein succinimidyl ester

CFSE sau đó đồng nuôi cấy với các Exosome phân lập từ môi trường nuôi cấy DC,

DCno máu cuống rốn trữ đông. CFSE là thuốc nhuộm có tính xuyên màng, không

màu và không phát huỳnh quang khi nhóm acetate được loại bỏ bởi các esterases

nội bào trong các tế bào sống. Khi b phân cắt, CFSE liên kết cộng hóa tr với nhóm

amin có trong tế bào thông qua nhóm succinimidyl ester và phát tín hiệu huỳnh

quang tại bước sóng kích thích 490nm. CFSE tồn tại ở trong các tế bào sống và

giảm một nửa tín hiệu huỳnh quang tại các thể hệ phân bào tiếp theo.

Tế bào Lympho T được phân chia hai lần trong thời gian đồng nuôi cấy 7 ngày với DC đã

được cảm ứng kháng nguyên A549 và phân chia một lần với DC không được cảm ứng

với kháng nguyên (DCno) hoặc Exosome phân lập từ DC (Exo). Các tế bào Lympho T

không được đồng nuôi cấy với DC/Exosome hoặc các tế bào Lympho T được ủ với các

Exosome được phân lập từ môi trường nuôi cấy DC không cảm ứng với kháng nguyên

A549 (Exono) không phân chia. (T cell_DC: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DC, T

cell_DCno: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DCno, T cell_Exo: tế bào Lympho T

đồng nuôi cấy với Exo, T cell_Exono: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exono. T cell:

tế bào Lympho T được nuôi cấy độc lập)

Hình 3.8: Sự tăng sinh tế bào lympho T CD3+ khi nhuộm CSFE.

- Các phản ứng tăng sinh của các tế bào lympho T được xác đ nh bằng cách đo mật

độ tín hiệu huỳnh quang (Fluorescence intensity FI) CFSE. Kết quả nghiên cứu cho

thấy (Hình 3.8) các tế bào lympho T khi đồng nuôi cấy với DC cảm ứng với protein

A549 (T cell_DC) có tỷ lệ tăng sinh cao nhất, với sự phân chia lớn gấp hai lần trong

7 ngày nuôi cấy khi so sánh với các tế bào lympho T được ủ với DC không cảm

ứng với protein A549 (Tcell_DCno). Các tế bào lympho T đồng nuôi cấy với

Exosome phân lập từ DC (Tcell_Exo) cũng có số lượng tế bào tăng sinh gấp 2 lần.

Tuy nhiên, không ghi nhận thấy sự phân chia khi quan sát các tế bào Lympho T

nuôi cấy độc lập (Tcell), là các tế bào Lympho T không có khả năng tăng sinh in

vitro khi không có sự kích thích.

- Kết quả sự tăng sinh tế bào lympho T đồng loài trong cả hai trường hợp đồng nuôi

cấy tế bào Lympho T với DC và DCno tương tự như báo cáo trước đây [25]. Qing

Ge và cộng sự đã chứng minh rằng tế bào lympho T tăng sinh mạnh khi tỷ lệ đồng

nuôi cấy với DC là 2,5: 1 hoặc 5:1. Hơn nữa Nowruz el đã chứng minh rằng DC có

thể kích thích các tế bào Lympho T đồng loài bằng khả năng trình diện kháng

nguyên của chúng, phù hợp với các đặc tính của DC như quá trình tiết ra các

cytokine đáp ứng miễn d ch [9]. Sự tăng sinh gấp 2 lần ở nhóm tế bào Lympho T

đồng nuôi cấy với DC được kích thích kháng nguyên A549 (Tcell_DC) so với

nhóm lympho T đồng nuôi cấy với DC không được cảm ứng với kháng nguyên

A549 (Tcell_DCno) đã chỉ ra rằng khả năng trình diện kháng nguyên của DC tốt

hơn khi được cảm ứng với tác nhân lạ. Kết quả cũng tương tự như trong nghiên cứu

cứu của Miwa và đồng nghiệp [67].

- Từ kết quả tăng sinh gần 2 lần tế bào lympho T khi đồng nuôi cấy với Exo tiết từ tế

bào DC có cảm ứng kháng nguyên (Tcell_Exo) so với tế bào lympho T khi đồng

nuôi cấy với Exo tiết từ tế bào DC không cảm ứng kháng nguyên và tế bào Lympho

T nuôi cấy độc lập, có khả năng Exosome biểu hiện các kháng nguyên A549 lên bề

mặt và kích thích sự tăng sinh tế bào lympho T khi trình diện các kháng nguyên đó, bao gồm cả tế bào tế bào lympho T CD4+ và CD8+. Kết cuả đồng quan điểm với Charlotte Admyre và cộng sự khi chứng minh sự tăng sinh của tế bào CD8+ khi

được kích thích với Exosom tiết từ DC có nguồn gốc từ tế bào mono cũng như kích thích tế bào CD4+ tốt hơn giữa Exosome tiết từ tế bào DC trưởng thành và DC chưa

trưởng thành [1].

- Trong nghiên cứu này, DC và Exosome tiết từ DC cho thấy khả năng kích thích

tăng sinh tế bào Lympho T, tuy nhiên số lượng Exosome thu được đến từ nhiều loại

tế bào khác nhau tồn tại trong d ch nuôi cấy tế bào. Vì vậy, cần xác đ nh rõ tỷ lệ

Exosome có khả năng trình diện kháng nguyên trong hỗn hợp thu được để xác đ nh

công suất, tính hiệu kích thích tăng sinh tế bào Lympho T so với DC.

3.7. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thƣ biểu mô phế nang phổi

A549 của tế bào lympho T đã cảm ứng

- Khả năng gây độc tế bào của tế bào Lympho T được đánh giá dựa trên sự kháng lại

các tế bào A549 được nhuộm với thuốc nhuộm Calcein - acetoxymethyl ester

(Calcein-AM). Khi đi qua màng tế bào, nhóm acetoxymethyl ester của thuốc

nhuộm b thủy phân bởi các esterases nội bào, kích thích thuốc nhuộm phát hình

quang. Mật độ huỳnh quang FI của Calcein tỷ lệ thuận với tỷ lệ tế bào sống.

- Kết quả trong nghiên cứu chỉ ra rằng có sự giảm mức độ tín hiệu huỳnh quang

đáng kể sau khi dòng tế bào A549 phản ứng với tế bào Lympho T đã được cảm

ứng sau thời gian ủ trong 2 giờ (Hình 3.9). Trong nghiên cứu này, tế bào A549

được đồng nuôi cấy với tế bào lympho T tại các nồng độ khác nhau lần lượt là

1/12,5; 1/25; 1/50. Tỷ lệ gây độc tế bào của Lympho T đối với tế bào A549 được

quy đổi thành biểu đồ tuyến tính từ mức độ tín hiệu huỳnh quang (Hình 3.10). Tại

các tỷ lệ tế bào Lympho T so với tế bào ung thư A549 (E/T) càng cao thì tín hiệu giảm càng mạnh, chứng tỏ vài trò tiêu diệt tế bào A549 của tế bào T gây độc CD8+

tỷ lệ thuận với mật độ tế bào. Lympho T đồng nuôi cấy với DC có cảm ứng kháng

nguyên cho thấy khả năng gây độc tế bào tế bào A459 cao nhất. Trong khi đó gần

như không có sự khác biệt FI giữa tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exosome

từ môi trường DC cảm ứng kháng nguyên (Exo) và DC không cảm ứng kháng

nguyên (DCno) ở các tỷ lệ E/T thấp, ngoại trừ tỷ lệ E/T=50/1 cho thấy Lympho T

đồng nuôi cấy với Exosome từ môi trường DC cảm ứng kháng nguyên (Exo) có

khả năng tiêu diệt tế bào cao hơn DC không cảm ứng kháng nguyên (DCno). Cụ

thể độc tính của tế bào lympho T đồng loài được cảm ứng với DCno và Exo lần

lượt là 37% và 50% khi tỷ lệ E/T=50/1, 31% và 26% khi E/T=25/1 và 26% và

13% khi E/T=12,5/1. Trong khi đó độc tính tế bào lympho T cảm ứng Exono cho

tỷ lệ thấp nhất với giá tr lần lượt là 21%, 11%, 9% khi tỷ lệ E/T lần lượt là 50/1,

25/1 và 12,5/1.

Tín hiệu huỳnh quang FI của tế bào A549 sau khi đồng nuôi cấy trong 2 giờ với các tế bào

lympho T cảm ứng với các điều kiện khác nhau. (T cell_DC: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với

DC, T cell_DCno: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DCno, T cell_Exo: tế bào Lympho T

đồng nuôi cấy với Exo, T cell_Exono: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exono, T cell: tế bào

Lympho T được nuôi cấy độc lập)

Hình 3.9: Hoạt tính gây độc lên tế bào A54 của tế bào Lympho T.

- Kết quả từ Casper J. E. Wahlund (2017) đã chứng mình khả năng kích thích tăng sinh tế bào T CD8+ đặc hiệu kháng nguyên của Exosome tiết từ tế bào tua cảm ứng

Interferon γ đáp ứng miễn d ch ex vivo [71]. Các Exosome thu được từ DC có thể kích thích tăng sinh tế bào T CD8+ in vitro và in vivo mạnh hơn các exosome tiết từ

với Ovalbumin. Trong cùng nghiên cứu, exosome thúc đẩy tế bào lách chuột tiết

DC chưa trưởng thành, và kích thích tế bào CTLs đặc hiệu khối u tăng sinh tăng

khả năng miễn d ch kháng khối u [27, 66]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này,

Exosome tiết từ DC có cảm ứng và không cảm ứng kháng nguyên chưa thể hiện rõ

mức độ kích thích tế bào Lympho T tiêu diệt tế bào ung thư A549 và kém hơn hiệu

quả tiêu diệt của DC, không loại trừ trường hợp liều lượng Exosome thu được còn

thấp chưa đủ để kích thích tăng sinh mạnh cũng như khả năng gây độc của tế bào

Lympho T.

Khả năng tiêu diệt tế bào A549

o à b

ế t c ộ đ

y â g

31 26

13 9

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

12.5

h n í t t ạ o h % ệ l ỷ T

25 Tỷ lệ E/T

T-DC

T-DC no

T-Exo

T-Exo no

Hình 3.10: Tỷ lệ hoạt tính gây độc tế bào (mẫu 1)

- Gần đây Gruijl và cộng sự đã trình bày kết quả của thử nghiệm lâm sàng giai đoạn

I liên quan đến việc cấy ghép DC đồng loài để điều tr bệnh bạch cầu tủy cấp tính

[19]. Kết luận chỉ ra rằng việc điều tr là an toàn, khả thi và có thể kich thích các

mức độ đáp ứng miễn d ch khác nhau, ngay cả khi không có kết hợp hệ thống

kháng nguyên bạch cầu người (human leucocyte antigen-HLA) [68]. Tương tự

trong nghiên cứu này, chúng tôi không thực hiện kiểm tra mức độ HLA tại bốn mẫu

máu cuống rốn trữ đông đối với các tế bào Lympho T từ máu ngoại vi người khỏe

mạnh. Tuy nhiên, kết quả cho thấy DC đồng loài và Exosome được tiết ra của

chúng có thể đáp ứng miễn d ch kháng ung thư biểu mô phế nang phổi A549 in

vitro và tế bào tua được cảm ứng với kháng nguyên có khả năng trình diện kháng

nguyên tốt hơn so với tế bào tua không được cảm ứng kháng nguyên trong kích

thích tắng sinh tế bào Lympho T. Với tiềm năng đã được nghiên cứu từ DC, Dex

trong liệu pháp miễn d ch, máu cuống rỗn trữ đông có thể là nguồn cung cấp một

lưộng lớn DC, Dex cho liệu pháp miễn d ch và đóng vai trò là nguồn dự trữ sẵn

sàng để sản xuất vắc xin.

Chƣơng 4 - KẾT LUẬN

Từ những những kết quả thu được trong các thí nghiệm trên, rút ra những kết luận

- Phân lập được tế bào mono từ máu cuống rốn trữ đông với hiệu suất xấp xỉ 40%

- Biệt hóa và trưởng thành thành công DC từ tế bào đơn nhân máu cuống rốn trữ

đông trong môi trường KBM 551 có chứa các cytokine GM-CFS, IL-4, và TNF-α:

kích thước lớn, xuất hiện tua dài và sự biểu hiện cao các dấu ấn bề mặt điển hình ở

DC, gồm: HLA-DR (41.0 ± 28.4 %), CD11c (40.9 ± 29.6), CD80 (80.4 ± 29.1 %),

CD40 (41.9 ± 8.9 %), CD86 (80.6 ± 16.8 %)

- Phân lập tế bào Lympho T từ máu ngoại vi có độ tinh sạch cao (CD3+: 98.7±0.5%)

- Thu nhận được dung d ch có khả năng cao chứa Exosome tiết từ tế bào tua.

- DC cảm ứng với kháng nguyên A549, và Exosome tiết từ môi trường nuôi cấy DC

cảm ứng kháng nguyên A549 có khả năng kích thích tăng sinh tế bào lympho T

thông qua việc phân chia tế bào (từ 1-2 thế hệ), và có khả năng tiêu diệt tế bào ung

thư A549 mạnh hơn so với các tế bào không được cảm ứng.

Chƣơng 5 - KIẾN NGHỊ

- Theo nghiên cứu của Phạm Văn Phúc và cộng sự sử dụng MNC từ máu cuống rốn

để biệt hóa thành DC cho tỷ lệ sống tế bào cao >90% [69]. Thay vì sử dụng nguồn

máu cuống rốn trữ đông thu MNC tế bào MNC nên được phân lập khi thu thập

máu cuống rốn trước khi trữ đông.

- Kiểm tra chất lượng Exosome thu được từ quá trình siêu ly tâm, kiểm tra nồng độ

cytokine tiết ra từ quá trình đồng nuôi cấy tế bào Lympho T với Exosome, tế bào

tua để đánh giá hiệu quả kích thích miễn d ch kháng ung thư

- Tiến hành thí nghiệm đối chứng với DC được biệt hóa từ tế bào đơn nhân máu

cuống rốn tươi và DC đồng nuôi cấy với tế bào Lympho T tự thân để so sánh sự

khác biệt trong khả năng kích thích kháng ung thư

- Tiến hành thí nghiệm đối chứng Exosome thu được từ môi trường nuôi cấy DC từ

máu cuống rốn tươi và Exosome thu được từ môi trường nuôi cấy DC với tế bào

Lympho T tự thân để so sánh sự khác biệt trong khả năng kích thích kháng ung thư

Chƣơng 6 – TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Admyre C. S.M. Johansson S. Paulie and S. Gabrielsson (2006) ―Direct exosome stimulation of peripheral humanT cells detected by ELISPOT‖ European journal of immunology, 36 (7), pp. 1772-1781.

2. Aldahlawi A.M. and Ultrastructure (2016) ―Modulation of dendritic cell immune functions

by plant components‖ Journal of microscopy, 4 (2), pp. 55-62.

3. Allan R.S., J. Waithman, S. Bedoui, C.M. Jones, J.A. Villadangos, Y. Zhan, A.M. Lew, K. Shortman W.R. Heath and F.R. Carbone (2006) ―Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming‖ Immunity, 25 (1), pp. 153-162.

4. André F., N. Chaput, N.E. Schartz, C. Flament, N. Aubert, J. Bernard, F. Lemonnier, G. Raposo, B. Escudier, and D.-H. Hsu (2004) ―Exosomes as potent cell-free peptide-based vaccine. I. Dendritic cell-derived exosomes transfer functional MHC class I/peptide complexes to dendritic cells‖ The Journal of Immunology, 172 (4), pp. 2126-2136.

5. Andre F., B. Escudier, E. Angevin, T. Tursz and L. Zitvogel (2004) ―Exosomes for cancer

immunotherapy‖ Ann Oncol, 15 (Suppl 4), pp. iv141-144.

6. Antoniewicz‐Papis J. E. Lachert J. Woźniak K. Janik and M. Łętowska (2014)

―Methods of freezing cord blood hematopoietic stem cells‖ Transfusion, 54 (1), pp. 194- 202.

7. Ballen K. F. Verter and J. Kurtzberg (2015) ―Umbilical cord blood donation: public or

private?‖ Bone marrow transplantation, 50 (10), pp. 1271.

8. Ballen K.K. E. Gluckman and H.E. Broxmeyer (2013) ―Umbilical cord blood

transplantation: the first 25 years and beyond‖ Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 122 (4), pp. 491-498.

9. Banchereau J. and R.M. Steinman (1998) ―Dendritic cells and the control of immunity‖

Nature, 392 (6673), pp. 245.

10. Beauvillain C., S. Ruiz, R. Guiton, D. Bout, I. Dimier-Poisson and Infection (2007) ―A vaccine based on exosomes secreted by a dendritic cell line confers protection against T. gondii infection in syngeneic and allogeneic mice‖ Microbes, 9 (14-15), pp. 1614-1622.

11. Besse B., M. Charrier, V. Lapierre, E. Dansin, O. Lantz, D. Planchard, T. Le Chevalier, A. Livartoski F. Barlesi and A. Laplanche (2016) ―Dendritic cell-derived exosomes as maintenance immunotherapy after first line chemotherapy in NSCLC‖ Oncoimmunology, 5 (4), pp. e1071008.

12. Brode S. and P.A. Macary (2004) ―Cross‐presentation: dendritic cells and macrophages

bite off more than they can chew!‖ Immunology, 112 (3), pp. 345-351.

13. Buschow S.I., E.N. Nolte‐‗T Hoen G. Van Niel M.S. Pols, T. Ten Broeke, M. Lauwen, F. Ossendorp C.J. Melief G. Raposo and R. Wubbolts (2009) ―MHC II in dendritic cells is targeted to lysosomes or T cell‐induced exosomes via distinct multivesicular body pathways‖ Traffic, 10 (10), pp. 1528-1542.

14. Carbone D.P., D.R. Gandara, S.J. Antonia, C. Zielinski, and L. Paz-Ares (2015) ―Non–

small-cell lung cancer: role of the immune system and potential for immunotherapy‖ Journal of Thoracic Oncology, 10 (7), pp. 974-984.

15. Castell-Rodríguez A., G. Piñón-Zárate, M. Herrera-Enríquez, K. Jarquín-Yáñez, and I. Medina-Solares (2017) ―Dendritic cells: Location function and clinical implications‖ Biology of Myelomonocytic Cells, pp. 21.

16. Chen S. M. Lv S. Fang W. Ye Y. Gao and Y. Xu (2018) ―Poly (I: C) enhanced anti- cervical cancer immunities induced by dendritic cells-derived exosomes‖ International journal of biological macromolecules, 113, pp. 1182-1187.

17. Colino J. and C.M. Snapper (2006) ―Exosomes from bone marrow dendritic cells pulsed

with diphtheria toxoid preferentially induce type 1 antigen-specific IgG responses in naive recipients in the absence of free antigen‖ The Journal of Immunology, 177 (6), pp. 3757- 3762.

18. Collin M. N. Mcgovern and M. Haniffa (2013) ―Human dendritic cell subsets‖

Immunology, 140 (1), pp. 22-30.

19. De Gruijl T., S. Santegoeds, S. Van Wetering, S.K. Singh, A. Hall, A.A. Van De

Loosdrecht and A. Kruisbeek (2013) ―Allogeneic dendritic cell (DC) vaccination as an ―off the shelf‖ treatment to prevent or delay relapse in elderly acute myeloid leukemia patients: results of Phase I/IIa safety and feasibility study‖ Journal for immunotherapy of cancer, 1 (1), pp. P205.

20. Del Cacho E., M. Gallego, S.H. Lee, H.S. Lillehoj, J. Quilez, E.P. Lillehoj, and C.

Sánchez-Acedo (2011) ―Induction of protective immunity against Eimeria tenella infection using antigen-loaded dendritic cells (DC) and DC-derived exosomes‖ Vaccine, 29 (21), pp. 3818-3825.

21. Delirezh N., S.M. Moazzeni, F. Shokri, M.A. Shokrgozar, M.M. Atri, and H. Karbassian

(2012) ―In vitro analysis of T cell responses induced by breast tumor cell lysate pulsed with autologous dendritic cells‖ Advances in Bioscience Biotechnology, 3 (02), pp. 126.

22. Domagala-Kulawik J., I. Osinska, and G.J.T.L.C.R. Hoser (2014) ―Mechanisms of

immune response regulation in lung cancer‖ Translational lung cancer research, 3 (1), pp. 15.

23. Ebrahimi M. Z.M. Hassan J. Hadjati P. Hayat and S.M. Moazzeni (2009) ―Immediate exposure to TNF-α activates dendritic cells derived from non-purified cord blood mononuclear cells‖ Iranian Journal of Immunology, 6 (3), pp. 107-118.

24. Erfani N., B. Khademi, M.R. Haghshenas, Z. Mojtahedi, B. Khademi, and A.J.I.I. Ghaderi

(2013) ―Intracellular CTLA4 and regulatory T cells in patients with laryngeal squamous cell carcinoma‖ Immunological investigations, 42 (2), pp. 81-90.

25. Ge Q. D. Palliser H.N. Eisen and J. Chen (2002) ―Homeostatic T cell proliferation in a T cell-dendritic cell coculture system‖ Proceedings of the National Academy of Sciences, 99 (5), pp. 2983-2988.

26. Gluckman E., H.E. Broxmeyer, A.D. Auerbach, H.S. Friedman, G.W. Douglas, A.

Devergie H. Esperou D. Thierry G. Socie and P. Lehn (1989) ―Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling‖ New England Journal of Medicine, 321 (17), pp. 1174-1178.

27. Hao S. O. Bai F. Li J. Yuan S. Laferte and J. Xiang (2007) ―Mature dendritic cells pulsed with exosomes stimulate efficient cytotoxic T‐lymphocyte responses and antitumour immunity‖ Immunology, 120 (1), pp. 90-102.

28. Herrera O.B., D. Golshayan, R. Tibbott, F.S. Ochoa, M.J. James, F.M. Marelli-Berg, and R.I. Lechler (2004) ―A novel pathway of alloantigen presentation by dendritic cells‖ The Journal of Immunology, 173 (8), pp. 4828-4837.

29. Holla S. M. Sharma J. Vani S.V. Kaveri K.N. Balaji and J. Bayry (2014) ―GM-CSF along with IL-4 but not alone is indispensable for the differentiation of human dendritic cells from monocytes‖ Journal of Allergy Clinical Immunology, 133 (5), pp. 1500-1502. e1501.

30. Hwang S.-J., L.S.-C. Cheng G. Lozano C.I. Amos X. Gu and L.C. Strong (2003) ―Lung cancer risk in germline p53 mutation carriers: association between an inherited cancer predisposition cigarette smoking and cancer risk‖ Human genetics, 113 (3), pp. 238-243.

31.

Inamura K. (2017) ―Lung cancer: understanding its molecular pathology and the 2015 WHO classification‖ Frontiers in oncology, 7, pp. 193.

32.

Joshi S.S., U.E. Vu, T.R. Lovgren, M. Lorkovic, W. Patel, G.L. Todd, C. Kuszynski, B.J. Joshi and H.P. Dave (2002) ―Comparison of phenotypic and functional dendritic cells derived from human umbilical cord blood and peripheral blood mononuclear cells‖ Journal of hematotherapy stem cell research therapy, 11 (2), pp. 337-347.

33. Klechevsky E., A.-L. Flamar, Y. Cao, J.-P. Blanck, M. Liu, A. O'bar, O. Agouna-Deciat, P. Klucar, L. Thompson-Snipes and S. Zurawski (2010) ―Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR‖ Blood, 116 (10), pp. 1685- 1697.

34. Kowanetz M., W. Zou, S.N. Gettinger, H. Koeppen, M. Kockx, P. Schmid, E.E. Kadel, I. Wistuba J. Chaft and N.A. Rizvi (2018) ―Differential regulation of PD-L1 expression by immune and tumor cells in NSCLC and the response to treatment with atezolizumab (anti– PD-L1)‖ Proceedings of the National Academy of Sciences, 115 (43), pp. E10119-E10126.

35. Ladanyi M. and W. Pao (2008) ―Lung adenocarcinoma: guiding EGFR-targeted therapy

and beyond‖ Modern pathology, 21 (S2), pp. S16.

36. Lindenbergh M.F. and W. Stoorvogel (2018) ―Antigen presentation by extracellular

vesicles from professional antigen-presenting cells‖ Annual review of immunology, 36, pp. 435-459.

37. Lindenbergh M.F. and W. Stoorvogel (2018) ―Antigen presentation by extracellular

vesicles from professional antigen-presenting cells‖ Annual review of immunology, 36, pp. 435-459.

38. Liu H., T. Zhang, J. Ye, H. Li, J. Huang, X. Li, B. Wu, X. Huang, and J. Hou (2012),

―Tumor-infiltrating lymphocytes predict response to chemotherapy in patients with advance non-small cell lung cancer‖ Cancer immunology, immunotherapy, 61 (10), pp. 1849-1856.

39. Liu J. and X. Wang (2019) ―Focus on exosomes—From pathogenic mechanisms to the potential clinical application value in lymphoma‖ Journal of cellular biochemistry.

40. Liu L., D. Ge, L. Ma, J. Mei, S. Liu, Q. Zhang, F. Ren, H. Liao, Q. Pu, and T. Wang

(2012) ―Interleukin-17 and prostaglandin E2 are involved in formation of an M2 macrophage-dominant microenvironment in lung cancer‖ Journal of Thoracic Oncology, 7 (7), pp. 1091-1100.

41. Ma J. L. Liu G. Che N. Yu F. Dai and Z. You (2010) ―The M1 form of tumor-

associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time‖ BMC cancer, 10 (1), pp. 112.

42. Mellman I. G. Coukos and G. Dranoff (2011) ―Cancer immunotherapy comes of age‖

Nature, 480 (7378), pp. 480.

43. Miwa S., H. Nishida, Y. Tanzawa, M. Takata, A. Takeuchi, N. Yamamoto, T. Shirai, K. Hayashi H. Kimura and K. Igarashi (2012) ―TNF-α and tumor lysate promote the maturation of dendritic cells for immunotherapy for advanced malignant bone and soft tissue tumors‖ PloS one, 7 (12), pp. e52926.

44. Nair S. G.E. Archer and T.F. Tedder (2012) ―Isolation and generation of human dendritic

cells‖ Current protocols in immunology, 99 (1), pp. 7.32. 31-37.32. 23.

45. Näslund T.I., U. Gehrmann, K.R. Qazi, M.C. Karlsson, and S. Gabrielsson (2013),

―Dendritic cell–derived exosomes need to activate both T and B cells to induce antitumor immunity‖ The Journal of Immunology, 190 (6), pp. 2712-2719.

46. Ostrand-Rosenberg S. and P. Sinha (2009) ―Myeloid-derived suppressor cells: linking inflammation and cancer‖ The Journal of Immunology, 182 (8), pp. 4499-4506.

47. Paez J.G., P.A. Jänne, J.C. Lee, S. Tracy, H. Greulich, S. Gabriel, P. Herman, F.J. Kaye, N. Lindeman and T.J. Boggon (2004) ―EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy‖ Science, 304 (5676), pp. 1497-1500.

48. Palucka K. and J. Banchereau (2013) ―Human dendritic cell subsets in vaccination‖

Current opinion in immunology, 25 (3), pp. 396-402.

49. Pardoll D.M. (2012) ―The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy‖

Nature Reviews Cancer, 12 (4), pp. 252.

50. Pitt J.M., F. André, S. Amigorena, J.-C. Soria, A. Eggermont, G. Kroemer, and L. Zitvogel (2016) ―Dendritic cell–derived exosomes for cancer therapy‖ The Journal of clinical investigation, 126 (4), pp. 1224-1232.

51. Ramalingam S.S., T.K. Owonikoko and F.R. Khuri (2011) ―Lung cancer: New biological insights and recent therapeutic advances‖ CA: a cancer journal for clinicians, 61 (2), pp. 91-112.

52. Sakamoto S., T. Yamada, Y. Terazaki, K. Yoshiyama, S. Sugawara, S. Takamori, S.

Matsueda, S. Shichijo A. Yamada and M. Noguchi (2017) ―Feasibility study of personalized peptide vaccination for advanced small cell lung cancer‖ Clinical lung cancer, 18 (6), pp. e385-e394.

53. Schott M. (2006) ―Immunesurveillance by dendritic cells: potential implication for

immunotherapy of endocrine cancers‖ Endocrine-related cancer, 13 (3), pp. 779-795.

54. Schott M.J.E.-R.C. (2006) ―Immunesurveillance by dendritic cells: potential implication

for immunotherapy of endocrine cancers‖ 13 (3) pp. 779-795.

55. Schreiber R.D. L.J. Old and M.J. Smyth (2011) ―Cancer immunoediting: integrating immunity‘s roles in cancer suppression and promotion‖ Science, 331 (6024), pp. 1565- 1570.

56. Shigematsu Y., T. Hanagiri, H. Shiota, K. Kuroda, T. Baba, Y. Ichiki, M. Yasuda, H. Uramoto M. Takenoyama and K. Yasumoto (2012) ―Immunosuppressive effect of regulatory T lymphocytes in lung cancer, with special reference to their effects on the induction of autologous tumorspecific cytotoxic T lymphocytes‖ Oncology letters, 4 (4), pp. 625-630.

57. Sohlberg E., S. Saghafian‐Hedengren, K. Bremme, and E. Sverremark‐Ekström (2011), ―Cord blood monocyte subsets are similar to adult and show potent peptidoglycan‐ stimulated cytokine responses‖ Immunology, 133 (1), pp. 41-50.

58. Steinman R.M. (2012) ―Decisions about dendritic cells: past present and future‖ Annual

review of immunology, 30, pp. 1-22.

59. Stuffers S. C. Sem Wegner H. Stenmark and A. Brech (2009) ―Multivesicular endosome

biogenesis in the absence of ESCRTs‖ Traffic, 10 (7), pp. 925-937.

60. Swart M. I. Verbrugge and J.B. Beltman (2016) ―Combination approaches with immune-

checkpoint blockade in cancer therapy‖ Frontiers in oncology, 6, pp. 233.

61. Szaryńska M. K. Preis P. Zabul and Z. Kmieć (2018) ―Diversity of dendritic cells

generated from umbilical cord or adult peripheral blood precursors‖ Central-European journal of immunology, 43 (3), pp. 306.

62. Taieb J., N. Chaput, C. Ménard, L. Apetoh, E. Ullrich, M. Bonmort, M. Péquignot, N. Casares, M. Terme and C. Flament (2006) ―A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance‖ Nature medicine, 12 (2), pp. 214.

63. Théry C. S. Amigorena G. Raposo and A. Clayton (2006) ―Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids‖ Current protocols in cell biology, 30 (1), pp. 3.22. 21-23.22. 29.

64. Théry C., M. Boussac, P. Véron, P. Ricciardi-Castagnoli, G. Raposo, J. Garin, and S. Amigorena (2001) ―Proteomic analysis of dendritic cell-derived exosomes: a secreted subcellular compartment distinct from apoptotic vesicles‖ The Journal of Immunology, 166 (12), pp. 7309-7318.

65. Théry C. L. Duban E. Segura P. Véron O. Lantz and S. Amigorena (2002) ―Indirect

activation of naïve CD4+ T cells by dendritic cell–derived exosomes‖ Nature immunology, 3 (12), pp. 1156.

66. Utsugi-Kobukai S. H. Fujimaki C. Hotta M. Nakazawa and M. Minami (2003) ―MHC

class I-mediated exogenous antigen presentation by exosomes secreted from immature and mature bone marrow derived dendritic cells‖ Immunology letters, 89 (2-3), pp. 125-131.

67. Van De Laar L. P.J. Coffer and A.M. Woltman (2012) ―Regulation of dendritic cell

development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy‖ Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 119 (15), pp. 3383- 3393.

68. Van De Loosdrecht A.A., S. Van Wetering, S.J. Santegoets, S.K. Singh, C.M. Eeltink, Y. Den Hartog, M. Koppes, J. Kaspers, G.J. Ossenkoppele, and A.M. Kruisbeek (2018) ―A novel allogeneic off-the-shelf dendritic cell vaccine for post-remission treatment of elderly patients with acute myeloid leukemia‖ Cancer Immunology, Immunotherapy, 67 (10), pp. 1505-1518.

69. Van Pham P., B.T. Vu, V.Q. Pham, P.M. Le, H.T. Le, and N.K. Phan (2015) ―Production of dendritic cells and cytokine-induced killer cells from banked umbilical cord blood samples‖ Biomedical Research Therapy, 2 (11), pp. 402-408.

70. Vesely M.D. M.H. Kershaw R.D. Schreiber and M.J. Smyth (2011) ―Natural innate and

adaptive immunity to cancer‖ Annual review of immunology, 29, pp. 235-271.

71. Wahlund C.J., G. Güclüler, S. Hiltbrunner, R.E. Veerman, T.I. Näslund, and S. Gabrielsson (2017) ―Exosomes from antigen-pulsed dendritic cells induce stronger antigen-specific immune responses than microvesicles in vivo‖ Scientific reports, 7 (1), pp. 17095.

72. Wykes M. and G. Macpherson (2000) ―Dendritic cell–B‐cell interaction: dendritic cells

provide B cells with CD40‐independent proliferation signals and CD40‐dependent survival signals‖ Immunology, 100 (1), pp. 1-3.

73. Yi H.-J. and G.-X. Lu (2012) ―Adherent and non-adherent dendritic cells are equivalently

qualified in GM-CSF, IL-4 and TNF-α culture system‖ Cellular immunology, 277 (1-2), pp. 44-48.

74. Zappa C. and S.A. Mousa (2016) ―Non-small cell lung cancer: current treatment and

future advances‖ Translational lung cancer research, 5 (3), pp. 288.

75. https://www.immunopaedia.org.za/immunology/basics/5-overview-of-t-cell-subsets/