ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Thị Uyên

NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA

PROTEIN KOD DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Thị Uyên

NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA

PROTEIN KOD DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Văn Sáng

Hà Nội – Năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Sáng,

bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, trường Khoa học tự nhiên, người đã hướng

dẫn, giúp đỡ và tận tình chỉ bảo tôi. Tôi cũng cảm ơn thầy vì đã cho tôi có cơ hội

được làm việc trong nhóm của thầy, giúp tôi học tập được nhiều điều và có niềm

đam mê với khoa học.

Tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Nguyễn Thị Thu Huyền và anh

Lê Tuấn Anh, học viên cao học, phòng thí nghiệm Sinh học phân tử tế bào, trung

tâm khoa học sự sống đã luôn giúp đỡ và đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập

cũng như quá trình làm việc trong phòng thí nghiệm.

Tôi cũng xin được cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Di truyền học,

PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, TS. Đỗ Thị Phúc, TS. Trần Đức Long, ThS. Trần

Thùy Anh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi

cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc tại trường.

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ

Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-NN 02-2016 58”

Nghiên cứu có sự hợp tác và hỗ trợ cung cấp gen mã hóa bởi công ty

TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, chia sẻ

và động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 12 năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Uyên

i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i

MỤC LỤC .................................................................................................................. ii

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ..................................................... vii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

Chương 1 - TỔNG QUAN ........................................................................................ 3

1.1. Tổng quan về PCR ............................................................................................ 3

1.1.1. Giới thiệu ....................................................................................................... 3

1.1.2. Ứng dụng của PCR ........................................................................................ 3

1.1.3. Nguyên lý ...................................................................................................... 5

1.1.1. Thành phần phản ứng PCR ............................................................................ 6

1.2. Giới thiệu về DNA polymerase ......................................................................... 7

1.2.1. Giới thiệu chung ............................................................................................ 7

1.2.2. Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein .................................... 7

1.2.3. Các loại DNA polymerase thương mại ......................................................... 7

1.2.4. Cấu trúc của DNA polymerase ...................................................................... 9

1.3. KOD DNA polymerase .................................................................................... 10

1.3.1. Tình hình nghiên cứu ................................................................................... 10

1.3.2. Giới thiệu về KOD....................................................................................... 10

1.3.3. Đặc điểm và cấu trúc ................................................................................... 11

1.4. Lựa chọn hệ thống biểu hiện ........................................................................... 12

1.4.1. Vật chủ biểu hiện ......................................................................................... 12

1.4.2. Vector .......................................................................................................... 14

1.5. Phương pháp tinh sạch sử dụng sắc ký ái lực ................................................ 16

1.5.1. Sắc ký ái lực Nickel ..................................................................................... 17

1.5.2. Sắc ký ái lực Glutathione ............................................................................. 19

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 21

2.1. Vật liệu và hóa chất ........................................................................................ 21

2.1.1. Vật liệu ........................................................................................................ 21

2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................... 21

ii

2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................... 22

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 23

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................... 23

2.2.2. Tổng hợp và nhân dòng gen KOD ............................................................... 23

2.2.3. Thiết kế vector biểu hiện mang gen KOD ................................................... 24

2.2.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp ......................................................................... 27

2.2.5. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực ...................................................... 27

2.2.6. Thẩm tách protein ........................................................................................ 29

2.2.7. Thử hoạt tính enzyme .................................................................................. 30

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 31

3.1. Nhân dòng gen KOD ....................................................................................... 31

3.1.1. Tối ưu mã bộ ba và tổng hợp gen KOD ...................................................... 31

3.1.2. Khuếch đại đoạn chèn bằng phản ứng PCR ................................................ 31

3.1.3. Chèn đoạn gen mã hóa KOD vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1.32

3.1.4. Kết quả tách chiết plasmid DNA ................................................................. 34

3.1.5. Giải trình tự plasmid .................................................................................... 35

3.2. Biểu hiện protein tái tổ hợp ............................................................................ 36

3.3. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực ......................................................... 38

3.3.1. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel ......................... 38

3.3.2. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực GST ............................. 42

3.4. Thẩm tách protein ........................................................................................... 42

3.5. Thử hoạt tính enzyme ...................................................................................... 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 47

iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: So sánh các đặc tính của một số loại DNA polymerase phổ biến [3] ......... 11

Bảng 2: Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng .......................................................... 21

Bảng 3: Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 22

Bảng 5: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn ................................................. 25

Bảng 6: Thành phần phản ứng nối ............................................................................ 25

Bảng 7: Kết quả phân tích tối ưu mã bộ ba sử dụng GenScript ................................ 31

iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Ứng dụng của kỹ thuật PCR [10] ................................................................... 4

Hình 2: Nguyên lý nhân bản DNA qua các chu kỳ nhiệt [15] .................................... 5

Hình 3: Các thành phần chính trong phản ứng PCR [33] ........................................... 6

Hình 4: Cấu trúc chung của một DNA polymerase [36]............................................. 9

Hình 5: Cấu trúc của KOD DNA polymerase [14] ................................................... 12

Hình 6: Cơ chế biểu hiện gen bởi hệ thống pET ở tế bào E. coli BL21 (DE3) [8]... 13

Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện pET-32a .............................................................. 15

Hình 8: Cấu trúc vector biểu hiện pGEX-4T-1 ......................................................... 16

Hình 9: Các bước tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực ................................... 17

Hình 10: Cơ chế tinh sạch của phương pháp sắc ký ái lực với Nickel [25] .............. 18

Hình 11: Cơ chế của phương pháp sắc ký ái lực với đuôi GST [19] ........................ 20

Hình 12: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu ................................................................. 23

Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen KOD từ vector pUC19-KOD ............ 32

Hình 14: Kết quả biến nạp sản phẩm lai KOD-pET-M và KOD-pGEX-4T-1 vào tế

bào ............................................................................................................................. 33

Hình 15: Kết quả PCR khuẩn lạc .............................................................................. 34

Hình 16: Kết quả điện di plasmid ............................................................................. 35

Hình 17: Kết quả PCR kiểm tra plasmid ................................................................... 35

Hình 18: So sánh trình tự axit amin của KOD với trình tự KOD gốc ...................... 36

Hình 19: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi 6xHis ở tế bào BL21 ............................ 37

Hình 20: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi GST ở tế bào BL21 .............................. 38

Hình 21: Kết quả tinh sạch protein KOD-His ........................................................... 39

Hình 22: Kết quả tối tinh sạch KOD-His kết hợp với biến tính bằng nhiệt .............. 40

Hình 23: Kết quả tinh sạch protein KOD-His ở điều kiện biến tính. ........................ 41

Hình 24: Kết quả tinh sạch KOD-His ở điều kiện biến tính và không biến tính. ..... 41

Hình 25: Kết quả tinh sạch KOD-GST. .................................................................... 42

Hình 26: Kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-His ..................................... 43

v

Hình 27: Kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-GST ................................... 44

Hình 28: Kết quả PCR thử hoạt tính enzyme KOD-His và KOD-GST với các kích

thước gen và đệm PCR khác nhau. ........................................................................... 45

vi

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Kí hiệu Tên đầy đủ

APS Ammonium Persulfate

Aa Axit amin

BSA Bovine serum albumin

Bp Base pair

DNA Axit deoxyribonucleic

DTT Dithiothreitol

dNTPs Deoxynucleoside triphosphates

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

E. coli Escherichia coli

GST Glutathione S-transferase

IMAC Immobilized metal affinity chromatography

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

Kb Kilo base pair

LB Luria-Bertani

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Axit ribonucleic

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE Điện di polyacrylamide với SDS

TAE Tris – acetic EDTA

TEMED Tetramethylethylenediamine

vii

MỞ ĐẦU

KOD DNA polymerase là enzyme có hoạt tính tốt trong số các DNA

polymerase đang được sử dụng hiện nay. KOD DNA polymerase có vai trò quan

trọng và được ưu tiên sử dụng trong PCR khuếch đại các sản phẩm gen kích

thước lớn, giải trình tự hệ gen, hay nghiên cứu đột biến và tổng hợp gen. Do đó,

enzyme này đang được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh, y học, lĩnh

vực pháp y, khoa học hình sự và nông nghiệp như: xét nghiệm sinh học phân tử

để chuẩn đoán các bệnh liên quan đến virus, vi khuẩn, phát hiện mầm mống gây

ung thư…

Trên thị trường hiện nay, KOD DNA polymerase đang được cung cấp

bởi công ty TOYOBO Ltd, Nhật Bản hay Millipore, Sigma của Mỹ với các đặc tính

ưu việt như tần số đột biến thấp, tính ổn định cao, và tốc độ kéo dài rất nhanh. Tuy

nhiên việc nhập khẩu hoàn toàn từ các công ty nước ngoài kèm theo những vấn đề

không mong muốn cho người sử dụng khi như (1) giá thành cao, (2) thời gian vận

chuyển kéo dài lâu, (3) chất lượng enzyme có thể bị ảnh hưởng do điều kiện bảo

quản không đảm bảo trong thời gian vận chuyển.

Xuất phát từ thực tiễn nhu cầu enzyme KOD DNA polymerase trong các

phòng thí nghiệm cũng như các công ty công nghệ sinh học ở Việt Nam là rất lớn,

Việt Nam cần có quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase đạt chất lượng tốt và

giá thành rẻ hơn, để đảm bảo tính chủ động trong nghiên cứu và làm chủ về mặt

công nghệ.

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về DNA polymerase, tuy

nhiên số lượng công bố liên quan đến quá trình tinh sạch KOD DNA polymerase tái

tổ hợp vẫn còn rất hạn chế. Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất nghiên cứu “Nhân

dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein KOD DNA polymerase

tái tổ hợp ở E. coli” với mục tiêu tạo ra KOD DNA polymerase tái tổ hợp bằng

phương pháp đơn giản, từ đó có thể sản xuất lượng lớn enzyme này, làm chủ về mặt

công nghệ ở Việt Nam.

1

Căn cứ vào mục tiêu chính của đề tài, chúng tôi đề ra các mục tiêu cụ thể

như sau:

1. Tối ưu hóa được mã bộ ba của gen KOD DNA polymerase bằng công cụ

tin sinh.

2. Tổng hợp và nhân dòng gen mã hóa cho KOD DNA polymerase.

3. Chèn đoạn gen mã hóa cho KOD DNA polymerase vào vector biểu hiện

pET-M và pGEX-4T-1.

4. Biểu hiện protein KOD tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 DE3.

5. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực với cột Niken

hoặc GST.

6. Đánh giá hoạt tính enzyme KOD bằng kỹ thuật PCR.

2

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về PCR

1.1.1. Giới thiệu

Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là kỹ thuật trong sinh học phân tử được sử

dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp lũy thừa,

tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của trình tự DNA đó. Quá trình PCR có thể

khuếch đại không chỉ những đoạn DNA có kích thước ngắn khoảng vài trăm bp mà

còn có thể khuếch đại những đoạn lên tới 10 kb. Đặc biệt, khi sử dụng các DNA

polymerase tái tổ hợp phản ứng PCR còn có thể khuếch đại các đoạn có kích thước

lên đến 70 kb [2].

Phản ứng PCR được giới thiệu và phát triển trong ống nghiệm bởi một nhà

khoa học người Mỹ, Kary Mullis, năm 1985 [28]. Kỹ thuật PCR nguyên thủy của

K. Mullis sử dụng enzyme DNA polymerase không chịu nhiệt từ vi khuẩn E. coli

[28]. Do đó, việc thực hiện phản ứng còn khó khăn khi phải bổ sung enzyme

polymerase vào mỗi chu kỳ phản ứng. Cho đến nay, để trở thành một công cụ

không thể thiếu trong phòng thí nghiệm sinh y học, đã có những tiến bộ kỹ thuật

đóng góp làm cho kỹ thuật PCR nguyên thủy trở thành kỹ thuật PCR khá đơn giản

và hiệu quả. Sự thay đổi đầu tiên phải kể đến việc phát hiện và sản xuất được các

enzyme polymerase chịu nhiệt. Năm 1988, lần đầu tiên phân lập được enzyme bền

nhiệt, Taq polymerase, đã đơn giản hóa được quá trình PCR và đưa PCR thành phản

ứng tự động [27]. Kể từ đó, có rất nhiều ứng dụng được phát triển dựa trên phản

ứng PCR. Tiếp sau đó là việc chế tạo được các máy luân nhiệt hoạt động hiệu quả

và chính xác hơn. Hiện nay, các máy PCR đều được thiết kế gọn nhẹ hơn, có nhiều

chức năng hơn, kể cả chức năng gradient – chức năng thực hiện nhiệt độ gắn mồi

thay đổi tuyến tính trên các giếng ủ nhiệt.

1.1.2. Ứng dụng của PCR

Kỹ thuật PCR đã được khai thác và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác

nhau (Hình 1) [10].

(1) PCR ứng dụng trong công nghệ gen: nhờ có PCR mà việc có được gen

mong muốn thực hiện một cách dễ dàng và trong thời gian rất ngắn có thể chỉ trong

3

một vài ngày, thay vì phải cần rất nhiều thời gian như khi chứa có công cụ PCR.

Chính vì vậy, hiện nay công nghệ gen đã có nhiều tiến bộ đáng kể qua các sản phẩm

protein được sản xuất và đưa vào sử dụng trong y học, dược phẩm hay nông nghiệp

[15].

(2) PCR ứng dụng trong y học: Ngoài ra PCR cũng đóng vai trò trong việc

phát hiện và sàng lọc các bệnh lý di truyền. Việc phát hiện các bệnh di truyền trong

một gen nhất định là một quá trình lâu dài và khó khăn, quá trình này đã được rút

ngắn nhờ sử dụng kỹ thuật PCR. Mỗi gen sẽ được khuếch đại và phân tích trình tự

xác định đột biến hay những thay đổi gây bệnh di truyền, hoặc còn có thể phát hiện

các bệnh do các tác nhân vi sinh vật gây ra bằng phương pháp PCR khuếch đại

DNA của virus, vi khuẩn [16].

(3) PCR ứng dụng trong pháp y: PCR cũng là một công cụ hiệu quả trong

giám định pháp y để xác định tông tích nạn nhân, xác định thủ phạm qua những dấu

vết sinh học để lại tại hiện trường; xác định quan hệ huyết thống qua dấu vân tay di

truyền; và xác định hài cốt lâu năm… nhờ có kỹ thuật PCR mà các dấu vết DNA

muốn tìm trong các mẫu được khuếch đại và phân tích [10].

(4) PCR ứng dụng trong nông nghiệp: Phản ứng PCR được ứng dụng nhiều

trong nông nghiệp, cụ thể, trong việc chọn giống và nhân giống cây trồng vật nuôi,

hay giúp phát hiện các tác nhân gây bệnh cho cây trồng, vật nuôi [10] .

Hình 1: Ứng dụng của kỹ thuật PCR [10]

4

1.1.3. Nguyên lý

Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm các chu kỳ tăng giảm

nhiệt độ để biến tính và tái bản DNA. Mỗi chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm ba giai đoạn

nhiệt độ (Hình 2): (1) đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 95°C để phá vỡ các liên kết

hydro của mạch đôi DNA, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn (

giai đoạn biến tính). Thời gian để biến tính tùy thuộc vào kích thước của khuôn,

thường sẽ từ 1 – 5 phút. (2) Tiếp theo, nhiệt độ sẽ được hạ đến 45°C - 65°C, đây là

khoảng nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến và bắt cặp bổ sung vào hai đầu

của mạch đơn DNA đích (giai đoạn bắt cặp). Nhiệt độ và thời gian gắn mồi phụ

thuộc vào thành phần base, độ dài và nồng độ của mồi. Đối với một số loại khuôn

và mồi, sự chênh lệch rất nhỏ giữa nhiệt độ gắn mồi từ 1°C – 2°C cũng ảnh hưởng

đến tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Với những mồi có nhiệt độ nóng chảy trên

65°C có thể kết hợp giai đoạn gắn mồi và kéo dài thành chu kỳ PCR có hai bước.

(3) Cuối cùng, 72°C là nhiệt độ thích hợp để enzyme DNA polymerase tổng hợp

mạch bổ sung với DNA đích. Thời gian kéo dài tùy thuộc vào kích thước đoạn gen

muốn nhân bản và loại DNA polymerase được sử dụng. Thời gian kéo dài 1 phút

thường đủ cho sản phẩm gen có kích thước dưới 2 kb. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, một

DNA đích được nhân bản thành hai bản sao, với chu kỳ được lặp lại nhiều lần liên

tục 30 đến 40 lần thì sẽ có hàng tỷ bản sao được tạo ra.

Hình 2: Nguyên lý nhân bản DNA qua các chu kỳ nhiệt [15]

5

1.1.1. Thành phần phản ứng PCR

Để thực hiện được phản ứng PCR trong ống nghiệm, cần có điều kiện thích

hợp để DNA polymerase có thể thực hiện. Các thành phần chính để thực hiện phản

ứng PCR được mô tả trong Hình 3, phản ứng cần có dNTPs, các oligonucleotide mở

đầu (primer-mồi), enzyme DNA polymerase và các điều kiện phản ứng khác thích

hợp với enzyme. Phản ứng cần có dNTPs bao gồm khoảng 200 µM mỗi loại

Adenosine - , Thymidine - , Guanosine - , Cytosine – triphosphate [33].

Hình 3: Các thành phần chính trong phản ứng PCR [33]

Mồi (primers) là những đoạn oligonucleotides dài khoảng 18-30 bases

mang nhóm 3’–OH tự do và có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA cần

được nhân bản. Mồi được bắt cặp bổ sung với khuôn DNA ở điểm khỏi đầu và kết

thúc, giúp DNA polymerase có thể nối và tổng hợp sợi đơn DNA mới. Sự lựa chọn

chiều dài và trình tự mồi phụ thuộc ba yếu tố. Đầu tiên đó là nhiệt độ nóng chảy

(biến tính) của mồi, đây là nhiệt độ mà trên nó thì mồi sẽ tách ra khỏi mạch khuôn

DNA. Nhiệt độ nóng chảy của mồi thường khoảng từ 60-75 °C. Thứ hai đó là hàm

lượng GC trong mồi, thường thì hàm lượng GC nên trong khoảng từ 40-60%. Ở

hàm lượng này, nhiệt độ biến tính của mồi sẽ không quá cao, vì có thể sẽ ảnh hưởng

đến hoạt động của DNA polymerase. Nhiệt độ nóng chảy của các mồi nên gần nhau,

có thể chênh lệch nhau nhưng không quá 5°C. Yếu tố cuối cùng đó là việc hình

thành cấu trúc kẹp tóc, hay tự bắt cặp của các mồi, điều này cũng có thể ảnh hưởng

đến chất lượng của phản ứng PCR [6].

6

Hỗn hợp phản ứng trong môi trường đệm Tris-HCl có pH từ 7.5 – pH 8.8,

KCl, 500 – 1000 µg/ml gelatin hoặc BSA, 0.5 – 5.0 mM MgCl2 (MgCl2 là cofactor

của DNA polymerase). Ngoài ra cũng có thể bổ sung hàm lượng thấp cho số chất

khử như Triton X-100, Tween-20, dimethylsulphoxide (DMSO) để làm tăng tính

đặc hiệu của mồi [33].

Cuối cùng, quan trọng nhất là DNA polymerase được sử dụng để tổng hợp

lên mạch DNA mới. Các loại DNA polymerase thương mại dùng trong phản ứng

PCR đều có tính bền nhiệt, nhưng khác nhau ở khả năng đọc sửa, độ chính xác và

hiệu suất [33].

1.2. Giới thiệu về DNA polymerase

1.2.1. Giới thiệu chung

Năm 1956, Arthur Kornberg phát hiện ra DNA polymerase I ở Escherichia

coli, đây là enzyme đầu tiên được xác định liên quan đến quá trình nhân đôi DNA.

Nguyên lý cơ bản về chức năng của DNA polymerase đó là sao chép một đoạn

DNA sử dụng một mạch làm khuôn mẫu và một đoạn DNA hay RNA có kích thước

nhỏ làm mồi cho quá trình sao chép và tổng hợp từ đầu 5’ đến đầu 3’-OH. DNA

polymerase đóng vai trò tổng hợp chuỗi polydeoxyribonucleotide từ các

monodeoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) [30].

1.2.2. Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein

Dựa trên trình tự protein tương đồng, DNA polymerase được chia thành 5

họ chính đó là Escherichia coli DNA polymerase I (họ A), DNA polymerase II (họ

B), DNA polymerase III (họ C), và những loại khác (họ X) [26]. Các loại DNA

polymerase khác nhau có thể tìm thấy ở các sinh vật khác nhau. Ví dụ như DNA

polymerase I, II, III được tìm thấy ở E. coli hoặc ở các sinh vật nhân thực có thể tìm

thấy cả năm loại DNA polymerase (DNA Pol α, β, γ, δ, ε).

1.2.3. Các loại DNA polymerase thương mại

Hiện nay, các DNA polymerase sử dụng trong phản ứng PCR hầu hết là các

polymerase tái tổ hợp. Các DNA polymerase thương mại này có nguồn gốc từ các

loài khác nhau sẽ có sự khác biệt về cấu trúc, đặc tính như là hiệu suất, độ chính xác

do khả năng đọc sửa hay tỉ lệ kéo dài chuỗi polynucleotit. Các loại polymerase

7

thường được sử dụng cho phản ứng PCR được thu nhận từ các vi sinh vật bền nhiệt

như Thermus aquaticus (Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu polymerase),

Thermococcus litoralis (Tli polymerase), Thermus thermophiles (Tth polymerase)

và Thermococcus kodakaraensis (KOD polymerase) [9]. Việc lựa chọn polymerase

phụ thuộc vào mục đích, loại phản ứng PCR được thực hiện và kích thước của đoạn

gen.

Vai trò của DNA polymerase trong việc sao chép, tổng hợp và sửa chữa phụ

thuộc vào một số đặc tính enzyme quan trọng của polymerase. Chúng được đánh

giá dựa trên các đặc điểm đó là độ đặc hiệu (specificity), tính bền nhiệt

(thermostability), hiệu suất (processivity), và độ chính xác (fidelity) [30].

Độ đặc hiệu (specificity)

Khuếch đại không đặc hiệu là một trong những trở ngại lớn trong phản ứng

PCR, vì nó ảnh hưởng đến năng suất và độ nhạy của việc khuếch đại gen đích. Nếu

DNA polymerase có độ đặc hiệu kém thường có thể tạo dimer của mồi hay mồi bám

không đặc hiệu trong phản ứng PCR. Để DNA polymerase có độ đặc hiệu tốt hơn

nên để enzyme trên đá hoặc bổ sung DNA polymerase ở bước gắn mồi.

Tính bền nhiệt (thermostability)

Tính bền nhiệt của DNA polymerase là đặc điểm chính cho phép phản ứng

PCR lặp đi lặp lại qua các chu kỳ để khuếch đại các đoạn DNA, do đó đây là một

đặc tính quan trọng của DNA polymerase. Khả năng chịu nhiệt của enzyme liên

quan đến kết quả của phản ứng PCR qua các chu kỳ.

Hiệu suất (processivity)

Hiệu suất của PCR số nucleotide trung bình được thêm vào bởi DNA

polymerase trong một lần enzyme bám vào khuôn. Hiệu suất tổng hợp của mỗi

enzyme quyết định thời gian tổng hợp một đoạn DNA của Polymerase đó. Một

enzyme được cho là có hiệu suất nếu nó duy trì sao chép được một đoạn khuôn dài

mà không bị gián đoạn. Hiệu suất của một enzyme có thể được xác định dựa trên

những đặc điểm sau: polymerase trap hay tỉ lệ phản ứng bị giới hạn (Limited

reaction rate)[23].

Độ chính xác hay tỉ lệ đột biến (fidelity hay error frequency)

8

Độ chính xác là một trong những đặc tính quan trọng của polymerase, nó

ảnh hưởng đến trình tự đoạn DNA được khuếch đại. DNA polymerase có độ chính

xác càng cao thì khả năng đột biến trong quá trình tổng hợp mạch DNA mới càng

thấp. Độ chính xác của phản ứng PCR phụ thuộc vào hoạt tính của vùng 5’- 3’

exonuclease của DNA polymerase, đây là vùng có chức năng đọc sửa trong quá

trình tổng hợp sợi DNA mới.

1.2.4. Cấu trúc của DNA polymerase

Hiện nay, rất nhiều loại DNA polymerase đã được khám phá. Tuy có các

trình tự axit amin khác nhau nhưng tất cả các loại DNA polymerase đều có một cấu

trúc chung giống bàn tay phải (Hình 4) bao gồm ba phần được gọi là palm (lòng bàn

tay), thumb (ngón tay cái) và fingers (ngón tay). Trong đó, cấu trúc của vùng

fingers và thumb là khác nhau, còn vùng palm lại tương đồng giữa các loại khác

nhau [36]. Trình tự bảo thủ ở vùng palm đóng vai trò là trung tâm hoạt động (là

vùng liên kết với kim loại hóa trị 2 thường là Mg2+), với cấu trúc bao gồm 2 chuỗi

xoắn α gấp chồng lên nhau và chồng lên gấp β [36]. Vùng fingers giúp xác định

chính xác vị trí của khuôn ở trung tâm hoạt động, trong khi đó vùng thumb có liên

quan đến việc bám của DNA và đóng vai trò trong hiệu suất của enzyme[36].

Hình 4: Cấu trúc chung của một DNA polymerase [36]

9

1.3. KOD DNA polymerase

1.3.1. Tình hình nghiên cứu

Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều enzyme thương mại được sử dụng

rộng rãi như Taq, Pfu, Phusion hay KOD. Trong đó, KOD là enzyme thế hệ mới với

nhiều đặc tính ưu việt so với Taq hay Pfu. Trên thị trường, KOD đã được một số hãng hóa chất trên thế giới đưa vào thương mại như Sigma của Mỹ, TOYOBO của

Nhật Bản. Tuy nhiên, để nhập khẩu enzyme này về Việt Nam rất khó khăn về việc

vận chuyển, hay giá thành cao. Việc lựa chọn KOD để nghiên cứu sản xuất tại Việt

Nam giúp chủ động hơn về công nghệ sản xuất và nguồn nguyên liệu phục vụ

nghiên cứu. Trên thế giới đã có nghiên cứu về cấu trúc của KOD năm 1997 [32], và một số nghiên cứu tinh sạch enzyme này ở vật chủ E. coli, tuy nhiên kết quả tinh

sạch vẫn chưa được công bố cụ thể. Gần đây nhất là nghiên cứu biểu hiện, tinh sạch

KOD ở hệ thống biểu hiện nấm men năm 2015 [39]. Như vậy, việc nghiên cứu sản

xuất enzyme KOD DNA polymerase ở Việt Nam là nhu cầu cấp thiết và cần được

triển khai nghiên cứu.

1.3.2. Giới thiệu về KOD

KOD DNA polymerase thuộc họ DNA polymerases B hay còn gọi là α-

DNA polymerase vì nó có trình tự axit amin bảo thủ với DNA polymerase α ở sinh

vật nhân thực. KOD được tìm thấy ở vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus

kodakarensis hay còn có tên khác là Pyrococcus kodakarensis. Loại vi khuẩn này

được phân lập từ khu vực hồ nước nóng gần miệng núi lửa, ở đảo Kodakara,

Kagoshima, Nhật Bản [21]. Vi khuẩn này là sinh vật biển, sống trong môi trường kỵ

khí, dị dưỡng và chịu nhiệt cao (lên đến 95°C).

Tương tự như một số loại enzyme họ B khác, ví dụ như Pfu được phân lập

từ vi khuẩn Pyrococcus furiosus, thì KOD được sử dụng trong các phản ứng PCR,

đặc biệt là đối với việc khuếch đại các đoạn DNA dài. Trên thực tế, hoạt tính của

KOD DNA polymerase và khả năng ứng dụng của enzyme này trong phản ứng PCR

đã được chứng minh trong rất nhiều công bố [20, 31]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra

rằng KOD là polymerase có tính bền nhiệt rất tốt, độ chính xác cao nhờ khả năng

đọc sửa của vùng 3’ – 5’ exonuclease [32], điều này giúp KOD có sự vượt trội so

với Taq và Pfu DNA polymerase. Cụ thể, qua các số liệu ở Bảng 1 đã cho thấy,

KOD có tốc độ kéo dài cao gấp đôi (6-8 kb/phút), số lượng nucleotide trong 1 lần

bám của enzyme (>300 base) cao gấp 5 lần so với Taq (50-60 base) và 15 lần so với

10

Pfu (15-20 base). Hơn nữa KOD còn có vùng 3’-5’ exonuclease có khả năng đọc

sửa, khiến tỉ lệ đột biến của nó rất thấp giống như ở Pfu đó là 0.38% [32]. Nhiệt độ

tối ưu của KOD DNA polymerase là 75°C, tương tự như Pfu [32]. Đặc biệt, KOD

DNA polymerase còn có tính bền nhiệt cao hơn gấp khoảng 20 lần so với Taq

polymerase ở 95°C. Do vậy, KOD DNA polymerase được sử dụng rộng rãi trong

các hệ thống PCR yêu cầu nhanh, độ chính xác cao như các phản ứng PCR tạo đột

biến, nhân dòng gen hay PCR phát hiện đột biến gây bệnh. (Ví dụ như TOYOBO

Ltd, Nhật Bản hay Millipore, Sigma của Mỹ đã đưa vào sản xuất là enzyme thương

mại).

Bảng 1: So sánh các đặc tính của một số loại DNA polymerase phổ biến [3]

AmpliTaq Pfu KOD

Tốc độ kéo dài chuỗi 2-4 kb/phút 2-4 kb/phút 6-8 kb/phút

Processivitya 50-60 nu 15-20 nu >300 nu

3’-5’ Exonuclease activityb Không Có Có

Terminal transferase activityc Có Không Không

Độ chính xácd 98.7% 99.61% 99.62%

a Processivity: số nucleotide được kéo dài trong một lần polymerase bám vào

khuôn

b Khả năng đọc sửa của enzyme

c TTA kết quả sự adenyl hóa của đầu 3’của mạch mới tổng hợp

d Độ chính xác của enzyme. Một enzyme có độ chính xác là 1.3% sẽ có 1.3

nucleotide trong 100 không đúng.

1.3.3. Đặc điểm và cấu trúc

KOD DNA polymerase gồm 774 axit amin, tương tự như cấu trúc chung

của các DNA polymerase khác, KOD cũng gồm có các phần của polymerase là

palm, thumb và finger. Nghiên cứu của Hashimoto và cộng sự năm 2001 đã chỉ ra

cấu trúc của KOD DNA polymerase bao gồm các domain đã biết [13] và các

subdomain như mô tả ở Hình 5. Theo đó, KOD bao gồm vùng N-terminal (kí hiệu

N-ter gồm aa từ 1-130 và 327-368, màu tím), vùng có chức năng giúp polymerase

này đọc sửa là exonuclease (kí hiệu Exo gồm aa từ 131-326, màu xanh), và vùng

polymerase (Pol). Vùng Pol này bao gồm subdomain Palm (aa 369-449, 500-587,

11

màu nâu), Finger (450-499, màu xanh lá) và domain Thumb gồm thumb-1 và

thumb-2 (588-774, màu đỏ) [14]. Khác biệt của KOD DNA polymerase so với cấu

trúc của các Polymerase họ A, cụ thể là cấu trúc Thermus aquaticus DNA

polymerase I đã được công bố năm 1998 bởi Ying .L và cộng sự [17]. Qua đó, ở

Taq DNA polymerase các axit amin cơ bản của vùng finger có vai trò giữ nhóm

phosphate của các dNTPs đến và vùng khác của finger gây ra sự thay đổi về hình

dáng để vận chuyển các nucleotide đến trung tâm hoạt động. Đối với KOD DNA

polymerase thì vùng finger lại bao gồm 2 chuỗi xoắn dài không giống như cấu trúc

của DNA pol I. Do đó, ở KOD DNA polymerase, sự di chuyển của vùng pol để vận

chuyển dNTP đến trung tâm hoạt động khác so với họ A.

Hình 5: Cấu trúc của KOD DNA polymerase [14]

1.4. Lựa chọn hệ thống biểu hiện

1.4.1. Vật chủ biểu hiện

Cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu về KOD DNA polymerase lựa chọn

hệ thống biểu hiện ở E. coli [3, 11, 14, 21, 31], còn lại rất ít ở nấm men [39] và tế

bào côn trùng [37]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn hệ thống biểu hiện ở

E. coli BL21 với hai lý do chính. Thứ nhất, hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn như E.

12

coli là khá đơn giản và kinh tế vì cấu trúc thí nghiệm không phức tạp, thời gian nuôi

cấy ngắn và cung cấp được lượng protein tái tổ hợp lớn. Thứ hai protein KOD

không yêu cầu quá trình biến đổi sau dịch mã.

Chủng vi khuẩn E. coli BL21 được tạo bởi F.William Studier và Barbara A.

Moffatt, là chủng vi khuẩn được lựa chọn phổ biến để sản xuất protein tái tổ hợp.

BL21(DE3) đã được cải biến mang gen T7 mã hóa cho T7 RNA polymerase dưới

sự kiểm soát của promoter lacUV5. T7 RNA polymerase giúp protein biểu hiện ở

mức độ cao dưới sự kiểm soát của T7 promoter [8].

Hình 6: Cơ chế biểu hiện gen bởi hệ thống pET ở tế bào E. coli BL21 (DE3) [8]

Cơ chế biểu hiện gen ở tế bào E. coli BL21 dựa vào sự điều khiển của hai

promoter chính là promoter lac trên hệ gen vi khuẩn và T7 promoter ở vector biểu

hiện (Hình 6). Theo đó, khi ở trạng thái bình thường, Lac repressor sẽ bám vào lacO

và ngăn cản RNA polymerase bám vào promoter và do vậy quá trình phiên mã T7

gen1 không thể diễn ra. Tuy nhiên, khi có sự xuất hiện của chất cảm ứng IPTG, chất

này có khả năng ngăn lac repressor bám vào lacO, do vậy RNA polymerase có thể

bám vào lac promoter và quá trình phiên mã T7 gen1 được diễn ra. Khi đó T7 RNA

polymerase sẽ được tổng hợp, enzyme này giúp quá trình phiên mã gen đích trên

vector biểu hiện với sự điểu khiển của T7 promoter.

13

1.4.2. Vector

Vector là các đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài các đoạn DNA cần

thiết, có khả năng tự sao chép, không phụ thuộc và sự phân chia của tế bào, tồn tại

độc lập trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ mà không gây biến đổi hệ gen của tế bào

vật chủ. Dựa vào mục đích sử dụng có thể chia vector làm hai loại đó là vector nhân

dòng và vector biểu hiện.

Vector nhân dòng

Vector nhân dòng là DNA có thể gắn đoạn DNA đích vào và làm tăng số

lượng bản sao qua khả năng tự nhân đôi, không phụ thuộc vào hệ gen của vật chủ,

có thể nhận biết nhờ có các gen chỉ thị hoặc các gen đánh dấu. Vector nhân dòng có

thể là plasmid, bacteriophage hay nhiễm sắc thể nấm men (YAC). Loại vector nhân

dòng thường được chọn dựa trên kích thước của DNA đoạn chèn [24]. Plasmid là

các phân tử DNA nhỏ, mạch vòng có thể xâm lấn vào tế bào vi khuẩn và tự sao

chép được trong tế bào chủ. DNA plasmid có thể dược phân lập từ nuôi cấy vi

khuẩn chứa plasmid. Plasmid có chứa gen kháng kháng sinh để chọn lọc, vùng bắt

đầu sao chép cho phép plasmid có thể tự sao chép trong tế bào chủ. Plasmid là

vector có khả năng để chèn được DNA có kích thước nhỏ nhất, tối đa là 5 kb [24].

Vector biểu hiện

Vector biểu hiện là cấu trúc biểu hiện, được thiết kế để biểu hiện gen trong

các tế bào. Vector được dùng để đưa một gen cụ thể vào tế bào đích và có thể điều

khiển cơ chế của tế bào để tổng hợp được protein mã hóa bởi gen đó. Nó chứa các

trình tự điều hòa, trình tự tăng cường, promoter và các vùng cần thiết để biểu hiện

một gen mong muốn sử dụng cơ chế phiên mã và dịch mã của tế bào chủ. Vector

biểu hiện có thể là plasmid, phage, hay comid. Chúng đều có các vùng như vùng

sao chép, vùng gen chỉ thị, vị trí đa điểm cắt để chèn đoạn gen mong muốn và các

nhân tố khác cần thiết cho biểu hiện gen (ví dụ: promoter, vị trí bám ribosome, bộ

ba mở đầu, các đuôi để tinh sạch và các vị trí nhận biết cắt của protease....).

Hệ thống biểu hiện T7 ở pET vector

Mỗi hệ thống vector biểu hiện phù hợp với hệ thống vật chủ khác nhau.

Trong đó hệ thống pET vector là một hệ thống sử dụng T7 promoter, đây là một hệ

14

thống biểu hiện rất tốt ở E. coli. Gen đích được biểu hiện dưới sự điều hòa của T7

promoter, và sử dụng T7 RNA polymerase của tế bào vật chủ và được cảm ứng bởi

IPTG. Cấu trúc của hệ thống vector biểu hiện pET bao gồm các vùng sao chép,

vùng gen chỉ thị, vị trí đa điểm cắt, T7 promoter như cấu trúc của vector biểu hiện

pET-32a ở Hình 7. Vector pET-32a được thiết kế để nhân dòng và biểu hiện protein

ở mức độ cao khi trình tự peptide được dung hợp với protein thioredoxin Trx-

TagTM. Sau vị trí chèn gen là các vị trí của protein dung hợp His-Tag và S-Tag để

phát hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp. Trên vector cũng có trình tự nhận biết của

enzyme cắt protease thrombin giúp loại bỏ các protein dung hợp sau khi đã tinh

sạch được.

Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện pET-32a

Hệ thống biểu hiện ở pGEX vector

Đối với hệ thống biểu hiện ở pGEX vector của GE Healthcare, có nhiều các

gen dung hợp khác nhau, cùng được biểu hiện bởi tac promoter, với mức độ biểu

hiện cao với IPTG. Các vector pGEX đều có cấu trúc chung giống như các vector

biểu hiện khác, tuy nhiên, nó có dung hợp gen GST giúp protein đích được biểu

hiện tốt ở thể tan và có thể dễ dàng tinh sạch. Hình 8 mô tả cấu trúc của vector

pGEX-4T-1, vector này cũng gồm các vị trí như vùng sao chép, vùng chọn lọc, tac

promoter, vùng đa điểm cắt… Đặt biệt ở đầu N của protein tái tổ hợp sẽ được dung

hợp với đuôi GST giúp tinh sạch protein và vị trí nhận biết của protease thrombin

giúp cắt bỏ GST khỏi protein sau khi tinh sạch.

15

Hình 8: Cấu trúc vector biểu hiện pGEX-4T-1

1.5. Phương pháp tinh sạch sử dụng sắc ký ái lực

Phương pháp sắc ký ái lực là phương pháp phân tách và tinh sạch một phân

tử đặc hiệu từ một nhóm các phân tử trong một hỗn hợp. Phương pháp này dựa trên

mối tương tác sinh học đặc hiệu giữa hai phân tử ví dụ như giữa kháng nguyên và

kháng thể, enzyme và cơ chất, hay chất cho và chất nhận. Những mối tương tác này

được ứng dụng để tinh sạch một trong các phân tử tương tác, được gọi là phối tử ái

lực (affinity ligand), trên một ma trận chất rắn ở pha tĩnh, còn các phân tử đích ở

pha động.

Có rất nhiều biến thể trong quy trình tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái

lực nhưng đều dựa trên ba bước cơ bản được mô tả cụ thể ở Hình 9. Đầu tiên, ủ mẫu

(tế bào đã được ly giải, serum) trong môi trường đệm thích hợp để mẫu có thể bám

vào phối tử ái lực trên cột (ligand). Sau đó, hỗn hợp được rửa bỏ các thành phần,

các chất không đặc hiệu bằng dung dịch đệm mà vẫn duy trì được ái lực của phân tử

đích và ligand. Cuối cùng, phân tử đích từ hỗn hợp với ligand được thu bằng dung

dịch đệm làm thay đổi ái lực của phân tử đích và ligand.

16

Hình 9: Các bước tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực

Thông thường, các ligand được cố định và liên kết với các giá thể là chất

rắn, bằng cách hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm chức (ví dụ như:

cấu trúc bậc 1 của các nhóm amin, carboxylic axit, aldehyde…). Ví dụ như trường

hợp protein dung hợp với đuôi glutathione S-transferase (GST) sẽ dựa vào ái lực

giữa đuôi GST và chất khử glutathione. Hay là các protein dung hợp với như 6xHis,

polyHis – là những đuôi có ái lực với kim loại hóa trị II như nickel hay cobalt. Một

số đuôi dung hợp khác như HA, Myc, FLAG, SUMO hầu hết đều được gọi là đuôi

epitope vì chúng đòi hỏi phải có kháng thể đặc hiệu. Phương pháp sắc ký ái lực

được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm vì hệ thống sử dụng khá là đơn

giản, và hiệu suất cao.

1.5.1. Sắc ký ái lực Nickel

Việc tinh sạch protein tái tổ hợp là điều kiện tiên quyết trong rất nhiều ứng

dụng để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein. Protein tái tổ hợp được biểu

hiện với một loại protein dung hợp ở đầu N hoặc đầu C, giúp cho việc phát hiện và

tinh sạch được diễn ra dễ dàng. Một trong những protein dung hợp được sử dụng đó

là His-tag, nó gồm 6 – 9 histidine [35]. Vì kích thước rất nhỏ chỉ khoảng 0.84 kDa

cho nên đuôi này không làm thay đổi nhiều độ tích điện hay thường không làm ảnh

hưởng đến việc hình thành gấp xoắn, do đó không làm ảnh hưởng đến cấu trúc,

17

chức năng của protein [5]. Tuy nhiên đây cũng có thể là nhược điểm của phương

pháp này, vì có thế có những tương tác không đặc hiệu với các protein tổng số có

nhiều axit amin histidine.

Nguyên lý: Tinh sạch protein gắn đuôi His bằng phương pháp sắc ký ái lực

kim loại cố định (Immobilized metal affinity chromatography gọi tắt là IMAC) dựa

vào ái lực giữa nhóm axit amin Histidine và ion kim loại hóa trị II (Ni2+ hoặc Co2+)

như Hình 10. Những ion kim loại này được cố định trên ma trận sắc ký bằng

nitrilotriacetic acid (NTA) hoặc iminodiacetic acid (IDA) [4]. Điều kiện có thể thu

protein gắn đuôi His từ phương pháp IMAC dựa vào tính cạnh tranh của imidazole

với đuôi His.

Hình 10: Cơ chế tinh sạch của phương pháp sắc ký ái lực với Nickel [25]

Phương pháp ái lực với đuôi His và Ni-NTA phụ thuộc vào cấu trúc bậc một

của đuôi His, do đó protein gắn đuôi His có thể tinh sạch được ở điều kiện tự nhiên

hoặc điều kiện biến tính. Điều này có thể giúp tinh sạch các protein ở dạng thể vùi

khi biểu hiện ở mức độ cao ở E. coli. Protein gắn đuôi His có thể biểu hiện và tinh

sạch từ nhiều hệ thống khác nhau, trong số đó, phương pháp tinh sạch bằng IMAC

giúp thu được mức độ protein biểu hiện khá cao (từ 10-50 mg/l) và nhanh chóng

[29].

18

1.5.2. Sắc ký ái lực Glutathione

Ái lực glutathione là phương pháp rất hiệu quả để tinh sạch protein có gắn

đuôi dung hợp GST bằng một bước tinh sạch. Protein GST từ các nguồn khác nhau,

tự nhiên, hay tái tổ hợp ở E. coli hay các vật chủ khác, đều có thể dễ dàng tinh sạch

bằng phương pháp sắc ký ái lực với glutathione, được thu hồi bằng cách rửa giải với

lượng dư glutathione. GST có thể biểu hiện ở dạng tan trong tế bào E. coli với

lượng lớn và có hoạt tính. Hơn nữa, nhiều protein nhân thực không tan khi biểu hiện

ở E. coli có thể tan một phần khi biểu hiện cùng protein dung hợp là GST [19]. Do

đó, protein dung hợp GST được sử dụng phổ biến để làm tăng khả năng tan của một

số protein khi biểu hiện ở E. coli [34].

Các bước tinh sạch và nguyên lý tinh sạch rất đơn giản gồm ba bước chính

được mô tả như Hình 11 [19]. Đầu tiên, dựa vào lực bám của tripeptide ligand

glutathione với matrix được cố định (gel Sapharose) và lực tương tác của đuôi GST

và glutathione giúp protein tái tổ hợp có thể gắn lên cột. Sau đó, các protein tạp

được rửa trôi bởi dung dịch đệm rửa. Cuối cùng, protein dung hợp GST hay GST

đều dễ dàng thu được bởi dung dịch đệm có nồng độ glutathione từ 5-10 mM, dựa

vào tương tác cạnh tranh của glutathione trong môi trường đệm và glutathione trên

cột. Đối với các protein nghiên cứu cấu trúc, hay chức năng mà cần loại bỏ đuôi

GST, thì có thể loại bỏ được bằng các protease như Thrombin, preScission hay

factor Xa tùy thuộc vào vector lựa chọn. Phản ứng cắt này có thể phân cắt trực tiếp

trên cột để thu được protein mong muốn loại bỏ đuôi GST hoặc có thể tiếp tục tinh

sạch protein bằng phương pháp sắc ký lọc gel…

19

Hình 11: Cơ chế của phương pháp sắc ký ái lực với đuôi GST [19]

20

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu và hóa chất

2.1.1. Vật liệu

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng chủng vi khuẩn biểu hiện E.

coli BL21 DE3, vector biểu hiện pET-M (biến thể của vector pET 32a), vector biểu

hiện pGEX-4T-1 (Novagen). Các vật liệu này đều được nhận từ Phòng thí nghiệm

sinh học phân tử tế bào thuộc Trung tâm khoa học sự sống, Khoa Sinh học, trường

đại học Khoa học tự nhiên.

Trình tự gen mã hóa cho protein KOD DNA polymerase trên vector pUC19

và các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Kod-SalI R, Kod-BamHI F, Kod-EcoRI

R, T7 promoter, T7 terminator, pGEX 3’, pGEX 5’, KOD F, KOD R được tổng hợp

từ công ty TNHH MTV Phusa Biochem, Việt Nam. Các mồi có trình tự thể hiện

trên Bảng 2.

Bảng 2: Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng

Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’)

T7 promoter TAATACGACTCACTATAGGG

T7 terminator GCTAGTTATTGCTCAGCGG

pGEX 3’ CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG

pGEX 5’ GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG

KOD F GACCTATACCCTGGAAGCGG

KOD R AATATATTYGCGGCCCCACG

KOD-BamHI F GCggatccATTCTGGATACCGATTATATTACC

KOD-EcoRI R CGgaattcTTAGGTGCCTTTCGGTTT

KOD-SalI R CGgtcgacTTAGGTGCCTTTCGGTTT

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này được mua từ các hãng uy

tín như Bio-rad, Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Thermo scientific gồm có: Agarose,

Amoni sulfat, axit acetic, Ampicilline, APS, acrylamide, Bis-Acrylamide, β-

mercaptoethanol, BSA, Bromophenol blue, coomassie, DTT, EDTA, ethanol, SDS,

21

IPTG, Tris Base, Natri clorua, Kali clorua, glycerol, LB, LB agar, Methanol, Niken

clorua, Urea, Glutathione, dNTPs (Thermo scientific), HisPurTM Ni-NTA Resin

(Thermo scientific), Glutathione Sepharose 4B GST-tagged và một số hóa chất

thông dụng khác trong sinh học phân tử.

Các loại enzyme và một số bộ kit như FastDigest BamHI, FastDigest

EcoRI, FastDigest SalI, T4 DNA ligase, PhusionTM Hot Start II High-Fidelity DNA

polymerase, bộ hóa chất tách chiết plasmid GeneJET Plasmid Miniprep Kit

(Thermo Scientific), bộ hóa chất tinh sạch DNA MEGAquick-spinTM (iNtRON).

2.1.3. Dụng cụ và thiết bị

Các thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu được đặt tại Phòng

thí nghiệm Sinh học phân tử tế bào, Trung tâm khoa học sự sống và bộ môn Di

truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, được liệt kê ở

Bảng 3.

Bảng 3: Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị và dụng cụ Hãng và nước sản xuất

Máy ly tâm lạnh 5430R Eppendorf (Đức)

Máy PCR Eppendorf (Đức)

Máy điện di Powerpac 300 Bio-Rad, America

Hệ thống soi gel Thermo Scientific, Mỹ

Máy điện di DNA Mupid-EXU Nhật Bản

Máy lắc ổn nhiệt Hàn Quốc

Máy quang phổ Thermo Scientific, Mỹ

Máy điện di protein LONZA LONZA, Thụy Sĩ

Bể ổn nhiệt Memmert, Đức

Máy quang phổ nanodrop

Máy siêu âm LABONIC® M LABONIC® M, Đức

Máy chuẩn độ pH cầm tay HANNA

Cột tinh sạch Econo-column Biorad

Pipet, đầu tip, ống Eppendorf, ống Biologix Fancol 50ml, ống Fancol 15ml

22

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được sơ đồ hóa các bước như Hình 12.

Hình 12: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu

2.2.2. Tổng hợp và nhân dòng gen KOD

− Tối ưu mã bộ ba và tổng hợp gen KOD

Trình tự axit amin của protein KOD từ vi khuẩn Thermococcus

kodakarensis KOD1 (gene bank: BAD84190.1) được lấy trên ngân hàng gen để tối

ưu mã bộ ba sử dụng phần mềm OptimumGene trên trang web GenScript.

OptimumGene là phần mềm của công ty hàng đầu thế giới về dịch vụ tổng hợp gen.

Các thuật toán mà OptimumGene đưa vào xem xét rất nhiều các yếu tố quan trọng

liên quan đến giai đoạn khác nhau của biểu hiện protein, ví dụ như khả năng thích

ứng codon, cấu trúc mRNA, yếu tố phiên mã và dịch mã. Các tham số được sử dụng

trong phần mềm OptimumGene đó là chỉ số thích nghi codon (Codon Adaptation

index – CAI), thành phần codon (codon context), Hàm lượng GC phân bố trong gen

(GC content), cấu trúc bậc hai của mRNA và loại bỏ motif trong trình tự (Motif

avoidance). Chỉ số CAI có giá trị dao động từ 0 đến 1. Giá trị CAI càng gần 1 thì

23

các gen có xu hướng sử dụng các codon phổ biến đối với hệ thống biểu hiện, giá trị

CAI càng gần 0 thì các gen sử dụng các codon không hoặc ít được dùng trong hệ

thống biểu hiện đó. Hàm lượng GC tốt nhất nên từ 30% - 70%, tỉ lệ GC càng cao thì

lực liên kết giữa hai mạch sẽ lớn, gây khó khăn cho sự phá vỡ các liên kết trong

việc tách mạch để PCR. Cấu trúc bậc hai của mRNA quyết định tính bền của phân

tử, còn ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tham gia vào quá trình dịch mã tạo protein

[1].

Trình tự gen nhận được từ phần mềm sẽ được kiểm tra lại vị trí cắt enzyme

giới hạn, các chỉ số và được tổng hợp bằng phương pháp hóa học bởi công ty sinh

hóa Phù Sa (PHUSA Biochem, Việt Nam).

− Khuếch đại đoạn chèn bằng phản ứng PCR

DNA đoạn chèn được khuếch đại bằng phản ứng PCR, sử dụng khuôn là

vector pUC19-KOD. Mồi xuôi và ngược được sử dụng trong phản ứng PCR chứa vị

trí cắt của enzyme cắt giới hạn BamH I và EcoR I. 50µl hỗn hợp phản ứng gồm 1.5

µl plasmid pUC19-KOD (10 ng/µl), 1µl dNTPs 10 mM, 1.5 µl mồi xuôi và ngược,

5x Phusion HF buffer, 0.01 U Phusion DNA Polymerase (Thermo scientific). Phản

ứng PCR được thực hiện 35 chu kỳ với thời gian biến tính 98°C 30s, thời gian gắn

mồi là 15 giây ở 62°C và thời gian kéo dài 60 giây ở 72°C. Sản phẩm PCR được

phân tích trên gel agarose TAE 1% và tinh sạch sử dụng Gel Extraction Kit

(Quiagen) dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.2.3. Thiết kế vector biểu hiện mang gen KOD

− Cắt, nối gen vào vector biểu hiện

DNA mã hóa cho protein KOD sau đó được chèn vào vector biểu hiện

pETM (vector pET-32a đã được loại bỏ S-tag và Thioredoxin tag). DNA đoạn chèn

và plasmid pETM đều được cắt bởi enzyme cắt giới hạn BamHI và EcoRI (Thermo

scientific). 10 µl sản phẩm PCR được cắt trong hỗn hợp gồm 4 µl 10x Fast Digest

buffer, 1 µl BamHI, 1.5 µl EcoRI và thêm nước cho đủ thể tích 40 µl. Tương tự, 3

µl plasmid pETM cũng được cắt trong hỗn hợp gồm 4 µl 10x Fast Digest buffer, 1

µl BamHI, 1 µl EcoRI và thêm nước cho đủ thể tích 40 µl (Bảng 5). Hai hỗn hợp

này đều được ủ ở 37°C trong hai giờ. Sản phẩm cắt của plasmid và gen được trộn

24

theo tỉ lệ 1:1 và tinh sạch sử dụng bộ sử dụng Gel Extraction Kit (Quiagen) dựa trên

hướng dẫn của nhà sản xuất.

Đối với gen được chèn vào vector pGEX-4T-1, DNA đoạn chèn và plasmid

pGEX-4T-1 đều được cắt bởi enzyme cắt giới hạn BamHI và SalI (Thermo

scientific). Thể tích và thành phần của phản ứng cắt tương tự như đối với cắt gen

vào vector pETM chỉ khác ở enzyme EcoRI được thay bằng SalI (Bảng 5).

Bảng 4: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn

Thành phần DNA Plasmid

23.5 µl 31 µl H2O

10X Fast Digest buffer 4 µl 4 µl

BamHI 1 µl 1 µl

EcoRI/ SalI 1.5 µl 1 µl

Khuôn 10 µl 3 µl

Sản phẩm tinh sạch plasmid và DNA sau đó được ủ với enzyme nối T4

DNA ligase với thành phần gồm 16 µl sản phẩm tinh sạch plasmid và DNA đoạn

chèn, 2 µl 10X T4 DNA ligase, 2 µl T4 DNA ligase (Bảng 6). Quá trình nối được

thực hiện ở nhiệt độ phòng trong một tiếng. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào

khả biến E. coli BL21 DE3.

Bảng 5: Thành phần phản ứng nối

Thành phần DNA

10X T4 DNA ligase 2µl

T4 DNA ligase 2 µl

Khuôn (DNA+plasmid) 16 µl

− Biến nạp sản phẩm nối DNA vào tế bào khả biến E. coli BL21 DE3

Tế bào khả biến E. coli BL21 được lấy ra từ -80 °C và ủ trên đá. 20 µl hỗn

hợp phản ứng nối được thêm vào 100 µl tế bào khả biến và ủ trên đá 20 phút. Tế

bào sau đó được sốc nhiệt ở 42 °C, 1 phút trước khi ủ 5 phút trên đá. Bổ sung 500

µl LB lỏng vào tế bào, ủ ở 37 °C trong 15 phút, sau đó được nuôi lắc ở 37 °C, và

trong một tiếng. Tế bào được ly tâm 6000 rpm trong 2 phút và loại bỏ 500 µl dịch

25

nổi. Lượng tế bào còn lại được hòa tan và cấy trải trên đĩa thạch LB chứa 100 µg/ml

kháng sinh amp để chọn lọc. Tế bào được nuôi cấy ở đĩa thạch trong 37 °C qua

đêm.

− PCR sàng lọc khuẩn lạc

Phương pháp PCR sàng lọc khuẩn lạc được sử dụng để xác nhận DNA đã

được chèn vào vector. Chọn một vài khuẩn lạc mọc riêng rẽ có kích thước trung

bình và đánh dấu số thứ tự trên đĩa thạch. Sử dụng đầu tip lấy một nửa khuẩn lạc

được đánh dấu và hòa tan tế bào này trong 50 µl nước cất đã khử trùng trong ống

microcentrifuge, hỗn hợp này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Phản

ứng PCR được tiến hành trong 10µl hỗn hợp chứa 2µl 5X HF buffer, 0.2 µl dNTPs

10 mM, 0.3 µl mồi T7 promoter và T7 terminator (Bảng 3) đối với vector pET-M

và cặp mồi pGEX 3’ và 5’ đối với vector pGEX-4T-1, 0.002U Phusion DNA

polymerase, 0.5 µl khuôn và nước. Phản ứng PCR được thực hiện trong 35 chu kỳ

với thời gian biến tính 15s ở 98 °C, gắn mồi 10s ở 53 °C, kéo dài 1 phút ở 72 °C,

mỗi chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5%.

− Phân lập plasmid DNA

Khuẩn lạc chứa DNA đoạn chèn đúng kích thước được chọn lọc từ phản

ứng PCR khuẩn lạc được chuyển sang nuôi cấy qua đêm trong 10 ml LB lỏng chứa

ampicillin 100 µg/ml, ở 37 °C, qua đêm. 5 ml dịch nuôi cấy qua đêm thu được ly

tâm 13000 rpm, 2 phút để thu tế bào. Plasmid được tách chiết sử dụng GeneJET

Plasmid Miniprep Kit (Thermo scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA

plasmid thu được trong 40 µl nước cất. Nồng độ plasmid được đo ở bước sóng

A260 trên máy Nanodrop.

− Giải trình tự plasmid

Plasmid tách chiết được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR để giải trình

tự. Khoảng 10 ng plasmid được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự

trong hỗn hợp chứa 0.6 µl mồi T7 promoter, 0.6 µl mồi T7 terminator, 2 µl 5X HF

buffer, 0.4 µl dNTPs 10mM, 0.002U Phusion DNA polymerase và nước cho đủ thể

tích 20 µl. Phản ứng PCR được thực hiện 35 chu kỳ với thời gian biến tính 30s ở 98

°C, gắn mồi 10s ở 53 °C, kéo dài 1 phút ở 72 °C, mỗi chu kỳ. Sản phẩm PCR được

điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5% và được gửi đi đọc trình tự sử dụng 2 cặp mồi

26

T7 promoter, T7 terminator và KOD-F , KOD-R (Bảng 4) ở công ty 1st BASE

(Malaysia) theo phương pháp Sanger.

2.2.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp

− Biến nạp plasmid vào tế bào khả biến E. coli BL21 DE3

Vector biểu hiện chứa gen mã hóa KOD được biến nạp vào tế bào khả biến

BL21 (DE3) để biểu hiện protein tái tổ hợp. Tế bào khả biến E. coli BL21 được lấy

ra từ -80 °C và ủ trên đá. 0.5µl plasmid được thêm vào 100 µl tế bào khả biến và ủ

trên đá 20 phút. Tế bào sau đó được sốc nhiệt ở 42 °C, 1 phút trước khi ủ 5 phút

trên đá. Bổ sung 500 µl LB lỏng vào tế bào, ủ ở 37 °C trong 15 phút, sau đó được

nuôi lắc ở 37 °C, một tiếng. Tế bào được ly tâm 6000 rpm trong 2 phút và loại bỏ

500 µl dịch nổi. Lượng tế bào còn lại được hòa tan và cấy trải trên đĩa thạch LB

chứa 100 µg/ml kháng sinh amp để chọn lọc. Đĩa thạch được ủ 37 °C qua đêm.

− Biểu hiện protein tái tổ hợp

Chọn một khuẩn lạc chứa plasmid mong muốn từ đĩa thạch, nuôi cấy qua

đêm trong 5ml LB lỏng chứa 100 µg/ml ampicillin. 1 ml dịch nuôi cấy qua đêm

được chuyển sang 500 ml LB lỏng chứa 100 µg/ml ampicillin và được nuôi cấy ở

37°C. Khi mật độ tế bào ở bước sóng 600 nm (OD600) đạt 0.6, bổ sung chất cảm ứng

IPTG với nồng độ cuối cùng là 0.3 mM. Protein tái tổ hợp được biểu hiện ở 37°C

trong 16 tiếng. Tế bào được thu bằng ly tâm trong 15 phút, ở 4°C với tốc độ 4000

rpm. Dịch nổi được loại bỏ và cặn tế bào thu được bảo quản ở -20°C cho đến khi

tinh sạch. Kết quả biểu hiện được điện di kiểm tra bằng phương pháp điện di protein

SDS – PAGE.

2.2.5. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực

− Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel với protein

KOD-His

Để tối ưu quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp có độ tinh sạch tốt nhất,

chúng tôi đã kết hợp phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực Nickel với nhưng điều

kiện khác nhau. Cụ thể, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein tái tổ hợp bằng

phương pháp sắc ký ái lực Nickel ở dạng tự nhiên, biến tính bởi nhiệt và biến tính

bằng Urea ở các nồng độ khác nhau.

27

− Tinh sạch protein gắn đuôi 6xHistidine bằng ái lực nickel ở dạng tự

nhiên

Cặn tế bào thu được từ 500 ml môi trường nuôi cấy được hòa trong 25 ml

dung dịch đệm nickel-binding (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.3M NaCl, 5mM

Imidazole). Tế bào được phá vỡ bằng hệ thống siêu âm ở 4°C trong 1 giờ với thời

gian 5 phút cho mỗi lần. Sau đó, dịch tế bào được ly tâm trong 30 phút, 13000 rpm

ở 4°C để loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc Acrodisc®

Syringe 0.2 µm trước khi tra vào cột Econo-column (Biorad) đã được nạp sẵn

Nickel và được ủ sẵn với nickel-binding buffer. Phần dịch nổi được đưa lên cột và ủ

trên đá 10 phút. Sau đó, cột được rửa 10 lần với dung dịch washing (50 mM Tris-

HCl pH 8.0, 0.3M NaCl, 30mM Imidazole). Protein được tách khỏi cột bằng dung

dịch Elution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole). Sau khi

tinh sạch, protein được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE.

− Tinh sạch protein gắn đuôi 6xHistidine bằng ái lực nickel kết hợp với sử

dụng nhiệt

Phương pháp sử dụng nhiệt độ cao và ly tâm được sử dụng trong việc biến

tính và loại bỏ các protein tổng số khi tinh sạch DNA polymerase đã được áp dụng

trong nhiều nghiên cứu [7, 12, 38]. Dựa trên tính bền nhiệt của DNA polymerase,

chúng tôi sử dụng nhiệt độ cao để biến tính các protein tổng số của vi khuẩn, kết

hợp với ly tâm lạnh để loại bỏ các protein biến tính này. Dịch tế bào thu được sau

bước siêu âm phá vỡ tế bào (như mô tả ở phần tinh sạch protein gắn đuôi His ở

trạng thái tự nhiên) được ủ ở nhiệt độ 75°C và 85°C trong 15 phút, sau đó để trên đá

10 phút và ly tâm ở 13000 rpm, 4°C trong 30 phút. Phần dịch nổi sau ly tâm sẽ

được thu và tinh sạch sử dụng phương pháp sắc ký với Nickel như mô tả ở phần

tinh sạch ở trạng thái tự nhiên. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp

điện di trên gel SDS – PAGE.

− Tinh sạch protein gắn đuôi 6xHistidine dưới điều kiện biến tính

Cặn tế bào thu được từ 100 ml môi trường nuôi cấy được hòa trong 5 ml

dung dịch đệm nickel-binding có bổ sung Urea với nồng độ lần lượt là 2 M, 4 M và

6 M (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazole, 2M/4M/6M Urea).

Tế bào được phá vỡ bằng hệ thống siêu âm ở 4°C trong 1 giờ với thời gian 5 phút

28

cho mỗi lần. Sau đó, dịch tế bào được ly tâm trong 30 phút, 13000 rpm ở 4°C để

loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc Acrodisc® Syringe 0.2 µm

trước khi tra vào cột Econo-column (Biorad) đã được nạp sẵn Nickel và được ủ sẵn

với nickel-binding buffer. Phần dịch nổi được đưa lên cột và ủ trên đá 10 phút. Sau

đó, cột được rửa 10 lần với dung dịch washing có bổ sung Urea với các nồng độ

tương ứng với nồng độ ở dung dịch binding lần lượt là 2M, 4M và 6M (50 mM

Tris-HCl pH 8.0, 0.3M NaCl, 30mM Imidazole, 2M/4M/6M Urea). Protein được

tách khỏi cột bằng dung dịch Elution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 500

mM Imidazole). Sau khi tinh sạch, protein được phân tích bằng phương pháp điện

di trên gel SDS-PAGE.

− Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực GST

Cặn tế bào thu được từ 500 ml môi trường nuôi cấy được hòa trong 25 ml

dung dịch đệm PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM

KH2PO4 pH 7.4). Tế bào được phá vỡ bằng hệ thống siêu âm ở 4°C trong 1 giờ với

thời gian 5 phút cho mỗi lần. Sau đó, dịch tế bào được ly tâm trong 30 phút, 13000

rpm ở 4°C để loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc Acrodisc®

Syringe 0.2 µm trước khi tra vào cột Econo-column (Biorad) đã được nạp sẵn

Glutathione Sepharose 4B GST-tagged resin và cân bằng với đệm PBS. Phần dịch

nổi được đưa lên cột và ủ trên đá 10 phút. Sau đó, cột được rửa 10 lần với dung dịch

đệm PBS. Protein được tách khỏi cột bằng đệm Elution (50 mM Tris-HCl pH 8.0,

300 mM NaCl, 10mM glutathione). Sau khi tinh sạch, protein được phân tích bằng

phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE.

2.2.6. Thẩm tách protein

Protein sau khi được tinh sạch sẽ được thẩm tách trong 1 lít dung dịch đệm

A (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl) trong 6 tiếng. Sau đó, protein được

thẩm tách tiếp trong 1 lít dung dịch đệm B (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl)

qua đêm. Cuối cùng protein được thẩm tách chuyển sang dung dịch đệm bảo quản

(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Nonidet

P-40, 0.5% Tween 20, 50% glycerol). Enzyme trong dung dịch bảo quản được để ở

-20°C và sử dụng cho các phản ứng kiểm tra hoạt tính enzyme.

29

2.2.7. Thử hoạt tính enzyme

Để đánh giá hoạt tính của enzyme tinh sạch được, protein tái tổ hợp được

đem thử trong các phản ứng PCR, và so sánh bằng độ đậm nhạt của băng DNA trên

gel Agarose. Protein được kiểm tra hoạt tính, xác định tương đối đơn vị hoạt độ và

tối ưu các đệm phù hợp cho phản ứng PCR.

− Xác định đơn vị hoạt độ của enzyme

Xác định đơn vị hoạt độ của DNA polymerase bằng cách so sánh độ đậm

nhạt của băng DNA sản phẩm của lượng enzyme khác nhau [18, 22], so sánh KOD-

His, KOD-GST và enzyme Phusion DNA polymerase của hãng Thermo scientific.

Hoạt tính enzyme ban đầu được thử với phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen có kích

thước nhỏ 260 bp và 400 bp, với dung dịch đệm 5X HF của hãng Thermo scientific

để kiểm tra hoạt tính và xác định tương đối đơn vị của enzyme so sánh với Phusion

DNA polymerase của hãng Thermo scientific. Phản ứng PCR có thời gian biến tính

ban đầu là 2 phút ở 95 °C, gồm 35 chu kỳ với thời gian biến tính là 95°C trong 15 s,

gắn mồi ở 55 °C trong 15s, và kéo dài ở 72°C trong 10s. 10µl hỗn hợp phản ứng

PCR gồm 2 µl 5X HF buffer, 0.2 µl dNTPs 10 mM, 0.3 µl xuôi và ngược, 10 ng

khuôn plasmid, DNA polymerase với các thể tích khác nhau từ 0.3 – 3 µl, và nước.

Kết quả phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 2%, nhuộm EtBr và quan sát

dưới tia UV để đánh giá hoạt tính enzyme.

− Thử hoạt tính enzyme với các loại đệm chạy PCR và các kích thước gen

khác nhau

Hai loại enzyme KOD-His và KOD-GST được thử hoạt tính với các loại

kích thước gen khác nhau. Các loại khuôn và mồi có kích thước 500 bp, 1100 bp và

2400 bp đều được chúng tôi tối ưu và lựa chọn nồng độ phù hợp. Dựa trên những

nghiên cứu trước đây về thành phần và nồng độ các chất trong đệm PCR, chúng tôi

lựa chọn thành phần đệm 10x buffer có nồng độ các chất là 10 mM Tris HCl, 1 mM

(NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.01% Triton X100 và 0.1 mg/ml BSA, và

các đệm lựa chọn các pH khác nhau 7.5, 8.0 và 8.8. Ngoài ra chúng tôi cũng so sánh

với đệm 5X HF buffer của hãng Thermo scientific để làm đối chứng.

30

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nhân dòng gen KOD

3.1.1. Tối ưu mã bộ ba và tổng hợp gen KOD

Trình tự gen mã hóa cho protein KOD được tối ưu mã bộ ba để biểu hiện

trong vật chủ E. coli sử dụng phần mềm OptimumGene trên trang web GenScript.

Kết quả phân tích trình tự nhận được ở Bảng 7, theo đó, trình tự DNA đã được tối

ưu có chỉ số CAI 1.00 đạt giá trị lý tưởng. Hơn nữa hàm lượng GC là 49.55% và chỉ

số CFD là 0% đều trong khoảng giá trị lý tưởng. Do đó chúng tôi đã lựa chọn và đặt

tổng hợp trình tự này bởi phương pháp hóa học tại công ty sinh hóa Phù Sa. Trình

tự gen KOD được tổng hợp và thiết kế vào vector nhân dòng pUC19 với nồng độ

184 ng/µl.

Bảng 6: Kết quả phân tích tối ưu mã bộ ba sử dụng GenScript

Kết quả phân tích tối ưu mã bộ ba

Giá trị Giá trị lý Điều kiện

thực tưởng

Chỉ số thích ứng 1.00 0.8-1.0 • Chỉ số CAI là 1.0 được coi là

codon lý tưởng

(Codon adaptation • Chỉ số CAI càng thấp thì khả

Index – CAI) năng biểu hiện gen càng kém

Hàm lượng GC 49.55% 30% - 70% • Phần trăm GC lý tưởng trong

khoảng 30% đến 70%

Phân bố tần số 0% < 30% • Trình tự gen không được tối

codon ưu mã bộ ba có thể làm giảm

(Codon Frequency hiệu suất quá trình dịch mã

Distribution - CFD)

3.1.2. Khuếch đại đoạn chèn bằng phản ứng PCR

Đoạn DNA mã hóa cho protein KOD từ vector pUC19-KOD được nhân

dòng bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Đoạn gen được nhân lên có kích

thước 2341 bp, có vị trí cắt của hai enzyme cắt giới hạn BamHI và EcoRI ở hai đầu

5’ và 3’, đảm bảo cho gen sau khi được cắt và chèn vào vector pET-M sẽ giữ đúng

31

khung đọc. Tương tự đoạn gen được chèn vào vector pGEX-4T-1 cũng có vị trí cắt

của hai enzyme BamHI và SalI ở hai đầu 5’ và 3’.

Phản ứng PCR được thực hiện với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

giống như đã mô tả ở phần phương pháp. Sản phẩm PCR được điện di trê n gel

agarose 1% và quan sát kết quả dưới máy soi gel. Kết quả điện di sản phẩm PCR

được thể hiện trên Hình 12, trong đó, marker M là thang DNA chuẩn giúp xác định

kích thước tương đối của các băng DNA trong mẫu cần phân tích. Trong các đường

chạy mẫu phân tích KOD-pGEX và KOD-pETM đều xuất hiện một băng duy nhất

có kích thước khoảng trên 2300 bp tương đương với kích thước lý thuyết của gen

Kod. Điều này chỉ ra rằng, chúng tôi đã nhân thành công đoạn gen mã hóa cho

KOD DNA polymerase bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu KOD BamHI

F và KOD EcoRI R, Kod BamHI F và KOD SalI R. Độ sáng của băng sản phẩm

được so sánh với thang chuẩn cho thấy nồng độ sản phẩm PCR cao, có thể sử dụng

cho phản ứng cắt nối.

A B

Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen KOD từ vector pUC19-KOD

(A) Đường chạy KOD pETM: sản phẩm PCR nhân gen KOD chứa trình tự cắt BamHI và EcoRI ở hai đầu 5’ và 3’, so sánh với thang chuẩn 1 kb của hãng intRon ở đường chạy M. (B) Đường chạy KOD pGEX: sản phẩm PCR nhân gen KOD chứa trình tự cắt BamHI và SalI ở hai đầu 5’ và 3’, so sánh với thang chuẩn DNA 1 kb ở đường chạy M..

3.1.3. Chèn đoạn gen mã hóa KOD vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1.

Sau khi có được sản phẩm PCR của gen mã hóa cho KOD DNA

polymerase, chúng tôi tiến hành cắt, nối đoạn gen này vào vector biểu hiện pET-M

và pGEX-4T-1, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 DE3. Tế bào nhận

32

plasmid và gen đã nối được cấy trải trên đĩa thạch LB và chọn lọc bởi kháng sinh

ampicillin 100 mg/ml. Khuẩn lạc mọc được là khuẩn có thể chứa vector đã được

chèn gen. Kết quả biến nạp ở Hình 14 cho thấy có khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa môi

trường có kháng sinh. Điều này chứng tỏ tế bào E. coli BL21 DE3 có khả năng đã

mang vector tái tổ hợp mong muốn.

(A) KOD – pET-M (B) KOD – pGEX-4T-1

Hình 14: Kết quả biến nạp sản phẩm lai KOD-pET-M và KOD-pGEX-4T-1 vào tế bào

E. coli BL21 DE3.

(A) Đĩa thạch có amp được cấy tế bào E. coli BL21 được biến nạp sản phẩm nối của gen KOD và vector pET-M, (B) Đĩa thạch có amp được cấy tế bào E. coli BL21 được biến nạp sản phẩm nối của gen KOD và vector pGEX-4T-1.

Để xác định được chắc chắn vector pET-M đã mang gen KOD mong muốn,

chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi T7 promoter và

T7 terminator nhân từ 2 vùng biên của MCS trên vector để xác định đoạn gen đã

được chèn vào vector. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose ở Hình 14-A

cho thấy khuẩn lạc số 3 trong số ba khuẩn lạc đã chọn ở sản phẩm nối với vector

pET-M có xuất hiện băng có kích thước khoảng 2600 bp tương đương với kích

thước tính toán lý thuyết.

Tương tự với đĩa thạch của sản phẩm nối gen KOD với vector pGEX-4T-1

ở Hình 14-B, có khuẩn lạc số 5 trong số năm khuẩn lạc được lựa chọn có chứa băng

DNA có kích thước khoảng 2400 bp tương đương với kích thước lý thuyết khi sử

dụng cặp mồi pGEX 5’ và pGEX 3’ trên vector pGEX-4T-1.

33

A: BL21-pETM- KOD B: BL21-pGEX4T1- KOD

Hình 15: Kết quả PCR khuẩn lạc A: Sản phẩm PCR các khuẩn lạc 1, 2, 3 chọn từ đĩa thạch nuôi cấy tế bào E. coli chứa sản phẩm chèn gen KOD vào vector pETM được ký hiệu KL1, KL2, KL3, so sánh với thang chuẩn M1kb. B: sản phẩn PCR từ 5 khuẩn lạc từ đĩa từ thạch nuôi cấy tế bào E. coli chứa sản phẩm chèn gen KOD vào vector pGEX-4T-1 được ký hiệu KL1 đến KL5, so sánh với thang chuẩn 1 kb (M).

Hai khuẩn lạc từ hai đĩa thạch cho sản phẩm PCR có kích thước mong

muốn được lựa chọn và nuôi cấy trong môi trường LB lỏng để tách plasmid và PCR

để gửi đi giải trình tự.

3.1.4. Kết quả tách chiết plasmid DNA

Khuẩn lạc chứa DNA đoạn chèn đúng kích thước được chọn lọc từ phản

ứng PCR khuẩn lạc được chuyển sang nuôi cấy qua đêm trong LB lỏng và dùng để

tách chiết plasmid sử dụng GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo scientific) theo

hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA plasmid thu được được điện di trên gel agarose

1% và cho kết quả băng sáng rõ trên Hình 16. Nồng độ plasmid được đo ở bước

sóng A260 là 150 ng/µl và 138 ng/µl lần lượt với plasmid pETM-KOD và pGEX-

4T-1-KOD.

A B

34

Hình 16: Kết quả điện di plasmid A – Sản phẩm điện di plasmid pETM-KOD, B – Sản phẩm điện di plasmid pGEX-4T-1 KOD

3.1.5. Giải trình tự plasmid

Plasmid tách chiết được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR để giải trình

tự. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5% cho kết quả có một

băng sáng (Hình 17) và đủ tiêu chuẩn để gửi đi đọc trình tự ở công ty 1st BASE

(Malaysia) theo phương pháp Sanger. Trình tự của KOD được giải bằng cặp mồi T7

promoter và T7 terminator; Kod-F và Kod-R để xác định đoạn gen đã được chèn

đúng khung đọc và xác định chính xác trình tự của toàn bộ đoạn gen mã hóa cho

KOD DNA polymerase.

A B

Hình 17: Kết quả PCR kiểm tra plasmid A: Kết quả PCR kiểm tra plasmid pETM-KOD từ hai vùng biên để giải trình tự, B: Kết quả PCR có khuôn là plasmid pGEX4T1-KOD

Trình tự gen thu được tiếp tục được dịch mã thành trình tự axit amin sử

dụng công cụ SnapGene và được so sánh với trình tự axit amin của KOD gốc. Kết

quả so sánh trình tự bằng công cụ tin sinh CLUSTALW được trình bày ở Hình 18.

Kết quả so sánh trình tự chỉ ra rằng, trình tự gen mà chúng tôi chèn vào vector biểu

hiện pET-M hay pGEX-4T-1 giống với trình tự gốc, chỉ khác ở trình tự giải được

trên vector pET-M có chứa trình tự cắt thrombin và đuôi 6xHis, còn trên vector

pGEX-4T-1 có chứa trình tự cắt thrombin. Như vậy kết quả chứng tỏ gen KOD đã

được chèn vào vector biểu hiện không có đột biến và đã đúng khung đọc của vector.

35

Hình 18: So sánh trình tự axit amin của KOD với trình tự KOD gốc Trình tự amino acid kí hiệu KOD (tương ứng cho KOD trên ngân hàng gen), pGEX4t1Kod: tương ứng với trình tự KOD trên vector pGEX-4T-1, pETMKod là trình tự axit amin trên vector pETM. Đuôi peptide chứa 6 histidine và trình tự cắt thrommbin (màu đỏ), và trình tự cắt gồm 6 acid amin của thrombin (đỏ). Dấu “*” thể hiện sự tương đồng giữa các acid amin của hai trình tự.

3.2. Biểu hiện protein tái tổ hợp

Gen mã hóa cho KOD DNA polymerase trên vector pET-M và pGEX-4T-1

được biến nạp và biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 (DE3). Chủng E. coli BL21 là

chủng được thiết kế mang gen khử tính độc của promoter T7 sử dụng trong hệ

thống vector biểu hiện pET, ngoài ra nó cũng được dùng để biểu hiện được với hệ

thống promoter tac trong vector biểu hiện pGEX-4T-1. Tế bào chứa vector tái tổ

hợp được biểu hiện trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin với nồng độ

chất cảm ứng IPTG 0.3 mM trong 16 tiếng. Kết quả biểu hiện KOD DNA

polymerase được phân tích bằng phương pháp điện di SDS-PAGE thể hiện trên

Hình 19 và 20.

Kết quả biểu hiện protein KOD gắn đuôi Histidine (KOD-His) được thể

hiện trên Hình 19. Ở đường chạy thứ 3, mẫu tế bào có cảm ứng bằng IPTG 0.3 mM

(mẫu BL21-KOD-His + IPTG) đã xuất hiện băng đậm có kích thước gần 92 kDa.

36

Kích thước này tương ứng với kích thước của KOD DNA polymerase có gắn đuôi

His. Trong khi đó, ở mẫu đối chứng (mẫu BL21-KOD-His không IPTG), không có

băng protein có kích thước tương ứng này. Kết quả này chứng tỏ rằng, protein

KOD-His đã được biểu hiện trong tế bào BL21 (DE3).

Hình 19: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi 6xHis ở tế bào BL21 Mẫu BL21-KOD-His +IPTG là mẫu cảm ứng biểu hiện bằng IPTG được so sánh với mẫu đối chứng là BL21-KOD-His không IPTG (mẫu không có chất cảm ứng IPTG.

Tương tự, Hình 20 thể hiện kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp KOD gắn

đuôi GST. Ở giếng BL21-KOD-GST +IPTG, có một băng đặc trưng kích thước của

protein KOD có gắn đuôi GST (KOD-GST) khoảng 116 kDa, kích thước này bao

gồm protein KOD (90 kDa) và đuôi GST (26 kDa). Trong khi, ở giếng đối chứng

thì không có băng này. Như vậy, protein KOD gắn đuôi GST đều được biểu hiện

thành công ở nồng độ IPTG 0.3 mM và ở 37°C.

37

Hình 20: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi GST ở tế bào BL21 Mẫu BL21-KOD-GST +IPTG là mẫu cảm ứng biểu hiện bằng IPTG 0.3 mM được so sánh với mẫu đối chứng là BL21-KOD-GST không IPTG (mẫu không có chất cảm ứng IPTG).

3.3. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực

3.3.1. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel

− Kết quả tinh sạch protein KOD-His bằng phương pháp sắc ký ái lực

nickel ở trạng thái tự nhiên

Sau khi biểu hiện thành công protein KOD có gắn đuôi Histidine, chúng tôi

tiếp tục tiến hành tinh sạch protein này bằng phương pháp sắc ký ái lực, sử dụng cột

có gắn ion nickel. Do được biểu hiện bằng hệ thống vector biểu hiện pET-M nên

protein tạo ra có thêm 1 trình tự gồm 6 axit amin Histidin. Trình tự His-tag này giúp

protein tái tổ hợp có thể bám với hạt nikel trên cột, còn các protein khác sẽ bị rửa

trôi bởi dung dịch đệm rửa. Protein tinh sạch được phân tích trên gel SDS-PAGE

10% và được thể hiện trên Hình 21. Trên đường chạy cuối cùng, KOD-His là sản

phẩm protein sau khi tinh sạch, có xuất hiện băng chính KOD, tuy nhiên vẫn còn rất

nhiều băng protein tạp. Do đó, cần có các quy trình tối ưu quá trình tinh sạch

protein KOD-His.

38

Hình 21: Kết quả tinh sạch protein KOD-His

M: thang chuẩn protein. Đường chạy KOD-His +IPTG là kết quả biểu hiện protein có chất cảm ứng IPTG được so sánh với mẫu không có IPTG ở đường chạy K IPTG. Đường chạy cuối cùng là protein KOD-His sau khi tinh sạch.

Do kết quả tinh sạch ở điều kiện thường không cho kết quả tốt, do đó,

chúng tôi đã tối ưu quy trình tinh sạch protein KOD-His với nhiều phương pháp

khác như dùng nhiệt độ để loại bỏ các băng tạp, hay tinh sạch ở điều kiện biến tính

protein sử dụng Urea ở các nồng độ khác nhau.

− Kết quả tinh sạch protein KOD-His bằng phương pháp sắc ký ái lực

Nickel kết hợp biến tinh bằng nhiệt

Dựa vào tính bền nhiệt của DNA polymerase và một số nghiên cứu tinh

sạch các loại DNA polymerase khác đã áp dụng phương pháp dùng nhiệt để biến

tính các protein khác [12, 18, 32]. Chúng tôi đã tiến hành ủ dịch tế bào sau phá vỡ ở

nhiệt độ 75°C trong 15 phút để loại bỏ các protein tổng số, tuy nhiên kết quả ở hình

22 cho thấy, lượng protein tái tổ hợp tồn tại hầu hết ở pha cặn (mẫu Tủa sau ủ 75)

so sánh với pha dịch sau khi ủ ở 75°C (Dịch pv sau ủ 75) thì băng protein KOD-His

đã giảm đi đáng kể. Mẫu tinh sạch protein ở giếng cuối (Dịch tinh sạch) cũng không

có băng protein KOD-His. Như vậy nhiệt độ có thể làm ảnh hưởng đến tính tan của

KOD DNA polymerase, khi những protein bám vào polymerase bị phân hủy thì kéo

theo KOD DNA polymerase cũng tồn tại ở pha cặn.

39

Hình 22: Kết quả tối tinh sạch KOD-His kết hợp với biến tính bằng nhiệt M: thang chuẩn protein. Đường chạy KOD-His +IPTG là kết quả biểu hiện protein có chất cảm ứng IPTG được so sánh với mẫu không có IPTG ở đường chạy K IPTG. Đường chạy cuối cùng là protein KOD-His sau khi tinh sạch −

Kết quả tinh sạch protein KOD-His bằng phương pháp sắc ký ái lực

Nickel ở điều kiện biến tính bằng Urea

Khi tinh sạch protein KOD-His ở điều kiện biến tính bằng Urea, chúng tôi

đã lựa chọn các nồng độ Urea khác nhau 2M, 4M hay 6M. Hình 21-A là kết quả

tinh sạch ở điều kiện biến tính với hệ đệm có bổ sung Urea 2M, protein KOD-His

(KOD-His + IPTG) được biểu hiện so sánh với giếng K IPTG, không được thêm

chất cảm ứng. Tế bào có biểu hiện sau đó được phá vỡ bằng sóng siêu âm, phần

dịch phá vỡ (Dịch pv) vẫn xuất hiện băng protein tái tổ hợp được tinh sạch trên cột

nickel. Kết quả tinh sạch proteins KOD-His ở đường chạy cuối cùng (Dịch tinh

sạch) cho thấy vẫn còn rất nhiều băng phụ. Do đó, chúng tôi đã tăng nồng độ Urea

lên 4M, kết quả được thể hiện ở Hình 21- B cho thấy protein KOD tinh sạch (mẫu

Dịch tinh sạch) đều vẫn còn protein tạp.

40

A B

Hình 23: Kết quả tinh sạch protein KOD-His ở điều kiện biến tính. A – Kết quả tinh sạch KOD-His trong điều kiện biến tính sử dụng Urea nồng độ 2M, protein KOD-His tinh sạch được thể hiện ở giếng cuối (Dịch tinh sạch). B – Kết quả tinh sạch KOD-His trong điều kiện biến tính với Urea nồng độ 4M, protein sau tinh sạch được điện di ở giếng cuối (Dịch tinh sạch).

Kết quả điện di SDS-PAGE ở Hình 24 so sánh protein tinh sạch ở điều kiện

không biến tính và biến tính trên cột Nickel. Kết quả cho thấy protein KOD-His khi

tinh sạch ở điều kiện biến tính (Elute 2M, 4M, 6M) băng protein phụ có mờ đi

nhưng băng protein tái tổ hợp cũng giảm đi so với protein tinh sạch ở điều kiện

thường (Elute).

Hình 24: Kết quả tinh sạch KOD-His ở điều kiện biến tính và không biến tính. M: thang chuẩn protein, Elute: Dịch tinh sạch protein KOD-His so sánh với dịch tinh sạch KOD-His ở điều kiện biến tính với nồng độ Urea 2M, 4M và 6M.

41

3.3.2. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực GST

Sau khi biểu hiện thành công protein KOD gắn đuôi GST, chúng tôi tiến

hành tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực với đuôi GST. Được biểu hiện bởi

hệ thống biểu hiện vector pGEX nên protein biểu hiện được gắn đuôi GST có kích

thước khoảng 26 kDa, do đó protein được tinh sạch nhờ ái lực của đuôi GST với cột

glutathione. Kết quả tinh sạch protein được phân tích bằng phương pháp điện di trên

gel SDS-PAGE. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 20, ở làn chạy dịch tinh sạch

KOD-GST elute có một băng đậm kích thước tương đương với protein KOD-GST.

Tuy nhiên vẫn còn xuất hiện một số băng protein tạp. So sánh với phương pháp tinh

sạch protein KOD có gắn đuôi Histidine thì KOD có gắn đuôi GST có độ tinh sạch

cao hơn, có thể do độ đặc hiệu của đuôi GST tốt hơn với đuôi Histidine.

Hình 25: Kết quả tinh sạch KOD-GST. Protein KOD-GST được biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 và được cảm ứng bởi IPTG (đường chạy KOD-GST có IPTG), so sánh với tế bào không bổ sung IPTG (đường chạy K IPTG), KOD-GST được tinh sạch ở đường chạy KOD-GST elute.

3.4. Thẩm tách protein

Protein sau khi được tinh sạch sẽ được thẩm tách trong 1 lít dung dịch đệm

A (50mM Tris-HCl pH 8.0, 0.3M NaCl) trong 6 tiếng. Sau đó, protein được thẩm

tách tiếp trong 1 lít dung dịch đệm B (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl) qua

đêm. Cuối cùng protein được thẩm tách chuyển sang dung dịch đệm bảo quản (20

mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Nonidet P-

40, 0.5% Tween 20, 50% glycerol). Enzyme trong dung dịch bảo quản được để ở -

20°C và sử dụng cho các phản ứng kiểm tra hoạt tính enzyme.

42

3.5. Thử hoạt tính enzyme

Xác định hoạt độ enzyme

Để xác định hoạt độ enzyme KOD-His và KOD-GST, chúng tôi tiến hành

phản ứng PCR để xác định lượng enzyme tối ưu cho một phản ứng PCR, so sánh

với enzyme Phusion DNA polymerase của Thermo scientific 2U/µl. Thực hiện phản

ứng PCR với lượng enzyme bổ sung cho mỗi phản ứng lần lượt là 0.3; 0.5; 1; 2

enzyme. Kết quả đối với enzyme KOD-His ở Hình 26 cho thấy sản phẩm của phản

ứng PCR có bổ sung 0.5 µl hoặc 1 µl KOD-His đóng vai trò xúc tác đều có băng

sáng nhất trong các nồng độ. Bằng mắt thường, so sánh tương đối độ đậm và độ

sáng nét của sản phẩm PCR dùng 0.5 µl enzyme KOD-His với băng tạo thành bởi

0.2 µl enzyme thương mại Phusion 2U/µl (Thermo scientific), chúng tôi ước lượng

hoạt độ của KOD-His sau khi tinh sạch khoảng 0.8U /µl, tương đương với khoảng

800-1000 đơn vị trên mỗi ml enzyme tinh sạch được.

Hình 26: Kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-His Phản ứng PCR với khuôn có kích thước 400 bp sử dụng enzyme KOD-His với thể tích lần lượt 0.3; 0.5; 1; 2 µl, so sánh với 0.2 µl enzyme Phusion của hãng Thermo scientific

Tương tự với protein KOD-GST chúng tôi cũng tiến hành PCR xác định

hoạt độ, so sánh với KOD-His và Phusion của Thermo scientific. Kết quả ở Hình 22

cho thấy, với cùng một lượng tế bào ban đầu sử dụng để tinh sạch, nhưng hoạt tính

của enzyme thu được lại thấp hơn so với KOD-His. Khi sử dụng 0.5 – 1 µl enzyme

KOD-GST thì không có băng nào xuất hiện, ở thể tích là 2 – 3 µl enzyme thì có

băng sản phẩm mong muốn, tuy nhiên độ sáng vẫn mờ hơn so với enzyme KOD-

His và Phusion DNA polymerase. Khi so sánh tương đối độ đậm và sắc nét của

băng sản phẩm PCR bổ sung 3 µl enzyme KOD-GST xúc tác với 1 µl KOD-His và

43

0.2 µl Phusion, chúng tôi ước lượng hoạt độ enzyme KOD-GST tinh sạch được

khoảng 0.1U/µl, tương đương 100 đơn vị enzyme trên mỗi ml enzyme tinh sạch

được.

Hình 27: Kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-GST Phản ứng PCR với khuôn có kích thước 260 bp sử dụng enzyme KOD-GST với thể tích lần lượt 0; 1; 2; 3; 4 µl, so sánh với 1 µl KOD-His và 0.2 µl enzyme Phusion của hãng Thermo scientific

Thử hoạt tính enzyme với các loại đệm chạy PCR và các kích thước gen

khác nhau

Sau khi xác định được lượng enzyme tương đương với mỗi đơn vị enzyme

thương mại, chúng tôi tiến hành pha chế dung dịch đệm cho phản ứng PCR dành

riêng cho enzyme KOD tinh sạch được. Thành phần pha chế dung dịch đệm được

pha dựa trên các nghiên cứu đã được công bố bao gồm 10 mM Tris HCl, 1 mM

(NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.01% Triton X100 và 0.1 mg/ml BSA, và

các giá trị các pH thử nghiệm khác nhau 7.5, 8.0 và 8.8, được so sánh với 5X HF

buffer của hãng Thermo scientific. Cả 2 enzyme cũng được thử hoạt tính trên các

gen có kích thước khác nhau từ 0.5 kp, 1.1 kp và 2.4 kp. Kết quả thể hiện trên Hình

28 ở hàng đầu tiên là kết quả đối với enzyme KOD-His và ở hàng thứ 2 là đối với

enzyme KOD-GST. Đối với enzyme KOD-His, ở cách kích thước khác nhau và các

buffer các khau thì các băng sản phẩm PCR đều lên sáng và có băng đặc hiệu, đối

với buffer pH 7.5 và 8.8 thì sản phẩm vẫn có băng phụ mờ và mật độ băng chính

cũng mờ hơn so với ở buffer pH 8.0 và HF buffer. Trái ngược lại thì hoạt tính của

enzyme KOD-GST vẫn chưa ổn định.

44

Hình 28: Kết quả PCR thử hoạt tính enzyme KOD-His và KOD-GST với các kích thước gen và đệm PCR khác nhau. Hàng trên – Kod-His: Phản ứng PCR sử dụng enzyme KOD-His với các đệm PCR có pH 7.5, 8.0, 8.8 tự pha và 5x buffer HF của hãng, ở mỗi loại đệm đều dung để nhân các khuôn có kích thước lần lượt 0.5; 1.1; 2.4 kb. Hàng dưới – Kod-GST: Phản ứng PCR sử dụng enzyme KOD-GST với các đệm PCR có pH 7.5, 8.0, 8.8 tự pha và 5x buffer HF của hãng, ở mỗi loại đệm đều dung để nhân các khuôn có kích thước lần lượt 0.5; 1.1; 2.4 kb.

45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Từ những kết quả đã đạt được, chúng tôi có những kết luận sau:

1. Chúng tôi đã tối ưu trình tự gen, nhân dòng gen mã hóa cho KOD DNA

polymerase và chèn thành công vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1.

2. Biểu hiện protein KOD tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21.

4. Protein tái tổ hợp KOD-His được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái

lực Nicken chưa có độ tinh sạch cao, còn protein KOD-GST đã tinh sạch được bằng

phương pháp sắc ký ái lực với đuôi GST với độ tinh sạch cao.

5. Hoạt tính của enzyme KOD gắn đuôi His có hoạt tính tốt, còn enzyme

KOD gắn đuôi GST kém hơn so với protein gắn đuôi His.

Kiến nghị

Trong phạm vi nghiên cứu của luận văn thạc sỹ này, tuy đã đạt được những

kết quả nhất định song vẫn còn những hạn chế và độ tinh sạch của protein tái tổ

hợp, gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Vì vậy, tôi có một số kiến nghị như

sau:

1. Loại bỏ protein dung hợp GST khỏi protein KOD-GST bằng protease

thrombin

2. Sử dụng sắc ký lọc gel sau đó để có thể loại bỏ các protein tạp khỏi

protein KOD-His, cũng như đuôi GST khỏi hỗn hợp KOD-GST

3. Thiết kế các thí nghiệm thử độ bền và hoạt tính của DNA polymerase tái

tổ hợp thu được.

46

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Dương Thị Kim Chi T. V. L., Lê Mậu Long (2016), "Xác định tham số quan trọng cho việc thiết kế gen dùng trong tái tổ hợp", Hội nghị Khoa học Quốc gia lần thứ IX “Nghiên cứu cơ bản và ứng dụng Công nghệ thông tin (FAIR'9), pp.

Tiếng Anh 2. Barnes W. M. (1994), "PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates", Proc Natl Acad Sci U S A, 91, pp. 2216-20.

3. Benson L. M., A. P. Null and D. C. Muddiman (2003), "Advantages of Thermococcus kodakaraenis (KOD) DNA Polymerase for PCR-mass spectrometry based analyses", J Am Soc Mass Spectrom, 14, pp. 601-4. 4. Block H., B. Maertens, A. Spriestersbach, N. Brinker, J. Kubicek, R. Fabis, J. Labahn and F. Schafer (2009), "Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review", Methods Enzymol, 463, pp. 439-73.

5. Carson M., D. H. Johnson, H. McDonald, C. Brouillette and L. J. Delucas (2007), "His-tag impact on structure", Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 63, pp. 295-301.

6. Chou Q., M. Russell, D. E. Birch, J. Raymond and W. Bloch (1992), "Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy- number amplifications", Nucleic Acids Research, 20, pp. 1717-1723. 7. Dąbrowski S. and J. Kur (1998), "Cloning and Expression inEscherichia coliof the Recombinant His-Tagged DNA Polymerases fromPyrococcus furiosusandPyrococcus woesei", Protein expression and purification, 14, pp. 131-138. 8. Donahue Jr R. A. and R. L. Bebee (1999), "BL21-SI™ competent cells for protein expression in E. coli", Protein Expr. Purif, 7, pp. 289. 9. Drouin R., W. Dridi and O. Samassekou (2007), DNA Polymerases for PCR Applications, 10. Edwards M. C. and R. A. Gibbs (1994), "Multiplex PCR: advantages, development, and applications", Genome Research, 3, pp. S65-S75.

11. Elshawadfy A. M., B. J. Keith, E. Ooi, T. Kinsman, P. Heslop and B. A. Connolly (2014), "DNA polymerase hybrids derived from the family-B enzymes of Pyrococcus furiosus and Thermococcus kodakarensis: improving performance in the polymerase chain reaction", Frontiers in microbiology, 5, pp. 224.

12. Ghasemi A., A. H. Salmanian, N. Sadeghifard, A. A. Salarian and M. K. Gholi (2011), "Cloning, expression and purification of Pwo polymerase from Pyrococcus woesei", Iranian journal of microbiology, 3, pp. 118.

13. Hashimoto H., T. Matsumoto, M. Nishioka, T. Yuasa, S. Takeuchi, T. Inoue, S. Fujiwara, M. Takagi, T. Imanaka and Y. Kai (1999), "Crystallographic studies on a family B DNA polymerase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis strain KOD1", J Biochem, 125, pp. 983-6.

47

structure of DNA polymerase "Crystal (2001),

14. Hashimoto H., M. Nishioka, S. Fujiwara, M. Takagi, T. Imanaka, T. Inoue and from Y. Kai hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1", J Mol Biol, 306, pp. 469-77. 15. Innis M. A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky and T. J. White (2012), PCR protocols: a guide to methods and applications, Place, Published.

16. Kaltenboeck B. and C. Wang (2005), "Advances in real-time PCR: application to clinical laboratory diagnostics", Advances in clinical chemistry, 40, pp. 219-259.

17. Li Y., S. Korolev and G. Waksman (1998), "Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation", The EMBO journal, 17, pp. 7514-7525.

18. Lu C. and H. P. Erickson (1997), "Expression inEscherichia coliof the furiosus", Protein fromPyrococcus Thermostable DNA Polymerase expression and purification, 11, pp. 179-184.

19. Magdeldin S. (2012), Affinity chromatography, Place, Published. 20. Mizuguchi H., M. Nakatsuji, S. Fujiwara, M. Takagi and T. Imanaka (1999), to hot start PCR of neutralizing "Characterization and application monoclonal antibodies against KOD DNA polymerase", J Biochem, 126, pp. 762-8.

21. Morikawa M., Y. Izawa, N. Rashid, T. Hoaki and T. Imanaka (1994), "Purification and characterization of a thermostable thiol protease from a newly isolated hyperthermophilic Pyrococcus sp", Appl Environ Microbiol, 60, pp. 4559-66.

22. Mroczkowski B. S., A. Huvar, W. Lernhardt, K. Misono, K. Nielson and B. Scott (1994), "Secretion of thermostable DNA polymerase using a novel baculovirus vector", Journal of Biological Chemistry, 269, pp. 13522-13528. 23. Papas T. S. and G. Vande Woude (1986), "Gene amplification and analysis", pp. 24. Pelley J. W. (2007), Elsevier's Integrated Biochemistry, Place, Published. 25. Pina A. S., I. L. Batalha and A. C. Roque (2014), "Affinity tags in protein purification and peptide enrichment: an overview", Methods Mol Biol, 1129, pp. 147-68.

26. Rosano G. L. and E. A. Ceccarelli (2014), "Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges", Frontiers in microbiology, 5, pp. 172-177.

27. Saiki R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis and H. A. Erlich (1988), "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase", Science, 239, pp. 487-91.

28. Saiki R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich and N. Arnheim (1985), "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia", Science, 230, pp. 1350-4.

29. Spriestersbach A., J. Kubicek, F. Schafer, H. Block and B. Maertens (2015), "Purification of His-Tagged Proteins", Methods Enzymol, 559, pp. 1-15. 30. Steitz T. A. (1999), "DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms", Journal of Biological Chemistry, 274, pp. 17395-17398.

48

31. Takagi M., M. Nishioka, H. Kakihara, M. Kitabayashi, H. Inoue, B. Kawakami, M. Oka and T. Imanaka (1997), "Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR", Appl Environ Microbiol, 63, pp. 4504-10.

32. Takagi M., M. Nishioka, H. Kakihara, M. Kitabayashi, H. Inoue, B. Kawakami, M. Oka and T. Imanaka (1997), "Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR", Appl. Environ. Microbiol., 63, pp. 4504-4510. 33. van Pelt-Verkuil E., A. Van Belkum and J. P. Hays (2008), Principles and technical aspects of PCR amplification, Place, Published. 34. Vikis H. G. and K.-L. Guan (2004), Glutathione-S-transferase-fusion based assays for studying protein-protein interactions,

35. Waugh D. S. (2005), "Making the most of affinity tags", Trends in biotechnology, 23, pp. 316-320.

36. Wu S., W. A. Beard, L. G. Pedersen and S. H. Wilson (2013), "Structural comparison of DNA polymerase architecture suggests a nucleotide gateway to the polymerase active site", Chemical reviews, 114, pp. 2759-2774. 37. Yamashita M., J. Xu, D. Morokuma, K. Hirata, M. Hino, H. Mon, M. Takahashi, S. M. Hamdan, K. Sakashita, K. Iiyama, Y. Banno, T. Kusakabe and J. M. Lee (2017), "Characterization of Recombinant Thermococcus kodakaraensis (KOD) DNA Polymerases Produced Using Silkworm- Baculovirus Expression Vector System", Mol Biotechnol, 59, pp. 221-233.

38. Zheng W., Q. Wang and Q. Bi (2016), "Construction, Expression, and Characterization of Recombinant Pfu DNA Polymerase in Escherichia coli", The protein journal, 35, pp. 145-153.

39. Wang F., S. Li, H. Zhao, L. Bian, L. Chen, Z. Zhang, X. Zhong, L. Ma and X. Yu (2015), "Expression and Characterization of the RKOD DNA Polymerase in Pichia pastoris", PLoS One, 10, pp. 731-757.

49