Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

=============***=============

PHẠM NHƢ TRỌNG

PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS PARACITICUS SINH ĐỘC TỐ TỪ HẠT LẠC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

=============***=============

PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS PARACITICUS SINH ĐỘC TỐ TỪ HẠT LẠC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vâ ̣t

Mã số: 62 42 40

Ngƣờ i hƣớ ng dẫn khoa ho ̣c: PGS.TS. Phạm Xuân Đà

Học viên: Phạm Nhƣ Trọng

Hà Nô ̣i - 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này

là trung thực.

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong khóa luận này đã được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015

Ngƣời viết báo cáo

Phạm Nhƣ Trọng

iii

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CÁM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện tại Khoa Vi sinh - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phạm Xuân Đà Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.

Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng, nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, quan tâm từ thầy cô, đồng nghiệp, gia đình, bạn bè.

Tôi Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Đà đã hướng

dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới các cán bộ Khoa Vi sinh, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này.

Và cuối cùng, tôi xin cám ơn gia đình và bạn bè đã luôn sát cánh bên tôi,

chia sẻ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015

Ngƣời viết báo cáo

Phạm Nhƣ Trọng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. i

MỤC LỤC ............................................................................................................ v

DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... viii

DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ ix

DANH MỤC VIẾT TẮT ..................................................................................... x

PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU ........................................................................ 1

1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1

1.2. Mục đích - Yêu cầu ....................................................................................... 2

1.2.1. Mục đích ..................................................................................................... 2

1.2.2. Yêu cầu ....................................................................................................... 2

PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................... 3

2.1. Giới thiệu chung về lạc ............................................................................... 3

2.1.1. Cấu tạo của lạc ........................................................................................... 3

2.1.2. Giá trị và công dụng của lạc đối với đời sống của con người.................... 3

2.2. Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên lạc ....................................................... 4

2.2.1. Các loại nấm sinh aflatoxin trên lạc ........................................................... 4

2.2.2. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 4

2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng A. flavus và A. parasiticus ........ 6

2.2.4. Điều kiện sinh độc tố .................................................................................. 7

2.3. Độc tố aflatoxin ............................................................................................. 7

2.2.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin ......................................................................... 7

2.2.2. Định nghĩa .................................................................................................. 8

2.2.3. Cấu tạo và tính chất hóa lý của aflatoxin ................................................... 8

2.2.4. Độc tính của aflatoxin .............................................................................. 10

2.2.5. Cơ chế tác động của aflatoxin trong cơ thể .............................................. 11

2.2.6. Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin ................................................................ 11

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.3. Các phương pháp xác định sự có mặt của độc tố aflatoxin ........................ 11

2.3.1. Phương pháp hóa sinh .............................................................................. 11

2.3.2. Phương pháp vi sinh ................................................................................. 11

2.3.3. Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR ........................................................ 12

2.4. Tình hình nghiên cứu về độc tố aflatoxin trên lạc ...................................... 14

2.4.1. Ngoài nước .............................................................................................. 14

2.4.2. Trong nước ............................................................................................... 14

PHẦN THỨ BA - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 16

3.1. Đối tượng ..................................................................................................... 16

3.1.1. Chủng chuẩn nấm Aspergillus và mẫu lạc ............................................... 16

3.1.2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................... 16

3.1.3. Các môi trường chính sử dụng trong quá trình nghiên cứu ..................... 16

3.1.4. Hóa chất .................................................................................................... 16

3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 17

3.2.1. Phương pháp phân lập nấm mốc A. flavus và A. parasiticus ................... 17

3.2.2. Phương pháp định danh nấm mốc dựa vào hình thái và cấu tạo vi thể ... 19

3.2.3. Phương pháp dịnh danh nấm mốc dựa vào trình tự gen ITS .................... 19

3.2.4. Xác định khả năng sinh độc tố dựa vào phương pháp sắc ký khối phổ ... 23

PHẦN THỨ TƢ - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................... 26

4.1. Kết quả phân lập nấm mốc A. flavus và A. parasiticus............................... 26

4.2. Kết quả định danh nấm mốc dựa vào hình thái và cấu tạo vi thể ............... 26

4.4. Kết quả giải trình tự gen ITS định danh nấm A. flavus, A. parasiticus ....... 31

4.4.1. Kết quả tách chiết ADN ........................................................................... 31

4.4.2. Kết quả khuếch đại bằng phản ứng PCR đặc hiệu ................................... 32

4.4.3. Kết quả giải trình tự ................................................................................. 33

4.4.4. Kết quả chụp ảnh hiển vi điện tử quét...................................................... 36

4.5. Kết quả phân tích khả năng sinh độc tố aflatoxin bằng sắc ký khối phổ .... 39

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

PHẦN NĂM - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 40

5.1. Kết luận ....................................................................................................... 40

5.2. Kiến nghị ..................................................................................................... 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 41

PHỤ LỤC .......................................................................................................... 43

vii

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Đặc điểm hình thái nấm A. flavus và A. parasiticus ............................ 5

Bảng 2.2. Công thức phân tử của các aflatoxin và tính chất................................ 9

Bảng 3.1. Chương trình gradient của pha động ................................................. 24

Bảng 3.2. Điều kiện chạy khối phổ .................................................................... 24

Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cấu tạo vi thể ................................. 27

Bảng 4.2. Kết quả định danh nấm A. flavus và A. parasiticus ........................... 31

Bảng 4.3. Kết quả đo nồng độ ADN sau khi tách chiết ..................................... 32

Bảng 4.4. Kết quả tìm kiếm trên ngân hàng gen quốc tế ................................... 36

viii

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Công thức cấu tạo chung của aflatoxin ................................................ 8

Hình 2.2. Trình tự đoạn ITS đi ̣nh danh nấm ....................................................... 12

Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MEA ....... 29

Hình 4.2. Hình thái khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MEA ....... 30

Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn ITS ........................................... 33

Hình 4.4. Trình tự từ nu từ 330 đên nu 590 ....................................................... 35

Hình 4.5. Trình tự ADN của nấm M45 .............................................................. 35

Hình 4.6. Ảnh hiển vi điện tử quét nấm M50 .................................................... 37

Hình 4.7. Sắc đồ chạy sắc ký khối phổ nấm M45 .............................................. 39

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC VIẾT TẮT

ADN

: Axid Deoxyribo Nucleic

ARN : Acid ribonucleic

ELISA

: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

EDTA : Ethylendiamin Tetraacetic Acid

ITS

: Internal Transcriped Spacer

HPLC

: High-performance Liquid Chromatography

MEA

: Malt Extract Agar

PCR

: Polymerase Chain Reaction

TAE

: Tris-acetate-EDTA

TLC

: Thin Layer Chromatography

YEP

: Yeast Extract Peptone

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Nấm mốc là nguyên nhân hàng đầu gây nên sự giảm chất lượng và phá hủy nông sản sau thu hoạch, hơn thế nữa nhiều chủng nấm còn sinh độc tố nấm

(mycotoxin) nhiễm vào thực phẩm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người

khi không may ăn phải, phổ biến nhất là chi Aspergillus (A. flavus; A.

parasiticus; …) có khả năng sinh độc tố aflatoxin, các chủng nấm thuộc chi này có phổ hoạt động rất rộng vì vậy có khả năng lây nhiễm trên nhiều loại nông sản như ngô,

lạc, bông, đậu tương … Các loại hạt có dầu (đặc biệt như lạc) rất thích hợp cho sự phát

triển của nấm Aspergillus cũng như sự hình thành độc tố aflatoxin, đây là một loại độc

tố không bị phân hủy trong điều kiện đun nấu thông thường, có khả năng gây ung thư

đối với người sử dụng lâu dài [4].

Cây lạc là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Cây lạc chiếm

một vị trí quan trọng trong nền kinh tế thế giới không chỉ do được gieo trồng trên

diện tích lớn ở trên 100 nước, mà còn vì lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573

Kcal/100g), bổ sung đạm và chất béo quan trọng cho con người, do vậy hạt lạc được sử dụng rộng rãi để làm thực phẩm và nguyên liệu cho công nghiệp như sản xuất

bánh kẹo... [11]. Tuy nhiên trong điều kiện khí hậu nước ta, khí hậu nhiệt đới gió

mùa, điều kiện bảo quản lạc trong các kho nhỏ lẻ chưa được quan tâm. Đó là điều

kiện thuận lợi cho các loài nấm mốc phát triển, xâm nhiễm nếu không có biện pháp

kiểm soát nghiêm ngặt.

Trong những năm gần đây công tác vệ sinh an toàn thực phẩm đã có những

tiến bộ rõ rệt và ngày càng được chú trọng. Từ những năm 70 các nhà khoa học dựa

vào hình thái đã xây dựng được hệ thống phân loại nấm khá đầy đủ, phương pháp

truyền thống dựa trên các kỹ thuật vi sinh cơ bản và hình thái học của sợi nấm, chồi và túi bào tử [4]. Tuy nhiên phương pháp truyền thống đòi hỏi thời gian tiến hành lâu thường 5 đến 10 ngày hệ sợi nấm mới phát triển đầy đủ.

Do đó, các nhà khoa học đã phát triển kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ thuật PCR, giải trình gen… để phát hiện và định danh nấm sinh độc tố aflatoxin. Và phương

pháp sắc ký lỏng khối phổ được dùng để xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin của các chủng nấm.

Xuất phát từ thực tế trên, để đảm bảo chất lượng sản phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng chúng tôi tiến hành đề tài " phân lập nấm Aspergillus flavus

và Aspergillus paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc ".

1.2. Mục đích - Yêu cầu

1.2.1. Mục đích

Phân lập, định danh chủng nấm sinh độc tố aflatoxin trên lạc bằng phương pháp

hình thái học kết hợp giải trình tự gen ITS. Từ đó xác định khả năng sinh độc tố

aflatoxin của các chủng nấm.

1.2.2. Yêu cầu

- Phân lập được chủng nấm mốc A. flavus; A. parasiticus có khả năng sinh độc tố

afatoxin của các mẫu lạc thu thập từ các chợ tại Hà Nội;

- Xây dựng được phương pháp định danh nấm mốc sinh độc tố aflatoxin dựa

vào hình thái kết hợp giải trình tự gen ITS;

- Phân tích khả năng sinh độc tố afatoxin bằng sắc ký lỏng khối phổ.

PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN

2.1. Giới thiệu chung về lạc

2.1.1. Cấu tạo của lạc

Lạc còn được gọi là đậu phộng hay đậu phụng (tên khoa học là Arachis hypogaea L), là một loài cây thực phẩm thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Trung và Nam

Mỹ. Nó là loài cây thân thảo hàng năm có thể cao từ 3-50 cm. Hoa dạng hoa đậu điển

hình màu vàng có điểm gân đỏ, cuống hoa dài 2-4 cm. Sau khi thụ phấn, quả phát triển

thành một dạng quả đậu dài 3-7 cm, chứa 1-4 hạt (ánh), và quả (củ) thường dấu

xuống đất để phát triển.

Hạt lạc là loại thực phẩm rất giàu năng lượng vì có chứa nhiều lipid. Theo

bảng thành phần dinh dưỡng các chất trong thực phẩm, hạt lạc có chứa nước 7,5%;

protein 27,5%; chất béo 44,5%; glucid 15,5%; cellulose 2,5% và một lượng nhỏ

vitamin (PP, E, B5, B1, B2, B6, Folat ), các axid amin và các nguyên tố vi lượng (

K, P, Mg , Mn, Fe, Na, Zn, Cu...). Trong thành phần chất đạm (protein) có một

globulin là arachin (60-70%) và một albumin là conarachin (25-40%) cả hai chất

này đều không tan trong nước. Cả arachin và conarachin đều cho các acid amin như

methionin, tryptophan và d-threonin. Thành phần chủ yếu trong nhân lạc là dầu lạc.

Nó gồm các glycerid của acid béo no và không no, với tỷ lệ thay đổi rất nhiều tuỳ

theo loại lạc, acid oleic 51-79%; acid linoleic 7,4-26%, acid palmitic 8,5% acid

stearic 4,5- 6,2%, acid hexaconic 0,1-0,4% và 2 acid chỉ thấy trong dầu lạc là acid

arachidic và acid lignoceric [11].

2.1.2. Giá trị và công dụng của lạc đối với đời sống của con người

Lạc là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Cây lạc chiếm một vị

trí quan trọng trong nền kinh tế thế giới không chỉ do được gieo trồng trên diện tích lớn ở trên 100 nước, mà còn vì lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573 Kcal/100g), bổ sung đạm và chất béo quan trọng cho con người, do vậy hạt lạc được sử dụng rộng rãi để làm thực phẩm và nguyên liệu cho công nghiệp.

Với giá trị dinh dưỡng của lạc, con người đã sử dụng như một nguồn thực phẩm quan trọng. Ngoài việc dùng để ăn dưới nhiều hình thức như luộc, rang, nấu xôi, làm

bánh kẹo, chao dầu… Lạc được dùng để ép dầu ăn và khô dầu để chế biến nước chấm

và chế biến các mặt hàng khác. Sản phẩm phụ của lạc là thức ăn quý cho động vật

nuôi. Khi ép dầu sản phẩm phụ là khô dầu với lượng dinh dưỡng khá cao làm thức ăn cho gia súc gia cầm. Khi phân tích thân lá lạc thì có 47% đường bột, trên 15% chất

hữu cơ chứa nitơ và 1,8% chất béo nên thân lá lạc cũng có thể dùng làm thức ăn cho

gia súc. Gần đây nhờ công nghiệp thực phẩm phát triển, người ta chế biến nhiều mặt

hàng thực phẩm có giá trị từ lạc như lạc rút dầu, bơ lạc, chao, phomat sữa, sữa lạc…, được sử dụng chế biến nhiều loại thuốc trong y dược, dùng làm dầu nhờn để xoa máy,

bỏ trục xe, loại dầu xấu dùng để nấu xà phòng.

Bên cạnh giá trị dinh dưỡng cho con người và là tài nguyên cho các ngành

khác. Cây lạc còn là cây quan trọng nhất trong hệ thống luân canh cây trồng đạt hiệu

quả cao vì nó có tác dụng cải tạo đất tốt. Nhu cầu sử dụng và tiêu thụ lạc ngày càng

tăng đã và đang khuyến khích đầu tư phát triển sản phẩm lạc với quy mô ngày càng

mở rộng ở các quốc gia trên thế giới. Lạc còn có nhiều công dụng tốt cho sức khỏe, đặc biệt là đối với những người ăn kiêng và mắc bệnh tim mạch [11].

Trên thị trường thương mại thế giới lạc là mặt hàng xuất khẩu đem lại kim

ngạch cao của nhiều nước. Do giá trị nhiều mặt của hạt lạc nên chưa bao giờ lạc mất

thị trường tiêu thụ. Theo số liệu của FAO 1999, có 100 nước đang trồng và xuất khẩu

lạc. Ở Senegal, giá trị lạc chiếm 80% giá trị xuất khẩu, ở Nigieria chiếm 60% giá trị

xuất khẩu. Hiện nay có 4 nước xuất khẩu lạc chủ yếu, đó là: Trung Quốc, Mỹ, Ấn Độ

và Việt Nam. Các nước phải nhập khẩu lạc là Nhật Bản , Canada, Philipin, Đức… Ở

Việt Nam sản lượng lạc xuất khẩu dao động từ 100-130 nghìn tấn/ năm [21].

2.2. Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên lạc

2.2.1. Các loại nấm sinh aflatoxin trên lạc

Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên sản phẩm nông sản (đặc biệt là lạc) thuộc chi Aspergillus gồm A. flavus và A. parasiticus có mối quan hệ chặt chẽ về cấu trúc

gen và là hai loài có khả năng sinh độc tố aflatoxin mạnh nhất. Việc xác định các loài sinh aflatoxin hiện tại dựa vào đặc điểm hình thái và loại mycotoxin sản sinh ra hoặc dựa vào trình tự ADN (Ito và cộng sự, 2000).

2.2.2. Đặc điểm hình thái

A. flavus và A. parasiticus đều thuộc họ nấm cúc có khả năng sinh độc tố

aflatoxin trong môi trường tự nhiên và môi trường nuôi cấy.

2.2.2.1. Đặc điểm hình thái của A. flavus

A. flavus phân bố ở khắp nơi trên trái đất: Dưới đất, trên các nông sản thực phẩm đặc

biệt là trên lạc và sản phẩm từ lạc là nơi phát triển ưa thích của chúng.

Con đường xâm nhập của A. flavus là chúng xâm nhập qua các điểm tiếp hợp

nhờ những chỗ do côn trùng hủy hoại gây ra. Tuy nhiên ở cây lạc tươi A. flavus

khó xâm nhập hơn vì vậy mà chúng xâm nhập khi củ lạc già, nhất là sau khi thu hoạch. A. flavus xâm nhập vào hạt lạc chứa 15- 30 % nước, tức là vào thời gian đầu của việc

làm khô [4].

A. flavus có khả năng sinh các loại độc tố AFB1, AFB2 và axid cyclopyazonic

(CPA).

2.2.2.2. Đặc điểm hình thái của A. parasiticus

A. parasiticus có đặc điểm hình thái tương tự A. flavus song bào tử của

A. parasiticus thường có màu xanh lục, có khả năng sinh các loại độc tố AFB1, AFB2 nhưng không có khả năng sinh axid cyclopyazonic (CPA).

Mặc dù có sự tương đồng khá lớn về đặc điểm hình thái nhưng người ta vẫn tìm

được một số khác biệt nhỏ giữa A. flavus và A. parasiticus.

Sự khác biệt giữa hai chủng này có thể tóm tắt trong bảng dưới đây:

Bảng 2.1. Đặc điểm hình thái nấm A. flavus và A. parasiticus [6,7]

Đặc điểm A. flavus A. parasiticus

Đường kính - d = 3-5 cm - d = 2- 3 cm

Màu sắc - Ban đầu hơi vàng cuối - Khóm nấm xanh lục, hơi Đại xanh lục hoặc vàng lục vàng thể - Đôi khi hóa nâu khi già - Không bao giờ hóa nâu khi

già

Bông - Lớn, cầu, tỏa tia, đôi khi - Nhỏ, cầu hoặc tỏa tia

tạo cột không rõ

Bọng - Cầu - gần cầu - Hình gần cầu Vi thể Thể bình - 1 hoặc 2 tầng - 1 tầng

Vách cuống - Xù xì - Xù xì

Hạt đính - Cầu đến gần cầu, trơn hoặc Cầu, vách có gai

có gai

Theo các kết quả nghiên cứu không phải tất cả các loại A. flavus đều có khả

năng sinh độc tố aflatoxin nhưng phần lớn các chủng A. parasiticus phân lập được lại

đều sinh tổng hợp aflatoxin. Các chủng A. flavus tạo thành aflatoxin lạc chiếm 40 - 50 %.

2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng A. flavus và A. parasiticus

 Nhiệt độ: A. flavus và A. parasiticus là loại nấm mốc ưa nhiệt có thể sinh trưởng và phát triển ở dải nhiệt độ từ 20 - 60ºC, tºopt = 25 - 35ºC, dưới 12ºC A. flavus không phát triển được hoặc phát triển rất yếu (Schroeder và cộng sự,1996).

 Độ ẩm: Độ ẩm tối ưu cho sự phát triển của chúng wopt = 80-85%, A. flavus và

A. parasiticus phát triển tốt trên các loại cơ chất có dầu như các nông sản: lạc, ngô,

gạo, bông... Hàm lượng nước trong cơ chất thích hợp cho sự sinh trưởng phát triển của

chúng từ 15- 30% . Ở hàm lượng nước cao hơn hoặc thấp hơn đều ức chế sự phát triển

của chúng [4].

 Độ pH: A. flavus và A. parasiticus có thể phát triển ở khoảng pH khá rộng

(pH =2 - 8) tùy thuộc vào loài. Nhưng pH tối ưu cho sự phát triển của chúng là 4,5 -

6,5 [4].

 Nguồn cơ chất: A. flavus và A. parasiticus có các enzyme thủy phân tinh bột, nhưng nguồn

hydrocacbon thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của các loại nấm này là

glucose và saccharose [2].

A. flavus và A. parasiticus đều có khả năng đồng hóa các loại muối amoni và nitrat. Ngoài ra còn có khả năng sử dụng axid glutamic, prolin, trytophan, alanin, asparagin, histidin, lysine, methionine. Để đảm bảo cho sự tồn tại và phát triển, các vi nấm đòi hỏi một lượng cần thiết các nguyên tố đa lượng (P, K,S, Mg, Ca…), các nguyên tố vi lượng (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni…) và các muối MgSO4, KCl, FeSO4, KCl, FeSO4... [2]

2.2.4. Điều kiện sinh độc tố

Khả năng sinh độc tố phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Chủng nấm mốc, nhiệt độ và

thành phần môi trường.

Lượng aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi phụ thuộc vào các yếu tố trên. Một số

chủng sinh aflatoxin có thể bị mất khả năng này sau nhiều lần cấy chuyển liên tiếp trên môi trường tổng hợp nhưng cũng có thể làm tăng độc tính của chúng nếu cấy chuyền

liên tiếp trên môi trường thích hợp. Khi khối lượng hệ sợi nấm càng nhiều thì khả năng

sinh độc tố càng mạnh và ngược lại. Môi trường bổ sung cao nấm men, peptone hay là

acid amin cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH = 5- 5.4, nhiệt độ 25- 28Cº)

là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành aflatoxin [4].

Ngoài ra các vitamin nhóm B cũng có tác dụng kích thích sự tạo thành các

aflatoxin. Tuy nhiên, riboflavin và piridoxin thì không có tác dụng nhiều. Người ta đã

xác định được khi A. flavus phát triển trên hạt lúa mỳ thì hàm lượng aflatoxin tạo ra ở

giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn giai đoạn phôi nhũ. Việc thêm nước chiết từ mầm

lúa mỳ, lipid hay các axid béo sẽ kích thích tốt sự hình thành aflatoxin. Điều này khiến

người ta nghĩ rằng các chất này có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp

aflatoxin vì sự phân hủy của chúng tạo thành các chất trao đổi tham gia vào vòng

chuyển hóa sinh tổng hợp aflatoxin [3].

2.3. Độc tố aflatoxin

2.2.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin

Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu

hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là '' Turkey X disease" . Sau đó, các loại

gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và chết rất nhiều. Qua điều tra người ta xác định được bệnh đó có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn

sinh ra.

Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất hóa học của chất này là aflatoxin do vi nấm A. flavus và A. parasiticus gây ra. Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 trong đó thì AFB1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất ( Nabil Saad, 2004). Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố aflatoxin.

2.2.2. Định nghĩa

Aflatoxin là nhóm các hợp chất có nhân difuranocumarin, là sản phẩm của quá

trình trao đổi chất bởi nấm A. flavus, A. parasiticus và một số nấm khác. Người ta đã phát hiện và xác định có 17 loại aflatoxin khác nhau, trong đó aflatoxin B1 có độc tính mạnh nhất, còn các loại khác chính là sản phẩm chuyển hóa của AFB1 gồm AFB2, AFG1, AFG2, AFM1, AFM2…[1,4]

2.2.3. Cấu tạo và tính chất hóa lý của aflatoxin

2.2.3.1. Cấu tạo của aflatoxin

Aflatoxin có nhiều loại và có cấu trúc khác nhau. Các loại này là các dạng biến

đổi của các aflatoxin loại B, G, M.

Cấu tạo của aflatoxin là các chất trao đổi chất có liên quan đến aflatoxin B1 và G1. Aflatoxin B2 và G2 là dẫn xuất hydro của các hợp chất mẹ. Các aflatoxin M1 và M2 là các chất trao đổi hydroxylat hóa của B1, B2 theo thứ tự chúng có công thức sau:

Hình 2.1. Công thức cấu tạo chung của aflatoxin

Trong 4 loại aflatoxin thì aflatoxin B1 được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp

theo là G1, trong đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn.

 Aflatoxin B1 và B2: Được sinh ra bởi A. flavus và A. parasiticus.  Aflatoxin G1 và G2: Được sinh ra bởi A. parasiticus.  Aflatoxin M1: chất chuyển hóa của aflatoxin B1 trên người và động vật.  Aflatoxin M2: chất chuyển hóa của aflatoxin B2 trong sữa của bò được cho

ăn thức ăn nhiễm aflatoxin ( Đậu Ngọc Hào và cộng sự, 2003).

2.2.3.2. Tính chất hóa lý của aflatoxin

Aflatoxin là tinh thể màu trắng, các aflatoxin có khả năng phát quang mạnh khi

ở dưới ánh sáng cực tím (λ= 360 nm) cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ

rất thấp. Từ đó, nó cung cấp một cơ sở lý thuyết cho việc phát hiện định lượng các

aflatoxin bằng phương pháp hóa lý [1].

Bảng 2.2. Công thức phân tử của các aflatoxin và tính chất

Aflatoxin Công thức Khối lượng phân Màu huỳnh

LD50 (µg/50g trọng lượng cơ thể vịt) tử (g/mol) quang

312 Xanh da trời 18,2

314 Xanh da trời 84,8

328 Xanh lá cây 39,2

330 Xanh lá cây 172,5

328 Xanh tím 16,6

330 Xanh tím 62,0 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AFM1 AFM2 phân tử C17H12O6 C17H14O6 C17H12O7 C17H14O7 C17H12O7 C17H14O7

Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Điều này cho

phép phát hiện các aflatoxin ở nồng độ thấp ( 0,5 ng hay thấp hơn trên một vết của sắc ký bản mỏng). Từ đó, nó cung cấp một cơ sở lý thuyết cho phép phát hiện và định lượng các aflatoxin bằng phương pháp hóa lý [4].

Các aflatoxin tan tốt trong các dung môi phân cực nhẹ như cloroform và metanol, đặc biệt là trong dimetylsulfoxit. Aflatoxin tan trong nước dao động khoảng từ 10-20mg/l [2].

Các aflatoxin rất bền ở nhiệt độ cao không bị phân hủy khi đun nóng thông

thường mà chỉ bị phân hủy khi hấp ở 120ºC trong 30 phút. Do đó nó vẫn tồn tại trong

lạc mà không có sự có mặt của nấm mốc. Tuy nhiên khi để trong không khí đặc biệt là dưới tia tử ngoại aflatoxin tương đối không bền.

Các aflatoxin cũng có thể bị phá hủy hoàn toàn bằng việc xử lý mạnh bằng

amoniac hoặc hypoclorid.

Sự có mặt của vòng lactone ở phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm. Đặc tính này là quan trọng trong quá trình chế biến

thực phẩm vì xử lý kiềm làm giảm sự nhiễm aflatoxin trong các sản phẩm thực phẩm.

Tuy nhiên nếu sau quá trình xử lý kiềm nếu acid hóa sẽ làm giảm phản ứng ngược trở

lại để tạo aflatoxin [1].

Các aflatoxin khá bền với các enzym tiêu hóa, aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ có trọng lượng phân tử thấp dễ dàng được hấp thụ sau khi ăn. Sự chuyển hóa aflatoxin B1 ở đường tiêu hóa chính là nhờ sự hoạt động tương tác giữa protein ở niêm mạc ống tiêu hóa tạo ra sản phẩm AFB1 - epoxie, AFB1- dihydrodiol hoặc AFB2α.

AFB1 và các sản phẩm chuyển hóa của nó được bài tiết qua ba con đường chính là qua mặt, nước tiểu và sữa (sản phẩm của AFM1). Người ta đã xác định có sự tương quan giữa AFB1 ăn vào và lượng AFM1 trong sữa. Lượng AFM1 trong sữa ước tính khoảng 1% trong lượng AFB1 ăn vào [4].

2.2.4. Độc tính của aflatoxin

Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính độc tố aflatoxin còn được xem là nguyên nhân

gây xơ gan và ung thư. Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất.

Nếu hấp thu một lượng là 2,5 mg aflatoxin trong thời gian ngắn (khoảng 3 tháng) có

thể dẫn đến ung thư gan sau một năm. Aflatoxin gây ra các tác hại chính sau đây:

- Phá hủy tế bào gan, thận và các bộ phận khác - Ức chế hệ miễn dịch

- Ăn mòn thành ruột và dạ dày - Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết - Gây ra ung thư gan ở người và gia súc

AFB1 là chất gây ung thư gan nhóm 1 đối với người. Aflatoxin khi kết hợp với virut viêm gan B làm tăng nguy cơ ung thư gan gấp 12 lần. Phơi nhiễm aflatoxin là một yếu tố gây bệnh còi cọc và thiếu cân, suy giảm thần kinh, suy giảm miễn dịch và

gây tử vong trẻ em. Phơi nhiễm aflatoxin gây suy giảm miễn dịch, nó có thể tương tác

với HIV/AIDS và các bệnh nhiễm trùng khác [3].

2.2.5. Cơ chế tác động của aflatoxin trong cơ thể

Ở mức độ tế bào việc nhiễm aflatoxin vào cơ thể với liều lượng khác nhau sẽ gây

ức chế enzym ADN và ARN polymerase ở gan do các aflatoxin liên kết với nhân ADN

trong tế bào. Theo đó là sự giảm sút quá trình sinh tổng hợp protein, đặc biệt khi quá trình

chịu ảnh hưởng mạnh sự biến đổi ở quá trình sinh tổng hợp của mARN. Người ta chứng minh rằng vòng α, β lactone không bão hòa trong phân tử aflatoxin làm cho chất này gây

ức chế tổng hợp ADN nhân tế bào. Do đó gây rối loạn quá trình quá trình tổng hợp tế bào [2].

Aflatoxin gây tác động lên gan, thận, não, gây ung thư gan nguyên phát, trong đó aflatoxin có độc tính gây ung thư mạnh nhất là AFB1. Ngoài ra, AFB1 cũng gây ra sự khác thường ở nhiễm sắc thể như các đoạn nhiễm sắc thể có cầu nối ở đôi chỗ [4].

2.2.6. Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin

Cho tới nay vai trò của aflatoxin sản sinh ra trong quá trình sinh trưởng và phát

triển của Aspergillus vẫn chưa được giải thích một cách đầy đủ, có nhiều sy đoán

được đưa ra (Benet và Christensen 1983; Ciegler 1983; Demain 2000).

Quá trình sinh tổng hợp aflatoxin là một quá trình phức tạp trải qua nhiều giai

đoạn và có sự tham gia của rất nhiều enzym và protein do tập hợp gen mã hóa. Các

gen này không nằm riêng lẻ mà tập hợp lại thành một cụm gen gồm 25 gen có kích

thước 66kb. Trung bình 1 gen có kích thước khoảng 2,8 kb, trong các gen này gen lớn

nhất có khối lượng khoảng 5-7 kb [20].

2.3. Các phƣơng pháp xác định sự có mặt của độc tố aflatoxin

2.3.1. Phương pháp hóa sinh

Cho tới nay việc sử dụng các phương pháp hóa sinh như phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC), phương pháp ELISA, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC) là phổ biến nhất trong việc phân tích aflatoxin. Các phương pháp này có đặc điểm là tương đối chính xác, tuy nhiên nhược điểm là không thích hợp cho số lượng mẫu lớn do phải tách chiết trong hệ dung môi phức tạp, đồng thời tốn nhiều thời gian và yêu cầu thiết bị đắt tiền.

2.3.2. Phương pháp vi sinh

Với các phương pháp này, thay vì xác định trực tiếp aflatoxin như phương pháp hóa sinh ta có thể xác định sự có mặt của aflatoxin một cách gián tiếp thông qua việc

xác định sự có mặt của các nấm mốc có khả năng sinh đôc tố aflatoxin trong mẫu. Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp này cần mất rất nhiều thời gian nuôi cấy và nguy

hiểm vì phải nuôi cấy vi sinh vật gây bệnh, đồng thời đòi hỏi kỹ năng và kinh nghiệm

quan sát của người phân tích. Không những thế đặc điểm hình thái vi sinh vật có thể

thay đổi theo điều kiện và thành phần môi trường nuôi cấy.

2.3.3. Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR

2.3.3.1. Cơ sở của phương pháp

Quá trình tạo aflatoxin được mã hóa bởi 25 gen nằm trong đoạn 66kb. Trong

cụm gen sinh tổng hợp aflatoxin vai trò của các gen là không giống nhau mỗi gen sẽ

có một chức năng riêng, một số gen có vai trò quan trọng mà nếu thiếu sự có mặt của

gen này thì qua trình sinh tổng hợp hầu như không xảy ra.

Phương pháp PCR phát hiện các chủng nấm sinh aflatoxin dựa trên các trình tự

DNA đặc hiệu của các chủng sinh độc tố để thiết kế mồi. Các mồi được thiết kế dựa

vào đặc điểm của các gen đóng vai trò quyết định trong quá trình sinh tổng hợp, từ đó

có thể kiểm tra sự có mặt hay không có mặt của các chủng sinh độc tố. Đây là phương

pháp có độ nhạy cao, tính đặc hiệu và xác định nhanh.

Trong thực tế việc xác định các chủng Aspergillus mang gen sinh aflatoxin dựa

vào các gen mã hóa các enzym xúc tác cho quá trình chuyển hóa các chất trong gen

trong quá trình sinh tổng hợp cũng như các gen điều khiển qua trình phiên mã của các

gen cấu trúc.

Sử dụng trình tự đoạn ITS cho định danh nấm

Hình 2.2. Trình tự đoạn ITS định danh nấm

Đoạn ITS (Internal Transcribed spacer) hay vùng đệm được phiên mã bao gồm 2 vùng ITS1 và ITS2 nằm giữa 18s; 5,8s và 28s trong đoạn cấu trúc thành operon

rDNA. Trong sinh vật nhân chuẩn được lặp lại hàng nghìn lần. Trình tự ITS được sử dụng rộng rãi trong định danh do chúng dễ dàng khuếch đại, có nhiều bản lặp và là

vùng không dịch mã nên có áp lực tiến hóa thấp sẽ tạo sự khác nhau đủ để phân biệt các loài. Hơn thế nữa trình tự ITS của chi Aspergillus đã được giải trình tự khá đầy đủ

trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế [13].

2.3.3.2. Cơ sở thiết kế mồi cho các phản ứng PCR

Trình tự mồi là chìa khóa của sự thành công hay thất bại của một phản ứng PCR. Nếu mồi được thiết kế đúng chuẩn mực thì phản ứng sẽ cho kết quả tốt, mồi thiết kế

không chuẩn thì phản ứng sẽ thất bại. Tìm ra trình tự mồi thích hợp là một vấn đề, ngoài

việc chúng cần tương ứng với các trình tự được đặt đối đầu cho vùng nhân bản mong

muốn của phẩn tử khuôn, thì nó còn yêu cầu tính đặc hiệu cao. Độ dài đoạn DNA được

nhân bản không còn là 3kb và lý tưởng nên nhỏ hơn. Một vấn đề quan trọng mồi cần dài

bao nhiêu thì đủ, nếu mồi quá ngắn thì chúng có khả năng bắt cặp với đoạn không mong

muốn và cho nhiều sản phẩm phụ, nếu mồi quá dài sẽ ảnh hưởng tới tốc độ bắt cặp làm

giảm hiệu quả phản ứng.

Nhiệt độ gắn mồi là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới tốc độ bắt cặp làm

giảm hiệu quả phản ứng. Nếu như nhiệt độ rất cao thì sẽ không có sự bắt cặp nào xảy

ra thay vào đó các đoạn mồi và khuôn tách nhau ra. Còn nếu nhiệt độ quá thấp thì các

thể lai không tương xứng sẽ rất không bền vững. Nhiệt độ gắn mồi lý tưởng cần phảo

đủ thấp để tạo điều kiện bắt cặp giữa mồi và khuôn, nhưng cũng đủ cao để các thể lai

khập khiễng hình thành. Nhiệt độ này có thể tính toán bằng cách xác định nhiệt độ nóng chảy Tm. . Tm là nhiệt độ mà ở đó thể lai cặp base bổ trợ tách nhau ra, va một nhiệt độ thấp hơn Tm 1-2 ºC là đủ thấp để cho phép thể lai khuôn- đoạn mồi bổ trợ xảy ra, nhưng lại quá cao để hình thành một đoạn lai để cặp base khập khiễng bền vững.

Tm được tính theo công thức sau:

Tm = (4[G +C] + (2[A +T]) ºC

Để khảo sát sự biểu hiện gen trong cụm gen aflatoxin thì phản ứng PCR cũng

cần thiết phải có các cặp mồi tương ứng với các gen đó.

Các cặp mồi tương ứng với các gen phần lớn được thiết kế dựa trên các đoạn nucleotid bảo thủ. Tuy nhiên, có những chủng Aspergillus vẫn mang hầu hết các gen trong cụm gen aflatoxin nhưng lại không có khả năng sinh aflatoxin, sở dĩ có điều này xảy ra vì tại các gen đó xảy ra một số trường hợp đột biến như mất đoạn, thêm đoạn

hay các đột biến điểm, làm thay đổi các nucleotide tương ứng. Trong trường hợp này các mồi thiết kế làm sao có vị trí tương ứng với vị trí xảy ra các đột biến

2.4. Tình hình nghiên cứu về độc tố aflatoxin trên lạc

2.4.1. Ngoài nước

Trong những năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu về đánh giá ô nhiễm

aflatoxin và các biện pháp can thiệp để hạn chế sự phát triển của aflatoxin hoặc giảm

hàm lượng aflatoxin trên lạc:

- Ở Brazil, Nakai và cộng sự (2008) báo cáo sự xuất hiện của aflatoxin trong lạc củ và hạt nhân và thấy rằng khoảng 20 mẫu (33,3%) đã bị ô nhiễm với AFB1 ở các cấp độ khác nhau, trung bình 7,0-116 mg/kg và 17 mẫu (28,3%) đã bị ô nhiễm với AFB2 ở các nồng độ khác nhau, 3,3-45,5 mg/kg. Khoảng 70,8% mẫu bị nhiễm aflatoxin vượt

quá giới hạn tối đa là 4 mg/kg [19].

- Atayde và cộng sự (2012) báo cáo sự hiện diện của aflatoxin có trong 5% mẫu

hạt lạc nhân với nồng độ khác nhau, 1,0-12,7 mg/kg và trong 13,8% các mẫu vỏ lạc

với nồng độ khác nhau, từ 1,0-117,8 mg/kg [14].

- Tỷ lệ aflatoxin trong lạc và các loại khác nhau của các sản phẩm lạc đã được

báo cáo từ các quốc gia khác nhau. Leon và cộng sự đã phân tích 196 mẫu hạt và các

sản phẩm lạc này và tìm thấy sự ô nhiễm aflatoxin cao dao động từ 16,6 mg/kg lên đến

711 mg/kg [16].

- Chun và cộng sự (2007) ở Hàn Quốc, tìm thấy các mẫu hạt lạc đã bị ô nhiễm

aflatoxin (chiếm 10,6 % tỷ lệ) có hàm lượng trong khoảng 0,20-28,2 mg/kg [12].

- Ở Trung Quốc, Wang và Liu (2006) tìm thấy hàm lượng aflatoxin trong lạc

nhiễm với mức trung bình là 80,3 mg/kg và mức cao nhất là 437 mg/kg [15].

- Năm 2013, tổng cộng có 198 lạc và sản phẩm của lạc ở các thành phố lớn của

Punjab của Pakistan được phân tích độc tố aflatoxin bằng HPLC thì kết quả cho thấy 59% lạc nguyên vỏ, 55% lạc nguyên bóc vỏ, 61% lạc rang nguyên vỏ, 68% lạc rang

bóc vỏ, 50% bơ lạc, 42% bánh lạc và 20% lạc nimko đã được tìm thấy nhiễm

aflatoxin. Nồng độ trung bình trong vỏ lạc là (6,4 mg/kg), lạc nguyên bóc vỏ (9,6 mg/kg), lạc rang có và không có vỏ (10,4 và 12,3 mg/kg), bơ lạc (2,4 mg/kg), bánh lạc (4,6 mg/kg) và lạc nimko (3,4 mg/kg) [15].

2.4.2. Trong nước

Ở Việt Nam có một số nghiên cứu về aflatoxin trong thực phẩm và biện pháp

giảm nguy cơ ô nhiễm aflatoxin như:

- Kết quả nghiên cứu của Lê Văn Giang, Phan Thị Kim và cộng sự Cục an toàn

vệ sinh thực phẩm (2001) cho thấy kết quả khảo sát ban đầu xác định 95,4% trong số

243 mẫu khảo sát ngô và lạc ban đầu bị nhiễm aflatoxin, trong đó có 23,64% vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế. Sau 6 tháng can thiệp bằng cách tách tạp chất, sấy và

bảo quản, kết quả cho thấy có sự cải thiện rõ rệt: 76,6% không phát hiện aflatoxin;

23% mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lượng nhỏ hơn mức quy định [1].

- Nguyễn Thùy Châu đã nghiên cứu công nghệ khử độc tố aflatoxin B1 trên ngô và lạc khô bằng hóa chất. Kết quả cho thấy NH3 nồng độ 6% hoặc Ca(OH)2 có tác dụng khử 90% độc tố aflatoxin. Nhưng chi phí xử lý bằng hóa chất này có giá thành cao, đặc biệt việc khử độc tố bằng amoniac đã để lại mùi khó chịu cho

ngô và khô lạc nên khó áp dụng rộng rãi trong thực tế ở Việt Nam [1].

- Virmani đã tiến hành nghiên cứu ở 7 vùng sinh thái của Việt Nam và đánh giá

mối liên quan của nguy cơ nhiễm aflatoxin tại các vùng sinh thái tại 3 giai đoạn (1)

giai đoạn sinh trưởng và phát triển, (2) giai đoạn thu hoạch và làm khô, (3) giai đoạn tàng trữ. Nhìn chung kết quả cho thấy nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc trong quá

trình bảo quản ở mức độ cao trên toàn Việt Nam [17].

PHẦN THỨ BA

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tƣợng

3.1.1. Chủng chuẩn nấm Aspergillus và mẫu lạc

Chủng chuẩn nấm : Aspergillus flavus ATCC 204304 được cung cấp từ Thư

viện chủng quốc gia Mỹ

Mẫu lạc nhân được thu thập từ các chợ thuộc 3 địa điểm:

Lô 1: 10 mẫu, Thị trấn Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội

Lô 2: 10 mẫu, Phố Huế, Hai Bà Trưng, Hà Nội

Lô 3: 10 mẫu, Phạm Đình Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội

3.1.2. Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ: Đĩa petri, đèn cồn, que cấy,bút viết phin, kính, thước kẻ, paraphin,

pipet, ống eppendorf, lam kính, lamen…

Thiết bị: Tủ sấy, tủ lạnh, buồng cấy, nồi hấp vô trùng , lò vi sóng, cân kỹ thuật,

kính hiển vi, tủ ấm, bồn rửa, bàn chuẩn bị môi trường, máy ly tâm, máy vortex…

3.1.3. Các môi trường chính sử dụng trong quá trình nghiên cứu

- Nước pepton: Peptone 10g , sodium chloride 8,5g; 1 lít nước cất

- Malt Extract Agar (MEA) : Maltose 12,75g/l; dextrin 2,75g/l; glycerol 2,75g/l;

peptone 0,78g/l; agar 15g/l

- Dichloran Glycerol Agar (DG18) bổ sung 18 % glycerol: Glucose 10g/l;

peptone 5 g/l; potassium dihydrogen phosphate 1g/l; dichloran 0,002g/l; magnesium

sulfate 0,5g/l; chloramphenicol 0,1g/l; agar 15g/l

- Yeast Extract Peptone (YEP): 2% yeast extract, 15 % peptone

3.1.4. Hóa chất

- Dung dịch Lactophenol amann: Sử dụng làm tiêu bản nấm mốc

Phenol tinh thể 10g Acid lactic 20g

Glycerol 10g Nước cất 10g

Cân 10g phenol tinh thể, bổ sung 10g nước. Đun sôi hỗn hợp đến tan. Lần lượt cho acid lactic và glycerol theo tỷ lên trên. Bảo quản dung dịch trong chai tối màu, để ở nhiệt độ phòng.

Ngoài ra còn có: Ethanol 96°, Isopropanol, cloroform, nước khử ion, thuốc

nhuộm redgel…

3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

3.2.1. Phương pháp phân lập nấm mốc A. flavus và A. parasiticus

Lấy các mẫu lạc nhân thu thập từ các chợ khác nhau, đánh số thứ tự, tiến hành

pha loãng và phân lập.

Phương pháp phân lập A. flavus; A. parasiticus dựa trên TCVN 8275-2: 2010

[8] gồm các bước như sau:

3.2.1.1. Chuẩn bị mẫu, dịch pha loãng

Mặc dù không tiến hành đếm số lượng nấm mốc nhưng để tiện cho việc xử lý

mẫu được đơn giản và đồng bộ, chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu giống như cách

thức đếm vi sinh vật.

Chuẩn bị mẫu lạc , dung dịch pha loãng ban đầu và các dung dịch pha loãng

theo TCVN 6507- 5-2013, TCVN 6404- 2008 và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản

phẩm [9], [10]

-1

Cân 10 g mẫu vào bao PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch nước pepton

Dập mẫu thu được dịch mẫu có nồng độ pha loãng 10

Lắc cho mẫu và nước pepton hòa vào nhau

3.2.1.2. Cấy và ủ

-1

-2

Chuẩn bị các nồng độ pha loãng tiếp theo : Hút 1ml dịch mẫu pha loãng vào

-3

nước muối sinh lý ( 0.85%) được nồng độ 10 , 10 , 10

Dùng pipet vô trùng, chuyển 0,1 ml dịch mẫu cho vào một đĩa thạch (DG18).

Dùng pipet vô trùng mới để chuyển 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10-2

cho vào đĩa thạch DG18 thứ hai.

Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vô

trùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng.

Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng, cho

đến khi dịch lỏng hấp thụ hết vào môi trường.

Có thể sử dụng kỹ thuật cấy bằng phương pháp đổ đĩa, nhưng trong trường hợp

này sự tương đương của các kết quả phải được đánh giá bằng cách so sánh với kết quả

được cấy trên bề mặt đĩa và có thể không phân biệt sự khác nhau của nấm men và nấm mốc. Phương pháp cấy bề mặt có thể cho kết quả định lượng cao hơn. Kỹ thuật dàn đĩa

tạo điều kiện cho các tế bào tiếp xúc tối đa với oxi của không khí và tránh mọi nguy cơ mất hoạt tính do nhiệt của các chồi nấm. Các kết quả có thể phụ thuộc vào từng loại

nấm.

Ủ các đĩa đã chuẩn bị trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên trong tủ

ấm ở 25oC ± 1oC trong 5 ngày đến 7 ngày.

Các bào tử nấm mốc phân bố trong không khí rất mạnh, nên cần thao tác với

các đĩa petri cẩn thận để tránh làm phát triển các khuẩn lạc vệ tinh mà có thể cho ước

tính kết quả quá cao.

Tiến hành kiểm tra bằng kính khuếch đại hai thị kính hoặc bằng kính hiển vi để

phân biệt giữa các tế bào nấm mốc từ các khuẩn lạc.

Chọn các đĩa mà khuẩn lạc mọc độc lập riêng rẽ, mật độ không quá dày để phân lập

tiếp tục đến khi thu được các chủng thuần khiết.

Chọn những khuẩn lạc có màu vàng , lục vàng và xanh lục nghi ngờ là A.

flavus và A. parasiticus, tiến hành làm thuần nấm mốc.

3.2.1.3. Phương pháp làm thuần và giữ giống

Xác định chủng nấm đã thuần hay chưa bằng phương pháp cấy chấm điểm:

- Dùng que cấy ( đã khử trùng bằng cách đốt ) lấy bào tử hoặc sợi tơ , cắm đầu

móc xuống giữa mặt thạch MEA, hoă ̣c chấm thành 3 điểm.

- Ủ trong tủ ấm 25±1 ºC

- Sau 5 - 7 ngày lấy ra quan sát đặc điểm hình thái và cấu tạo vi thể

Sau khi đã thu được khuẩn lạc thuần tiến hành bảo quản giống trên môi trường

lỏng YEP ở -80ºC để phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo.

3.2.2. Phương pháp định danh nấm mốc dựa vào hình thái và cấu tạo vi thể

Định danh A. parasiticus theo tiêu chuẩn: 52 TCN - TQTP 0009 : 2004

Định danh A. flavus theo tiêu chuẩn : 52 TCN - TQTP 0001: 2003

- Quan sát đại thể: Có thể nhìn bằng mắt thường hoặc dùng kính lúp để nhận xét

về hình thái, kích thước và màu sắc của khóm nấm

- Quan sát vi thể:

Các bước chuẩn bị tiêu bản để quan sát dưới kính hiển vi

Bước 1: Nhỏ một giọt thuốc nhuộm Lactophenol Amann lên giữa lam kính

sạch.

Bước 2: Dùng que cấy nhọn đầu lấy mẫu nấm dìm vào giọt thuốc nhuộm để

thấm ướt khóm nấm.

Bước 3: Đặt lamen sao cho một cạnh chạm lam kính gần mép giọt thuốc

nhuộm. Từ từ hạ cạnh bên kia của lamen xuống sao cho trùm lên giọt thuốc nhuộm để

đẩy bọt khí ra ngoài.

Bước 4: Dùng giấy sạch thấm đi phần thừa từ phía ngoài lam kính

Bước 5: Quan sát dưới kính hiển vi quang học

Quá trình làm tiêu bản được thực hiện trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn lửa đèn

cồn để tránh lây nhiễm nấm.

Đặc điểm khuẩn lạc và vi thể của A. flavus và A. paraciticus được trình bày

trong bảng 2.1.

3.2.3. Phương pháp dịnh danh nấm mốc dựa vào trình tự gen ITS

Các khuẩn lạc thu được từ 3.2.2 được giải trình đoạn gen ITS theo quy trình và

so sánh với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế.

3.2.3.1. Tách chiết ADN tổng số

Các mẫu nấm sau khi được phân lập và làm thuần trên môi trường MEA sẽ

được làm nguyên liệu tách chiết ADN tổng số. Quy trình tách chiết gồm các bước sau :

- Nuôi bào tử qua đêm trên môi trường YEP trong ống eppendorf 1,5ml ở

25±1 ᵒC

- Ly tâm 10000 vòng/ 5 phút, thu sinh khối rửa lại bẳng H20

- Thêm 400µl TES (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0, SDS 1%)

- Ủ 65◦C, 30 phút

- Thêm cát tha ̣ch anh, vortex 1 phút, thu dịch nổi

- Thêm 1 lần thể tích phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1).

Ly tâm ở 4ºC,13000 vòng/ 5 phút thu pha trên

- Lặp lại bước trên , tủa bằng Natri acetate + ethanol 96º ủ đá 10 phút, ly tâm ở

4ºC,14000 vòng/10 phút

- Bỏ dịch thêm 500µl ethanol 70º ly tâm ở 4ºC, 13000 vòng/5 phút

- Làm khô 15 phút, thêm 100 µl nước đã khử ion.

Các mẫu ADN tổng số sau đó được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ OD260/280nm để kiểm tra hàm lượng và chất lượng ADN tổng số thu được.

3.2.3.2. Định lượng ADN bằng phương pháp đo độ hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước

sóng 260/280nm

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm (A260) của các phân tử ADN. Từ giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm của các mẫu, với hệ số A260 = 1 tương đương với 50µg/ml.

Sử dụng công thức C = A260 x 50 x n (trong đó n là số lần pha loãng) để định

lượng ADN trong mẫu tách chiết

3.2.3.3. Khuếch đại bằng phản ứng PCR đặc hiệu

Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân

nhiệt bằng hai mồi đặc hiệu, quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 35 chu kỳ

 Chuẩn bị ống khuếch đại cho phản ứng 50 µl

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

Master mix 2X 25

19 H20

ITS1 2

ITS4 2

2 ADN

Tổng thể tích 50

Hút 25 µl master mix 2x chứa enzyme Taq polymerase, cho vào ống nghiệm

PCR dung tích 0,2ml thêm vào 2 µl mồi xuôi (ITS1), 2 µl mồi ngược (ITS4), 2 µl

mẫu, 19 µl nước không chứa ADNase

 Chương trình khuếch đại

Các ống khuếch đại được đặt trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại

như sau:

Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số chu kỳ

4 phút 96

45 giây 94

1 phút 57 35

1 phút 20 giây 72

8 phút 72

Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 4oC cho tới lúc điện

di.

3.2.3.4. Điện di sản phẩm khuếch đại:

 Nguyên lý điện di: Các phân tử ADN là các polyanion nên trong môi trường trung tính và kiềm, dưới tác dụng cuả điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức độ di chuyển của các phân tử ADN trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích thước ( hay khối lượng phân tử) của chúng. Phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh, còn phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm. Sử dụng thang chuẩn ADN với kích thước đã biết có thể dễ dàng xác định được kích thước tương đối của ADN mẫu.

 Chuẩn bị: Điện di bằng dung dịch đệm TAE 1X

Chuẩn bị bản gel: Cân 1g agarose cho vào 100ml TAE 1X sau đó lắc nhẹ lọ để hòa tan agarose. Đun chảy hoàn toàn trong lò vi sóng,bổ sung thuốc nhộm redgel theo

tỷ lệ cứ 100ml dung dịch gel cho 5µl, lắc đều để lọ ở nhiệt độ phòng

Khi dung dịch gel nằm trong khoảng 45- 50ºC và đổ vào khay điện di đã có sẵn

các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3- 4 mm.

 Điện di:

Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương. Nạp dung dịch điện di ( 1-2 µl loading Dye 6X + 5-6 µl mẫu) đã chuẩn

bị vào trong mỗi giếng gel agarose.

Cắm nguồn điện cho máy điện di. Đặt ở hiệu điện thế 110V trong 45 phút.

 Quan sát, chụp hình

Cho bản gel đã nhuộm vào máy soi UV, đóng kín cửa bảo vệ, bật đèn rồi quan

sát các băng phát sáng của ADN xuất hiện trên bản gel. Sau đó chụp hình để lưu trữ

kết quả.

 Đọc và diễn giải kết quả

Kết quả phân tích được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dương có sản phẩm

khuếch đại ADN với kích thước 640 bp và mẫu đối chứng âm không có sản phẩm này.

Phản ứng thành công khi có sản phẩm khuếch đại 640 bp trên bản gel

3.2.3.5. Giải trình tự Sanger

Các bước giải trình tự

Bước 1: Làm biến tính sợi khuôn ADN thành 2 sợi đơn và được lai với mồi.

Mồi là một sợi đơn gồm vài chục nucleotide có thể liên kêt với một trong hai sợi DNA

đơn theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung.

Bước 2 : 4 phản ứng riêng rẽ được tiến hành đồng thời. Mỗi phản ứng là hỗn hợp ADN khuôn, mồi, enzyme ADN polymerase, 1 loại dideoxynucleotide và 4 loại deoxynucleotide theo tỷ lệ 1:100

Bước 3: Sản phẩm của 4 phản ứng cùng được phân ly trên gel polyacrylamide cho

phép phân biệt hai sợi đơn ADN hơn kém nhau 1 nucleotide.

Bước 4: Các vạch ADN quan sát được nhờ có gắn phóng xạ P32 vào mồi hoặc

vào một trong 4 loại nucleotide bình thường.

Các mẫu giải trình tự tiến hành tại công ty 1st BASE Sequencing INT, Hàn

Quốc.

Phương pháp xử lý số liệu

Trình tự thô sẽ được xử lý tiếp bằng phần mềm FinchTV để chọn những

nucleotide phù hợp cho các sắc đồ. Trình tự nucleotide chuẩn được chuyển lên công cụ BLAST tại ncbi.nlm.nih.gov ( The National Center for Biotechnology Infomation )

so sánh với những loài đã có trình tự ITS đã công bố và định danh chủng theo dựa theo

sự tương đồng trên 98%.

3.2.4. Xác định khả năng sinh độc tố dựa vào phương pháp sắc ký khối phổ

Các chủng được định danh bằng hình thái học và trình tự ITS xác định khả

năntg sinh độc bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC- MS/MS

Chân không

Ion hóa

Sắc kýlỏng

Detector/ Lưu giữ số liệu

Bộ phân tích khối

Hình 3.1. Mô hình hệ thống LC- MS/MS

3.2.4.1. Chiết aflatoxin bằng cột ái lực miễn dịch:

 Chuẩn bị mẫu phân tích

 Chiết aflatoxin trong mẫu phân tích:

 Làm sạch trên cột SPE-IM:

Dịch rửa giải được thổi khô đến hết dung môi và hòa cặn chính xác bằng

methanol và được bơm vào LC/MS-MS.

3.2.4.2. Chạy sắc ký lỏng khối phổ LC- MS/ MS

Điều kiện chạy máy sắc kí lỏng khối phổ

Cột sắc ký pha đảo C18 Dionex hoặc tương đương: 250 mm x 4,6 mm x 5 µm.

Pha động:

Bảng 3.1. Chương trình gradient của pha động

Tỷ lệ % Amoniacetat 10 Thời gian (phút) Tỷ lệ % MeOH mM

0 ─> 4 5 95

4 ─> 5 100 0

5 ─>10 5 95

- Thể tích bơm mẫu: 10 µl.

- Tốc độ dòng pha động: 1 ml/phút

- Điều kiện khối phổ: Bảng sau mô tả điều kiện chạy đối với thiết bị MS ABI

5500 QQQ.

Bảng 3.2. Điều kiện chạy khối phổ

Nguồn ion hóa Electrospray (ESI)

Thế ion hóa 4000 KV

Chế độ Ion dương

Nhiệt độ nguồn 300 0C

Curtain gas: 25 psi

Khí Ion source gas 1: 30 psi

Ion source gas 2: 10 psi

Năng lượng bắn phá CE = 30 eV

B1: 313 ─> 241, CE=41 Ion chọn lọc ─>269, CE=37

Để xác nhận sự có mặt của chất phân tích trên LC-MS/MS, ngoài sự trùng lặp

về thời gian lưu tương ứng của mỗi chất còn căn cứ vào tỷ lệ đáp ứng tín hiệu của ion

định lượng và ion định tính. Tỷ lệ này có thể thay đổi tùy thuộc vào độ nhạy của thiết bị.

Với mẫu dương tính, căn cứ vào sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ,

căn cứ vào diện tích pic mẫu tính kết quả theo công thức sau

X = V x K x Cm/m

Trong đó: V: Thể tích dịch chiết cuối cùng chạy máy LC-MS/MS (ml)

Cm: Nồng độ aflatoxin trong dịch chiết cuối cùng(ng/ml)

m: Khối lượng của mẫu phân tích (g)

X: Hàm lượng aflatoxin trong mẫu phân tích (ng/g)

K: Hệ số pha loãng

PHẦN THỨ TƢ

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả phân lập nấm mốc A. flavus và A. parasiticus

Trong suốt quá trình nghiên cứu, chúng tôi sử dụng môi trường DG18, nhiệt độ nuôi cấy là 25±1 OC để phân lập nấm mốc. Phương pháp được trình bày ở mục 3.2.1 ở

phần phương pháp nghiên cứu.

Đánh giá sơ bộ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi thấy có nhiều khuẩn lạc có

đặc điểm hình thái khác nhau. Điều này chứng tỏ có nhiều loài vi sinh vật khác nhau

trong quá trình phân lập. Vì vậy sau 5 ngày nuôi cấy chúng tôi chọn ra những khuẩn

lạc màu vàng, lục vàng, xanh lục để tiến hành làm thuần.

Để định danh chính xác, chúng tôi xác định lại những khuẩn lạc này trên môi trường MEA nuôi ở 25±1OC và tiến hành nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn la ̣c và cấu ta ̣o vi thể.

Kết quả phân l ập được 30 chủng nấm mốc nghi ngờ là A. flavus và A.

parasiticus trên các mẫu lạc thu thập tại các chợ trên địa bàn Hà Nội.

4.2. Kết quả định danh nấm mốc dựa vào hình thái và cấu tạo vi thể

Chúng tôi đã tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc sau 5- 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MEA ở 25±1 OC, đồng thời tiến hành làm tiêu bản nhuộm Lactophenol Amann, soi dưới kính hiển vi quang học với vật kính 40X để quan sát cấu tạo vi thể.

Từ đó, định danh sơ bộ chủng nấm A. flavus và A. parasiticus sinh độc tố aflatoxin.

Kết quả định danh được trình bày ở bảng 4.1

Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cấu tạo vi thể

STT Kí hiệu Đặc điểm khuẩn lạc

Đặc điểm cấu tạo vi thể Bông hình cầu,thể bình 1 lớp 1 M1

d= 5,3 cm, rìa trắng, giữa lục vàng đến xanh lục d= 4,5 cm, xanh lục 2 M2

d= 6,0 cm, lục vàng 3 M3

d= 6,5cm, vàng đậm 4 M4

d= 6,2 cm, lục vàng 5 M5

6 M6 Bông hình cầu, tỏa tia,thể bình 1 lớp, Bông hình chổi, tạo cột, thể bình 2 lớp Bông hình chổi, tỏa tiathể bình 1 lớp Bông hình cầu, tỏa tia,thể bình 1 lớp Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình 2 lớp

d= 5,9cm, rìa trắng, giữa lục vàng, vàng đậm d= 5,3cm, rìa trắng, giữa xanh lục Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình 1 7 M7

d= 5,2cm, xanh lục 8 M8

d= 5,9cm, lục vàng 9 M9 lớp Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình 1 lớp Bông hình chổi, tỏa tia, thể bình 1 lớp

10 M10

d= 5,1cm, lục vàng đến xanh lục Bông hình cầu, thể bình 1 lớp d= 5,7cm rìa trắng giữa vàng đậm Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình 2 11 M12

d= 6,2, lục vàng 12 M13 lớp Bông hình chổi, tạo cột, thể bình 1 lớp

d= 4,9cm, rìa trắng, giữa xanh lục Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình 1 13 M14

14 M15 lớp Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình 1 lớp

d= 5,8 cm, rìa trắng giữa vàng đậm d= 5,7cm, rìa trắng, giữa lu ̣c vàng Bông hình chổi, tạo cột, thể bình 2 15 M16

16 M18

lớp Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình 2 lớp Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình lớp 17 M21 d= 6,1 cm, rìa vàng nhạt, giữa vàng đậm d= 4,2cm, rìa trắng giữa vàng đậm đến xanh lục

18 M25 19 M26

20 M28

21 M31

22 M33 Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình 1 lớp Bông hình cầu, thể bình 1 lớp Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình 1 lớp

d= 5,1cm, lục vàng đến xanh lục Bông hình cầu, thẻ bình 1 lớp d= 5,6cm, rìa trắng giữa xanh luc Bông hình cầu, thể bình 1 lớp d= 6,3 cm , rìa trắng, giữa vàng nhạt, lục vàng d= 6.0 cm, xanh lu ̣c d= 4,8 cm, rìa trắng, giữa xanh lục d= 6cm, vàng nhạt đến lục vàng , Bông hình cầu, tỏa tia, thể bình 2 23 M37

24 M38

25 M39

d= 5,9cm, vàng đậm đến lục vàng, d= 5,5, rìa trắng, giữa vàng lục d= 6,3cm , lục vàng 26 M43

27 M45

28 M46

lớp Bông hình chổi, tỏa tia, thể bình 1 lớp Bông hình cầu, thể bình 1 lớp Bông hình chổi, tỏa tia, thể bình 1 lớp Bông hình cầu, tỏa tia,thể bình 1 lớp Bông hình cầu, thể bình 2 lớp Bông hình cầu, thể bình 1 lớp 29 M47

Bông hình cầu, thể bình 1 lớp 30 M50 d= 5,4cm, rìa trắng , giữa vàng đâ ̣m, lục vàng d= 6,5cm, rìa trắng, lục vàng d= 6,3cm, rìa trắng, giữa vàng đậm d= 5,5, rìa trắng, giữa lục vàng đến xanh lục

Mẫu 28: A. flavus Mẫu 43: A. flavus

Mẫu 46: A. flavus Mẫu 50: A. parasiticus

Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MEA

M45: A. flavus M38: A. flavus

A. flavus ATCC 204304 M31: A. parasiticus

Hình 4.2. Hình thái khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MEA

Dựa vào những đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cấu tạo vi thể được miêu tả ở bảng 4.1. So sánh với đặc điểm hình thái trong bảng 2.1 bướ c đầu chúng tôi xếp vào hai nhóm như trong bảng 4.2.

Bảng 4.2. Kết quả định danh nấm A. flavus và A. parasiticus

Khuẩn lạc nghi ngờ là A. flavus Khuẩn lạc nghi ngờ là A. parasiticus

M3, M4,M5, M6, M9, M12, M13, M1, M2, M7, M8, M10, M14, M21,

M25, M26, M31, M33, M50

M15, M16, M18,M28, M37, M38, M39, M43, M45, M46, M47

Như vậy bằng phương pháp hình thái học chúng tôi đã định danh được 18

chủng nấm A. flavus và 12 chủng A. parasiticus trên tổng số 30 chủng phân lập được. Từ đó chúng tôi nhận thấy đặc điểm hình thái của 2 chủng nấm trên nuôi cấy 7 ngày

trên môi trường MEA như sau :

 A.flavus:

Đường kính khuẩn lạc từ 5.5- 6.5 cm, màu vàng đậm đến lục vàng, phân bố

dày.

Bông hình cầu, tạo cột, bào tử đính hình cầuđến gần cầu, thể bình 1 hoặc 2 lớp, cuống bào tử xù xì.

 A. parasiticus:

Đường kính khuẩn lạc từ 4.3- 6.0 cm. Màu lục vàng đến xanh lục, phân bố thưa. Bông hình cầu, tỏa tia, bào tử đính hình cầu, gần cầu, thể bình 1 lớp, cuống bào tử xù xì.

4.4. Kết quả giải trình tự gen ITS định danh nấm A. flavus, A. parasiticus

4.4.1. Kết quả tách chiết ADN

Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát một số phương pháp tách chiết ADN

tổng số ở nấm men, nấm mốc cũng như nấm Aspergillus đã được công bố. Tuy nhiên, sau khi thử nghiệm chúng tôi nhận thấy phương pháp tách chiết với các mẫu nấm nuôi cấy trong môi trường lỏng là hiệu quả nhất.

Vì thế chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp tách chiết này cho các mẫu nấm đã được làm thuần mang các đặc điểm hình thái đặc trưng của nấm A. flavus và A. parasiticus.

Kết quả thu được 11 mẫu ADN tổng số. Chất lượng của các mẫu ADN tổng số được kiểm tra theo phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng λ= 260 và 280nm

(bảng 4.3).

Bảng 4.3. Kết quả đo nồng độ ADN sau khi tách chiết

Chủng Nồng độ (ng/ µl) A260/A280

M14 20,39 1,85

M21 46,99 1,94

M28 62,62 1,83

M31 20,52 1,88

M32 38,88 2,03

M39 53,25 1,86

M43 42,86 1,91

M45 46,68 1,87

M46 69,21 2,05

M47 35,63 2,01

M50 57,32 1,81

M8.1 38,63 2,02

Có thể thấy rằng các mẫu ADN đều có tỷ số A260/280 dao động từ 1,8 đến 2,1 chứng tỏ ADN thu được sạch, không lẫn protein và ARN [5]. Kết quả này cho thấy,

các mẫu ADN tổng số thu được theo phương pháp tách chiết này đảm bảo chất lượng.

Các mẫu ADN tổng số được sử dụng làm sợi khuôn cho phản ứng PCR đặc

hiệu với cặp mồi đã thiết kế.

4.4.2. Kết quả khuếch đại bằng phản ứng PCR đặc hiệu

Các mẫu ADN tổng số thu được có nồng độ phù hợp sẽ được dùng là khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi ITS1 và ITS4 sau đó điện di kiểm tra kết quả của phản ứng.

640 bp

500 bp

Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn ITS

Trên hình 4.3 là kết quả điện di các mẫu đã được tách ADN ở bước trên trong

đó: Băng M là băng thang chuẩn ADN có kích thước từ 100 đến 1000 bp băng sáng nhất ở giữa có kích thước 500 bp, các băng đươ ̣c đánh số là các m ẫu sản phẩm PCR trong đó mẫu số 47 và 28 phải chạy lại phản ứng PCR, các mẫu còn lại băng lên rõ

ràng không có băng phụ kích thước vào khoảng 640 bp phù hợp với kích thước đoạn

ITS và thích hợp để giải trình tự.

4.4.3. Kết quả giải trình tự

Kết thúc quá trình PCR chúng tôi chọn 7 chủng M14, M21, M31, M43, M45,

M46, M50 để giải trình tự trong hình 4.4 và hình 4.5 là kết quả giải trình tự của nấm M

45. Các kết quả khác được liệt kê trong phần phụ lục.

Kết quả giải trình tự cho thấy sản phẩm giải trình tự có chất lương rất tốt, sắc ký

đồ rõ ràng. Trình tự ADN của nấm M45 được thể hiện trong hình 4.4

0 9 5 u n n ê đ

0 3 3

u n ừ

t

ự

t

h n ì r T

.

4 .

ì

4 h n H

Từ kết quả sắc đồ trình tự nucleotide được xuất ra trong hình 4.5

Hình 4.5. Trình tự ADN của nấm M45

Từ kết quả giải trình tự gen của 7 mẫu nấm trên . Chúng tôi so sánh trình tự của đó

trên ngân hàng gen, sử dụng phần mềm trực tuyến Blast tại địa chỉ :

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=Blast

Search&LINK_LOC=blasthome). Dựa vào mức độ tương đồng giữa chủng phân

tích và chủng đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để định danh.

Hình 4.6 kết quả so sánh của chủng M50

Trong hình 4.6 là kết quả so sánh chủng M50 với dữ liệu trên ngân hàng gen quốc tế cho thấy chủng FIB PP2.2 là có mức điểm cao nhất( 1022/1022) so với chủng

M50 được so sánh, có mức độ bao phủ trình tự phân tích là 100%, và có mức độ tương

đồng là 99%. Kết quả này so với kết quả hình thái học trong bảng 4.2 có sự khác biệt,

dựa vào hình thái học chủng M50 được phân vào nhóm A.flavus. sự khác nhau này sẽ được bàn luận sâu hơn ở phần kết quả ảnh hiển vi điện tử quét bào tử.

Tiến so sánh tất cả các chủng giải trình tự với dự liệu trên ngân hành gen quốc

tế chúng tôi thu được kết quả như trong bảng 4.4

Bảng 4.4. Kết quả tìm kiếm trên ngân hàng gen quốc tế

Loài xác định Mẫu nấm Đoạn ADN so sánh Chủng, trình tự trên ngân hàng gien quốc tế

Phần trăm đoạn so sánh % 100 100 100 100 Mức đồng nhất trình tự % 100 99 100 100

M45 MTCC 8654 M50 FIB PP 2.2 M46 KP214054.1 M43 QRF360 M14 Kết quả giải trình tự xấu M21 Kết quả giải trình tự xấu M31 Kết quả giải trình tự xấu ITS1, ITS2 Aspergillus flavus ITS1, ITS2 Aspergillus flavus ITS1, ITS2 Aspergillus flavus ITS1, ITS2 Aspergillus flavus ITS1, ITS2 Không định được loài ITS1, ITS2 Không định được loài ITS1, ITS2 Không định được loài

Trong 7 chủng được giải trình tự có 4 chủng được định danh là A. flavus và 3

chủng chưa định danh được do sai lỗi xảy ra. Trong 4 chủng giải trình tự thì có 3

chủng kết quả trùng với kết quả hình thái học.

4.4.4. Kết quả chụp ảnh hiển vi điện tử quét

Để khẳng định sâu hơn về phân loại chúng tôi tiến hành chụp ảnh hiển vi điện tử quét bào tử của hai mẫu M50 và M8.1 tại phòng kính hiển vi - Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương - 131 Lò Đúc. sau đó so sánh với hình ảnh chuẩn đã được công bố bởi Rodrigues P và cộng sự (2007) trong hình 4.7

Hình 4.7 ảnh hiển vi điện tử quét A.paraciticus (a) và A. flavus( b) và a theo

Rodrigues P và cộng sự (2007)

Hình 4.8. Ảnh hiển vi điện tử quét bào tử chủng M50

Hình 4.9. Ảnh hiển vi điện tử quét nấm M8.1

So sánh hình 4.8 của mẫu M50 với hình 4.6 cho thấy chủng M50 thuộc

A.flavus với những đặc điểm trên bề mặt bào tử có các thùy dạng như hạt đậu, và rãnh

giữa các thùy nông và đều, còn hình 4.8 có những đặc điểm giống với A.paraciticus:

Nhìn hình 4.9 ta thấy hình thái khuẩn lạc của nấm M8.1 hình cầu,xù xì và có

gai nhọn thùy chia sâu. Kết hợp của kết quả hình thái và ảnh hiển vi điện tử chúng tôi

kết luận nấm M8 là Aspergillus parasiticus.

4.5. Kết quả phân tích khả năng sinh độc tố aflatoxin bằng sắc ký khối phổ

Để bước đầu đánh giá khả năng sinh độc tố aflatoxin của các chủng phân lập

được chúng tôi tiến hành với hai chủng M45 và M33.

Mẫu thử được nuôi trên nền mẫu lạc ở điều kiện: 25oC, trong 2 tuần, Và được phân tích bằng kỹ thuật sắc ký khối phổ tại Khoa Độc học dị nguyên - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia.

Chuẩn AFB1

M45

Min

Hình 4.7. Sắc đồ chạy sắ c ký khối phổ nấm M45

Thời gian lưu của nấm M45 trùng với thời gian lưu của chuẩn, độc tố thuộc nhóm B1 nồng độ aflatoxin B1 của nấm M45 được định lượng là 6,8 ppb, kết quả tương tự với chủng M 33 là aflatoxin B1 với nồng độ 8,60ppb.

PHẦN NĂM

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

1. Xây dựng đươ ̣c phương p háp phân lập và định danh nấm mốc có khả năng

sinh đô ̣c tố aflatoxin trong la ̣c bằng phương pháp hình thái ho ̣c kết hơ ̣p giải trình tự gen ITS.

30 chủng nghi ngờ Aspergillus flavus và Aspergillus 2. Phân lâ ̣p đươ ̣c

parasiticus trong lạc.

- Khẳng đi ̣nh bằng hình thái ho ̣c 18 chủng là Aspergillus flavus;

- Khẳng đi ̣nh bằng hình thái ho ̣c 12 chủng là Aspergillus parasiticus;

- Khẳng đi ̣nh đươ ̣c 04 chủng là Aspergillus flavus khi giải trình tự đoạn ITS.

3. Xác định được 02 chủng là Aspergillus flavus sinh đô ̣c tố aflatoxin

B1với nồng độ 6,8 ppb và 8,6 ppb bằng sắc ký khối phổ .

5.2. Kiến nghị

1. Thẩm đi ̣nh phương pháp phân lâ ̣p và đi ̣nh danh nấm Aspergillus flavus và

Aspergillus parasiticus trong nền mẫu la ̣c và mô ̣t số nông sản.

2. Tiếp tu ̣c đi ̣nh danh 26 khuẩn la ̣c nghi ngờ còn la ̣i và phân tích khả năng sinh

đô ̣c tố aflatoxin.

3. Phân lâ ̣p và đi ̣nh danh các nấm sinh đô ̣c tố mycotoxin khác trong la ̣c và các

nông sản khác.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

1. Nguyễn Thùy Châu (1996). Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố của

chúng trên ngô, gạo Việt Nam và biện pháp phòng trừ, Luận án phó tiến sĩ khoa học

sinh học, Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội

2. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000). Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học,

Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.

3. Lê Văn Lương, Quyền Đình Thi (2004). Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, Nhà xuất

bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.

4. Nguyễn Hồng Miên (1980). Nấm mốc độc trong thực phẩm, Nhà xuất bản khoa học

và kỹ thuật Hà Nội.

5. Quyền Đình Thi (2005). Tập 1: Những kỹ thuật cơ bản trong phân tích DNA, Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.

6. Tiêu chuẩn ngành 52 TCN-TQTP 0009:2004. Thường quy kỹ thuật định danh nấm

mốc Aspergillus parasiticus, Aspergillus versi-color trong thực phẩm.

7. Tiêu chuẩn ngành 52 TCN-TQTP 0001: 2003. Thường quy kỹ thuật định danh nấm

mốc Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus trong thực phẩm

8. TCVN 8275-2:2010. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương

pháp định lượng nấm men nấm mốc - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc trong các sản

phẩm có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0.95

9. TCVN 6507-5-2013. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị

mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh

vật

10. TCVN 6004- 2008. Vi sinh vật trong thực phẩm và chức năng chăn nuôi. Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật

11. Viện Dinh Dưỡng - Bộ Y tế (2007). Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr.66.

Tài liệu nƣớc ngoài. 12. Eduardo Beltrán., María Ibáñez., Juan Vicente Sancho., Miguel Ángel Cortés., (2007). “UHPLC–MS/MS highly sensitive Vicent Yusà., Félix Hernández

determination of aflatoxins, the aflatoxin metabolite M1 and ochratoxin A in baby food and milk”, Food Chemistry, Issue 2, Pages 737–74.

13. Josep M. Guerrero, Josepa Gene´, Alberto M. Stchigel (1999). Developments in

Fungal Taxonomy , Clinical microbiology reviews, p.454-489

14. Anderson H.W., Nehring E.W and Wichser W.R. (1973), “Aflatoxin contamination of Corn in the Field”. Journal of Agriculturre and Food Chemistry,

Issue 23, pp. 775-782. 15. Wang J., & Liu X. M. (2006),“Surveillance on contamination of total aﬂatoxins

in corn, peanut, rice, walnut and pine nut in several areas in china”, Chinese Journal of

Prevantive Vetrinary Medicine, Issue 4, pp.33-37.

16. Rodrigues P., Soares C., Kozakiewicz Z., Paterson R.R.M., Lima N. and

Venâncio N. ( 2007). Identification and characterization of Aspergillus flavus and aflatoxins, Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in

Applied Microbiology

17. Virmani S.M (1997), “Risk of aflatoxin contamination of ground nut in Vietnam

appreliminary study”, India conference, No CP 1137, pp. 66-78.

18 . Meritxell Ventura, Antonio Gomez, Ivan Anaya, Jordi Diaz, Francesc Broto,

Montserrat Agut, Lluis Comellas (2004), “Determination of aflatoxin B1, G1, B2,

G2 in medicinal herbs by liquid chromatography – tantandem mass, spectrmetry”, Journal

of Chromatography A , Issue 1048, pp. 25-29.

19. Nakai V.K., Rocha de L.O., Goncalez, E., Fonseca H., Ortega E. M. M.,

& Corrêa B.(2008), “Distribution of fungi and aflatoxins in a stored peanut

variety”, Food Chemistry, Issue 106, pp. 285-290. 20. Jiujiang yu., Deepak Bhatnagar., Thomas E. Cleveland. Completed sequence of

aflatoxin parthway gene clusted in Aspergilus paraciticus. FEBS Letters 564, 2004 (

126-130).