Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Xác định kiểu gen của virus viêm gan B ở một số bệnh nhân nhiễm virus tại Thái Nguyên bằng phương pháp PCR lồng (Nested - PCR)

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:63

Thêm vào BST

Báo xấu

39
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định được kiểu gen của virus viêm gan B ở một số bệnh nhân nhiễm virus tại Thái Nguyên bằng phương pháp PCR lồng (Nested - PCR). Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Xác định kiểu gen của virus viêm gan B ở một số bệnh nhân nhiễm virus tại Thái Nguyên bằng phương pháp PCR lồng (Nested - PCR)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG (NESTED - PCR) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG (NESTED - PCR) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Đắc Trung THÁI NGUYÊN - 2017
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Lê Thị Thu Hà
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Đắc Trung và TS. Nguyễn Phú Hùng đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô Bộ môn Vi sinh, trường Đại học Y Dược - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017 Tác giả Lê Thị Thu Hà
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT................................................................................ v DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. viii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Đại cương về bệnh viêm gan B và virus viêm gan B ................................ 3 1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan B......................................................... 3 1.1.2. Tình hình bệnh viêm gan B trên thế giới và Việt Nam........................... 3 1.1.3. Virus HBV (Hepatitis B virus)................................................................ 5 1.2. Các kiểu gen của HBV và tình hình nghiên cứu về kiểu gen của HBV trong và ngoài nước......................................................................................... 13 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 17 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 17 2.1.1. Mẫu bệnh phẩm nghiên cứu .................................................................. 17 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ................................................................ 17 2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 20 2.3.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm .................................. 20 2.3.2. Phương pháp tách chiết HBV DNA ...................................................... 21 2.3.3. Định lượng DNA HBV bằng kỹ thuật real-time PCR .......................... 21
iv 2.3.4. Xác định kiểu gen HBV bằng kỹ thuật PCR lồng (Nested - PCR)....... 22 2.3.5. Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di .................................... 27 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 28 3.1. Kết quả tách chiết HBV-DNA tổng số..................................................... 28 3.2. Kết quả xác định kiểu gen (genotype) của virus viêm gan B bằng kỹ thuật PCR lồng (Nested – PCR) ...................................................................... 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 39
v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ATP Adenosin triphosphat Bp Base pair CS Cộng sự CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide ddNTP Dideoxy Nucleotide Triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate EDTA Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid HBV Hepatitis B virus HBcAg Hepatitis B Core Antigen HBeAg Hepatitis B Early Antigen HBsAg Hepatitis B Surface Antigen HCC Hepatocellular carcinoma IgM Immuno Globulin M Kb Kilobase KDa Kilodalton LiPA Line probe assay LMA Kết hợp kháng thể LTC Lympho T cytotoxic MHR Major Hydrophilic Region ORF Open - reading frame PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphism DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic Acid SDS Sodium Doecyl Sulphat
vi SGOT Serum Glutamo-oxalo transaminase SGPT Serum Glutamo-pyruvic transaminase SSR Simple Sequence Repeats TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tris Trioxymetylaminometan WHO World Health Organization
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sự phân bố kiểu gen HBV của một số tác giả trong nước và các nước trong khu vực ......................................................................... 13 Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm ........................... 17 Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ................................... 18 Bảng 2.3. Cặp mồi khuếch đại vùng gen S của HBV ..................................... 23 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR vòng ngoài .......................................... 24 Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vòng ngoài .............................. 24 Bảng 2.6. Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm 1) .................. 25 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR vòng trong nhóm I .............................. 25 Bảng 2.8. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm I) ............... 25 Bảng 2.9. Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm II) ................. 26 Bảng 2.10. Thành phần phản ứng PCR vòng trong (nhóm II)........................ 26 Bảng 2.11. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vòng trong (nhóm II) ............ 26 Bảng 3.1. Tỷ lệ kiểu gen của HBV trên một số bệnh nhân viêm gan B tại tỉnh Thái Nguyên ............................................................................ 36
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sự phân bố HBV trên thế giới .......................................................... 4 Hình 1.2: Hạt virus hoàn chỉnh ......................................................................... 6 Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi điện tử HBV .......................................................... 6 Hình 1.4: Cấu trúc bộ gen HBV tương ứng với các mRNA (A) và với các protein (B) ........................................................................................ 7 Hình 1.5: Gen S và P gối nhau trong cấu trúc genome của HBV .................... 8 Hình 1.6: Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) và hình ống (B) của HBV ...................... 9 Hình 1.7: Chu trình nhân lên của HBV trong tế bào gan ............................... 11 Hình 2.1: Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu ........... 20 Hình 2.2: Sơ đồ xác định kiểu gen của HBV bằng phản ứng nested-PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu (nt, nucleotide) ............................... 22 Hình 3.1: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) của một bệnh nhân nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real-time PCR ..... 29 Hình 3.2: Kết quả thông số của các phản ứng Realtime-PCR đã thực hiện ... 30 Hình 3.3: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của chứng dương và chứng âm .................................................................................... 31 Hình 3.4: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của một mẫu xét nghiệm dương tính .......................................................................... 32 Hình 3.5: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) của bệnh nhân Trần Văn H. nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real- time PCR ......................................................................................... 33 Hình 3.6: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) của bệnh nhân Tô Văn Kh. nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real- time PCR ......................................................................................... 33 Hình 3.7: Sản phẩm PCR vòng 2 với nhóm I (kiểu gen A, B, C) trên bản gel điện di ........................................................................................ 35
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay, tình trạng nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV) là vấn đề đang được quan tâm trên thế giới nói chung và Việt nam nói riêng. Virus viêm gan B là nguyên nhân chủ yếu gây xơ gan, ung thư gan [7], [8]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization - WHO), có khoảng hơn 2 tỷ người bị nhiễm virus viêm gan B; trong đó có 350 triệu người mang virus viêm gan B mạn tính. Những người mang virus viêm gan B mạn tính là nguồn lây nhiễm quan trọng trong cộng đồng và có nguy cơ cao mắc các bệnh về gan nguy hiểm liên quan đến nhiễm vi rút viêm gan B như bệnh viêm gan hoại tử (necroinflammatory) cấp hoặc mạn, xơ gan và đặc biệt là ung thư biểu mô tế bào gan (hepatocellular carcinoma: HCC), làm cho khoảng 5 trăm đến 2 triệu bệnh nhân tử vong mỗi năm [46], [47]. Tại Việt Nam có khoảng 15% - 20% người nhiễm HBV, trong đó có khoảng 80- 92% bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV [4]. Kiểu gen của HBV được phát hiện lần đầu tiên năm 1988 bởi Okamoto và cs dựa vào sự khác biệt trên 8% trình tự nucleotide trên toàn bộ bộ gen của HBV [37]. Ở các vùng địa lý khác nhau có sự phân bố khác nhau về kiểu gen của HBV [12], [13]. Để xác định genotype HBV có thể sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau như phân tích đa hình của các đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphism - RFLP) [6], phương pháp PCR đa mồi (multiplex - PCR) [9,28,30], phương pháp realtime - PCR [49], phương pháp oligonucleotide microarray [41]... Sự hiểu biết về sự phân bố giữa các kiểu gen của virus HBV có vai trò rất quan trọng trong công việc điều trị và theo dõi diễn tiến của bệnh, phòng ngừa được các biến chứng của bệnh. Đặc biệt điều này cũng rất có ý nghĩa trong công tác quản lý và giám sát về mặt dịch tễ học phục vụ cho công tác phòng chống bệnh viêm gan siêu vi B. Xuất phát từ
2 thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định kiểu gen của virus viêm gan B ở một số bệnh nhân nhiễm virus tại Thái Nguyên bằng phương pháp PCR lồng (Nested - PCR)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định kiểu gen của virus viêm gan B ở một số bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B tại Thái Nguyên. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Tách chiết HBV DNA tổng số từ mẫu huyết thanh của các bệnh nhân nhiễm HBV (có kết quả xét nghiệm HBsAg dương tính). Xác định hàm lượng HBV DNA trong mẫu bằng kỹ thuật Real-time PCR 3.2. Xác định kiểu gen của virus viêm gan B bằng kỹ thuật PCR lồng (Nested - PCR)
3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về bệnh viêm gan B và virus viêm gan B 1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan B Năm 1964 Baruch Blumberg đã mô tả một loại kháng nguyên (KN) đặc trưng ở thổ dân châu Đại Dương gọi là “KN Australia”. Đến năm 1968, phát hiện thấy trong máu bệnh nhân viêm gan B mãn tính có tiểu thể hình cầu và hình sợi, đường kính 27nm không chứa DNA. Đó chính là KN bề mặt HBsAg (hepatitis B surface antigen). Hai tiểu thể này không phải là HBV (Hepatitis B virus) hoàn chỉnh vì thiếu genome. Năm 1970, người ta phát hiện thấy trong máu bệnh nhân viêm gan B có các thể hình cầu, đường kính 42nm, bên trong chứa ADN kép gọi là tiểu thể Dane. Nghiên cứu sau này xác định chính tiểu thể Dane mới là HBV thực sự [13]. 1.1.2. Tình hình bệnh viêm gan B trên thế giới và Việt Nam 1.1.2.1. Trên thế giới Nhiễm virus viêm gan B là một vấn đề có tính chất toàn cầu bởi HBV xuất hiện ngay cả ở các quần thể dân chúng sống cách biệt và những người sống trên các hòn đảo. Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B và cách thức lây truyền có sự khác biệt rõ rệt giữa các vùng khác nhau trên thế giới. Trên cơ sở điều tra huyết thanh học các dấu ấn miễn dịch của virus viêm gan B đặc biệt là HBsAg, Tổ chức Y tế Thế giới chia mức độ nhiễm virus viêm gan B thành 3 mức độ khác nhau: cao, trung bình, thấp [45], [46], [47]. Vùng lưu hành dịch cao Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg  8% và tỷ lệ người đã nhiễm virus viêm gan  60%. Gần 45% dân số thế giới nằm trong vùng này bao gồm hầu hết các nước thuộc khu vực Châu Á (trừ Nhật Bản, Ấn Độ), Châu Phi, hầu hết các nước Trung Đông, vùng lưu vực sông Amazon (Nam Mỹ), hầu hết các đảo thuộc khu vực Thái Bình Dương, và một số dân tộc sống ở Bắc
4 cực như Eskimo, Maoris. Việt Nam là nước được xếp là vùng lưu hành dịch cao [20]. Hình 1.1: Sự phân bố HBV trên thế giới [50] Vùng lưu hành dịch trung bình Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg từ 2-7% và tỷ lệ người đã từng nhiễm virus viêm gan B từ 20-60%, 43% dân số thế giới nằm trong vùng này bao gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, Tây Á, Nhật Bản, Nga, Đông Âu, hầu hết các nước Nam và Trung Mỹ. Phương thức lây truyền rất đa dạng, xảy ra ở tất cả các lứa tuổi từ trẻ sơ sinh đến người lớn. Hay gặp những trường hợp nhiễm cấp virus viêm gan B do phần lớn nhiễm trùng xảy ra ở lứa tuổi thanh niên và người lớn [34], [45]. Vùng lưu hành thấp Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg  2% và tỷ lệ người đã từng nhiễm virus viêm gan B  20%. 12% dân số thế giới nằm trong vùng này bao gồm các nước như Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc, New Zealand, Bắc Mỹ, Nam Mỹ. Phương thức lây truyền chính là lây truyền ngang ở lứa tuổi trưởng thành, chủ yếu xảy ra ở các nhóm người có nguy cơ cao như tiêm chích ma
5 tuý, đồng tính luyến ái, nhân viên y tế, người được truyền máu hoặc lây nhiễm trong gia đình người nhiễm virus viêm gan B [16], [46]. 1.1.2.2. Tại Việt Nam Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng lưu hành viêm gan B cao. Tỷ lệ mang HBV trong cộng đồng dân cư là 15% - 25%. Hàng năm, có khoảng 20.000 người mắc viêm gan và tỷ lệ tử vong từ 0,7% - 0,8% [6]. Giai đoạn từ năm 1988 đến năm 1996, ở Việt Nam đã có hàng chục nghiên cứu về tỉ lệ mang HBsAg ở người bình thường. Mặc dù vậy nhưng các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở một vài nhóm đối tượng tại địa phương cụ thể, phân bố tại nhiều vùng trên cả nước. Theo nghiên cứu của Hoàng Thủy Nguyên, Phạm Song, giai đoạn 1990-1997, tỉ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng người Việt Nam: Cộng đồng người khỏe mạnh là 15% mang HBsAg và người bệnh có HBV là 45% (IgM anti-HBc) [8]. Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho kết quả tỉ lệ nhiễm HBsAg của các đối tượng nghiên cứu ở mức 2 con số. Theo nghiên cứu về tình hình viêm gan virus B ở Việt Nam (Chương trình Quốc gia - Mã số KY 01 - 09), tại Hà Nội, tỉ lệ mang HBV trong cộng đồng dân cư là 11,35 %. Tỉ lệ nhiễm HBV tại thành phố Hồ Chí Minh là 19,7% [6]. 1.1.3. Virus HBV (Hepatitis B virus) 1.1.3.1. Hình thái HBV HBV thuộc loại siêu vi trùng (virus): Nhóm VII (dsDNA-RT) Họ (familia): Hepadnaviridae. Chi (genus): Orthohepadnavirus. Loài (species): viêm gan B. Các nghiên cứu hiển vi điện tử đã xác định hình thái của HBV. Về cấu tạo, hạt virus HBV hoàn chỉnh (Virion) có hình cầu nhỏ, đường kính 22-45
6 nm, gồm 3 lớp: lớp bao ngoài dày khoảng 7 nm, lớp vỏ Capsit hình hộp, có đường kính khoảng 27 - 28 nm và lõi chứa bộ gen của virus. Trong huyết thanh bệnh nhân ở giai đoạn hoạt động nhân đôi virus, dưới kính hiển vi điện tử người ta thấy có 3 tiểu thể khác nhau của virus: Tiểu thể hình cầu nhỏ có đường kính 22 nm; Tiểu thể hình ống (hình que) có đường kính 20-22 nm, dài 40-400 nm; Tiểu thể hình cầu lớn có đường kính 42-45 nm còn gọi là tiểu thể Dane, đây chính là virus hoàn chỉnh [17]. Hình 1.2: Hạt virus hoàn chỉnh Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi điện tử (tiểu thể Dane) của HBV [17] HBV [17] 1.1.3.2. Cấu trúc HBV Cấu tạo của virus HBV cũng giống đại đa số các virus khác. Chúng có lớp vỏ ngoài bằng protein, có chứa trên bề mặt nhiều kháng nguyên HBs, và cấu trúc DNA bên trong. HBV là chủng virus duy nhất có cấu trúc DNA có khả năng lây truyền qua đường máu. Quá trình sao chép DNA là quá trình phiên mã ngược nhờ một RNA trung gian. Protein kháng nguyên được lắp ráp một cách đồng dạng DNA từng phần, trình tự protein tương đồng và phản ứng chéo về huyết thanh học [25], [26]. Bộ gen của HBV là một phân tử DNA mạch kép, dạng vòng không hoàn chỉnh, kích thước khoảng 3,2Kb, được cấu tạo bởi hai chuỗi đơn ngược dấu và có chiều dài không bằng nhau. Chuỗi dài (chuỗi âm) nằm ngoài tạo
7 nên một vòng tròn liên tục có chiều dài cố định là 3,2Kb mang toàn bộ thông tin di truyền của HBV. Chuỗi ngắn (chuỗi dương) nằm trong có kích thước thay đổi chỉ chiếm khoảng 50-80% chuỗi dài. Hình 1.4: Cấu trúc bộ gen HBV tương ứng với các mRNA (A) và với các protein (B) [37] Hệ gen của HBV có bốn khung đọc mở (open-reading frame) ORF gối lên nhau hoàn toàn hoặc không hoàn toàn nhằm giảm thiểu chiều dài của bộ gen, bao gồm: gen lõi C, gen bề mặt S, gen X, gen polymerase P. Các gen này mã hóa cho toàn bộ các protein của virus [44]. Sự bắt cặp bổ sung của các nucleotide trên vùng gối của hai sợi (âm và dương) được giới hạn bởi hai trình tự lặp trực tiếp DR1 và DR2 cho phép quá trình khép vòng của hệ gen xảy ra khi protein P (polymerase) liên kết đồng hóa trị với đầu 5’ của sợi âm (hình 1.4) [37]. Gen S là gen mã hóa cho các cấu trúc vỏ và bề mặtcủa HBV gồm 3 vùng: pre S1 (108 axít amin) và pre S2 (55 axít amin); hai vùng này mã hóa cho kháng nguyên bề mặt HBsAg, vùng S (226 axít amin) mã hóa các kiểu gen bề mặt HBsAg, vùng S (226 axít amin) mã hóa các kiểu gen.
8 Hình 1.5: Gen S và P gối nhau trong cấu trúc genome của HBV [37] Gen C mã hóa cho các cấu trúc lõi bao gồm hai vùng: pre C (29 axít amin) mã hóa cho HBeAg và vùng C (183 axít amin) mã hóa cho HBcAg. Gen P (832 axít amin) là gen dài nhất mã hóa cho DNA polymerase và cùng với RNA trung gian tham gia vào quá trình sao chép ngược của virus. Gen X gồm 154 axít amin mã hóa cho hai protein của HBV mà chức năng của chúng là tham gia vào các giai đoạn phiên mã và sao chép trong quá trình nhân đôi của HBV, cũng như đóng một vai trò chủ yếu trong sự phát triển thành ung thư gan trên bệnh nhân. Sự thay đổi trình tự của các nucleotide trên gen S dẫn đến sự thay đổi trong quá trình dịch mã và sao chép trong gen của HBV, dẫn đến có các sự khác biệt về cấu trúc tại vùng vỏ và bề mặt của HBV là nguyên nhân tạo thành 6 kiểu gen khác nhau của virus này [37].
9 1.1.3.3. Thành phần cấu trúc kháng nguyên HBV có ba loại kháng nguyên chính: kháng nguyên bề mặt là HBsAg, kháng nguyên lõi là HBcAg và HbeAg [15], [43]. HBsAg (Hepatitis B surface antigen) được tìm thấy ở huyết thanh và trong tế bào gan của người bị nhiễm HBV dưới dạng hoàn chỉnh hay không hoàn chỉnh. Kháng nguyên bề mặt này có hai dạng hình cầu và hình ống. Thành phần cấu tạo của hai dạng này gồm protein, lipid, carbonhydrat, nhưng không có acid nucleic nên được xem là dạng không hoàn chỉnh của HBV. HBsAg là chỉ điểm huyết thanh học thường được dùng để xác định nhiễm HBV [15], [43]. Hình 1.6: Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) và hình ống (B) của HBV [15] HBsAg xuất hiện rất sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng, tăng cao dần và biến mất sau 4-8 tuần kể từ khi có triệu chứng. Nếu sau 6 tháng mà vẫn còn HBsAg thì có nguy cơ chuyển thành người mang HBsAg mạn tính [15]. Sự hiện diện của HBsAg trong huyết thanh chứng tỏ có DNA của virus HBV trong tế bào gan. Định lượng HBsAg có giá trị tiên lượng, nếu trong giai đoạn bình phục hàm lượng HBsAg không nhỏ hơn ¼ so với trị số ban đầu thì có nguy cơ trở thành người mang virus mạn tính [12]. HBcAg (Hepatitis B core antigen) tìm thấy trong tế bào gan của người nhiễm HBV. Trong huyết thanh, HBcAg hiện diện như một thành phần của virus hoàn chỉnh chứ không ở dạng tự do [43].
10 1.1.3.4. Cơ chế nhân lên của HBV Quá trình sao chép của HBV có thể được chia làm nhiều bước: 1. Gắn kết virus vào tế bào ký chủ; 2. Xâm nhập của virus vào tế bào (sự nhập bào); 3. Phóng thích bộ gen virus; 4. Biểu hiện các sản phẩm gen virus; 5. Sao chép bộ gen virus; 6. Lắp ráp các hạt virion (virus hoàn chỉnh); 7. Phóng thích virus [2]. Sự gắn kết HBV vào tế bào chủ là một trong các bước then chốt, xác định tính hướng cơ quan của virus nhờ vào các điểm gắn virus và các thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào. Hạt HBV hoàn chỉnh lưu thông trong máu tìm cách gắn kết vào tế bào chủ. Nhiều bằng chứng cho thấy, một vùng protein bề mặt lớn (vùng PreS1) là nơi gắn kết thụ thể. Sự gắn kết cũng có thể qua trung gian albumin huyết thanh người đã biến đổi. Vì thế, HBV có thể dùng protein huyết thanh đã biến đổi như một phương tiện chuyên chở để vào tế bào gan [2]. Cơ chế HBV đi vào tế bào chủ chưa được hiểu biết rõ ràng: hoặc vỏ ngoài HBV có protein dung hợp, protein dung hợp này chèn một chuỗi mã kị nước vào hai lớp lipid của tế bào đích và gây dung hợp màng virus với màng tế bào, qua đó phóng thích nucleocapsit virus vào bào tương; hoặc virus nhập nội bào qua trung gian thụ thể [2]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, đường kính tối đa các lỗ nhân là 25nm quá nhỏ so với kích cỡ của các hạt lõi là 36nm. Tuy nhiên, hạt lõi có thể vận chuyển bộ gen virus đến phức hợp lỗ nhân nếu nó bị phosphoryl hóa. Vì kích cỡ của hạt lõi lớn nên sự phóng thích bộ gen sau đó phải xảy ra khi bộ gen của virus vào nhân, có thể qua trung gian của polymerase virus nối đồng hóa trị [3].