Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2024. ISBN: 978-604-82-8175-5
514
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM
Aspergillus oryzae CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO
TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN
Trần Thanh Thy1, Trần Thị Hoàng Đông2
1Trường Đại học Thủy lợi
2Trường Đại học Nông Lâm Huế, Đại học Huế
1. GIỚI THIỆU
Aspergillus oryzae được biết đến là loài
nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp các
enzyme amylase, protease, cellulase... có
hoạt tính cao trong môi trường bán rắn theo
phương pháp nuôi cấy bề mặt (Lương Đức
Phẩm, 1998; Manan và Webb, 2016). A.
oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản
xuất nước tương theo phương pháp vi sinh
vật (Nguyễn Thị Hiền, 2006). Hơn nữa, A.
oryzae có kiểu gen đặc trưng và được xem là
một sinh vật an toàn cho sản xuất thực phẩm
vì không sản sinh độc tố aflatoxin (Ogawa et
al, 1995). Protease ngoại bào có thể được sản
xuất theo phương pháp lên men chìm hoặc
lên men bán rắn. Phương pháp lên men bán
rắn đặc biệt thích hợp cho sự phát triển của
nấm vì chúng yêu cầu độ ẩm thấp hơn so với
vi khuẩn (Ogawa et al., 1995). Ngoài ra,
phương pháp lên men này tương đối đơn
giản, rẻ tiền và mang lại hiệu suất sinh tổng
hợp enzyme cao (Wang et al., 2005;
Thanapimmetha et al., 2012). Cơ chất dùng
trong phương pháp lên men này là các sản
phẩm nông nghiệp như gạo, cám, ngô mảnh,
bột mỳ hay các phế phụ phẩm (Nguyễn Đức
Lượng, 2010; Lương Đức Phẩm, 1998). Do
giá trị ứng dụng, giá trị kinh tế cao và tınh
khả thi của việc nuôi nấm A. oryzae ở quy
mô công nghiệp, việc phát triển các nghiên
cứu về nuôi A. oryzae trên môi trường rắn
nhằm tăng quy mô sản xuất, đáp ứng nhu cầu
của thị trường trong nước và chuyển giao
công nghệ cho các đơn vị sản xuất để đem lại
lợi ıch kinh tế cho địa phương là hết sức cần
thiết. Nghiên cứu này trình bày kết quả khảo
sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt độ
protease và mật độ tế bào trong quy trình sản
xuất chế phẩm A. oryzae trên môi trường bán
bán gồm tỷ lệ sinh khối nấm mốc bổ sung,
thời gian nuôi cấy và nhiệt độ sấy.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chủng A. oryzae được phân lập từ một số
mẫu vỏ củ, quả giàu pectin như dưa lưới,
chuối, xoài, táo và được nuôi trên môi trường
Czapek có bổ sung 15 % pectin. Sau khi chọn
lọc được chủng A. oryzae thuần được định
danh bằng phương pháp giải trình tự vùng
ITS đã khẳng định được loài Aspergillus
oryzae và được lưu trữ nguồn giống trong tủ
môi trường -80oC cho tới khi sử dụng
Ảnh hưởng của A. oryzae đến hoạt độ
protease và mật độ tế bào của chế phẩm A.
oryzae: Thí nghiệm (TN) được khảo sát gồm
4 nghiệm thức (NT) xác định mật độ bào tử
của A. oryzae và 20 lần lặp lại. Cố định môi
trường bán rắn là gạo ST25, nuôi nấm trong
điều kiện tối hoàn toàn và ẩm độ không khí
đạt 85%. Sau 3 ngày nuôi cấy nấm trên môi
trường tối ưu, thu chế phẩm sấy ở 40°C trong
6 giờ, làm nguội chế phẩm trong bình hút ẩm,
bao gói và bảo quản lạnh.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến
hoạt độ protease và mật độ tế bào của chế
Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2024. ISBN: 978-604-82-8175-5
515
phẩm A. oryzae: TN khảo sát gồm 5 NT thời
gian nuôi cấy nấm và 20 lần lặp lại.
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến
hoạt độ protease và mật độ tế bào của chế
phẩm A. oryzae: TN khảo sát gồm 5 NT nhiệt
độ sấy chế phẩm trong 6 giờ và 20 lần lặp lại.
Phương pháp phân tích: Xác định số bào
tử nấm sợi bằng buồng đếm hồng cầu. Xác
định hoạt độ protease bằng phương pháp
Anson (1938) và cải tiến.
Xử lý số liệu: Số liệu được tổng hợp bằng
phần mềm Microsoft Excel 2010 và xử lý
thống kê bằng phần mềm SPSS 21.0 qua
phân tích ANOVA và ý nghĩa được chấp
nhận ở p < 0,05.
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Ảnh hưởng của mật độ A. oryzae
đến hoạt độ protease và mật độ tế bào của
chế phẩm
Kết quả khảo sát cho thấy có sự khác nhau
về hoạt độ protease và mật độ tế bào ở những
mật độ A. oryzae nuôi cấy khác nhau. NT đối
chứng (ĐC) cho hoạt độ enzyme và mật độ tế
bào thấp nhất. Hoạt độ protease và mật độ tế
bào cao nhất ở NT 2 khác biệt ý nghĩa 1% so
với NT 1. Ở NT 2 và NT 3 thu được giá trị
hoạt độ protesae và mật độ tế bào không có
sự sai khác thống kê. Điều này cho thấy
không có sự cạnh tranh đáng kể khi tăng mật
độ nuôi cấy A. oryzae > 4 10
6 (Hình 1).
Theo Du et al. (2008), lên men dạng rắn sử
dụng A. oryzae và A. awamori trên môi
trường cám mỳ sẽ tạo ra dung dịch giàu
enzyme thủy phân tinh bột và protein tạo nên
dung dịch giàu amino acid và glucose.
Dorado et al. (2009) cho rằng việc bổ sung A.
oryzae vào môi trường rắn cám nghiền mịn
hoặc dạng mảnh sẽ tạo ra sản phẩm lên men
thức ăn chăn nuôi giàu cacbon và nitơ. Kết
quả nghiên cứu này phù hợp với Dorado et
al. (2009), nhóm tác giả này cho rằng việc
nuôi cấy hệ lên men rắn (SSF) của chủng A.
oryzae với mật độ 4 106 trên cám lúa mỳ sẽ
sản xuất các phức hợp giàu enzyme phân giải
tinh bột và protein.
Hình 1. Ảnh hưởng của mật độ A. oryzae
đến hoạt độ protease và mật độ tế bào
của chế phẩm
3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
đến khả năng sinh tổng hợp protease và
mật độ tế bào của chế phẩm A. oryzae
Hoạt độ protease và mật độ tế bào có sự
thay đổi có nghĩa theo thời gian. Hoạt độ
protease và mật độ tế bào có xu hướng tăng từ
24 giờ và đạt cực đại ở 48 giờ nuôi cấy. Sự
giảm hoạt độ enzyme và mật độ của chế phẩm
có thể là do càng về thời gian sau của quá
trình nuôi cấy, hàm lượng chất dinh dưỡng
trong môi trường giảm và sự gia tăng các sản
phẩm trao đổi chất của vi sinh vật gây bất hoạt
enzyme, do đó hoạt độ protease (Hình 2). Kết
quả nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với
Parathaman et al. (2009) khi nuôi cấy A. niger
để sản xuất protease từ dịch nước thải từ gạo
trên môi trường bán rắn, Lương Đức Phẩm
(1998) cũng cho rằng thời gian nuôi cấy
chủng A. awamori để thu nhận enzyme là
khoảng 48-72 giờ. Trong khi đó, Chutmanop
et al. (2008) nhận thấy hoạt độ protease đạt
cực đại sau 60 giờ khi nuôi cấy A. oryzae trên
môi trường cám gạo hoặc cám mỳ.
Hình 2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
A. oryzae đến hoạt độ protease và mật độ
tế bào của chế phẩm
Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2024. ISBN: 978-604-82-8175-5
516
Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy A. oryzae đến hoạt độ protease
và mật độ tế bào của chế phẩm
3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến chất
lượng của chế phẩm nấm mốc A. oryzae
Việc tăng nhiệt độ sấy từ 40°C đến 55°C
không có sự ảnh hưởng đáng kể đến sự biến
thiên độ ẩm của chế phẩm. Tuy nhiên, hoạt
độ protease và mật độ tế bào có xu hướng
giảm mạnh khi tiếp tục tăng nhiệt độ sấy từ
40oC đến 55°C. Do đó, chế độ sấy ở 40°C
trong 6 giờ sẽ đảm bảo độ ẩm và hoạt độ
protease và mật độ tế bào của chế phẩm A.
oryzae (Hình 3). Kết quả nghiên cứu này phù
hợp với yêu cầu về độ ẩm chế phẩm enzyme
thô sau quá trình sấy kết thúc là <10% của
Nguyễn Đức Lượng (2010) và cũng phù hợp
với chế độ sấy chế phẩm Koji tương của
Nguyễn Hiền Trang và Ctv., 2013. Do đó,
40°C là nhiệt độ thích hợp để sấy chế phẩm
A. oryzae.
4. KẾT LUẬN
Chế phẩm A. oryzae được sản xuất với các
điều kiện nuôi cấy tối ưu sau: sử dụng gạo
ST25, độ ẩm cơ chất sau khi hấp tiệt trùng ở
nhiệt độ 121oC trong 45 phút là 65%, nuôi cấy
0,4% mật độ 4 106 A. oryzae với thời gian
nuôi cấy 48 giờ trong điều kiện tối hoàn toàn
với ẩm độ không khí 85%. Sau khi nuôi cấy,
thu sinh khối sấy ở 40°C trong 6 giờ để giảm
độ ẩm của chế phẩm tối ưu cho quá trình bảo
quản và vẫn đảm bảo hoạt độ protease và mật
độ tế bào trong chế phẩm cao.
5. TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Anson M.L. (1938). The estimation of
pepsin, trypsin, papain and cathepsin with
hemoglobin, Journal of General Physiology,
22, pp. 79 - 89.
[2] Chutmanop J., Sinsupha C., Yusuf C.,
Penjit S. (2008). Protease production by
Aspergillus oryzae in soil-state fermentation
usinggagroindustrial substrates, Journal of
Chem. Techol. Biotechnol, 83, pp. 1012 - 1018.
[3] Dorado M. P., Lin S. K. L., Koutinas A., Du
C., Wang R., Web C. (2009). Cereal-based
biorefinery development: Utilisation of
wheat milling by-productsfor the production
of succinic acid, Journal of Biotechnology,
143, pp. 51-59.
[4] Ogawa A., Yasuhara A., Tanaka T.,
Sakiyama T. and Nakanishi K. (1995).
Production of neutral protease by membrane
- surface liquid culture of Aspergillus oryzae
IAM2704, J. Ferment. Bioeng, 80, pp. 35-40.
[5] Paranthaman R., Alagusundaram K. and
Indhumathi J. (2009). Production of Protease
from Rice Mill Wastes by Aspergillus niger
in Solid State Fermentation, World Journal
of Agricultural Sciences, 5(3), pp. 308-312.
[6] Lương Đức Phẩm (1998). Công nghệ vi
sinh vật, NXB Nông nghiệp - Hà Nội.
[7] Manan M. A. and Webb C. (2016). Multi-
enzymes Production Studies in Single Tray
Solid State Fermentation with Opened and
Closed System, Journal of Life Sciences,
10, pp. 342-356.