Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu vai trò của gen ABCC4 liên quan đến rối loạn tự kỷ bằng mô hình ruồi giấm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

--------------------------

z--

Trần Quốc Đạt

NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA GEN ABCC4

LIÊN QUAN ĐẾN RỐI LOẠN TỰ KỶ

BẰNG MÔ HÌNH RUỒI GIẤM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 12/2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Quốc Đạt

NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA GEN ABCC4

LIÊN QUAN ĐẾN RỐI LOẠN TỰ KỶ

BẰNG MÔ HÌNH RUỒI GIẤM

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Trọng Tuệ

PGS. TS. Võ Thị Thương Lan

HÀ NỘI - 12/2019

LỜI CẢM ƠN

Để thực hiện thành công luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.

Nguyễn Trọng Tuệ - Khoa Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội và PGS.TS.

Võ Thị Thương Lan – Khoa Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐHQGHN

– những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và

kinh nghiệm quý báu, cho tôi những hành trang để bước vào nghề, bước vào sự

nghiệp nghiên cứu khoa học của mình. Họ cũng là những người thầy, người cô

mang đến cho tôi tình yêu và niềm đam mê khoa học, luôn nhắc nhở, bảo ban và

động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS Matsamitsu Yamaguchi và

nhóm nghiên cứu ruồi giấm tại Khoa Sinh học Ứng dụng, Học viện Công nghệ

Kyoto– người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập và trao đổi ngắn hạn

tại Nhật Bản. Thầy cũng là người hỗ trợ tôi rất nhiều trong việc thu thập các dòng

ruồi giấm cần thiết cho nghiên cứu, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết

bị để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, lãnh đạo Trung tâm Nghiên

cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học

tập và nghiên cứu.

Trong thời gian thực hiện luận văn, tôi cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp

đỡ và động viên của các anh chị thuộc nhóm nghiên cứu ứng dụng mô hình ruồi

giấm và các bạn đồng nghiệp tại Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại

học Y Hà Nội.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè

đã luôn giúp đỡ, ủng hộ và động viên tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành luận

văn này.

Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019

Học viên

Trần Quốc Đạt

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Trần Quốc Đạt, học viên cao học khoá 26, chuyên ngành Sinh học thực

nghiệm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội,

xin cam đoan:

1. Đây là luận văn do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn

Trọng Tuệ và PGS.TS. Võ Thị Thương Lan

2. Công trình nghiên cứu này hoàn toàn mới không trùng lặp với bất kỳ công

trình nghiên cứu nào khác.

3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu chính xác, trung thực và khách

quan.

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019

Học viên

Trần Quốc Đạt

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

MỤC LỤC

Mở đầu ........................................................................................................................... 1

1.1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 Tổng quan về hội chứng rối loạn phổ tự kỷ ..................................................... 3 1.1.1. Chẩn đoán ...................................................................................................... 4 1.1.2. Nguyên nhân .................................................................................................. 4 1.1.3. Điều trị ........................................................................................................... 6 1.2. Tổng quan về ruồi giấm ................................................................................... 7 1.2.1. Chu kỳ vòng đời ............................................................................................ 8 1.2.2. Hệ gen của ruồi giấm ..................................................................................... 9 1.3. Ứng dụng mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu ............................................. 12 1.4. Hệ thống kiểm soát biểu hiện gen GAL4-UAS và ứng dụng trong nghiên cứu mô hình ruồi giấm ..................................................................................................... 16 1.4.1. Hệ thống GAL4/UAS .................................................................................. 16 1.4.2. Phương pháp knockdown một gen bằng kỹ thuật RNAi và biểu hiện gen knockdown bằng hệ thống GAL4/UAS ................................................................ 17 1.5. Họ gen ABC và gen ABCC4 ........................................................................... 18 1.5.1. Tổng quan về họ gen ABC ........................................................................... 18 1.5.2. Gen ABCC4 ................................................................................................. 19 1.6. Ứng dụng mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu rối loạn tự kỷ ...................... 20

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 22 2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 22 2.2. Nguyên vật liệu, hoá chất và thiết bị .............................................................. 22 2.2.1. Nguyên vật liệu và hoá chất ........................................................................ 22 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ...................................................................................... 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 24 2.3.1 Phương pháp lai tạo dòng ruồi giấm knockdown biểu hiện dABCC4 tại mô não của ruồi ........................................................................................................... 24 2.3.2. Phương pháp đánh giá biểu hiện của protein ABCC4 tại mô não ruồi giấm bằng kỹ thuật western blotting .............................................................................. 26 2.3.3. Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm bằng thí nghiệm leo trèo ........ 27 2.3.4. Phương pháp đánh giá khả năng tương tác xã hội ....................................... 28 2.3.5. Phương pháp đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm (activity assay) .......... 29 2.3.6. Phương pháp đánh giá tuổi thọ của ruồi giấm (viability assay) .................. 30 2.3.7. Xác định sự thay đổi trong cấu trúc mối nối thần kinh cơ bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang ............................................................................. 31 2.3.8. Phân tích kết quả ......................................................................................... 34

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................ 36 3.1. So sánh mức độ tương đồng giữa protein ABCC4 của người và ruồi giấm ...... 36

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

3.2. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein ABCC4 tại mô não ruồi giấm ....... 37 3.3. Kết quả đánh giá khả năng vận động và tương tác ở ruồi trưởng thành. ........... 40 3.4. Kết quả xác định nhịp sinh học của ruồi giấm ................................................... 43 3.5. Kết quả xác định sự thay đổi trong cấu trúc mối nối thần kinh cơ (neuromuscular junction-NMJ) ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang .............................................................................................................. 46 3.6. Kết quả đánh giá tuổi thọ của ruồi giấm ............................................................ 49

KẾT LUẬN .................................................................................................................. 51

Tài liệu tham khảo ..........................................................................................................

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Hoạt động lưu trữ và thao tác trên ruồi giấm trong thực nghiệm ...................... 8

Hình 2: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm.. ....................................................................... 9

Hình 3: Quy tắc kí hiệu kiểu gen của ruồi giấm và ứng dụng trong viết phép lai ....... 10

Hình 4. Chức năng của các cơ quan có sự tương đồng giữa người và ruồi giấm. ....... 11

Hình 5: Bảo tồn về mặt chức năng của các cơ quan trong hệ thần kinh (A) và hệ vận động (B) giữa người và ruồi giấm ................................................................... 12

Hình 6: Phương pháp chuyển gen vào ruồi giấm sử dụng vectơ P-element. ............... 13

Hình 7: Hoạt động của hệ thống GAL4/UAS. ............................................................. 17

Hình 8: Cơ chế RNA can thiệp (RNA interference – RNAi). ...................................... 18

Hình 9: Sơ đồ cấu trúc và các vùng chức năng của protein ABC. ............................... 19

Hình 10: Sơ đồ miêu tả quá trình lai tạo các dòng ruồi giấm thí nghiệm và cơ chế hoạt động của các thành phần trong con lai F1. ...................................................... 25

Hình 11: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng leo trèo ............................................ 27

Hình 12: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng tương tác xã hội của ruồi giấm ....... 29

Hình 13: Thiết kế thí nghiệm xác định nhịp sinh học của ruồi giấm.. ......................... 30

Hình 14: Cấu trúc thần kinh cơ (neuromuscular junction)ở ấu trùng ruồi giấm. ......... 32

Hình 15: Sơ đồ thiết kế các thí nghiệm trong nghiên cứu. ........................................... 35

Hình 16: Mức độ tương đồng giữa protein ABCC4 của người và ruồi giấm. ............. 36

Hình 17: Kết quả western blotting xác định mức độ biểu hiện của protein dABCC4 ở mô não của ruồi giấm ....................................................................................... 38

Hình 18: Thí nghiệm hành vi tương tác xã hội trên ruồi giấm trưởng thành. .............. 41

Hình 19: Kết quả thí nghiệm leo trèo xác định khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành ở thời điểm 3 ngày tuổi, 7 ngày tuổi và 14 ngày tuổi.. ............... 42

Hình 20: Kết quả xác định nhịp sinh học của ruồi giấm.. ............................................ 44

Hình 21: Kết quả phân tích nhịp thức-ngủ ở ruồi giấm ............................................... 45

Hình 22: Kết quả phân tích cấu trúc thần kinh cơ (neuromuscular junction-NMJ) của ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang ........................ 47

Hình 23: Kết quả xác định mật độ protein BRP tại vùng hoạt động trước synap ở ấu trùng ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang. .............. 48

Hình 24: Biểu đồ đánh giá tỷ lệ sống của ruồi giấm. ................................................... 50

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chú thích Tiếng Anh

Chú thích Tiếng Việt

Chữ viết tắt

ABCC4

Thành viên số 4 phân lớp C của protein bám ATP

ATP-binding cassette subfamily C member 4

Autism Spectrum Disorder Hội chứng rối loạn phổ tự kỷ ASD

Adenosine Triphosphat ATP

Brurchpilot BRP

dsRNA double stranded RiboNucleic Acid RNA mạch đôi

Enzyme củ cải ngựa

Disc-large DLG

Horseradish Peroxidase HRP

hemolymph-like 3 saline HL3

Trình tự lặp-đảo Inverted Repeat IR

kilo Dalton kDal

Nucleotide Binding Domain Vùng bám nucleotide NBD

Normal goat serum Huyết thanh dê NGS

Neuromuscular-junction Mối nối thần kinh cơ NMJ

Phosphat Buffer Saline PBS

Paraformandehide PFA

RNA induced silencing complex Phức hệ gây bất hoạt RNA RISC

RNA interference RNA can thiệp RNAi

RT-PCR Reverse transcription – Polymerase Chain Reaction Phản ứng PCR sử dụng enzyme phiên mã ngược

Transmembrane Domain Vùng xuyên màng TMD

Upstream Activation Sequence Trình tự hoạt hóa thượng nguồn UAS

Subsynap Reticulum Vùng dưới synap

MSSR

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Mở đầu

Theo tiêu chuẩn DSM-IV (The Diagnostic and Statistical Manual of Mental

Disorders – 5th Edition), tự kỷ là tình trạng rối loạn hành vi nghiêm trọng, nằm trong

nhóm các rối loạn phát triển lan tỏa (pervasive developmental disoders). Gần đây, rối

loạn phổ tự kỷ và tự kỷ là tên gọi chung cho toàn bộ các thể bệnh này. Bệnh đặc trưng

bởi tình trạng rối loạn thần kinh phức tạp bao gồm những khiếm khuyết trong tương

tác xã hội, phát triển ngôn ngữ và kỹ năng giao tiếp kết hợp với hành vi cứng nhắc, lặp

đi lặp lại. Do mang đồng thời nhiều triệu chứng nên còn được gọi là rối loạn phổ tự kỷ

(autism spectrum disorder - ASD). Bệnh được phân loại gồm: rối loạn tự kỷ, rối loạn

Asperger, rối loạn Rett, rối loạn phân rã tuổi thơ và rối loạn phát triển lan tỏa không

đặc hiệu khác. Việc nghiên cứu căn bệnh này ở mức độ phân tử và tế bào cũng trở nên

khó khăn đối với các nhà khoa học bởi tính phức tạp và trở ngại trong việc lựa chọn,

xây dựng mô hình thực nghiệm. Hầu hết các nghiên cứu cơ bản đều dừng lại ở mức độ

in vitro, tập trung vào việc phát hiện đột biến gen được cho là liên quan đến bệnh mà

chưa đi sâu vào nghiên cứu ở mức độ in vivo.

Mô hình ruồi giấm chuyển gen mang lại những giá trị to lớn trong nghiên cứu

bệnh học phân tử với rất nhiều ưu điểm như: vòng đời ngắn, sinh trưởng nhanh, bản đồ

hệ gen đã giải mã chi tiết, có khoảng 70% gen gây bệnh tương đồng với người, ít hạn

chế pháp lý đối với các thử nghiệm, dễ tạo dòng, dễ chuyển gen và biểu hiện protein

ngoại lai. Cấu trúc và chức năng của hệ cơ, hệ thần kinh, hệ tiêu hoá…được bảo tồn

giữa ruồi giấm và người, do đó ruồi giấm biến đổi gen thực sự là mô hình lý tưởng để

nghiên cứu các bệnh lý ở người đặc biệt là các bệnh lý thần kinh.

Trên thế giới, đã có nghiên cứu sử dụng mô hình ruồi giấm để xác định mối liên

quan giữa đột biến một số gen với bệnh tự kỷ bằng việc giảm biểu hiện của các gen

này (knockdown) tại hệ thần kinh, đồng thời phân tích ảnh hưởng của gen liên quan

đến các biểu hiện hành vi, khả năng vận động, khả năng sống sót, các thay đổi về nhịp

sinh học và biến đổi trong cấu trúc thần kinh NMJ ruồi giấm. Một nghiên cứu gần đây

khi knockdown gen ABCA13 (ATP-binding cassette subfamily A member 13) – một

gen thuộc họ ABC có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển lipid, ion, vitamin, các

chất hữu cơ và một số phân tử thuốc qua màng tế bào đã cho thấy sự giảm tương tác rõ

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

rệt giữa các cá thể trong quần thể ruồi giấm. Ruồi bị rối loạn giấc ngủ và cấu trúc thần

kinh cơ bị biến đổi. Kiểu hình ghi nhận được trên mô hình này tương tự như triệu

chứng rối loạn tự kỷ ở người. Bên cạnh đó, đột biến gen ABCA13 cũng đã được chứng

minh là có liên quan đến rối loạn tự kỷ trên mô hình khỉ thực nghiệm. Như vậy, họ

gene ABC đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năng

của hệ thần kinh ở động vật. Để tiếp nối hướng nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu của

chúng tôi đã lựa chọn nhắm vào gen đích ABCC4, một gen cũng nằm trong họ gen

ABC tuy nhiên chức năng của nó liên quan đến hệ thần kinh và ảnh hưởng đến rối loạn

tự kỷ lại chưa được biết đến và cũng chưa có một nghiên cứu nào trên mô hình động

vật xác định được vai trò sinh bệnh học của gen này. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến

hành đề tài ‘Nghiên cứu vai trò của gen ABCC4 liên quan đến rối loạn tự kỷ bằng

mô hình ruồi giấm’ với hai mục tiêu chính: (1) knockdown gen ABCC4 trên mô hình

ruồi giấm và (2) phân tích các biểu hiện hành vi và cấu trúc mối nối thần kinh cơ NMJ

trên ruồi knockdown ABCC4 trong mối liên quan đến bệnh tự kỷ.

Đây là hướng tiếp cận hoàn toàn mới, sẽ góp phần làm sáng tỏ vai trò không chỉ

của gen ABCC4 mà còn cho thấy chức năng mới của họ gen ABC trong cơ chế phân tử

của bệnh, đồng thời cung cấp một mô hình tiềm năng và kinh tế cho những nghiên cứu

thử nghiệm và sàng lọc thuốc.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 . Tổng quan về hội chứng rối loạn phổ tự kỷ

Rối loạn phổ tự kỷ (Autism Spectrum Disoders – ASD) là một bệnh lý rối loạn

về phát triển thần kinh phức tạp ở trẻ em được giả thuyết do sự phơi nhiễm với các

chất độc hoặc do thay đổi về những yếu tố di truyền [5]. Bệnh được phân loại bao

gồm: rối loạn Rett, rối loạn phân rã tuổi thơ, rối loạn Asperger, rối loạn phát triển lan

toả không đặc hiệu và hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy… [72]. Những rối loạn về

hành vi thường phát triển trong những năm đầu tiên của cuộc đời. Đây là căn bệnh

đang có xu hướng phát triển với một tốc độ đáng báo động không chỉ ở Việt Nam mà

còn trên toàn thế giới. Theo số liệu thống kê năm 2012, thế giới có khoảng 62/10 000

người bị mắc hội chứng rối loạn tự kỷ. Trước đó, nhiều nghiên cứu khảo sát toàn diện

về tỷ lệ mắc bệnh từ khu vực Tây Thái Bình Dương đến Nhật Bản và Trung Quốc.

Năm 2000, tỷ lệ mắc tự kỷ dao động từ 2,8/10000 đến 94/10000 với giá trị trung bình

là 11,6 /10 000. Chỉ có một nghiên cứu về hội chứng này ở khu vực Đông Nam Á,

được thực hiện ở Indonesia vào năm 1992; ước tính tỷ lệ mắc tự kỷ là 11,7/10 000

[23]. Công bố năm 2014 của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Hoa kỳ- CDC khi điều tra

trên 11 bang của Mỹ cho thấy trung bình cứ 59 trẻ ở độ tuổi 8 tuổi thì có 1 trẻ bị hội

chứng tự kỷ. Tỷ lệ này có thể khác nhau giữa các bang (khoảng từ 13.1 đến 29.3 trên

1.000 trẻ em 8 tuổi) và thay đổi theo giới tính và chủng tộc/sắc tộc. Bé trai có nguy cơ

mắc tự kỷ cao gấp từ 4 -5 lần so với bé gái [72].

Tại Việt Nam, số trẻ được chẩn đoán tự kỷ ngày càng tăng lên. Cụ thể, tại

Bệnh viện Nhi Trung ương, số trẻ được chẩn đoán tự kỷ trong năm 2008 là 450 trẻ,

năm 2009 là 963 trẻ, con số này vào năm 2010 lên tới 1792 trẻ [2]. Nghiên cứu của

Hoàng Văn Minh và cs năm 2019 về tỷ lệ mắc tự kỷ ở nhóm trẻ 18-30 tháng tuổi ở

Miền Bắc Việt Nam là 75,2/10 000 trẻ, cao hơn so với thống kê giai đoạn 2013-2014.

Cũng trong nghiên cứu này, tác giả còn chỉ ra tỷ lệ mắc rối loạn tự kỷ cao hơn ở những

trẻ em sống trong môi trường đô thị. Mức độ đô thị hoá ngày càng tăng dẫn đến trẻ có

nguy cơ mắc bệnh cao hơn [29].

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

1.1.1. Chẩn đoán

Về mặt chẩn đoán, trong khoảng thời gian dài tranh luận và sửa đổi, các nhà

tâm thần học đã đi đến thống nhất và mô tả hoàn chỉnh các tiêu chí trong hai bảng

phân loại bệnh quốc tế là “The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders

– 5th Edition” (DSM-V) và “Autism Spectrum Diagnostic Observation Schedule”

(ASD-OC) [27], [31]. Trẻ mắc hội chứng này thường biểu hiện sự thiếu hụt và bất

thường ở ba yếu tố chẩn đoán cốt lõi là tương tác xã hội, khả năng giao tiếp và hành

vi có tính lặp lại. Trong đó, tiêu chuẩn chẩn đoán bao gồm việc xuất hiện ít nhất ba

dấu hiệu của sự giảm giao tiếp xã hội hoặc hai dấu hiệu của việc lặp đi lặp lại các hành

vi và có phản ứng quá mức, hoặc dưới mức với các tác động từ môi trường [27]. Một

số biểu hiện khác như động kinh, tăng động giảm chú ý, lo âu, trầm cảm cũng được sử

dụng làm tiêu chuẩn chẩn đoán. Dấu hiệu của sự giảm tương tác xã hội và khả năng

giao tiếp bao gồm sự suy giảm rõ rệt các hành vi phi ngôn ngữ như ánh mắt, biểu cảm

khuôn mặt hay ngôn ngữ cơ thể. Các hành vi của trẻ có tính lặp đi lặp lại và dập

khuôn. Trẻ không có hứng thú với việc giao tiếp và hoạt động xã hội. Những biểu hiện

này thường đi kèm với rối loạn giấc ngủ và thay đổi nhịp sinh học [59]. Đây cũng là

một trong những tiêu chí quan trọng để chẩn đoán hội chứng rối loạn tự kỷ.

1.1.2. Nguyên nhân

Ngày nay, có nhiều giả thuyết khác nhau về nguyên nhân gây ra hội chứng rối

loạn tự kỷ như: cấu tạo não bất thường, thiếu cân bằng về kích thích tố, dị ứng, di

truyền, nhiễm độc thuỷ ngân, căn nguyên tâm lý hoặc tổn thương trong khi sinh …

Tuy nhiên, các nhà khoa học hiện đang quan tâm đến yếu tố về gen và di truyền. Yếu

tố này chiếm khoảng 10-20% số ca bệnh và đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh

học của rối loạn tự kỷ với nhiều hướng tiếp cận khác nhau như xác định số bản copy

của biến thể di truyền, xác định đột biến đơn gen, phân tích đa hình thái đơn nucleotid

và mối liên quan của gen trong toàn bộ genome [8].

Kết quả của nghiên cứu giải trình tự toàn bộ genome (whole-genome

sequencing) và phân tích toàn bộ vùng mã hoá (whole-exome) đã xác định được nhiều

gen có liên quan đến hội chứng rối loạn tự kỷ [34], [54], [66], [82]. Những gen này có

chức năng và vai trò quan trọng trong nhiều quá trình như: phiên mã và tái cấu trúc sợi

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

nhiễm sắc, tổng hợp và phân giải protein, cấu tạo và nâng đỡ bộ khung xương tế bào,

và hình thành các synap thần kinh [78]. Bên cạnh đó, còn có các gen mã hoá cho

protein tham gia vào quá trình tổng hợp và phân giải protein như mTOR, UBE3A,

PAM. Việc thay đổi trong cách sắp xếp của các protein cấu tạo nên khung xương tế

bào cũng là một trong những nguyên nhân được nhắc đến trong cơ chế sinh bệnh học

của hội chứng này. Quá trình định vị các protein ở đúng vị trí của nó có vai trò trong

việc tạo liên kết và sự kết dính giữa các tế bào, thụ thể trên bề mặt tế bào và là kênh

dẫn truyền tín hiệu giữa các synap thần kinh. Các gen liên quan đến quá trình này bao

gồm SHANK, NBEA, ANK3 [10], [53], [85].

Biến đổi di truyền ngoại gen cũng được đề cập đến là một trong những yếu tố

có liên quan đến hội chứng rối loạn tự kỷ [24], [67]. Những thay đổi này ảnh hưởng

đến quá trình và mức độ biểu hiện gen, thay vì ảnh hưởng trực tiếp lên chính trình tự

DNA. Trong đó, methyl hoá DNA là một ví dụ điển hình nhất trong việc tái cấu trúc

sợi nhiễm sắc và bất hoạt quá trình phiên mã. Một số biến đổi được chứng minh gần

đây nhất như sự methyl hoá dưới mức của gen PRRT1, hay sự methyl hoá quá mức của

gen FAM181A, CHFR. Đột biến trên gen POGZ – mã hoá cho protein tham gia quy

định cấu trúc dị nhiễm sắc, hay đột biến gen mã hoá cho protein H3K9 tham gia vào

quá trình methyl hoá histon H3 đã được xác định là có liên quan đến rối loạn tự kỷ

[10], [25], [40]. Yếu tố môi trường cũng được xem là tác nhân thúc đẩy sự biểu hiện

của biến đổi di truyền ngoại gen, gây nên hội chứng rối loạn tự kỷ tạm thời [74].

Ở mức độ di truyền học, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ở các cặp sinh đôi

cùng trứng, nếu một trong hai trẻ mắc tự kỷ thì nguy cơ mắc bệnh ở trẻ còn lại là 36%-

95%. Tỷ lệ này ở các cặp trẻ không sinh đôi cùng trứng chỉ là 0-30% [28]. Anh chị em

ruột của những trẻ tự kỷ cũng có 2-8% nguy cơ mắc bệnh, con số này tăng lên 12%-

20% nếu những đứa trẻ đó có dấu hiệu của hai trong ba yếu tố chẩn đoán cốt lõi. Bệnh

có xu hướng biểu hiện rõ nét hơn ở những bệnh nhân có bất thường mức độ nhiễm sắc

thể. Khoảng 10% trẻ mắc hội chứng rối loạn tự kỷ có kèm theo hội chứng Down hoặc

hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy [21].

Cha mẹ có tiền sử rối loạn tâm thần, tâm thần phân liệt hoặc rối loạn cảm xúc

cũng có nguy cơ sinh con mắc bệnh [36]. Ngoài ra, tuổi của cha mẹ cũng có thể trở

thành yếu tố nguy cơ. Trẻ được sinh ra từ cha mẹ lớn tuổi có nguy cơ mắc bệnh cao

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

hơn [22]. Trẻ sinh thiếu tháng (dưới 33 tuần tuổi) hoặc thiếu cân (dưới 2,5kg) cũng có

nguy cơ mắc bệnh cao gấp hai lần trẻ bình thường. Những thai nhi bị phơi nhiễm với

thuốc trừ sâu như chlorpyrifos có liên quan đến sự giảm trọng lượng và chiều dài cơ

thể đồng thời có nguy cơ chậm phát triển tâm lý và mắc hội chứng rối loạn tự kỷ cao

hơn [41], [61]. Nhiều nghiên cứu dịch tễ học gần đây cũng chỉ ra rằng, phụ nữ mang

thai (đặc biệt trong tuần đầu hoặc tuần thứ 2 của thai kỳ) bị nhiễm virus hoặc vi khuẩn

sẽ thúc đẩy việc kích hoạt hệ miễn dịch và có nguy cơ sinh con mắc các bệnh lý rối

loạn phát triển thần kinh cao hơn 13% so với trường hợp không bị nhiễm [55]. Quá

trình kích hoạt hệ miễn dịch này ở thai phụ có liên quan đến sự tăng tiết cytokines tại

các vị trí viêm thần kinh và xuất hiện những bất thường trong biểu hiện protein ở vùng

synap. Điều này là cơ sở của sinh bệnh học rối loạn tự kỷ.

1.1.3. Điều trị

Hiện nay, việc điều trị rối loạn tử kỷ bao gồm 2 hướng: dùng thuốc và không

dùng thuốc. Các phương pháp điều trị bằng thuốc chủ yếu sử dụng các nhóm thuốc có

tác dụng kích thích thần kinh, chống loạn thần không điển hình, thuốc chống trầm

cảm, thuốc đối kháng thụ thể alpha-adregenic và N-methyl-D-aspartate (NMDA),

thuốc ức chế cholinesterase, thuốc chống động kinh [4]. Các loại thuốc này nằm trong

nhóm được sử dụng phổ biến để điều trị các bệnh lý thần kinh. Tuy nhiên, tính an toàn,

hiệu quả và khả năng dung nạp của chúng đối với trẻ tự kỷ cần được kiểm chứng thêm

bằng các nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng, chưa kể tới việc những thuốc này chỉ có

khả năng cải thiện một số triệu chứng cơ bản.

Với hướng điều trị không sử dụng thuốc bao gồm các phương pháp điều trị bổ

trợ và điều trị thay thế [12]. Phương pháp này dựa trên cơ sở phối hợp các giác quan,

yoga, châm cứu và sử dụng phương pháp trị liệu bằng âm nhạc, trị liệu hành vi. Bên

cạnh đó, việc bổ sung các hormone như oxytocine, vasopressin hay omega-3, vitamin

và các dược chất có nguồn gốc thiên nhiên, hay việc bổ sung dinh dưỡng vào chế độ

ăn uống cũng là một trong những cách thức hỗ trợ điều trị bệnh [12], [46].

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về rối loạn tự kỷ chủ yếu tập trung vào dịch tễ

học, xã hội học và tâm lý học, chú trọng vào phương pháp giúp trẻ tự kỷ hoà nhập

cộng đồng, phục hồi chức năng và giảm thiểu các tổn thương não [1], [3]. Trong khi

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

đó, các nghiên cứu về cơ chế phân tử, sinh bệnh học còn rất hạn chế. Đặc biệt, chưa có

nghiên cứu nào xây dựng được mô hình động vật thực nghiệm cho bệnh tự kỷ, phục vụ

nghiên cứu ở mức độ in-vivo.

1.2. Tổng quan về ruồi giấm

Ruồi giấm (tên khoa học là Drosophila melanogaster) là sinh vật được sử dụng

trong lĩnh vực di truyền học với lịch sử nghiên cứu hơn 100 năm. Nó được nhà di

truyền học người Mỹ T.H. Morgan sử dụng trong nghiên cứu của mình từ những năm

đầu thế kỷ XX. Ngày nay, ruồi giấm là loài được sử dụng phổ biến trong các phòng thí

nghiệm di truyền. Nó được coi là sinh vật mô hình có khả năng ứng dụng rộng rãi nhất

trong việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh ở mức độ phân tử, hay các vấn đề của sinh học cơ

bản từ sinh lý cho đến thần kinh, chuyển hoá. Ruồi giấm được coi là mô hình tuyệt vời

để thiết lập trong phòng thí nghiệm với các đặc tính và ưu điểm sau:

Hệ gen đơn giản và đã được lập bản đồ chi tiết, dễ dàng so sánh, tra cứu các gen

có chức năng tương đồng với người

Có khoảng 70% gen gây bệnh tương đồng với người

Ít hạn chế về mặt pháp lý và vấn đề đạo đức với các thử nghiệm

Dễ tạo dòng, chuyển gen, biểu hiện protein ngoại lai

Có vòng đời ngắn (khoảng 30 ngày) (Hình 2), đây là lợi thế cho các nghiên cứu

giải mã quy trình sinh học phức tạp như lão hoá, bệnh liên quan đến các thế hệ,

phả hệ

Ruồi giấm chỉ có 4 cặp nhiễm sắc thể, do vậy việc thao tác, phân tích, sàng lọc

di truyền trở nên dễ dàng

Tuy chúng có một cơ thể nhỏ bé nhưng cấu trúc cơ thể lại hoàn chỉnh, tạo lợi

thế trong nghiên cứu về chuyển hoá và dinh dưỡng

Hiểu rõ được quá trình phát triển từ phôi đến ấu trùng. Do đó có lợi thế trong

nghiên cứu tế bào gốc và ung thư

Chi phí thấp, dễ nuôi trong phòng thí nghiệm dễ tạo ra quần thể lớn, có tiềm

năng trong sàng lọc dược chất và thuốc.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Hình 1. Hoạt động lưu trữ và thao tác trên ruồi giấm trong thực nghiệm [60].

(A)Tủ lưu giữ, (B) Ống nghiệm nuôi ruồi, (C) Chọn cá thể, (D, E) Dùng CO2 làm ruồi ngủ.

Hiện nay trên thế giới có nhiều trung tâm bảo tồn các dòng ruồi biến đổi gen

dành cho nghiên cứu, trong đó phải kể đến các trung tâm lớn nhất bao gồm trung tâm

Bloomington, Indiana, Mỹ; DGRC của Học viện Kỹ thuật Kyoto, Nhật Bản; NIG-FLY

thuộc viện di truyền quốc gia Nhật Bản; DSSC ở đại học California, Hoa Kỳ; VDRC

của Viena, Australia; TRiP thuộc trường Y của Đại học Harvad, Hoa Kỳ….Tại các

trung tâm này, rất nhiều các dòng ruồi đã được biến đổi gen, chúng được tạo mã và

kèm theo là các thông số biến đổi di truyền. Các phòng thí nghiệm có thể nhận được

dòng ruồi biến đổi gen mà họ quan tâm từ các trung tâm này với kinh phí rất nhỏ.

Ngược lại, bất kỳ các nghiên cứu nào tạo ra các nguồn gen mới đều có thể gửi tới các

trung tâm này để duy trì và cung cấp cho các nhà nghiên cứu khác trên thế giới. Các

trung tâm này là nơi cung cấp nguồn ruồi chuyển gen và cũng là nơi trao đổi với các

nhà khoa học để tạo thêm nhiều dòng ruồi nghiên cứu khác nhau. Nếu ở người, toàn bộ

thông tin chi tiết về hệ gen đều có thể tìm thấy ở cơ sở dữ liệu thuộc Trung tâm thông

tin Công nghệ sinh học Quốc Gia Hoa Kỳ NCBI [86] thì đối với ruồi giấm cũng có

một cơ sở dữ liệu Flybase phục vụ việc tra cứu thông tin di truyền [87]. Điều này giúp

các nhà nghiên cứu dễ dàng trao đổi, tìm hiểu thông tin và theo đuổi các nghiên cứu

dựa trên cơ sở dữ liệu khoa học đã công bố.

1.2.1. Chu kỳ vòng đời

Chu kỳ phát triển của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: Trứng, ấu trùng, nhộng và

ruồi trưởng thành. Ruồi cái dài khoảng 3mm và đẻ khoảng 750- 1500 trứng trong suốt

vòng đời. Trứng sau khi được thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 24 giờ. Các

phôi sẽ trải qua liên tiếp các thay đổi để trở thành ấu trùng bậc một, bậc hai và bậc ba

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

(tương ứng với một, hai và ba ngày tuổi). Giai đoạn ấu trùng được đặc trưng bởi sự

tiêu thụ thức ăn trong khoảng 5 ngày trước khi phát triển thành nhộng. Sau khoảng 4

ngày nhộng sẽ lột xác phát triển thành ruồi trưởng thành. Do vậy, chỉ mất khoảng 10

ngày để thu được ruồi trưởng thành từ phôi ở nhiệt độ 25 ℃ [57]. Tuổi thọ trung bình

Thụ tinh

Phôi

Ruồi giấm trưởng thành

Nhộng

1 ngày

3,5-4,5 ngày ở giai đoạn nhộng

Ấu trùng ngày 1

2,5-3 ngày

Vòng đời của ruồi giấm

1 ngày

Ấu trùng ngày 3

Ấu trùng ngày 2

của ruồi giấm khi nuôi ở điều kiện nhiệt độ 29 ℃ là khoảng 30-40 ngày.

Hình 2: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm. Trứng sau thụ tinh sẽ trải qua các giai đoạn ấu trùng ngày 1, ngày 2 và ngày 3, sau đó phát triển thành giai đoạn nhộng sau khoảng 2,5 đến 3 ngày rồi nở thành ruồi trưởng thành sau khoảng 3,5 đến 4,5 ngày. Ruồi trưởng thành có thời gian sống khoảng 50-60 ngày [57].

1.2.2. Hệ gen của ruồi giấm

Hệ gen ruồi giấm chứa khoảng 132 triệu cặp base gồm 15500 gen nằm trên

4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể

giới tính (XX, XY) [57]. Do cặp nhiễm sắc thể thứ 4 rất nhỏ và chứa ít gen nên

thường được bỏ qua, và chỉ tập trung vào ba cặp nhiễm sắc thể còn lại. Theo đó,

quy cách viết kiểu gen của ruồi giấm cũng sẽ chỉ biểu thị ba cặp nhiễm sắc thể theo

thứ tự: nhiễm sắc thể giới tính; nhiễm sắc thể số 2; nhiễm sắc thể số 3. Các nhiễm

sắc thể ngăn cách nhau bởi dấu “;”. Các allen tương đồng được phân cách bằng một

&’

(

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

(

NST số 1

NST số 2

. ; ; đường gạch ngang. Ví dụ như: ruồi đực mang gen vestigial ở dạng dị hợp tử biểu hiện kiểu hình cánh ngắn sẽ có kiểu gen # $

Hình 3 : Quy tắc kí hiệu kiểu gen của ruồi giấm và ứng dụng trong viết phép lai di truyền. P: thế hệ bố mẹ; F1: thế hệ con lai; w: gen white quy định kiểu hình mắt trắng; vg: gen vestigial quy định kiểu hình cánh ngắn; B: gen Bar quy định giảm kích thước mắt; “+”: gen kiểu dại (wildtype) [62].

Bằng cách so sánh hệ gen của người và ruồi giấm, các nhà nghiên cứu có thể

hiểu rõ hơn về cấu trúc, chức năng các gen trên người. Ngoài ra, việc so sánh cũng

cung cấp bằng chứng cho nghiên cứu di truyền tiến hóa giữa các sinh vật.

Với việc hiểu rõ về cấu trúc bộ gen, các thao tác di truyền cũng dễ dàng được thực

hiện như:

- Đưa một gen gây bệnh vào bộ gen của ruồi giấm, biểu hiện và nghiên cứu chức

năng của nó

- Loại bỏ một gen ra khỏi bộ gen của ruồi, từ đó xem xét vai trò của gen này như

thế nào, gây bệnh gì, ảnh hưởng đến sự phát triển ra sao

- Hoặc đồng thời bất hoạt 1 gen và biểu hiện một gen khác có chức năng thay

thế nhằm chứng minh vai trò và chức năng của các gen đó

- Dễ dàng gây đột biến….

- Đa phần các dòng ruồi chuyển gen đều có thể lưu trữ trong ống nghiệm cho các

mục đích ứng dụng lâu dài.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Tuy ruồi giấm chỉ là một côn trùng nhỏ, nhưng có tổ chức đa bào hoàn chỉnh về

mặt cấu trúc, và có sự tương đồng cao về mặt chức năng khi so sánh với các hệ cơ

quan của người như hệ thần kinh, hệ vận động (Hình 5). Sự tương đồng thể hiện ở

hình thái, cấu trúc cơ thể (Hình 4). Cơ thể của con người và ruồi được chia thành các

phân đoạn. Khi quan sát từ bên ngoài, sự phân chia này có thể không rõ ràng. Tuy

nhiên, khi quan sát cách sắp xếp các phân đoạn dây thần kinh xuất phát từ tuỷ sống

của con người (một cặp trên mỗi phân đoạn) hoặc xem các đốt sống trong xương sống

của người như một phân đoạn, có thể thấy sự phân chia rõ ràng trong từng phần của cơ

thể. Các phân đoạn này được tổ chức thành các đơn vị cấu trúc lớn hơn. Ở người và

ruồi, có thể phân biệt được đầu, ngực và bụng. Mặc dù phần phụ của hai loài khác

nhau (2 cánh tay và 2 chân so với 6 chân và 2 cánh) nhưng chúng có chung nguyên tắc

là nằm ở những vị trí nhất định và gắn với các phân đoạn cơ thể cụ thể. Xét riêng trên

hệ thần kinh, ở người và ruồi đều tồn tại hệ thống thần kinh trung ương (central

nervous system) ở phần đầu và thần kinh tuỷ sống ở phần thân. Cùng là đơn vị chức

năng nhỏ nhất, các tế bào thần kinh có chung hệ thống gen/protein chức năng và cấu

trúc bởi các synap. Cả hai loài đều có sự phân chia các vùng chức năng ở não tương tự

nhau như vùng thị giác, vùng khứu giác, vùng tiếp nhận-xử lý-lưu trữ thông tin và

vùng vận động [60].

Hình 4. Chức năng của các cơ quan có sự tương đồng giữa người và ruồi giấm. Sự tương đồng thể hiện ở cách sắp xếp từng phần của cơ thể, cách phân chia hệ thống thần kinh, chức năng từng cơ quan trong hệ vận động [60].

não

Tuỷ sống

Thần kinh lưng

Thần kinh phân nhánh

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Hình 5: Bảo tồn về mặt chức năng của các cơ quan trong hệ thần kinh (A) và hệ vận động (B) giữa người và ruồi giấm [60].

Với cấu trúc hoàn thiện như vậy, ruồi giấm được ứng dụng rộng rãi trong

nghiên cứu các bệnh thoái hoá thần kinh như Alzheimer, Huntington's, Parkinson hay

một số bệnh di truyền hiếm gặp như Charcot-Marrie-Tooth (CMT), hội chứng xơ cứng

teo cơ một bên (Amyotrophic lateral sclerosis – ALS) …

1.3. Ứng dụng mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu

Bằng việc sử dụng ruồi giấm làm đối tượng nghiên cứu, Thomas Morgan – cha

đẻ của mô hình này đã phát hiện ra quy luật di truyền và đặt nền móng cho di truyền

học hiện đại. Với bề dày lịch sử nghiên cứu hàng trăm năm, mô hình ruồi giấm đã

chứng tỏ được khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học hiện đại

như mô phỏng bệnh lý của người (bệnh thoái hoá thần kinh, rối loạn chuyển hoá, ung

thư . . .), nghiên cứu chức năng của gen, tương tác giữa các gen, các biến đổi di truyền,

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

xác định các con đường tín hiệu trong bệnh học phân tử, thử nghiệm và sàng lọc dược

chất, xác định độc tố môi trường…Nhiều mô hình ruồi giấm mô phỏng bệnh lý dựa

trên các cơ chế phân tử gây bệnh đã được xây dựng bằng nhiều phương pháp. Theo đó,

các gen gây bệnh có thể được chèn vào hệ gen của ruồi giấm thông qua vectơ chuyển

Gen mã hoá cho transposase

Plasmid hỗ trợ

Plasmid chuyển gen

Vi tiêm

Ruồi trưởng thành mang plassmid

DNA genome của ruồi giấm

gen. Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất là sử dụng plasmid P-element (Hình 6).

Biol 202 Genetics, 2013 Lecture 23

Hình 6: Phương pháp chuyển gen vào ruồi giấm sử dụng vectơ P-element. Phương pháp sử dụng hai plasmid; một plasmid mang gen chuyển và gen quy định màu mắt nằm giữa hai đoạn trình tự P-element, plasmid còn lại mang gen mã hoá cho enzyme transposase. Hai plasmid này được đồng chuyển vào hệ gen bằng phương pháp vi tiêm vào phôi của ruồi giấm. Ruồi giấm mang gen chuyển được sàng lọc bằng marker màu mắt [88].

Bên cạnh phương pháp chuyển gen, mô hình ruồi giấm bệnh lý còn có thể được

tạo lập bằng cách tác động lên các gen/protein ở ruồi có mức độ tương đồng cao với

gen/protein của người. Sự tương đồng về trình tự axit amin mã hoá, đặc biệt là trình tự

ở từng vùng cụ thể trong cấu trúc cho thấy tính bảo tồn cao về chức năng của protein ở

hai loài.

Việc bảo tồn lượng lớn các gen và con đường dẫn truyền tín hiệu giữa người và

ruồi, cũng như sự phát triển của não ruồi, đã củng cố thêm cho việc sử dụng ruồi giấm

để tạo lập mô hình các bệnh thoái hóa thần kinh như Parkinson, Alzheimer,

Huntington… [38], [75], [76]. Ở mô hình ruồi giấm biểu hiện bệnh Parkinson, người

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

ta tiến hành giảm biểu hiện gen duch (một gen tương đồng với UCH-L1 ở người) trên

các tế bào thần kinh sinh dopamine. Mô hình này biểu hiện triệu chứng suy giảm khả

năng vận động và mất tế bào thần kinh sinh dopamine ở cả hai giai đoạn ấu trùng và

ruồi trưởng thành [75]. Các đặc điểm trên tương tự như triệu chứng của bệnh

Parkinson ở người. Nghiên cứu của Mizuno và cs năm 2010 cũng dùng ruồi giấm

chuyển gen alpha-synuclein làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson và các yếu tố liên

quan [50]. Đối với bệnh Alzheimer, mô hình ruồi giấm cũng được sử dụng để nghiên

cứu cơ chế bệnh sinh; từ đó mô phỏng lại kiểu hình. Một số mô hình có thể kể đến như

mô hình ruồi giấm chuyển gen mã hoá cho protein gây bệnh như b-amyloid, Tau [76].

Ngoài lợi thế về các bệnh di truyền, gần đây mô hình ruồi giấm còn được ứng

dụng trong nghiên cứu bệnh ung thư. Các nghiên cứu này mô phỏng lại sự thay đổi của

các tế bào biểu mô như mất tính phân cực của tế bào, gián đoạn các con đường tín hiệu

(con đường tín hiệu JNK, PI3K/TOR, …) [49]. Việc kích hoạt gen ung thư để tạo khối

u ác tính có thể được thực hiện trên ruồi. Ngoài ra, người ta còn có thể cấy ghép mô

ung thư trên ruồi, hoặc từ ấu trùng sang ruồi trưởng thành và đánh giá khả năng sinh

ung thư của các mô đột biến; tại đây các tế bào có khả năng tăng sinh và tạo khối u

mới [65].

Năm 1946, giải Nobel Y học được trao cho nhà khoa học Hermann Joseph với

nghiên cứu chứng minh tia X có khả năng làm đột biến DNA và các đột biến này có

thể di truyền sang các thế hệ sau, nghiên cứu của ông thực hiện trên ruồi giấm. Từ ý

tưởng nghiên cứu đó mà ruồi giấm đã được sử dụng trong nghiên cứu các độc tố môi

trường ảnh hưởng đến sự biển đổi di truyền sau này. Ruồi có thể được nuôi trong điều

kiện nhân tạo để đánh giá ảnh hưởng của tác động môi trường lên sức khoẻ hay nhằm

nghiên cứu khả năng chịu đựng hoặc phục hồi của ruồi mang gen nghiên cứu…Một

công bố gần đây nhất năm 2017 của nhóm tác giả Robert R. H. Anholt đã cho ruồi

giấm sống trong môi trường bị phơi nhiễm các kim loại nặng là chì và cadmium [84].

Nghiên cứu đã chỉ ra các alen liên quan đến khả năng đề kháng với chì và/hoặc

cadmium, ngoài ra họ cũng cho thấy đa hình nucleotide đơn (SNPs) có liên quan đến

sự thay đổi khả năng đề kháng với cả kim loại nặng cũng như SNPs có liên quan đến

sự kháng thuốc cụ thể đối với mỗi loại.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

So với các mô hình khác, mô hình ruồi giấm có một số nhược điểm bao gồm

khoảng cách tiến hóa xa với người, sức sống yếu, dễ bị tác động bởi các yếu tố bên

ngoài và bên trong (như việc chèn ngẫu nhiên các gen mục tiêu); việc các mô nhỏ cũng

gây một phần khó khăn cho phân tích [32].

Tuy nhiên, mô hình ruồi giấm cũng mang nhiều đặc điểm thuận lợi cho nghiên

cứu. Cụ thể, ruồi giấm là đối tượng đã được hiểu biết rõ về kiểu hình, tập tính, chu kì

sống, thông tin di truyền và hình thái giải phẫu; các công cụ thao tác phục vụ cho việc

chuyển gen, gây đột biến, giảm biểu hiện (knockdown) hay biểu hiện vượt mức gen

cũng đa dạng và phổ biến [11]. Đây là sinh vật có vòng đời ngắn, số lượng nhiều, phù

hợp cho các thí nghiệm có nhu cầu số lượng mẫu lớn. Các thí nghiệm trên ruồi có thể

cho thấy đồng thời sự thay đổi ở mức độ cơ thể (hình thái, hành vi, kiểu hình vận

động), mô và tế bào. Bên cạnh đó, chi phí cho việc tiến hành nghiên cứu trên mô hình

ruồi, tính tương đối, sẽ thấp hơn một vài mô hình khác như tế bào hay chuột. Về bộ

gen ruồi giấm, độ tương đồng giữa ruồi và động vật có vú ở mức độ nucleotide và

trình tự protein là 40%, con số này có thể lên đến 80 – 90% hoặc cao hơn nếu xét trên

các vùng chức năng được bảo tồn. Ước tính rằng, 75% gen bệnh ở người có gen tương

đồng trên ruồi [62]. Ruồi có hệ thần kinh vận động tương đối hoàn thiện và hoạt động

vận động phức tạp. Não ruồi trưởng thành chứa hơn 100.000 neuron, điều khiển nhiều

loại hành vi bao gồm nhịp sinh học, thức - ngủ, học tập, ghi nhớ, ăn uống, hành vi ve

vãn, giao phối và điều hướng bay [47]. Đáp ứng của hệ thần kinh trung ương ở não

ruồi với nhiều loại thuốc cũng tương tự như ở động vật có vú [15]. Việc bảo tồn lượng

lớn gen và các con đường dẫn truyền tín hiệu giữa người và ruồi, cũng như sự phát

triển của não ruồi, đã củng cố thêm cho việc sử dụng ruồi giấm để tạo lập mô hình các

bệnh lý thần kinh, trong đó có rối loạn tự kỷ.

Một số công cụ di truyền đã được phát triển để có thể khai thác tiềm năng ứng

dụng mô hình ruồi giấm vào nghiên cứu. Trong đó, hệ thống điều hòa biểu hiện gen

GAL4-UAS, hay sự kết hợp của hệ thống này với kỹ thuật RNAi (RNA interference,

RNA can thiệp) là một trong những công cụ quan trọng trong các nghiên cứu chức

năng gen và tạo mô hình bệnh trên ruồi giấm.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

1.4. Hệ thống kiểm soát biểu hiện gen GAL4-UAS và ứng dụng trong

nghiên cứu mô hình ruồi giấm

1.4.1. Hệ thống GAL4/UAS

Năm 1993, Brand và Perrimon lần đầu tiên sử dụng hệ thống GAL4/UAS có

nguồn gốc từ nấm men Saccharomyces cerevisiae trong việc định hướng biểu hiện các

gen ở ruồi giấm. Từ đó hệ thống này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các

nghiên cứu trên ruồi.

Hệ thống GAL4/UAS sử dụng 2 dòng ruồi chính (Hình 7). Một dòng mang gen

mã hoá cho protein GAL4 dưới sự kiểm soát của promoter định hướng mô (dòng

driver). Tuỳ vào vị trí muốn biểu hiện mà người ta lựa chọn dòng driver mang

promoter đặc hiệu mô như elav cho biểu hiện protein ở não, gmr cho biểu hiện protein

ở mắt, hay pnr cho biểu hiện protein ở cánh… Một dòng khác chứa gen đích được điều

hòa bởi trình tự UAS (upstream activator sequence) gắn trước nó. Thông thường, khi

các dòng ruồi chuyển gen này sống độc lập với nhau thì gen đích không được biểu

hiện. Điều này đặc biệt thuận lợi trong việc nghiên cứu các protein có tính độc như các

protein kích hoạt quá trình apoptosis; tránh việc biểu hiện thường xuyên một protein

ngoại lai có khả năng gây độc và làm giảm sức sống của các dòng ruồi chuyển gen,

gây trở ngại lớn cho nghiên cứu.

Trong thí nghiệm, 2 dòng ruồi được lai với nhau để tạo dòng con lai mang cả 2

trình tự gene gal4 và ‘UAS-gene đích’. Khi đó, dưới tác động của promoter định

hướng mô, protein GAL4 sẽ được biểu hiện tại các tế bào (mô) mong muốn. Trong các

tế bào (mô) này, GAL4 bám lên vùng trình tự UAS nằm phía trước gen đích, hoạt hóa

sự phiên mã của gen đích. Việc sử dụng hệ thống này giúp cho việc biểu hiện

gen/protein đích tại các mô xác định, tránh biểu hiện tại quá nhiều mô gây giảm mạnh

sức sống của các dòng ruồi, cũng như giúp việc khảo sát chuyên biệt tại tế bào (mô)

cần quan tâm.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Hình 7: Hoạt động của hệ thống GAL4/UAS.

Ngoài hệ thống GAL4-UAS cơ bản, một số hệ thống GAL4-UAS mở rộng còn

cho phép điều khiển quá trình biểu hiện trình tự mục tiêu theo nhiệt độ, hormone và cơ

chất bổ sung vào môi trường [33], [44], [62].

1.4.2. Phương pháp knockdown một gen bằng kỹ thuật RNAi và

biểu hiện gen knockdown bằng hệ thống GAL4/UAS

Ngoài chức năng biểu hiện vượt mức một protein, hệ thống GAL4 cũng có thể

sử dụng để tạo ra kiểu hình mất hay giảm biểu hiện của một gen bằng cách biểu hiện

RNA sợi đôi (dsRNA) nội sinh nhằm knockdown gen theo cơ chế RNAi (Hình 8).

dsRNA có cấu trúc kẹp tóc (hair-pin) được tạo ra từ sự phiên mã trình tự lặp lại đảo

chiều của gen đích nhờ hệ thống GAL4/UAS, từ đó có khả năng phân giải mRNA gen

đích, làm giảm lượng mRNA và giảm mức độ biểu hiện của gen [30].

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Hình 8: Cơ chế RNA can thiệp (RNA interference – RNAi).

1.5. Họ gen ABC và gen ABCC4

1.5.1. Tổng quan về họ gen ABC

Ở người, họ gen ABC (ATP-binding cassette) bao gồm 49 gen chia làm 7 phân họ,

kí hiệu lần lượt từ A đến G. Chức năng chính của họ gen này là mã hoá cho một loạt

các protein trên màng tế bào có vai trò như “chiếc bơm” vận chuyển các chất qua

màng [19], [79]. Hoạt động của những “chiếc bơm” này phụ thuộc vào sự có mặt của

phân tử ATP, sử dụng năng lượng từ việc thuỷ phân ATP. Các protein xuyên màng

này có vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động của tế bào như: vận chuyển cơ chất

(ion kim loại, peptide, axit amin, đường, và các chất chuyển hoá) [79]. Cấu trúc chung

của chúng bao gồm hai vùng chính: vùng xuyên màng (transmembrane domains-

TMDs) cấu tạo bởi các chuỗi alpha-helix; vùng bám nucleotide (nucleotide binding

domains – NBDs) với các trình tự Walker A, Walker B có tính bảo tồn cao. Vùng bám

nucleotide cũng đồng thời là vị trí gắn và thuỷ phân ATP trong khi vùng xuyên màng

tham gia vào quá trình nhận biết các chất và vận chuyển lipid qua màng tế bào [79].

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Hình 9: Sơ đồ cấu trúc và các vùng chức năng của protein ABC. TMD: vùng xuyên màng (transmembrane domain); NBD: vùng bám nucleotid (nucleotide binding domain) [19].

Cho đến nay, đột biến tại ít nhất 11 gen thuộc họ ABC đã được chứng minh là

có liên quan đến các bệnh lý di truyền như: bệnh Tangier gây ra bởi đột biến ABCA1,

bệnh Stargardt gây ra bởi đột biến ABCA4, bệnh gan nhiễm mỡ di truyền gây ra bởi

đột biến gen ABCB11 hay hội chứng Dubin-Johnson gây ra bởi đột biến ABCC2.

Trong số các gen thuộc họ ABC đã được xác định mối liên quan với bệnh lý ở

người phải kể tới ABCA13 (ATP-binding cassette subfamily A member 13), mã hoá

cho protein có cấu trúc hoàn chỉnh bao gồm 2 vùng xuyên màng TMD1, TMD2, mỗi

vùng có chứa 6 chuỗi alpha-helic và hai vùng bám nucleotide NBD1, NBD2 có khả

năng gắn với phân tử ATP. ABCA13 là thành viên lớn nhất trong họ protein ABC với

hơn 3500 amino axit và vùng NH2 dài; định vị trên màng tế bào và có vai trò quan

trọng trong việc vận chuyển lipid, các chất nội sinh bao gồm các anion vô cơ, ion kim

loại, peptide, axit amin, đường và một lượng lớn các hợp chất kỵ nước. Protein này

biểu hiện ở vỏ não và vùng dưới đồi của não người và chuột. Do đó, đột biến gen

ABCA13 đã được chứng minh là có liên quan đến hội chứng tâm thần phân liệt và rối

loạn lưỡng cực ở người [37], [73]. Nhiều nghiên cứu trên mô hình động vật thực

nghiệm cũng khẳng định vai trò của ABCA13 trong biểu hiện rối loạn tự kỷ [35], [77].

1.5.2. Gen ABCC4

Bên cạnh ABCA13, gen ABCC4 cũng là một thành viên thuộc họ gen ABC- mã

hoá cho protein có cấu trúc tương tự như protein ABCA13 gồm 2 vùng xuyên màng

(membrane spanning domain – MSD) MSD1 và MSD2, mỗi vùng chứa 6 chuỗi helix,

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

2 vùng gắn nucleotide (NBD1 và NBD2) và vùng NH2 với khoảng 12 axit amin với

nhiều chức năng như vận chuyển các chất qua màng tế bào (bao gồm các ion vô cơ,

các phân tử thuốc), thụ thể trên bề mặt tế bào và bài tiết độc tố. Nhiều nghiên cứu đã

chỉ ra vai trò của nó trong việc điều hoà cân bằng nội môi và truyền tin nội bào, điều

khiển quá trình lão hoá của tế bào tuỷ xương và tuyến ức [39]. Ngoài ra, protein này

còn định vị ở các tế bào nội mô mạch máu não, tế bào hình sao của chất trắng dưới vỏ

não và đóng vai trò trong sinh bệnh học khối u (u xơ nang, u não) và một số bệnh

thoái hoá thần kinh (Parkinson, Alzheimer…) [16], [18], [26], [52].

1.6. Ứng dụng mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu rối loạn tự kỷ

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu sử dụng ruồi giấm làm sinh vật mô hình để

mô phỏng bệnh lý rối loạn tự kỷ ở người với mục tiêu xác định được tác động của các

yếu tố về gen, môi trường đến các hành vi, biểu hiện, khả năng vận động, khả năng

sống sót, các thay đổi về nhịp sinh học và biến đổi trong cấu trúc thần kinh ruồi giấm

[42], [77], [81]. Năm 2015, nghiên cứu của Wise và cs đã xác định được mối liên quan

giữa đột biến gen rugose (một gen tương đồng với gen NBEA ở người) với biểu hiện

của rối loạn tự kỷ trên mô hình ruồi giấm [81]. Nhóm nghiên cứu này cũng đã chứng

minh được gen rugose có khả năng tương tác với phức hệ EGFR và North trong nhiều

con đường tín hiệu; đóng vai trò trung gian trong quá trình truyền tin giữa các con

đường tín hiệu với nhau [68]. Theo đó, đột biến gây mất chức năng của gen rugose

(Drosophila Neurobeachin) làm giảm khả năng vận động, gây nên bất thường trong

cấu trúc và kiểu hình thần kinh của ấu trùng ruồi giấm. Những cá thể trưởng thành

mang đột biến cũng bị ảnh hưởng đến tập tính, cường độ hoạt động và hành vi tương

tác xã hội [81]. Đột biến chuyển đoạn nhiễm sắc thể với điểm đứt gãy trên gen NBEA

là nguyên nhân dẫn đến chứng tự kỷ vô căn ở trẻ nam [53]. Đột biến xoá đoạn gen này

cũng được công bố là có liên quan đến bệnh [34]. Nhiều nghiên cứu trên mô hình động

vật đã chỉ ra vai trò của NBEA trong nhiều quá trình của tế bào như cấu tạo võng mạc,

trao đổi và giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh qua màng tế bào, củng cố trí nhớ

ngắn hạn [68], [78].

Năm 2018, nghiên cứu của Ueoka và cs nhận thấy ở ruồi giấm có chứa gen

CG1718 (nằm trên vùng 19F3 của nhiễm sắc thể X) có trình tự và chức năng tương

đồng như gen ABCA13 ở người. Do đó, nghiên cứu hướng đến gen này trên ruồi và gọi

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

tắt là Drosophila ABCA13 (dABCA13) [77]. Kết quả giảm biểu hiện (knockdown) gen

dABCA13 tại mô não của ruồi giấm cho thấy sự giảm tương tác rõ rệt giữa các cá thể

trong quần thể, ruồi bị rối loạn nhịp thức-ngủ và cấu trúc thần kinh cơ bị biến đổi thể

hiện rõ nhất ở các nút thần kinh. Kiểu hình ghi nhận được trên mô hình này tương tự

như triệu chứng rối loạn tự kỷ ở người. Bên cạnh đó, đột biến gen ABCA13 cũng đã

được chứng minh là có liên quan đến rối loạn tự kỷ trên mô hình động vật bậc cao

[35]. Những kết quả này đã cho thấy tính tiềm năng trong việc sử dụng mô hình ruồi

giấm để nghiên cứu rối loạn tự kỷ.

Mặc dù tương đồng về cấu trúc và chức năng với ABCA13 nhưng vai trò của

ABCC4 đối với hệ thần kinh và ảnh hưởng đến rối loạn tự kỷ lại chưa được biết đến và

cũng chưa có một nghiên cứu nào trên mô hình động vật xác định được vai trò sinh

bệnh học của gen này. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài ‘Nghiên cứu vai trò

của gen ABCC4 liên quan đến rối loạn tự kỷ bằng mô hình ruồi giấm’ với hai mục

tiêu chính:

(1) knockdown gen ABCC4 trên mô não của ruồi giấm sử dụng hệ thống

GAL4/UAS.

(2) phân tích các biểu hiện hành vi và thay đổi cấu trúc mối nối thần kinh cơ NMJ

trên ruồi knockdown ABCC4 trong mối liên quan đến bệnh tự kỷ.

Đây là hướng nghiên cứu hoàn toàn mới, góp phần làm sáng tỏ vai trò của gen này

trong cơ chế phân tử của bệnh, đồng thời cung cấp một mô hình tiềm năng và kinh tế

cho những nghiên cứu thử nghiệm và sàng lọc thuốc.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu sử dụng các dòng ruồi giấm chuyển gen thu thập từ các trung tâm lưu

2.1. Đối tượng nghiên cứu

trữ lớn trên thế giới như Vienna Stock Center, Italy và Bloomington Drosophila Stock

Center – Indiana,USA. Trong đó bao gồm:

- w; +; elav-GAL4 (mã số #8760 – Bloomington Stock Center): dòng driver định

hướng biểu hiện protein GAL4 tại mô não ruồi giấm.

- w;UAS-GFP-IR; + (mã số #56179 - Vienna Stock Center): biểu hiện dsRNA của

gen GFP.

- w; UAS-dABCC-IR63-155; + (mã số CG7627/v2808 – Vienna Stock Center): biểu

hiện dsRNA của gen dABCC4. Ruồi được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản và trong điều kiện nhiệt độ 25oC,

thời gian chiếu sáng chu kỳ 12 giờ sáng : 12 giờ tối.

2.2. Nguyên vật liệu, hoá chất và thiết bị

2.2.1. Nguyên vật liệu và hoá chất

Môi trường cơ bản

- Agar 0.85% (w/v) (Serva)

- Đường 5% (w/v)

- Bột ngô 5% (w/v)

- Nấm men 5% (w/v)

- Propionic acid 0.5% (v/v) (Merck – Đức)

- Sodium benzoate 0.1% (w/v) (Merck – Đức)

- Sữa bột 3% (w/v) (Nutrifood)

- Nước cất một lần

Hóa chất Western Blot

- Sample Buffer (Tris-HCl 50mM (pH 6.8), 2% SDS, 10% glycerol, 0.1%

Bromophenol Blue, và 1,2% ß-mercaptoethanol)

- Proteinase inhibitor (Sigma Aldrich – Đức)

- Acrylamide : Bisacrylamide

- Skim milk

- Tris Buffer Saline chứa 0,1% Tween 20 (Sigma Aldrich – Đức )

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

- Dung dịch Transfer Buffer (5 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3)

- Kháng thể đặc hiệu anti-dABCC4 (Sigma-Aldrich)

- Kháng thể đặc hiệu anti-tubulin (Thermo Scientific)

- Dung dịch ECL (Enhance Cheluminesence Substrate) (GE Healthcare)

- Màng PVDF (Polyvinylidene Difluoride) (Thermo Fisher)

Hóa chất nhuộm miễn dịch huỳnh quang

- Dung dịch HL3 (hemolymph-like 3 saline)

- Huyết thanh dê: Normal goat serum (#S-1000, Vector Laboratories, Nhật)

- Kháng thể anti-HRP (horseradish peroxidase) có gắn huỳnh quang FITC

(Fluorescein isothiocyanate)

- Kháng thể anti-DLG (Thermo Fisher)

- Kháng thể anti-BRP (Thermo Fisher)

- Kháng thể bậc 2 Stabilized Peroxidase Conjugated Goat Anti Mouse

(ThermoFisher Scientific)

- Kháng thể bậc 2 Stabilized Peroxidase Conjugated Goat Anti Rabbit

(ThermoFisher Scientific)

- Kháng thể dê kháng thỏ gắn chất phát huỳnh quang Alexa 488: Alexa

Flour® 488 goat anti-rabbit IgG (#A-11008, Invitrogen, Nhật)

- Kháng thể dê kháng thỏ gắn chất phát huỳnh quang Alexa 594: Alexa

Flour® 594 goat anti-rabbit IgG (#A-11037, Invitrogen, Nhật)

- Dung dịch đệm phosphate: PBS (NaCl 8g/l, KCl 0.2g/l, Na2HPO4 1.44g/l,

KH2PO4 0.24g/l, pH= 7.4)

- Dung dịch Triton X-100 0.3% trong PBS: PBS-T 0.3%

- Dung dịch paraformaldehyde 4% trong PBS: PFA 4%

- Huyết thanh dê 10% trong PBS-Triton X-100 0.15%: NGS 10%

- Dung dịch mounting: VECTASHIELD Mounting Medium (#H-1000,

Vector Laboratories)

Các hoá chất đều đạt độ tinh sạch dung trong nghiên cứu sinh học phân tử.

2.2.2. Dụng cụ và thiết bị

- Tủ 4oC (Vestfrost Reetech, Đan Mạch)

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

- Tủ ủ 28 oC (Faithful SPX-150BX, Trung Quốc)

- Nồi hấp (Labtech, Hàn Quốc)

- Tủ sấy (Memmert, Đức)

- Kính phóng đại soi nổi ZMZ660 (Nikon, Nhật Bản)

- Kính hiển vi đồng quét Confocal (Olympus Flouview FV10i)

- Thiết bị đo hoạt động của ruồi Activity Monitoring (Trikinetics, USA)

- Máy ảnh kỹ thuật số Canon D50

- Dụng cụ gây mê ruồi

- Bộ dụng cụ thử nghiệm leo trèo (climbing assay)

- Máy ly tâm (Beckman Coulter, Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh Micro 17R (Hanil)

Ngoài ra còn có các dụng cụ cơ bản khác trong phòng thí nghiệm.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lai tạo dòng ruồi giấm knockdown biểu hiện dABCC4 tại mô

Nguyên tắc: Để knockdown gen ABCC4 tại các tế bào thần kinh trong mô não của

não của ruồi

ruồi giấm cần tạo được dòng ruồi mang cả hai thành phần elav-GAL4 và UAS-

dABCC4-IR. Trong đó, elav là promoter điều khiển sự biểu hiện của GAL4 chuyên

biệt tại các tế bào thần kinh trên não; UAS-dABCC4-IR là cấu trúc bao gồm trình tự

điều hoà UAS nằm phía trước hai đoạn trình tự của gen dABCC4 được sắp xếp đảo

chiều. Protein GAL4 tạo ra sẽ bám vào vùng UAS và liên tục hoạt hoá quá trình phiên

mã gen đích dABCC4-IR, tạo ra sợi RNA mang hai trình tự ngược chiều và có khả

năng bắt cặp bổ sung với nhau để hình thành cấu trúc “kẹp tóc”. Từ đó hoạt hoá con

đường RNAi để knockdown gen dABCC4 tại các tế bào thần kinh ở thế hệ con lai F1.

Cách thực hiện: Chúng tôi tiến hành lai các cặp ruồi bố mẹ: (1) ruồi mẹ mang

promoter elav-GAL4 và ruồi bố mang gene UAS-dABCC4-IR (v2808) để tạo dòng

knockdown; (2) ruồi mẹ mang promoter elav-GAL4 và ruồi bố mang gene UAS-GFP-

IR (56179) để tạo dòng đối chứng. Quá trình lai tạo được miêu tả trong Hình 10. Sơ đồ

lai, kiểu gene ruồi bố mẹ, kiểu gene đời con F1 được nêu chi tiết ở phép lai 1 và phép

lai 2.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Trình tự UAS

Promoter elav

Trình tự UAS

Gen GAL4

Đoạn trình tự lặp đảo của gen GFP

Promoter elav

Gen GAL4

Đoạn trình tự lặp đảo của gen dABCC4

dABCC4

Hình 10: Sơ đồ miêu tả quá trình lai tạo các dòng ruồi giấm thí nghiệm và cơ chế hoạt động của các thành phần trong con lai F1.

Phép lai 1: tạo dòng đối chứng (Dc):

♀ +; +; elav-GAL4 (8760) X ♂ +; UAS-GFP-IR; + (56179) P:

+; UAS-GFP-IR; elav-GAL4 (elav>GFP-IR) F1:

Phép lai 2: tạo dòng knockdown (Kd):

♀ +; +; elav-GAL4 (8760) X ♂ +; UAS-dABCC4-IR; + (v2808) P:

+; UAS-dABCC4-IR; elav-GAL4 (elav>dABCC4-IR) F1:

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

2.3.2. Phương pháp đánh giá biểu hiện của protein ABCC4 tại mô não ruồi giấm

bằng kỹ thuật western blotting

Chủng ruồi giấm sau khi lai tạo sẽ được tiến hành đánh giá hiệu quả

knockdown protein trên mô não bằng kỹ thuật western blotting, sử dụng kháng thể đặc

hiệu với protein ABCC4. Quy trình bao gồm các bước chính như sau:

• Chuẩn bị protein tổng số

- Lựa chọn 40 cá thể ruồi giấm trưởng thành có cùng ngày tuổi hoặc 20 ấu trùng

ruồi giấm ngày 3 ở cả hai dòng đối chứng và dòng knockdown.

- Mô não của ruồi trưởng thành hoặc hệ thần kinh trung ương của ấu trùng ngày 3 được tách trong dung dịch PBS 1X sau đó ủ ở 95oC/2 phút trong dung dịch

Tris-HCl 0.1M (pH 7.6) có chứa protease inhibitor.

- Nghiền mô trong dung dịch đệm có chứa Tris-HCl 50mM (pH 6.8), 2% SDS,

10% glycerol, 0.1% Bromophenol Blue, và 1,2% ß-mercaptoethanol.

- Ủ dịch nghiền ở 95oC trong 5 phút và ly tâm 10.000 vòng/5 phút. Thu dịch nổi. - Protein tổng số sau khi tách chiết được bảo quản ở -80oC.

• Điện di SDS-PAGE

- Protein tổng số sau khi tách chiết được điện di biến tính trên gel

polyacrylamide 6% trong điều kiện 120V/90 phút hoặc tới khi dye xanh chạm

tới đáy bản gel.

• Chuyển màng

Quá trình chuyển màng được thực hiện theo các bước:

- Nhúng màng PVDF theo thứ tự: methanol 100% trong 20 giây; nước cất vô

trùng trong 1 phút; cân bằng màng trong Transfer Buffer trong 5 phút.

- Quá trình chuyển màng được thực hiện trong dung dịch đệm Transfer Buffer

trong điều kiện 80V/1,5h.

- Khoá màng bằng dung dịch skim milk 5% có chứa TBS và 0.1% Tween 20

(TBS-T) trong 60 phút ở nhiệt độ phòng.

• Ủ màng với kháng thể - Màng được ủ với kháng thể bậc 1 Anti-dABCC (1:1000) trong đệm ở 4oC qua

đêm.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

- Rửa màng từ 3-5 lần với TBS-T 1X và ủ với kháng thể bậc 2 anti-rabbit

(1:3000) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

- Lặp lại bước rửa 3 – 5 lần với TBS-T 1X

• Phát hiện

- Ủ màng với cơ chất phát màu ECL Substrate. Dàn đều cơ chất lên màng.

- Chụp ảnh và phân tích bằng hệ thống AE-9300H Ez-Capture

Ngoài việc sử dụng kháng thể bậc 1 đặc hiệu cho protein đích ABCC4, chúng

tôi tiến hành ủ màng với kháng thể đặc hiệu cho alpha-tubulin (1:3000) để kiểm chứng

lượng protein ở từng mẫu thí nghiệm.

Ruồi giấm thế hệ F1 sau khi được đánh giá biểu hiện của protein ABCC4 ở mô

não sẽ được sử dụng cho một loạt các thí nghiệm đánh giá hành vi trong mối liên quan

với rối loạn tự kỷ. Do ruồi cái bị ảnh hưởng bởi quá trình mang thai và đẻ trứng nên

toàn bộ các thí nghiệm được tiến hành trên ấu trùng hoặc ruồi giấm trưởng thành đực

để đảm bảo tính ổn định. Các thí nghiệm được tiến hành song song giữa nhóm bệnh

(knockdown gen ABCC4) và nhóm chứng (knockdown gen GFP).

2.3.3. Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm bằng thí nghiệm leo trèo

(Climbing assay)

Thí nghiệm dựa trên tập tính leo trèo ngược chiều trọng lực khi có lực tác động

cùng chiều trọng lực của các dòng ruồi giấm. Dựa trên nguyên tắc này, dòng ruồi khỏe

mạnh hơn sẽ có khả năng leo trèo và cho ra quãng đường di chuyển dài hơn trong cùng

một khoảng thời gian. Theo đó, ấu trùng ruồi giấm tiếp tục được nuôi đến giai đoạn trưởng thành trong điều kiện nhiệt độ 28oC. Con đực của thế hệ F1 sẽ được sử dụng để

đánh giá hành vi trèo tại các thời điểm 3 ngày tuổi, 7 ngày tuổi và 14 ngày tuổi.

Hình 11: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng leo trèo

của ruồi giấm trưởng thành.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

- Thí nghiệm được thực hiện dựa trên quy trình trong nghiên cứu của Madabatula và cs

(2010) [45]. Ruồi giấm được gây mê bằng CO2 sau đó được chuyển vào mỗi ống thủy

tinh (15 – 20 ruồi/ ống) có chia vạch từ 1 đến 5, mỗi vạch cách nhau 2 cm. Đợi ít nhất

10 phút cho các con ruồi ổn định, dùng sức của tay đập lực đủ mạnh liên tục 5 lần để

đưa ruồi về đáy ống thủy tinh (về cùng vạch xuất phát). Sau đó đợi 30s cho ruồi bò

lên, lặp lại động tác 5 lần.

- Sử dụng dữ liệu video ghi được tại 5s đầu tiên sau khi kết thúc mỗi lần đập để phân

tích, so sánh khả năng leo trèo của ruồi ở các nhóm thí nghiệm.

- Chỉ số vận động của ruồi giấm ở mỗi nhóm đươc tính toán dựa theo phương pháp

cho điểm như sau:

+ 0 điểm đối với ruồi ở dưới vạch 2cm

+ 1 điểm đối với ruồi ở giữa vạch 2 và 4cm

+ 2 điểm đối với ruồi ở giữa vạch 4 và 6cm

+ 3 điểm đối với ruồi ở giữa vạch 6 và 8cm

+ 4 điểm đối với ruồi ở giữa vạch 8 và 10cm

+ 5 điểm đối với ruồi ở trên vạch 10cm

- Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Image-J, thống kê bằng Microsoft Excel và

phần mềm SPSS.

2.3.4. Phương pháp đánh giá khả năng tương tác xã hội

Thí nghiệm đánh giá hành vi tương tác xã hội (social space assay) được tiến

hành theo quy trình của nhóm nghiên cứu Simon và cs (2012) [70]. Buồng thí nghiệm

hình tam giác cân nằm trong hai tấm kính vuông (18 x 18 cm), cách nhau bằng một

tấm đệm acrylic 0,5 cm cho phép ruồi hoạt động trong không gian hai chiều (Hình 12).

Thí nghiệm được tiến hành trên nhóm bệnh là ruồi giấm đực knockdown gen ABCC4.

Nhóm chứng là chủng ruồi giấm đực knockdown gen GFP.

Khoảng cách tương tác

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Hình 12: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng tương tác xã hội của ruồi giấm.

Thí nghiệm được tiến hành trên 40 cá thể ruồi giấm mỗi nhóm ở thời điểm 3 ngày tuổi:

- Ruồi được gây mê, sau đó chuyển vào buồng thí nghiệm.

- Đậy chặt buồng và đợi toàn bộ ruồi tỉnh lại.

- Đập nhẹ buồng thí nghiệm đảm bảo toàn bộ ruồi ở cùng một điểm xuất phát

đáy của buồng.

- Đợi 20 phút cho ruồi tự do vận động, giao tiếp với nhau. Quá trình này được

ghi lại bằng camera.

- Phân tích khoảng cách gần nhất giữa các các thể ruồi bằng phần mềm Image-J.

2.3.5. Phương pháp đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm (activity assay)

Ruồi giấm trưởng thành được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25oC, chu kỳ sáng

tối cách nhau 12 tiếng trước khi sử dụng cho thí nghiệm đánh giá nhịp thức ngủ

(activity assay). Thí nghiệm được tiến hành dựa trên mô tả trong nghiên cứu của Wise

và cs (2015) [81]. Theo đó, mỗi cá thể ruồi trưởng thành được cho vào một ống thuỷ

tinh đường kính 5mm với một đầu có chứa thức ăn và đặt trong một thiết bị đo chuyên

dụng (Hình 13A).

Đèn laser cảm biến

g n ộ đ

t ạ o h ộ đ

g n ờ ư C

Thời gian sinh học

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Hình 13: Thiết kế thí nghiệm xác định nhịp sinh học của ruồi giấm. (A) Thiết bị đo nhịp hoạt động của ruồi giấm (Activity Monitoring – Trikinetics, USA) có cảm biến kết nối với máy tính; (B) Biểu đồ minh hoạ cường độ hoạt động của ruồi giấm.

Toàn bộ hoạt động của ruồi được ghi nhận 24/24h liên tục trong vòng 7-10

ngày nhờ thiết bị cảm biến kết nối với máy tính. Qua đó có thể đo được thời gian và

cường độ hoạt động ban ngày/ban đêm của ruồi nhóm bệnh so với nhóm chứng.

2.3.6. Phương pháp đánh giá tuổi thọ của ruồi giấm (viability assay)

40 con ruồi giấm trưởng thành ở mỗi dòng đối chứng và knockdown được nuôi trong điều kiện thức ăn cơ bản, 10 con/ ống, nhiệt độ 25oC, độ ẩm 60% và thời gian

chiếu sáng 12h sáng : 12h tối. Ruồi liên tục được chuyển sang các ống thức ăn mới và

ghi nhận số lượng ruồi chết 3 ngày 1 lần. Tỷ lệ sống của ruồi được tính là phần trăm số

cá thể còn lại ở mỗi dòng qua từng ngày, cho đến khi không còn con nào sống sót. Số

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

liệu được ghi lại bằng Microsoft Excel và phân tích bằng phần mềm Graphpad Prism

6.0 sử dụng log-rank test.

2.3.7. Xác định sự thay đổi trong cấu trúc mối nối thần kinh cơ (neuromuscular

junction-NMJ) bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang

Ở ruồi giấm, cấu trúc mối nối thần kinh cơ (neuromuscular junction-NMJ) bao

gồm các nút thần kinh (bouton), vùng hoạt động trước synap (pre-synaptic active

zone) và vùng sau synap (post-synaptic) (Hình 14A). Các nút thần kinh được chia làm

4 dạng: Ib, Is, II và III [43]. Trong đó, bouton dạng Ib và Is khác nhau về kích thước,

hình thái, chức năng sinh lý và số lượng mạng lưới sau synap (subsynap reticulum

region – SSR) bao quanh chúng (Hình 14B). Bên cạnh sự khác biệt về kích thước và

hình thái của tế bào thần kinh, các bouton cũng khác nhau về chất dẫn truyền thần kinh

được sử dụng [48]. Bouton dạng I và dạng II chủ yếu sử dụng glutamate là chất dẫn

truyền chính. Các phân tử tín hiệu này được truyền thông qua một thụ thể đặc hiệu

glutamate (Glutamate receptor-GluR) trên màng tế bào. Do đó, có thể đánh giá hình

thái, cấu trúc NMJ của ruồi giấm ở giai đoạn ấu trùng ngày 3 hoặc giai đoạn nhộng

bằng kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang sử dụng các kháng thể đặc hiệu cho từng

loại tế bào.

Nút thần kinh vùng trước synap

vùng sau synap

vùng hoạt động trước synap

GluR Protein tín hiệu

vùng sau synap

vùng sau synap bao gồm phần khung và các phân tử tín hiệu

(G. Lee et al 2016)

(K. Menon et al 2013)

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Hình 14: Cấu trúc mối nối thần kinh cơ (neuromuscular junction – NMJ) ở ấu trùng ruồi giấm [48]. (A) Mối nối thần kinh cơ NMJ được cấu tạo bởi các nút (bouton) bao gồm các vùng chức năng chính như vùng hoạt động trước synap (pre-synap active zone), vùng sau synap chứa các protein tín hiệu (protein signaling) và thụ thể glutamate (GluR). (B) Phân loại một số dạng bouton chính dựa vào kích thước, số lượng mạng lưới sau synap (SSR) và loại chất dẫn truyền thần kinh (NT).(C) Phân loại bouton dựa trên ảnh chụp NMJ nhuộm với kháng thể anti-HRP và anti-DLG dưới kính hiển vi huỳnh quang.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Vùng SSR chỉ có ở bouton dạng I mà không có ở các bouton dạng II và dạng

III, do đó có thể xác định được vùng này trong cấu trúc thần kinh NMJ ruồi giấm bằng

phương pháp nhuộm với kháng thể anti-Discs-Large (anti-DLG). Kháng thể anti-HRP

được sử dụng để nhuộm với tế bào thần kinh vùng trước synap và cho phép quan sát

tất cả các dạng bouton. Ngoài ra, vùng hoạt động sau synap và thụ thể glutamate cũng

được xác định bằng các kháng thể đặc hiệu anti-BRP và anti-GluR.

Phương pháp thực hiện bao gồm các bước chính như sau:

• Giải phẫu ấu trùng ruồi giấm ngày 3

- Chọn larva ngày 3 trong dung dịch PBS 1X. Chuẩn bị dụng cụ giải phẫu.

- Gim 6 kim giải phẫu vào chính giữa ĩa, nhỏ khoảng 6-8 giọt dung dịch HL3 xung

quanh.

- Thả ấu trùng ngày 3 vào giọt dung dịch HL3, để larva sao cho mặt lưng hướng lên

trên (quan sát thấy 2 ống khí quản màu trắng chạy dọc sống lưng).

- Đâm kim số 1 vào phần đỉnh, gần lỗ miệng của ấu trùng.

- Đâm kim số 2 vào phần đuôi, giữa 2 ống khí quản. sao cho thân larva căng giãn

vừa phải.

- Hút bỏ dung dịch HL3, dùng kéo cắt 4 đường (cắt trên da): đường thứ nhất dưới

kim số 1, ngang qua phần đầu, đường thứ 2 bắt đầu từ vết cắt số 1 dọc theo thân

(cắt giữa 2 ống khí quản, đến gần kim số 2 thì dừng).Đường số 3 và 4 cắt vát về 2

bên thân bắt đầu từ điểm cuối đường số 2. Bộc lộ nội quan.

- Thêm trở lại dung dịch HL3 để loại bỏ nội quan. Hút bỏ dịch chứa nội quan.

- Đưa kim số 2 về gần hơn để tránh việc giãn căng làm đứt thân larva.

- Giữ mẫu trong dung dịch HL3 khoảng 1 giờ.

• Cố định mẫu

- Hút bỏ dung dịch HL3, thêm dung dịch cố định PFA 4% và ủ ở nhiệt độ phòng

trong 30 phút

- Gỡ bỏ toàn bộ kim giải phẫu, nhặt ấu trùng cho vào ống eppendorf 1.5ml có chứa

sẵn dung dịch rửa PBS1x.

- Rửa mẫu với dung dịch Triton/PBS 0.3%, đặt lên máy lắc đảo. Lặp lại bước này 3

lần, mỗi lần 10 phút.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

- Blocking trong dung dịch NGS 10% (có chứa 0,15%Trion+PBS) trong 30 phút ở

nhiệt độ phòng.

• Ủ kháng thể bậc 1

Hỗn hợp ủ bao gồm: kháng thể anti-BRP (đặc hiệu cho vùng hoạt động trước

synap) hoặc kháng thể anti-DLG (đặc hiệu cho vùng sau synap) hoặc anti-GluR (đặc

hiệu cho thụ thể glutamine) trong dung dịch Trition/PBS 0,15% và dung dịch

NGS10%.

- Bọc giấy bạc, Ủ hỗn hợp qua đêm ở 4oC.

• Ủ kháng thể bậc 2

- Rửa mẫu vơi Triton/PBS 0.3% 5 lần, mỗi lần 10 phút.

- Ủ kháng thể bậc 2 trong hỗn hợp bao gồm: kháng thể anti-HRP, anti-mouse Alexa

594 và NGS 10%

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 tiếng.

- Rửa với dung dịch Triton/PBS 0,3% 5 lần.

• Gắn lam

- Gắn larva lên lam (lật mặt trong lên trên). Dùng dao cắt phần đầu, đuôi.

- Nhỏ 10 ul Viecta SHIELD, đặt lam men.

- Mẫu mô được quan sát và ghi ảnh dưới kính hiển vi huỳnh quang Confocal

(Fluor View – Olympus). Kết quả được xử lý bằng phần mềm MetaMorph Imaging

System –JH Technology để đo chiều dài synap thần kinh, số lượng nhánh, số lượng

nút, và mật độ, kích thước của vùng hoạt động trước synap.

2.3.8. Phân tích kết quả

Kết quả của thí nghiệm tương tác cộng đồng, thí nghiệm đánh giá khả năng vận

động và xác định cấu trúc tế bào thần kinh của ruồi giấm được xử lý bằng phần mềm

phân tích hình ảnh Image J (NIH, USA) sau đó phân tích thống kê bằng phần mềm

SPSS. Kết quả của thí nghiệm đánh giá nhịp sinh học và thời gian sống sót của ruồi

giấm được tổng hợp và phân tích bằng Microsoft Excel. Tất cả các thí nghiệm đều

được lặp lại tối thiểu 3 lần. Giá trị P được tính toán sử dụng Kruskal-Wallis test.

Sơ đồ thiết kế thí nghiệm được trình bày trong Hình 15.

Ruồi giấm trưởng thành

Phôi

Ấu trùng ngày 1

Ấu trùng ngày 2

Quan sát cấu trúc thần kinh cơ

Ấu trùng ngày 3

Thử nghiệm leo trèo

nhộng

F1:

Thử nghiệm tương tác cộng đồng

Xác định thời gian sống vòng đời

Thử nghiệm đánh giá nhịp thức ngủ

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Hình 15: Sơ đồ thiết kế các thí nghiệm trong nghiên cứu.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. So sánh mức độ tương đồng giữa protein ABCC4 của người và ruồi giấm

Trình tự axit amin của protein CG7627 (mã số Q9VLN6) ở ruồi giấm được trích

xuất từ cơ sở dữ liệu UniProt và so sánh với trình tự của các thành viên trong họ

NBD2

NBD1

TMD2

(1325 aa)

TMD1

protein ABCC ở người, sử dụng công cụ FASTA và BLAST.

A

ABCC4 ở người

1325

1274

1038

633

410

NBD1

NBD2

(1355 aa)

TMD2

TMD1

1355

1091

668

1326

445

63-155

dABCC4 ở ruồi giấm (Drosophila CG7627)

Đoạn trình tự mà sợi RNAi bám vào và phân huỷ mRNA đích

B

Hình 16: Mức độ tương đồng giữa protein ABCC4 của người và ruồi giấm. (A) Kết quả so sánh mức độ tương đồng về cấu trúc protein ABCC4 giữa ngườivà ruồi giấm. TMD: vùng xuyên màng (transmembrane domain); NBD: vùng bám nucleotid (nucleotide binding domain). Mũi tên màu đỏ chỉ vị trí mà đoạn RNAi bám vào để phân huỷ mRNA gen đích. (B)

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

So sánh mức độ tương đồng về trình tự axit amin giữa vùng TMD (màu vàng) và vùng NBD (màu xanh) của protein ABCC4 giữa người (human) và ruồi giấm (Droso).

Kết quả so sánh cho thấy, giữa protein CG7627 ở ruồi giấm và protein ABCC4

ở người có tỷ lệ tương đồng (identity) là 44% và mức độ giống nhau (similarity) là

63%, cao nhất trong số các thành viên khác thuộc họ protein ABCC.

Kết quả so sánh cũng cho thấy mức độ tương đồng về cấu trúc protein ABCC4

giữa người và ruồi giấm với hai vùng xuyên màng (TMD) và hai vùng bám nucleotid

(NBD) (Hình 16A).Ngoài ra, các vùng chức năng này ở cả hai loài cũng được xác định

với tỷ lệ tương đồng cao (TMD1 và TMD2 có tỷ lệ tương đồng với lần lượt là 72% và

81%; NBD1 và NBD2 lần lượt là 87,5% và 100%).

Trong số các thành viên thuộc họ ABCC, ABCC4 là protein có mức độ tương

đồng cao nhất với protein CG7627 ở ruồi. Cả hai protein này có mức độ bảo tồn cao

giữa các vùng chức năng, đặc biệt là vùng xuyên màng và vùng bám nucletotid. Đây là

hai vùng có vai trò quan trọng, tham gia vào quá trình nhận biết và vận chuyển các

chất qua màng tế bào. Quá trình này góp phần vào việc ổn định con đường tín hiệu và

duy trì cân bằng nội môi ở các tế bào trong hệ thần kinh trung ương. Dựa trên sự tương

đồng với động vật bậc cao về cấu trúc gen và trình tự axit amin mã hoá, dABCC4 ở

ruồi giấm cũng được dự đoán là có vai trò vận chuyển các chất qua màng tế bào (bao

gồm các base nitơ, nucleotid dạng vòng như cAMP, cGMP) và duy trì cân bằng nội

môi.

3.2. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của protein ABCC4 tại mô não ruồi giấm

Chủng ruồi giấm sau khi lai tạo sẽ được tiến hành đánh giá hiệu quả

knockdown protein trên mô não bằng kỹ thuật western blotting, sử dụng kháng thể đặc

hiệu với protein dABCC4. Ngoài việc knockdown dABCC4 tạo dòng bệnh lý, nghiên

cứu cũng sử dụng dòng ruồi knockdown GFP làm đối chứng. Dòng đối chứng có cùng

một phương thức knockdown và cùng một hệ thống biểu hiện, với mục đích tạo ra ảnh

hưởng và tác động tương tự trên mô não của ruồi giấm. Từ đó dễ dàng đánh giá được

vai trò của gen thông qua sự khác biệt về kiểu hình.

Đối chứng Knockdown

dABCC 150 kDa

⍺-tubulin

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Hình 17: Kết quả western blotting xác định mức độ biểu hiện của protein dABCC4 ở mô não của ruồi giấm ở nhóm knockdown (w/Y; UAS-dABCA-IR63-155; elav-GAL4) và nhóm đối chứng (w/Y; UAS-GFP-IR; elav-GAL4).

Kết quả cho thấy, xuất hiện băng protein kích thước 150 kDa tương ứng với

155;elav-GAL4 với cường độ thấp hơn so với băng protein cùng kích thước ở nhóm

trọng lượng phân tử của protein dABCC4 ở nhóm knockdown w/Y;UAS-dABCC-IR63-

chứng w/Y;UAS-GFP-IR; elav-GAL4. Điều này chứng tỏ mức độ biểu hiện của protein

dABCC4 tại mô não của ruồi giấm ở nhóm knockdown giảm đáng kể so với nhóm

chứng, khẳng định hiệu suất của quá trình knockdown và tính đặc hiệu của kháng thể.

Ngoài việc sử dụng kháng thể bậc 1 đặc hiệu cho protein đích dABCC4, nghiên cứu

cũng sử dụng kháng thể đặc hiệu cho alpha-tubulin làm đối chứng cho lượng protein

đưa vào ở từng mẫu thí nghiệm.

Để xác định hiệu suất của quá trình knockdown, một số kỹ thuật có thể được sử

dụng như western blotting, RT-PCR … Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ

thuật western blotting với kháng thể đặc hiệu cho protein dABCC4 (Sigma-Aldrich).

Kháng thể có khả năng gắn đặc hiệu với trình tự peptide (H-

CIEPEGALEAPADKKPPKSW-OH) tương ứng với trình tự từ axit amin thứ 63 đến

axit amin thứ 155 của dABCC4.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Giảm biểu hiện của protein là một trong những cách để xác định vai trò của nó

đối với sự thay đổi trong kiểu hình và mối liên quan với quá trình chuyển hoá trong cơ

thể sống. Trong nghiên cứu này, hệ thống GAL4/UAS đã được sử dụng một cách có

hiệu quả bằng cách kết hợp với kỹ thuật RNAi để knockdown một gen chuyên biệt.

Việc tạo ra các dòng ruồi giấm mang thư viện RNAi đòi hỏi việc khuếch đại một đoạn

trình tự gen đích, cắt và nối hai đầu của trình tự bằng enzyme giới hạn để tạo nên cấu

trúc chứa trình tự lặp lại ngược chiều nhau (inverted repeat –IR) [20]. Trình tự lặp lại

ngược chiều này sẽ được chèn vào vector chuyển gen, dưới sự kiểm soát của promoter

hsp70. Ngoài ra, vector chuyển gen còn chứa một số thành phần như trình tự UAS

(upstream activator sequence) nằm ở phía trước vùng khởi động của gen giúp tăng

cường hiệu suất phiên mã; hay trình tự lặp lại poly A giúp cho quá trình phiên mã và

tạo sợi mRNA hoàn chỉnh. Một gen mini-white cũng được chèn vào trong vector và

được sử dụng như một loại marker màu mắt, giúp phân biệt ruồi giấm mang gen

chuyển (biểu hiện kiểu hình mắt đỏ) và không mang gen chuyển (biểu hiện kiểu hình

mắt trắng). Vector chuyển gen còn chứa hai trình tự P3 và P5, có vai trò trong việc

chèn toàn bộ các cấu trúc trên vào gen đích. Trong tế bào chủ, gen đích được phiên mã

tạo thành sợi mRNA mang trình tự lặp-đảo, từ đó hình thành cấu trúc kẹp tóc và trải

qua quá trình phân cắt để hình thành nên sợi RNAi. Sợi RNAi được tạo ra sẽ tìm và

phân huỷ mRNA gen đích. Nhờ đó mà protein đích không được tạo thành.

Bên cạnh hệ thống GAL4/UAS, nghiên cứu còn sử dụng hệ thống biểu hiện

Elav-GAL4. Đây là hệ thống thường được sử dụng để biểu hiện gen trên tế bào tiền

thân thần kinh và gần như tất cả các tế bào thần kinh đệm phôi. Chính vì vậy, khi sử

dụng dòng driver này, protein có thể được biểu hiện từ giai đoạn sớm, trên các tế bào

tiền thân của thần kinh trong giai đoạn ấu trùng bậc 3.

Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng sử dụng hệ thống GAL4/UAS kết hợp với

công nghệ RNAi để xác định vai trò của gen đến sự biểu hiện và thay đổi trong kiểu

hình ruồi giấm. Nghiên cứu của Ueoka và cs (2018) đã tiến hành knockdown gen

dABCA13 và xác định mối liên quan đến biểu hiện rối loạn tự kỷ [77]. Hay như nghiên

cứu của Suda và cs (2018) cũng sử dụng hệ thống này với cơ chế knockdown tương tự

để xác định vai trò của protein vận chuyển SLC25A46 [71]. Cả hai nghiên cứu này

đều có chung một cách thức giảm biểu hiện của một gen và cùng nhắm vào những gen

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

trên ruồi có mức độ tương đồng cao với gen trên người. Từ đó xác định sự thay đổi

trong kiểu hình đặc trưng cho từng bệnh lý. Việc kiểm soát mức độ knockdown của

gen cũng có thể thực hiện được thông qua việc tăng hay giảm số bản copy của trình tự

lặp đảo của gen đích trong hệ gen của ruồi giấm. Quá trình và cách thức lai tạo sẽ

quyết định việc cài trình tự này vào một hay cả hai allen trong cặp nhiễm sắc thể ruồi

giấm. Đồng thời, số bản copy của gen mã hoá cho promoter đặc hiệu mô (driver) cũng

là một trong những yếu tố giúp tăng hay giảm mức độ knockdown gen đích. Dòng ruồi

mang driver ở dạng dị hợp tử (elav-GAL4/+) sẽ có mức độ biểu hiện yếu hơn một nửa

so với dòng mang driver đồng hợp tử (elav-GAL4/elav-GAL4). Thông thường, người

ta sẽ tăng số bản copy của driver trong trường hợp kiểu hình biểu hiện chưa rõ ràng

hoặc chưa đủ để thấy sự khác biệt; và giảm khi kiểu hình biểu hiện quá mạnh, gây độc

cho ruồi. Đây là cách thức giúp kiểm soát sự cân bằng trong kiểu gen và kiểu hình của

ruồi giấm.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng ruồi giấm mang 2 copy của trình tự

lặp-đảo gen đích và 2 copy của driver cho thí nghiệm western blotting để thấy rõ hiệu

quả của việc knockdown. Kết quả thu được cho thấy mức độ biểu hiện của protein này

ở nhóm knockdownw/Y;UAS-dABCC-IR63-155;elav-GAL4 thấp hơn so với nhóm chứng

w/Y;UAS-GFP-IR; elav-GAL4. Điều này chứng tỏ cường độ biểu hiện của protein

dABCC4 tại mô não của ruồi giấm ở nhóm knockdown giảm đáng kể, khẳng định hiệu

suất của quá trình knockdown và tính đặc hiệu của kháng thể.

3.3. Kết quả đánh giá khả năng vận động và tương tác ở ruồi giấm trưởng thành.

Để đánh giá ảnh hưởng của việc knockdown dABCC4 tại mô não đến sự thay

đổi trong hành vi bao gồm vận động và tương tác của ruồi giấm, nghiên cứu đã tiến

hành thí nghiệm tương tác xã hội (social space assay) trên ruồi giấm trưởng thành ở

giai đoạn 3 ngày tuổi. Thí nghiệm được tiến hành song song với nhóm chứng

knockdown gen GFP. Kết quả được thể hiện trong Hình 18.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

elav > GFP-IR

elav > dABCC-IR63-155

)

elav > G F P-IR

m c (

elav > d A B C C-IR 63-155

Social space assay

t ấ h n

n ầ g n o c

n ế đ

h c á c

g n ả o h K

elav > GFP-IR

elav > dABCC-IR63-155

elav > G F P-IR

elav > d A B C C-IR 63-155

Social space assay

Hình 18: Thí nghiệm hành vi tương tác xã hội trên ruồi giấm trưởng thành. (A) Phân bố trong không gian của quần thể ruồi giấm ở nhóm knockdown (elav>dABCC-IR63-155) và nhóm chứng (elav>GFP-IR). (B) Kết quả phân tích khoảng cách tương tác không gian của ruồi giấm giữa nhóm bệnh knockdown dABCC4 và nhóm chứng knockdown GFP. (n=40); ***:p<0.01 .

Kết quả cho thấy ruồi giấm knockdown gen dABCC4 có mức độ tương tác với

quần thể giảm rõ rệt (Hình 18A). Các cá thể ở nhóm bệnh đứng riêng lẻ và rải rác

trong không gian, không có xu hướng giao tiếp hay di chuyển thành đám như ở nhóm

chứng. Trên 80% cá thể ruồi giấm knockdown dABCC4 có khoảng cách đến con gần

nhất trên 1.5cm, trong khi ở nhóm chứng chỉ là dưới 0.5cm. Sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê với p<0.01. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng tiến hành thí nghiệm leo trèo

(climbing assay) trên chính quần thể ruồi này để khẳng định sự phân bố ngẫu nhiên rải

rác trong không gian của các cá thế ruồi giấm ở nhóm knockdown không phụ thuộc

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

vào sự thay đổi trong khả năng vận động của chúng. Ruồi được đánh giá tại các thời

điểm 3 ngày tuổi, 7 ngày tuổi và 14 ngày tuổi.

g n ộ đ n ậ v ố s ỉ

h C

Ngày 3 Ngày 7 Ngày 14

Hình 19: Kết quả thí nghiệm leo trèo xác định khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành ở thời điểm 3 ngày tuổi, 7 ngày tuổi và 14 ngày tuổi. Kết quả không có sự khác biệt giữa nhóm ruồi bệnh lý knockdown gen dABCC và nhóm chứng knockdown gen GFP (n=40).

Kết quả thu được cho thấy, khả năng vận động của nhóm ruồi bệnh lý

knockdown gen dABCC4(elav>dABCC-IR63-155) và nhóm chứng knockdown gen

GFP(elav>GFP-IR) là tương đương nhau (Hình 19). Do vậy, sự tăng khoảng cách

tương tác và phân bố ngẫu nhiên của quần thể ruồi trong không gian không chịu ảnh

hưởng bởi khả năng leo trèo của chúng. Thay đổi trong tương tác xã hội của ruồi giấm

knockdown gen dABCC4 không gây nên bởi sự suy giảm khả năng vận động.

Thông thường, trong một không gian hai chiều, khi được tác động một lực vừa

đủ để đưa toàn bộ ruồi về cùng một điểm xuất phát, ruồi giấm không mang gen đột

biến có xu hướng bò ngược chiều trọng lực và di chuyển thành từng đám. Cụ thể với

thiết kế thí nghiệm trong nghiên cứu của Simon và cs, ruồi giấm sẽ tương tác và tập

trung lại thành đám tại đỉnh của tam giác cân. Việc ghi lại hình ảnh và phân tích bằng

phần mềm sẽ giúp xác định được khoảng cách tương tác giữa các cá thể trong quần

thể.

Tuy nhiên, để khẳng định sự phân bố ngẫu nhiên của quần thể ruồi giấm trong

không gian không phụ thuộc vào khả năng vận động của chúng, đòi hỏi nghiên cứu

phải tiến hành đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm ngay trước thời điểm làm thí

nghiệm không gian giao tiếp. Việc tiến hành thí nghiệm leo trèo cũng đòi hỏi phải

được lặp lại nhiều lần tại nhiều thời điểm khác nhau trong vòng đời. Đồng thời tại mỗi

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

lần lặp lại, thí nghiệm phải được thực hiện tại cùng một vị trí, cùng một thời điểm

trong ngày để đảm bảo độ chính xác, tránh sai số. Trong nghiên cứu này, do ruồi cái bị

ảnh hưởng bởi quá trình mang thai và đẻ trứng, nên thí nghiệm vận động và tương tác

sử dụng ruồi giấm đực để đảm bảo tính ổn định. Điều này cũng đã được chứng minh

trong nhiều nghiên cứu trước đó [77]. Một số nghiên cứu sử dụng ruồi giấm làm sinh

vật mô hình để chứng minh mối liên quan giữa gen rugose với hội chứng rối loạn tự

kỷ [81]. Ruồi giấm biến đổi gen rugose cũng bị giảm khả năng tương tác xã hội.

Khoảng cách tới con gần nhất trong quần thể tăng lên, sự phân bố của chúng là ngẫu

nhiên và không khác so với khi thí nghiệm trên từng cá thể đơn lẻ. Ruồi giấm biểu

hiện hành vi như thể không có con ruồi nào khác trong buồng thí nghiệm.

3.4. Kết quả xác định nhịp sinh học của ruồi giấm

Một trong những yếu tố chẩn đoán cốt lõi của rối loạn tự kỷ là những thay đổi

trong nhịp sinh học bao gồm tổng thời gian hoạt động trong ngày, thời gian thức và

ngủ. Để đánh giá tác động của việc knockdown gen dABCC4 lên nhịp sinh học ở ruồi

giấm, nghiên cứu tiến hành theo dõi hoạt động thức-ngủ của 40 cá thể ở nhóm bệnh và

nhóm chứng. Ruồi giấm ở cả hai nhóm được lựa chọn ở thời điểm 3-4 ngày tuổi, được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản, nhiệt độ 25oC, độ ẩm 60% và dưới điều kiện

chiếu sáng 12h sáng : 12h tối trong tối thiểu 2 ngày. Sau đó, mỗi cá thể được đưa vào 1

ống thuỷ tinh trong suốt đường kính 5mm và đặt vào thiết bị đo có gắn cảm biến kết

nối với máy tính. Thí nghiệm được tiến hành trong vòng 7 ngày. Tần suất hoạt động

của ruồi tại mỗi khoảng thời gian được ghi nhận là số lần ruồi di chuyển qua đèn laser

cảm biến. Kết quả được thống kê và phân tích bằng Microsoft Excel.

ĐỈnh hoạt động ban đêm

ĐỈnh hoạt động ban ngày

g n ộ đ

Khởi phát sớm đỈnh hoạt động ban đêm

Thời gian ngủ ban đêm

Thời gian ngủ ban ngày

ạ o h ộ đ g n ờ ư C

g n ộ đ

ạ o h ộ đ g n ờ ư C

elav-GAL4/+; UAS-GFP-IR (đối chứng)

elav-GAL4/+ ;UAS-dABCC-IR63-155 (knockdown)

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Hình 20: Kết quả xác định nhịp sinh học của ruồi giấm. Thí nghiệm sử dụng dòng ruồi knockdown mang kiểu gen w/Y; UAS-dABCC-IR63-155; elav-GAL4/+ (đường màu đỏ) và dòng w/Y; UAS-GFP-IR; elav-GAL4/+ (đường màu xanh) làm đối chứng. Trục hoành biểu thị các mốc thời gian trong một ngày. Trục tung biểu thị cường độ hoạt động của ruồi.

Kết quả xác định nhịp sinh học của ruồi giấm cho thấy ruồi hoạt động chủ

yếu vào hai thời điểm trong ngày tương ứng với hai đỉnh có cường độ tín hiệu cao

nhất. Thời điểm từ 8h-10h là đỉnh hoạt động ban ngày (morning peak) và thời điểm từ

20h30-21h30 là đỉnh hoạt động ban đêm (evening peak). Theo đó, thời gian ngủ ban

ngày (midday siesta) được tính là khoảng thời gian giữa hai đỉnh trong cùng một ngày

còn thời gian ngủ ban đêm (nighttime sleep) được tính từ đỉnh hoạt động ban đêm của

ngày hôm trước đến đỉnh hoạt động ban ngày của ngày hôm sau. Biểu đồ nhịp thức-

ngủ của ruồi giấm cho thấy, ruồi bị knockdown gen dABCC4 tại mô não có hiện tượng

khởi phát sớm đỉnh hoạt động ban đêm. Cụ thể, đỉnh hoạt động ban đêm ở nhóm ruồi

bệnh lý khởi phát từ thời điểm 18h30 thay vì 20h30 như nhóm ruồi đối chứng (Hình

20). Hiện tượng này xuất hiện trong nhiều ngày liên tiếp, cho thấy biểu hiện hành vi có

tính lặp đi lặp lại của ruồi giấm. Kiểu hình thu được tương tự như triệu chứng rối loạn

tự kỷ ở người.

Cường độ hoạt động ban đêm

Cường độ hoạt động ban ngày

250

300

** **

250

200

** **

200

150

** **

150

100

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

C

D

Thời gian ngủ ban đêm

Thời gian ngủ ban ngày

600

300

500

250

** **

400

200

300

150

100

200

100

Tổng cường độ hoạt động trong một ngày

1200

1000

800

600

400

200

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Ngày 8

elav-GAL4/+; UAS-GFP-IR

elav-GAL4/+ ;UAS-dABCC-IR63-155

Hình 21: Kết quả phân tích nhịp thức-ngủ ở ruồi giấm bao gồm cường độ hoạt động ban ngày (A), ban đêm (B); thời gian ngủ ban ngày (C), ban đêm (D) và tổng thời gian hoạt động trong một ngày (E) giữa dòng ruồi knockdown mang kiểu gen w/Y; UAS-dABCC-IR63-155; elav-GAL4/+ và dòng đối chứng w/Y; UAS-GFP-IR; elav-GAL4/+; *:p<0.05; **:p<0.01.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Ngoài ra, kết quả so sánh và phân tích cường độ hoạt động của ruồi trong một

ngày còn cho thấy ruồi giấm knockdown gen dABCC4 có xu hướng hoạt động nhiều

hơn, thời gian ngủ ban ngày và thời gian ngủ ban đêm cũng dài hơn so với nhóm

chứng. Ruồi có xu hướng tăng động tại nhiều thời điểm trong ngày. Sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê với p<0.05. Kết quả này tương tự như kết quả thu được trong nghiên

cứu của Ueoka và cs trên ruồi giấm knockdown dABCA13 [77]. So sánh với kết quả

trong nghiên cứu của Wise và cs cho thấy, ruồi giấm knockdown dABCC4 có biểu

hiện tương tự như ruồi giấm mang đột biến gen rugose [81]. Cụ thể, cường độ hoạt

động của ruồi ở mức cao và kéo dài liên tục trong nhiều ngày và trong điều kiện không

có bất kỳ kích thích nào.

3.5. Kết quả xác định sự thay đổi trong cấu trúc mối nối thần kinh cơ

(neuromuscular junction-NMJ) ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn

dịch huỳnh quang

Phần lớn các tế bào thần kinh vận động ở ruồi giấm trưởng thành có nguồn gốc

từ các tế bào thần kinh cơ ở giai đoạn ấu trùng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến

hành so sánh cấu trúc NMJ bao gồm chiều dài nhánh, số lượng nhánh, số lượng các

nút thần kinh (bouton) ở nhóm cơ số 4 (nhóm cơ có kích thước lớn nhất) ở ấu trùng

ruồi giấm ba ngày tuổi bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang sử dụng

kháng thể anti-HRP (đặc hiệu cho màng tế bào thần kinh), kháng thể anti-DLG (đặc

hiệu cho vùng sau synap) và kháng thể anti-BRP (đặc hiệu cho vùng hoạt động trước

synap). Kết quả được thể hiện trong Hình 22 và Hình 23

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

A

DLG

Merge

HRP

g n ứ h c

i ố Đ

10 µm

n w o d k c o n K

10 µm

ns

t ú n

h n á h n

i à d

g n ợ ư l

ố S

u ề i h C

Hình 22: Kết quả phân tích cấu trúc mối nối thần kinh cơ (neuromuscular junction- NMJ) của ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang. (A) Cấu trúc thần kinh NMJ nhuộm với kháng thể HRP (màu xanh lá cây) đặc hiệu cho màng tế bào thần kinh và kháng thể DLG (màu đỏ) đặc hiệu cho vùng trước synap, đồng thời so sánh sự thay đổi về số lượng nhánh (B), chiều dài nhánh (C) và số lượng nút thần kinh (D). (n = 8); (*:p<0.05) ; (ns: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê).

Kết quả quan sát dưới kính hiển vi Confocal (Flour View – Olympus) và

phân tích bằng phần mềm MetaMorph Imaging System –JH Technology cho thấy, có

sự tăng số lượng nhánh trong cấu trúc thần kinh NMJ ở ấu trùng ruồi giấm bị

knockdown gen dABCC4 (UAS-dABCC-IR63-155; elav-GAL4/+) so với nhóm chứng

(Hình 22B). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0.05. Ngoài ra, chiều dài nhánh và

số lượng nút thần kinh ở nhóm knockdown cũng thấp hơn so với nhóm chứng. Tuy

nhiên, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (Hình 22C,D). Những kết quả này gợi ý

rằng gen dABCC4 có liên quan đến việc hình thành và duy trì cấu trúc, hình thái thần

kinh NMJ ở ấu trùng ruồi giấm. Bên cạnh việc xác định hình thái cấu trúc của tế bào

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

thần kinh NMJ, nghiên cứu cũng tiến hành xác định sự thay đổi ở mức độ sâu hơn bao

gồm số lượng, mật độ và kích thước trung bình của vùng hoạt động trước synap ở ấu

trùng ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đặc

BRP

HRP

Merge

hiệu cho protein BRP.

B

C

D

ì

i

p r h g n ù v h c í t n ệ d / p r b g n ợ ư

l

i

ố S

) 2 m µ / 2 m µ ( p r h h c í t n ệ d / p r b h c í t n ệ D

) 2 m µ ( p r b g n ù v h n b g n u r t c ớ ư h t h c í K

Hình 23: Kết quả xác định mật độ protein Bruchpilot (BRP) tại vùng hoạt động trước synap (pre-synaptic active zone) ở ấu trùng ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang. (A) Cấu trúc NMJ nhuộm với kháng thể HRP (màu xanh lá cây) đặc hiệu cho màng tế bào thần kinh và kháng thể BRP (màu đỏ) đặc hiệu cho protein BRP ở vùng hoạt động trước synap đồng thời so sánh số lượng (B), mật độ trung bình (C) và kích thước trung bình (D) của vùng hoạt động sau synap. (n = 8); (*:p<0.05) ; (ns: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê).

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Kết quả cho thấy có sự tăng kích thuớc trung bình của vùng hoạt động trước

synap ở ấu trùng ruồi giấm bị knockdown gen dABCC4 (UAS-dABCC-IR63-155; elav-

GAL4/+) so với nhóm chứng (Hình 23D). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với

p<0,05. Ngoài ra, số lượng và mật độ trung bình của vùng này ở nhóm knockdown

cũng có sự thay đổi so với nhóm chứng. Tuy nhiên, sự khác biệt không có ý nghĩa

thống kê (Hình 23B,C). Từ những kết quả trên, có thể thấy, việc giảm biểu hiện gen

dABCC4 ở ruồi giấm đã làm tăng số lượng nhánh và tăng kích thước trung bình vùng

hoạt động của tế bào thần kinh ấu trùng ruồi giấm.

So sánh với kết quả trong các nghiên cứu trước đó, ruồi giấm biến đổi gen

rugose trong nghiên cứu của Wise và cs lại có sự giảm số lượng nút thần kinh

(bouton), còn ruồi giấm knockdown dABCA13 trong nghiên cứu của Ueoka và cs lại

có hiện tượng tăng số lượng nút thần kinh vi vệ tinh (satteline bouton) [77], [81]. Bên

cạnh gen rugose và dABCA13, đột biến trên gen dfmr1 ở ruồi giấm làm tăng đồng thời

cả số lượng nhánh và số lượng các nút thần kinh vi vệ tinh (satellite bouton) [69], [83].

Do đó, tuỳ thuộc vào việc biến đổi từng gen đích khác nhau mà hình thái cấu trúc thần

kinh NMJ có thể khác nhau. Sự khác biệt đó góp phần giải thích cho sự thay đổi trong

nhịp sinh học, thời gian sống trong vòng đời và khả năng tương tác xã hội của ruồi

giấm.

Việc tổng hợp dữ liệu của nhiều nghiên cứu sử dụng mô hình ruồi giấm biến

đổi gen cho bệnh tự kỷ cũng góp phần xác định được vai trò các nhóm gen liên quan,

làm sáng tỏ cơ chế phân tử của bệnh. Trong họ gen ABC ở người, gen ABCC có vai trò

vận chuyển nhiều loại cơ chất qua màng tế bào bao gồm lipid, các ion vô cơ, nucleotid

dạng vòng (cAMP, cGMP) và các phân tử thuốc. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hệ thần

kinh trung ương là cơ quan tập trung hàm lượng lipid cao thứ hai chỉ sau các mô mỡ.

Do đó, chức năng vận chuyển lipid qua màng tế bào của ABC nói chung và ABCC nói

riêng đóng vai trò quan trọng, đặc biệt trong việc ổn định con đường tín hiệu và duy trì

cân bằng nội môi ở các tế bào trong hệ thần kinh trung ương [58].

3.6. Kết quả đánh giá tuổi thọ của ruồi giấm

Ruồi giấm trưởng thành ở mỗi dòng đối chứng và knockdown được nuôi trong điều kiện thức ăn cơ bản, 10 con/ ống, nhiệt độ 25oC, độ ẩm 60% và thời gian chiếu

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

sáng 12h sáng : 12h tối. Ruồi liên tục được chuyển sang các ống thức ăn mới và ghi

nhận số lượng ruồi chết 3 ngày 1 lần. Kết quả được thể hiện trong Hình 24.

)

Elav> UAS-GFP-IR Elav> UAS-dABCC-IR63-155

)

(

% % t ó ( s g g n n ố ố s s ệ ệ l l ỷ ỷ T T

Thời gian sống (ngày) Thời gian sống (ngày)

Hình 24: Biểu đồ đánh giá tỷ lệ sống của ruồi giấm ở hai nhóm knockdown (kiểu gen w/Y; UAS-dABCC-IR63-155; elav-GAL4/+ và dòng đối chứng (w/Y; UAS-GFP-IR; elav-GAL4/+). Phân tích thống kê sử dụng log-rank test, n=40.

Biều đồ đánh giá tỷ lệ sống của ruồi giấm ở hai nhóm cho thấy thời gian sống

trung bình của ruồi giấm ở nhóm đối chứng mang kiểu gen w/Y; UAS-GFP-IR; elav-

GAL4/+ là 54 ngày, cao hơn so với nhóm knockdown có kiểu gen w/Y; UAS-dABCC-

IR63-155; elav-GAL4/+(43 ngày). Kết quả này cho thấy, việc giảm biểu hiện gen

dABCC4 đã làm giảm thời gian sống trung bình trong vòng đời của ruồi giấm.

Việc giảm biểu hiện của gen ở mô não là nguyên nhân gây nên sự thiếu hụt

chức năng của protein này, từ đó ảnh hưởng đến các con đường truyền tin nội bào, gây

ra sự bất thường trong hình thái cấu trúc tế bào thần kinh và hệ quả là làm giảm khả

năng tương tác xã hội, giảm thời gian sống trong vòng đời và thay đổi nhịp sinh học ở

ruồi giấm. Mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu này có thể tiếp tục được sử dụng để

xác định các gen có khả năng tương tác với dABCC từ đó tìm ra các gen, nhóm gen có

liên quan đến rối loạn tự kỷ ở người, làm sáng tỏ cơ chế sinh bệnh học, góp phần tìm

ra các dấu ấn sinh học mới trong chẩn đoán và điều trị. Ngoài ra, mô hình ruồi giấm

trong nghiên cứu còn có thể được sử dụng để sàng lọc một số dược chất, hợp chất

thiên nhiên Việt Nam có tác dụng cải thiện và điều trị hội chứng rối loạn tự kỷ.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

KẾT LUẬN

1. Nghiên cứu đã knockdown thành công gen dABCC4 ở mô não của ruồi giấm sử

dụng hệ thống GAL4/UAS, mức độ biểu hiện của protein ở nhóm bệnh lý giảm

rõ rệt so với nhóm chứng.

2. Nghiên cứu đã xác định được mối liên quan giữa giảm biểu hiện dABCC4 với

các biểu hiện tự kỷ. Kết quả cho thấy:

+ Ruồi giấm bị knockdown dABCC4 có mức độ tương tác với quần thể giảm

mạnh, ruồi có xu hướng đứng riêng lẻ và tăng khoảng cách tương tác.

+ Ruồi bị rối loạn nhịp sinh học, có cường độ hoạt động ban ngày và ban đêm

cao hơn so với nhóm chứng, xuất hiện sớm các đỉnh hoạt động ban đêm.

+ Ruồi giấm knockdown dABCC4 có cấu trúc mối nối thần kinh cơ NMJ bị biến

đổi, thể hiện ở việc tăng số lượng nhánh và kích thước vùng hoạt động trước

synap.

+ Ruồi giấm bị knockdown gen dABCC4 cũng có thời gian sống trong vòng đời

ngắn hơn so với dòng đối chứng.

Đây là những kết quả bước đầu góp phần làm sáng tỏ vai trò của protein này

trong cơ chế phân tử của bệnh, đồng thời cungcấp một mô hình tiềm năng và kinh

tế cho nghiên cứu thử nghiệm và sàng lọc thuốc.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

Tài liệu tham khảo

Tiếng Việt

1. Nguyễn Huy Hoàng., Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở bệnh nhân tự

kỷ Việt Nam (Whole exome sequencing of patients with autism in Vietnam) Đề tài

nghiên cứu cấp Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam. 2015-2016.

2. Quách Thuý Minh (2011), Hoạt động của khoa Tâm bệnh, Bệnh viện Nhi Trung

ương.

3. Thảo NP (2015). Kỹ năng giao tiếp của trẻ tự kỷ. Luận văn Thạc sĩ Tâm lý học;15.

Tiếng Anh

4. Aman M.G., Farmer C.A., Hollway J. và cộng sự. (2008). Treatment of

Inattention, Overactivity, and Impulsiveness in Autism Spectrum Disorders. Child

Adolesc Psychiatr Clin N Am, 17(4), 713–738.

5. Autism Spectrum Disorder. 2018. National Institue of Mental Health.

6. Ayajuddin M., Das A., Phom L. và cộng sự. (2018). Parkinson’s Disease: Insights

from Drosophila Model. Drosoph Melanogaster - Model Recent Adv Genet Ther.

7. Balan S., Iwayama Y., Maekawa M. và cộng sự. (2014). Exon resequencing of

H3K9 methyltransferase complex genes, EHMT1, EHTM2 and WIZ, in Japanese

autism subjects. Mol Autism, 5.

8. Banerjee S., Riordan M., và Bhat M.A. (2014). Genetic aspects of autism spectrum

disorders: insights from animal models. Front Cell Neurosci, 8.

9. Banovic D., Khorramshahi O., Owald D. và cộng sự. (2010). Drosophila

Neuroligin 1 Promotes Growth and Postsynaptic Differentiation at Glutamatergic

Neuromuscular Junctions. Neuron, 66(5), 724–738.

10. Bi C., Wu J., Jiang T. và cộng sự. (2012). Mutations of ANK3 identified by exome

sequencing are associated with autism susceptibility. Hum Mutat, 33(12), 1635–

1638.

11. Bilen J. và Bonini N.M. (2005). Drosophila as a Model for Human

Neurodegenerative Disease. Annu Rev Genet, 39(1), 153–171.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

12. Brondino N., Fusar-Poli L., Rocchetti M. và cộng sự. (2015). Complementary and

Alternative Therapies for Autism Spectrum Disorder. Evid Based Complement

Alternat Med, 2015, 1–31.

13. Castermans D. (2003). The neurobeachin gene is disrupted by a translocation in a

patient with idiopathic autism. J Med Genet, 40(5), 352–356.

14. Castermans D. (2003). The neurobeachin gene is disrupted by a translocation in a

patient with idiopathic autism. Journal of Medical Genetics, 40(5), 352–356.

15. Chongtham A. và Agrawal N. (2016). Curcumin modulates cell death and is

protective in Huntington’s disease model. Sci Rep, 6.

16. D.C. Gadsby., P. Vergani., L. Csanady., (2006) The ABC protein turned chloride

channel whose failure causes cystic fibrosis, Nature, 440, 477–483.

17. Dahmann C., btv. (2008), Drosophila: Methods and Protocols, Humana Press.

18. Dallas S., Miller D.S., và Bendayan R. (2006). Multidrug Resistance-Associated

Proteins: Expression and Function in the Central Nervous System. Pharmacol Rev,

58(2), 140–161.

19. Dean M., Rzhetsky A., và Allikmets R. (2001). The human ATP-binding cassette

(ABC) transporter superfamily. Genome Res, 11(7), 1156–1166.

20. Dietzl G., Chen D., Schnorrer F. và cộng sự. (2007). A genome-wide transgenic

RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature, 448(7150),

151–156.

21. DiGuiseppi C., Hepburn S., Davis J.M. và cộng sự. (2010). Screening for Autism

Spectrum Disorders in Children with Down Syndrome: Population Prevalence and

Screening Test Characteristics. J Dev Behav Pediatr, 31(3), 181.

22. Durkin M.S., Maenner M.J., Newschaffer C.J. và cộng sự. (2008). Advanced

Parental Age and the Risk of Autism Spectrum Disorder. Am J Epidemiol,

168(11), 1268–1276.

23. Elsabbagh M., Divan G., Koh Y.-J., et al. (2012). Global Prevalence of Autism

and Other Pervasive Developmental Disorders. Autism Res, 5(3), 160–179.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

24. Eshraghi A.A., Liu G., Kay S.-I.S. và cộng sự. (2018). Epigenetics and Autism

Spectrum Disorder: Is There a Correlation? Front Cell Neurosci, 12.

25. Gunawardhana L.P., Baines K.J., Mattes J. và cộng sự. (2014). Differential DNA

methylation profiles of infants exposed to maternal asthma during pregnancy.

Pediatr Pulmonol, 49(9), 852–862.

26. H. Bronger., J. Konig., K. Kopplow., et al., (2005) ABCC drug efflux pumps and

organic anion uptake transporters in human gliomas and the blood-tumor barrier,

Cancer Res. 65, 11419–11428

27. Halfon N. và Kuo A.A. (2013). What DSM-5 Could Mean to Children with

Autism and Their Families. JAMA Pediatr, 167(7), 608–613.

28. Hallmayer J., Cleveland S., Torres A. và cộng sự. (2011). Genetic Heritability and

Shared Environmental Factors Among Twin Pairs with Autism. Arch Gen

Psychiatry, 68(11), 1095–1102.

29. Hoang V.M., Le T.V., Chu T.T.Q. và cộng sự. (2019). Prevalence of autism

spectrum disorders and their relation to selected socio-demographic factors among

children aged 18–30 months in northern Vietnam, 2017. Int J Ment Health Syst,

13(1), 29.

30. Hudson AM., Cooley L. (2014) Methods for studying oogenesis. Methods;

68(1):207-17

31. Huerta M., Bishop S.L., Duncan A. và cộng sự. (2012). Application of DSM-5

Criteria for Autism Spectrum Disorder to Three Samples of Children With DSM-

IV Diagnoses of Pervasive Developmental Disorders. Am J Psychiatry, 169(10),

1056–1064.

32. H.U. Pandey., C.D. Nichols., (2011) Human Disease Models in Drosophila

melanogaster and the Role of the Fly in Therapeutic Drug Discovery. Pharmacol

Rev; 63(2):411-436

33. I D. Han., D. Stein., L.M. Stevens., (2000) Investigating the function of follicular

subpopulations during Drosophila oogenesis through hormone-dependent

enhancer-targeted cell ablation | Development.127: 573-583

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

34. Iossifov I., O’Roak B.J., Sanders S.J. và cộng sự. (2014). The contribution of de

novo coding mutations to autism spectrum disorder. Nature, 515(7526), 216–221.

35. Iritani S., Torii Y., Habuchi C. và cộng sự. (2018). The neuropathological

investigation of the brain in a monkey model of autism spectrum disorder with

ABCA13 deletion. Int J Dev Neurosci Off J Int Soc Dev Neurosci, 71, 130–139.

36. Jokiranta E., Brown A.S., Heinimaa M. và cộng sự. (2013). Parental psychiatric

disorders and autism spectrum disorders. Psychiatry Res, 207(3), 203–211.

37. Knight H.M., Pickard B.S., Maclean A. và cộng sự. (2009). A Cytogenetic

Abnormality and Rare Coding Variants Identify ABCA13 as a Candidate Gene in

Schizophrenia, Bipolar Disorder, and Depression. Am J Hum Genet, 85(6), 833–

846.

38. Krench M. và Littleton J.T. (2013). Modeling Huntington disease in Drosophila.

Fly (Austin), 7(4), 229–236.

39. Kyle-Cezar F., Echevarria-Lima J., và Rumjanek V.M. (2007). Independent

Regulation of ABCB1 and ABCC Activities in Thymocytes and Bone Marrow

Mononuclear Cells during Aging. Scand J Immunol, 66(2-3), 238–248.

40. Ladd-Acosta C., Hansen K.D., Briem E. và cộng sự. (2014). Common DNA

methylation alterations in multiple brain regions in autism. Mol Psychiatry, 19(8),

862–871.

41. Landrigan P.J. (2010). What causes autism? Exploring the environmental

contribution. Curr Opin Pediatr, 22(2), 219.

42. Leblond C.S., Nava C., Polge A. và cộng sự. (2014). Meta-analysis of SHANK

Mutations in Autism Spectrum Disorders: A Gradient of Severity in Cognitive

Impairments. PLoS Genet, 10(9).

43. Lee G. và Schwarz T.L. Filamin, a synaptic organizer in Drosophila, determines

glutamate receptor composition and membrane growth. eLife, 5.

44. Lue N.F., Chasman D.I., Buchman A.R. và cộng sự. (1987). Interaction of GAL4

and GAL80 gene regulatory proteins in vitro. Mol Cell Biol, 7(10), 3446–3451.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

45. Madabattula S.T., Strautman J.C., Bysice A.M. và cộng sự. (2015). Quantitative

Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative

Disorders. J Vis Exp JoVE, (100).

46. Mazahery H., Conlon C., Beck K.L. và cộng sự. (2016). Vitamin D and omega-3

fatty acid supplements in children with autism spectrum disorder: a study protocol

for a factorial randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Trials, 17.

47. McClung C. và Hirsh J. (1998). Stereotypic behavioral responses to free-base

cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr Biol

CB, 8(2), 109–112.

48. Menon K.P., Carrillo R.A., và Zinn K. (2013). Development and plasticity of the

Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol, 2(5),

647–670.

49. Mirzoyan Z., Sollazzo M., Allocca M. và cộng sự. (2019). Drosophila

melanogaster: A Model Organism to Study Cancer. Front Genet, 10.

50. Mizuno H., Fujikake N., Wada K. và cộng sự. (2010). α-Synuclein Transgenic

Drosophila As a Model of Parkinson’s Disease and Related Synucleinopathies.

Park Dis, 2011, 212706.

51. Neal D., Matson J.L., và Hattier M.A. (2012). A comparison of diagnostic criteria

on the Autism Spectrum Disorder Observation for Children (ASD-OC). Dev

Neurorehabilitation, 15(5), 329–335.

52. Nies A.T., Jedlitschky G., König J. và cộng sự. (2004). Expression and

immunolocalization of the multidrug resistance proteins, MRP1-MRP6 (ABCC1-

ABCC6), in human brain. Neuroscience, 129(2), 349–360.

53. O’Neal J., Gao F., Hassan A. và cộng sự. (2009). Neurobeachin (NBEA) is a

target of recurrent interstitial deletions at 13q13 in patients with MGUS and

multiple myeloma. Exp Hematol, 37(2), 234.

54. O’Roak B.J., Vives L., Fu W. và cộng sự. (2012). Multiplex Targeted Sequencing

Identifies Recurrently Mutated Genes in Autism Spectrum Disorders. Science,

338(6114), 1619–1622.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

55. Patterson P.H. (2009). Immune involvement in schizophrenia and autism:

Etiology, pathology and animal models. Behav Brain Res, 204(2), 313–321.

56. Peñagarikano O., Abrahams B.S., Herman E.I. và cộng sự. (2011). Absence of

CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities and core autism-

related deficits. Cell, 147(1), 235–246.

57. Perveen F.K. (2018). Introduction to Drosophila. Drosoph Melanogaster - Model

Recent Adv Genet Ther.

58. Piehler A.P., Ozcürümez M., và Kaminski W.E. (2012). A-Subclass ATP-Binding

Cassette Proteins in Brain Lipid Homeostasis and Neurodegeneration. Front

Psychiatry, 3, 17.

59. Pinato L., Galina Spilla C.S., Markus R.P. và cộng sự. (2019). Dysregulation of

circadian rhythms in autism spectrum disorders. Curr Pharm Des.

60. Prokop A. (2016). Fruit flies in biological research. Biological Sciences Review.

10(14);10-14

61. Rauh V.A., Garfinkel R., Perera F.P. và cộng sự. (2006). Impact of Prenatal

Chlorpyrifos Exposure on Neurodevelopment in the First 3 Years of Life Among

Inner-City Children. PEDIATRICS, 118(6), e1845–e1859.

62. Reiter LT., Pôtcki L., Chien S. A Systematic Analysis of Human Disease-

Associated Gene Sequences In Drosophila melanogaster. Genome Re;11(6):1114-

63. Roote J. và Prokop A. (2013). How to design a genetic mating scheme: a basic

training package for Drosophila genetics. G3 Bethesda, 3(2):353-8

64. Rosenberg R.E., Kaufmann W.E., Law J.K. và cộng sự. (2011). Parent Report of

Community Psychiatric Comorbid Diagnoses in Autism Spectrum Disorders.

Autism Res Treat, 2011, 1–10.

65. Rossi F. và Gonzalez C. (2015). Studying tumor growth in Drosophila using the

tissue allograft method. Nat Protoc, 10(10), 1525–1534.

66. Sanders S.J., Murtha M.T., Gupta A.R. và cộng sự. (2012). De novo mutations

revealed by whole exome sequencing are strongly associated with autism. Nature,

485(7397), 237–241.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

67. Schiele M.A. và Domschke K. (2018). Epigenetics at the crossroads between

genes, environment and resilience in anxiety disorders. Genes Brain Behav, 17(3),

e12423.

68. Shamloula H.K., Mbogho M.P., Pimentel A.C. và cộng sự. (2002). rugose (rg), a

Drosophila A kinase anchor protein, is required for retinal pattern formation and

interacts genetically with multiple signaling pathways. Genetics, 161(2), 693.

69. Siller S.S. và Broadie K. (2011). Neural circuit architecture defects in a

Drosophila model of Fragile X syndrome are alleviated by minocycline treatment

and genetic removal of matrix metalloproteinase. Dis Model Mech, 4(5), 673–685.

70. Simon A.F., Chou M.-T., Salazar E.D. và cộng sự. (2012). A simple assay to study

social behavior in Drosophila: measurement of social space within a group. Genes

Brain Behav, 11(2), 243–252.

71. Suda K., Ueoka I., Azuma Y. và cộng sự. (2018). Novel Drosophila model for

mitochondrial diseases by targeting of a solute carrier protein SLC25A46. Brain

Res, 1689, 30–44.

72. Sztainberg Y. và Zoghbi H.Y. (2016). Lessons learned from studying syndromic

autism spectrum disorders. Nat Neurosci, 19(11), 1408–1417.

73. Tomioka M., Toda Y., Kurisu J. và cộng sự. (2012). The Effects of Neurological

Disorder-Related Codon Variations of ABCA13 on the Function of the ABC

Protein. Biosci Biotechnol Biochem, 76(12), 2289–2293.

74. Tordjman S., Somogyi E., Coulon N. và cộng sự. (2014). Gene × Environment

Interactions in Autism Spectrum Disorders: Role of Epigenetic Mechanisms.

Front Psychiatry, 5.

75. Tran H.H., Dang S.N.A., Nguyen T.T. và cộng sự. (2018). Drosophila Ubiquitin

C-Terminal Hydrolase Knockdown Model of Parkinson’s Disease. Sci Rep, 8.

76. Tsuda L. và Lim Y.-M. (2018). Alzheimer’s Disease Model System Using

Drosophila. Adv Exp Med Biol, 1076, 25–40.

77. Ueoka I., Kawashima H., Konishi A. và cộng sự. (2018). Novel Drosophila model

for psychiatric disorders including autism spectrum disorder by targeting of ATP-

binding cassette protein A. Exp Neurol, 300, 51–59.

Luận văn thạc sĩ khoa học Trần Quốc Đạt – K26 Sinh học thực nghiệm

78. Ueoka I., Pham H.T.N., Matsumoto K. và cộng sự. (2019). Autism Spectrum

Disorder-Related Syndromes: Modeling with Drosophila and Rodents. Int J Mol

Sci, 20(17), 4071.

79. Vasiliou V., Vasiliou K., và Nebert D.W. (2009). Human ATP-binding cassette

(ABC) transporter family. Hum Genomics, 3(3), 281–290.

80. Vef O., Cleppien D., Löffler T. và cộng sự. (2006). A new strategy for efficient in

vivo screening of mutagenized Drosophila embryos. Dev Genes Evol, 216(2),

105–108.

81. Wise A., Tenezaca L., Fernandez R.W. và cộng sự. (2015). Drosophila mutants of

the autism candidate gene neurobeachin (rugose) exhibit neuro-developmental

disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social

behavior and activity patterns. J Neurogenet, 29(0), 135–143.

82. Yuen R.K., Merico D., Cao H. và cộng sự. (2016). Genome-wide characteristics of

de novo mutations in autism. Npj Genomic Med, 1(1), 1–10.

83. Zhang Y.Q., Bailey A.M., Matthies H.J. và cộng sự. (2001). Drosophila fragile X-

related gene regulates the MAP1B homolog Futsch to control synaptic structure

and function. Cell, 107(5), 591–603.

84. Zhou S., Luoma S.E., Armour G.E.S. và cộng sự. (2017). A Drosophila model for

toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure.

PLOS Genet, 13(7), e1006907.

85. Zhu L., Wang X., Li X.-L. và cộng sự. (2014). Epigenetic dysregulation of

SHANK3 in brain tissues from individuals with autism spectrum disorders. Hum

Mol Genet, 23(6), 1563–1578.

Website:

86. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

88. http://www.discoveryandinnovation.com/BIOL202/notes/lecture23/

87. http://flybase.org/

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu vai trò của gen ABCC4 liên quan đến rối loạn tự kỷ bằng mô hình ruồi giấm

Đề tài nghiên cứu nhằm 2 mục tiêu chính: Knockdown gen ABCC4 trên mô hình ruồi giấm và phân tích các biểu hiện hành vi và cấu trúc mối nối thần kinh cơ NMJ trên ruồi knockdown ABCC4 trong mối liên quan đến bệnh tự kỷ.

z--

Trần Quốc Đạt

NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA GEN ABCC4

LIÊN QUAN ĐẾN RỐI LOẠN TỰ KỶ

BẰNG MÔ HÌNH RUỒI GIẤM

Trần Quốc Đạt

NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA GEN ABCC4

LIÊN QUAN ĐẾN RỐI LOẠN TỰ KỶ

BẰNG MÔ HÌNH RUỒI GIẤM

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420101.14

Hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Trọng Tuệ

PGS. TS. Võ Thị Thương Lan

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Trần Quốc Đạt, học viên cao học khoá 26, chuyên ngành Sinh học thực

MỤC LỤC

Chú thích Tiếng Anh

Chú thích Tiếng Việt

Chữ viết tắt

Mở đầu

Hình 1. Hoạt động lưu trữ và thao tác trên ruồi giấm trong thực nghiệm [60].

Biol 202 Genetics, 2013 Lecture 23

Hình 7: Hoạt động của hệ thống GAL4/UAS.

Hình 8: Cơ chế RNA can thiệp (RNA interference – RNAi).

Hình 9: Sơ đồ cấu trúc và các vùng chức năng của protein ABC. TMD: vùng xuyên màng (transmembrane domain); NBD: vùng bám nucleotid (nucleotide binding domain) [19].

2.2.1. Nguyên vật liệu và hoá chất

Hóa chất nhuộm miễn dịch huỳnh quang

Trình tự UAS

Promoter elav

Trình tự UAS

Gen GAL4

Đoạn trình tự lặp đảo của gen GFP

Promoter elav

Gen GAL4

Đoạn trình tự lặp đảo của gen dABCC4

dABCC4

Hình 10: Sơ đồ miêu tả quá trình lai tạo các dòng ruồi giấm thí nghiệm và cơ chế hoạt động của các thành phần trong con lai F1.

Hình 11: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng leo trèo

của ruồi giấm trưởng thành.

Hình 12: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng tương tác xã hội của ruồi giấm.

Hình 15: Sơ đồ thiết kế các thí nghiệm trong nghiên cứu.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

A

B

Hình 17: Kết quả western blotting xác định mức độ biểu hiện của protein dABCC4 ở mô não của ruồi giấm ở nhóm knockdown (w/Y; UAS-dABCA-IR63-155; elav-GAL4) và nhóm đối chứng (w/Y; UAS-GFP-IR; elav-GAL4).

elav > GFP-IR

elav > dABCC-IR63-155

elav > G F P-IR

elav > d A B C C-IR 63-155

Social space assay

elav > GFP-IR

elav > dABCC-IR63-155

elav > G F P-IR

elav > d A B C C-IR 63-155

Social space assay

g n ộ đ n ậ v ố s ỉ

h C

Ngày 3 Ngày 7 Ngày 14

C

D

A

ns

ns

B

C

D

ì

i

i

p r h g n ù v h c í t n ệ d / p r b g n ợ ư

l

i

ố S

) 2 m µ / 2 m µ ( p r h h c í t n ệ d / p r b h c í t n ệ D

) 2 m µ ( p r b g n ù v h n b g n u r t c ớ ư h t h c í K

)

Elav> UAS-GFP-IR Elav> UAS-dABCC-IR63-155

(

% % t ó ( s g g n n ố ố s s ệ ệ l l ỷ ỷ T T