Ch ng 7ươ PH NG PHÁP PHÂN TÍCH TRÌNH T ƯƠ Ự
AXIT NUCLEIC
.1Nguyên t c c b n c a kĩ thu t đ c trình t (DNA ắ ơ ả ủ ậ ọ ự
sequencing)
- Là kĩ thu t xác đ nh t t c nh ng h p ph n do nucleotide hình ậ ị ấ ả ữ ợ ầ
thành nên phân t DNA.ử
-Các công trình đ u tiên v “DNA sequencing” đ c công b b i ầ ề ượ ố ở
Maxam và Gilbert (1977), Sanger và cs (1977).
-C u trúc c a chu i DNA là dây xo n đôi, liên k t v i nhau b i ấ ủ ỗ ắ ế ớ ở
liên k t hidro. Trên m i dây có m t chu i các base, t p h p c a ế ỗ ộ ỗ ậ ợ ủ
b n nucleotide : A, T, C, G.ố
-Kĩ thu t DNA sequencing d a trên kĩ thu t đi n di, s d ng gel ậ ự ậ ệ ử ụ
lo i polyacrylamide có đ phân gi i cao.ạ ộ ả
2. Ph ngươ pháp hóa h c (Maxam và Gilbert)ọ
D a vào s th y gi i đ c tr ng phân t DNA c n xác đ nh trình t ự ự ủ ả ặ ư ử ầ ị ự
b ng ph ng pháp hóa h c.ằ ươ ọ
Tr c h t DNA đ c đánh d u b ng Pướ ế ượ ấ ằ 32 m t đ u. Sau đó, chúng ở ộ ầ
đ c chia thành ượ năm phân đo n, m i phân đo n đ c x lí v i ạ ỗ ạ ượ ử ớ
m t ch t hóa h c chuyên bi t (có kh năng bi n đ i đ c hi u 1 ộ ấ ọ ệ ả ế ổ ặ ệ
lo i nucleotide) ạ phân c t DNA ngay t i v trí có nucleotide b ắ ạ ị ị
bi n đ i.ế ổ
K t qu : t o ra 5 t p h p, m i t p h p là các oligonuclotide có kích ế ả ạ ậ ợ ỗ ậ ợ
th c khác nhau nh ng đ u k t thúc t i cùng m t lo i ướ ư ề ế ạ ộ ạ
nucleotide.
Ti n hành đi n di trên gel polyacrilamide, v trí các oligonucleotide ế ệ ị
t ng ng v i kích th c c a chúng.ươ ứ ớ ướ ủ
Hóa ch tấBase b nh h ngị ả ưở
Dimethyl sulfate pH 8 G
Piperidine formate pH 2 A+G
Hydrazine A+ T
Hydrazine + 1,5 M NaCl C
Nhi t đ cao (90ệ ộ 0C), 1,2 M NaOH A >C
Các hóa ch t s d ng trong x lí các base chuyên bi tấ ử ụ ử ệ
Gi i trình t m t đo n ả ự ộ ạ
oligonucleotide theo
ph ng pháp hóa h cươ ọ
3. Ph ng pháp enzyme h c c a Sanger thông qua vi c s d ng ươ ọ ủ ệ ử ụ
các dideoxynucleotide.
D a vào s t ng h p nh enzyme DNA polymerase m ch b sung ự ự ổ ợ ờ ạ ổ
cho trình t DNA m ch đ n c n xác đ nh trình t .ự ạ ơ ầ ị ự
S d ng 4 lo i nucleotide thông th ng + 4 dideoxynucleotide.ử ụ ạ ườ
Dideoxynucleotide là deoxynucleotide, nhóm 3’ OH đ c thay th ượ ế
b ng Hằ2
Khi các Dideoxynucleotide b t c p b sung v i nucleotide t ng ắ ặ ổ ớ ươ
ng trên m ch g c thì ph n ng t ng h p ng ng l i do không t o ứ ạ ố ả ứ ổ ợ ừ ạ ạ
đ c liên k t phosphodister.ượ ế